ES2544687T3 - Cepa de Lactobacillus rhamnosus - Google Patents

Cepa de Lactobacillus rhamnosus

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ES2544687T3 ES09728680.1T ES09728680T ES2544687T3 ES 2544687 T3 ES2544687 T3 ES 2544687T3 ES 09728680 T ES09728680 T ES 09728680T ES 2544687 T3 ES2544687 T3 ES 2544687T3
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Abstract

Cepa de Lactobacillus rhamnosus que posee propiedades antimicrobianas, inmunomoduladoras y de adherencia específica a la manosa, depositada en la CNCM con el número I-3690.

Description

DESCRIPCIÓN
Cepa de Lactobacillus rhamnosus.
La invención se refiere a una nueva cepa de Lactobacillus rhamnosus dotada de propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras.
Numerosos estudios científicos han descrito los efectos beneficiosos para la salud de ciertos microorganismos 5 presentes en los alimentos fermentados, principalmente productos lácteos. Estos microorganismos se denominan comúnmente «probióticos». Según la definición generalmente aceptada en la actualidad, los probióticos son: «microorganismos vivos que, cuando se consumen en cantidades adecuadas, tienen un efecto beneficioso sobre la salud del hospedante» (Informe de la FAO/OMS sobre la evaluación de las propiedades sanitarias y nutricionales de los probióticos en los alimentos, incluida la leche en polvo, que contienen bacterias lácticas vivas; Córdoba, 10 Argentina; 1-4 octubre 2001).
Se ha demostrado que el consumo de productos alimenticios que contienen bacterias probióticas puede producir efectos favorables sobre la salud, por medio principalmente del reequilibrio de la flora intestinal, la mejora de la resistencia a las infecciones y la modulación de la respuesta inmunitaria.
Los microorganismos probióticos utilizados en la alimentación humana son generalmente bacterias lácticas, 15 pertenecientes principalmente a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium.
Los efectos beneficiosos sobre la salud no son sin embargo generalmente comunes al conjunto de bacterias de un mismo género ni incluso de una misma especie. Frecuentemente, no se encuentran más que en ciertas cepas; además, los efectos observados pueden variar cualitativa y/o cuantitativamente de una cepa probiótica a otra, dentro de una misma especie. 20
Para que un microorganismo pueda ser considerado potencialmente utilizable como probiótico, debe cumplir al menos uno, e idealmente varios, de los siguientes criterios:
- presentar una actividad inhibidora frente a microorganismos patógenos que puedan estar presentes en la flora intestinal, pudiendo resultar esta actividad bien de la capacidad de adherirse a las células intestinales, excluyendo o reduciendo así la adherencia de agentes patógenos, o bien de la capacidad de 25 producir sustancias inhibidoras de los agentes patógenos, o bien la combinación de estas dos características;
- presentar propiedades inmunomoduladoras y principalmente inmunoestimuladoras y/o anti-inflamatorias.
Además, si este microorganismo está destinado a ser incorporado en un producto lácteo, debe presentar preferiblemente un desarrollo satisfactorio en la leche. 30
Por último, debe conservar una buena viabilidad, durante la producción y conservación del alimento al que se incorpora, así como después de la ingestión de este alimento por el consumidor, de modo que pueda llegar al intestino y sobrevivir en el medio intestinal.
Sin embargo, ha de observarse que aunque la viabilidad sea esencial para responder a la definición actual de «probiótico», se ha demostrado que ciertos efectos beneficios asociados a las cepas probióticas se podrían obtener 35 incluso en ausencia de bacterias vivas y serían atribuibles a ciertas fracciones bacterianas o fracciones activas de sus líquidos sobrenadantes de cultivo. Por ejemplo, la Solicitud PCT WO2004/093898 describe una preparación inmunomoduladora obtenida por fraccionamiento del líquido sobrenadante de cultivo de la cepa CNCM I-2219.
