ES2543385T3 - Especies de levadura genéticamente modificadas y procesos de fermentación que emplean levaduras genéticamente modificadas - Google Patents

Especies de levadura genéticamente modificadas y procesos de fermentación que emplean levaduras genéticamente modificadas Download PDF

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Chris Miller
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Abstract

Una célula de levadura que tiene un gen de xilosa isomerasa exógeno que es al menos 80% homólogo con la SEC ID Nº 151 pero no más de 95% homólogo con la SEC ID Nº 58 o que produce una enzima que es al menos 80% homóloga con la SEC ID Nº 152, pero no más de 95% homóloga con la SEC ID Nº 59.

Description

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(glucosa), fructosa, oligómeros de glucosa, tales como maltosa, maltotriosa e isomaltotriosa, y panosa. En el caso de los azúcares oligoméricos puede resultar necesario añadir enzimas al caldo de fermentación para digerirlos para producir el correspondiente azúcar monomérico.
El medio contendrá generalmente los nutrientes requeridos por la célula concreta, que incluyen una fuente de nitrógeno (tal como aminoácidos, proteínas, fuentes de nitrógeno inorgánico, tal como amoniaco o sales de amonio, y similares), y diversas vitaminas, minerales y similares.
No se considera que otras condiciones de fermentación, tales como la temperatura, la densidad celular, la selección del sustrato o sustratos, la selección de nutrientes y similares, sean críticas para la invención, y en general se seleccionan para proporcionar un proceso barato. Las temperaturas durante la fase de crecimiento y durante la fase de producción pueden variar desde por encima de la temperatura de congelación del medio a aproximadamente 50 ºC, aunque la temperatura óptima dependerá de alguna manera del microorganismo concreto. Una temperatura preferida, en particular durante la fase de producción, es de aproximadamente 30-45 ºC. Cuando la célula es una K. marxianus modificada puede tolerar unas temperaturas relativamente altas (tales como mayores que 40 ºC y hasta 50 ºC, en especial hasta 45 ºC). Otra especie preferida de célula, C. sonorensis, puede tolerar temperaturas de hasta aproximadamente 40 ºC. Este intervalo de temperatura proporciona la posibilidad de realizar la fermentación a estas temperaturas altas (reduciendo así los costes de enfriamiento) sin una pérdida significativa de productividad. Otra ventaja que proporciona una buena tolerancia a altas temperaturas es que si la fermentación resulta contaminada por un microorganismo no deseado, en muchos casos el microorganismo no deseado pueden destruirse de modo selectivo calentando el medio de fermentación hasta 40 ºC o más, en especial 45 ºC o más, sin dañar significativamente las células deseadas de la invención.
Durante la fase de producción, la concentración de células en el medio de fermentación generalmente está en el intervalo de aproximadamente 1-150, preferiblemente de aproximadamente 3-10, aún más preferiblemente de aproximadamente 3-6 g de células secas/litro de medio de fermentación.
La fermentación puede realizarse de forma aerobia, microaerobia, o anaerobia. Si se desea, la velocidad de captación de oxígeno específica puede utilizarse como control del proceso, según se describe en el documento WO 03/102200. Una ventaja de la invención es que la célula genéticamente modificada en general fermentará la xilosa de modo anaerobio debido a la expresión del gen XI y otras modificaciones.
Cuando el producto de la fermentación es un ácido, el medio puede tamponarse durante la fase de producción de la fermentación, de modo que se mantiene el pH en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0, preferiblemente de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0. Los agentes tamponantes adecuados son materiales básicos que neutralizan el ácido láctico a medida que se forma e incluyen, por ejemplo, hidróxido de calcio, carbonato de calcio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de potasio, carbonato de sodio, carbonato de amonio, amoniaco, hidróxido de amonio y similares. En general, los agentes tamponantes que se han estado utilizando en los procesos de fermentación convencionales también resultan adecuados en la presente. Sin embargo, se encuentra dentro del alcance de la invención permitir que el pH del medio de fermentación disminuya desde un pH inicial que generalmente es de 6 o mayor, hasta por debajo del pKa del producto de la fermentación ácido, tal como en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o en el intervalo de aproximadamente 2,8 a aproximadamente 4,5.
