ES2540733T3 - Anticuerpo que se dirige a la proteína Siglec-15 relacionada con osteoclastos - Google Patents

Anticuerpo que se dirige a la proteína Siglec-15 relacionada con osteoclastos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo que reconoce específicamente uno o más polipéptidos de Siglec-15, que consiste en una secuencia de aminoácidos descrita en uno cualquiera de los siguientes puntos (a) a (h) e inhibe la formación de osteoclastos y/o la resorción ósea osteoclástica: (a) una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias; (b) una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácidos 21 a 328 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias; (c) una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácidos 1 a 260 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias; (d) una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácidos 21 a 260 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias; (e) una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias; (f) una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácidos 21 a 341 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias; (g) una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácidos 1 a 258 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias; y (h) una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácidos 21 a 258 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias.

Description

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La Fig. 17 muestra los resultados de ensayar la neutralización mediante un antígeno de inhibición de la diferenciación de osteoclastos (estimulación con RANKL) de células no adherentes de médula ósea de ratón mediante la adición de un anticuerpo policlonal de Siglec-15 anti-ratón basándose en la actividad enzimática de TRAP (N = 3). Fig. 18 La Fig. 18 muestra los resultados de ensayar el efecto de la adición de un anticuerpo policlonal de Siglec-15 antiratón en la diferenciación de osteoclastos (estimulación con TNF-α) de células no adherentes de médula ósea de ratón basándose en la actividad enzimática de TRAP (N = 3). Fig. 19 La Fig. 19 muestra fotomicrografías usadas para evaluar el efecto de la adición de un anticuerpo policlonal de Siglec-15 anti-ratón en la diferenciación de osteoclastos (estimulación con TNF-α) de células no adherentes de médula ósea de ratón mediante tinción con TRAP. Fig. 20 La Fig. 20 muestra gráficas que ilustran, mediante la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de la diferenciación de osteoclastos (estimulación con vitamina D3 activa) de células de médula ósea de ratón mediante la adición de un anticuerpo policlonal de Siglec-15 anti-ratón (N = 6). Fig. 21 La Fig. 21 muestra fotomicrografías que ilustran, mediante tinción de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos gigantes (estimulación con vitamina D3 activa) a partir de células de médula ósea de ratón mediante la adición de un anticuerpo policlonal de Siglec-15 anti-ratón. Fig. 22 La Fig. 22 muestra fotomicrografías que ilustran, mediante tinción de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos gigantes (estimulación con RANKL humana) a partir de células de médula ósea de ratón mediante la adición de un anticuerpo policlonal de Siglec-15 anti-ratón. Fig. 23 La Fig. 23 muestra fotomicrografías que ilustran, mediante tinción de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos gigantes (estimulación con RANKL humana) a partir de células RAW 264.7 mediante la adición de un anticuerpo policlonal de Siglec-15 anti-ratón y la anulación del efecto inhibidor mediante Siglec-15 soluble. Fig. 24 La Fig. 24 muestra los resultados de ensayar la unión de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Siglec-15 de ratón a una placa que tiene Siglec-15-Fc de ratón inmovilizado sobre esta mediante un procedimiento ELISA. El símbolo (♦) indica anticuerpo Nº 1A1, el símbolo (■) indica anticuerpo Nº 3A1, el símbolo (A) indica anticuerpo Nº 8A1, el símbolo (X) indica anticuerpo Nº 24A1, el símbolo (·) indica anticuerpo Nº 32A1, el símbolo (·) indica anticuerpo Nº 32A1, el símbolo (+) indica anticuerpo Nº 39A1, el símbolo (-) indica anticuerpo Nº 40A1, el símbolo (-) indica anticuerpo Nº 41B1, el símbolo (O) indica anticuerpo Nº 61A1, y el símbolo (□) indica IgG de control. Fig. 25 La Fig. 25 muestra los resultados de ensayar el efecto de la adición de un anticuerpo monoclonal de Siglec-15 anti-ratón (Nº 3A1, Nº 8A1, o Nº 32A1) en la diferenciación de osteoclastos (estimulación con RANKL) de células no adherentes de médula ósea de ratón. La IgG de control de rata en la figura es un control negativo común en las figuras Figs. 25 y 26. Fig. 26 La Fig. 26 muestra los resultados de ensayar el efecto de la adición de un anticuerpo monoclonal de Siglec-15 anti-ratón (Nº 34A1, Nº 39A1, o Nº 40A1) en la diferenciación de osteoclastos (estimulación con RANKL) de células no adherentes de médula ósea de ratón. El anticuerpo policlonal de Siglec-15 anti-ratón Nº 3 en la figura es un control positivo para las Figs. 25 y 26. Fig. 27 La Fig. 27 muestra gráficas que ilustran un cambio en la expresión de catepsina K, TRAP o el gen Siglec-15 cuando se indujo la diferenciación de osteoclastos a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales. Fig. 28 La Fig. 28 muestra los resultados de examinar la pureza del Siglec-15-His humano purificado por cromatografía en columna de HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q mediante electroforesis de SDSpoliacrilamida. Fig. 29 La Fig. 29 muestra los resultados de examinar la pureza de Siglec-15-Fc humana purificada mediante cromatografía en columna de proteína A mediante electroforesis de SDS-poliacrilamida. Fig. 30 La Fig. 30 muestra cromatogramas de anticuerpos policlonales de Siglec-15 anti-humano purificados usando una columna de afinidad que tenía Siglec-15-Fc inmovilizado sobre ésta. Fig. 31 La Fig. 31 muestra fotomicrografías que ilustran, mediante tinción de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo policlonal de Siglec-15 anti-humano. Fig. 32
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el primer anticuerpo anti-Siglec-15 por la unión a Siglec-15 (es decir, el segundo anticuerpo inhibe la unión entre Siglec-15 y el primer anticuerpo), puede determinarse que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comparten el mismo epítopo incluso si no se ha determinado la secuencia del epítopo específico. Además, cuando el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen al mismo epítopo y también el primer anticuerpo tiene un efecto especial, tal como una actividad neutralizante de antígeno, se puede esperar que el anticuerpo tenga la misma actividad.
La expresión "la hibridación se efectúa en condiciones rigurosas", tal como se usa en el presente documento, se refiere a que se efectúa la hibridación en condiciones en las que puede efectuarse la identificación efectuando hibridación a 68 °C en una solución de hibridación comercialmente disponible, solución de hibridación ExpressHyb (fabricada por Clontech, Inc.) o efectuando la hibridación a 68 °C en presencia de NaCL de 0,7 a 1,0 M usando un filtro que tiene ADN inmovilizado en este, seguido de efectuar el lavado a 68 °C usando solución SSC de 0,1 a 2 x (solución SSC 1 x está compuesta de NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM) o en condiciones equivalentes a estas.
1. Siglec-15
Los presentes inventores descubrieron que el gen de Siglec-15 se expresa específicamente en tumores de células gigantes y también descubrieron que el nivel de expresión del gen de Siglec-15 aumenta cuando una línea celular derivada de monocitos se diferencia en osteoclastos.
Para usar Siglec-15 en la invención, se purifica Siglec-15 directamente a partir de monocitos o células de célula ósea de ser humano, mamífero no humano (tal como de cobaya, rata, ratón, conejo, cerdo, oveja, ganado o mono) o pollo y se usan, o se prepara una fracción de membrana celular de las células anteriormente mencionadas y pueda usarse. Además, puede obtenerse Siglec-15 mediante síntesis in vitro del mismo o producción del mismo en una célula hospedadora mediante ingeniería genética. En la ingeniería genética, específicamente, se integra ADNc de Siglec-15 en un vector capaz de expresar ADNc de Siglec-15, y se sintetiza Siglec-15 en una solución que contiene enzimas, sustratos, y sustancias energéticas necesarias para la transcripción y traducción, o se transforma otra célula hospedadora procariota o eucariota para expresar Siglec-15, mediante lo que puede obtenerse la proteína.
