ES2547471A1

ES2547471A1 - ARN de interferencia para el tratamiento del Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune de tipo la

Info

Publication number: ES2547471A1
Application number: ES201430504A
Authority: ES
Inventors: Estela PAZ ARTAL; Esther MANCEBO SIERRA
Original assignee: Fundacion Investigacion Biomedica Hospital Universitario 12 Octubre
Current assignee: Fundacion Investigacion Biomedica Hospital Universitario 12 Octubre
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2015-10-06
Anticipated expiration: 2034-04-04
Also published as: ES2547471B1

Abstract

ARN de interferencia para el tratamiento del Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune de tipo Ia. La presente invención se refiere a un ARN de interferencia específico del alelo mutado del gen FAS y su uso en el tratamiento del Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune de tipo Ia.

Description

La presente invención se refiere a un ARN de interferencia especifico del alelo mutado del gen FAS y su uso en el tratamiento del Sindrome Linfoproliferativo Autoinmune de tipo la. Por lo tanto, la presente invención pertenece al campo de la medicina, en concreto del tratamiento terapéutico de enfermedades autoinmunes.

10 ESTADO DE LA TÉCNICA El Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (SLPA) es una patología congénita de la apoptosis (muerte celular programada) linfocitaria que causa linfoproliferación y autoinmunidad. La enfermedad se caracteriza por linfadenopatía crónica,

15 esplenomegalia, citopenias autoinmunes y una expansión anómala de linfocitos T aj3+ CD3+CD4-C08-(a~ dobles negativos).

Los individuos con SLPA tienen defectos en la vía de apoptosis mediada por el receptor FAS, cuyo funcionamiento es crítico para mantener la tolerancia y 20 homeostasis linfocitarias. Aproximadamente dos tercios de los pacientes con SLPA (correspondientes al denominado tipo la) presentan una mutación germinal en heterocigosis en el gen de FAS (también llamado AP01 , TNFRSF6 Ó CD95) que suele localizarse en la porción intracelular del receptor FAS conocida como dominio de muerte (DO). La correcta función de este dominio proteico es necesaria para el 25 reclutamiento de la molécula intracelular FADO y la activación de las caspasas que conduce finalmente a la apoptosis. Las mutaciones que afectan al DO actúan en forma "dominante negativa". Esto significa que en individuos heterocigotos y por tanto con un 50% de proteína FAS anómala, las cadenas aberrantes de FAS se incorporan en la mayoría de los homotrímeros FAS (se calcula que esto sucede en 7 de 8 30 homotrímeros) impidiendo la transducción de una señal de muerte eficaz en los linfocitos. Las mutaciones en el DO se asocian con formas severas de la enfermedad y alta penetrancia de los síntomas clínicos. Además , los pacientes con mutaciones germinales en FAS presentan un riesgo relativo 51 veces superior que la población normal de sufrir linfoma de Hodgkin y 14 veces superior de sufrir linfomas no Hodgkin.

Aunque en los últimos años ha mejorado considerablemente, el tratamiento del SLPA no es curativo ni completamente satisfactorio. El cuidado de los pacientes con SLPA incluye consejo genético familiar, vigilancia ante la potencial aparición de linfomas y fármacos inmunosupresores dirigidos principalmente al tratamiento de las citopenias. 5 La prednisona (sola o en combinación con inmunoglobulinas intravenosas) suele administrarse al principio pero sus importantes efectos secundarios, especialmente en niños, impiden un uso continuado. Los pacientes refractarios a corticoides con importantes esplenomegalia e hiperesplenismo pueden beneficiarse del tratamiento con micofenolato mofetilo (MMF), pero este fármaco no mejora la linfoproliferación ni 10 reduce el número de células dobles negativas y presenta toxicidades como diarrea y neutropenia. La terapia con sirolimus (Rapamicina), particularmente útil en la recuperación de las células sanguíneas y la reducción de la linfoproliferación, las adenomegalias, esplenomegalia y células dobles negativas, puede causar hipercolesterolemia, hipertensión y alteración de las funciones hepática y renal, y

15 requiere la cuantificación regular de niveles sanguíneos para asegurar márgenes terapéuticos adecuados. Por último, la administración de rituximab y la esplenectomía se asocian con toxicidades específicas en el SLPA que incluyen profundas y duraderas hipogammaglobulinemias y sepsis mortales respectivamente, por lo que sólo se utilizan en casos muy seleccionados.

20 La interferencia de RNA es un método ampliamente utilizado para disminuir la abundancia de productos génicos específicos. Este proceso de silenciamiento de la expresión génica, post-transcripcional y específico de secuencia, tiene un gran potencial como herramienta terapéutica en enfermedades en las que teóricamente la

25 inhibición génica puede ser beneficiosa.

Desde hace algún tiempo se viene demostrando la posibilidad de sintetizar moléculas

de siRNA capaces de suprimir la expresión del alelo patogénico con preservación de

la expresión del alelo normal (wild type) por discriminación de un solo nucleótido.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Los autores de la presente invención han descubierto que la inhibición alelo-específica de las mutaciones en el gen FAS con siRNAs provoca la recuperación de la actividad

35 funcional de la vía FAS lo que deriva en la muerte celular por apoptosis. Por lo tanto, el proceso de silenciamiento específico en mutaciones del gen FAS permite el tratamiento de sujetos que padecen el Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (SLPA) de tipo la de herencia dominante negativa.

Para ello, se diseñaron varios siRNA dirigidos a mutaciones en el gen FAS en dos

5 pacientes que padecen SLPA de tipo la y se transfectaron los fibroblastos de dichos pacientes con los siRNA diseñados. El tratamiento de los fibroblastos de los pacientes con sus siRNA específicos de los alelas FAS mutados permitió la recuperación de la apoptosis celular, no afectando a fibroblastos control, lo que demostró que efectivamente el silenciamiento afecta sólo a las formas mutadas de FAS y preserva la

10 expresión de moléculas FAS wild type (silvestres). Sin querer estar vinculados a ninguna teoría, se piensa que esto ocurre por generar mayor cantidad de trímeros FAS funcionales en la superficie celular, logrando incrementar la activación de las caspasas y la desorganización de las mitocondrias, pasos previos a la muerte celular por apoptosis. Por lo tanto, tras la transfección de los fibroblastos se observó una

15 recuperación significativa de la muerte celular respecto a células no transfectadas o células transfectadas con un siRNA control (ver Ejemplo 1).

ARN de interferencia de la invención

20 La presente invención requiere el diseño de un ARN de interferencia (ARNi o en inglés, iRNA) dirigido a un alelo mutado del gen FAS que, al entrar en la célula, suprime la expresión del alelo patógeno, por lo que la proporción de proteína del alelo silvestre (wild type) se ve aumentada, permitiendo que la vía de señalización de FAS sea funcional.

25 Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona con un ARNi específico de un alelo mutado del gen FAS asociado al SLPA de tipo la, de aquí en adelante "ARNi de la invención", en el que dicho ARNi inhibe la expresión de dicho alelo mutado.

30 En la presente invención se entiende por "ARN de interferencia" (ARNi o iRNA) a la molécula de ácido ribonucleico, de entre 15 a 40 nucleótidos, que suprime la expresión de genes específicos mediante mecanismos conocidos globalmente como ribointerferencia o interferencia por ARN. De entre los tipos de ARNi que existen en el

35 estado de la técnica, los más adecuados para poner en práctica la presente invención son los siARN y shARN. En una realización particular, el ARNi es un siARN o un shARN.

El acrónimo siARN proviene del inglés small interfering RNA: en español, ARN

5 interferente pequeño. Son moléculas de ARN bicatenario perfectamente complementarias con 2 nucleótidos desemparejados en cada extremo 3'. Cada hebra de ARN tiene un grupo fosfato 5' y un grupo hidroxilo (-OH) 3'.

Un shARN es una pequeña horquilla de ARN codificada por un AON , de tal forma que

10 cuando se realiza la transcripción (generación del ARN) se genera un ARN autocomplementario que se pliega como una horquilla y que será reconocido por la maquinaria celular como un iARN. Se puede, por tanto, utilizar para silenciar la expresión del gen diana a través de la interferencia de ARN. La expresión de shRNA en las células se realiza típicamente mediante la introducción de plásmidos, que

15 codifican para la formación de shARN, a través de vectores virales.

En el contexto de la presente invención, el ARNi tiene que ser diseñado para que sea específico del alelo mutado del gen FAS

20 En la presente invención se entiende por "alelo" a la forma alternativa de un gen que se halla en el mismo locus de cromosomas homólogos. Cada individuo presenta dos alelas para un mismo gen, cada uno procedente de uno de sus progenitores. Se entiende por "alelo mutado" al alelo que presenta un cambio en su secuencia de nucleótidos desencadenante de la enfermedad.

