ES2545769T3 - Anticuerpos neutralizantes del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humano - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo que comprende (a) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 19 y que además comprende una región variable de la cadena pesada seleccionada de: (i) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 21; (ii) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 22; (iii) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 52; y (iv) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 53; o (b) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 54 y que además comprende una región variable de la cadena pesada seleccionada de: (i) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 23; (ii) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 26; y (iii) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 28; o (c) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 55 y que además comprende una región variable de la cadena pesada seleccionada de: (i) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 21; y (ii) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 22; o (d) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 34 y que además comprende una cadena pesada seleccionada de: (i) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 35; (ii) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 37; (iii) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 40; (iv) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 42; y (v) una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 48.

Description

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torrente sanguíneo de un paciente de una manera dependiente del tamaño, siendo excretadas y eliminadas las moléculas pequeñas antes que las grandes. Puesto que el complejo de los dos polipéptidos -anticuerpo o fragmento de anticuerpo y GM-CSF unido -es obviamente mayor que el anticuerpo solo, la baja koff mencionada anteriormente tiene el efecto de que el neutralizador terapéutico se excreta y elimina del cuerpo del paciente más lentamente de lo que sería el caso, si no estuviera unido a GM-CSF. Por tanto, no solo la magnitud de la actividad neutralizante sino también su duración in vivo aumenta.

Por último, la actividad neutralizante determinada para unidores según estas formas de realización especialmente preferidas es sorprendentemente alta. Como se describirá en más detalle en el presente documento posteriormente, la actividad neutralizante se medió in vitro usando un ensayo de inhibición de crecimiento de TF-1 (Kitamura, T. et al. (1989). J Cell Physiol 140, 323-34). Como una indicación del potencial neutralizante, se midieron valores de CI50, CI50 representa la concentración de anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo según cualquiera de estas formas de realización de la invención requerida la inducir una inhibición semimáxima de la proliferación celular de TF-1. Para anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de los mismos según cualquiera de estas formas de realización de la invención se determinó un valor CI50 de aproximadamente 3 x 10-10 M, o aproximadamente 0,3 nM. Las moléculas de unión según cualquiera de estas formas de realización de la invención son por tanto neutralizadores muy potentes de la actividad de GM-CSF de primates.

En resumen, por tanto, un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo según cualquiera de las formas de realización anteriores de la invención muestra alto grado de distinción para el antígeno deseado, se une a este antígeno de forma extremadamente estrecha y durante un largo tiempo y muestra actividad neutralizante muy potente durante el tiempo que permanece unido. Al mismo tiempo, la larga persistencia del complejo unidor-antígeno ralentiza la eliminación de este unidor del cuerpo, alargando de esta manera la duración del efecto terapéutico deseado in vivo.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo como se describe en el presente documento.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo o una molécula de polinucleótido como se describe en el presente documento.

Según esta invención, el término “composición farmacéutica” se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para la administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o por inyección directa en el tejido. En particular se prevé que dicha composición farmacéutica se administre a un paciente a través de infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas se puede efectuar por diferentes rutas, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un soporte farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tal como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, liposomas, etc. Las composiciones que comprenden tales soportes se pueden formular por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. La pauta de dosis la determinará el médico y factores clínicos. Como se sabe bien en las técnicas médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, el compuesto particular que se va administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general y otros fármacos que se administren al mismo tiempo. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tal como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los soportes acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato, o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen reaprovisionadores de líquido y nutrientes, reaprovisionadores de electrolitos (tal como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tal como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y similares. Además, la composición farmacéutica de la presente invención podría comprender soportes proteinaceos como, por ejemplo, seroalbúmina o inmunoglobulina, preferiblemente de origen humano. Se prevé que la composición farmacéutica de la invención pudiera comprender, además del anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo (como se describe en esta invención), más agentes biológicamente activos, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Tales agentes podrían ser fármacos que actúan sobre el aparato digestivo, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben inmunorreacciones (por ejemplo, corticoesteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como citoquinas conocidos en la técnica.

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Un aspecto adicional de la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo como se ha descrito en el presente documento anteriormente o una molécula de polinucleótido como se describe en el presente documento anteriormente, que opcionalmente comprende uno o más agentes antiinflamatorios para su uso en un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias. Las enfermedades inflamatorias se eligen ventajosamente del grupo que consiste en artritis reumatoide (AR) (incluyendo AR que es resistente a tratamiento con neutralizantes de TNF-alfa), asma, esclerosis múltiples (EM), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) enfermedad de Crohn, fibrosis pulmonar idiopática (FPI), enfermedad intestinal inflamatoria (EII), uveítis, degeneración macular, colitis, psoriasis, degeneración walleriana, síndrome antifosfolípido (SAF), síndrome coronario agudo, restinosis, ateroesclerosis, policondritis recidivante (PR), hepatitis aguda o crónica, implantes ortopédicos fallidos, glomerulonefritis, lupus o trastornos autoinmunitarios.

De especial interés es el anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo según la invención para su uso en un método de tratamiento de AR (incluyendo AR que es resistente a tratamiento con neutralizantes de TNF-alfa), asma, EM y/o enfermedad de Crohn.

Con respecto a AR, asma y/o EM, hay dos teorías populares respecto a la patogénesis de artritis reumatoide (AR). La primera sostiene que la célula T, a través de interacciones con un antígeno -todavía no identificado -es la célula principal responsable para el inicio de la enfermedad así como para dirigir el proceso inflamatorio crónico. Esta teoría se basa en la asociación conocida de AR con antígenos de histocompatibilidad principal de clase II, el gran número de células T CD4+ y uso sesgado de genes del receptor de células T en la membrana sinovial de AR. Se sabe que el GM-CSF aumenta la función presentadora de antígenos al aumentar la expresión de MHC de clase II de superficie y el GM-CSF está producido por células T, lo que indica un papel putativo para GM-CSF en la evolución de la enfermedad según la hipótesis basada en células T.

La segunda teoría sostiene que, mientras las células T pueden ser importantes en iniciar la enfermedad, la inflamación crónica se autoperpetúa por macrófagos y fibroblastos de una manera independiente de células T. Esta teoría se basa en la ausencia relativa de fenotipos de células T activadas en AR crónica y la preponderancia de fenotipos de macrófagos y fibroblastos activados. GM-CSF es un potente estimulador de macrófagos y fomenta la proliferación de monocitos y macrófagos.

GM-CSF sabido que se produce principalmente por células “efectoras” (macrófagos) y células de tejido conjuntivo (fibroblastos) se expresa en abundancia en la membrana sinovial y líquido sinovial de AR, medido por ELISA o estudios de ARNm. Según la “teoría de macrófago-fibroblasto” de AR, estos dos tipos de células parecen ser en gran parte responsables de crear un estado autoperpetuante de inflamación crónica en el que la participación de células T puede ya no ser crítica. En este escenario, los macrófagos activados secretan continuamente IL-1 y TNF que mantienen el fibroblasto sinovial en un estado activado. El fibroblasto a su vez, secreta grandes cantidades de: a) citoquinas -IL6, IL8 y GM-CSF); b) prostaglandinas; y c) enzimas proteasas. GM-CSF se retroalimenta para fomentar la maduración de monocitos recién reclutados a macrófagos. IL8 e IL-6 contribuyen al reclutamiento y/o activación de aún otras poblaciones celulares, mientras que las prostaglandinas y proteasas actúan directamente para erosionar y destruir tejidos conjuntivos cercanos tal como hueso y cartílago.

Con respecto a la enfermedad de Crohn, el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos recombinante humano (rGM-CSF) de levadura ha mostrado eficacia en el tratamiento de enfermedad de Crohn de moderada a grave (Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002). Lancet 360, 1478-80). Desde entonces varios artículos de revisión han especulado sobre el efecto terapéutico de esta potente citoquina proinflamatoria en esta enfermedad, que se piensa que es de una naturaleza inflamatoria. Las posibles explicaciones para modo de acción de rGM-CSF incluían un componente de inmunodeficiencia en la enfermedad de Crohn, diferenciación hacía Th2 y expansión de células dendríticas que fomentan la diferenciación de células T reguladoras (Wilk NJ, Viney JL (2002). Curr Opin Invest Drugs 3, 1291-6; Folwaczny C et al. (2003). Eur J Gastroenterol Hepatol 15, 621-6). Los inventores creen que se puede proponer un modo de acción más sencillo, que al mismo tiempo sea más consistente con el papel conocido de GM-CSF en otras enfermedades proinflamatorias.

GM-CSF es uno de lo adyuvantes más potentes conocidos, que es por lo que la citoquina se coadministra en numerosos ensayos de vacunación en marcha. Al mismo tiempo, GM-CSF es muy inmunogénico (Ragnhammar P et al. (1994). Blood 84, 4078-87). Un estudio muy reciente (Rini B et al. (2005) Cytokine 29, 56-66) ha mostrado que el tratamiento subcutáneo diario con rGM-CSF de levadura, como se realiza en el ensayo de la enfermedad de Crohn (Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002). Lancet 360, 1478-80), produjo en tres meses en el 87% (13/15) de pacientes de cáncer de próstata, el desarrollo de anticuerpos contra la citoquina. El sesenta por ciento de los pacientes (9/15) desarrollaron anticuerpos neutralizantes contra GM-CSF (policlonales). La posibilidad de una respuesta neutralizante a GM-CSF no se investigó en el ensayo de la enfermedad de Crohn, ni se determinaron los niveles en suero de GM-CSF con la terapia. Dentro del ámbito de esta forma de realización de la invención, se contempla que pacientes con la enfermedad de Crohn tratados con rGM-CSF no respondieran directamente solo a la actividad inmunoestimuladora de la citoquina, sino también, al menos en parte, respondieran clínicamente a una respuesta de anticuerpo que neutraliza tanto el GM-CSF administrado así como el endógeno, que se sabe que se sobreproduce en la enfermedad de Crohn (Agnholt J et al. (2004) Eur Gastroenterol Hepatol 16, 649-55). Por tanto, los anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF, pueden tener una actividad terapéutica similar en la enfermedad de Crohn que rGM

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a su receptor se inhibe de la manera anterior, se esperaría observar una disminución en la intensidad de la tinción de fluorescencia de células TF-1 por rhGM-CSF marcado con fluoresceína (rhGM-CSF-FITC) en un ensayo basado en citometría de flujo.