La secuencia de nucleótidos de ADNc de Siglec-15 humano se ha registrado en GenBank con el número de registro NM_213602 y se representa por SEC ID Nº: 1 en el Listado de secuencias, y su secuencia de aminoácidos se representa por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias. La secuencia de nucleótidos de ADNc de Siglec-15 de ratón se ha registrado en GenBank con el número de registro XM_884636 y se representa por SEC ID Nº: 3 en el Listado de secuencias, y su secuencia de aminoácidos se representa por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias. La Siglec-15 humana madura de la que se ha eliminado la secuencia de señal corresponde a una secuencia de aminoácidos compuesta de los restos de aminoácidos 21 a 328 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2. Además, la Siglec-15 de ratón de la que se ha eliminado la secuencia de señal corresponde a una secuencia de aminoácidos compuesta de los restos de aminoácidos 21 a 341 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4. Incidentalmente, Siglec-15 se denomina en ocasiones antígeno 3 similar a CD33, molécula 3 similar a CD33, similar a CD33 o CD33L3, y todos estos representan la misma molécula.
El ADNc de Siglec-15 puede obtenerse, por ejemplo, mediante un procedimiento denominado PCR en el que se efectúa una reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo citada como "PCR") usando una biblioteca de ADNc que expresa ADNc de Siglec-15 como patrón y cebadores que amplifican específicamente ADNc de Siglec-15 (Saiki, R. K., y col., Science, (1988) 239, 487-49).
Además, también se incluye un polinucleótido que hibrida con un polinucleótido compuesto de una secuencia de nucleótidos complementaria a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótido representada por las SEC ID Nº: 1 y 3 en el listado de secuencias en condiciones rigurosas y que codifica una proteína que tiene una actividad biológica comparable a la de Siglec-15 en el ADNc de Siglec-15. Además, también se incluye un polinucleótido que es una variante de corte y empalme del locus de Siglec-15 humana o de ratón o un polinucleótido que hibrida con esta en condiciones rigurosas y codifica una proteína que tiene una actividad biológica comparable a la de Siglec-15 en el ADNc de Siglec-15.
Además, también se incluye en Siglec-15 una proteína que está compuesta de una secuencia de aminoácidos que incluye sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 2 y 4 en el listado de secuencias
o la secuencia de aminoácidos en la que se ha eliminado la secuencia de señal y tiene una actividad biológica comparable a la de Siglec-15. Además, también se incluye en Siglec-15 una proteína que está compuesta de una secuencia de aminoácidos codificada por una variante de corte y empalme transcrita a partir del locus de Siglec-15 de ser humano o de ratón o una secuencia de aminoácidos que incluye sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en esta y tiene una actividad biológica comparable a la de Siglec-15.
2. Detección de metabolismo óseo anormal
Un análisis del nivel de expresión del gen de Siglec-15 en un grupo de muestras de ensayo de varios tejidos óseos humanos demostró que el nivel de expresión del gen aumenta significativamente en tumor de células gigantes (TCG)
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que es un tumor óseo que surge con un gran número de células gigantes multinucleadas similares a osteoclastos y está caracterizado por hallazgos clínicos de destrucción ósea osteolítica (Bullought y col., Atlas of Orthopedic Pathology 2ª edición, págs. 17.6-17.8; Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992)).
También se descubrió que el nivel de expresión del gen Siglec-15 aumenta cuando se diferencia una línea celular derivada de monocitos en osteoclastos.
Por consiguiente, se considera que Siglec-15 está asociado con la patología humana tal como TCG en el que aumenta la resorción ósea. En otras palabras, la medida del nivel de expresión del gen de Siglec-15 y/o Siglec-15 en cada célula y/o cada tejido permite la determinación del estado de metabolismo óseo anormal acompañado por la sobreexpresión de Siglec-15. Los ejemplos del metabolismo óseo anormal, tal como se usa en el presente documento, incluyen, pero sin limitación, osteoporosis (osteoporosis postmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debida al uso de un agente terapéutico, tal como un esteroide o un inmunosupresor, u osteoporosis acompañada de artritis reumatoide), destrucción ósea acompañada de artritis reumatoide, hipercalcemia cancerosa, destrucción ósea que acompaña a mieloma múltiple o metástasis del cáncer al hueso, tumor de células gigantes, pérdida de hueso debida a la periodontitis, osteolisis alrededor de una articulación prostética, destrucción ósea en osteomielitis crónica, enfermedad ósea de Paget, osteodistrofia renal y osteogénesis imperfecta.
Tal como se desvela en el presente documento, la "muestra de ensayo" usada para examinar el nivel de expresión del gen de Siglec-15 y/o Siglec-15 se refiere a una muestra de un tejido de médula ósea, hueso, próstata, testículo, pene, vejiga, riñón, cavidad oral, faringe, labios, lengua, encías, nasofaringe, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, hígado, vesícula biliar, páncreas, nariz, pulmón, tejido blando, piel, mama, útero, ovario, cerebro, tiroides, nódulo linfático, músculo, tejido adiposo o similar, o sangre, un fluido corporal o una excreción o similares, sin embargo, se prefiere sangre o médula ósea.
3. Procedimiento para explorar sustancias que inhiben la diferenciación en osteoclastos
También se desvela en el presente documento un procedimiento para explorar una sustancia que inhibe la diferenciación en osteoclastos que mide el nivel de expresión del gen Siglec-15 y/o Siglec-15.
También se desvela en el presente documento un procedimiento para explorar una sustancia que tiene un efecto terapéutico y/o un efecto preventivo en el metabolismo óseo anormal identificando una sustancia que inhibe la actividad de Siglec-15 de inducir la diferenciación en osteoclastos maduros.
La "sustancia de ensayo" se refiere a una sustancia para su uso en el examen de la actividad de inhibición de la diferenciación en osteoclastos mediante el procedimiento de exploración desvelado en el presente documento. Los ejemplos de la sustancia de ensayo incluyen un compuesto, un metabolito microbiano, un extracto de un tejido vegetal o animal, un derivado de los mismos, y una mezcla de los mismos. Además, también puede usarse un ácido nucleico diseñado para disminuir el nivel de expresión de Siglec-15 o un derivado del mismo (tal como un oligonucleótido antisentido, una ribozima, ARNbc o ARNpi) como sustancia de ensayo. Puede ajustarse la dosis o concentración de la sustancia de ensayo de manera adecuada o puede ajustarse una pluralidad de dosis, por ejemplo, preparando diluciones en serie de la misma. La sustancia de ensayo puede administrarse en un estado adecuado, tal como un sólido o un líquido, y puede disolverse en un tampón adecuado o puede añadirse un estabilizante o similares a esta. En el caso de un procedimiento de exploración usando células cultivadas, la sustancia de ensayo se añade a un medio y las células pueden cultivarse en este. En el caso donde se añade una sustancia de ensayo a un medio, la sustancia de ensayo puede añadirse al inicio del cultivo en el medio de cultivo, y el número de operaciones de adición no está limitado a una. El periodo de cultivo en presencia de una sustancia de ensayo puede ajustarse de manera adecuada, sin embargo, es preferible de 30 minutos a 2 semanas, más preferentemente de 30 minutos a 72 horas. En el caso donde la sustancia de ensayo se administra a un individuo mamífero, la ruta de administración, incluyendo administración oral, inyección intravenosa, inyección intraperitoneal, administración transdérmica, inyección subcutánea y similares, se determina de manera adecuada dependiendo de las propiedades físicas y características similares de la sustancia de ensayo. Incidentalmente, un tiempo adecuado hasta que se obtiene la sustancia de ensayo, después de la administración de la sustancia de ensayo, puede seleccionarse.
Las células cultivadas para ser usadas en el procedimiento de exploración de la invención pueden ser células normales, una línea celular establecida, o células que muestran crecimiento anormal, tales como células de cáncer siempre que sean células de mamífero que expresan Siglec-15. Los ejemplos de las mismas incluyen, pero sin limitación, células precursoras de osteoclastos humanos normales (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, disponibles a través de Sanko Junyaku Co., Ltd., Nº de Cat. 2T-110), células RAW 264.7 derivadas de monocitos de ratón (Nº de Cat de la ATCC TIB-71), células RAW 264 (Nº de Cat de la ECACC 85062803), y células cultivadas primarias derivadas de médula ósea de ratón. Como especie animal de las células cultivadas, se prefieren de ser humano, ratón, u otros mamíferos (cobaya, rata, conejo, cerdo, oveja, ganado, mono, etc.), pollo y similares, pero la especie no está limitada a estas. Incidentalmente, como células cultivadas, se prefiere usar células de mamífero que sobreexpresan Siglec-15, y por ejemplo, células RAW 264.7, células RAW 264, células 293, células
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CHO y células COS7 modificadas introduciendo el gen de Siglec-15 junto con la región promotora del mismo para sobreexpresar Siglec-15, y similares pueden ejemplificarse.
