ES2410263T3 - Nueva cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei dotada de propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras - Google Patents

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Abstract

Cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, que posee propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras, caracterizada porque es la cepa depositada en la CNCM bajo el número I-3689.

Description

Nueva cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei dotada de propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras
La invención se refiere a una nueva cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei dotada de propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras.
Numerosos estudios científicos han informado sobre los efectos beneficiosos para la salud de ciertos microorganismos presentes en los alimentos fermentados, en particular en los productos lácteos. Estos microorganismos son comúnmente denominados "probióticos". Según la definición generalmente admitida actualmente, los probióticos son "unos microorganismos vivos, que cuando se consumen en cantidades adecuadas, tienen un efecto beneficioso sobre la salud del hospedante" (Informe FAO/OMS sobre la evaluación de las propiedades sanitarias y nutricionales de los probióticos en los alimentos, incluyendo la leche en polvo que contiene unas bacterias lácticas vivas; Cordoba, Argentina; 1-4 de octubre de 2001).
Se ha demostrado que el consumo de productos alimenticios que contienen bacterias probióticas puede producir efectos favorables sobre la salud, en particular por medio del reequilibrio de la flora intestinal, de la mejora de la resistencia a las infecciones, y de la modulación de la respuesta inmunitaria.
Los microorganismos probióticos utilizados en la alimentación humana son generalmente unas bacterias lácticas, que pertenecen principalmente a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium y, en particular, a la especie Lactobacillus paracasei subespecie paracasei (de la cual se describe una cepa en la solicitud de patente EP0794707).
Sin embargo, los efectos beneficiosos sobre la salud no son generalmente comunes al conjunto de las bacterias de un mismo género, ni siquiera de una misma especie. Muy a menudo, sólo se encuentran en algunas cepas; además, los efectos observados pueden variar cualitativa y/o cuantitativamente de una cepa probiótica a otra, incluso en el interior de una misma especie.
Para que un microorganismo pueda ser considerado como potencialmente utilizable como probiótico, debe satisfacer al menos uno, e idealmente varios, de los criterios siguientes:
-
presentar una actividad inhibidora frente a microorganismos patógenos, que pueden estar presentes en la flora intestinal, pudiendo esta actividad resultar bien de la capacidad para adherirse a las células intestinales, excluyendo
o reduciendo así la adherencia de los patógenos, o bien de la capacidad para producir unas sustancias que inhiben los patógenos, o bien la combinación de estas dos características;
-
presentar propiedades inmunomoduladoras, y en particular inmunoestimulantes y/o anti-inflamatorias.
Además, si este microorganismo está destinado a ser incorporado en un producto lácteo, preferiblemente, debe presentar un crecimiento satisfactorio en la leche.
Finalmente, debe conservar una buena viabilidad durante la producción y la conservación del alimento en el que se incorpora, así como después de la ingestión de este alimento por el consumidor, de manera que pueda alcanzar el intestino y sobrevivir en el medio intestinal.
Sin embargo, se debe señalar que a pesar de que la viabilidad sea esencial para responder a la definición actual de "probiótico", se ha demostrado que algunos de los efectos beneficiosos asociados a unas cepas probióticas podían ser obtenidos incluso en ausencia de bacterias vivas, y eran atribuibles a ciertas fracciones bacterianas o a fracciones activas de sus sobrenadantes de cultivo. Por ejemplo, la solicitud PCT WO2004093898 describe una preparación inmunomoduladora obtenida por fraccionamiento del sobrenadante de cultivo de la cepa CNCM I-2219.
Los inventores han conseguido aislar una nueva cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, que responde a los criterios indicados anteriormente.
La presente invención tiene por objeto esta cepa, que ha sido depositada según el Tratado de Budapest, en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, 25 rue du Docteur Roux, Paris), el 9 de noviembre de 2006, bajo el número I-3689.
La cepa CNCM I-3689 posee las características siguientes:
-
Morfología: microorganismo Gram-positivo, pequeños bacilos finos, aislados o cadenas cortas.