En una fermentación tamponada, los productos de la fermentación ácidos, tales como el ácido láctico, son neutralizados a medida que se forman en la correspondiente sal lactato. Por tanto, la recuperación del ácido implica la regeneración del ácido libre. Esto se realiza generalmente retirando las células y acidulando el caldo de fermentación con un ácido fuerte, tal como ácido sulfúrico. Se forma un subproducto salino (yeso en el caso en que una sal de calcio es el agente neutralizante, y el ácido sulfúrico es el agente acidulante), que se separa del ácido. Entonces se recupera el ácido mediante técnicas, tales como una extracción líquido-líquido, una destilación, una absorción, etc., como se describe en T.B. Vickroy, vol. 3, capítulo 38 de Comprehensive Biotechnology (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16:221-231; patentes de EEUU nº 4.275.234, 4.771.001, 5.132.456, 5.420.304, 5.510.526, 5.641.406, y 5.831.122, y el documento WO 93/00440.
El proceso de la invención puede realizarse de modo continuo, discontinuo, o en combinaciones de estos.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, pero no pretenden limitar su alcance. Los ejemplos 7-14 y 16-18 no están comprendidos en la invención. Todas las partes y porcentajes son en peso a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1A: Construcción del plásmido que contiene el promotor de PGK1 de S. cerevisiae y el terminador Gal10 de S. cerevisiae (pNC2, figura 1); construcción del plásmido que contiene el promotor de PDC1 de S. cerevisiae y el terminador Gal10 de S. cerevisiae (pNC4, figura 2)
La secuencia de nucleótidos del promotor de PGK1 de S. cerevisiae (ScPGK1) se identifica como SEC ID NO:1. Esta secuencia se obtiene como un fragmento de restricción a partir de un plásmido patentado denominado pBFY004. Como alternativa, puede obtenerse mediante una amplificación con PCR utilizando el ADN cromosómico
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de S. cerevisiae como molde, y cebadores diseñados basados en SEC ID NO:1.
El terminador GAL10 de S. cerevisiae (ScGAL10) utilizado tiene la secuencia de nucleótidos identificada como SEC ID NO:2. Esta secuencia se obtiene como un fragmento de restricción a partir de un plásmido patentado denominado pBFY004. Como alternativa, puede obtenerse mediante una amplificación con PCR utilizando el ADN cromosómico de S. cerevisiae como molde, y cebadores diseñados basados en SEC ID NO:2.
El promotor de PDC1 de S. cerevisiae (ScPDC1) se amplificó con PCR utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:3 y SEC ID NO:4, utilizando el ADN cromosómico de la cepa GY5098 de S. cerevisiae (ATCC 4005098) como molde. El termociclado se realizó con 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 56 ºC, y 1 minuto a 72 ºC, seguido de una incubación final de 7 minutos a 72 ºC, utilizando la ADN polimerasa PfuTurbo (Stratagene, Madison, WI). La secuencia de nucleótidos del promotor ScPDC1 se identifica como SEC ID NO:5.
Se generó el plásmido pNC2 (figura 1) combinando el promotor ScPGK1 y el terminador ScGal10 sobre el vector de esqueleto pGEM5Z(+) (Promega, Wisconsin). El ScPGK1 y el ScGAL10 están separados en el vector resultante por una región de policonector con los sitios de restricción XbaI, EcoRI y BamHI para insertar genes concretos para ser expresados entre el promotor y el terminador de levadura. Un fragmento de restricción NotI de aproximadamente 1,2 kpb formado por el promotor ScPGK1 y el terminador ScGAL10 con sitios de multiclonación se identifica como SEC ID NO:6.
Se construyó el vector de expresión pNC4 que contiene un módulo de expresión en general de la misma manera, excepto que se utilizó el gen ScPDC1 en lugar del gen ScPGK1. El vector resultante (pNC4) se muestra en la figura
2. Un fragmento de restricción NotI de aproximadamente 1,3 kpb formado por el promotor ScPDC1 y el terminador ScGAL10 con sitios de multiclonación se identifica como SEC ID NO:7.