25 En la presente invención se entiende por "alelo mutado del gen FAS" a aquel cambio en la secuencia de nucleótidos del gen FAS que afecta únicamente a uno de sus alelas y que se asocia con el Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (SLPA) de tipo la.

El gen FAS (también llamado AP01, TNFRSF6 o C095) codifica para la proteína FAS

o receptor FAS, una proteína de superficie de 36 kOa con un dominio citoplasmático de "muerte celular" conservado. El receptor FAS es un receptor de muerte sobre la superficie de las células, es decir, su activación por el ligando correspondiente

35 conduce a la muerte celular programada o apoptosis. El gen FAS (NCBI, GenelO: 335) está localizado en humanos en el brazo largo de cromosoma 10 (10q24.1). La

secuencia de nucleótidos del gen FAS se muestra en la SEQ ID NO: 1 (NCBI, número

de acceso NG_009089, versión NG_009089.2 GI:329299085).

Alelas mutados del gen FAS que pueden emplearse en el diseño de los ARNi de la

5 invención incluyen, sin limitar a, mutaciones en los exones 7, 8 o 9 del gen FAS.

Ejemplos de mutaciones en el exón 7 del gen FAS incluyen, sin limitar a, K181(del

11), T1821, E195X-Is(-1), S1961-ls"7 (dup+1), y L 199X (15 indica cambio de la pauta de

lectura, del inglés frameship; del indica delección de nucleótidos; dup indica

10 duplicación). Ejemplos de mutaciones en el exón 8 del gen FAS incluyen, sin limitar a, N207X (del

8), L208X (del-2), variación del splicing (del codones 202-210) y 1206X 15(-1).

15 Ejemplos de mutaciones en el exón 9 del gen FAS incluyen, sin limitar a, T225P, 0257X, D253 (15 -2), L290 (del 29 últimos aminoácidos), K230X 15(+1 ), D244Y, R234X, D244V, D244G, D244Y, T2541, S214 15(+2), S227 15(+4), V233L, R234P, G237D, G237S, 1243R, T254K, E256K, W265 15, K280 15(-1), R2340, 1246S, D244N, V204 (del-2), D212X (del-5 ), Y275S, D253Y, K235R, N264H, D244V, N248K. E256K,

20 L262F, K283N, L213 15(-20), A241T, N250S, V2511, N239D, Y216X, E240V, D244N, D244H, 15 exón 9 (+1 codon 285), V229A, 284 (inserción +1) 15, T254A, 0260X, 0260N, 0260N, N239D, E240G, D244V, R263H, D210G, A221G, N239S, H266L, K271M, D276G, 1279V, 1302V, T203P, A285 15(+1 ), 0228X, N250S, D244N y 0260X.

25 Aunque cualquiera de las mutaciones arriba indicadas puede emplearse en el diseño de los ARNi de la invención, en una realización particular, el alelo mutado del gen FAS asociado al SlPA de tipo la se selecciona del grupo que consiste en: -la mutación c.797T>G de la secuencia de nucleótidos con número de acceso a

GeneBank AY495076 (SEO ID NO: 2), o

30 -la mutación c.827dupA de la secuencia de nucleótidos con número de acceso a

GeneBank EU481974.2 (SEO ID NO: 3)

Como se ha indicado previamente, los ARNi pueden ser de varios tipos, incluyendo

tanto ARNi de cadena sencilla como de doble cadena. Así, en una realización

35 particular, el ARNi comprende:

-: una primera cadena sentido que comprende una longitud de entre 16 y 30 nucleótidos homólogos a la región del gen FAS que comprende el alelo mutado y la posición nucleotídica mutada de dicho alelo, y -una segunda cadena antisentido que comprende de entre 16 y 30 nucleótidos

5 complementarios a la primera cadena.

En otra realización más particular, la primera cadena sentido comprende la secuencia SEO ID NO: 4 dirigida al alelo mutado del gen FAS portador de la mutación c.979T>G,

o la secuencia SEO ID NO: 5 dirigida al alelo mutado del gen FAS portador de la 10 mutación c.827dupA.

Como entiende el experto en la materia , el ARNi puede sintetizarse químicamente o mediante la expresión del AON correspondiente en una célula adecuada. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con una secuencia de nucleótidos

15 que codifica el ARNi de la invención, de aquí en adelante, secuencia de nucleótidos de la invención, la cual, opcionalmente, puede estar incluida dentro de un vector o dentro de una célula.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende la 20 secuencia de nucleótidos de la invención .

La obtención de dicho vector puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. En general, un vector comprende, además de la secuencia de nucleótidos de la invención, un promotor que dirige su transcripción (por 25 ejemplo, U6, H1 , etc.) al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso. La elección del vector dependerá de la célula huésped y del tipo de uso que se quiera realizar. Por ejemplo, dicho vector 30 puede ser un vector viral (adenovirus, virus asociados a los adenovirus así como retrovirus y, en particular, lentivirus) o no viral (pcONA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFI/His, pIND/GS, pRdHCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6N5-His, pVAXI, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, pBPV-1 , pML2d y pTDTI). Vectores adecuados para alojar la secuencia de nucleótidos de la invención incluyen un plásmido 35 o un vector que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra o no en el genoma

de dicha célula. Dicho vector puede obtenerse mediante procedimientos convencionales conocidos por expertos en la materia.

Así, en una realización particular, el vector es un vector viral, un vector retroviral, un casette de expresión o un plásmido y que, opcionalmente comprende un promotor ARN polimerasa 1I1 o ARN polimerasa 11.

Como entiende el experto en la materia, los vectores de la invención pueden usarse alternativamente para transformar, transfectar o infectar células, preferentemente células de mamífero que incluyen células humanas, por ejemplo, ex vivo, y, posteriormente implantarlas al cuerpo humano o animal para obtener el efecto terapéutico deseado.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención o un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos.

Prácticamente cualquier célula huésped (tanto eucariota como procariota) puede usarse en el contexto de la presente invención (por ejemplo células animales, levaduras, células vegetales, etc.) y obtenerse mediante procedimientos convencionales conocidos por expertos en la materia.

Por otro lado, dentro del ámbito de la presente invención, también se contemplan como aspectos inventivos adicionales el vector y la célula que comprenden el ARNi de la invención.

Una vez que se ha diseñado el ARNi dirigido de forma específica al alelo mutado del gen FAS, el ARNi puede formar parte de una composición formulada de forma adecuada para su administración a un sujeto.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición, de aquí en adelante "composición farmaceútica de la invención", que comprende una cantidad efectiva del ARNi de la invención, una secuencia de nucleótidos, un vector o una célula según la presente invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la presente invención se entiende por "composición farmacéutica" o "medicamento" a toda preparación o forma farmacéutica, cuya fórmula de composición expresada en unidades del sistema internacional, está constituida por una sustancia o mezcla de sustancias, con peso, volumen y porcentajes constantes, elaborada en laboratorios

5 farmacéuticos legalmente establecidos, envasada o etiquetada para ser distribuida y comercializada como eficaz para diagnóstico, tratamiento, mitigación y profilaxis de una enfermedad, anomalía física o síntoma, o el restablecimiento, corrección o modificación del equilibrio de las funciones orgánicas de los seres humanos y de los animales.

10 En la presente invención se entiende por "vehículo farmacéuticamente aceptable" a aquella sustancia/s inerte de naturaleza acuosa u oleosa, que se emplea/n en las formulaciones farmacéuticas para diluir el principio activo hasta un volumen o peso determinado, que pueden ir acompañados de otros excipientes. Dichos excipientes

15 son sustancias que modifican alguna de las características del principio activo en el producto final denominado forma farmacéutica.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos

20 en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas. La composición terapéutica puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida, por ejemplo, por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc.

25 Asimismo, la composición farmacéutica puede comprender otros compuestos farmacéuticos útiles para el tratamiento de la SLPA de tipo la. Ejemplos de compuestos farmacéuticos útiles en el tratamiento de la SLPA de tipo la incluyen, pero no se limitan a, inmunosupresores como corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus,

30 sirolimus y micofenolato-mofetil.

La elaboración de la composición farmacéutica puede llevarse por cualquiera de los métodos descritos en el estado de la técnica, y además de los ARNi específicos de los alelas mutados del gen FAS, puede comprender un adyuvante y vehículos

35 farmacéuticamente aceptables para su administración.