Lo siguiente describe los resultados de tal ensayo basado en citometría de flujo. Se incubó una concentración final de rhGM-CSF-FITC 0,4 μg/ml conjugado en PBS con 10 μg/ml de anticuerpo materno o extracto periplásmico sin diluir del scFv que se había purificado con la columna de centrifugación NiNTA. Las muestras de proteína se dejaron equilibrar a 25ºC durante 1 h antes de la adición de una suspensión de células TF-1. Las células TF-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco; L-glutamina, sin rojo fenol), SFT inactivado por calor al 10% en ausencia de rhGM-CSF durante la noche. Se usaron una concentración final de 2 x 10exp6 células/ml y 150 μl de suspensión de células por muestra. Las células se recogieron por centrifugación a 500 x g a 4ºC durante 3 min y se lavaron dos veces con tampón FACS. Las células lavadas se resuspendieron en 100 μl de muestra de proteína preequilibrada que contenía el rhGM-CSF-FITC y el anticuerpo materno respectivo o scFv. Las muestras se incubaron a 4ºC durante 60 minutos. Después de dos lavados adicionales las células se resuspendieron en 150 μl de tampón de FACS helado y posteriormente se analizaron por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la figura 2. Específicamente, la figura 2 muestra un gráfico en el que varias moléculas de prueba se organizan a lo largo del eje x, y en la que la intensidad media de fluorescencia (“IMF”) se indica en el eje y. Como se puede ver en la figura 2, se observó una clara pérdida de intensidad de fluorescencia de las células TF-1 con el anticuerpo materno (segundo desde la izquierda a lo largo del eje x). La competición de la unión a rhGM-CSF de la molécula de scFv designada 5-306 se pudo seguir por pérdida en la tinción de fluorescencia de células TF-1 mientras que la molécula de scFv 4-301 apenas mostró efecto. Puesto que estos resultados sugieren que la molécula de scFv designada 5-306 puede ser un neutralizador prometedor de GM-CSF, el análisis adicional de la actividad neutralizante se restringió a scFv 5-306.

Ejemplo 2.2.6.3: Expresión y purificación de gran escala de scFv cabeza de serie

La producción y purificación de proteína a gran escala se realizó como sigue. Brevemente, se transformaron E. coli BL21DE3 con el plásmido de expresión y se hicieron crecer a 37ºC en 1 L de medio selectivo hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,5-0,8. La producción de proteína se indujo por adición de IPTG a 1 mM y los cultivos se incubaron durante otras 16 h con agitación a una temperatura de 25ºC. Las células se recogieron por centrifugación a 5.000 x g durante 10 min y se resuspendieron en 100 ml de 1 x PBS. Las proteínas periplásmicas se extrajeron por congelación óptima, secuencial en etanol/nieve carbónica y descongelación en un baño de agua a 37ºC durante cuatro ciclos. Por último, el extracto se centrifugó a 10.000 x g durante 20 min.

El scFv 5-306 se aisló en un proceso de purificación de dos pasos de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) y filtración en gel. Todos los cabezas de serie se purificaron según este método. Se usaron el sistema de FPLC Äkta® (Pharmacia) y el software Unicorn® para la cromatografía. Todos los productos químicos eran de grado de investigación y se compraron de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).

Se realizó IMAC usando una columna Ni-NTA Superflow de Qiagen según el protocolo proporcionado por el fabricante. La columna se equilibró con tampón A2 (fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCl 0,4 M) y la PPP (100 ml) se aplicó a la columna (2 ml) a una velocidad de flujo de 2 ml/min. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón B2 al 5% (fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCl 0,4 M, imidazol 0,5 M) para eliminar la nuestra no unida. La proteína unida se eluyó usando tampón B2 al 100% en 5 volúmenes de columna. Las fracciones de proteína eluída se juntaron para purificación adicional.

La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna HiLoadTM 16/60 Superdex 75 Prep Grade (Pharmacia) equilibrada con PBS (Gibco). Las muestras de proteína eluída (velocidad de flujo 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia estándar para la detección. Antes de la purificación, la columna se calibró para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). La separación dependiente de tamaño en la columna Superdex 75 Prep Grade produjo fracciones de picos claramente distinguibles de monómero y dímero asociativo de los cabezas de serie scFv. Las concentraciones de proteína se determinaron midiendo la densidad óptica 280 nm y se calcularon usando el coeficiente de extinción molecular específico de secuencia del respectivo cabeza de serie scFv.

Ejemplo 2.2.6.4: Inhibición de la proliferación dependiente de rhGM-CSF de células TF-1 por un scFv cabeza de serie

El fin de este experimento es alcanzar información cualitativa sobre la actividad neutralizante del scFv 5-306 semihumano usando la línea celular TF-1 dependiente de hGM-CSF (DSMZ ACC 334). Las células TF-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco; L-glutamina, sin rojo fenol), SFT inactivado por calor al 10% en presencia de rhGM-CSF 2,5 ng/ml como describe el distribuidor (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Braunschweig, Alemania). Las células se hicieron crecer a una densidad celular de 0,5 x 10exp6 células/ml. Para el ensayo de proliferación las células TF-1 se recogieron por centrifugación a 300 x g durante 4 min y se lavaron con PBS 1x (Dulbecco, Gibco). Las células se resuspendieron a una concentración final de 1 x 10exp5 células/ml en RPMI 1640, SFT al 10% y se usaron 90 μl de suspensión de células por pocillo de placa de cultivo celular de fondo plano Microtest (0,9 x 10exp4 células/pocillo). Se usó una concentración final de rhGM-CSF de 0,3

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segundos y extensión del cebador a 72ºC durante 90 segundos se realizaron durante 40 ciclos, seguido por una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. Mediante este paso de PCR y la respectiva secuencia del cebador 3’, los segmentos VH humanos se prolongan para una parte de la CDR3 de VH materna, que después a su vez es el sitio de cebado para el cebador 3’ del segundo paso de PCR.

Estos fragmentos de ADN VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) se usaron después como moldes en una segunda reacción de PCR usando de nuevo el respectivo cebador específico 5’-VH y un cebador 3’ universal coincidente con el extremo 3’ universal de los fragmentos de ADN amplificados (3'-Lib 134-JH3-BstE2, 5'-AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC TTG GCC CCA GTA ATC AAA GTA GAC TGC-3').

Se usó el siguiente programa de PCR para la amplificación: desnaturalización a 94ºC durante 15 segundos, hibridación de cebadores a 52ºC durante 50 segundos y extensión del cebador a 72ºC durante 60 segundos se realizaron durante 40 ciclos, seguido por una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. Los fragmentos V de ADN se aislaron según protocolos estándar.

Ejemplo 2.3.3: Construcción de biblioteca -clonación del grupo de VH humanas

En una segunda ronda del método anterior, la VL humana de scFv 5-306 identificada en la primera, selección previa se eligió, y posteriormente se combinó con la biblioteca de fragmentos de VH humana descrita en el ejemplo 2.3.2 con el fin de generar un scFv humano. Se construyó generalmente una biblioteca de presentación en fagos en base a procedimientos estándar, como se divulga, por ejemplo, en "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Los fragmentos de ADN de cadena pesada de las diferentes amplificaciones por PCR se ponderaron para cada ligación como sigue:

a:b:c.d:e:f = 3:1:3:1:1:1, en donde a-f tienen los siguientes significados.

a) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 b) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 c) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MI-13 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 d) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE

Se montó una reacción de ligación que consistía en 400 ng del grupo de fragmentos Lib 134-VH humanos (digeridos con XhoI-BsteII) y 1200 ng del plásmido pComb3H5BHis/5-306 VL (el ADN que codifica la región VL de scFv 5-306 se clonó a través de los sitios de restricción SacI y SpeI en pComb3H5BHis según procedimientos estándar). El grupo de VH humano de anticuerpo resultante se transformó después en 300 μl de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de hueco, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) produciendo un tamaño de biblioteca de 1,6 x 10exp8 clones independientes en total.

Después de la electroporación el ensayo se incubó en caldo SOC (Fluka) para la expresión del fenotipo. Los cultivos se incubaron después cada uno en 500 ml de medio de selección SB que contenía carbenicilina 50 μg/ml y glucosa al 2% v/v durante la noche. Al día siguiente, las células se recogieron por centrifugación y la preparación del plásmido se llevó a cabo usando un kit de preparación de plásmido comercialmente disponible (Qiagen) para conservar la genoteca de ADN.

1,5 μg de este grupo de plásmidos que codifican el respectivo conjunto de scFv se electroporaron después en E. coli XL1blue (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de hueco, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) produciendo un tamaño de biblioteca de 2,4 x 10exp9 clones independientes en total. Después de la expresión del fenotipo y adaptación lenta a carbenicilina la biblioteca de anticuerpos se transfirió a medio de selección SB-carbenicilina (50 μg/ml). La biblioteca de anticuerpo se infectó después con una dosis infecciosa de 1 x 10exp12 partículas de fago auxiliar VCSM13 dando como resultado la producción y secreción de fago filamentoso M13, en donde cada partícula de fago contenía pComb3H5BHis-ADN que codifica un fragmento scFv humano monocatenario y presentaba la correspondiente proteína scFv como una fusión de traducción a la proteína de cubierta del fago III.