Ejemplo 1B: Inserción de un gen marcador de resistencia a G418 en pNC2 (ejemplo 1A, figura 1) para crear un plásmido en el que el gen G418 está unido operablemente con el promotor de PGK1 y el terminador ScGAL10 de S. cerevisiae (pVR22, figura 3)
El gen de resistencia a G418 se amplificó mediante PCR utilizando la polimerasa Pfu (Stratagene, Madison, WI) con los cebadores identificados como SEC ID NO:8 y SEC ID NO:9, utilizando el plásmido pPIC9K (Invitrogen, CA) como molde. El termociclado se realizó inicialmente incubando la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 49 ºC, y 2 minutos a 72 ºC, seguido de una incubación final durante 10 minutos a 72 ºC. El producto de la PCR se digirió con BamHI y XbaI, y se aisló un fragmento de 821 pb y se acopló a un fragmento BamHI-XbaI de aproximadamente 4303 pb de pNC2 (ejemplo 1A, figura 1). El plásmido resultante (pVR22, figura 3) tiene el promotor ScPGK1 y el terminador ScGAL10 unidos operablemente al gen de resistencia a G418.
Ejemplo 1C: Inserción de un gen marcador de resistencia a G418 en pNC4 (ejemplo 1A, figura 2) para crear un plásmido en el que el gen G418 está unido operablemente al promotor de PDC1 y al terminador ScGAL10 de S. cerevisiae (pVR29, figura 4)
El gen de resistencia a G418 se amplificó mediante PCR utilizando la polimerasa Pfu (Stratagene, Madison, WI) con los cebadores identificados como SEC ID NO:8 y SEC ID NO:9, utilizando el plásmido pVR22 (ejemplo 1B, figura 3) como molde. El termociclado se realizó inicialmente incubando la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 49 ºC, y 2 minutos a 72 ºC, seguido de una incubación final durante 10 minutos a 72 ºC. El producto de la PCR se digirió con BamHI y XbaI, y se aisló un fragmento de 821 pb y se acopló a un fragmento BamHI-XbaI de aproximadamente 4303 pb de pNC4 (ejemplo 1A, figura 2). El plásmido resultante, pVR29 (figura 4) contiene el promotor ScPDC1 y el terminador ScGAL10 unidos operablemente al gen de resistencia a G418.
Ejemplo 1D: Construcción de un vector (pBH5b, figura 5) que contiene las secuencias flanqueantes 5’ y 3’del gen PDC1 de K. marxianus, y el gen G418 bajo el control del promotor ScPDC1 y el terminador ScGAL10
Un fragmento de ADN de 1254 pb inmediatamente cadena arriba del gen PDC1 de K. marxianus (KmPDC1) se amplificó mediante PCR con los cebadores identificados como SEC ID NO:10 y SEC ID NO:11, utilizando el plásmido pSO21 (descrito en la solicitud de patente publicada de EEUU 2004/029256A1) como molde. El termociclado se realizó incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 2 minutos a 94 ºC, después con 35 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC, y 1,5 minutos a 72 ºC, seguido de una incubación final de 7 minutos a 72 ºC. El producto de la PCR se separó en un gel de agarosa al 0,8% y se aisló un producto de aproximadamente 1254 pb. El producto de la PCR y el plásmido pVR29 (ejemplo 1C, figura 4) se digirieron ambos con KpnI y SbfI, y se acoplaron para producir un vector de aproximadamente 6315 pb denominado pBH5a (figura 5). El plásmido pBH5a contiene el gen de resistencia a G418 unido operablemente al promotor ScPDC1 y al terminador ScGAL10, y un fragmento de ADN de aproximadamente 1240 pb homólogo al ADN inmediatamente cadena arriba del gen KmPDC1.
Un fragmento de ADN de 535 pb inmediatamente cadena abajo del gen KmPDC1 se amplificó mediante PCR con
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(Stratagene, Madison, WI). El producto de la PCR se separó electoforéticamente en un gel de agarosa al 0,8% y se aisló un fragmento de 1026 pb. El fragmento de 1026 pb entonces se digirió con XbaI y BamHI y se acopló en el fragmento XbaI-BamHI de pNC4 (ejemplo 1A, figura 2) que contenía el promotor ScPDC1 y el terminador ScGAL10 para producir el plásmido pPS1 (figura 8).