Los autores de la presente invención han conseguido ahora aislar una cepa de Lactobacillus rhamnosus que responde a los criterios indicados anteriormente. 40
La presente invención tiene por objeto esta cepa, que ha sido depositada, según el Tratado de Budapest, en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, París), el 9 de noviembre de 2006 con el número I-3690.
Dicha cepa posee las siguientes características:
- Morfología: pequeños bacilos achaparrados a veces cocoides, aislados o en pequeñas cadenas. 45
- Fermentación de los azúcares siguientes (resultados obtenidos en una galería API 50 CH – Medio MRS API a 37ºC durante 48 horas): ribosa, galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, L-sorbosa, ramnosa, manitol, sorbitol, metil-D-glucósido, N-acetilglucosamina, arbutina, esculina, salicina, maltosa, lactosa, trehalosa, melecitosa, beta-gentiobiosa, D-turanosa, D-tagatosa y gluconato.
Por otra parte dicha cepa posee propiedades antimicrobianas, que se traducen en una fuerte capacidad de inhibir el 50 desarrollo en cultivo de microorganismos patógenos.
Además dicha cepa presenta propiedades de adherencia a la manosa. Se sabe que glicoconjugados ricos en manosa presentes en la superficie de las células epiteliales intestinales desempeñan un papel en la unión de bacterias patógenas, tales como Escherichia coli enterotóxicas, las salmonelas, Vibrio cholerae o Pseudomonas aeruginosa, y se ha descrito que las propiedades de adherencia a la manosa de ciertas bacterias probióticas les permitían competir con estos agentes patógenos e inhibir su adherencia a la mucosa intestinal, confiriéndoles así 5 propiedades anti-infecciosas (MICHAIL et ABERNATHY, Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 35, 350-355, 2002; MANGELL et al., Dig Dis Sci., 47, 511-506, 2002). Estas propiedades, sin embargo, se habían observado principalmente en bacterias de la especie Lactobacillus plantarum (principalmente la cepa L. plantarum 229v, descrita en la Solicitud EP0817640 y la cepa L. plantarum WCFS1), pero no en las bacterias de la especie Lactobacillus rhamnosus.
La cepa CNCM I-3690 posee igualmente propiedades inmunomoduladoras y principalmente anti-inflamatorias. 10
La presente invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de obtención de una cepa de Lactobacillus rhamnosus, caracterizado por que comprende la mutagénesis o la transformación genética de la cepa CNCM I-3690, así como cualquier cepa de Lactobacillus rhamnosus susceptible de ser obtenida por este procedimiento, y que conserve las propiedades antimicrobianas y las propiedades inmunomoduladoras de la cepa CNCM I-3690. Se puede tratar de cepas en las que uno o varios de los genes endógenos de la cepa CNCM I-3690 han sido mutados, 15 por ejemplo con el fin de modificar ciertas de sus propiedades metabólicas (por ejemplo, la capacidad de esta cepa de metabolizar azúcares, su resistencia al tránsito intestinal, su resistencia a la acidez, su post-acidificación o su producción de metabolitos). Se puede tratar igualmente de cepas resultantes de la transformación genética de la cepa CNCM I-3690 con uno o varios genes de interés, permitiendo, por ejemplo, conferir a dicha cepa características fisiológicas complementarias o expresar proteínas de interés terapéutico o vacunal, que se desea administrar por 20 medio de dicha cepa.
Estas cepas se pueden obtener a partir de la cepa CNCM I-3690 por técnicas clásicas de mutagénesis aleatoria o dirigida y de transformación genética de lactobacilos, tales como las descritas por ejemplo, por GURY et al., (Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004) o por VÉLEZ et al., (Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007), o por la técnica denominada «barajado del genoma» (genome shuffling) (PATNAIK et al., Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002; WANG, 25 Y. et al., J Biotechnol., 129, 510-15, 2007).