El procedimiento de exploración desvelado en el presente documento también incluye un procedimiento para detectar la expresión del gen Siglec-15 en células de un órgano o un tejido reseccionado de un individuo mamífero después de administrar una sustancia de ensayo al individuo mamífero sin usar células cultivadas. El órgano o tejido a usar para detectar la expresión del gen puede ser cualquiera siempre que exprese Siglec-15, sin embargo, se prefiere un tejido asociado con el metabolismo óseo anormal, y se prefiere más un tejido óseo y médula ósea. Como especie de mamífero, puede usarse un mamífero no humano, y se prefiere de ratón, rata o hámster, y se prefiere más de ratón o rata. Como modelo animal que tiene metabolismo óseo anormal puede usarse un animal que tiene el ovario extirpado, un animal que tiene el testículo extirpado, un animal portador de cáncer que tiene células tumorales implantadas bajo la piel, en la piel, en el ventrículo izquierdo, en la médula ósea, en una vena, en la cavidad abdominal o similares, un animal que tiene un nervio ciático extirpado, un modelo animal de artritis por adyuvante, un modelo animal de artritis inducida por colágeno, un modelo animal de osteoporosis inducida por glucocorticoides, un ratón con senescencia acelerada (ratón SAM P6, Matsushita y col., Am. J. Pathol. 125, 276-283 (1986)), un animal que tiene extirpada la tiroides/paratiroides, un animal que recibe una infusión continua de un péptido relacionado con hormona paratiroidea (PTHrP), un ratón knockout para factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) (Mizuno y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 247, 610-615), un animal con la administración de RANKL soluble o similares. Además, también puede usarse un modelo animal con pérdida de piezas dentales debido a enfermedad periodontal o un animal modificado para sobreexpresar Siglec-15. Además, se administra una sustancia de ensayo seleccionada mediante exploración a cualquiera de los modelos animales anteriormente mencionados, y se mide cada parámetro que puede obtenerse mediante la medición del número de osteoclastos maduros en un tejido óseo, una densidad ósea, una fuerza ósea o una morfología ósea, parámetros del metabolismo óseo (CTx, NTx, etc.) en sangre y orina o parámetros que varían debido al metabolismo óseo anormal, tal como niveles de calcio en sangre, mediante los cuales puede evaluarse el efecto terapéutico y/o el efecto preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal.
Las células cultivadas para su uso en el procedimiento desvelado en el presente documento pueden cultivarse en cualquier condición siempre que las condiciones permitan que las células cultivadas expresen Siglec-15 son la adición de una sustancia de ensayo. Por ejemplo, hay condiciones de cultivo conocidas para las células cultivadas, y cuando las células expresan Siglec-15 en las condiciones, las células pueden cultivarse en las condiciones. Además, en el caso donde se detecta la expresión de Siglec-15 en un órgano o tejido reseccionado de un individuo mamífero, las condiciones de cría para el animal pueden ser cualquiera siempre que las condiciones permitan que el animal exprese Siglec-15 sin la adición de una sustancia de ensayo.
Para examinar el efecto de una sustancia de ensayo en la expresión de Siglec-15, existen procedimientos para medir el nivel de expresión del gen de Siglec-15 y un procedimiento para medir el nivel de expresión de Siglec-15 que es un producto de traducción del gen de Siglec-15. Se considera que una sustancia de ensayo que inhiba la expresión del gen de Siglec-15 y/o de Siglec-15 es una sustancia que tiene un efecto terapéutico y/o un efecto preventivo en el metabolismo óseo anormal, preferentemente osteoporosis, o destrucción ósea que acompaña a artritis reumatoide y/o metástasis del cáncer al hueso.
La medida del nivel de expresión del gen Siglec-15 o de Siglec-15 en células cultivadas puede efectuarse mediante un análisis de Northern, un procedimiento de PCR cuantitativa, un procedimiento de ELISA o similares. En el caso donde se usan células de mamífero cultivadas, se añade una cantidad adecuada de RANKL, TNF-α, M-CSF, la vitamina D3 activa, o similares, según sea necesario, a un medio junto con una sustancia de ensayo, y también en un control sin la adición de la sustancia de ensayo, se añade una cantidad adecuada de RANKL, TNF-α, M-CSF, la vitamina D3 activa, o similares. Además, se construye un sistema experimental para medir la cantidad de unión de un ligando endógeno a Siglec-15, y se evalúa si la unión del ligando endógeno a Siglec-15 se inhibe o no mediante la adición de una sustancia de ensayo, por lo que se efectúa la exploración de una sustancia que inhibe la diferenciación en osteoclastos.
Los respectivos procedimientos de exploración se describirán en los siguientes (1) a (3).
(1) Procedimiento usando gen de Siglec-15.
Como procedimiento de exploración, por ejemplo, existe un procedimiento que usa células de mamífero cultivadas y un procedimiento que usa individuos mamíferos, que se describirá más adelante. respectivamente.
(a) Procedimiento que usa células de mamífero cultivadas
(i) Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) a c):
a) una etapa de extracción de ARN total de células de mamífero cultivadas en un medio con la adición de una sustancia de ensayo; b) una etapa de detectar una diferencia en el nivel de expresión del gen de Siglec-15 entre el ARN total obtenido en a) y el ARN total obtenido de células cultivadas de mamífero cultivadas sin la adición de la sustancia de ensayo; y
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c) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal analizando la diferencia en el nivel de expresión del gen descrito en b).
(ii) Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) a d):
a) una etapa de extracción de ARN total de células de mamífero cultivadas en un medio con la adición de una sustancia de ensayo; b) una etapa de extracción de ARN total de células de mamífero cultivadas en un medio sin la adición de la sustancia de ensayo; c) una etapa de medir el nivel de expresión del gen Siglec-15 en el ARN total obtenido en a) y se obtiene el ARN total obtenido en b). respectivamente, y d) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal analizando una diferencia en el nivel de expresión del gen medido en c) entre el ARN total obtenido en a) y el ARN total obtenido en b).
(b) Procedimiento que usa individuos mamíferos
(i)
Un procedimiento que incluye las siguientes etapas (a) a (c):
a) una etapa de extracción de ARN total de una muestra de ensayo recogida de un individuo mamífero con la administración de una sustancia de ensayo; b) una etapa de detectar una diferencia en el nivel de expresión del gen de Siglec-15 entre el ARN total obtenido en a) y el ARN total obtenido de una muestra de ensayo recogida de un individuo mamífero sin la administración de una sustancia de ensayo; y c) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal analizando la diferencia en el nivel de expresión del gen descrito en b).
(ii)
Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) a d):
a) una etapa de extracción de ARN total de una muestra de ensayo recogida de un individuo mamífero con la administración de una sustancia de ensayo; b) una etapa de extracción de ARN total de una muestra de ensayo recogida de un individuo mamífero sin la administración de la sustancia de ensayo; c) una etapa de medir el nivel de expresión del gen Siglec-15 en el ARN total obtenido en la etapa a) y se obtiene el ARN total obtenido en la etapa b), respectivamente, y d) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal analizando una diferencia en el nivel de expresión del gen descrito en c).
(2) Procedimiento usando Siglec-15.
Al igual que el procedimiento utilizando la medición del nivel de expresión de Siglec-15, existe un procedimiento usando células cultivadas de mamífero y un procedimiento que usa individuos mamíferos, cada uno de los cuales incluye las siguientes etapas:
(a) Procedimiento que usa células de mamífero cultivadas
(i)
Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) y b):
a) una etapa de medir el nivel de expresión de Siglec-15 en células de mamífero cultivadas en un medio con la adición de una sustancia de ensayo; y b) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o efecto preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal analizando una diferencia entre el nivel de expresión de la proteína medido en a) y el nivel de expresión de la proteína en células de mamífero cultivadas en un medio sin la adición de la sustancia de ensayo.