Ejemplo 2.3.4: Selección por presentación en fago de una VH humana

La biblioteca de fago resultante que tiene el repertorio de scFv clonado se recogió del sobrenadante de cultivo por precipitación con PEG8000/NaCl y centrifugación. Aproximadamente de 1 x 10exp11 a 1 x 10exp12 partículas de fagos de scFv se resuspendieron en 0,4 ml de PBS/BSA al 0,1% y se incubaron con rhGM-CSF soluble biotinilado recombinante (material de E. coli, como se describe en el ejemplo 1) durante 1 h con agitación suave en un volumen total de 0,5 ml. Después se añadieron 6,7 x 10exp7 bolas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal) y se incubó adicionalmente con agitación suave durante 30 minutos.

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Los fagos de scFv que no se unió específicamente al antígeno diana se eliminaron por pasos de lavado con PBS/BSA al 0,1%. Para ese fin los complejos antígeno biotinilado-bolas de estreptavidina (con los potenciales scFv unidores) se recogieron mediante un imán y se resuspendieron en 1 ml de solución de lavado (un paso de lavado). Este procedimiento de lavado se repitió hasta cuatro veces. Después de lavar, las entidades de unión se eluyeron usando HCl-glicina pH 2,2 y después de la neutralización con Tris 2 M pH 12, el eluato se usó para la infección de un cultivo de E. coli XL1 Blue sin infectar fresco.

Para eluir el resto de las entidades de alta unión las bolas se resuspendieron directamente en 200 μl de un cultivo de

E. coli XL1 blue fresco (DO600 ≥ 0,5) y se incubó durante 10 minutos con agitación suave. Ambos cultivos se mezclaron después y las células transducidas con éxito con una copia de fagémido, que codifica un fragmento scFv humano, se seleccionaron de nuevo para resistencia a carbenicilina y posteriormente se infectaron con fago auxiliar VCSM13 para empezar la segunda ronda de presentación de anticuerpo y selección in vitro.

Se llevaron a cabo un total de 4 rondas de selección para los dos anticuerpos. Las concentraciones de antígeno se disminuyeron durante la selección hasta las concentraciones finales como sigue:

1ª ronda 100 nM 2ª ronda 10 nM 3ª ronda 10 nM 4ª ronda 10 nM

Se aisló ADN de plásmido de cultivos de E. coli correspondiente a 3 y 4 rondas de adsorción.

Para la producción de proteína scFv soluble los fragmentos de ADN VH-VL se cortaron del plásmido (XhoI-SpeI), y se clonaron a través de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His (sin proteínas de fago adicionales requeridas para la infección del fago). Después de la ligación cada grupo (diferentes rondas de adsorción) de ADN de plásmido se transformó en 100 μl de E. coli TG1 competentes por choque térmico y se plaquearon en LB-agar con carbenicilina. Se cogieron colonias individuales y se inocularon en 120 μl de LB carb (50 μg/ml) glucosa al 1% en placas de 96 pocillos (Greiner). Los pocillos se sellaron con una membrana semipermeable (Greiner) y las placas se incubaron durante la noche a 37ºC en un incubador con agitación (placa principal). A continuación 10 μl de cultivos de la placa principal se transfirieron a una segunda placa de 96 pocillos (placa de trabajo) que contenía 90 μl de LB carb (50 μg/ml) glucosa al 1% por pocillo. Después de incubar durante 4 horas en un incubador con agitación a 37ºC, la producción de scFv se indujo añadiendo 20 μl de LB carb IPTG 6 mM a cada pocillo. Después de otro paso de incubación durante la noche a 30ºC con agitación, las células se lisaron en una incubación de 1 hora a temperatura ambiente con 40 μl de tampón de lisis (ácido bórico 400 mM, NaCl 320 mM, EDTA 4 mM pH 8, lisozima 2,5 mg/ml). Se separaron las células residuales y restos celulares por centrifugación durante 12 minutos a 1.900 x g (Hettich).

Los sobrenadantes que contenían moléculas scFv se ensayaron después para unión en ensayos ELISA. La detección de fragmentos scFv unidos a antígeno rhGM-CSF inmovilizado (Leukine) se llevó a cabo usando un antiflag M2 (1 μg/ml en PBS/BSA al 1%) y se detectó con anticuerpo policlonal de cabra específico anti Fab2 de ratón conjugado a peroxidasa de rábano (Dianova, 1 μg/ml en PBS/BSA al 1%). La señal de formó añadiendo solución de sustrato ABTS y se detectó a una longitud de onda de 405 nm.

De aproximadamente 100 clones ensayados después de la tercera ronda de selección, 12 clones mostraron unión fuerte a rhGM-CSF. De aproximadamente 160 clones ensayados después de la cuarta ronda más del 80% de los lisados mostraron señales de ELISA fuertes comparados con PBS como un control negativo en el antígeno recombinante. Los resultados de los clones representativos se muestran en la figura 4, en la que estos clones representativos se organizan a lo largo del eje x, y la intensidad de absorbancia se indica en el eje y. Como se puede ver de la figura 4, el control negativo de PBS (segundo desde la derecha en el eje x) no mostró unión apreciable, mientras que los clones scFv representativos scFv A, scFv 3035, scFv 3039, scFv 3080 y scFv 5-306 mostraron diferentes grados de potencia de unión por ELISA.

Todos los lisados se ensayaron sin rhGM-CSF en experimentos paralelos para unión inespecífica al agente bloqueante. No se pudo observar señal detectable significativa, lo que indica la especificidad de la unión al rhGM-CSF.

Se determinaron las secuencias de ADN de más de 13 clones de scFv positivos por ELISA. En total, se identificaron seis secuencias diferentes. Todas las secuencias eran de origen humano y estaban estrechamente relacionadas a la secuencia de línea germinal humana VH-1 1-O2.

Ejemplo 2.3.5: Caracterización de construcciones de scFv humanos que contienen regiones VL y VH humanas

Ejemplo 2.3.5.1: Producción y purificación a gran escala de construcciones scFv cabeza de serie producidos por el método descrito en el ejemplo 3

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Se aislaron y purificaron scFv cabeza de serie como se describe en el ejemplo 2.2.6.3.

Ejemplo 2.3.5.2: Análisis de unión cinética de scFv cabeza de serie por resonancia de plasmón de superficie (SPR)

El fin del experimento es la caracterización en profundidad de los scFv cabezas de serie. Se midieron las cinéticas de unión (kd y ka) de los scFv cabezas de serie inyectando 10 μl de proteína purificada en series de diluciones que variaban desde 10 μg/ml a 1 pg/ml de scFv purificado y siguiendo la disociación a 25ºC durante 100 segundos. La proteína se tamponó en HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005%). Los datos se ajustaron usando el software BIAevalution™ que determina la constante de velocidad para la cinética de disociación y asociación con una ecuación de unión de Langmuir 1:1 (fórmulas 1 y 2), en donde A es la concentración de analito inyectado y B es la concentración de ligando.

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Las curvas de unión cinética se determinaron usando hasta 8 concentraciones de cada scFv cabeza de serie analizado. El ajuste independiente de los datos sin elaborar produjo constantes de velocidad de disociación y asociación que se usaron para calcular la constante de disociación de equilibrio (KD, los resultados se muestran en

la tabla 1).

Tabla 1

3035 3039 scFvA 3080

ka [1/Ms] 1,6 x 105 ± 1,1 x 105 0,6 x 104 ± 0,4 x 104 1,7 x 106 ± 1,1 x 106 1,0 x 105 ± 0,5 x 105 kd [1/s] 1,5 x 10-3 ± 0,4 x 10-3 0,9 x 10-4 ± 0,1 x 10-4 1,6 x 10-3 ± 0,2 x 10-3 3,5 x 10-3 ± 0,2 x 10-3 KD [M] 0,9 x 10-8 1,7 x 10-6 1,2 x 10-9 3,5 x 10-8 CI50 [nM] 3,2 130,5 2,6 19,1

2.3.5.3: Inhibición de proliferación dependiente de rhGM-CSF de células TF-1 por scFv cabezas de serie

Después de confirmar que la potencia de unión específica se conservaba en los scFv cabeza de serie, el fin de este experimento era evaluar la especificidad de la interacción del scFv cabeza de serie con el antígeno rhGM-CSF. La inhibición de la función biológica del antígeno rhGM-CSF por la unión del scFv se caracterizó en un experimento de inhibición de la proliferación de TF-1.

Los experimentos de inhibición de la proliferación se realizaron como se ha descrito anteriormente. Las células se resuspendieron a una concentración final de 1 x 10exp5 células/ml en RPMI 1640, SFT al 10% y se usaron 90 μl de suspensión celular por pocillo (0,9 x 10exp4 células/pocillo). Se usó una concentración final de rhGM-CSF de 0,3 ng/ml para estimular la proliferación de las células TF-1. Para la neutralización de la proliferación dependiente de rhGM-CSF se añadió scFv purificado en PBS 1x en una serie de dilución con concentraciones finales de proteína que variaban desde 100 μg/ml a 10 pg/ml. Se añadieron 10 μl de solución de proteína dializada y esterilizada por filtración (filtros de 0,22 μm) a 100 μl de solución de TF-1 y rhGM-CSF. Las muestras se incubaron a 37ºC en CO2 al 5% durante 72 h. Después de 72 horas el estado proliferativo de las células TF-1 se determinó añadiendo WST-1 y siguiendo el cambio colorimétrico con un lector de ELISA a 450 nm (figura 5). Como se puede ver en la figura 5, la actividad neutralizante de GM-CSF humano se demuestra claramente. ScFv A mostró la actividad neutralizante más fuerte.

Ejemplo 2.4: Optimización de las características de unión de los scFv seleccionados

Se contempló que la actividad biológica de un agente neutralizante para un ligando monomérico se puede mejorar o incluso optimizar aumentando la potencia de unión entre neutralizador y ligando, en particular aumentando la constante de disociación del neutralizador.