La presente invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de obtención de fracciones celulares que poseen propiedades inmunomoduladoras y antimicrobianas, caracterizado por que dichas fracciones se obtienen a partir de una cepa de Lactobacillus rhamnosus de acuerdo con la invención. Dicha invención trata principalmente de preparaciones de ADN o preparaciones de paredes bacterianas obtenidas a partir de cultivos de dicha cepa. Puede 30 tratar igualmente de líquidos sobrenadantes de cultivo o de fracciones de estos líquidos sobrenadantes.
La presente invención tiene igualmente por objeto composiciones que comprenden una cepa de Lactobacillus rhamnosus de acuerdo con la invención.
Estas composiciones pueden ser principalmente fermentos lácticos, que asocian una cepa de Lactobacillus rhamnosus de acuerdo con la invención con una u otras varias cepas de bacterias lácticas, probióticas o no. 35
Igualmente, se puede tratar de productos alimenticios, principalmente productos lácteos, o productos farmacéuticos o cosméticos que comprenden una cepa de Lactobacillus rhamnosus de acuerdo con la invención.
Una cepa de Lactobacillus rhamnosus de acuerdo con la invención se puede utilizar por tanto como medicamento, principalmente como medicamento destinado al tratamiento de una infección microbiana.
Cuando dicha cepa está presente en forma de bacterias vivas, estás estarán presentes preferiblemente en una 40 proporción de al menos 105 UFC por gramo, ventajosamente al menos de 106 UFC por gramo de producto, más ventajosamente al menos de 107 UFC por gramo e incluso más ventajosamente al menos de 108 UFC por gramo.
La presente invención tiene también por objeto un procedimiento de obtención de una composición que posee propiedades antimicrobianas y/o inmunomoduladoras, caracterizado por que comprende la obtención de una fracción celular por un procedimiento de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente y la 45 incorporación de dicha fracción en dicha composición. Preferiblemente, dicha composición es un producto alimenticio.
La presente invención se comprenderá mejor con la ayuda de la siguiente descripción que se refiere a los ejemplos que ilustran las propiedades antimicrobianas, inmunomoduladoras y anti-infecciosas de la cepa CNCM I-3690.
Ejemplo 1: Comparación de las propiedades de la cepa CNCM I-3690 con las de las cepas probióticas 50 conocidas
Las propiedades de la cepa CNCM I-3690 se compararon con las de las diferentes cepas de la técnica anterior, conocidas por sus propiedades probióticas.
La lista de estas cepas se da en la Tabla I siguiente.
Tabla I
Género
Especie Denominaciones Número de publicación de las solicitudes de patentes
Lactobacillus
johnsonii NCC533 = La1 = CNCM I-1225 EP0577903
Lactobacillus
acidophilus NCFM WO2004/032639
Lactobacillus
acidophilus La-5
Lactobacillus
casei Shirota
Lactobacillus
paracasei CRL431 = ATCC 55544
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 US4839281
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97/09514 WO9910476
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917 = DSMZ 20174 = WCFS1
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 WO9391823
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112: ATCC 55730 WO2004/034808
Bifidobacterium
breve ATCC 15700
Bifidobacterium
breve BBC50 = CNCM I-2219 EP1189517
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697
Bifidobacterium
longum BB536
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM I-2618
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis BB12 = ATCC 27536
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis HN019 = NM97/01925 WO9910476
Materiales y métodos
1- Actividad antimicrobiana
La búsqueda de las actividades antimicrobianas se efectuó frente a tres bacterias patógenas dianas: Escherichia coli 5 E1392-75-2A, Salmonella enteritidis NIZO B1241 y Listeria monocytogenes 4B. Las bacterias lácticas se cultivaron en placas de Petri en diferentes medios: LM17 (medio M17 (TERZAGHI & SANDINE, Appl. Microbiol. 29, 807-813, 1975) al que se había añadido 1% de lactosa, medio Elliker (ELLIKER et al., J. Dairy Sci., 39, 1611-1612, 1956) y medio TGV (triptona-glucosa-extracto de carne).