(ii)
Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) a c):
a) una etapa de medir el nivel de expresión de Siglec-15 en células de mamífero cultivadas en un medio con la adición de una sustancia de ensayo; b) una etapa de medir el nivel de expresión de la proteína descrita en a) en células de mamífero cultivadas en un medio sin la adición de la sustancia de ensayo; y c) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o efecto preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal*** detectando una diferencia entre el nivel de expresión de la proteína medido en a) y el nivel de expresión de la proteína medido en b).
(iii) Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) a c):
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(3) Procedimiento de exploración usando ligando endógeno
También puede efectuarse la exploración de una sustancia que inhibe la diferenciación en osteoclastos observando si se inhibe o no la unión de un ligando endógeno a Siglec-15 mediante la adición de una sustancia de ensayo. Los ejemplos de un glucano sialilado que sirve como ligando endógeno para Siglec-15 incluyen la unión de Neu5Acα26GalNAc a Siglec-15 de ser humano y de ratón y la unión de Neu5Aα2-3Gaβ1-4Glc a Siglec-15 de ratón. Sin embargo, el ligando endógeno para Siglec-15 no está limitado a estos glicanos, siempre que tenga una afinidad de unión a Siglec-15. Estos ligandos endógenos pueden marcarse con un marcador adecuado, un radioisótopo o una sustancia fluorescente con el fin de examinar la unión del mismo a Siglec-15. Por ejemplo, puede usarse poliacrilamida biotinilada a la que se le ha unido un oligosacárido sialilado, tal como Neu5Acα2-6GalNAc, en la exploración como sonda que se une a Siglec-15. Como Siglec-15 al que se une un ligando endógeno, pueden usarse células que expresan Siglec-15 o una fracción de membrana preparada a partir de las células. Además, Siglec-15 puede someterse a exploración después de que se haya aislado Siglec-15 de células que expresan Siglec15, seguido de purificación. Como células que expresan Siglec-15, puede usarse cualquier línea celular cultivada que expresa Siglec-15, células a las que se hace expresar transitoria o constantemente el gen de Siglec-15 sometiendo a las células cultivadas adecuadas a modificación por ingeniería genética, y células que expresan Siglec-15 obtenido in vivo. El procedimiento de exploración usando dicho ligando endógeno puede llevarse a cabo de acuerdo con las etapas tal como se describen a continuación.
(i)
Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) y b):
a) una etapa de añadir un ligando endógeno para Siglec-15 y una sustancia de ensayo a células que expresan Siglec-15; y b) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal comparando la cantidad de unión del ligando endógeno a las células que expresan Siglec-15 entre el caso donde se añadió la sustancia de ensayo y el caso donde no se añadió la sustancia de ensayo.
(ii)
Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) a c):
a) una etapa de preparar una fracción de membrana celular de células que expresan Siglec-15; b) una etapa de añadir un ligando endógeno para Siglec-15 y una sustancia de ensayo a la fracción de membrana celular; y c) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal comparando la cantidad de unión del ligando endógeno a la fracción de membrana celular entre el caso donde se añadió la sustancia de ensayo y el caso donde no se añadió la sustancia de ensayo.
(iii) Un procedimiento que incluye las siguientes etapas a) a c):
a) una etapa de preparar Siglec-15; b) una etapa de añadir un ligando endógeno para Siglec-15 y una sustancia de ensayo para Siglec-15 en a); y c) una etapa de determinar el efecto terapéutico y/o preventivo de la sustancia de ensayo en el metabolismo óseo anormal comparando la cantidad de unión del ligando endógeno a Siglec-15 entre el caso donde se añadió la sustancia de ensayo y el caso donde no se añadió la sustancia de ensayo.
En el caso donde se hace que las células adecuadas expresan Siglec-15 mediante ingeniería genética y la Siglec-15 resultante se purifica y somete a exploración, la Siglec-15 a explorar puede seleccionarse entre polipéptidos compuestos de las secuencias de aminoácidos mostradas en las siguientes (a) a (i):
(a)
una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias;
(b)
una secuencia de aminoácidos compuesta de los restos de aminoácidos 21 a 328 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias;
(c)
una secuencia de aminoácidos compuesta de los restos de aminoácidos 1 a 260 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias;
(d)
una secuencia de aminoácidos compuesta de los restos de aminoácidos 21 a 260 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el Listado de secuencias;
(e)
una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias;
(f)
una secuencia de aminoácidos compuesta de los restos de aminoácidos 21 a 341 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias;
(g)
una secuencia de aminoácidos compuesta de los restos de aminoácidos 1 a 258 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias;
(h)
una secuencia de aminoácidos compuesta de los restos de aminoácidos 21 a 258 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el Listado de secuencias; y
(i) una secuencia de aminoácidos que incluye sustitución, deleción o adición de uno o varios restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos descrita en (a) a (h).
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La Siglec-15 a explorar también puede seleccionarse de polipéptidos compuestos de secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos mostradas en los siguientes (j) a (n):
(j)
una secuencia de nucleótidos representada por SEC ID Nº: 1;
(k)
una secuencia de nucleótidos representada por SEC ID Nº: 3;
(l)
una secuencia de nucleótidos representada por SEC ID Nº: 19;
(m)
una secuencia de nucleótidos representada por SEC ID Nº: 43; y
(n)
una secuencia de un polinucleótido que hibrida con un polinucleótido compuesto de una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos descrita en (j) a (m) en condiciones rigurosas.
Además, también es posible usar un polipéptido obtenido mediante el acoplamiento de un marcador adecuado a cualquiera de estos polipéptidos, o un polipéptido fusionado con una proteína soluble diferente, como una diana para exploración. Incidentalmente, el polipéptido compuesto de los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 2 en el listado de secuencias corresponde con el péptido de señal de Siglec-15 humana, y el polipéptido compuesto de los restos de aminoácidos 21 a 260 del mismo se corresponden con el dominio extracelular de la proteína madura de Siglec-15 humana. Además, el polipéptido compuesto de los restos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 4 en el listado de secuencias corresponde con el péptido de señal de Siglec-15 de ratón, y el polipéptido compuesto de los restos de aminoácidos 21 a 258 del mismo se corresponden con el dominio extracelular de la proteína madura de Siglec-15 de ratón. Además, la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID Nº: 43 codifica el dominio extracelular de Siglec-15 humana codificado por la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1, y la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID Nº: 19 codifica el dominio extracelular de Siglec-15 de ratón codificado por la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 3.
Las sustancias candidatas para una sustancia que inhibe la diferenciación en osteoclastos seleccionados mediante cualquiera de los procedimientos de exploración (1) a (3) pueden evaluarse de manera secundaria usando la inhibición de la actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) en forma de un índice, tal como se muestra en los Ejemplos 17, 19 y 20. Además, la evaluación secundaria del mismo también puede efectuarse usando la inhibición de la formación de osteoclastos multinucleados positivos a TRAP, es decir, la inhibición de la fusión celular de osteoclastos en forma de un índice se muestra en los Ejemplos 19, 21, 22 y 35.
(4) Otros procedimientos
La tasa de incidencia de metabolismo óseo anormal a lo largo del tiempo, el grado de metabolismo óseo anormal, y/o la tasa de supervivencia, etc. se determinan para el caso donde una sustancia de ensayo se administró a un individuo mamífero al que se le hace sobreexpresar Siglec-15 y el caso donde la sustancia de ensayo no se administró a esto. En los casos donde en el mamífero con la administración de la sustancia de ensayo la tasa de incidencia de metabolismo óseo anormal disminuye significativamente, el grado de metabolismo óseo anormal es significativamente más bajo, y/o la tasa de supervivencia aumenta en aproximadamente un 10 % o más, preferentemente aproximadamente un 30 % o más, más preferentemente aproximadamente un 50 % o más, la sustancia de ensayo puede seleccionarse como un compuesto que tiene un efecto terapéutico y/o preventivo en el metabolismo óseo anormal.