Usos y métodos del ARNi de la invención

Tal como se ha explicado al inicio de la presente descripción, la inhibición aleloespecífica de las mutaciones FAS con siRNAs específicos provoca la recuperación de la capacidad de morir por apoptosis de células portadoras de dichas mutaciones, lo que resulta de utilidad en el tratamiento de sujetos con SLPA de tipo la.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso del ARNi, una secuencia de nucleótidos, un vector o una célula según la presente invención, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del SLPA de tipo la o alternativamente, se refiere al ARNi, una secuencia de nucleótidos, un vector o una célula según la presente invención, para su uso en el tratamiento del SLPA de tipo la.

Las características de la composición farmacéutica y la forma de obtenerla han sido descritas previamente en la presente descripción y son aplicables al presente aspecto inventivo.

En la presente invención se entiende por "tratamiento" al conjunto de medios que se utilizar para tratar, aliviar o curar una enfermedad, en particular, el Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (SLPA) de tipo la.

En la presente invención, la enfermedad a tratar es el SLPA de tipo la. El SLPA de tipo la es una enfermedad congénita y hereditaria, causada por una mutación en el gen que codifica la proteína FAS, lo que provoca una alteración de los mecanismos naturales de apoptosis de linfocitos, causando la supervivencia anormalmente alta de los mismos. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad incluyen linfadenopatías, hepatoesplenomegalia con o sin hiperesplenismo, y enfermedades autoinmunes (anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune, neutropenia autoinmune, glomerulonefritis, hepatitis autoinmune, síndrome de Guillen-Barre, uveitis, entre otras), que mayoritariamente afectan a células sanguíneas. Adicionalmente los pacientes presentan un riesgo elevado de sufrir linfomas (Hodgkin y no-Hodgkin), carcinomas (tiroideos, pulmonares, piel, lengua, hígado) y múltiples lesiones neóplasicas (adenomas, gliomas).

Las manifestaciones linfoproliferativas no malignas frecuentemente mejoran con la edad, mientras que los eventos autoinmunes no suelen remitir con el paso del tiempo. Por otro lado, el riesgo a desarrollar linfomas permanece elevado durante toda la vida del paciente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para determinar si un ARNi es útil en el tratamiento de un sujeto que padece SLPA de tipo la, de aquí en adelante "método de la invención", que comprende: a) poner en contacto un ARNi específico de una mutación en un alelo del gen FAS con

10 un cultivo celular procedente de dicho sujeto, y b) evaluar la apoptosis celular en el cultivo celular procedente del sujeto, en donde un incremento de la apoptosis estadísticamente significativo en el cultivo celular procedente del sujeto con respecto a la apoptosis de un cultivo celular procedente del mismo sujeto tratado con un ARNi control negativo, es indicativo de que el ARNi

15 específico de una mutación en un alelo del gen FAS, es útil en el tratamiento del sujeto que padece SLPA de tipo la.

A efectos de la presente invención, el término "ARNi control negativo" se refiere a un ARNi no interferente del RNA.

En una realización preferida del método de la in vención, previamente a la etapa a), se determina en una muestra biológica del sujeto, la mutación en el alelo del gen FAS y se diseña un ARNi específico para dicha mutación.

25 En la presente invención se entiende por "sujeto" a un ser humano de cualquier raza, sexo o edad.

La puesta en práctica del método de la invención puede comprender, adicionalmente, una etapa previa a la etapa a) del método de la in vención, para determinar en una 30 muestra biológica del sujeto una mutación en un aleo del gen FAS, por lo que primero es necesario la obtención de la muestra biológica del sujeto que se quiere tratar o para el que se quiere diseñar la terapia personalizada. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas muestras incluyen sangre y muestras de tejidos. Las muestras de sangre pueden ser obtenidas por cualquier método convencional al igual que las

35 muestras de tejidos; a modo ilustrativo dichas muestras de tejidos pueden ser muestras de biopsias obtenidas por resección quirúrgica.

A continuación, se procede a procesar la muestra y aislar el ADN genómico y ARN de la misma para después identificar la mutación presente en los alelos del gen FAS. El procesamiento de la muestra y el aislamiento del ADN genómico y ARN es práctica habitual para el experto en la materia y puede llevarse a cabo por cualquiera de los

5 métodos disponibles actualmente para dicho propósito.

Cualquiera de las técnicas que existen actualmente para detectar alelos mutados en un gen puede emplearse en la puesta en práctica del método de la invención. Ejemplos de dichos métodos son la amplificación de las regiones codificantes del gen

10 FAS (utilizando la reacción en cadena de la polimerasa) y posterior secuenciación directa de los productos de PCR. Las variaciones de secuencia detectadas son contrastadas con bases de datos de polimortismos y las posibles mutaciones se confirman con estudios familiares y poblacionales.

15 Ejemplos de alelas mutados del gen FAS que pueden detectarse en la etapa a) del método de la invención incluyen, sin limitar a, mutaciones en los exones 7, 8 o 9 del gen FAS. Ejemplos de mutaciones en dichos exones han sido descritos previamente en la presente descripción.

20 No obstante, en una realización particular, la mutación en el alelo del gen FAS determinada en la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en: -mutación c.979>G de la secuencia de nucleótidos con número de acceso a

GeneBank AY495076 (SEO ID NO: 2), y -la mutación c.827dupA de la secuencia de nucleótidos con número de acceso a

25 GeneBank EU481974.2 (SEO ID NO: 3).

Una vez determinada la mutación que presenta el sujeto se procede a diseñar un ARNi específico para la mutación detectada previamente.

30 Técnicas y procedimientos adecuados para diseñar ARNi han sido descritos previamente en la presente descripción, así como las clases y características de los ARNi. Así, en una realización particular, el ARNi es un siARN o un shARN que, en otra realización todavía más particular, el ARNi comprende -una primera cadena sentido que comprende una longitud de entre 16 y 30

35 nucleótidos homólogos a la región del gen FAS que comprende el alelo mutado y la posición nucleotídica mutada de dicho alelo, y -una segunda cadena antisentido que comprende de entre 16 y 30 nucleótidos complementarios a la primera cadena.

En otra realización aún más particular, la cadena sentido del ARNi comprende la

5 secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 4, específica del alelo mutado del gen FAS portador de la mutación c.979T>G, o la secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 5, específica del alelo mutado del gen FAS portador de la mutación c.827dupA.

Tras diseñar el ARNi específico de la mutación, el método de la invención comprende

10 en una etapa a) poner en contacto el ARNi diseñado específicamente para la mutación identificada, con un cultivo celular procedente del sujeto que padece SLPA de tipo la. Para poder llevar a cabo esta etapa, es necesario extraer células del sujeto para el que se está diseñando la terapia personalizada y una vez extraídas hacer un cultivo celular el cual, si se desea, puede ser almacenado en las condiciones

15 adecuadas hasta su utilización. No obstante, células adecuadas para la puesta en práctica, validación, del método de la invención son las células del tejido conectivo o fibroblastos. Estas células pueden obtenerse de pequeñas biopsias de piel que se procesan en el laboratorio con el fin de generar pequeños explantes, a partir de los cuales crecen fibroblastos adheridos al plástico de placas o frascos. Los fibroblastos

20 se mantienen en cultivo creciendo durante 2 o 3 meses. Cuando el cultivo está confluente las células se transfieren para aumentar la superficie disponible para su cultivo. Las células utilizadas en la validación del método no han de exceder los 8 pases.

25 Una vez que se ha puesto en contacto el ARNi diseñado específicamente para la mutación identificada, con el cultivo celular procedente del sujeto, el método de la invención comprende detectar la apoptosis celular [etapa b)).

En la presente invención se entiende por "apoptosis" o "apoptosis celular" al proceso

30 celular coordinado, dependiente de energía, que involucra la activación de un grupo de cisteín proteasas denominadas 'caspasas' (en inglés: cysteinyl aspartate-specific proteases) y una compleja cascada de eventos que unen el estímulo inicial con la desaparición definitiva de la célula, es decir, a la muerte celular.

35 Son múltiples los parámetros que pueden emplearse para determinar si una célula está sufriendo apoptosis o muerte celular. Ejemplos de dichos parámetros son:

1) Detección del marcaje con ioduro de propidio. La membrana plasmática de las células que mueren es permeable a ciertos reactivos (colorantes o fluorocromos) y pueden ser teñidas con ellos. Sin embargo, las células vivas excluyen a los denominados "colorantes vitales", que no penetran a través de la membrana

5 plasmática. Una de estas moléculas es el ioduro de propidio (PI), que tras su unión al DNA incrementa mucho su fluorescencia bajo excitación con luz ultravioleta. Sin permeabilización previa, el PI sólo tiñe células no viables.