Las placas se incubaron a 37ºC hasta la aparición de colonias bacterianas. Los cultivos de Bifidobacterium se 10 efectuaron bajo anaerobiosis. Una capa de agar-agar que contenía medio BHI (infusión cerebro-corazón) y el agente patógeno se vertieron entonces en la superficie de las placas. Las placas se incubaron de nuevo a 37ºC durante 24 horas. A continuación se midieron los diámetros de las zonas de inhibición del agente patógeno alrededor de cada colonia de bacterias lácticas. La puntuación 1 corresponde a un diámetro entre 1 y 3 mm. La puntuación 2 corresponde a un diámetro entre 4 y 6 mm. La puntuación 3 corresponde a un diámetro superior a 6 mm. Cada 15 experimento se realizó tres veces independientemente para cada cepa.
En cada experimento se añadieron las puntuaciones obtenidas con los agentes patógenos dianas para obtener, para cada bacteria láctica, una puntuación global de la actividad antimicrobiana.
Los resultados se recogen en la Tabla II siguiente.
Estos resultados muestran que entre las cepas ensayadas, la cepa CNCM I-3690 es con la cepa ATCC55544 la que posee la actividad antimicrobiana más elevada. 5
Tabla II
Género
Especie Referencia (1) coli/ Elliker (2) coli/ LM17 (3) Listeria /Elliker (4) Listeria /TGV (5) Listeria /LM17 (6) Salmonella /Elliker (7) Salmonella /TGV Puntuación antipatógenos (1+2+3+4+5+6+7)
Lactobacillus
rhamnosus DN 116 010 o CNCM I-3690 2 1 3 2 0 3 3 14
Lactobacillus
paracasei CRL431 = ATCC55544 2 0 3 3 1 3 2 14
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 2 0 1 2 0 3 3 11
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917 = DSMZ 20174 = WCFS1 2 0 1 2 0 3 2 10
Lactobacillus
casei Shirota 2 0 3 1 0 1 2 9
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97/09514 1 0 1 2 0 3 2 9
Lactobacillus
johnsonii NCC533 = La1 = I-1225 1 0 1 1 1 2 1 7
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 1 0 1 1 0 1 1 5
Lactobacillus
acidophilus La-5 1 0 1 2 0 0 1 5
Lactobacillus
acidophilus NCFM 1 0 1 1 0 0 1 4
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis BB12 = ATCC 27536 1 0 0 0 0 0 2 3
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 0 0 1 0 0 1 0 2
Bifidobacferium
longum BB536 0 0 0 0 0 0 0 0
Bitidobacterium
animalis subsp. lactis HN019 = NM97/01925 0 0 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016 0 0 0 0 0 0 0 0
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697 0 0 0 0 0 0 0 0
Bifidobacterium
breve BBC50 = I- 0 0 0 0 0 0 0 0
Género
Especie Referencia (1) coli/ Elliker (2) coli/ LM17 (3) Listeria /Elliker (4) Listeria /TGV (5) Listeria /LM17 (6) Salmonella /Elliker (7) Salmonella /TGV Puntuación antipatógenos (1+2+3+4+5+6+7)
2219
Bifidobacterium
breve ATCC 15700 0 0 0 0 0 0 0 0
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM I-2618 0 0 0 0 0 0 0 0
2 - Inmunomodulación
Las propiedades inmunomoduladoras de las diferentes bacterias lácticas se evaluaron por detección de la modulación inducida por estas bacterias sobre la respuesta inflamatoria de células epiteliales de colon (HT-29), midiendo el efecto de estas bacterias sobre la activación del regulador transcripcional NF-κB y la secreción de la 5 citoquina proinflamatoria IL-8 por las células HT-29 en presencia de una mezcla de TNFα, IL-1β e IFNγ (Cytomix) simulando las condiciones de un ataque inflamatorio.