4. Producción de anticuerpo anti-Siglec-15
El anticuerpo contra Siglec-15 desvelado en el presente documento puede obtenerse inmunizando un animal con Siglec-15 o un polipéptido arbitrario seleccionado de la secuencia de aminoácidos de Siglec-15, y recogiendo y purificando el anticuerpo producido in vivo de acuerdo con un procedimiento convencional. Las especies biológicas de Siglec-15 a emplear como antígeno no están limitadas a humano, y un animal puede inmunizarse con Siglec-15 derivado de un animal distinto de un ser humano, tal como un ratón o rata. En este caso, al examinar la reactividad cruzada entre un anticuerpo que se une a los Siglec-15 heterólogo y Siglec-15 humano obtenidos, puede seleccionarse un anticuerpo aplicable a una enfermedad en el ser humano.
Además, puede obtenerse un anticuerpo monoclonal fusionando células productoras de anticuerpo que producen un anticuerpo frente a Siglec-15 con células de mieloma para establecer un hibridoma, de acuerdo con un procedimiento conocido (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, (1975) 256, págs. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, págs. 365-367; Prenum Press, N.Y. (1980)).
El Siglec-15 para su uso como antígeno puede obtenerse mediante ingeniería genética para hacer que la célula hospedadora exprese el gen de Siglec-15.
Específicamente, la ingeniería genética puede llevarse a cabo del modo siguiente. Se produce un vector capaz de expresar el gen de Siglec-15, y el vector resultante se transfecta en una célula hospedadora para expresar el gen, y, después, se purifica la Siglec-15 expresada. A continuación, se describirá específicamente un procedimiento para obtener un anticuerpo contra Siglec-15.
(1) Preparación del antígeno
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Los ejemplos del antígeno a usar para producir el anticuerpo anti-Siglec-15 incluyen Siglec-15, un polipéptido compuesto de una secuencia parcial de aminoácidos que consiste en al menos 6 restos de aminoácidos consecutivos de Siglec-15, y un derivado obtenido añadiendo una secuencia de aminoácidos dada o transportador al mismo. Además, en la sección "3. Procedimiento para explorar sustancias que inhiben la diferenciación en osteoclastos", la Siglec-15 ejemplificada como diana para exploración también puede ejemplificarse como antígeno a usar para producir el anticuerpo anti-Siglec-15.
Siglec-15 puede usarse después de purificarla directamente de tejidos tumorales humanos o células tumorales. Además, puede obtenerse Siglec-15 sintetizándola in vitro o haciendo que una célula hospedadora lo produzca por ingeniería genética.
En la ingeniería genética, específicamente, el ADNc de Siglec-15 se integra en un vector capaz de expresar ADNc de Siglec-15 y se sintetiza Siglec-15 en una solución que contiene enzimas, sustratos, y sustancias energéticas necesarias para la transcripción y traducción, o se transforma otra célula hospedadora procariota o eucariota para expresar Siglec-15, mediante lo que puede obtenerse el antígeno.
Además, también puede obtenerse el antígeno como una proteína secretada mediante la expresión de una proteína de fusión obtenida ligando el dominio extracelular de Siglec-15, que es una proteína de membrana, a la región constante del anticuerpo en un sistema de hospedador-vector adecuado.
El ADNc de Siglec-15 puede obtenerse, por ejemplo, mediante un procedimiento denominado PCR en el que se efectúa una reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo citada como "PCR") usando una biblioteca de ADNc que expresa ADNc de Siglec-15 como patrón y cebadores que amplifican específicamente ADNc de Siglec-15 (véase Saiki, R. K., y col., Science, (1988) 239, págs. 487-489).
Como sistema de síntesis in vitro del polipéptido, por ejemplo, puede ejemplificarse el sistema Rapid Translation System (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc., pero no está limitado a éste.
Los ejemplos del hospedador procariota incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Para transformar la célula hospedadora con un gen diana, se transforma la célula hospedadora usando un vector plasmídico que contiene un replicón, es decir, un origen de replicación derivado de una especie compatible con el hospedador, y una secuencia reguladora. Además, el vector tiene preferentemente una secuencia capaz de imponer selectividad fenotípica en la célula transformada.
Los ejemplos de la célula hospedadora eucariota incluyen células de vertebrado, células de insecto, y células de levadura. Como células cultivadas, por ejemplo, se usan frecuentemente cepas deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl.. Acad. Sci. USA (1980) 77, págs. 4126-4220) de células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, págs. 175-182; ATCC CRL-1650), fibroblastos NIH3T3 murinos (ATCC Nº: CLR1658), y células de ovario de cáncer chino (células CHO; ATCC: CCL-61) y similares, sin embargo, no están limitadas a estas.
El transformante obtenido de este modo puede cultivarse de acuerdo a un procedimiento común, y mediante el cultivo del transformante, se produce intracelularmente o extracelularmente un polipéptido diana.
Puede seleccionarse un medio a usar adecuado para el cultivo entre varios medios de cultivo usados de manera común dependiendo de la célula hospedadora empleada. Si se emplea Escherichia coli, puede usarse un medio LB suplementado con un antibiótico, tal como ampicilina o IPMG, si es necesario.
Puede separarse y purificarse una proteína recombinante producida intracelularmente o extracelularmente por el cultivo del transformante mediante cualquiera de varios procedimientos de separación conocidos que utilizan una propiedad física o química de la proteína.
Los ejemplos específicos de procedimientos incluyen tratamiento con un precipitante común de proteínas, ultrafiltración, varios tipos de cromatografía líquida, tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, diálisis, y una combinación de las mismas.
Además, al unir seis restos de histidina a una proteína recombinante que se va a expresar, la proteína puede purificarse de manera eficaz con una columna de afinidad de níquel. Como alternativa, al unir la región Fc de IgG a una proteína recombinante que se va a expresar, la proteína puede purificarse de manera eficaz con una columna de proteína A.
Al combinar los procedimientos anteriormente mencionados, puede producirse fácilmente una gran cantidad de polipéptido diana con un alto rendimiento y una elevada pureza.
(2) Producción de anticuerpo monoclonal anti-Siglec-15
Los ejemplos del anticuerpo que se une específicamente a Siglec-15 incluyen un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a Siglec-15, y un procedimiento para obtener el anticuerpo es como se describe a continuación.
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La producción de un anticuerpo monoclonal requiere generalmente de las siguientes etapas operativas:
(a)
purificar un biopolímero a usar como antígeno;
(b)
preparar células productoras de anticuerpos inmunizando a un animal mediante inyección del antígeno, recogiendo la sangre, ensayando su titulación de anticuerpo y determinando cuando se debe reseccionar el bazo;
(c)
preparando células de mieloma (en lo sucesivo citado como "mieloma");
(d)
fusionar las células productoras de anticuerpo con el mieloma;
(e)
explorar un grupo de hibridomas que producen un anticuerpo diana;
(f)
dividir los hibridomas en clones de una sola célula (clonación);
(g)
opcionalmente, cultivar el hibridoma o criar a un animal con el hibridoma implantado para producir una gran cantidad de un anticuerpo monoclonal;
(h)
examinar la actividad biológica y la especificidad de unión del anticuerpo producido de este modo, o ensayar las mismas propiedades con un reactivo marcado; y similares.
A continuación, se describirá en detalle el procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal siguiendo las etapas anteriores, sin embargo, el procedimiento no está limitado a este, y, por ejemplo, pueden usarse células productoras de anticuerpo y mielomas distintos de células de bazo.
(a) Purificación de antígeno
Como antígeno, puede usarse Siglec-15 preparado mediante el procedimiento descrito anteriormente o un péptido parcial del mismo.
Además, también puede usarse como antígeno una fracción de membrana preparada a partir de células recombinantes que expresan Siglec-15 o las células recombinantes que expresan Siglec-15 en sí, y también un péptido parcial de la proteína de la invención sintetizada químicamente mediante un procedimiento conocido para los expertos en la materia.