-
Fermentación de los azúcares siguientes (resultados obtenidos en una galería api 50 CH - Medio MRS API a 37ºC durante 48h): ribosa, galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, manitol, N-acetilglucosamina, arbutina, celobiosa,
maltosa, lactosa, trehalosa, melezitosa, D-turanosa, D-tagatosa, gluconato.
-
Presencia de un solo locus CRISPR de secuencia SEC ID nº 1, que contiene una secuencia repetida representada por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 2.
Posee, por otra parte, unas propiedades antimicrobianas, que se traducen por una fuerte capacidad para inhibir el crecimiento, en cultivo, de microorganismos patógenos, en particular Escherichia coli, Salmonella enteritidis y Listeria monocitogenes.
Igualmente, la cepa CNCM I-3689 posee unas propiedades inmunomoduladoras, y, en particular, anti-inflamatorias.
La presente descripción tiene igualmente por objeto unas cepas de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, susceptibles de ser obtenidas por mutagénesis o por transformación genética de la cepa CNCM I-3689. Preferiblemente, estas cepas conservan las propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras de la cepa CNCM I-3689. Puede tratarse de cepas en las que uno o varios de los genes endógenos de la cepa CNCM I-3689 ha(n) mutado, por ejemplo a fin de modificar algunas de sus propiedades metabólicas (por ejemplo, la capacidad de esta cepa para metabolizar unos azúcares, su resistencia al tránsito intestinal, su resistencia a la acidez, su post-acidificación, o su producción de metabolitos). Puede tratarse, igualmente, de cepas que resultan de la transformación genética de la cepa CNCM I-3689 por uno o varios genes de interés, que permiten, por ejemplo, conferir a dicha cepa unas características fisiológicas suplementarias, o expresar unas proteínas de interés terapéutico o vaccíneo, que se desea administrar por medio de dicha cepa.
Estas cepas se pueden obtener a partir de la cepa CNCM I-3689, mediante las técnicas clásicas de mutagénesis aleatoria o dirigida, y de transformación genética de lactobacilos, tales como las descritas, por ejemplo, por GURY y otros (Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004) o por VELEZ y otros (Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007), o mediante la técnica denominada "mezcla de genomas " (PATNAIK y otros Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002; Wang
Y. y otros, J Biotechnol., 129, 510-15, 2007). Estas cepas poseen, en particular, un locus CRISPR de la secuencia SEC ID nº 1.
La presente invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de obtención de una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, que posee unas propiedades antimicrobianas y/o inmunomoduladoras, que comprende una etapa de mutagénesis o de transformación genética de la cepa CNCM I-3689.
La presente invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de obtención de una fracción celular, que posee unas propiedades antimicrobianas y/o inmunomoduladoras a partir de una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei conforme a la invención. Se trata, en particular, de preparaciones de ADN o de preparaciones de paredes bacterianas obtenidas a partir de cultivos de dicha cepa. Puede tratarse asimismo de sobrenadantes de cultivo o de fracciones de estos sobrenadantes.
La presente invención tiene igualmente por objeto unas composiciones que comprenden una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei conforme a la invención, o una fracción celular obtenida a partir de ésta.
Estas composiciones pueden ser, en particular, unos fermentos lácticos, que asocian una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei conforme a la invención, con una o varias otras cepas de bacterias lácticas, probióticas o no. A título de ejemplo de cepas de bacterias lácticas, se pueden citar las cepas Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus.
Puede tratarse igualmente de productos alimenticios y, en particular, de productos lácteos, o de productos farmacéuticos o cosméticos que comprenden una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei conforme a la invención, o una fracción celular obtenida a partir de ésta.
Cuando dicha cepa está presente en forma de bacterias vivas, estas estarán preferentemente presentes a razón de al menos 105 ufc por gramo, ventajosamente al menos 106 ufc por gramo de producto, más ventajosamente al menos 107 ufc por gramo y aún más ventajosamente al menos 108 ufc por gramo.