Ejemplo 1I: Construcción de un vector (pCM9, figura 9) que contenía la región flanqueante cadena arriba de KmPDC1, un sitio de multiclonación, un marcador de poli-his, un terminador ScCYC1 (todos de pCM3, ejemplo 1G, figura 7) y el gen de resistencia a la higromicina de E. coli bajo el control transcripcional del promotor ScPDC1 y del terminador ScGAL10 (de pSI1, ejemplo 1H, figura 8)
El plásmido pPS1 se digirió con SphI, y un fragmento de aproximadamente 2,2 kpb que contenía el gen hgh bajo el control del promotor ScPDC1 y del terminador ScGAL10 se acopló a pCM3 digerido con SphI. El plásmido resultante (pCM9, figura 9) contiene la región promotora KmPDC1, seguida de un unico sitio SbfI y del terminador ScCYC1 para la futura expresión del gen de la xilosa isomerasa. Además, este módulo para la expresión génica está colocado justo al lado de un fragmento de aproximadamente 2,2 kpb que contiene el gen hph bajo el control del promotor ScPDC1 y del terminador ScGAL10 para la selección de los transformantes en levaduras.
Ejemplo 2A: Reconstrucción del gen de la xilosa isomerasa de Piromyces sp. E2 (PXYLA) basada en la secuencia disponible en GenBank
El método utilizado para reconstruir el gen de la xilosa isomerasa de Piromyces sp. E2 (PXYLA) se adapta de “A method for synthesizing genes and cDNA’s by polymerase chain reaction”, de Alberto Di Donato et al., Analytical Biochemistry, 212, 291-293 (1993). Los cebadores purificados mediante PAGE se ordenan comenzando desde el centro del gen para ir reconstruyendo hacia afuera. Se mantienen los solapamientos de 14-16 pb para los conjuntos de cebadores. Cada cebador tiene una longitud de 60-70 pb. El gen se reconstruyó en 17 etapas.
El protocolo de PCR que se siguió durante este método emplea la ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen, CA), y su tampón y MgSO4 según indica el fabricante. La etapa 1 se realiza utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:20 y SEC ID NO:21. Estos cebadores representan el centro de la secuencia génica. No se necesita molde en la etapa 1, puesto que el apareamiento de los cebadores y su extensión formará el molde central sobre el cual se construirán las posteriores reacciones de PCR. El ciclado en la etapa 1 es de 20 ciclos a 94 ºC durante 1 minuto, 54 ºC durante 1 minuto, y 68 ºC durante 2 minutos (añadiéndose 5 segundos más a cada ciclo sucesivo), seguido de una conservación a 4 ºC.
En las etapas de reacción 2-17, se utilizó la ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen, CA), y su tampón y MgSO4 según indica el fabricante. Se emplearon 2,5 l de la mezcla de cada etapa como molde para cada etapa posterior (reacción de 50 l). Los conjuntos de cebadores para cada reacción se describen en la tabla 1. El molde en cada caso fue de 5 l de ADN de la etapa de reación anterior. El ciclado en las etapas 2-17 fue de 20 ciclos a 94 ºC durante 1 minuto, 46 ºC durante 1 minuto, y 68 ºC durante 2 minutos (añadiéndose 5 segundos más a cada ciclo sucesivo), seguido de una conservación a 4 ºC.
Tabla 1
Etapa de reacción nº
SEC ID NO:
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variables de la disolución enzimática, y se siguió la absorbancia a 340 nm. El uso del NADPH indica la actividad de la enzima reductasa. Se empleó una disolución de blanco sin xilosa para determinar la utilización de NADPH de fondo.
