ES2708932T3

ES2708932T3 - Agente inductor de apoptosis

Info

Publication number: ES2708932T3
Application number: ES11868386T
Authority: ES
Inventors: Yoshiro Niitsu; Hiroki Nishita
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2031-06-21
Also published as: BR112013033072A2; RU2639459C2; CA2841203C; EP2724729B1; AU2011371755B2; JPWO2012176282A1; AU2011371755A1; WO2012176282A1; KR20140041770A; EP2724729A4; KR101786905B1; RU2014101547A; JP6023709B2; BR112013033072B1; CN103619355A; US20140315975A1; EP2724729A1; CA2841203A1

Abstract

Una composición para el uso en el tratamiento de cáncer debido a sobreexpresión de GST-π y mutación de KRAS, en la que la composición comprende como principios activos un fármaco que suprime GST-π y un fármaco que suprime la autofagia, en la que el fármaco que suprime la autofagia es un inhibidor de PI3K, y en la que el inhibidor de PI3K es un inhibidor de PI3K de clase III.

Description

DESCRIPCION

Agente inductor de apoptosis

Campo tecnico

La presente descripcion se refiere al uso novedoso de GST-n y a un agente supresor de la misma, a un agente inductor de apoptosis novedoso, a una composicion farmaceutica que contiene el agente inductor de apoptosis y a un metodo terapeutico novedoso para una enfermedad asociada con apoptosis anomala.

Tecnica anterior

El cancer es una de las enfermedades mas importantes y problematicas a las que se enfrenta la humanidad, y esta llevandose a cabo una enorme cantidad de esfuerzo de investigacion en el tratamiento del mismo. El cancer es una enfermedad en la que las celulas crecen de manera incontrolable debido a mutacion genica, anomalfa epigenetica, etc. Con respecto a las anomalfas geneticas en cancer, se han notificado ya un gran numero (por ejemplo, Futreal et al., Nat Rev Cancer. 2004; 4 (3):177-83, etc.), y se cree que muchas de las mismas estan asociadas en parte con la transduccion de senales relacionada con proliferacion, diferenciacion y supervivencia celulares. Ademas, debido a tales anomalfas geneticas, se producen anomalfas en la transduccion de senales en celulas que consiste en moleculas normales, y esto provoca activacion o inactivacion de una cascada de senales espedfica y puede convertirse finalmente en un factor que desencadena la proliferacion celular anomala. El tratamiento temprano del cancer se ha centrado en la supresion de la propia proliferacion celular, pero puesto que un tratamiento de este tipo tambien suprime la proliferacion de celulas con proliferacion fisiologicamente normal, iba acompanado por efectos secundarios tales como perdida de cabello, disfuncion gastrointestinal o supresion de la medula osea. Con el fin de reducir tales efectos secundarios, esta emprendiendose el desarrollo de farmacos para el tratamiento de cancer basandose en un nuevo concepto tal como farmacos dirigidos molecularmente que seleccionan como diana anomalfas geneticas espedficas de cancer o anomalfas en la transduccion de senales.

Como anomalfa genetica espedfica de cancer, se conoce bien la anomalfa de KRAS (homologo de oncogen viral de sarcoma de rata de Kirsten V-Ki-ras2). KRAS es una protema de union a GTP de bajo peso molecular (tambien denominada protema G de bajo peso molecular) situada posteriormente a un receptor tirosina cinasa tal como EGFR o PDGFR, y se encarga de transferir una senal relacionada con proliferacion o diferenciacion desde estos receptores hasta una cascada de MAPK posterior. KRAS normal se activa por medio de Grb2 y SOS por medio de activacion por tirosina cinasa de un receptor activado por union de ligando, y fosforila una MAPK tal como Raf para que dirija la cascada de MAPK, pero KRAS mutado se activa de manera constante sin estimulacion a partir del receptor y sigue transmitiendo una senal de proliferacion. Se cree que, debido a esto, se produce proliferacion celular anomala. Por otro lado, la expresion de glutation-S-transferasa (GST), que es una de las enzimas que catalizan la conjugacion de glutation, en particular GST-n (glutation-S-transferasa pi, tambien denominada GSTP1), aumenta en diversas celulas cancerosas, y se ha senalado que existe la posibilidad de que este sea un factor para la resistencia a algunos antineoplasicos. De hecho, se sabe que cuando se prepara ADN antisentido de GST-n o un inhibidor de GST-n para actuar sobre una lmea celular cancerosa que esta sobreexpresando GST-n y que presenta resistencia farmacologica, se suprime la resistencia farmacologica (Takahashi y Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994; 21 (7): 945-51, Ban et al., Cancer Res. 1996; 56 (15): 3577-82, Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 306 (3): 861 9). Ademas, en un informe reciente, cuando se prepara ARNip de GST-n para actuar sobre una lmea celular de cancer de prostata androgeno-independiente que esta sobreexpresando GST-n, la proliferacion de la misma se suprime y aumenta la apoptosis (Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008; 29 (6): 1134-8). Ademas, se ha sugerido que en cancer colorrectal humano, la mutacion de KRAS parece inducir sobreexpresion de GST-n por medio de activacion de AP-1 (Miyanishi et al., Gastroenterology. 2001; 121 (4): 865-74).