La presente invención se entenderá mejor con la lectura del complemento de descripción que sigue, que se refiere a unos ejemplos que ilustran las propiedades antimicrobianas, inmunomoduladoras y anti-infecciosas de la cepa CNCM I-3689, así como la tipificación molecular de esta cepa.
EJEMPLO 1: COMPARACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE LA CEPA CNCM I-3689 CON LAS DE LAS CEPAS PROBIÓTICAS CONOCIDAS
Las propiedades de la cepa CNCM I-3689 se han comparado con las de diferentes cepas de la técnica anterior, conocidas por sus propiedades probióticas.
La lista de estas cepas se da en la tabla I siguiente.
Tabla I
Género
Especie Denominación(es) Número de publicación de solicitudes de patente
Lactobacillus
johnsonii NCC533 = La1 = CNCM I-1225 EP0577903
Lactobacillus
acidophilus NCFM WO2004032639
Lactobacillus
acidophilus La-5
Lactobacillus
casei Shirota
Lactobacillus
paracasei CRL431 = ATCC 55544
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 US4839281
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97/09514 WO9910476
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917= DSMZ 20174=WCFS1
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 WO9391823
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112 = ATCC55730 WO2004034808
Bifidobacterium
breve ATCC 15700
Bifidobacterium
breve BBC50 = CNCM I-2219 EP1189517
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697
Bifidobacterium
longum BB536
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM I-2618
Bifidobacterium
animalis subespecielactis BB12 = ATCC 27536
Bifidobacterium
animalis subespecielactis HN019 = NM97/01925 WO9910476
1. Actividad antimicrobiana
5 La investigación de actividades antimicrobianas se ha efectuado contra tres bacterias patógenas diana: Escherichia coli E1392-75-2A, Salmonella enteritidis NIZO B1241 y Listeria monocytogenes 4B. Las bacterias lácticas se pusieron en cultivo, en cajas de Petri, en dos medios diferentes: medio Elliker (ELLIKER y otros, J. Dairy Sci., 39, 1611-1612, 1956), y medio TGV (Tryptone-Glucose-Meat Extract).
10 Las cajas son incubadas a 37ºC hasta la aparición de colonias bacterianas. Los cultivos de Bifidobacterium se han efectuado bajo anaerobiosis. Una capa de agar que contiene el medio BHI (brain-heart infusion) y el patógeno se vierten entonces en la superficie de las cajas. Las cajas se incuban de nuevo a 37ºC durante 24h. Después, alrededor de cada colonia de bacterias lácticas, se miden los diámetros de las zonas de inhibición del patógeno. La
15 puntuación 1 corresponde a un diámetro de entre 1 y 3 mm. La puntuación 2 corresponde a un diámetro de entre 4 y 6 mm. La puntuación 3 corresponde a un diámetro superior a 6 mm. Cada experimento se realizó tres veces, independientemente, para cada cepa.
Las puntuaciones obtenidas sobre los patógenos diana en cada experimento se adicionaron, para obtener, para 20 cada bacteria láctica, una puntuación global de actividad antimicrobiana.
Los resultados se dan en la tabla II siguiente.
Estos resultados muestran que entre las cepas ensayadas, la cepa CNCM I-3689 es, con la cepa ATCC 55544, la 25 que posee la actividad antimicrobiana más elevada.