2) Un método fundamental en la detección temprana de apoptosis es la valoración de

10 cambios en la localización de la fosfatidilserina (PS) en la membrana plasmática ya que este fosfolípido está normalmente ubicado en la cara interna de la misma. En la apoptosis se pierde la asimetría de la membrana plasmática con la exposición de la PS en la cara externa, precediendo esta translocación a otros eventos apoptóticos. Este proceso se puede cuantificar mediante citometría de flujo utilizando anexina-A5

15 conjugada con f1uorocromos, ya que esta proteína tiene una elevada afinidad por este tipo de fosfolípido. Normalmente se detecta en conjunción con el loduro de Propidio (IP) permitiendo la distinción de células apoptóticas tempranas (anexina V+/IP-) y apoptóticas tardías (anexina V+/IP+).

20 3) Cambios morfológicos en la célula, como por ejemplo, pérdida de la unión celular, cambios en las microveliosidades en la organización de la membrana citoplasmática, la aparición de condensación de la cromatina, fragmentación nuclear, etc. Todo este tipo de cambios se puede detectar mediante microscopía de luz (de campo, de fluorescencia, etc), como mediante microscopía electrónica.

25 4) Detección de degradación del ADN de forma específica entre nucleosomas. Métodos utilizados para detectar esta degradación es la extracción de ADN con fenol/cloroformo y su precipitación con etanol, o la detección de las proteínas presentes en los nucleosomas (histonas).

30 5) La fragmentación nucleosomal del DNA genómico se puede determinar por diferentes métodos. Uno de los métodos más utilizados es el ensayo de TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-dUTP Nick End Labeling), test in situ basado en la unión específica de la desoxinucleotidil transferasa terminal a los extremos 3'OH

35 de los fragmentos de DNA e incorporación a dicho extremo de dUTP marcado.

6) Detección de la activación de caspasas, que son una serie de cistein-proteasas que se encuentran en forma de zimógeno en todas las células. La activación de la caspasa 3 se utiliza como marcador temprano de la apoptosis. Puede analizarse el paso de forma pro-caspasa a caspasa activa, que incluye la escisión de parte de la proteína,

5 generándose una proteína activa de menor tamaño, detectable por western-Blot. También puede detectarse la funcionalidad de las caspasas activas proporcionando a las células un sustrato de las caspasas (Ej PARP) que al ser degradado proporcionará una señal calorimétrica, luminiscente o fluorescente.

10 7) La mitocondria participa activamente en el desencadenamiento de la apoptosis y la despolarización de la membrana mitocondrial es un indicador más de apoptosis. La pérdida de potencial de membrana mitocondrial (LlllJm) es consecuencia de la interrupción del paso de electrones a través de la cadena respiratoria. El DIOC2.3 es un sustrato lipofílico catiónico (3,3'-diethyloxacarbocyanine iodide) que difunde

15 libremente al citosol celular y se acumula preferentemente en las mitocondrias que tienen potencial de membrana activo, emitiendo fluorescencia; su emisión fluorescente disminuye cuando se produce alteración del potencial de membrana mitocondrial.

Estas y otras técnicas están ampliamente descritas en la literatura científica y están

20 disponibles para el experto en la materia. Ensayos sobre cómo pueden medirse algunos de estos y otros parámetros se describen en los Ejemplos que acompañan a la presente descripción.

Finalmente, tras llevar a cabo cada una de las etapas descritas, podemos concluir si el

25 ARNi diseñado o la terapia es útil en el tratamiento de un sujeto que padece SLPA de tipo la, ya que la detección de apoptosis en el cultivo celular es indicativo de que el ARNi diseñado específicamente para la mutación identificada es útil en el tratamiento del sujeto que padece SLPA de tipo la.

30 En la presente invención se entiende que el ARNi o la terapia es útil en el tratamiento de un sujeto que padece SLPA de tipo la, cuando la administración del ARNi o la terapia al sujeto, diseñada mediante el método de la invención produce la disminución, atenuación o desaparición del cuadro clínico asociado al SLPA de tipo la (Iinfadenopatías, hepatoesplenomegalia, citopenias y otras manifestaciones

35 autoinmunes).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la

5 invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

10 Figura 1. Mutaciones en FAS y defecto de apoptosis en P1 y P2. (A) Estructura del gen FAS y mutaciones encontradas en P1 (c.979T>G) y P2 (c.827dupA). SP, péptido señal; TM, dominio transmembrana; DO, dominio de muerte. (B) Tras 16 horas de estimulación con AcM o anti-FAS, los fibroblastos de los pacientes permanecen vivos y adheridos a la placa (fibroblastos P1 y P2), mientras que los fibroblastos de controles

15 sanos mueren y pierden la adhesión (fibroblastos Control). (e) Tras 16 horas de estimulación con AcMo anti-FAS, la mayoría de los fibroblastos de P1 y P2 permanecen viables (Ioduro de propidio (IP)-negativo, anexina V-negativo), mientras que la mayoría de las células del control son inviables: apoptóticas tardías (IP-positivo, anexina V-positivo) o apoptóticas tempranas (IP-negativo, anexina V-positivo).

20 Figura 2. Inducción de apoptosis tras silenciación con siRNAs específicos de alelos mutados. 48 horas después de la transfección con siR NAs los fibroblastos fueron tratados con AcMo anti-FAS durante 16 horas y marcados con Anexina V. El porcentaje de apoptosis específica se evaluó por citometría de flujo considerando

25 todas las células anexina-V positivas en P1 (A), P2 (B) Y sus respectivos controles. Hiperfect indica células que han pasado por el mismo proceso de transfección sin añadir siRNA. (C) Experimento representativo (de 8): la apoptosis se induce de forma óptima en fibroblastos del control sano previamente transfectados con siRNA C-NEG,

o con los oligonucleétidos diseñados frente a las formas mutadas de FAS (siRNAP1-1

30 o siRNAP2-1), y se reduce de forma importante en fibroblastos transfectados con siRNAWT, por interferencia específica del gen FAS normal (wild type). La apoptosis es prácticamente nula en células de P1 y P2 tratadas con siRNA C-NEG pero se induce tras el tratamiento con siRNA-P1-1 y siRNA-P2-1 respectivamente. Cuadrantes inferiores izquierdos: células viables (anexina V-, IP-), cuadrantes superiores

35 derechos: células apoptéticas tardías (anexina V+, IP+), cuadrantes inferiores derechos: células apoptéticas tempranas (Anexina-V+, IP -). (D) Resultados agrupados de los 8 experimentos. (E) Expresión en membrana de FAS en fibroblastos tras 72 horas de transfección con siRNAs versus células sin transfectar.

Figura 3. Digestión de caspasa-8 en los fibroblastos de los pacientes tras

5 silenciamiento específico de FAS mutados y estimulación con AcMo anti-FAS. Las células del control y pacientes se trataron con los siRNAs indicados, y en los extractos celulares se analizó el procesamiento de caspasa-8 antes (TO) y 300 min tras la inducción de apoptosis con AcMo anti-FAS (T300). Las cabezas de flecha indican la isoforma de procaspasa-8 (p55), las formas de digestión intermedia (p43 y

10 p41) Y de digestión final (p18).

Figura 4. Permeabilización de la membrana mitocondrial en la inducción de apoptosis tras el silenciamiento específico. (A) Citometria de flujo de un experimento representativo. Tras transfectar fibroblastos control con siRNA-C-NEG o 15 siR NAs específicos de FAS mutado (siRNA-P1-1 y siRNA-P2-1) la inducción de apoptosis incluye pérdida de potencial de membrana mitocondrial [DiOC2 (3) low). Al transfectarlos con siRNA-WT, que silencia las formas normales de FAS, la pérdida de potencial de membrana es inferior. Tras la estimulación con AcMo anti-FAS, se observa mayor pérdida de potencial de membrana en fibroblastos P1 y P2 tratados

20 con sus siRNA específicos que en los tratados con siRNA-C-NEG. (B) Resultados agrupados de los 8 experimentos.

Figura 5. Activación de caspasas 317 en fibroblastos de pacientes transfectados con siRNAs alelo-específicos. (A) 48 horas después de la transfección, las células 25 se estimularon con AcMo anti-FAS y tras 5 horas se incubaron con Caspase-Glo® 3/7 Reagent. La intensidad de luminiscencia es proporcional a la actividad de las caspasas 3/7. Cada barra representa medias entre duplicados tras sustraer el valor obtenido en los pocillos "blanco" (sólo medio). (B) El sustrato de la caspasa 3, PARP, se digiere tras la silenciación alelo-específica y estimulación con AcMo anti-FAS.