Esto se puede alcanzar preferiblemente mutando la secuencia de la respectiva región VH y VL al azar mediante (i) inserción de una o más mutaciones al azar a lo largo de la secuencia entera o mediante (ii) inserción de mutaciones únicas o mutaciones contiguas múltiples (por ejemplo, tramos de cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos) en regiones del scFv que tienen una alta probabilidad de interaccionar con el antígeno. Los mutantes respectivos se deben caracterizar después para cualquier aumento en la actividad o, antes de la caracterización, se debe enriquecer para cualidades preferentes (por ejemplo, unión más fuerte) a través de métodos de selección adecuados (por ejemplo, presentación en fagos).

Ejemplo 2.4.1: Aumento de la actividad mutando la CDR3 de VH en una o más posiciones

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Para mejorar las características de un fragmento de anticuerpo, por ejemplo una molécula de scFv, por mutaciones puntuales o tramos cortos de aminoácidos, se deben atacar residuos de aminoácidos que tienen una probabilidad muy alta de interaccionar con el antígeno respectivo. Con este enfoque, no es necesario cribar más de solo un número limitado de mutantes sin reducir la probabilidad de éxito. La CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo o fragmento del mismo habitualmente contribuye fuertemente a la unión global de un antígeno por este anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por tanto, se contempló que una manera prometedora de aumentar la afinidad de unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser mutar la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR3 de VH.

Existe una variedad de metodologías para realizar tal mutagénesis al azar dirigida, algunas de las cuales se describen a continuación en términos de cómo la afinidad de unión de las moléculas de scFv descritas anteriormente se puede aumentar:

A) Para atacar la CDR3 de VH se debe introducir un sitio de restricción adecuado en la secuencia de nucleótidos en la CDR3 de VH, preferentemente por síntesis génica de la región VH entera con una secuencia de nucleótidos de CDR3 modificada manteniendo la secuencia de aminoácidos original (Entelechon, Alemania). Mediante corte por la enzima de restricción respectiva y añadiendo nucleasa S1/ADN polimerasa I de Klenow y dGTP seguido por un dúplex oligómero mutante, se puede realizar mutagénesis al azar dirigida en una o más posiciones de aminoácidos según Matteucci y Heyneker, Nucleic Acids Research 11: 3113 ff (1983). Las VH mutagenizadas se combinan posteriormente con la respectiva VL (a través de un enlazador adecuado) en un vector de expresión de scFv adecuado y se transforman en células de E. coli. Se pueden coger después colonias únicas que expresen las scFv variantes y cribar para scFv mejoradas como se describe para el cribado y caracterización de prototipos de scFv y cabezas de serie en los ejemplos previos.

B) Un método alternativo es la mutagénesis mediada por oligonucleótido por el método del doble cebador como se describe en detalle en Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) "A laboratory manual". En esencia la región VH se clona en un vector basado en M13 y se aísla plásmido monocatenario. Un cebador capaz de hibridar con el molde del plásmido monocatenario que contiene una secuencia al azar se hibrida y extiende. Después de la propagación del respectivo grupo de plásmidos en E. coli, las VH mutadas se pueden recoger del grupo de plásmidos y combinar con la VL original (a través de un enlazador adecuado) en un vector de expresión de scFv adecuado y transformar en células de E. coli. Se pueden coger después colonias únicas que expresen las scFv variantes y cribar para scFv mejoradas como se describe para el cribado y caracterización de prototipos de scFv y cabezas de serie en los ejemplos previos.

C) Aún otra alternativa es mutar hasta seis o incluso más aminoácidos contiguos. Para este fin, se puede construir una variante de deleción de la secuencia de nucleótidos de VH que tenga una CDR3 y FR4 delecionadas. Esta construcción se usa como molde para una amplificación por PCR de uno o dos pasos, en la que un cebador 5’ (que hibrida con el extremo 5’ de la secuencia de VH y que añade un sitio de clonación adecuado) se combina con un conjunto de cebadores 3’ que hibridan con el extremo 3’ de la región FR3 como molde y se añade una región CDR3 y FR4 (con un sitio de restricción adecuado) al fragmento de amplificación. Este conjunto de cebadores 3’ contiene una secuencia de uno o más tripletes para insertar codones al azar en la secuencia de CDR3. Este grupo de regiones VH que contiene regiones CDR3 aleatorizadas se puede combinar posteriormente con la respectiva VL (a través de un enlazador adecuado) en un vector de expresión de scFv adecuado y transformar en células de E. coli. Se pueden coger después colonias únicas que expresen las scFv variantes y cribar para scFv mejoradas como se describe para el cribado y caracterización de prototipos de scFv y cabezas de serie en los ejemplos previos.

Los grupos respectivos de scFv mutados que tienen una mayor diversidad (ya que se puede cribar fácilmente) se pueden clonar en un vector de presentación en fagos adecuado y después se pueden seleccionar scFv mejoradas por presentación en fagos sobre el antígeno de interés preferentemente en condiciones de concentraciones decrecientes de antígeno para seleccionar afinidades más altas. Las selecciones por presentación en fagos se llevan a cabo según protocolos estándar como se describe en otro lugar en el presente documento. Cualquiera de los métodos anteriores A a C se puede combinar o realizar en ciclos repetidos para mejorar y optimizar más scFv ya modificados.

Ejemplo 2.4.2: Aumento de la afinidad mutando las regiones V al azar a lo largo de la secuencia entera

En lugar de mutar sitios específicos del scFv que tiene una alta probabilidad de interaccionar con el antígeno respectivo, se puede llevar a cabo un enfoque más pragmático introduciendo mutaciones puntuales a lo largo de la secuencia entera de VH y/o VL y después cribando para scFv optimizados o seleccionando y cribando para scFv optimizados. A modo de ejemplo, la secuencia de VH y/o VL se puede mutagenizar usando cepas mutadoras de E. coli (como se describe en Low et al. 260: 359 ff J Mol Biol (1996)) o mala incorporación de nucleótidos por ADN polimerasas como se describe en detalle en Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) "A laboratory manual". La clonación, expresión y selección de variantes optimizadas de las moléculas de scFv se puede llevar a cabo por presentación en fagos o por la tecnología de presentación en ribosomas frecuentemente usada (como se describe en el documento EP 0 975 748 A1). Las versiones optimizadas se expresan en sistemas vector/E. coli adecuados para cribar para candidatos scFv mejorados.

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Se aplicó metodología adecuada como se describe anteriormente en el ejemplo 2.4 para optimizar un scFv cabeza de serie representativo (scFv A), produciendo una clase de fragmentos de anticuerpo neutralizante monoclonal humano anti-GM-CSF representados por las moléculas scFv B-N. Las características de estas moléculas de scFv se aclararán y describirán adicionalmente en los siguientes ejemplos. La generación de moléculas de IgG monoclonales a partir de las moléculas de scFv seleccionadas se describe en el siguiente ejemplo.

Ejemplo 3: Clonación y expresión eucariota de anticuerpos monoclonales de los scFv seleccionados

Aunque se sabe que las bacterias expresan fragmentos Fab funcionales, habitualmente no son capaces de producir inmunoglobulinas funcionales completas. Para la producción de anticuerpos funcionales completos, se deben usar células de mamífero y por tanto la región VL de scFv 5-306 y diferentes regiones VH de las moléculas de scFv seleccionadas en los ejemplos previos se subclonaron en vectores de expresión en mamíferos (especialmente las regiones VH de scFv A y scFv B).

Ejemplo 3.1: Clonación de la cadena ligera humana basada en scFv 5-306

Para generar sitios de restricción terminales adecuados, el fragmento de ADN que codifica la región VL de scFv 5306 se amplificó por PCR, produciendo fragmentos Vkappa con un sitio Bsu36I en el extremo 5’ y un sitio XhoI en el extremo 3’. Este fragmento se subclonó después en el plásmido BSPOLL mediante Bsu36I y XhoI usando el cebador 5’ (5'-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGC-3') y el cebador 3' (5'-CATGCACTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAAAG-3'), añadiendo de esta manera una secuencia líder humana y una región constante Ckappa humana y se verificó por secuenciación. Utilizando EcoRI y SalI, el ADN de VL-Ckappa de 5-306 se cortó de BSPOLL y se subclonó en el vector de expresión eucariota pEF-ADA derivado del vector de expresión pEF-DHFR (Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7021-5) sustituyendo el ADNc que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) murina con el que codifica la adenosina desaminasa (ADA) murina.

Ejemplo 3.2: Clonación de dominios variables de la cadena pesada humana

A partir de diferentes regiones VH humanas seleccionadas en los ejemplos previos (especialmente regiones VH de scFv A y scFv B), la región variable se reamplificó por PCR, generando sitios de restricción Bsu36I en ambos extremos. Para todas las construcciones se usó la combinación de dos cebadores: cebador 5’ VH-Bsu36I (5'-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGT CCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGC-3') y cebador 3' (5'-ACGTCACCTGAGGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG-3'). Los fragmentos de ADN resultantes se subclonaron después usando estos sitios de restricción en el vector de expresión eucariota pEF-DHFR que ya contenía una secuencia líder eucariota y un fragmento de ADN que codifica la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana. Las regiones variables de la cadena pesada se insertaron por tanto entre el líder y la región constante de la cadena pesada. Las secuencias correctas de las regiones variables se confirmaron por secuenciación.