Sin embargo, hasta la fecha apenas ha habido alguna aclaracion de la relacion entre GST-n y la proliferacion o apoptosis celular, el mecanismo molecular de GST-n, y el papel, etc., de GST-n en diversos tipos de transduccion de senales intracelulares. La transduccion de senales intracelulares es muy complicada; una molecula puede influir en el efecto de una pluralidad de moleculas, o a la inversa una molecula puede verse influida por una pluralidad de moleculas, cuando se inhibe el efecto de una determinada molecula, puede activarse otra cascada de senales, y no puede obtenerse a menudo un efecto esperado. Por tanto, es necesario dilucidar el complicado mecanismo de transduccion de senales celulares con el fin de desarrollar mejores farmacos dirigidos molecularmente, pero se ha dilucidado solamente una parte muy pequena del mecanismo en muchos anos de investigacion, y se necesita un esfuerzo de investigacion adicional.

Sumario

[Problemas que van a solucionarse]

La invencion actual se define, entre otros, mediante los siguientes puntos:

1. Una composicion para el uso en el tratamiento de cancer debido a sobreexpresion de GST-n y mutacion de KRAS, en la que la composicion comprende como principios activos un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia, en la que el farmaco que suprime la autofagia es un inhibidor de PI3K, y en la que el inhibidor de PI3K es un inhibidor de PI3K de clase III.

2. La composicion segun la reivindicacion 1 para su uso segun la reivindicacion 1, en la que el inhibidor de PI3K es 3-metiladenina.

3. La composicion segun la reivindicacion 1 para el uso segun la reivindicacion 1, en la que el inhibidor de PI3K se selecciona del grupo que consiste en una molecula de iARN, una ribozima, un acido nucleico antisentido, un polinucleotido de quimera de ADN/ARN y un vector que expresa el mismo.

4. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el farmaco que suprime GST-n se selecciona del grupo que consiste en una molecula de iARN, una ribozima, un acido nucleico antisentido, un polinucleotido de quimera de ADN/ARN y un vector que expresa el mismo.

Un objeto de la presente descripcion es proporcionar usos novedosos de GST-n y un agente supresor de la misma, una composicion para inducir apoptosis eficazmente en celulas y un metodo que usa la misma.

[Medios para solucionar los problemas]

Mientras llevaban a cabo una investigacion intensiva con el fin de dilucidar el mecanismo molecular de GST-n, los presentes inventores han encontrado que, cuando se inhibe la expresion de GST-n, la activacion de Raf-1, MEK y ERK se inhibe en gran medida, y de manera similar en la cascada de senales de PI3K (fosfoinosttido 3-cinasa), que se activa mediante activacion de un receptor acoplado a protema G o un receptor tirosina cinasa, se produce la supresion de la transduccion de senales, y han aclarado que, aunque la apoptosis esta provocada por la inhibicion de la expresion de GST-n, la autofagia se induce mas rapidamente que la apoptosis. Como resultado de una investigacion adicional, se ha encontrado adicionalmente que suprimiendo la autofagia al mismo tiempo que se inhibe GST-n, puede inducirse a las celulas a que experimenten apoptosis con alta eficacia, y por tanto se ha logrado la presente descripcion.

Es decir, la presente descripcion se refiere a lo siguiente.

(1) Un agente para inducir apoptosis, conteniendo el agente como principios activos un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia.

(2) Un agente para inducir apoptosis en una celula en la que se suprime GST-n, conteniendo el agente como principio activo un farmaco que suprime la autofagia.

(3) El agente segun (1) o (2) anterior, siendo el agente para inducir apoptosis en una celula que tiene KRAS mutado. (4) El agente segun uno cualquiera de (1) a (3) anteriores, en el que el principio activo se selecciona del grupo que consiste en una molecula de iARN, una ribozima, un acido nucleico antisentido, un polinucleotido de quimera de ADN/ARN y un vector que expresa el mismo.

(5) Una composicion farmaceutica que contiene el agente segun uno cualquiera de (1) a (4) anteriores.

(6) La composicion farmaceutica segun (5) anterior, siendo la composicion para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por proliferacion celular anomala.

(7) La composicion farmaceutica segun (5) anterior, siendo la composicion para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por mutacion de KRAS.

(8) La composicion farmaceutica segun (5) anterior, siendo la composicion para su uso en el tratamiento de un cancer.

(9) Un agente para promover la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, conteniendo el agente como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma.

(10) Un agente para suprimir la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, conteniendo el agente como principio activo un farmaco que suprime GST-n.

(11) Un agente para suprimir la ubiquitinacion, conteniendo el agente como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma.