30 Western blot de PARP (forma completa: p119, producto de digestión: p89) de células no tratadas (TO) o tratadas 300 minutos (T300) con AcMo anti-FAS.

EJEMPLOS

35 A continuación se ilustrará la in vención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

l. MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes con SlPA y controles sanos

Se estudiaron dos pacientes con SlPA tipo la. P1 es un varón que a los 3 años de

5: edad presentó múltiples adenopatías, hepatosplenomegalia persistente, otitis

recurrente , fiebre y exantema generalizado. Las adenopatías y la

hepatosplenomegalia fueron disminuyendo gradualmente. En la actualidad el paciente

tiene 21 años y no sufre infecciones ni fenómenos autoinmunes. P2 es una mujer, sin

síntomas hasta la actualidad, hermana de un varón de 29 años con SLPA y linfoma de

10: Hodgkin en forma de masas abdominales paraaórticas. El padre de ambos falleció a

los 58 años por linfoma de Hodgkin. En todos los experimentos se incluyeron

muestras de sujetos control sanos.

Caracterízación de mutaciones en el gen FAS

15: De sangre periférica se obtuvieron DNA genómico y RNA citoplasmático por

procedimientos estándar. los cebadores diseñados y usados para amplificar y

secuenciar el cONA (secuencia codificante) de FAS fueron : F1-5'

cccgctcagtacggagttgg-3' (SEO ID NO: 6) y R1-S'-ccaagttagatctggatccttcc-3' (SEO ID

NO: 7); F2-S'cccUgcaccaaatgtgaacatgg-3' (SEO ID NO: 8) y R2-S'

20: ccaagcagtatttacagccagc-3' (SEO ID NO: 9]. Las condiciones de PCR fueron :

desnaturalización de 94°C-15s, anillamiento a 57°C-30s y extensión a 72°C-80s, 38

ciclos. la secuenciación se realizó en la plataforma ABI 3100 Genetic Analyzer

(Applied Biosystems).

2S: siRNAs

los siRNAs diseñados y sintetizados frente a FAS (Sigma-Aldrich Ouimica , Spain)

fueron: un siRNA frente a la secuencia normal de FAS (siRNA-WT) (Sense siRNA

strand: S'-UAGAUGAGAUCAAGAATGAtt-3' (SEO ID NO: 10)), tres siRNAs frente a la

mutación de FAS del primer paciente (c.979T>G): siRNA-P1-1 (SEO ID NO: 4), siRNA

30: P1-2 (SEO ID NO: 12) y siRNA-P1-3 (SEO ID NO: 14), y tres siRNAs frente a la

mutación de FAS del segundo paciente, (c.828dupA): siRNA-P2-1 (SEO ID NO: S),

siRNA-P2-2 (SEO ID NO: 17) y siRNA-P2-3 (SEO ID NO: 19) (Tabla 2). Como control

negativo se utilizó un siRNA irrelevante, no interferente (siRNA-C-NEG) y como

control positivo se utilizó una mezcla de siRNAs que causan muerte celular ("AII Stars

3S: Negative Control siRNA" and "AII Stars Hs Cell Death Control siRNA",

respectivamente, Oiagen , Hilden, Germany).

Este último se utilizó para evaluar la eficiencia de la transfección, generando una

muerte superior al 90% de las células tanto en fibroblastos de controles como de los

pacientes en todos los experimentos realizados.

5 Cultivo de fibroblastos y transfecciones Los fibroblastos de los pacientes se obtuvieron a partir de muestras de piel de la cara anterior del antebrazo. Los de los controles sanos se obtuvieron a partir de restos de prepucio tras intervenciones de fimosis. Se cultivaron en DMEM (Gibco, Rockville, MD, USA) suplementado con 4.5 gIL de glucosa, 2 mM de glutamina, 10% de suero

10 de ternera fetal, 50 U/mL de penicilina y 50 mg/mL de estreptomicina (Gibco). Los cultivos se mantuvieron a 37°C y 5% C02. Todos los experimentos se realizaron con células entre pases 5 y 9.

Los fibroblastos de pacientes y controles se transfectaron en placas de 24 pocillos

15 utilizando Hiperfect Transfection Reagent (Qiagen). En cada pocillo se sembraron 6x104 fibroblastos y se transfectaron con 10 nM de los siRNAs, como concentración final. Tras 48 horas de incubación a 3rC y 5% de C02, se evaluó la apoptosis de las células transfectadas.

20 Inducción de apoptosis y evaluación de la tinción anexina V I ioduro de propidio (IP) por citometria de flujo Una vez confluentes, los cultivos de fibroblastos se deprivaron de suero y se mantuvieron en DMEM 24 horas. A continuación se indujo la apoptosis tratando las células con el anticuerpo monocional (AcMo) anti-FAS (clan APO-1-3; 500 ng/ml;

25 ENZa Life Sciences) en presencia de proteina A de StaphiJococcus aureus (Prot A; 1~g/ml; Sigma Aldrich) y cicloheximida (CHX; 100 ~g/ml; Sigma Aldrich) (Santiago B, et al. J Immunol. 2004, 1 ;172(1 ):560-6). Tras tratar los cultivos celulares con tripsina y recuperar por centrifugación tanto las células adheridas como las que se encontraban previamente en suspensión, la muerte celular inducida por el AcMo anti-FAS se

30 analizó por citometria de flujo mediante el uAnnexin V-FITC Apoptosis detection kit" (Immunostep, Salamanca, Spain), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La apoptosis especifica se calculó con la fórmula: (% apoptosis experimental -% apoptosis espontanea)/(100-% apoptosis espontánea) *100.

Expresión de FAS en la superficie celular Para determinar la expresión de membrana de FAS, los fibroblastos, sin transfectar o tras 48 o 72 horas tras transfección con siRNAs, se trataron con tripsina-EDTA y una vez resuspendidos en PBS con 5% de FCS se incubaron con anticuerpos anti-CD95

5 o anticuerpos anti-lgG control isotipo (BD Biosciences), ambos marcados con ficoeritrina, durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad. Tras un lavado con PBS, se analizaron las muestras por citometria de flujo adquiriendo 50.000 células viables de cada una.

10 Evaluación del potencial de membrana mitocondrial por citometría de flujo La inducción de apoptosis se comprobó también determinando la pérdida del potencial de membrana mitocondrial (~'+'m). Tras la transfección con los siRNAs y la inducción de la apoptosis, las células se incubaron con 5 nM de ioduro de 3,3'dietiloxacarbocianina [DiOC2(3)] (Molecular Probes; Invitrogen) durante 15 minutos a

15 37°C, Y el .8.4Jm se determinó por citometría de flujo. El porcentaje de apoptosis específica se calculó con la fórmula: (% de apoptosis experimental -% de apoptosis espontánea) I (100 -% apoptosis espontánea) "100

Medición de la actividad de la caspasa-3

20 Trascurridas 48 horas desde la transfección, los fibroblastos se sembraron en placas blancas de 96 pocillos (2x104 células I pocillo en 100 IJI de medio) y se trataron con AcMo anti-FAS, Proteína A y cicloheximida (ver antes "Inducción de la apoptosis"). Cinco horas más tarde se midió la actividad de la caspasa-3 mediante el ensayo luminogénico Caspase-Glo 3/7 (Promega), añadiendo 100 IJL de sustrato de las

25 caspasas 3/7 por pocillo y evaluando las reacciones en el luminómetro 1 hora más tarde.

Western blotting 48 horas después de la transfección, los fibroblastos se trataron con AcMo anti-FAS,

30 Prot A (proteína A de Staphilococcus aureus) y CHX (Cycloheximida), para inducir la apoptosis. A tres tiempos diferentes (tiempo O, fibroblastos sin AcMo anti-FAS, 60 minutos y 300 minutos), se extrajeron proteinas de 106 fibroblastos mediante el buffer RIPA (Bio-Rad Laboratories, Spain) adicionado con 1X Halt Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific Erembodegem) y 0,05M EDTA. Los extractos de proteína (20IJg) se

35 sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 4-20% y se transfirieron a filtros de PVDF usando el sistema de transferencia semiseco Trans-810t (Biorad). Tras bloquear la membrana 2 horas con 5% de leche en polvo desnatada en TBS-T, las membranas se incubaron durante la noche a 4°G con el anticuerpo monoclonal antiGaspase-8 (dilución 1/1000, clan 12F5; ENZa Life Science), el policlonal antiCaspase-3 (dilución 1/1000, Cell Signaling), el monoclonal anti-PARP (dilución 1/1 000,

5 clone 46D11; Gell Signalling), y el manoclonal anti-j3-Actina (clan AG-74; SigmaAldrich Quimica, Spain). Las membranas se lavaron en incubaron durante 1 hora con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa a dilución 1/2500 (1/20000 para j3-Actina). Las reacciones se revelaron con el sistema ECL (Clarity Western ECL Substrate, Biorad) en un detector ImageQuanFM LAS 4000 (GE Healthcare).