Ejemplo 3.3: Conversión de los fragmentos scFv en IgG humanas completas

El plásmido que codifica la cadena ligera (VL 5-306/Ckappa) y el plásmido que codifica una cadena pesada (VH/región constante de IgG1 humana) se cotransfectaron en células HEK según protocolos estándar para expresión transitoria de proteínas y las células se cultivaron para permitir la expresión y producción de las inmunoglobulinas en el medio de cultivo. De esta manera, se produjeron IgG A, que deriva de scFv A e IgG B, que deriva de scFv B. Después del respectivo periodo de producción, los sobrenadantes se recogieron y las inmunoglobulinas humanas se aislaron a través de cromatografía en proteína A según protocolos estándar para la purificación de inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas purificadas se usaron entonces para experimentos de caracterización adicionales.

Ejemplo 3.4: Reconversión de especificidades de IgG a fragmentos scFv

Las regiones VH de las construcciones de IgG (IgG A e IgG B, como se describe anteriormente) se reclonaron en un vector de expresión de scFv adecuado según protocolos estándar y se acoplaron operativamente a través de un enlazador flexible a la región VL procedentes de la cadena ligera humana del ejemplo 3.1. Estas construcciones se produjeron de forma soluble en el periplasma de E. coli como se ha descrito anteriormente. La caracterización de estos scFv (scFv O, derivado de IgG A, y scFv P, derivado de IgG B) se describe en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 4: Evaluación de la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal humano anti-GM-CSF para GM-CSF de primate y humano

El fin de este experimento era mostrar que un anticuerpo obtenido como se ha mostrado anteriormente se une específicamente a GM-CSF. Por tanto se comparó la unión de tal anticuerpo a diferentes factores estimulantes de colonias recombinantes humanos (“rh”) (rhG-CSF y rhM-CSF, Strathmann) a la unión del mismo anticuerpo a rhGM-CSF mediante ELISA.

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Con 50 μl del antígeno particular (1 μg/ml en PBS) se recubrió una placa de ELISA (Nunc, Maxisorp) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05% los pocillos se bloquearon con 200 μl de PBS/leche en polvo desnatada al 3% por pocillo durante 1,5 horas a temperatura ambiente seguido por lavar 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. Se añadieron 50 μl/pocillo de una serie de anticuerpos humanos (por ejemplo IgG A e IgG B), cada uno con cadenas ligeras idénticas de secuencia según SEQ ID NO: 34 pero con diferentes cadenas pesadas según SEQ OD NO: 35-48 en una serie de diluciones que variaban desde 1 μg/ml a 0,5 ng/ml (en PBS/Tween 20 al 0,05%/leche desnatada en polvo al 3%) y se incubó durante 1 hora. Después de 3 lavados con PBS/Tween 20 al 0,05%, el anticuerpo unido se detectó usando 50 μl de un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado a peroxidasa de rábano (Dianova; diluido 1:1000 en PBS/Tween 20 al 0,05%/leche desnatada en polvo al 3%). La señal se formó por adición de solución de ABTS (Roche) 50 μl/pocillo y se midió la absorción a 405 nm usando una longitud de onda de 450 nm como referencia.

Se usaron anticuerpos de conejo comercialmente disponibles (Strathmann Biotech AG) específicos para rhM-CSF y rhG-CSF, respectivamente, como controles positivos para la unión de estos antígenos, siendo detectada dicha unión con un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado a fosfatasa alcalina. La señal se formó con solución de pNpp (Sigma) 50 μl/pocillo y la absorción se midió a 405 nm usando una longitud de onda de 450 nm como referencia.

Los resultados se muestran en las figuras 6A, 6B y 6C para dos anticuerpos humanos representativos IgG A e IgG

B.

Como se puede ver en la figura 6A, la concentración creciente de anticuerpo titulado produjo un aumento en la absorción, lo que indica buena unión a rhGM-CSF para ambos anticuerpos representativos IgG A y B. La figura 6B muestra los resultados de la unión de los dos mismos anticuerpos representativos a rhM-CSF. Como se puede ver en esta figura, las concentraciones crecientes de un anticuerpo de conejo anti-rhM-CSF produjeron absorción creciente, es decir unión creciente de este anticuerpo control (puntos rellenos), mientras que los dos anticuerpos representativos descritos anteriormente (cuadrados rellenos y triángulos rellenos) se sobreponen como una absorbancia basal continua que no aumenta con concentración de anticuerpo de prueba creciente. Se ve un resultado completamente análogo tanto para el anticuerpo control así como las IgG representativas de prueba A y B en la figura 6C, que nuestra los resultados de unión a rhG-CSF.

En conjunto, los datos mostrados en las figuras 6A, 6B y 6C indican que los dos anticuerpos de prueba representativo IgG A y B se unen específicamente a rhGM-CSF, pero no a otros factores estimulantes de colonias tal como M-CSF y G-CSF. Tal especificidad de unión al antígeno es importante para un agente terapéutico anticuerpo prometedor.

Ejemplo 5: Caracterización de los datos de unión para anticuerpos monoclonales humanos anti-GM-CSF y fragmentos de los mismos

Se deseó generar una clasificación cualitativa de varios miembros identificados como unidores positivos de rhGM-CSF por ELISA como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2. La clasificación pretendía reflejar los parámetros cinéticos (disociación) y de equilibrio (afinidad) de varios anticuerpos unidores representativos así identificados. Para este fin, se realizó resonancia de plasmón de superficie (SPR) en el aparato BIAcore™ 2000, Biacore AB (Upsala, Suecia) con una velocidad de flujo de 5 μl/min y HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005%) como tampón de carrera a 25ºC. Se inmovilizó GM-CSF recombinante humano (Leukine, Berlex, de aquí en adelante alternativamente denominado “el antígeno” o “rhGM-CSF”) producido en levadura en las células de flujo 2-4 en un chip sensor CM5. La superficie del chip se activó inyectando 80 μl de hidroxisuccinimida de sodio 0,1 M, N-etil-N’(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida 0,4 M (NHS/EDC). El antígeno se acopló por inyección manual de rhGM-CSF 10 μg/ml en acetato de sodio 0,01 M, pH 4,7. Se inmovilizaron diferentes densidades de antígeno en las células de flujo 2-4 ajustando la cantidad de tiempos de inyección manual. La célula de flujo 1 se dejó sin modificar mientras que la célula de flujo 2 re recubrió con la mayor densidad posible de rhGM-CSF (800 UR). La célula de flujo 3 se recubrió el 50% de la cantidad de antígeno inmovilizado en la célula de flujo 2 y la célula de flujo 4 se recubrió con la menor densidad de rhGM-CSF (típicamente el 10%). La superficie activada del chip sensor se bloqueó inyectando 85 μl de etanolamina 1 M y el chip se dejó equilibrar durante la noche a una velocidad de flujo constante de 5 μl/min de HBS-EP.

Ejemplo 5.1: Determinación cualitativa de los parámetros de unión cinéticos (constante de disociación) para fragmentos scFv de anticuerpos monoclonales humanos anti-GM-CSF

Los experimentos de Biacore se realizaron como se expone en el párrafo anterior. Antes del experimento, las soluciones de proteínas eluidas de la preparación periplásmica (“PPP”) se dializaron contra PBS a 25ºC durante 2 horas y se diluyeron 1:1 en HBS-EP. Las cinéticas de unión de los miembros de la clase reivindicada se midieron inyectando 10 μl de solución de proteína periplásmica purificada a 25ºC sobre el chip sensor. La adsorción de fondo no específica de proteína a la superficie del chip sensor sin modificar (FC1) se restó de la señal respuesta en las células de flujo con rhGM-CSF inmovilizado (FC2, FC3, FC4). Se determinó la señal respuesta relativa (FC2-1, FC31, FC4-1) y la velocidad de disociación específica se siguió durante 100 segundos.

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Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 7A para una serie de fragmentos scFv representativos que se habían identificado previamente como unidores positivos de rhGM-CSF en experimentos de ELISA. Los fragmentos de anticuerpo scFv representativos para los que se muestran datos de Biacore en la figura 7A son como sigue: scFv A, scFv B, scFv C, scFv D, scFv E, scFv F, scFv G, scFv H, scFv I, scFv J, scFv K, scFv L, scFv M y scFv N.

Generalmente, al interpretar los resultados de Biacore, la amplitud del pico de unión (URmax) se correlaciona directamente con la concentración de proteína en la muestra inyectada. La constante de asociación cinética (ka) depende de la concentración y, debido a concentraciones variables de proteína en la PPP, no se puede usar para la clasificación cualitativa de los miembros de la clase reivindicada. La constante de disociación cinética (kd) es independiente de la concentración de proteína y característica para la potencia de unión de los miembros respectivos de la clase reivindicada. Todos los miembros identificados de la clase reivindicada muestran unión específica al rhGM-CSF inmovilizado. Los miembros de la clase reivindicada con la mejor constante de disociación aparente se identificaron y después de correlación adicional de los datos de SPR con los datos de inhibición se sometieron a la determinación de la afinidad a través de experimentos de unión en equilibrio en el BIAcore.

Al examinar la figura 7A, por tanto, se ven picos distintos para cada uno de los fragmentos de anticuerpo scFv representativos A-N, cuyas partes superiores muestran cada una curvatura característica que se puede extrapolar para obtener una constante de disociación para el fragmento scFv en cuestión. Cualitativamente, por tanto, se puede concluir que cada uno de los fragmentos scFv representativos se une bien a GM-CSF humano.

Ejemplo 5.2: Determinación cuantitativa de parámetros de unión en equilibrio (afinidad) para ciertos anticuerpos humanos anti-GM-CSF y fragmentos scFv de los mismos

Habiendo establecido, cualitativamente, en el ejemplo 5.1 que un número de fragmentos scFv de anticuerpos anti-GM-CSF que previamente se habían ensayado positivos para unión a GM-CSF por ELISA demuestran constantes de disociación cinéticas razonables cuando se unen a GM-CSF humano, se deseaba después obtener una representación cuantitativa de tal unión para anticuerpos y fragmentos de los mismos enfocándose en las características de unión en equilibrio a GM-CSF recombinante humano. Como se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 4, la unión específica al antígeno -aquí rhGM-CSF -es uno de los atributos característicos y específicos de la clase de anticuerpos anti-GM-CSF y fragmentos de los mismos reivindicados en el presente documento.