(b) Preparación de células productoras de anticuerpo
El antígeno obtenido en la etapa (a) se mezcla con un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o con sulfato de potasio y aluminio, y la mezcla resultante se usa como inmunógeno para inmunizar a un animal experimental. Como animal experimenta, puede usarse sin problema cualquier animal usado en un procedimiento de producción de hibridoma conocido. Específicamente, por ejemplo, ratón, rata, una cabra, oveja, ganado, caballo o similares pueden usarse. Sin embargo, desde el punto de vista de la facilidad de biodisponibilidad de células de mieloma para fusionarlas con las células productoras de anticuerpos extraídas, se usan preferentemente ratones o ratas como animal a inmunizar.
Además, la raza de ratón o rata a usar no está particularmente limitada, y en el caso de ratones, por ejemplo, pueden usarse varias líneas, tales como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, y 129, y en el caso de ratas pueden usarse, por ejemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague Dawley, ACI, BN, Fischer y similares.
Estos ratones y ratas están comercialmente disponibles a través de criadores/distribuidores de animales experimentales, por ejemplo, CLEA Japan, Inc. y Charles River Laboratories Japan, Inc.
Entre estas, teniendo en consideración la compatibilidad de fusión con las células de mieloma descritas más adelante, se prefieren particularmente en el caso de ratones la raza BALB/c y en el caso de ratas, las líneas Wistar y Low.
Además, teniendo en consideración la homología antigénica entre seres humanos y ratones, también se prefiere usar un ratón que tenga una función biológica disminuida para eliminar autoanticuerpos, es decir, un ratón con una enfermedad autoinmunitaria.
La edad del ratón o rata en el momento de la inmunización es preferentemente de 5 a 12 semanas de edad, más preferentemente de 6 a 8 semanas de edad.
Para inmunizar a un animal con Siglec-15 o un recombinante de la misma, por ejemplo, se describe en detalle un procedimiento conocido en, por ejemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol . I. II. III.; Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964), o similares.
Entre estos procedimientos de inmunización, un procedimiento específico citado es, por ejemplo, del siguiente modo.
Es decir, en primer lugar, se administra a un animal una fracción de proteína de membrana que sirve como antígeno
o células a las que se hace expresar el antígeno por vía intradérmica o intraperitoneal.
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Sin embargo, la combinación de ambas rutas de administración se prefiere para aumentar la eficacia de la inmunización, y cuando se efectúa administración intradérmica en la primera mitad y administración intraperitoneal en la última mitad o solo en la última dosificación, puede aumentarse particularmente la eficacia de la inmunización.
La pauta de administración del antígeno varía dependiendo del tipo de animal a inmunizar, de diferencias individuales o similares. Sin embargo, en general, la frecuencia de administración del antígeno es preferentemente de 3 a 6 veces, más preferentemente de 3 a 4 veces, y el intervalo de dosificación es preferentemente de 2 a 6 semanas, más preferentemente de 2 a 4 semanas.
Además, la dosis del antígeno varía dependiendo del tipo de animal a inmunizar, de diferencias individuales o similares. Sin embargo, la dosis se ajusta generalmente a de 0,05 a 5 mg, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,5 mg.
Se efectúa una inmunización de refuerzo de 1 a 6 semanas, preferentemente de 2 a 4 semanas, más preferentemente de 2 a 3 semanas después de la administración del antígeno, tal como se ha descrito anteriormente.
La dosis del antígeno en el momento de efectuar la inmunización de refuerzo varía dependiendo del tipo o tamaño del animal, o similares, sin embargo, en el caso de un ratón, la dosis se ajusta generalmente a de 0,05 a 5 mg, preferentemente de 0,1 a 0,5 mg, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,2 mg.
Se retiran de manera aséptica células del bazo o linfocitos que incluyen células productoras de anticuerpos del animal después de 1 a 10 días, preferentemente de 2 a 5 días, más preferentemente de 2 a 3 días después de la inmunización de refuerzo.
En ese momento, se mide el título de anticuerpo, y si se usa un animal que tiene un título de anticuerpo suficientemente elevado como fuente de células productoras de anticuerpo, el procedimiento posterior puede llevarse a cabo más eficazmente.
El procedimiento para medir el título de anticuerpo para su uso en el presente documento incluye, por ejemplo, un procedimiento RIA y un procedimiento ELISA, pero no está limitado a estos.
Por ejemplo, se emplea un procedimiento ELISA, puede llevarse a cabo la medida del título de anticuerpo de acuerdo con los procedimientos descritos a continuación.
En primer lugar, se adsorbe un antígeno purificado o parcialmente purificado sobre la superficie de una fase sólida, tal como una placa de 96 pocillos para ELISA, y la superficie de la fase sólida que no tiene antígeno adsorbido se cubre con una proteína no relacionada con el antígeno, tal como albúmina de suero bovina (en lo sucesivo citada como "BSA"). Después de lavar la superficie, ésta se pone en contacto con una muestra diluida en serie (por ejemplo, suero de ratón) como anticuerpo primario para permitir que el anticuerpo contenido en la muestra se una al antígeno.
Además, como anticuerpo secundario, se añade un anticuerpo marcado con una enzima contra un anticuerpo de ratón y se deja unir al anticuerpo de ratón. Después de lavar, se añade una sustancia para la enzima y se mide el cabio en la absorbancia que sucede debido al revelado del color inducido por la degradación del sustrato o similares para calcular el título de anticuerpo.
La separación de las células productoras de anticuerpo de las células del bazo o linfocitos puede llevarse a cabo de acuerdo con un procedimiento conocido (por ejemplo, Kohler y col., Nature (1975), 256, pág. 495; Kohler y col., Eur.
J. Immunol. (1977), 6, pág. 511; Milstein y col., Nature (1977), 266, pág. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495).
Por ejemplo, en el caso de células de bazo, puede emplearse un procedimiento general en el que las células productoras de anticuerpo se separan homogenizando el bazo para obtener células mediante filtración con un tamiz de acero inoxidable y suspendiendo las células en medio esencial mínimo de Eagle (MEM).
(c) Preparación de células de mieloma (en lo sucesivo citadas como "mieloma")
Las células de mieloma a usar para la fusión celular no están particularmente limitadas y las células adecuadas pueden seleccionarse de líneas celulares conocidas. Sin embargo, teniendo en consideración la conveniencia cuando un hibridoma se selecciona de células fusionadas, se prefiere usar una cepa defectuosa en HGPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa) cuyo procedimiento de selección se haya establecido.
Más específicamente, los ejemplos de cepa defectuosa en HGPRT incluyen X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), F0, S149/5XXO y BU.1 derivadas de ratones, 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) derivada de ratas; y U266AR(SKO-007), GM1500.GTGA12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) y 8226AR/NIP4-1(NP41) derivadas de seres humanos.
Estas cepas defectuosas en HGPRT están disponibles de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) o similares.
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32A1", y el anticuerpo producido por el hibridoma Nº 41B1 se representa como "anticuerpo Nº 41B1" o simplemente como "Nº 41B1". Además, los anticuerpos obtenidos en los Ejemplos de la presente descripción que forman el hibridoma Nº 32A1 y el hibridoma Nº 41B1 también se representan por los nombres de anticuerpos del mismo modo.
(g) Preparación de anticuerpo monoclonal cultivando hibridoma
Mediante el cultivo del hibridoma seleccionado de este modo, puede obtenerse un anticuerpo monoclonal de manera eficiente. Sin embargo, antes del cultivo, se prefiere efectuar una exploración de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal diana.
En la exploración, puede emplearse un procedimiento conocido.
La medición del título de anticuerpo en la invención puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, un procedimiento ELISA explicado en el artículo (b) descrito anteriormente.
El hibridoma obtenido mediante el procedimiento tal como se describe anteriormente puede almacenarse en estado congelado en nitrógeno líquido o en un congelador a -80 °C o menos.
Después de completar la clonación, se cambia el medio de un medio HT a un medio normal, y se cultiva el hibridoma.
Se efectúa un cultivo a gran escala mediante cultivo rotatorio usando una botella grande de cultivo o mediante cultivo rotativo.
Del sobrenadante obtenido por el cultivo a gran escala, puede obtenerse un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína desvelada en el presente documento mediante purificación usando un procedimiento conocido para los expertos en la materia, tal como filtración en gel.