10 Análisis estadístico Las diferencias entre los valores de pacientes y controles se evaluaron estadisticamente con el test t de Student (no pareado, dos colas) y las diferencias entre resultados obtenidos con células sometidas a diferentes tratamientos se

15 evaluaron mediante el test t de Student pareado. Todos los datos se expresan mediante medias y desviaciones estándar (SD).

11. RESULTADOS los pacientes presentan las anomalías analíticas del SlPA, mutaciones en FAS

20 Y apoptosis defectuosa. Estudiamos dos pacientes con características clínicas e inmunológicas compatibles con SLPA (Tabla 1).

Tabla 1. Características inmunológicas del paciente 1 y paciente 2.

Paciente 1: Paciente 2 Valor de referencia

Linfocitos totales (/pl): 2298 2460 1050-4800

Linfocitos T (%)

CD3+: 81 82 61-82

CD3+CD4+: 26 49 36-56

CD3+CD8+: 32 27 13-31

CD3+TCRa~+: 71 74 55-75

CD3+TCRV~+: 9 3 0-7

TCRa~+CD4-CD8-(DN): 12 6 0-2

Paciente 1: Paciente 2 Valor de referencia

Jnmunoglobulinas (mgldl)

IgG: 1950 878 700-1600

IgA: 233 64 70-400

IgM: 40 105 40-230

Citokinas (pglml)

IL-10: 45 6 0-5

sCD25: 12968 2844 0-1900

Auto-anticuerpos

ANA: Positivo Negativo

Otros'": Negativo Negativo

Apoptosis linfocitaria (%)~: 3 4 75-85

• Otros auto-anticuerpos. antl-cardlollplnas (lgM, IgG e IgA), antl-musculo 1150, antimitocondriales, anti-LKM, anti-DNA, anti-¡32 glicoproteina. b Ensayo realizado con linfocitos aislados, activados con PHA e IL2 y mantenidos in vitro una semana. Inducción de la apoptosis con anticuerpo monoclonal anti-FAS (clon

5 APO-1-3).

P1 se diagnosticó en la infancia de SLPA tipo la. El estudio molecular del gen codificante de la proteína FAS (TNFRSF6) demostró una mutación en heterocigosis 10 (c.979T>G, número de acceso AY495076 en GenBank) en el exón 9, que afecta al dominio de muerte de la proteína (p.lle246Ser). Su padre es portador de la misma mutación en heterocigosis. P2 presentaba, como su hermano enfermo, la mutación c.827dupA en heterocigosis en el gen de FAS, no reportada hasta el momento (número de acceso EU481974.2 en GenBank). Esta mutación, que genera un cambio 15 de serina por isoleucina en la posición 196 de la proteína (p.Ser1961Iefs*7), distorsiona la pauta de lectura y genera un codón stop prematuro en el aminoácido 202, inicio del exón 8, impidiendo la traducción del dominio de muerte de la proteína (exón 9) (Figura 1A). Como se esperaba, los fibroblastos de ambos pacientes mostraban un defecto en

la apoptosis mediada por FAS (Figuras 18 y 1C), similar al que se había observado previamente en sus linfoblastos (no mostrado).

Recuperación de la apoptosis por interferencia específica de alelos FAS

5 mutados: diseño y selección de siRNAs óptimos. Los siRNAs alelo-específicos se diseñaron como construcciones de 19 nucleótidos más 2 nucleótidos "colgantes" dT (formato 19+2), de forma que el "mismatch" (diferencia) entre los alelas mutado y normal queda situado en el centro del oligonucleótido, según los estudios que han demostrado que esta región de la hebra

10 antisentido del siRNA es la que dirige la rotura del mRNA diana. Tras analizar la secuencia de varios siRNAs posibles, se seleccionaron los oligonucleótidos siRNA-P11 y siRNA-P2-1 por ser los que mejor cumplían los criterios asociados con funcionalidad (Reynolds A, et al.. Nat Biotechnol. 2004, 22(3):326-30). A continuación, y de acuerdo a los resultados que demuestran que la discriminación puede mejorarse

15 al añadir en el siRNA "mismatches" secundarios respecto al alelo normal, aunque ello suponga la introducción de un mismatch frente al alelo mutado diana, se diseñaron siRNA-P1-2 y siRNA-P2-2, con mismatches secundarios introducidos inmediatamente a continuación de la posición ocupada por la mutación patogénica. Finalmente se diseñaron otros dos siRNAs, siRNA-P1 -3 y siRNA-P2-3, con un mismatch en el

20 extremo 3' de la hebra sentido, con el fin de potenciar su unión al complejo de silenciación inducido por RNA (RISC) (Tabla 2).

Tabla 2. siRNAs diseñados dirigidos a la región de las mutaciones c.979T>G y 25 c.827dupA del gen FAS.

FAS mRNA c.979T>G

Ale lo wild type: [SEO ID NO: 21] 5'AGCCAAAATAGATGAGATCAAGAATGACAAT GTCCAA -3'

Alelo mutado: [SEO ID NO: 22] 5'AGCCAAAATAGATGAGAGCAAGAATGACAAT GTCCAA -3'

Hebra sentido siRNA: [SEO ID NO: 4] 5' -UAGAUGAGAGCAAGAA TGAtt-3 siRNAP1-1

Hebra antisentido siRNA: [SEO ID NO 11] 3'-ttAUCUACUCUCCUUCUUACU -5"

Hebra sentido siRNAcon 2 missmatch: [SEO ID NO: 12] 5'-UAGAUGAGAGAAAGAATGAtt-3' siRNAP1-2

Hebra antisentido siRNA: [SEO ID NO: 13] 3'-ttAUCUACUCUCUUUCUUACU-5'

Hebra sentido siRNA modificada en 3': [SEO ID NO: 14] 5'-UAGAUGAGAGCAAGAATGGtt-3' siRNAP1-3

Hebra antisentido siRNA: [SEO ID NO: 15] 3'-ttAUCUACUCUCCUUCUUACU-5'

FAS mRNA c.827dupA

Alelo wild Iype: [SEO ID NO: 23] 5'GAAAACCAAGGTTCTCATGAATCTCCAACCTA AATCC-3

Alelo mutado: [SEO ID NO: 24] 5'GAAAACCAAGGTTCTCATGAAATCTCCAACCT AAATCC-3

Hebra sentido siRNA: [SEO ID NO: 5] 5'-GGUUCUCAUGAAAU CUCCAtt-3' siR NAP2-1

Hebra antisentido siRNA: [SEO ID NO: 16] 3'-ttCCAAGAGUACUUUAGAGGU-5'

Hebra sentido siRNAcon 2 missmatch: [SEO ID NO: 17] 5'-GGUUCUCAUGACAUCUCCAtt-3' siRNAP2-2

Hebra antisentido siRNA: [SEO ID NO: 18] 3'-ttCCAAGAGUACUGUAGAGGU-5'

Hebra sentido siRNA modificada en 3': [SEO ID NO: 19] 5'-GGUUCUCAUGAAAUCUCCGtt-3' siRNAP2-3

Hebra antisentido siRNA: [SEQ ID NO: 20) 3'-ttCCAAGAGUACUUUAGAGGU-5'

Las letras mayúsculas representan 19 nucleótidos de las secuencias de siRNA de las hebras sentido y antisentido diseñadas para el silenciamiento alelo-específico de cada 5 mutación. Cada siRNA tiene un dinucleótido "colgante" en 3' (letras minúsculas).