Las cinéticas de unión (la constante de disociación, kd, y la constante de asociación, ka) de ciertos miembros representativos de la clase de anticuerpos humanos anti-GM-CSF y fragmentos de los mismos se midieron inyectando 10 μl de proteína purificada (es decir, anticuerpo o fragmento del mismo) en un serie de diluciones que varían desde 10 μg/ml a 1 pg/ml de proteína purificada y siguiendo la disociación a 25ºC durante 100 segundos. La proteína purificada se tamponó en HBS-EP. Los datos se ajustaron usando el software BIAevalution™, determinando la constante de velocidad para las cinéticas de disociación y asociación con una ecuación de unión de Langmuir 1:1 (véanse las fórmulas 1 y 2, a continuación), donde A es la concentración de analito de proteína purificada inyectada y B[0] es Rmax:

dB/dt = -(ka *[A]*[B] -kd * [AB]) (fórmula 1) dAB/dt = -(ka *[A]*[B] -kd * [AB]) (fórmula 2)

Se determinaron curvas de unión cinética con hasta 8 concentraciones de cada anticuerpo humano anti-GM-CSF representativo o fragmento del mismo analizado. El ajuste independiente de los datos sin procesar produjo constantes de velocidad de disociación y asociación que se usaron para calcular la constante de disociación en equilibrio (KD). Los resultados obtenidos para cada anticuerpo humano anti-GM-CSF representativo o fragmento del mismo se muestran en las figuras 7B-I. Específicamente, la figura 7B muestra los datos de unión obtenidos para IgG B representativa; la figura 7C muestra los datos de unión obtenidos para IgG A representativa; la figura 7D muestra los datos de unión obtenidos para scFv C representativo; la figura 7E muestra los datos de unión obtenidos para scFv I representativo; la figura 7F muestra los datos de unión obtenidos para scFv B representativo; la figura 7G muestra los datos de unión obtenidos para scFv A representativo; la figura 7H muestra los datos de unión obtenidos para scFv E representativo; y la figura 7G muestra los datos de unión obtenidos para scFv D representativo. Los datos se resumen a continuación en la tabla 2.

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neutralización de la proliferación dependiente de GM-CSF se añadieron 10 μl de muestras purificadas de anticuerpos neutralizantes humanos representativos anti-GM-CSF humano a una solución que contenía 100 μl de TF-1 y rhGM-CSF en una serie de diluciones. Las concentraciones finales de proteína variaban desde 10 μg/ml a 10 pg/ml.

Las muestras se incubaron a 37ºC en CO2 al 5% durante 72 horas. Después de 72 horas el estado proliferativo de las células TF-1 se determinó como se ha descrito en el ejemplo 7.1 anteriormente. Los datos se ajustaron para la inhibición semimáxima de la proliferación (CI50) usando el ajuste de curva por regresión no lineal del software Prism.

El claro efecto neutralizante de GM-CSF visto en el experimento de inhibición de proliferación cualitativo descrito en el ejemplo 7.1 anteriormente se pudo confirmar y cuantificar. Todos los fragmentos scFv probados de anticuerpo neutralizantes monoclonales humanos anti-GM-CSF humano mostraron una constante de inhibición semimáxima (CI50) en el intervalo nanomolar en este experimento de inhibición de la proliferación. Se pudo establecer una clasificación clara en eficacia neutralizante, como se ve en la figura 10A.

Los anticuerpos IgG neutralizantes monoclonales humanos anti-GM-CSF humano probados muestran una eficacia neutralizante significativamente mayor que sus equivalentes scFv. La constante de inhibición semimáxima de las moléculas IgG generadas en este experimento estaba en el intervalo sub-nanomolar. Como se puede ver en la figura 10B, la CI50 evaluada para IgG A fue 0,9 nM e IgG B tenía una CI50 de 0,3 nM.

Para comprobar si los fragmentos de anticuerpo scFv generados de las IgG A y B (scFv O y P, respectivamente) se correspondían cuantitativamente en su potencial de neutralización a los scFv A y B, se realizaron ensayos de neutralización en TF-1 análogos como se ha descrito anteriormente excepto que se usaron scFv O y P como moléculas de prueba. Los resultados se muestran en las figuras 10C y 10D para scFv P y O, respectivamente. Como se puede ver en la figura 10D, scFv O tiene el mismo potencial de neutralización que scFv A, lo que muestra que la reconversión de IgG de vuelta al formato scFv es posible sin pérdida de actividad biológica.

Ejemplo 7.3: Evaluación cuantitativa del potencial de neutralización de ciertos anticuerpos humanos representativos anti-GM-CSF humano y fragmentos de los mismos, medida por producción de IL-8 reducida

Este experimento se realizó para cuantificar la actividad de neutralización de anticuerpos humanos representativos anti-GM-CSF humano y fragmentos de los mismos midiendo la producción de IL-8 dependiente de GM-CSF por células U-937. El antígeno GM-CSF usado en los experimentos anteriores era rhGM-CSF. Las células monocíticas U-937 se cultivaron en medio RPMI 1640 Gibco (L-glutamina, sin rojo fenol), suplementado con suero fetal de ternera inactivado por calor al 10% como describe el distribuidor (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Braunschweig, Alemania). Las células se hicieron crecer a una densidad celular de 1 x 10exp6 células/ml.

Al realizar el ensayo de inhibición basado en la medida de la producción de IL-8, las células se recogieron por centrifugación a 300 x g durante 4 minutos y se resuspendieron a una concentración final de 1 x 10exp6 células/ml en RPMI, SFT al 10%. Se sembraron 1,8 x 10exp5 células/pocillo (180 μl de suspensión celular) por pocillo de placa de cultivo celular de fondo plano Microtest. Se usó una concentración final de rhGM-CSF de 1 ng/ml para estimular la producción de IL-8 por las células U-937. Se añadieron 20 μl de scFv o IgG purificados a 180 μl de solución de células U937 y rhGM-CSF en una serie de diluciones dando concentraciones finales de proteína que variaban desde 10 μg/ml a 10 pg/ml.

Después de incubación durante 18 horas a 37ºC en CO2 al 5% las células se precipitaron por centrifugación de las placas de cultico durante 2 min a 600 x g. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron pipeteando a una placa nueva y se analizaron para determinar la concentración de IL-8 en los mismos usando el conjunto de ELISA de IL-8 humana OptEIA (Becton Dickenson and Company).

La detección por ELISA se llevó a cabo según las instrucciones de fabricante. Brevemente, 50 μl de anticuerpo de captura diluido en carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5 bañaron una placa de microprueba durante la noche a 4ºC. Después de lavar 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05% los pocillos se bloquearon con 200 μl de PBS/SFT al 10% por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por lavar 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. A continuación se añadieron 50 μl de las muestras de sobrenadante de cultivo a los pocillos y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Para la cuantificación posterior de la concentración de IL-8 se llevó a cabo una dilución en serie del estándar de IL-8 proporcionado por el fabricante a lo largo del procedimiento.

Después de lavar 5 veces con PBS/Tween 20 al 0,05% la detección se llevó a cabo usando 50 μl del detector de trabajo (Ac de detección + Av-HRP) proporcionado por el conjunto de ELISA de IL-8 humana OptEIA. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron 7 veces adicionales. La señal se formó añadiendo solución de sustrato OPD (Sigma) y se detectó a una longitud de onda de 490 nm (usando una longitud de onda de referencia de 620 nm).

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Se representó una curva estándar de IL-8 para la calibración y la concentración de IL-8 en las muestras de sobrenadante del cultivo se calculó según esta curva de calibración. Los datos se ajustaron para la inhibición semimáxima de la producción de IL-8 (CI50) usando el ajuste de curva por regresión no lineal del software Prism.

Todos los fragmentos representativos de anticuerpos neutralizantes monoclonales humanos anti-rhGM-CSF probados mostraron clara inhibición de la producción de IL-8 dependiente de GM-CSF de células U-937, como se puede ver claramente por la disminución en la concentración de IL-8 con concentración creciente de scFv en la figura 11. La clasificación en eficacia de neutralización vista en este experimento está de acuerdo con la clasificación obtenida probando las mismas moléculas para su efecto neutralizador en el experimento de inhibición de la proliferación de TF-1 descrito anteriormente.

Se advertirá que los valores de CI50 determinados en este experimento son mayores comparados con los obtenidos para las mismas moléculas en el experimento de proliferación de TF-1 previo. Esto se debe a la mayor concentración de GM-CSF requerida para la estimulación de la producción de IL-8 por células U-937 que la requerida para la estimulación de TF-1.

Ejemplo 7.4: Evaluación cuantitativa del potencial de neutralización de ciertos anticuerpos humanos representativos anti-GM-CSF humano y fragmentos de los mismos sobre GM-CSF recombinante de macaco, medida por proliferación celular

El fin de este experimento era mostrar la potencia neutralizante de anticuerpos humanos representativos anti-GM-CSF humano y fragmentos de los mismos para GM-CSF de primates no humanos de la familia Macaca (“macGM-CSF”).