Cultivo de bacterias lácticas
El desarrollo de bacterias lácticas se efectuó en medio MRS (DE MAN et al., J. Appl. Bacteriol. 23, 130-135, 1960) o MRS complementado con L-cisteína (1% final) o en medio Elliker, según la especie bacteriana ensayada. Las 10 bacterias se inocularon y cultivaron en un primer pre-cultivo de 10 mL durante 16 horas a 37ºC y se volvieron a cultivar al día siguiente en un segundo cultivo en 100 mL durante 16 horas a 37ºC, y se recogieron al finalizar la fase estacionaria.
Cultivo y preparación de células
Las células HT29 se mantuvieron a 37ºC y 5% de CO2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) 15 complementado con 4,5 g/L de D-glucosa, L-glutamina (1 mM final), aminoácidos (AA) no esenciales (1% final), penicilina/estreptomicina (1% final), suero fetal bovino (SFB) (10% final).
Las células HT-29 se sembraron en placas de 12 pocillos en la proporción de 2x105 células por pocillo en 2 mL de medio, dos días antes de los experimentos de interacción con las bacterias y de estimulación por Cytomix.
Para la medición de la activación del regulador transcripcional NF-κB, se transfectaron las células al día siguiente de 20 la siembra, con el plásmido indicador Ig-κB-luciferasa, como ha sido descrito por TIEN et al. (J. Immunol., 176, 1228-37, 2006). Previamente a la transfección, las células se lavaron y el medio fue reemplazado por el mismo medio sin antibióticos. La transfección se efectuó depositando en cada pocillo 100 µL de una mezcla que contenía 75 ng de plásmido pIg-κB-luciferasa y 1 µL de lipofectamina 2000 en 99 µL de medio OptiPro. A continuación se incubaron las placas durante 24 horas a 37ºC y 5% de CO2. 25
Interacción con las bacterias y estimulación por Cytomix
Las bacterias se recuperaron al final de la fase estacionaria y se lavaron dos veces con PBS antes de ser puestas en contacto con las células.
A continuación se incubaron durante 2 horas con las bacterias, con una multiplicidad de infección de 100 bacterias por célula. Después de dos horas de interacción con las bacterias, las células se incubaron durante 6 horas en 30 presencia de bacterias y de Cytomix en una proporción de 50 ng/mL de TNFα, 2,5 ng/mL de IL-1β y 7,5 ng/mL de IFNγ en el medio de incubación. Todas las incubaciones se realizaron a 37ºC y 5% de CO2.
Con el fin de determinar el nivel basal de activación de NF-κB y de secreción de IL-8 en ausencia de bacterias lácticas, se realizó el mismo experimento efectuando la estimulación por Cytomix durante 6 horas, después de dos horas de incubación de las células en ausencia de bacterias. 35
Después de 8 horas de incubación, se recuperó 1 mL de medio para evaluar la IL-8 segregada. Esta evaluación se realizó por ELISA utilizando el kit «Chimioluminescent ELISAs QuantiGlo Human IL-8» (R & D Systems).
Para medir la activación de NF-κB, se lisaron las células en 100 microlitros de un tampón (Tris pH 7,9, 25 mM, MgCl2 8 mM, Triton al 1%, glicerol al 15%), al que se había añadido DTT 1 mM. Para medir la actividad de luciferasa se añadieron 10 microlitros de lisado celular al tampón de lectura (Tris pH 7,9, 25 mM, MgCl2 8 mM, Triton al 1%, 40 glicerol al 15%), al que se habían añadido DTT 1 mM, ATP 100 mM y luciferina/K2HPO4 2 mM - PH 7,58. La medición se efectuó utilizando un luminómetro (BECKMAN COULTER).
Después de este tiempo total de interacción de 8 horas, se midieron la activación de NF-κB y la secreción de IL-8.