Además, se inyecta el hibridoma en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma (por ejemplo, el BALB/c anteriormente mencionado) o en un ratón Nu/Nu para proliferar el hibridoma, mediante lo que puede obtenerse la ascitis que contiene una gran cantidad del anticuerpo monoclonal desvelado en el presente documento.
En el caso donde el hibridoma se administra en la cavidad abdominal, si se administra un aceite mineral, tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristine) de 3 a 7 días antes de este, puede obtenerse una cantidad mayor de la ascitis.
Por ejemplo, se inyecta previamente un inmunosupresor en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma para inactivar a los linfocitos T. 20 días después, se suspenden de 106 a 107 células clones de hibridoma en un medio sin suero (0,5 ml), y se inyecta la suspensión en la cavidad abdominal del ratón. En general, cuando se expande el abdomen y se llena con la ascitis, se recoge la ascitis.
Mediante este procedimiento, puede obtenerse el anticuerpo monoclonal a una concentración aproximadamente 100 veces mayor que la de la solución de cultivo.
El anticuerpo monoclonal obtenido mediante el procedimiento anteriormente mencionado puede purificarse mediante el procedimiento descrito en, por ejemplo, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
Es decir, los ejemplos del procedimiento incluyen un procedimiento de precipitación por sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de afinidad.
Como un procedimiento de purificación sencillo, puede usarse un kit de purificación de anticuerpo monoclonal comercialmente disponible (por ejemplo, el kit MAbTrap GII fabricado por Pharmacia, Inc.) o similares.
El anticuerpo monoclonal obtenido de este modo tiene una elevada especificada antigénica por Siglec-15.
(h) Ensayo de anticuerpo monoclonal
El isotipo y subclase del anticuerpo monoclonal obtenido de este modo puede determinarse del modo siguiente.
En primer lugar, los ejemplos del procedimiento de identificación incluyen el procedimiento de Ouchterlony, un procedimiento ELISA y un procedimiento RIA.
El procedimiento de Ouchterlony es sencillo, pero cuando la concentración del anticuerpo monoclonal es baja, se necesita una operación de condensación.
Por otra parte, cuando se emplea un procedimiento ELISA o un procedimiento RIA, haciendo reaccionar directamente el sobrenadante de cultivo con una fase sólida con antígeno adsorbido y usando anticuerpos
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correspondientes a varios tipos de isotipos y subclases de inmunoglobulina como anticuerpos secundarios, puede identificarse el isotipo y subclase del anticuerpo monoclonal.
Además, como procedimiento más sencillo, puede usarse un kit de identificación comercialmente disponible (por ejemplo, el kit Mouse Typer fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) o similares.
Además, puede efectuarse una determinación cuantitativa de una proteína mediante el procedimiento de Folin Lowry y un procedimiento de cálculo basado en la absorbancia a 280 nm [1,4 (DO 280) = 1 mg/ml de inmunoglobulina].
(3) Otros anticuerpos
El anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo recombinante obtenido mediante modificación artificial con el fin de disminuir la antigenicidad heteróloga a humanos, tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. Estos anticuerpos pueden producirse usando un procedimiento conocido.
Como anticuerpo quimérico, sirve como ejemplo un anticuerpo en el que las regiones variable y constante de anticuerpo se derivan de diferentes especies, por ejemplo, un anticuerpo quimérico en el que una región variable de anticuerpo derivada de ratón se conecta a una región constante derivada de ser humano (véase Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81, 6851-6855, (1984)).
Como anticuerpo humanizado, sirve como ejemplo un anticuerpo obtenido integrando solo una región determinante de la complementariedad (CDR) en un anticuerpo derivado de ser humano (véase Nature (1986) 321, págs. 522525), y un anticuerpo obtenido injertando una parte de los restos de aminoácidos del armazón así como la secuencia de CDR en un anticuerpo humano o mediante un procedimiento de injerto de CDR (documento WO 90/07861).
Además, el anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo humano. Un anticuerpo humano anti-Siglec-15 se refiere a un anticuerpo humano que tiene solo una secuencia génica de un anticuerpo derivada de un cromosoma humano. El anticuerpo humano anti-Siglec-15 puede obtenerse mediante un procedimiento usando un ratón que produce anticuerpos humanos que tiene un fragmento de cromosoma humano que contiene los genes de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. y col., Nature Genetics (1997) 16, págs. 133-143; Kuroiwa, Y. y col., Nuc. Acids Res. (1998) 26, págs. 3447-3448; Yoshida, H. y col., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, págs. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. y Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, págs. 722-727; etc.).
Dicho animal transgénico puede crearse específicamente del modo siguiente. Se crea un animal genéticamente modificado en el que se han eliminado los locus génicos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina endógenas de mamífero no humano, y en su lugar, se han introducido los locus génicos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana a través de un vector de cromosoma artificial de levadura (YAC) o similar produciendo un animal knockout y un animal transgénico y emparejando a estos animales.
Además, de acuerdo con una técnica de ingeniería genética, usando ADNc que codifican dichas cadenas ligera y pesada de un anticuerpo humano, respectivamente, preferentemente un vector que contiene los ADNc, se transforman células eucariotas, y se cultiva un transformante que produce un anticuerpo monoclonal humano recombinante, por lo que también puede obtenerse el anticuerpo a partir del sobrenadante de cultivo.
En el presente documento, como hospedador, por ejemplo, pueden usarse células eucariotas, preferentemente células de mamífero, tales como células CHO, linfocitos o células de mieloma.
Además, también se conoce un procedimiento para obtener un anticuerpo humano derivado de una presentación en fagos explorado a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase Wormstone, I. M. y col., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), págs. 2301-2308; Carmen, S. y col., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), págs. 189-203; Siriwardena, D. y col., Opthalmology (2002) 109 (3), págs. 427-431; etc.).
Por ejemplo, puede usarse un procedimiento de presentación en fatos en el que una región variable de un anticuerpo humano se expresa sobre la superficie de un fago como un anticuerpo monocatenario (scFv), y se selecciona un fato que se une a un antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), págs. 1105-1116).
Mediante el análisis del gen del fago seleccionado basándose en la unión a un antígeno, puede determinarse la secuencia de ADN que codifica la región variable de un anticuerpo humano que se une a un antígeno.
Si se determina la secuencia de ADN de un scFv que se une a un antígeno, puede obtenerse un anticuerpo humano preparando un vector de expresión que tiene la secuencia e introduciendo el vector en un hospedador adecuado para expresarlo (documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, págs. 433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), págs. 1105-1116).
En el caso donde se produce un anticuerpo aislando una vez un gen de anticuerpo y después introduciendo el gen en un hospedador adecuado, puede usarse una combinación adecuada de hospedador y vector de expresión.
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En el caso donde se usan células eucariotas como hospedador, pueden usarse células animales, células vegetales y microorganismos eucariotas.
Como células animales, sirven de ejemplo células de mamífero, por ejemplo, cepas deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, págs. 4126-4220) de células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, págs. 175-182; ATCC CRL-1650), fibroblastos NIH3T3 murinos (ATCC Nº: CLR1658), y células de ovario de cáncer chino (células CHO; ATCC: CCL-61).
En los casos donde se usan células procariotas, por ejemplo, sirven de ejemplo Escherichia coli y Bacillus subtilis.
Al introducir un gen de un anticuerpo diana en estas células mediante transformación, y cultivar las células transformadas de este modo in vitro, puede obtenerse el anticuerpo.
No hay limitación en cuanto al isotipo del anticuerpo de la invención, y los ejemplos del mismo incluyen IgG (IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD e IgE, y los ejemplos preferidos del mismo incluyen IgG e IgM.