Para mostrar el efecto neutralizante de moléculas scFv e IgG seleccionadas sobre macGM-CSF, se realizó un experimento de inhibición de la proliferación según el protocolo descrito en los ejemplos 7.1 y 7.2 usando macGM-CSF en lugar de hGM-CSF. Tanto hGM-CSF como macGM-CSF estimulan la proliferación de células TF-1 con la misma eficacia semimáxima (CE50). Se usó una concentración final de macGM-CSF de 3 ng/ml para estimular la proliferación de las células TF-1 en el experimento que prueba las moléculas scFv y rhGM-CSF 0,3 ng/ml en el experimento que prueba IgG B como un anticuerpo humano representativo anti-GM-CSF humano. Para neutralizar la proliferación de las células TF-1, se añadieron 10 μl de anticuerpo humano anti-GM-CSF humano purificado o fragmento del mismo a 100 μl de solución de TF-1 y macGM-CSF en una serie de diluciones. Las concentraciones finales de proteína variaban desde 10 μg/ml a 10 pg/ml. Las muestras se incubaron a 37ºC en CO2 al 5% durante 72 horas. Después de 72 horas el estado proliferativo de las células TF-1 se determinó como se ha descrito en los ejemplos 7.1 y 7.2. Los datos se ajustaron para inhibición semimáxima de la proliferación (CI50) usando el ajuste de curva por regresión no lineal del software Prism.

Como se ve en la figura 12A, ciertos fragmentos de anticuerpo monoclonal humano representativo anti-GM-CSF humano mostraron un claro potencial de neutralización de mac GM-CSF (scFv B, scFv E, scFv C, scFv I, scFv A). Además, como se puede ver en la figura 12B, concentraciones crecientes del anticuerpo monoclonal humano representativo anti-GM-CSF humano IgG B claramente produjo un descenso en la proliferación de TF-1, lo que demuestra el potencial neutralizante de este anticuerpo. De forma interesante, el valor CI50 generado para IgG B en este experimento (0,3 nM) usando mac GM-CSF para la inducción de proliferación celular de TF-1 es igual al generado en el experimento usando hGM-CSF, lo que muestra clara reactividad cruzada de IgG B para GM-CSF en estas especies.

Ejemplo 8. Reactividad cruzada de IgG B con GM-CSF de varias especies

Se investigó la reactividad cruzada de IgG B con GM-CSF de varias especies no humanas para identificar especies adecuadas para estudios in vivo posteriores. En un primer conjunto de experimentos, se probó la unión de IgG B a GM-CSF recombinante comercialmente disponible de humano (Leukine®, Berlex), cerdo, perro, rata (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania) y ratón (Strathmann Biotech, Hamburgo, Alemania) en un experimento de ELISA. Específicamente, una placa de ELISA se recubrió con GM-CSF 1 μg/ml de las varias especies mencionadas. Se añadió IgG B en una serie de diluciones y se detectó usando un anticuerpo anti-IgG1 humana conjugado a peroxidasa de rábano. El ELISA se desarrolló añadiendo solución sustrato OPD o-fenilendiamina (“OPD”, amarillonaranja cuando reacciona con peroxidasa) (Roche, Alemania) y se midió a 490 nm.

Como se puede ver en la figura 13, IgG B mostró unión robusta a GM-CSF recombinante humano, mientras que GM-CSF de las otras especies probadas no era reconocido. Cerdo, perro, rata o ratón, por tanto, no pueden ser especies adecuadas para ensayos in vivo. Sin embargo, como se ha visto anteriormente en el ejemplo 7.4, IgG B muestra una marcada reactividad cruzada con macGM-CSF (de macaco cangrejero, macaca fascicularis), lo que implica la idoneidad de al menos una especie de mono de la familia de macacos para los estudios in vivo de IgG B.

Ejemplo 9: Unión de IgG B a variantes de GM-CSF diferentemente glucosiladas

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El fin de este experimento era determinar el grado al que la unión de IgG B a GM-CSF depende del patrón de glicosilación del último. Para este fin, un serie de diluciones de medio acondicionado que contiene hGM-CSF natural (glicosilación humana), así como hGM-CSF recombinante de E. coli (sin glicosilación) y levadura (glicosilación de levadura), así como GM-CSF recombinante de macaco se probaron para su potencia para inducir proliferación de TF-1.

Se obtuvo GM-CSF glicosilado humano de sobrenadantes de cultico de células BEAS-2B tratadas con IL-1β (células pulmonares humanas obtenidas de ATCC CRL-9609). Las células BEAS-2B se propagaron en medio BEBM sustituido con el kit BEGM Bullet (Cambrex, Verviers, Bélgica) pero se cultivaron en RPMI 1640, STF al 10% en presencia de IL-1β 50 ng/ml (Strathmann Biotech, Hamburgo, Alemania) para la inducción de la producción de GM-CSF. Después de 48 horas de incubación a 37ºC, CO2 al 5% el sobrenadante de cultivo se analizó para su contenido en GM-CSF usando el conjunto de ELISA de GM-CSF humano OptEIA (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) según las instrucciones del fabricante.

El hGM-CSF recombinante de E. coli se produjo internamente como se explica en el ejemplo 1.1 del documento WO 2005/105844. El hGM-CSF recombinante de levadura se obtuvo comercialmente bajo el nombre comercial “Leukine” (Berlex, EE UU). El GM-CSF de macaco se produjo de forma recombinante en células HEK293.

Primero se probó una serie de diluciones de medio acondicionado que contenía hGM-CSF natural, así como hGM-CSF recombinante de E. coli y levadura, y GM-CSF de macaco para su potencia para inducir proliferación de TF-1. Las tres variantes de glicosilación de GM-CSF humano y GM-CSF de macaco mostraron valores CE50 muy similares para la activación de TF-1. Estos fueron 10 pg/ml para hGM-CSF producido en E. coli, 15 pg/ml para hGM-CSF producido en levadura, 36 pg/ml para hGM-CSF producido en células pulmonares humanas, y 11 pg/ml para GM-CSF de macaco, respectivamente (figura 14A).

La actividad neutralizante de IgG B se determinó después en presencia de 0,3 ng/ml de hGM-CSF recombinante, o 0,2 ng/ml de hGM-CSF fisiológico. Después de 72 horas, el estado proliferativo de las células TF-1 en presencia de diferentes concentraciones de IgG B se cuantificó por una reacción colorimétrica (figura 14B).

En conjunto, los datos mostrados en la figura 14 muestran que IgG B inhibía la proliferación de células TF-1 dependiente de GM-CSF a concentraciones subnanomolares aparentemente independientemente del patrón de glicosilación de GM-CSF humano. El patrón de glicosilación de GM-CSF humano por tanto no influye sustancialmente la capacidad de IgG B de neutralizar la actividad de GM-CSF.

Ejemplo 10: Efecto de IgG B sobre las actividades biológicas de GM-CSF en eosinófilos

Ejemplo 10.1: Efecto de IgG B sobre la supervivencia de eosinófilos mediada por GM-CSF

Una de las varias actividades biológicas de GM-CSF es la prolongación de la supervivencia de granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos. Puesto que las enfermedades inflamatorias pulmonares se asocian con acumulación local de eosinófilos, que desempeñan un papel sustancial en mantener la inflamación, se probó la eficacia de IgG B en inhibir la supervivencia de eosinófilos medida por GM-CSF.

Los eosinófilos se aislaron de sangre periférica de donantes sanos por eliminación de neutrófilos CD16+ de la población de granulocitos obtenida por centrifugación en gradiente de densidad y lisis de eritrocitos. Se sembraron eosinófilos de sangre periférica recién aislados a una densidad de 5 x 104 células/pocillo en RPMI 1640/STF al 10% y Pen/Estrep en una placa de microprueba de fondo plano de 96 pocillos. Se añadió GM-CSF en una serie de diluciones que variaban desde 33 ng/ml a 10 pg/ml para seguir la supervivencia de eosinófilos dependiente de concentración. Para analizar el potencial inhibidor de IgG B sobre la supervivencia de eosinófilos dependiente de GM-CSF, el anticuerpo se añadió en una serie de diluciones que variaban desde 10 μg/ml a 0,1 ng/ml. Se usó una concentración final de GM-CSF de 0,1 ng/ml para realizar la supervivencia de eosinófilos. Después de incubar durante 72 horas a 37ºC, CO2 al 5% se añadió el reactivo WST-1. La reacción colorimétrica resultante correspondiente a la parte de células viables se cuantificó midiendo la absorbancia a 450 nm. Los datos se analizaron y ajustaron para la inhibición semimáxima de la supervivencia (CI50) usando el ajuste de curva por regresión no lineal de paquete de software prism. Como se ve en la figura 15A, se determinó una dosis eficaz semimáxima (CE50) de rhGM-CSF de 0,02 ng/ml. Como se ve en la figura 15B, se ve un potente efecto neutralizante de IgG B con inhibición semimáxima de la supervivencia de eosinófilos a una concentración de anticuerpo de 0,13 nM.

Estos datos indican que IgG B es eficaz en inhibir la supervivencia de eosinófilos de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 10.2: Efecto de IgG B sobre la activación de eosinófilos inducida por GM-CSF

También se deseaba investigar el efecto de IgG B sobre la activación de eosinófilos inducida por GM-CSF. Se encontró que la expresión de CD69 estaba aumentada en eosinófilos periféricos (CD16-) aislados de sangre humana

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después de estimular durante 20 horas o 3 días con (a) GM-CSF 0,1 ng/ml o (b) GM-CSF, IL-3 e IL-5 0,1 ng/ml, pero no con (c) IL-3 e IL-5 0,1 ng/ml solo (figura 16A). Los eosinófilos cultivados en presencia de medio solo no mostraron aumento de CD69. Por tanto, CD69 se puede tomar como un marcador para la activación de eosinófilos por GM-CSF, y el nivel de expresión de CD69 se siguió como una medida de la activación de eosinófilos dependiente de GM-CSF. En ambos tiempos (20 h y 3 días), IgG B (10 μg/ml) prevenía casi por completo la activación de eosinófilos dependiente de GM-CSF, como se ve por la falta de expresión de CD69 en citometría de flujo.