Los valores de activación de NF-κB y de secreción de IL-8 se expresaron en porcentajes con relación al nivel basal observado en ausencia de bacterias lácticas. Para cada cepa ensayada, se calculó una puntuación media de inmunomodulación sumando el porcentaje de activación de NF-κB y el porcentaje de secreción de IL-8. Estos resultados se recogen en la Tabla III siguiente. 5
Tabla III
Género
Especie Referencia NFκB-HT29 (8) IL8-HT29 (9) Puntuación media de HT29 IL8/NFκB (8+9)/2
Lactobacillus
rhamnosus DN 116 010 o CNCM I-3690 34,7 49,7 42
Lactobacillus
paracasei CRL431 = ATCC55544 58,7 101,5 80
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 78,0 81,0 80
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917 = DSMZ 20174 = WCFS1 80,7 91,9 86
Lactobacillus
casei Shirota 94,0 99,7 97
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97/09514 25,0 49,7 37
Lactobacillus
johnsonii NCC533 = La1 = I-1225 86,9 92,7 90
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 93,9 107,7 101
Lactobacillus
acidophilus La-5 93,8 89,5 92
Lactobacillus
acidophilus NCFM 85,8 95,0 90
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis BB12 = ATCC 27536 99,4 98,0 99
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 82,0 87,9 85
Bifidobacterium
longum BB536 111,6 92,0 102
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis HN019 = NM97/01925 107,7 101,2 104
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016 71,4 83,6 78
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697 77,5 96,3 87
Bifidobacterium
breve BBC50 = I-2219 97,5 103,6 101
Bifidobacterium
breve ATCC 15700 117,7 104,6 111
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM I-2618 87,8 91,4 90
Estos resultados muestran que la cepa CNCM I-3690 inhibe fuertemente la respuesta inflamatoria de las células epiteliales HT-29. Entre las otras cepas ensayadas, sólo la cepa HN001 posee propiedades anti-inflamatorias comparables. 10
3- Supervivencia al estrés gástrico e intestinal
Se utilizó un modelo in vitro que reflejaba las condiciones del estrés gástrico e intestinal.
Se realizaron cultivos de bacterias lácticas en leche complementada con extracto de levadura. Los cultivos se incubaron durante 24 a 48 horas, según las especies (hasta la fase estacionaria de cultivo).
Estrés intestinal: Se preparó un jugo intestinal artificial compuesto de sales biliares de cerdo (3,3 g/L) y tampón de 5 hidrogenocarbonato NaHCO3 (16,5 g/L). El pH se ajustó a 6,3. Se añadió 1 mL de este jugo intestinal a 100 µL de cultivo bacteriano. A continuación se incubaron los cultivos durante 5 horas. A continuación, se evaluaron sobre placas las poblaciones bacterianas antes y después del estrés.
Estrés gástrico: Se preparó un jugo gástrico artificial. Estaba compuesto de ácido láctico (9 g/L), pepsina (3,5 g/L) y NaCl (2,2 g/L). El pH se ajustó a 3,1. Se añadió 1 mL de este jugo artificial a 100 µL de cultivo bacteriano. Los 10 cultivos se incubaron durante diferentes tiempos: 10 minutos, 30 minutos y 60 minutos. Se evaluaron en las placas las poblaciones bacterianas.
Los valores se expresaron de la siguiente manera:
Estrés gástrico = valor medio [log (UFC10min/UFC0) y log (UFC0/UFC0)] *10 + valor medio [log (UFC30min/UFC0) y log (UFC10min/UFC0)] *20 + valor medio [log (UFC60min/UFC0) y log (UFC30min/UFC0)] *30. 15
Estrés intestinal = log (UFC5h/UFC0h)
siendo UFCXmin la concentración de bacterias expresada en Unidades Formadoras de Colonias (UFC) después de X minutos de incubación.
Para el estrés gástrico, la supervivencia es buena cuando el valor es superior a -50, medianamente buena cuando el valor está comprendido entre -50 y -100 y mala cuando el valor es inferior a -100. 20
Para el estrés intestinal, la supervivencia es buena cuando el valor es superior a -0,5, medianamente buena cuando el valor está comprendido entre -0,5 y -1,5 y mala cuando el valor es inferior a -1,5.
Los resultados se dan en la Tabla IV siguiente.