(12) Un agente para promover la ubiquitinacion, conteniendo el agente como principio activo un farmaco que suprime GST-n.

(13) Un agente para suprimir la autofagia, conteniendo el agente como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma.

(14) Un agente para promover la autofagia, conteniendo el agente como principio activo un farmaco que suprime GST-n.

[Efectos]

Puesto que el agente inductor de apoptosis de la presente descripcion puede inducir apoptosis eficazmente en comparacion con uno convencional, su eficacia como composicion farmaceutica es tambien alta. En el tratamiento de cancer en particular, puesto que las celulas cancerosas pueden destruirse mediante apoptosis, no solamente es posible inhibir el progreso del cancer, sino que tambien puede expresarse un efecto de regresion del cancer. Ademas, puesto que puede presentarse el mismo nivel de efecto que el de una formulacion convencional con una dosis inferior a la de una convencional, es posible reducir los efectos secundarios.

Ademas, segun la presente descripcion, el mecanismo molecular de GST-n ha quedado claro y se ha descubierto un uso novedoso de GST-n o un agente supresor de la misma. Esto proporciona nuevas opciones para el tratamiento de enfermedades, tecnicas experimentales, etc., y puede esperarse una enorme contribucion no solamente a la medicina y medicina veterinaria sino tambien a los campos de la biologfa, bioqmmica, biologfa molecular, etc.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 a) es el resultado de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra un estado en el que la expresion de GST-n esta espedficamente suprimida por ARNip de GST-n. La figura 1 b) es un diagrama que muestra el cambio en el numero de celulas y el nivel de expresion de GST-n el dfa 1.° a 4.° tras la transfeccion de ARNip de GST-n.

La figura 2 es el resultado de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra el estado de expresion de protemas implicadas en la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK el 2.° dfa tras la transfeccion de ARNip de GST-n. Puede observarse que, acompanando a la supresion de la expresion de GST-n, el nivel de expresion de protema Raf disminuye y, ademas, se suprime la fosforilacion de una MAPK tal como MEK o ERK.

La figura 3 muestra el resultado de un experimento sobre la inmunoprecipitacion de la protema Raf. Puede observarse que en un grupo tratado con ARNip de GST-n la expresion de protema Raf y protema Raf fosforilada en Ser621 (p-Raf-1 (S621)) disminma ligeramente, mientras que en cambio la protema Raf ubiquitinada aumentaba. La figura 4 es un diagrama que compara la abundancia de la protema Raf cuando se trataron transfectante de ARNip de GST-n y transfectante de ARNip revuelto con el inhibidor del proteosoma MG132 y DMSO, que era un control negativo. Se observo que para el transfectante de ARNip de GST-n, el tratamiento con inhibidor del proteosoma aumentaba la abundancia de protema Raf fosforilada (p-Raf-1 (S338)), pero no se observo ningun cambio para ARNip revuelto. Es decir, esto sugiere que debido a la supresion de la expresion de GST-n, la protema Raf fosforilada experimenta degradacion por el proteasoma, y esto concuerda con el aumento en protema Raf ubiquitinada en la figura 3.

La figura 5 muestra los resultados de un experimento sobre la coinmunoprecipitacion de protema Raf y GST-n. Debido a que se muestra una reaccion hacia anticuerpo anti-GST-n para protema precipitada por anticuerpo anti-p-Raf-1, se sugiere que p-Raf-1 y GST-n forman un complejo.

La figura 6 muestra imagenes de tincion por inmunofluorescencia de celulas con GST-n desactivada. Las filas superiores son imagenes tenidas con anticuerpo anti-LC3, y las filas inferiores son imagenes tenidas con DAPI. Desde la parte superior izquierda hay imagenes tenidas de los dfas 1.°, 2.° y 3.° tras la transfeccion, y desde la parte inferior izquierda de los dfas 4.° y 5.° dfa tras transfeccion, respectivamente. En celulas marcadas mediante flechas en la figura, se observo una senal de punto que puede considerarse que es un autofagosoma, deduciendo que se induce autofagia.

La figura 7 muestra imagenes de microscopio electronico de celulas con GST-n desactivada en el punto de tiempo cuando habfan transcurrido 2 dfas tras la transfeccion de ARNip de GST-n. En la figura a mano izquierda, N indica el nucleo, y la figura a mano derecha es una imagen alargada de la parte A rodeada por el recuadro. En la figura a mano derecha, M indica mitocondria y L indica lisosoma. Se observo que se formaron autofagosomas de modo que rodeaban la mitocondria en las zonas mostradas por las flechas.

La figura 8 muestra los resultados de una inmunotransferencia de tipo Western de un extracto celular con GST-n desactivada (KD) usando anticuerpo anti-LC3. Se observo que en celulas con GST-n KD (ARNip de GST-n), la expresion de LC3 aumentada notablemente en comparacion con el control (ARNip revuelto). Puesto que LC3 de tipo II (LC3-II) en particular aumentaba enormemente, esto implica la induccion de autofagosoma.