Tabla II
Género
Especie Referencia (1) E. coli. Elliker (2) Listerial Elliker (3) Listerial TGV (4) Salmonella /Elliker (5) Salmonella /TGV Puntuaciones antipatógenas (1+2+3+4+5)
Lactobacillus
Paracasei subespecieparacasei DN 114121 = CNCM I-3689 3 3 2 3 2 13
Lactobacillus
paracasei CRL431=ATCC55544 2 3 3 3 2 13
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 2 1 2 3 3 11
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917= DSMZ 20174=WCFS1 2 1 2 3 2 10
Lactobacillus
casei Shirota 2 3 1 1 2 9
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97109514 1 1 2 3 2 9
Lactobacillus
johnsonii NCC533=La1=l-1225 1 1 1 2 1 6
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 1 1 1 1 1 5
Lactobacillus
acidophilus La-5 1 1 2 0 1 5
Lactobacillus
acidophilus NCFM 1 1 1 0 1 4
Bifidobacterium
animalis subespecie lactis BB12 = ATCC 27536 1 0 0 0 2 3
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 0 1 0 1 0 2
Bifidobacterium
longum BB536 0 0 0 0 0 0
Bifidobacterium
animalis subespecie lactis HN019 = NM97/01925 0 0 0 0 0 0
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016 0 0 0 0 0 0
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697 0 0 0 0 0 0
Bifidobacterium
breve BBC50 = 1-2219 0 0 0 0 0 0
Bifidobacterium
breve ATCC 15700 0 0 0 0 0 0
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM 1-2618 0 0 0 0 0 0
2. Inmunomodulación
5 Las propiedades inmunomoduladoras de las diferentes bacterias lácticas se han evaluado mediante la medición de la proporción IL-10/IL-12.
Extracciones de sangre humana, obtenidas de sujetos sanos, se han diluido a una proporción 1:2 con PBS-CA
(GIBCO) y purificado gracias a un gradiente de Ficoll (GIBCO). Después de una centrifugación a 400 g durante 30 10 minutos a 20°C, se han extraído las PBMC ("células mononucleares de sangre periférica"). Se han efectuado
después tres etapas de lavado y, a continuación, se han resuspendido las PBMC en un medio de cultivo RPMI
(GIBCO) suplementado con el 1% de suero de ternera fetal, el 1% de L-glutamina (GIBCO) y 150 g/ml de
gentamicina (GIBCO). Las PBMC se han contado con microscopio y ajustadas a una concentración de 2x 106
células/ml, y después se han distribuido (en alícuotas de lml) en unas placas de 24 pocillos de cultivos celulares 15 (Corning, Inc.).
Las cepas de Lactobacillus se cultivaron en medio MRS (DE MAN y otros, J. Appl. Bacteriol. 23, 130-135, 1960), y las cepas de Bifidobacterium en medio MRS, suplementado con el 0,03% de L-cisteína (Sigma) bajo anaerobiosis. Todas las cepas se incubaron a una temperatura de 37ºC. El crecimiento de las bacterias se detuvo en la fase estacionaria, y las bacterias se lavaron después y se resuspendieron a una concentración de 3 unidades MacFarlan en PBS, que contiene el 20% de glicerol.
5 Un volumen de 10 l de preparación bacteriana fue añadido en cada pocillo de las placas que contienen las PBMC (proporción bacterias: célula 10:1). Las placas se incubaron durante 24h a 37ºC bajo una atmósfera que contiene el 5% de CO2. El sobrenadante se aspiró después, se centrifugó a 2000 rpm y se almacenó a -20ºC.
10 Las cepas bacterianas control, con propiedades inmunomoduladoras conocidas, se incluyeron en el ensayo. Se utilizó también PBS al 20% de glicerol, sin bacterias, como control negativo. El experimento se realizó para cada cepa sobre unas PBMC procedentes de tres donantes diferentes.
La expresión de las citoquinas se midió mediante los ensayos ELISA utilizando unos kit comerciales (Pharmingen, 15 BD Biosciences). Se han estudiado dos citoquinas: IL-10 e IL-12.
Para cada cepa ensayada, se ha calculado la media de la proporción IL-10/IL-12. Estos resultados son reunidos en la tabla III siguiente.