Se determinaron las proteínas totales utilizando el reactivo Advanced Protein Assay Reagent (Cytoskeleton nº ADV01) con BSA como patrón. La actividad de la enzima xilosa reductasa de la cepa CD683, según indica el consumo de NADPH, fue de 13,7 mU/mg de proteína. El consumo de NAPDH de la cepa CD804 es coherente con una actividad xilosa reductasa de 4,4 mU/mg de proteína, en lugar de la actividad cero esperada. Esta utilización de NADPH por CD804 se atribuye a una enzima aldosa reductasa no específica que está realizando alguna conversión de xilosa a xilulosa. Las cepas CD683 y CD804 se cultivan una junto a la otra en placas YPX. La cepa CD804 no mostró crecimiento en estas placas tras 4 días, mientras que la cepa CD683 creció sin problemas en estas placas.
Ejemplo 5A: Construcción del plásmido pVR67 (figura 16) que contiene un gen de xiluloquinasa de Saccharomyces cerevisiae (ScXKS1)
Se obtuvieron células de S. cerevisiae de the American Type Culture Collection (ATCC nº de registro 38626) y se cultivaron bajo condiciones convencionales. Se extrajo el ADN genómico de S. cerevisiae utilizando metodologías convencionales. Se realizaron reacciones de amplificación con PCR utilizando la polimerasa Pfx (Invitrogen, CA). Cada reacción contenía ADN genómico de S. cerevisiae a una concentración de 500 ng, cada uno de los cuatro dNTP (es decir, dATP, dGTP, dCTP y dTTP) a una concentración de 0,2 mM, y cada uno de los cebadores de la amplificación identificados como SEC ID NO:81 y SEC ID NO:82 a 1 M. El ciclado se realizó mediante una incubación inicial durante 10 minutos a 94 ºC, seguido de 35 ciclos que consisten en 15 segundos a 94 ºC, 15 segundos a 55 ºC, y 90 segundos a 68 ºC. Un fragmento de aproximadamente 1,8 kpb se purificó en gel utilizando procedimientos convencionales y se clonó en el vector de clonación TA (Invitrogen, CA). El plásmido resultante (pVR67, figura 16) se secuenció para verificar la secuencia del gen ScXKS1. El gen muestra una excelente homología con la secuencia conocida en GenBank (nº de registro X61377). La secuencia de nucleótidos del gen ScXKS1 se identifica como SEC ID NO:83. La secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por este gen se identifica como SEC ID NO:84.
Ejemplo 5B: Construcción del plásmido pVR52 (figura 16) que contiene el promotor de TEF1 de S. cerevisiae (ScTEF1) y el terminador ScGAL10
El promotor de TEF1 de S. cerevisiae (ScTEF1) se clonó del vector pTEFZeo (Invitrogen, CA). Se emplearon los cebadores identificados como SEC ID NO:85 y SEC ID NO:86 para amplificar el promotor ScTEF1 e insertar los sitios de restricción XbaI y SstI. El producto de la PCR y el plásmido pNC2 (ejemplo 1A, figura 1) se digirieron con las enzimas XbaI y SstI y se acoplaron para obtener el plásmido pVR52 (figura 16).
Ejemplo 5C: Construcción del plásmido pVR103 (figura 18) que contiene el gen ScXKS1 bajo el control del promotor ScTEF1 y del terminador ScGAL10
El plásmido pVR67 (ejemplo 5A, figura 16) se digirió con XbaI y BamHI. Un fragmento de aproximadamente 1,8 kpb que contiene el gen ScXKS1 se purificó en gel. El plásmido pVR52 (ejemplo 5B, figura 16) también se digirió con XbaI y BamHI, y el fragmento obtenido se acopló al fragmento de aproximadamente 1,8 kpb de pVR67 para formar el vector plasmídico pVR96 (figura 16). Este plásmido contiene el gen ScXKS1 bajo el control del promotor ScTEF1 y del terminador ScGAL10. En este vector, el sitio de inicio ATG del gen ScXKS1 está a aproximadamente 130 pb del final del promotor ScTEF1. Para reducir esta distancia a aproximadamente 70-73 pb se diseñaron los cebadores identificados como SEC ID NO:87 y SEC ID NO:88 que pudiesen amplificar el promotor ScTEF1 del vector pTEFzeo con la distancia y los sitios de restricción correctos. Se empleó pTEFzeo (Invitrogen, CA) como molde. El termociclado se realizó con 30 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 57 ºC, y 30 segundos a 72 ºC, seguido de una incubación final de 4 minutos a 72 ºC utilizando el sistema de PCR Failsafe (Epicentre, Madison, WI). El producto de la PCR se separó en un gel de agarosa al 0,8% y se aisló un fragmento de 460 pb. Se realizó una segunda PCR para amplificar este fragmento utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:89 y SEC ID NO:90. El producto de la PCR se digirió con EcoRI y se acopló al plásmido pVR96 digerido con EcoRI (figura 16). El plásmido resultante (pVR102, figura 17) tiene dos promotores ScTEF1, y el segundo es el que controla el gen ScXKS1. La distancia entre el final del promotor y el ATG del gen es exactamente de 73 pb. El plásmido pVR102 se digirió con SphI y se acopló al pPUC19 digerido con SphI (New England Biolabs, EEUU). El plásmido resultante (pVR103, figura 18) se secuenció para verificar el gen ScXKS1 bajo el control del promotor ScTEF1 y del terminador ScGAL10.