La figura 9 muestra los resultados de la tincion TUNEL. La fila superior muestra imagenes de un grupo de control y la fila inferior muestra imagenes de un grupo de celulas con GST-n KD. Muestra desde la izquierda imagenes tenidas de los dfas 3.°, 4.° y 5.° tras la transfeccion. En el grupo de celulas con GST-n KD, se observaron celulas positivas para TUNEL.

La figura 10 es un grafico (parte superior) que muestra el cambio a lo largo del tiempo de las proporciones de celulas positivas para autofagia y celulas positivas para apoptosis en un grupo de celulas con GST-n KD y un grupo de celulas de control en el punto de tiempo cuando habfan transcurrido de 1 a 4 dfas tras la transfeccion de ARNip, y un diagrama (parte inferior) que muestra el nivel de expresion de GST-n en celulas con GST-n KD. Muestra que en el grupo de control apenas se observo autofagia o apoptosis, mientras que en el grupo de GST-n KD las celulas positivas para autofagia aumentaron rapidamente en primer lugar con un pico el 2.° dfa, y luego se indujo apoptosis. La figura 11 muestra los resultados de una inmunotransferencia de tipo Western de protema implicada en la senalizacion de EGFR/PI3K/Akt/mTOR en celulas con GST-n KD. Puede observarse que en un grupo de celulas con GST-n KD, la fosforilacion de EGFR, PI3K y Akt se suprimio notablemente.

La figura 12 muestra los resultados de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra el cambio en la expresion de EGFR fosforilado (p-EGFR) cuando se trataron celulas con GST-n KD con inhibidor del proteosoma MG132. Puesto que una disminucion en el nivel de expresion de p-EGFR en celulas con GST-n KD se recupero mediante tratamiento con inhibidor del proteosoma, se dedujo que la disminucion en la expresion de p-EGFR se debfa a la degradacion por el proteasoma.

La figura 13 muestra el resultado de una inmunotransferencia de tipo Western de protema coinmunoprecipitada usando anti-p-EGFR. Puesto que se observo una senal para anticuerpo anti-GST-n, se dedujo que p-EGFR y GST-n interaccionaban entre sf.

La figura 14 muestra los resultados cuando se examina el cambio del nivel de expresion de protema Raf y EGFR dependiendo de la concentracion de inhibidor cuando se uso el inhibidor de GST-n C16C2. Se observo que, como en el caso con la desactivacion de GST-n, la fosforilacion de EGFR o protema Raf tambien se suprimio cuando se uso el inhibidor de GST-n.

La figura 15 es un grafico que muestra el cambio en el numero de celulas cuando se anadio el inhibidor de GST-n C16C2. Puede observarse que cuando se anadio el inhibidor de GST-n, apenas hubo un aumento en el numero de celulas.

La figura 16 es un grafico que muestra la proporcion de celulas positivas para autofagia en un grupo tratado con ARNip revuelto, un grupo con GST-n KD y un grupo con GST-n KD 3MA. Puede observarse que la autofagia que habfa aumentado mediante la desactivacion de GST-n se suprimio mediante 3-MA.

La figura 17 muestra imagenes tenidas con TUNEL cuando se anadio 3-MA a celulas con GST-n KD. La fila superior es un caso en el que se anadio 3-MA a 1 mM, y la fila inferior es un caso en el que se anadio 3-MA a 5 mM. Se muestra desde la izquierda imagenes tenidas los dfas 2.°, 3.° y 4.° tras la transfeccion. Cuanto mayor era la cantidad de 3-MA anadida, mas celulas apoptoticas se observaban.

La figura 18 es un grafico que muestra los resultados cuando se examino el porcentaje de apoptosis a lo largo del tiempo en un grupo de celulas de control (ARNip revuelto), un grupo de celulas con GST-n Kd (ARNip de GST-n), un grupo de celulas con GST-n KD 3-mA 1 mM (ARNip de GST-n 3-MA 1 mM) y un grupo de celulas con GST-n KD 3-MA 5 mM (ARNip de GST-n 3-MA 5 mM). Se encontro que habfa una induccion de apoptosis dependiente de la dosis de 3-MA adicional.

[Modos para llevar a cabo la invencion]

La presente descripcion se refiere a un agente o una composicion para inducir apoptosis (a continuacion en el presente documento, tambien denominado "agente inductor de apoptosis" o "composicion inductora de apoptosis") que contiene como principios activos un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia.

Cuando se usa en el presente documento, GST-n indica una enzima, codificada por el gen de GSTP1, que cataliza la conjugacion de glutation. GST-n esta presente en diversos animales, incluyendo seres humanos, y su informacion de secuencia se conoce (por ejemplo, ser humano: NP_000843 (NM_0o0852), rata: NP_036709 (NM_012577), raton: NP_038569 (NM_013541), etc. Los numeros indican numeros de registro de la base de datos del NCBI; los que estan fuera de los parentesis son numeros de secuencias de aminoacidos y los que estan dentro de los parentesis son numeros de secuencias de bases).