20 Tabla III
Género
Especie Referencia Proporción IL-10/IL-12
Lactobacillus
paracasei subespecie paracasei DN 114121 = CNCM 1-3689 11,8
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 12,7
Lactobacillus
acidophilus La-5 23,5
Lactobacillus
acidophilus NCFM 23,6
Lactobacillus
johnsonii NCC533=La1=I-1225 23,7
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917= DSMZ 20174=WCFS1 25,0
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 25,4
Bifidobacterium
longum BB536 26,4
Bifidobacterium
animalis subespecie lactis HN019 = NM97/01925 28,7
Bifidobacterium
animalis subespecie lactis BB12 = ATCC 27536 32,4
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 34,5
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016 42,0
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697 51,4
Bifidobacterium
breve BBC50 = 1-2219 58,6
Lactobacillus
casei Shirota 67,6
Bifidobacterium
breve ATCC 15700 68,5
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM 1-2618 72,6
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97/09514 92,1
Lactobacillus
paracasei CRL431=ATCC55544 164,0
Estos resultados muestran que la cepa CNCM I-3689 presenta importantes propiedades antiinflamatorias en este modelo. Ninguna de las cepas de referencia ensayadas presenta tan buenas propiedades.
25 La figura 1 representa la proporción IL-10/IL-12 de cada cepa bacteriana en función de su puntuación anti-patógena (unidad arbitraria) determinada anteriormente. Esta figura muestra hasta qué punto la cepa CNCM I-3689 se diferencia con respecto a las demás cepas ensayadas.
3. Supervivencia al estrés intestinal
Se ha utilizado un modelo in vitro que refleja las condiciones de estrés intestinal.
5 Se realizan unos cultivos de bacterias lácticas en leche suplementada con el extracto de levadura. Los cultivos se incuban durante 24 a 48h, según las especies (hasta la fase estacionaria de cultivo).
Se realiza un jugo intestinal artificial compuesto de sales biliares de cerdo (en 3,3 g/l) y de tampón carbonato NaHCO3 (en 16,5 g/l). El pH se ajusta a 6,3. Se añade 1 ml de este jugo intestinal a 100 l de cultivo bacteriano. Los 10 cultivos se incuban después durante 5 horas. Después, se evalúan sobre las cajas las poblaciones bacterianas antes y después del estrés.
Los valores son expresados de la manera siguiente: estrés intestinal = log (ufc5h/ufc0h).
15 Siendo ufcXmin la concentración en bacterias expresada en Unidades que Forman Colonias (UFC) después de X minutos de incubación.
Para el estrés intestinal, la supervivencia es buena cuando el valor es superior a -0,5, medianamente buena cuando el valor está comprendido entre -0,5 y -1,5 y mala cuando el valor es inferior a -1,5. 20 Los resultados son dados en la tabla IV siguiente.
Tabla IV
Género
Especie Referencia Estrés intestinal
Lactobacillus
paracasei subespecie paracasei DN 114121 = CNCM I-3689 -0,40
Bifidobacterium
animalis subespecie lactis HN019 = NM97/01925 3,40
Bifidobacterium
infantis ATCC 15697 2,79
Lactobacillus
reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 1,00
Lactobacillus
johnsonii NCC533=La1=I-1225 0,69
Bifidobacterium
animalis subespecie lactis BB12 = ATCC 27536 0,07
Lactobacillus
paracasei CRL431=ATCC55544 0,04
Lactobacillus
rhamnosus HN001 = NM97/09514 0,00
Lactobacillus
rhamnosus LGG = ATCC 53103 -0,07
Bifidobacterium
breve ATCC 15700 -0,14
Bifidobacterium
longum NCC2705 = CNCM 1-2618 -0,22
Lactobacillus
acidophilus La-5 -0,23
Lactobacillus
plantarum ATCC 14917= DSMZ 20174=WCFS1 -0,79
Bifidobacterium
breve BBC50 = I-2219 -0,91
Lactobacillus
plantarum Probi 299v = DSM 9843 -1,04
Bifidobacterium
longum BB536 -1,12
Lactobacillus
acidophilus NCFM -1,45
Lactobacillus
casei Shirota -1,50
Lactobacillus
reuteri DSMZ 20016 -1,91
25 4. Conclusión
Los resultados ilustrados en las tablas II, III y IV anteriores muestran que, entre las diferentes cepas ensayadas, la cepa CNCM I-3689 es la única en presentar, al mismo tiempo, unas propiedades antimicrobianas y unas propiedades anti-inflamatorias importantes, acompañadas además de buenas propiedades de resistencia al estrés
30 intestinal.