Tabla IV
Género
Especie Referencia Estrés intestinal Estrés gástrico
Lactobacillus
rhamnosus DN 116 010 o CNCM I-3690 0,31 -31,9
Lactobacillus
paracasei CRL431 = ATCC55544 0,04 -47,4
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 -0,07 -44,0
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917 = DSMZ 20174 = WCFS1 -0,79 -68,5
Lactobacillus
casei Shirota -1,50 -139,2
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97/09514 0,00 -86,3
Lactobacillus
johnsonii NCC533 = La1 = I-1225 0,69 20,3
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 -1,04 -29,7
Lactobacillus
acidophilus La-5 -0,23 43,3
Lactobacillus
acidophilus NCFM -1,45 -63,0
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis BB12 = ATCC 27536 0,07 -70,0
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 1,00 -4,6
Género
Especie Referencia Estrés intestinal Estrés gástrico
Bifidobacterium
longum BB536 -1,12 -438,7
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis HN019 = NM97/01925 3,40 114,0
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016 -1,91 -80,0
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697 2,79 -412,9
Bifidobacterium
breve BBC50 = I-2219 -0,91 -333,8
Bifidobacterium
breve ATCC 15700 -0,14 -370,2
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM I-2618 -0,22 -319,2
Los resultados ilustrados en las Tablas II, III y IV anteriores muestran que, entre las diferentes cepas ensayadas, la cepa CNCM I-3690 es la única que presenta a la vez propiedades antimicrobianas y propiedades anti-inflamatorias importantes, acompañadas además de muy buenas propiedades de resistencia al estrés gástrico y al intestinal.
Para ilustrar la superioridad de esta cepa, se sumaron las diferentes puntuaciones obtenidas por esta cepa en el 5 plano antimicrobiano y se obtuvo la media entre los resultados obtenidos por esta cepa en el plano de la inmunomodulación. La Figura 1 muestra hasta qué punto esta cepa se diferencia en comparación con las otras cepas ensayadas.
Ejemplo 2: Propiedades de adherencia a la manosa de la cepa CNCM I-3690
La capacidad de la cepa CNCM I-3690 para adherirse específicamente a la manosa se determinó por medio de un 10 ensayo de aglutinación. Este ensayo se basa en la presencia de polisacáridos que contienen manosa en la superficie de las células de Saccharomyces cerevisiae. Cuando estas bacterias que se adhieren a la manosa se ponen en contacto con S. cerevisiae, se produce un fenómeno de aglutinación, visible al microscopio.
Este modelo permite evaluar las propiedades anti-infecciosas potenciales de una bacteria que resultan de su capacidad para competir con los agentes patógenos en la adherencia a la mucosa intestinal. 15
Las cepas L. plantarum 229v y L. plantarum WCFS1, conocidas por su alta capacidad de adherencia a la manosa, se utilizaron como controles positivos.
Las cepas de Lactobacillus se cultivaron en medio MRS, a una temperatura de 37ºC. El desarrollo de las bacterias se detuvo en la fase estacionaria y las bacterias se lavaron a continuación y se ajustó su concentración. El cultivo de S. cerevisiae se realizó en el medio «extracto de malta» (Oxoid). 20
A continuación se mezcló un volumen de 5 µL de suspensión bacteriana con PBS o metil-α-D-manopiranósido (concentración final: 25 mM). Luego se añadieron 100 µL de una preparación al 1% de células de S. cerevisiae. La mezcla se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se examinó al microscopio y se les asignaron puntuaciones, utilizando la siguiente anotación:
Puntuación 0 = sin aglutinación 25
Puntuación 1 = aglutinación débil
Puntuación 3 = aglutinación fuerte
Puntuación 5 = aglutinación muy fuerte.
El experimento se realizó tres veces independientemente para cada cepa.