Además, el anticuerpo desvelado en el presente documento puede ser un fragmento funcional del anticuerpo que tiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo o un fragmento modificado del mismo. El fragmento del anticuerpo puede obtenerse tratando al anticuerpo con una proteasa, tal como papaína o pepsina, o modificando el gen de anticuerpo de acuerdo con una técnica de ingeniería genética y expresando el gen modificado en células cultivadas adecuadas. Entre estos fragmentos de anticuerpo, un fragmento que tenga la totalidad o parte de las funciones de la molécula de longitud completa del anticuerpo puede denominarse fragmento funcional del anticuerpo. Los fragmentos funcionales de la invención tienen la función de inhibir la formación de osteoclastos y/o la resorción ósea osteoclástica. En cuanto a las otras funciones del anticuerpo, sirven generalmente de ejemplo una actividad de unión a antígeno, una actividad de neutralizar la actividad de un antígeno, una actividad de aumentar la actividad de un antígeno, una actividad citotóxica dependiente de anticuerpo, una actividad citotóxica dependiente de complemento, y una actividad citotóxica celular dependiente de complemento. La función del fragmento funcional del anticuerpo de acuerdo con la invención es preferentemente una actividad de inhibición de la formación de osteoclastos, más preferentemente, una actividad de inhibir el proceso de fusión de osteoclastos. Los ejemplos del fragmento de anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv, Fv monocatenario (scFv) en el que las moléculas de la cadena pesada y de la cadena ligera están ligadas a través de un enlazador adecuado, un diacuerpo (diacuerpos), un anticuerpo lineal, y un anticuerpo poliespecífico compuesto del fragmento de anticuerpo. Además, Fab', que es un fragmento monovalente en una región variable de un anticuerpo obtenido tratando F(ab')2 en condiciones reductoras también está incluido en el fragmento de anticuerpo.
Además, el anticuerpo desvelado en el presente documento puede ser un anticuerpo poliespecífico con especificidad por al menos dos antígenos diferentes.
En general, dicha molécula se une a dos antígenos (es decir, anticuerpo biespecífico), sin embargo, el "anticuerpo poliespecífico", tal como se usa en el presente documento incluye un anticuerpo que tiene especificidad por dos o más (por ejemplo, tres) antígenos.
El anticuerpo desvelado en el presente documento puede ser un anticuerpo poliespecífico compuesto de un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de dicho anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo biespecífico F(ab')2). El anticuerpo biespecífico puede producirse ligando las cadenas ligera y pesada (pares HL) de dos tipos de anticuerpos, o también pueden producirse fusionando hibridomas que producen diferentes anticuerpos monoclonales para preparar células fusionadas que producen el anticuerpo biespecífico (Millstein y col., Nature (1983) 305, págs. 537-539).
El anticuerpo desvelado en el presente documento puede ser un anticuerpo monocatenario (también citado como scFv). El anticuerpo monocatenario puede obtenerse ligando las regiones V de la cadena ligera y de la cadena pesada del anticuerpo mediante un enlazador polipeptídico (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Editado por Rosenburg y Moore, Springer Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, págs. 1126-1136). Además, también puede usarse un fragmento BiscFv producido ligando dos moléculas scFv mediante un enlazador polipeptídico como anticuerpo biespecífico.
Se conoce en este campo técnico un procedimiento para producir un anticuerpo monocatenario (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nº 4.946.778, 5.260.203, 5.091.513, 5.455.030, etc.). En este scFv, las regiones V de la cadena pesada y de la cadena ligera se ligan mediante un enlazador que no forma un conjugado, preferentemente mediante un enlazador polipeptídico (Huston, J. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, págs. 5879-5883). En los scFv, las regiones V de la cadena pesada y de la cadena ligera pueden derivarse del mismo anticuerpo o de anticuerpos distintos. Como enlazador polipeptídico a usar para ligar las regiones V, por ejemplo, se usa un péptido monocatenario dado compuesto de 12 a 19 restos.
El ADN que codifica al scFv puede obtenerse efectuando amplificación usando un ADN parcial que codifica una secuencia completa o una deseada de un ADN seleccionado de un ADN que codifica la cadena pesada o la región V de la cadena pesada del anticuerpo anteriormente mencionado y un ADN que codifica la cadena ligera o la región V de la cadena ligera del mismo como molde mediante un procedimiento PCR usando un par de cebadores que define
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ambos extremos del mismo, y efectuar adicionalmente amplificación combinando un ADN que codifica una porción de enlazante polipeptídico y un par de cebadores que define ambos extremos del mismo para ligar ambos extremos a la cadena pesada y a la cadena ligera, respectivamente.
Además, una vez se ha producido el ADN que codifica el scFv, puede obtenerse un vector de expresión que contiene al mismo y transformarse un hospedador mediante el vector de expresión de acuerdo con un procedimiento común. Además, mediante el uso del hospedador resultante, puede obtenerse el scFv de acuerdo con un procedimiento común.
Puede producirse un fragmento de anticuerpo del mismo en un hospedador obteniendo un gen y expresando el gen del mismo modo descrito anteriormente.
El anticuerpo desvelado en el presente documento puede multimerizarse para aumentar la afinidad por un antígeno. El anticuerpo a multimerizar puede ser un tipo de anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos que reconocen una pluralidad de epítopos del mismo antígeno. Como procedimiento de multimerización del anticuerpo, la unión del dominio CH3 de IgG a dos moléculas scFv, unión a estreptavidina, introducción de un motivo hélice-bucle-hélice y similares sirven como ejemplos.
El anticuerpo desvelado en el presente documento puede ser un anticuerpo policlonal que es una mezcla de diversos tipos de anticuerpos anti-Siglec-15 que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. Como ejemplo del anticuerpo policlonal, sirve de ejemplo una mezcla de varios tipos de anticuerpos que tienen diferentes CDR. Como dicho anticuerpo policlonal, se cultiva una mezcla de células que producen diferentes anticuerpos, y puede usarse un anticuerpo purificado a partir del cultivo resultante (véase el documento WO 2004/061104).
Como anticuerpo modificado, también puede usarse un anticuerpo unido a cualquiera de varios tipos de moléculas, tales como polietilenglicol (PEG).
Además, el anticuerpo desvelado en el presente documento puede estar en forma de un conjugado formado entre cualquiera de estos anticuerpos y otro agente medicinal (inmunoconjugado). Los ejemplos de dicho anticuerpo incluyen uno en el que el anticuerpo está conjugado a un material radiactivo o a un compuesto que tiene una acción farmacológica (Nature Biotechnology (2005) 23, págs. 1137-1146).
El anticuerpo obtenido puede purificarse hasta la homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo puede efectuarse empleando un procedimiento de separación y purificación de proteínas convencional.
Por ejemplo, el anticuerpo puede separarse y purificarse seleccionando y combinando de manera adecuada el uso de una columna de cromatografía, filtrado, ultrafiltración, precipitación de sal, diálisis, electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida, electroforesis de focalización isoeléctrica, y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak y col. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero el procedimiento no está limitado a esto.
Los ejemplos de cromatografía incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en fase inversa, y cromatografía de adsorción.
Dicha cromatografía puede efectuarse empleando cromatografía líquida, tal como HPLC o FPLC.
Como columna para su uso en la cromatografía de afinidad, sirven como ejemplo una columna de proteína A y una columna de proteína G.
Por ejemplo, como columna que usa una columna de proteína A, sirven como ejemplos Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) y similares.
Además, mediante el uso de un vehículo que tiene un antígeno inmovilizado sobre este, también puede purificarse el anticuerpo utilizando la propiedad de unión del anticuerpo al antígeno.
5. Medicina que contiene anticuerpo anti-Siglec-15
A partir de los anticuerpos anti-Siglec-15 obtenidos mediante el procedimiento descrito en el apartado anterior "4. Producción de anticuerpo anti-Siglec-15", puede obtenerse un anticuerpo que neutraliza la actividad biológica de Siglec-15. Dicho anticuerpo que neutraliza la actividad biológica de Siglec-15 inhibe la actividad biológica de Siglec15 in vivo, es decir, la diferenciación y/o maduración de osteoclastos, y por lo tanto puede usarse como un agente terapéutico y/o preventivo para el metabolismo óseo anormal causado por una diferenciación y/o maduración anormal de los osteoclastos, como una medicina. El metabolismo óseo anormal es un trastorno caracterizado por una pérdida neta de hueso (osteopenia u osteolisis). En general, el tratamiento y/o prevención mediante el anticuerpo anti-Siglec-15 se aplica a un caso donde se necesita la inhibición de la resorción ósea. El metabolismo óseo anormal que puede tratarse y/o prevenirse mediante el anticuerpo anti-Siglec-15 es uno de los siguientes: osteoporosis (osteoporosis postmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debida al uso de un
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