EJEMPLO 2: CRECIMIENTO SOBRE LECHE DE LA CEPA CNCM I-3689
Las propiedades de crecimiento sobre leche de la cepa CNCM I-3689 se han ensayado utilizando el protocolo siguiente:
-
Un medio constituido de leche desnatada, reconstituida por agua adicionada de polvo de leche desnatada, ha sido inoculado con la cepa CNCM I-3689 (5, 6x106 ufc/g o 1, 1x107 ufc/g).
-
la actividad fermentaria de esta cepa, relacionada a su crecimiento, se mide siguiendo de manera continua el pH del medio de crecimiento.
Los resultados se ilustran por la gráfica presentada en la figura 2.
Estos resultados muestran que la cepa CNCM I-3689 es capaz de crecer eficazmente sobre la leche y que, por lo tanto, se puede utilizar en la fabricación de productos lácteos fermentados.
EJEMPLO 3: TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE LA CEPA CNCM I-3689
Numerosos organismos procariotas poseen uno o varios loci CRISPR -acrónimo para " Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats" (Jansen y otros, 2002, OMICS, Vol. 6, Nb 1, 23-33). Un locus CRISPR se caracteriza por unas secuencias repetidas (o DR) no contiguas, generalmente de 21 a 37 pares de bases (pb), separadas por unas secuencias únicas, generalmente de 20 a 40 pares de bases, denominadas secuencias variables ("spacers"). De una cepa bacteriana a otra, es posible observar diferencias sobre:
-
el número de loci CRISPR,
-
la posición de los loci CRISPR en el genoma,
-
el número de secuencia repetidas, y/o
-
la naturaleza y/o el tamaño de las secuencias variables.
1. Identificación del locus CRISPR de la cepa CNCM I-3689
Se ha secuenciado la cepa CNCM I-3689. El análisis de su genoma, con la ayuda de la sucesión de programas ERGOTM, ha permitido identificar un solo locus CRISPR en esta cepa. Este locus, de un tamaño de 3323 pbs, se sitúa a 20 pares de bases más abajo del ORF RDBK00370. Su secuencia de ADN genómico está representada mediante la secuencia SEC ID nº 1. Está compuesto de una unidad repetitiva (GTTTTCCCCGCACATGCGGGGGTGATCC; SEC ID nº 2) que es idéntica a la del locus CRISPR de la cepa ATCC 334 (LActobacillus casei), y de 54 secuencias variables ("spacers").
2. Construcción de cebadores para la amplificación PCR, específicos de la cepa CNCM I-3689
Se han definido varios pares de cebadores oligonucleotídicos a partir de las secuencias variables del locus CRISPR de la cepa CNCM I-3689. Se han ensayado estos cebadores mediante amplificación PCR sobre varias cepas bacterianas, a fin de verificar su especificidad para la cepa CNCM I-3689.
Se ha retenido un par de cebadores:
-
cebador OFF2486 (CTCAACAGGATAAGTGCCAC; SEC ID nº 3), situado en la 33ª secuencia variable del locus CRISPR, en las posiciones 2049-2068; TM = 60°C;
-
cebador OFF2488 (GGTTGGCTGGGTTTAACGC; SEC ID nº 4), situado en la 37ª secuencia variable del locus CRISPR, en las posiciones 2093-2110; TM = 60°C.