Ejemplo 5D: Construcción del plásmido pVR104 (figura 19) que contiene el módulo de expresión ScXKS1 (depVR103, ejemplo 5C) junto con el módulo HisG-ScUra3-HisG (de pVR65, ejemplo 3B)
El plásmido pVR65 (ejemplo 3B, figura 19) se digirió con SphI, y los extremos 5’-fosfato del vector linealizado se desfosforilaron utilizando fosfatasa alcalina de camarón (Roche Diagnostics, EEUU) seguiendo el protocolo del fabricante.
El plásmido pVR103 (ejemplo 5C, figura 18) también se digirió con SphI, y un fragmento de 3,5 kpb que tiene el gen
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gen ScXKS1 bajo el control del promotor ScTEF1 y del terminador ScGAL10 se acopló al fragmento de pVR65 linealizado para obtener el plásmido pVR104 (figura 19).
Ejemplo 5E: Generación de un mutante de K. marxianus (CD805) que tiene una actividad del gen ScXKS1 sobreexpresada y el gen de la xilosa reductasa delecionado por la cepa transformante CD804 (ejemplo 4D)
Se empleó un fragmento PvuII de aproximadamente 6,8 kpb del plásmido pVR104 (ejemplo 5D, figura 19) para transformar la cepa CD804 (ejemplo 4D), utilizando métodos de electroporación convencionales. Las células transformadas se recuperaron en el medio YPD, se cultivaron en placa después de 4 horas sobre placas SC-Ura (Qbiogene, CA) y se incubaron a 37 ºC durante 48-72 horas. Los transformantes que crecieron sobre placas SC-Ura tras 72 horas se volvieron a sembrar en estrías sobre placas SC-Ura frescas. Los transformantes sembrados de nuevo en estrías se seleccionaron utilizando PCR de colonias.
Una única colonia positiva de la cepa transformada se inoculó en 50 ml de medio YPD y se incubó durante la noche a 37 ºC con agitación a 200 rpm. Se cultivaron 10 l sobre placas 5-FOA y se incubaron durante la noche a 37 ºC. Las colonias que crecieron fueron resistentes a 5-FOA y se prevé que han perdido su gen ScUra3 debido a la recombinación de las regiones HisG. Se realizó una PCR utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:91 y SEC ID NO:92 para amplificar una región de 700 pb para indicar un gen ScXKS1 intacto y aproximadamente 1 kb del gen HisG. Se diseñó un segundo conjunto de cebadores identificados como SEC ID NO:93 y SEC ID NO:94 para amplificar un producto de aproximadamente 1 kpb entre el ScXKS1 y el final del gen. Estos dos conjuntos de cebadores confirman que el gen ScXKS1 se ha integrado en el cromosoma de los transformantes y que el gen ScUra3 ha sido eliminado por la recombinación espontánea de la región HisG. Esta cepa se denominó CD805 y se volvió a ensayar para determinar si había una mayor actividad de proteína xiluloquinasa.