Puesto que existe una posibilidad de la aparicion de una mutacion de una secuencia genica o una secuencia de aminoacidos entre individuos biologicos que no altera la funcion fisiologica de una protema, el gen de GST-n y GSTP1 en la presente invencion no esta limitado a una protema o acido nucleico que tenga la misma secuencia que las secuencias conocidas anteriores, y puede incluir los que tienen una secuencia que es diferente de la secuencia anterior en uno o mas aminoacidos o bases, normalmente uno o unos pocos, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoacidos o bases, pero tienen una funcion equivalente a la de GST-n conocida. La funcion espedfica de GST-n es tal como se describe mas adelante.

En la presente memoria descriptiva, frases tales como "cuando se usa en el presente documento", "usado en el presente documento", "en la presente memoria descriptiva" y "descrito en el presente documento" significan, a menos que se especifique otra cosa, que la descripcion tras ellas se aplica a toda la descripcion descrita en la presente memoria descriptiva. Ademas, a menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y terminos cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la tecnica.

Los ejemplos del "farmaco que suprime GST-n" usado en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, un farmaco que suprime la produccion y/o actividad de GST-n y un farmaco que promueve la degradacion y/o inactivacion de GST-n. Los ejemplos del farmaco que suprime la produccion de GST-n incluyen, pero no se limitan a, una molecula de iARN, ribozima, acido nucleico antisentido o polinucleotido de quimera de ADN/ARN para ADN que codifica GST-n, o un vector que expresa el mismo.

Los ejemplos del farmaco que suprime la actividad de GST-n incluyen, pero no se limitan a, una sustancia que se une a GST-n tal como, por ejemplo, glutation, un analogo de glutation (por ejemplo, los descritos en los documentos WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346, Nakajima et al., 20O3 , citado anteriormente, etc.), ketoprofeno (Takahashi y Niitsu, 1994 citados anteriormente), indometacina (Hall et al., Cancer Res. 1989; 49 (22): 6265-8), acido etacrmico, Piloprost (Tew et al., Cancer Res. 1988; 48 (13): 3622-5), un anticuerpo anti-GST-n y un mutante dominante negativo de GST-n. Estos farmacos o bien estan disponibles comercialmente o bien pueden producirse apropiadamente basandose en tecnicas conocidas.

El farmaco que suprime la produccion o actividad de GST-n es preferiblemente una molecula de iARN, ribozima, acido nucleico antisentido o polinucleotido de quimera de ADN/ARN para ADN que codifica GST-n, o un vector que expresa el mismo, en cuanto a alta especificidad y una baja posibilidad de efectos secundarios.

La supresion de GST-n puede determinarse mediante la expresion o actividad de GST-n en celulas que se suprimen en comparacion con un caso en el que no se utiliza un agente supresor de GST-n. La expresion de GST-n puede evaluarse mediante cualquier tecnica conocida; los ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a, un metodo de inmunoprecipitacion utilizando un anticuerpo anti-GST-n, EIA, ELISA, IRA, IRMA, un metodo de inmunotransferencia de tipo Western, un metodo inmunohistoqmmico, un metodo inmunocitoqmmico, un metodo de citometna de flujo, diversos metodos de hibridacion utilizando un acido nucleico que se hibrida espedficamente con un acido nucleico que codifica GST-n o un fragmento unico de la misma, o un producto de transcripcion (por ejemplo, ARNm) o producto de corte y empalme de dicho acido nucleico, un metodo de transferencia de tipo Northern, un metodo de transferencia de tipo Southern y diversos metodos de PCR.

Ademas, la actividad de GST-n puede evaluarse analizando una actividad conocida de GST-n incluyendo, pero sin limitarse a, union a una protema tal como, por ejemplo, Raf-1 (en particular Raf-1 fosforilada) o EGFR (en particular EGFR fosforilado) por medio de cualquier metodo conocido tal como, por ejemplo, un metodo de inmunoprecipitacion, un metodo de inmunotransferencia de tipo Western, un metodo de analisis de masas, un metodo de precipitacion o un metodo de resonancia de plasmon superficial (SPR).

Cuando se usa en el presente documento, la molecula de iARN indica cualquier molecula que provoque la interferencia de ARN, incluyendo, pero sin limitarse a, un ARN de duplex tal como ARNip (ARN de interferencia pequeno), miARN (micro a Rn), ARNhp (ARN en horquilla pequeno), ARNdd (ARN dirigido por ADN), ARNpi (ARN de interaccion con Piwi) o ARNipar (ARNip asociado a repeticion) y formas modificadas de los mismos. Estas moleculas de iARN pueden estar comercialmente disponibles o pueden disenarse y prepararse basandose en informacion de secuencia conocida, etc.

Ademas, cuando se usa en el presente documento, el acido nucleico antisentido incluye ARN, ADN, PNA o un complejo de los mismos.