Las condiciones de PCR retenidas son las siguientes:
Mezcla de reacción:
ADN: 1 dNTPs: 4 Tampón 10X: 5 Cebador OFF24 86: Cebador OFF24 88: ADN polimerasa Ex taq™ : Agua:
ciclos:
10 El tamaño esperado del producto de PCR a partir de la cepa CNCM I-3689 es de 263 pbs.
El par de cebadores OFF2486/OFF2488 se ha ensayado sobre la cepa CNCM I-3689 y sobre otras 18 cepas de Lactobacillus casei diferentes, entre ellas las cepas CNCM I-1518 y ATCC 334. Las cepas CNCM I-1518 y ATCC 334 representaban los controles negativos, ya que dichos cebadores no pueden hibridarse a la secuencia de ADN
15 genómico de estas cepas en las condiciones de PCR descritas anteriormente.
Los resultados se ilustran mediante la electroforesis sobre gel de agarosa de los productos de amplificación PCR, representada en la figura 3, en la que "121" representa la cepa CNCM I-3689, "001" representa la cepa CNCM I-1518, "S3" a "S18" representan respectivamente 16 cepas diferentes de Lactobacillus casei y "SL" representa un
20 marcador de peso molecular (SmartLadder ; Eurogentec).
Estos resultados muestran que el par de cebadores OFF2486/OFF2488 es bien específico de la cepa CNCM I-3689, en la medida en la que se han obtenido unos productos de amplificación PCR del tamaño esperado (es decir, de aproximadamente 260 pbs) únicamente para esta cepa.
25 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> COMPAÑÍA GERVAIS DANONE CHAMBAUD, Isabelle KHLEBNIKOV, Artem VILLAIN, Anne-Catherine GROMPONE, Gianfranco SAINT DENIS, Thierry DRUESNE, Anne SMOKVINA, Tamara
30 <120> NUEVA CEPA DE LACTOBACILLUS PARACASEI SUBESPECIE PARACASEI DOTADA DE PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS E INMUNOMODULADORAS
<130> F191PCT233 <160>4
<170> PatentIn versión 3.3 35 <210> 1
<211> 3323
<212> ADN
<213> Lactobacillus paracasei
<400> 1
<210> 2
<211> 28
<212> ADN
<213> Lactobacillus paracasei
5 <400> 2 gttttccccg cacatgcggg ggtgatcc 28
<210> 3
<211> 20 10 <212> ADN
<213> Lactobacillus paracasei
<400> 3 ctcaacagga taagtgccac 20
15 <210> 4
<211> 19
<212> ADN
<213> Lactobacillus paracasei
<400> 4 20 ggttggctgg gtttaacgc 19

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, que posee propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras, caracterizada porque es la cepa depositada en la CNCM bajo el número I-3689.
  2. 2.
    Cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, que posee propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras, caracterizada porque es susceptible de ser obtenida a partir de una cepa, según la reivindicación 1, por mutagénesis o transformación genética, y porque posee las propiedades antimicronianas e inmunomoduladoras de la cepa CNCM I-3689 y/o posee un locus CRISPR de la secuencia SEC ID nº 1.
  3. 3.
    Procedimiento de obtención de una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, que posee propiedades antimicrobianas y/o inmunomoduladoras, caracterizado porque comprende una etapa de mutagénesis o de transformación genética de la cepa CNCM I-3689.
  4. 4.
    Procedimiento de obtención de una fracción celular que posee propiedades antimicrobianas y/o inmunomoduladoras, caracterizado porque dicha fracción celular se obtiene a partir de una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
  5. 5.
    Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha fracción celular se selecciona del grupo constituido por: una preparación de ADN, una preparación de paredes bacterianas, un sobrenadante de cultivo y una fracción de dicho sobrenadante.
  6. 6.
    Composición que comprende una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una fracción celular obtenida según el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.
  7. 7.
    Composición, según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de un producto alimenticio.
  8. 8.
    Composición, según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de un producto farmacéutico.
  9. 9.
    Composición, según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de un producto cosmético.
  10. 10.
    Utilización de una cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una fracción celular obtenida según el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, para la obtención de una composición seleccionada del grupo constituido por un grupo alimenticio, un producto farmacéutico y un producto cosmético.
  11. 11.
    Cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para su utilización como agente inmunomodulador.
  12. 12.
    Cepa de Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para su utilización como agente antimicrobiano.
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