Se diseñaron los cebadores identificados como SEC ID NO:91 y SEC ID NO:93 para amplificar un producto de aproximadamente 2,6 kpb entre el promotor ScTEF1 y el final del gen ScXKS1. Se diseñaron los cebadores identificados como SEC ID NO:92 y SEC ID NO:95 para amplificar un producto de aproximadamente 1,7 kpb entre el gen ScXKS1 y el inicio del fragmento. Estos dos conjuntos de cebadores confirman que el gen ScXKS1 se ha integrado en el cromosoma de la cepa CD805.
Ensayo de la actividad xilulosaquinasa: Se inocularon diferentes matraces de agitación amortiguados (capacidad de 250 ml) con las cepas CD804 (ejemplo 4D) y CD805 (ejemplo 5E). Los matraces se colocaron a 35 ºC, se agitaron a 250 rpm y se cultivaron durante la noche. El medio consistió en extracto de levadura 20 g/l, peptona 10 g/l, y dextrosa 100 g/l. Después de 16 horas, las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 g durante 5 minutos, se lavaron con tampón fosfato de sodio 100 mM, y se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de ruptura. El tampón de ruptura consiste en tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 7,0), DTT 1 mM, 40 mg de PMSF (disuelto en 500 l de DMSO), y 4 comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasas (Roche) en un volumen de 200 ml. Las células se lisaron mecánicamente utilizando esferas de vidrio (Invitrogen, CA) y se centrifugaron a 14.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se retiró y se ensayó en una columna desaladora PD-10 según el protocolo del kit (Amersham Bioscience). Se añadieron 10 l de extracto a una mezcla de 80 l de XuK equilibrada a 30 ºC (que contenía 61 mg de Na2ATP·3H2O, 10,0 ml de HEPES 0,1 M/KOH (pH 7,5), 1,2 ml de MgCl2 0,1 M (diluido hasta 16,0 ml), y 10 l de xilulosa 20 mM para un volumen total de 100 ml. Se sustituye a la xilulosa por agua para el blanco. Las reacciones se terminan hirviendo durante dos minutos y transladándose a hielo. Se añadieron 900 l de Hek2 (HEPES 40 mM/KOH (pH 7,5), MgCl2 10 mM, PEP 2,5 mM, y NADH 0,2 mM) y se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se trasladó a una cubeta de espectrofotómetro, y se estableció la absorbancia en la línea de base a 340 nm inicial. Se añadieron 10 l de una mezcla 1:1:1 de mioquinasa, piruvato quinasa, y lactato deshidrogenasa y se midió la absorbancia final. Se determinaron las proteínas totales utilizando el reactivo Advanced Protein Assay Reagent (Cytoskeleton nº ADV01) con BSA como patrón. La medición de la actividad xiluloquinasa para la cepa CD804 fue de 69,7  8,0 mU/mg, mientras que para la cepa CD805 fue de 400,8  102,7 mU/mg, lo cual indica que CD805 tiene una actividad ScXKS1 sobreexpresada.
Ejemplo 6A: Construcción del plásmido pCM23 (figura 20) que contiene los flancos cadena arriba y cadena abajo de un gen de xilitol deshidrogenasa de K. marxianus (KmXYL2), y un gen hgh de E. coli bajo el controldel promotor ScPDC1 y del terminador ScGAL10
Un fragmento de 988 pb que contiene la región promotora del gen de xilitol deshidrogenasa de K. marxianus (KmXYL2) se amplificó mediante PCR desde el genoma con los cebadores indicados como SEC ID NO:96 y SEC ID NO:97. El termociclado se realizó con 35 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 52 ºC, 1 min a 68 ºC, seguido de una incubación final durante 8 minutos a 68 ºC utilizando la ADN polimerasa Pfx (Invitrogen, CA). El producto se clonó en un vector TOPOII (Invitrogen, CA). El plásmido pUC19 (New England Biolabs, EEUU) se digirió con EcoRI y se separó en un gel al 1,0%. Se aisló una banda de 2,686 kpb del plásmido pUC19 y se acoplo a un fragmento liberado del plásmido TOPOII mediante una digestión con EcoRI, creando un plásmido de aproximadamente 3,674 kpb denominado pCM20.