Cuando se usa en el presente documento, el polinucleotido de quimera de ADN/ARN incluye, pero no se limita a, un polinucleotido bicatenario compuesto por ADN y ARN que inhibe la expresion de un gen diana descrito en, por ejemplo, el documento JP, A, 2003-219893.

Cuando se usa en el presente documento, la autofagia puede incluir macroautofagia, microautofagia, autofagia mediada por chaperonas, etc., pero normalmente significa macroautofagia. Por tanto, el termino "autofagia" en la presente invencion se refiere a "macroautofagia" a menos que se especifique otra cosa.

Autofagia, que significa "devorarse a uno mismo", es uno de los mecanismos de degradacion de protemas intracelulares, y se encarga de la degradacion y el reciclaje de protemas dentro de una celula. Se observa autofagia en una amplia variedad de especies biologicas incluyendo levaduras y mairnferos y va acompanada generalmente por una serie de procesos que incluyen (a) formacion de un PAS (sitio de ensamblaje de fagoforo), (b) elongacion y extension del fagoforo que rodea a una protema que va a degradarse (membrana de aislamiento) y formacion de un autofagosoma que encapsula la protema que va a degradarse, (c) formacion de un autolisosoma mediante fusion de un autofagosoma y un lisosoma, y (d) degradacion de la protema dentro del autolisosoma.

Los procesos anteriores (a) a (c) implican factores relacionados con autofagia espedficos. Con respecto a los factores relacionados con autofagia, la primera investigacion se llevo a cabo con levaduras, y se han identificado un gran numero, incluyendo ATG1 a ATG27, hasta la fecha (Klionsky et al., Dev Cell. 2003; 5 (4): 539-45); la investigacion con marnffero tambien ha avanzado, se han identificado una pluralidad de homologos, y el mecanismo molecular central de la autofagia esta quedando claro (Yang y Klionsky, Curr Opin Cell Biol. 2010; 22 (2): 124-31).

Los ejemplos de factores relacionados con autofagia implicados en el mecanismo molecular central de la autofagia en mamfferos incluyen los implicados en la formacion de PAS, tales como VMP1, TP53INP2, mAtg9, el complejo ULK (compuesto por ULK1, u Lk2, mAtg13 y FIP200), el complejo PI3K (el complejo Atg14L compuesto por Beclinl, hVps34, p150, Ambral y Atg14L, y el complejo UVrAg compuesto por Beclinl, hVps34, p150, Bif-1 y uVrAG) y los implicados en la elongacion del fagoforo tales como LC3-II y el complejo Atg12-Atg5-Atgl6L.

Por tanto, los ejemplos del farmaco que suprime la autofagia incluyen, pero no se limitan a, un farmaco que suprime la produccion y/o actividad de un factor relacionado con autofagia tal como los descritos anteriormente y un farmaco para promover la degradacion y/o inactivacion de un factor relacionado con autofagia. Los ejemplos del farmaco que suprime la produccion de un factor relacionado con autofagia incluyen una molecula de iARN, ribozima, acido nucleico antisentido o polinucleotido de quimera de ADN/ARN para ADN que codifica un factor relacionado con autofagia, o un vector que expresa el mismo.

Los ejemplos del farmaco que suprime la actividad de un factor relacionado con autofagia incluyen, pero no se limitan a, un inhibidor de Pl3K (por ejemplo, wortmanina, etc.), en particular un inhibidor de PI3K de clase III (por ejemplo, 3-MA (3-metiladenina), etc.), una sustancia que inhibe la fusion de un autofagosoma y un lisosoma (por ejemplo, bafilomicina A1, etc.), una sustancia que inhibe la degradacion de protemas en un autolisosoma (por ejemplo, cloroquina, leupeptina, etc.), una sustancia que se une a un factor relacionado con autofagia (por ejemplo, un anticuerpo para un factor relacionado con autofagia, etc.), y un mutante dominante negativo de un factor relacionado con autofagia. Estos farmacos estan comercialmente disponibles o pueden producirse apropiadamente basandose en tecnicas conocidas. En una realizacion de la presente descripcion, el farmaco que suprime la autofagia no contiene GST-n y/o una variante funcional de la misma.

Desde el punto de vista de una alta especificidad y pocos efectos secundarios, el farmaco que suprime la autofagia es preferiblemente una molecula de iARN, ribozima, acido nucleico antisentido o polinucleotido de quimera de ADN/ARN para ADN que codifica un factor relacionado con autofagia, o un vector que expresa el mismo.