Para cada siRNA investigado, el efecto de la apoptosis mediada por FAS se determinó en experimentos duplicados testando distintas concentraciones molares de siRNAs frente a FAS wild type y a los alelos mutados (O, 2,5, 5, 10, 15 Y 20nM) en fibroblastos 10 de control y pacientes respectivamente. En cada caso, la apoptosis se indujo 24,48 Y 72 horas después de la transfección, yel porcentaje de células apoptóticas (Anexina V +), se midió 16 horas después de la estimulación con AcMo anti-FAS. La mayor y más específica recuperación de la apoptosis se obtuvo a concentración de 10 nM de los siRNAs y estimulación de la apoptosis 48 horas post-transfección. Aunque a

15 concentraciones de siRNAs superiores a 10 nM se observó un incremento en el porcentaje de células apoptóticas en los fibroblastos de los pacientes, la apoptosis de las células control se redujo, indicando silenciación del mRNA correspondiente al alelo wild type (efecto ''fuera de diana"). Cuando se indujo la apoptosis a tiempos más cortos (24 horas después de la transfección) se observó que el efecto del

20 silenciamiento era menos intenso, y a tiempos superiores (72 horas) los efectos del silenciamiento fueron similares que a 48 horas pero el porcentaje de células muertas espontáneamente (sin estimulación con AcMo anti-FAS) se incrementó

De los siRNAs específicos de los alelos mutados que se probaron, los siRNAs

25 modificados siRNA-P1-2, siRNA-P2-2 y siRNA-P2-3, mostraron un efecto discreto en la recuperación de la apoptosis en los fibroblastos de los pacientes. El siRNA-P1-3 consiguié una mayor capacidad apoptética en las células de P1 pero mostró más efectos fuera de diana, que se manifestaron como un descenso de la capacidad apoptética en las células control. Los mejores resultados se obtuvieron tras el

30 silenciamiento de los fibroblastos de los pacientes con los siRNAs específicos de secuencia mutada no modificados, siRNA-P1-1 [SEa ID No.4] y siRNA-P2-1 [SEa ID No. 5) (Figura 2A y 2B).

Utilizando los siRNAs P1-1 [SEQ ID NoA] y P2-1 [SEQ ID No. 5], el experimento se realizó repetidas veces para comprobar la reproducibilidad en su resultado (n=8, Figura 2C y 2D): tras la transfección con los siRNAs específicos y estimulación de la vía FAS, los fibroblastos de los pacientes recuperaron en buena medida su capacidad

5 de morir por apoptosis.

En los fibroblastos de P1 tratados con siRNA-C-NEG, la apoptosis específica (considerando todas las células Anexina V positivas y calculada según formula indicada en la sección "Pacientes y Métodos") fue 3,4±4,2 % (media ± SD), similar al 10 de las células no tratadas, mientras que ese porcentaje fue del 21,5±3,7% tras el tratamiento con siRNA-P1-1 (p=0,00004). Con los fibroblastos de P2 se obtuvieron resultados similares (siRNA-C-NEG= -0,7±5%; siRNA-P2-1 = 19,7±6,5%; p=0.00003). El tratamiento de los fibroblastos control con los siRNAs alelo específicos no pareció afectar a su capacidad para la apoptosis [porcentaje de apoptosis específica tras 15 tratamiento con siRNA-C-NEG= 59,5±14,2 %; siRNA-P1-1= 65,7±11,9 %; siRNA-P21= 59,3±13,9 %; p=O,16 (siRNA-C-NEG versus siRNA-P1-1), p=O,96 (siRNA-C-NEG versus siRNA-P2-1)] (Figura 2D). Sin embargo, el tratamiento de los fibroblastos control con siRNA dirigido frente al alelo wild type (siRNA-WT) redujo de forma significativa su capacidad de morir por apoptosis tras estimulación de la vía FAS

20 (apoptosis específica tras el tratamiento con siRNA-WT= 28,2±13,8% versus siRNA CNEG= 59,5±14,2 %, p=O,007)

En las células de P1 tratadas con siRNA-P1-1 [SEO ID No.4] y posteriormente estimuladas con AcMo anti-FAS, el porcentaje de células en apoptosis temprana 25 específica (células anexina V+ IP-, calculada según fórmula indicada en Pacientes y Métodos) fue 10,5±6,5% (media ± SD), similar al de células en apoptosis tardia (anexina V+ IP+) 10,4±7%, con valores p respecto a células tratadas con siRNA-CNEG (apoptosis temprana: 1,7±1,4%; apoptosis tardía: 1,4±2,7%) de 0,009 y 0,005 respectivamente. En células de P2, tratadas con siRNA-P2-1 [SEO ID NO.5l, el

30 porcentaje de células apoptéticas tempranas (11 ,5±4,5%) fue superior al de apoptéticas tardías (5,2±4,3%), pero ambos valores fueron también significativamente diferentes a los de células tratadas con siRNA-C-NEG (anexina V+ IP-: -0,3±3%; anexina V+ IP+: -0,6±1,9%) (p=0,00009 y p=0,023 respectivamente ).

El silenciamiento de los alelos mutados no modifica la expresión de FAS en la

superficie celular.

En trabajos previos se ha demostrado que la alteración de la apoptosis producida por

la mayor parte de las mutaciones en los dominios extracelulares de FAS se debe a un

5 mecanismo de haploinsuficiencia (baja expresión de FAS en la superficie celular), mientras que en los pacientes con SLPA tipo la con mutaciones intracelulares con interferencia dominante, la cantidad de FAS en la membrana celular suele ser normal. Para comprobar si el silenciamiento de las formas aberrantes de FAS en fibroblastos de P1 y P2 altera la expresión superficial de la proteína, se cuantificaron las moléculas

10 de FAS en la membrana celular por citometría de flujo, antes y después de la interferencia del RNA. Antes de la transfección con siRNAs, el 100% de los fibroblastos de pacientes y controles fue positivo para el marcaje de superficie de FAS, y la densidad de FAS, evaluada por intensidad media de fluorescencia (MFI) fue similar en pacientes y controles (Tabla 2). Transcurridas 48 y 72 horas después de la

15 transfección de fibroblastos de P1 y P2 con siRNA-P1-1 [SEO ID NoA] y siRNA-P2-1 [SEO ID No. 5] respectivamente, el 100% de los fibroblastos permaneció positivo para FAS. Tras el silenciamiento alelo específico se observó un leve descenso (no significativo) en la MFI de expresión de FAS (Tabla 3, Figura 2E). Estos resultados sugieren que tras la inteñerencia de las formas mutadas de FAS no se altera

20 significativamente la expresión de receptores FAS y la recuperación de la apoptosis en los pacientes depende del "rescate" de un número mayor de homotrímeros funcionales de receptores FAS en superficie.

Tabla 3. Expresión de FAS en superficie de fibroblastos.

Sin: siRNA siRNA siRNA p

Hiperfect

transfectar: C-NEG Pl-l P2-1 " (al vs (dl

(bl

(al: (el (dl (e l " (al vs (el

CONTROL: 495±28 470±15 490±6 470±15 491±2 0,2 ; 0,9

Pl: 495±13 488±21 502±8 474±22 0,2

P2: 508±14 518±6 523±20 482±8 0,1 ~ <

25: Se muestra la media de MFI de dos experimentos ± SD "1 , '2 valores de p establecidos comparando la MFI de células células transfectadas con siRNAs alelo específicos. sin transfectar versus

30

Aumento del procesamiento catalítico de caspasa-8 Los primeros eventos tras el desencadenamiento de la apoptosis por estimulación de FAS por AcMo anti-FAS (clan Apo-1-3) incluyen la formación del complejo de señalización inductor de muerte (DISC). Entre los componentes del multímero DISC

5 se encuentra la procaspasa-8, que tras la activación de la apoptosis se procesa generando varios productos de excisión. Los datos del western blof confirmaron que la estimulación de los fibroblastos de pacientes con AcMo anti-FAS tras el tratamiento con los siR NAs alelo-específicos (siRNA-P1-1 , siRNA-P2-1) era capaz de desencadenar la señal apoptótica mediada por la activación catalítica de la caspasa 8

10 (Figura 3).

La inducción de la apoptosis tras el silenciamiento específico incluye la

permeabilización de la membrana mitocondrial

Tras la estimulación de FAS, la apoptosis puede proceder por dos vías. En las células

15 denominadas "tipo r se forman muchos complejos CD95-DISC y gran cantidad de caspasa-8 activa, lo que conduce a una rápida activación de las caspasas terminales 3, 6 Y 7. En las células "tipo 11", los niveles de CD95-DISC y caspasa 8 activa son menores y la señal de apoptosis se amplifica mediante la brusca disminución del potencial de membrana mitocondrial, liberación de citocromo c y formación del

20 apoptosoma antes de la activación de las caspasas efectoras. No obstante, tras la estimulación de FAS, la activación y participación de las mitocondrias en la apoptosis ocurre tanto en las células tipo I como en las tipo 11 , y esto se ha demostrado en células murinas y en un importante número de líneas celulares humanas de diferentes tejidos, incluidos fibroblastos. En los experimentos llevados a cabo, 48 horas después

25 de la transfección con los siRNAs se estimuló la vía FAS y se midió el potencial de membrana mitocondrial. Tras inducir apoptosis, las células de los pacientes tratadas con los siRNAs específicos de los alelas mutados presentaron una pérdida significativa de potencial de membrana mitocondrial en comparación con las células de los pacientes tratadas con siRNA-CNEG, mientras que el potencial de membrana

30 mitocondrial permaneció elevado y fue similar en fibroblastos control transfectados con siRNA-C-NEG-, siRNA-P1-1 o siRNA-P2-1 , (Figuras 4A y 48), lo que sugiere que la apoptosis en fibroblastos de pacientes tras la interferencia de los alelas FAS mutados incluye la activación de las mitocondrias.