Los resultados se recogen en la Tabla V siguiente. 30
Tabla V
Género
Especie Referencia Puntuación de manosa
Lactobacillus
rhamnosus DN 116 010 o CNCM I-3690 3
Lactobacillus
paracasei CRL431 = ATCC55544 0
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 0
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917 = DSMZ 20174 = WCFS1 3
Lactobacillus
casei Shirota 0
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97/09514 0
Lactobacillus
johnsonii NCC533 = La1 = I-1225 0
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 3
Lactobacillus
acidophilus La-5 0
Lactobacillus
acidophilus NCFM 0
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis BB12 = ATCC 27536 0
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 0
Bifidobacterium
longum BB536 0
Bifidobacterium
animalis subsp. lactis HN019 = NM97/01925 0
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016 0
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697 0
Bifidobacterium
breve BBC50 = I-2219 0
Bifidobacterium
breve ATCC 15700 0
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM I-2618 0
Se observa que el porcentaje de células de S. cerevisiae aglutinadas por la cepa CNCM I-3690 es comparable con el porcentaje de células de S. cerevisiae aglutinadas por las cepas L. plantarum 229v y L. plantarum WCFS1.
Ejemplo 3: Desarrollo en leche de la cepa CNCM I-3690 5
Se analizaron las propiedades de desarrollo en leche de la cepa CNCM I-3690 utilizando el siguiente protocolo:
En un medio constituido por leche desnatada, reconstituida con agua añadida a la leche desnatada en polvo, se sembró la cepa CNCM I-3690, en proporciones que variaban entre 5,5x106 UFC/g y 3,3x107 UFC/g.
La actividad de fermentación de la cepa, asociada a su desarrollo, se midió controlando continuamente el pH del medio de desarrollo. 10
Los resultados se ilustran en la Figura 2.
Estos resultados muestran que la cepa CNCM I-3690 es capaz de desarrollarse eficazmente en leche y por lo tanto que puede utilizarse en la fabricación de productos lácteos fermentados.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Cepa de Lactobacillus rhamnosus que posee propiedades antimicrobianas, inmunomoduladoras y de adherencia específica a la manosa, depositada en la CNCM con el número I-3690.
  2. 2. Procedimiento de obtención de una cepa de Lactobacillus rhamnosus, caracterizado por que comprende la mutagénesis o la transformación genética de la cepa CNCM I-3690. 5
  3. 3. Cepa de Lactobacillus rhamnosus, caracterizada por que es susceptible de ser obtenida por el procedimiento según la reivindicación 2 y por que posee las propiedades antimicrobianas y las propiedades inmunomoduladoras de la cepa CNCM I-3690.
  4. 4. Composición que comprende una cepa de Lactobacillus rhamnosus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3. 10
  5. 5. Composición según la reivindicación 4, caracterizada por que se trata de un producto alimenticio.
  6. 6. Cepa de Lactobacillus rhamnosus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, para la utilización como medicamento.
  7. 7. Cepa de Lactobacillus rhamnosus para la utilización como medicamento según la reivindicación 6, caracterizada por que dicho medicamento está destinado al tratamiento de una infección microbiana. 15
  8. 8. Cepa de Lactobacillus rhamnosus para la utilización como medicamento según la reivindicación 6, caracterizada por que dicho medicamento es anti-inflamatorio.
  9. 9. Procedimiento de obtención de una fracción celular que posee propiedades antimicrobianas y/o inmunomoduladoras, caracterizado por que dicha fracción se obtiene a partir de un cultivo de una cepa de Lactobacillus rhamnosus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3. 20
  10. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por que dicha fracción celular se elige entre:
    - una preparación de ADN o una preparación de paredes bacterianas;
    - un líquido sobrenadante de cultivo o una fracción de dicho líquido sobrenadante.
  11. 11. Procedimiento de obtención de una composición que posee propiedades antimicrobianas y/o inmunomoduladoras, caracterizado por que comprende la obtención de una fracción celular por un procedimiento 25 según una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, y la incorporación de dicha fracción en dicha composición.
  12. 12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizada por que dicha composición es un producto alimenticio.
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