La supresion de la autofagia puede determinarse observando que la autofagia se suprime en celulas en comparacion con un caso en el que el agente supresor de la autofagia de la presente descripcion no se utiliza. La inhibicion de la autofagia puede evaluarse basandose en cualquier tecnica conocida, ejemplos de las cuales incluyen, pero no se limitan a, deteccion de un autofagosoma mediante un metodo de microscopio electronico, y deteccion de un marcador de autofagia (por ejemplo, Atg5, Atg12, LC3, en particular LC3-II, etc.). LC3-II puede detectarse, por ejemplo, pero sin limitarse a, usando un anticuerpo espedfico para LC3-II, o puede detectarse sometiendo una muestra a separacion con electroforesis, etc., y luego detectando LC3-II, separado como una banda que es diferente de LC3-I, mediante un metodo de inmunotransferencia de tipo Western, etc., usando un anticuerpo que reacciona con LC3-II o tanto LC3-I como LC3-II. Ademas, debido a que LC3-I esta dispersado dentro del citoplasma, mientras que LC3-II se localiza en una estructura espedfica de autofagia tal como una membrana de aislamiento, un autofagosoma o un autolisosoma, puede usarse la presencia o el numero de senales similares a puntos que muestran estas estructuras, que se manifiestan mediante inmunotincion, etc., con un anticuerpo que reacciona con LC3-II (incluyendo un anticuerpo que reacciona con tanto LC3-I como LC3-II) como indicador para la autofagia.

El farmaco que suprime GST-n y el farmaco que suprime la autofagia pueden estar contenidos en una unica formulacion o pueden estar contenidos por separado en dos o mas formulaciones. En este ultimo caso, cada formulacion puede administrarse al mismo tiempo o puede administrarse con un intervalo de tiempo entre medias. Cuando se administran con un intervalo de tiempo entre medias, la formulacion que contiene un farmaco que suprime GST-n puede administrarse antes que la formulacion que contiene un farmaco que suprime la autofagia o puede administrarse posteriormente a la misma.

La presente descripcion tambien se refiere a un agente o una composicion para inducir apoptosis (a continuacion en el presente documento, tambien denominado "agente inductor de apoptosis" o "composicion inductora de apoptosis") en celulas en las que se suprime GST-n, conteniendo el agente o la composicion como principio activo un farmaco que suprime la autofagia.

Cuando se usa en el presente documento, "GST-n que esta suprimiendose" incluye, por ejemplo, un estado en el que GST-n esta suprimiendose en celulas que expresan GST-n. Los ejemplos de un estado de este tipo incluyen un estado en el que un farmaco que suprime GST-n (por ejemplo, los descritos anteriormente, etc.) se ha administrado a celulas que expresan GST-n.

Si esta expresandose o no GST-n en determinadas celulas o bien se conoce de la bibliograffa o bien puede determinarse detectando realmente la expresion de GST-n en celulas. La expresion de GST-n puede detectarse mediante cualquier tecnica conocida, incluyendo las descritas anteriormente.

El agente o la composicion de la presente descripcion puede ser uno para inducir apoptosis en celulas que tienen un KRAS mutado.

Cuando se usa en el presente documento, los ejemplos del KRAS mutado incluyen, pero no se limitan a, los que tienen una mutacion que provoca activacion constante de KRAS, tal como una mutacion que inhibe la GTPasa endogena o una mutacion que aumenta la tasa de intercambio de nucleotidos de guanina. Los ejemplos espedficos de tal mutacion incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, una mutacion en los aminoacidos 12, 13 y/o 61 en KRAS humano (que inhibe la GTPasa endogena) y una mutacion en los aminoacidos 116 y/o 119 en KRAS humano (que aumenta la tasa de intercambio de nucleotidos de guanina) (Bos, Cancer Res. 1989; 49 (17): 4682-9, Levi et al., Cancer Res. 1991; 51 (13): 3497-502). Por tanto, en una realizacion de la presente invencion, el KRAS mutado puede ser un KRAS que tiene una mutacion en al menos uno de los aminoacidos 12, 13, 61, 116 y 119 de KRAS humano. En una realizacion de la presente invencion, el KRAS mutado tiene una mutacion en el aminoacido 12 de KRAS humano. Ademas, en una realizacion de la presente invencion, el KRAS mutado puede ser uno que induce la sobreexpresion de GST-n. Por tanto, las celulas que tienen KRAS mutado pueden presentar sobreexpresion de GST-n.

La deteccion de KRAS mutado puede llevarse a cabo usando cualquier tecnica conocida. Los ejemplos de una tecnica de este tipo incluyen, pero no se limitan a, hibridacion selectiva por medio de una sonda de acido nucleico espedfica para una secuencia de mutacion espedfica, un metodo de escision de apareamiento erroneo enzimatico, secuenciacion (Bos, 1989 citado anteriormente) y un metodo de PCRRFLP (Miyanishi et al., 2001 citado anteriormente).

Ademas, la deteccion de la expresion de GST-n puede llevarse a cabo usando cualquier tecnica conocida, incluyendo las descritas anteriormente. Si esta sobreexpresandose o no GST-n puede evaluarse, por ejemplo, comparando el grado de expresion de GST-n en celulas que tienen KRAS mutado con el grado de expresion de GST-n en el mismo tipo de celulas que tienen KRAS normal. En este caso, puede decirse que GST-n esta sobreexpresandose si el grado de expresion de GST-n en celulas que tienen KRA^smutado excede del grado de expresion de GST-n en el mismo tipo de celulas que tienen KRAS normal.