La abolición especifica de RNA FAS mutados permite la activación de las

caspasas efectoras 3 y 7 tras la estimulación de la vía FAS en fibroblastos de

pacientes con SLPA tipo la.

Los pasos finales en la cascada de apoptosis incluyen la activación de las caspasas

5 efectoras 3 y 7 previa a la fragmentación del ADN . Entre los sustratos de estas caspasas se encuentra PARP (del inglés poly-ADP-ribose-polymerase), una enzima nuclear que facilita la reparación del DNA. Cuarenta y ocho horas después de la transfección de fibroblastos de pacientes y controles con siRNAs, la vía FAS se estimuló con el AcM o anti-FAS. Midiendo la luminiscencia derivada del procesamiento

10 del sustrato que contiene la secuencia DEVD, se pudo observar un incremento de actividad de las caspasas 3 y 7 casi tres veces superior en los fibroblastos de P1 y P2 transfectados con sus siRNAs específicos respecto a células de pacientes no transfectadas o transfectadas con siRNAC-NEG (Figura 5A).

15 En fibroblastos de pacientes sin transfectar o transfectados con siRNA-C-NEG, la actividad de caspasa 3[7 fue prácticamente nula, similar a la que se detecta en controles normales cuando no se activa la vía FAS. En consonancia con estos resultados sobre la activación de las caspasas 3 y 7, los western blots mostraron las bandas correspondientes al procesamiento del sustrato de la Caspasa-3, PARP

20 (Figura 58).

111. Conclusiones y discusión La presente invención explora la posibilidad de incrementar la apoptosis en pacientes con SLPA la, heterocigotos para las mutaciones dominantes negativas c.979T>G y

25 c.827dupA, mediante un método que interfiriera específicamente la expresión del alelo mutado de FAS y preservara la expresión del alelo wild type. Se diseñaron tres siR NAs estructuralmente diferentes frente a cada mutación, y se comprobó si, después de tratar los fibroblastos de los pacientes con los siRNAs y estimular la vía FAS en ellos, se mejoraba la apoptosis. Los siRNAs específiCOS para cada mutación

30 que mostraron una recuperación más robusta de la apoptosis (siRNA-P1-1 y siRNAP2-1) se eligieron para comprobar, en los ejemplos mostrados en la presente invención, que el aumento de la muerte celular en los fibroblastos tratados con siRNAs efectivamente dependía de la activación de los eventos clásicos de la cascada de la apoptosis, que incluyen el procesamiento de las caspasas 8, 3 Y 7, la digestión de

35 PARP Y la pérdida del potencial de membrana mitocondrial. La ausencia de variación en la expresión de FAS en la superficie celular tras el silenciamiento específico (Figura 2E), apoya el concepto de que la recuperación de la apoptosis post-tratamiento se debe a la superación del efecto dominante negativo de las formas mutadas de FAS. En base a estas observaciones, se puede concluir que por interferencia de la expresión de las moléculas FAS aberrantes, éstas se incorporan en menor grado en

5 los homotrímeros FAS, lo que permite una mayor disponibilidad de receptores FAS completamente funcionales en la superficie celular.

En los experimentos llevados a cabo, se observó similar capacidad apoptótica en los fibroblastos de control tratados con siRNA-P1-1 y siRNA-P2-1 frente a los tratados con 10 siRNA-C-NEG, lo cual indica ausencia de efectos "fuera de diana" de los siRNAs alelo específicos en relación a la expresión del alelo wild type.

Aunque SLPA la es una enfermedad genéticamente heterogénea, el análisis de las mutaciones descritas en la literatura señala la existencia de "puntos calientes" en el 15 gen CD95. De hecho, cambios en arginina-234, ácido aspártico-244 y valina-251 suponen en conjunto el 16% de las mutaciones documentadas en FAS (Tauzin S Tauzin S, et al. Cell Mol Life Sci. 2012, 69(8):1261-77). Esto sugiere, de acuerdo a los datos que se presentan en la presente invención, que tres siR NAs diferentes podrían ser suficientes para tratar el 16% de los casos de SLPA la. Es bien conocido que

20 linfomas y tumores de distinto origen histológico presentan una frecuencia considerable de mutaciones en el gen FAS que se agrupan sobre todo en los exones 8 y 9 codificantes del dominio intracelular. Tanto en las células malignas como en los linfocitos T doble-negativos de SLPA-Ia, se ha observado que a la vez que las mutaciones en heterocigosis en el dominio de muerte de FAS median resistencia a la

25 apoptosis, la conservación de una copia del alelo wild type es suficiente para generar señales no apoptóticas por activación de las vías NF-KB/MAPK que se traducen en inflamación, carcinogenesis e invasividad (Tauzin S Tauzin S, et aL. Cell Mol Life Sci. 2012, 69(8):1261-77). Estas observaciones sugieren otra potencial aplicación de la silenciación específica de alelas mutados de FAS en la personalización de terapia

30 contra el cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Usode -un ARNi específico de un alelo mutado del gen FAS asociado al síndrome 5 Linfoproliferativo Autoinmune (SLPA) de tipo la, en el que dicho ARNi inhibe la

expresión de dicho alelo mutado, -una secuencia de nucleótidos que codifica para dicho ARNi

-un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos, -una célula que comprende dicha secuencia de nucleótidos o dicho vector,

10 en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (SLPA) de tipo la.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho alelo mutado del gen FAS asociado al SLPA de tipo la es:

15 -la mutación c.979>G de la secuencia de nucleótidos con número de acceso a GeneBank AY495076 (SEO ID NO: 2), o

-

la mutación c.827dupA de la secuencia de nucleótidos con número de acceso a GeneBank EU481974.2 (SEO ID NO: 3).

20 3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el ARNi es un siARN o un shARN.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ARNi comprende: -una primera cadena sentido que comprende una longitud de entre 16 y 30 nucleótidos homólogos a la región del gen FAS que comprende el alelo mutado y la

25 posición nucleotídica mutada de dicho alelo, y -una segunda cadena antisentido que comprende de entre 16 y 30 nucleótidos complementarios a la primera cadena.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que la primera cadena sentido comprende la

30 secuencia SEO ID NO: 4 dirigida al alelo mutado del gen FAS portador de la mutación c.979T>G, o la secuencia SEO ID NO: 5 dirigida al alelo mutado del gen FAS portador de la mutación c.827dupA.
6. Método in vitro para determinar si un ARNi es útil en el tratamiento de un sujeto que 35 padece SLPA de tipo la, que comprende: a) poner en contacto un ARNi específico de una mutación en un alelo del gen FAS con un cultivo celular procedente de dicho sujeto, y b) evaluar la apoptosis celular en el cultivo celular procedente del sujeto, en donde un incremento de la apoptosis estadísticamente significativo en el cultivo

5 celular procedente del sujeto con respecto a la apoptosis de un cultivo celular procedente del mismo sujeto tratado con un ARNi control negativo, es indicativo de que el ARNi es útil en el tratamiento del sujeto que padece SLPA de tipo la.
7. Método según la reivindicación 6, en el que previamente a la etapa a), se determina

10 en una muestra biológica del sujeto la mutación en el alelo del gen FAS y se diseña un ARNi especifico dicha mutación.
8. Método la reivindicación 6 ó 7, en el que la mutación en el alelo del gen FAS se selecciona del grupo que consiste en:

15 -mutación c.979>G de la secuencia de nucleótidos con número de acceso a GeneBank AY495076 (SEO ID NO: 2), y -la mutación c.827dupA de la secuencia de nucleótidos con número de acceso a GeneBank EU4819742 (SEO ID NO: 3)

20 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el ARNi es un siARN o un shARN.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el ARNi comprende:

25 -una primera cadena sentido que comprende una longitud de entre 16 y 30 nucleótidos homólogos a la región del gen FAS que comprende el alelo mutado y la posición nucleotídica mutada de dicho alelo, y -una segunda cadena antisentido que comprende de entre 16 y 30 nucleótidos complementarios a la primera cadena.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la cadena sentido del ARNi comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 específica del alelo mutado del gen FAS portador de la mutación c.979T>G, o la secuencia SEQ ID NO: 5 específica del alelo mutado del gen FAS portador de la mutación c.827dupA.