Los eosinófilos se aislaron como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 10.1 y se cultivaron a una densidad de 5 x 105 células/pocillo en RPMI 1640/SFT al 10% y Pen/Estrep en una placa de microprueba de fondo plano de 48 pocillos. Las células se incubaron con medio solo o en presencia de GM-CSF 0,1 ng/ml solo o junto con IL-3 o IL-5 0,1 ng/ml. Se usó IgG B 10 μg/ml para la neutralización de GM-CSF. Después de una incubación de 1 o 3 días las células se analizaron para la expresión de CD69 por citometría de flujo.

Detección de CD69 por citometría de flujo: La expresión de CD69 en eosinófilos se determinó en un instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson). Se incubaron 105 células con 5 μl de un anticuerpo anti-CD16 humano conjugado a FITC (clon 3G8, BD Biosciences) y un anti-CD69 humano conjugado a PE (clon FN50, BD Biosciences) cada uno durante 1 hora a 4ºC. Como control negativo irrelevante, se usaron anticuerpos conjugados a FITC y PE de isotipo coincidente. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS, SFT al 1%, NaN3 al 0,05% y se resuspendieron en 250 μl de PBS, SFT al 1%, NaN3 al 0,05%. Se añadió yoduro de propidio para marcar las células muertas a una concentración final de 1 μg/ml inmediatamente antes del análisis por FACS. La interpretación de los datos se hizo usando el software CellQuestPro (BD Biosciences). Las células positivas para yoduro de propidio (es decir, muertas) se excluyeron del análisis de expresión de CD69.

IgG B también redujo el porcentaje de eosinófilos vivos y activados seguidos por tinción de yoduro de propidio de células CD16-/CD69+ en presencia de GM-CSF 0,1 ng/ml. IgG B redujo el porcentaje de células activadas del 35% al 8% después de 1 día y del 43% al 3% después de 3 días de cultivo. En presencia de GM-CSF, IL-3 e IL-5 0,1 ng/ml, el porcentaje de eosinófilos vivos y activados se redujo del 32% al 8% y del 48% al 11% después de 1 y 3 días, respectivamente. Incluso aunque el aumento de CD69 se inhibió por completo por IgG B, números mayores de eosinófilos en reposo (CD16-/CD69-) sobrevivieron durante 3 días en presencia de GM-CSF, IL-3 e IL-5 0,1 ng/ml comparado con las células incubadas con medio o GM-CSF solo (figura 16A, última columna). Se observó lo mismo para células incubadas en presencia de IL-3 más IL-5 0,1 ng/ml.

En experimentos de búsqueda de dosis, IgG B se añadió en una serie de diluciones a eosinófilos cultivados en presencia de GM-CSF 0,1 ng/ml (figura 16B). Se observó un efecto inhibidor de IgG B en la intensidad de fluorescencia mediana (IFM) dependiente de CD69 a una concentración semimáxima de IgG B de 0,22 nM.

En conjunto, estos datos indican que IgG B es un neutralizador eficaz de la actividad de GM-CSF en un contexto biológico muy relevante para enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias, por ejemplo, asma.

Ejemplo 11: Estudios toxicológicos preliminares ex vivo usando IgG B

Como se ha explicado anteriormente, la neutralización de la actividad de GM-CSF puede ser terapéuticamente ventajosa en un número de marcos de enfermedad. Al mismo tiempo, sin embargo, GM-CSF desempeña un papel importante en la función normal del sistema inmunitario en combatir patógenos exógenos, por ejemplo como en fagocitosis por granulocitos neutrófilos y monocitos. Esta función natural de los neutrófilos y monocitos debe permanecer inafectada en presencia de cantidades terapéuticas de IgG B. Por tanto se investigaron dos aspectos del proceso fagocítico: 1) ingestión de bacterias (fagocitosis); y 2) actividad de estallido oxidativo (indicativo de destrucción intracelular). Estos estudios se detallan en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 11.1: Ingestión de bacterias (fagocitosis)

La determinación de la actividad fagocíticas de granulocitos y monocitos en sangre completa heparinizada se hizo usando el kit Phagotest por Orpegen (Heidelberg, Alemania). Este ensayo se basa en la ingestión de E. coli opsonizadas marcadas con fluorescencia por células fagocíticas. Estas células se pueden detectar después por fluorescencia verde en citometría de flujo. Se añadieron 20 μl de E. coli opsonizadas marcadas con fluorescencia a 100 μl de sangre completa heparinizada y se incubó a 37ºC. Se realizó incubación a 0ºC como un control negativo. Después de 10 min el proceso fagocítico se paró enfriando las muestras en hielo y la adición de 100 μl de solución de extinción (Orpegen). Esta solución permite la distinción de unión e internalización de bacterias extinguiendo la fluorescencia de FITC de las bacterias unidas a la superficie mientras que la fluorescencia de las partículas internalizadas permanece sin afectar. Después de tres pasos de lavado con 3 ml de solución de lavado (Orpegen), los eritrocitos se lisaron. Los leucocitos restantes se lavaron una vez con 3 ml de solución de lavado (Orpegen). Después de la adición de 200 μl de solución de tinción de ADN, que permite la exclusión de bacterias o células agregadas, las células se analizaron por citometría de flujo. El porcentaje de células que han realizado fagocitosis se determinó por medio de fluorescencia de FITC.

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Para determinar la influencia de IgG B en la fagocitosis, se añadió IgG B a tres muestras de sangre idénticas a una concentración final de 10 μg/ml. Estas tres muestras se dejaron después incubar a 37ºC con IgG B durante varias intervalos de tiempo antes de la adición de E. coli. Se añadieron E. coli a la primera muestra inmediatamente, mientras que se añadieron E. coli a la segunda y tercera muestras después de 24 y 48 horas, respectivamente.

Resultados observados para granulocitos: Directamente después de sacar la sangre más del 98% de los granulocitos ingerían bacterias en presencia o ausencia de IgG B (figura 17A). Después de la incubación de las muestras de sangre con IgG B durante 24 horas se determinó una disminución hasta aproximadamente el 92% sin IgG B y hasta el 90% en presencia de IgG B (figura 17B). Después de 48 horas, el 81% de los granulocitos eran positivos para fagocitosis en ausencia y el 89% en presencia de IgG B (figura 17C).

Resultados observados para monocitos: Independientemente de que IgG B estuviera presente o no el 98% de los monocitos fagocitaban después de sacar la sangre (figura 18A). Después de la preincubación de 24 horas con IgG B el 90% de los monocitos eran positivos (figura 18B). Después de preincubación de 24 horas sin IgG B eran el 92%. Después de 48 horas, se encontró que el 81% de los mocitos sin IgG B y el 89% con IgG B eran positivos para fagocitosis (figura 18C).

Ejemplo 11.2: Estallido oxidativo

La determinación de la actividad de estallido oxidativo en granulocitos y monocitos en sangre completa heparinizada se realizó usando el kit Phagoburst por Orpegen (Heidelberg, Alemania). Este ensayo permite la determinación del porcentaje de células fagocíticas que producen oxidantes reactivos por oxidación del sustrato dihidrorrodamina (DHR) 123 al fluorescente R 123. Las células que muestran actividad de estallido oxidativo se pueden identificar en citometría de flujo. Se incubó sangre heparinizada con diferentes estímulos para inducir actividad de estallido oxidativo: 12-miristato 13-aceto de forbol (“PMA”) como un estímulo alto; E. coli sin marcar, opsonizada como estímulo intermedio y el péptido quimiotáctico N-formil-MetLeuPhe (fMLP) como estímulo bajo. Se incubaron 100 μl de sangre completa con estos estímulos a 37ºC. Como control negativo se realizó la incubación sin estimulación. Después de 10 minutos de incubación se añadió solución de sustrato DHR 123 y se incubó durante otros 10 minutos. DHR 123 se convierte en R 123 fluorescente por células oxidantes. Después de tres pasos de lavado con 3 ml de solución de lavado (Orpegen), se lisaron los eritrocitos. Los leucocitos restantes se lavaron una vez con 3 ml de solución de lavado (Orpegen). Después de la adición de 200 μl de solución de tinción de ADN, que permite la exclusión de bacterias o células agregadas, las células se analizaron por citometría de flujo.

Para determinar la influencia de IgG B en el estallido oxidativo, se añadió IgG B a tres muestras de sangre idénticas a una concentración final de 10 μg/ml. cada una de estas tres muestras se dividió después en tres alícuotas y se dejaron incubar a 37ºC durante varios intervalos de tiempo antes de la adición, a alícuotas se paradas, de E. coli, fMLP o PMA. Se añadieron E. coli, fMLP o PMA a las tres alícuotas de la primera muestra inmediatamente, mientras que se añadieron E. coli, fMLP o PMA a las tres alícuotas de la segunda y tercera muestras después de 24 y 48 horas respectivamente. Se trataron muestras de sangre paralelas que carecen de IgG B de forma idéntica como anteriormente como controles. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 4, donde “+” en la segunda columna desde la izquierda indica que IgG B está presente en la alícuota de la muestra ensayada, y “-” en la segunda columna desde la izquierda indica el control sin IgG B.

Tabla 4: Efecto de IgG B en el comportamiento de estallido oxidativo de granulocitos

Tiempo

IgG B Porcentaje de granulocitos oxidantes después de estimulación con… Resultados mostrados en…

E. coli

fMLP PMA

0 h

- 97 9 99 Figura 17D

+

94 10 99

24 h

- 82 8 97 Figura 17E

+

80 10 95

48 h

- 68 6 64 Figura 17F

+

71 5 64

Se obtuvieron resultados similares usando monocitos en lugar de granulocitos. El experimento se realizó de forma análoga a como se ha descrito anteriormente, y los resultados se muestran en la tabla 5, donde “+” en la segunda columna desde la izquierda indica que IgG B está presente en la alícuota de la muestra ensayada, y “-” en la segunda columna desde la izquierda indica el control sin IgG B.

Claims (1)

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