Un fragmento que contiene la secuencia terminadora y la región cadena abajo de KmXYL2 se amplificó mediante PCR desde el genoma utilizando tres conjuntos de cebadores. El primer conjunto de cebadores se identifica como
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Denominación de la cepa
Ej. nº XI 1 XK 2 XR3 XDH4 Actividad XI (mU/mg) Actividad XK (mU/mg)
Cs/T-1
13E 1 1 + + 170 840
Cs/T-25
13E 1 2 + + 40 1060
Cs/T-34
13E 2 2 + + 50 1600
Cs/T-51
13E 2 1 + + 80 730
Cs/417-214
13F 2 0 - + 70 70
Cs/417-206
13F 1 0 - + 30 140
Cs/417-201
13F 2 0 + + 60 100
Cs/417-208
13F 1 0 + + 60 120
Cs/417-214/425A
13G 2 1 - - 50 1440
Cs/417-214/425B
13G 2 1 - + 50 860
Cepas que producen ácido láctico (todas contiene LDH exógeno)
Denominación de la cepa
Ej. nº XI 1 XK 2 XR3 XDH4 Actividad XI (mU/mg) Actividad XK (mU/mg)
C29/403-7
13H 2 0 + + 90 N.D.5
C29/403-7/425
13I 2 1 + + 90 N.D.
C29/417-4
13J 1 0 - + 20 250
C29/417-9
13J 2 0 - + 30 150
C29/417-9/425-11
13K 2 1 - - 50 960
C29/417-9/425-9
13K 2 1 - + 30 920
Notas a las anteriores tablas: XI1 = gen PXYLA; XK2 = gen ScXKS1; XR3 = gen de la xilosa reductasa nativo; XDH4 = gen de la xilitol dehidrogenasa nativo. Los números indican el nº de copias integradas del gen. “+” indica que el 5 gen nativo está intacto; “-“ indica una deleción del gen nativo. N.D.5: no determinado.
Se determinaron las actividades xiluloquinasa y xilosa isomerasa para estas muestras como sigue.
Las muestras (5-10 ml) se centrifugaron y se lavaron una vez con tampón fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0. Después de lavar, las muestras se resuspendieron en reactivo de extracción de proteínas de levadura Y-PER (Pierce, Rockford, IL) que contenía inhibidores de proteasas (Complete Mini, sin EDTA, Roche). Después de 20 minutos de
10 incubación a temperatura ambiente, las células se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 minutos a +4 ºC. Se recogieron muestras de sobrenadante para la medición de las actividades.
Se determinó la actividad xiluloquinasa mediante un protocolo en dos etapas. En la etapa 1, la reacción contenía HEPES 50 mM/KOH, pH 7,5, ATP 5 mM, MgCl2 6 mM, y xilulosa 20 mM. La reacción de fondo se determinó añadiendo agua en lugar de xilosa. Después de añadir la muestra de enzima, las reacciones se incubaron a 30 ºC 15 durante 0 y 240 segundos. Después de la incubación, las reacciones se detuvieron mediante su incubación a 95 ºC durante 5 min. Después de que la reacción se detuviese se añadió HEPES 40 mM/KOH, pH 7,5, MgCl2 10 mM, PEP 2,5 mM, y NADH 0,2 mM a la reacción y se midió la absorbancia a 340 nm. Después de medir la absorbancia inicial se añadió una mezcla de mioquinasa, piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa. Esta reacción se incubó durante 1 hora más y se midió la absorbancia 340 nm. La actividad xiluloquinasa se calculó a partir de la producción de ADP
20 durante los ensayos.
Se determinó la actividad xilosa isomerasa controlando la oxidación del NADH a 340 nm a 30 ºC. La reacción contiene (además de la muestra) TES 100 mM-NaOH, pH 7,0, xilosa 250 mM, MgCl2 10 mM, NADH 0,6 mM, y sorbitol deshidrogenasa 2,5 U. El fondo se detectó midiendo la actividad sin xilosa. El ensayo de xilosa isomerasa se realizó en un analizador automático Cobas Mira (Roche).
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