La cantidad de principio activo formulado en el agente o la composicion de la presente descripcion puede ser una cantidad que induce apoptosis cuando se administra el agente o la composicion. Ademas, es preferiblemente una cantidad que no provoca un efecto adverso que excede el beneficio de la administracion. Una cantidad de este tipo se conoce o puede determinarse apropiadamente mediante una prueba in vitro usando celulas cultivadas, etc., o una prueba en un modelo animal tal como un raton, una rata, un perro o un cerdo, y tales metodos de prueba los conoce bien un experto en la tecnica. La induccion de la apoptosis puede evaluarse mediante diversas tecnicas conocidas, por ejemplo, mediante deteccion de un fenomeno espedfico de apoptosis tal como fragmentacion del ADN, union de anexina V a la membrana celular, cambio en el potencial de membrana mitocondrial o activacion de caspasa, o mediante tincion con TUNEL. La cantidad de principio activo formulado puede variar segun la manera en la que el agente o la composicion se administra. Por ejemplo, cuando se usa una pluralidad de unidades de la composicion para una administracion, la cantidad de principio activo que va a formularse en una unidad de la composicion puede determinarse dividiendo la cantidad de principio activo necesario para una administracion entre dicha pluralidad de unidades. El ajuste de una cantidad de formulacion de este tipo puede llevarla a cabo apropiadamente un experto en la tecnica.

La presente descripcion tambien se refiere a un procedimiento para producir un agente o una composicion para inducir apoptosis, comprendiendo el procedimiento formular como principios activos un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia; el uso de un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia en la produccion de un agente o una composicion para inducir apoptosis; una combinacion de un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia para su uso en la induccion de apoptosis; y un metodo de induccion de apoptosis que comprende administrar cantidades eficaces de farmaco que suprime GST-n y farmaco que suprime la autofagia.

La presente descripcion tambien se refiere a un procedimiento para producir un agente o una composicion para inducir apoptosis en celulas en las que se suprime GST-n, comprendiendo el procedimiento formular como principio activo un farmaco que suprime la autofagia; el uso de un farmaco que suprime la autofagia en la produccion de un agente o una composicion para inducir apoptosis en celulas en las que se suprime GST-n; un farmaco que suprime la autofagia para su uso en la induccion de la apoptosis en celulas en las que se suprime GST-n; y un metodo de induccion de apoptosis en celulas en las que se suprime GST-n, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un farmaco que suprime la autofagia.

El farmaco o la cantidad de formulacion del mismo en el uso o procedimiento de produccion mencionado anteriormente son tal como se describieron anteriormente. La formulacion de cada farmaco puede llevarse a cabo segun cualquier tecnica conocida.

Todos los metodos anteriores para inducir apoptosis pueden ser o bien un metodo in vitro o bien un metodo in vivo. Ademas, los farmacos en los metodos son tal como se describieron anteriormente, y la cantidad eficaz de farmaco puede ser una cantidad que induce apoptosis en celulas a las que se administra. Tambien es preferiblemente una cantidad que no provoca un efecto adverso que exceda el beneficio de la administracion. Una cantidad de este tipo se conoce o puede determinarse apropiadamente mediante una prueba in vitro usando celulas cultivadas, etc., y un experto en la tecnica conoce bien un metodo de prueba de este tipo. La induccion de la apoptosis puede evaluarse mediante diversas tecnicas conocidas, incluyendo las descritas anteriormente. La cantidad eficaz anterior no es necesario que sea necesariamente una que induzca apoptosis en todas las celulas de una poblacion de celulas a las que se administra el farmaco. Por ejemplo, la cantidad eficaz anterior puede ser una cantidad que induce apoptosis en, de la poblacion de celulas, al menos el 1 % de las celulas, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 %, al menos el 5 %, al menos el 6 %, al menos el 8 %, al menos el 10 %, al menos el 12 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, etc.

El agente inductor de apoptosis de la presente descripcion puede inducir apoptosis eficazmente incluso en celulas que tienen una anomalfa en la proliferacion celular, etc., y es eficaz como componente de una composicion farmaceutica. Por tanto, un aspecto de la presente descripcion incluye una composicion farmaceutica que contiene el agente inductor de apoptosis de la presente descripcion.

La composicion farmaceutica de la presente descripcion es eficaz en el tratamiento de una enfermedad en la que hay apoptosis anomala en particular. Por tanto, una realizacion de la presente descripcion se refiere a una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad en la que hay apoptosis anomala, conteniendo la composicion farmaceutica el agente inductor de apoptosis. Cuando se usa en el presente documento, los ejemplos de la enfermedad en la que hay apoptosis anomala incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad debida a proliferacion celular anomala, una enfermedad debida a mutacion de KRAS y una enfermedad debida a sobreexpresion de GST-n. Los ejemplos de la enfermedad debida a proliferacion celular anomala incluyen, pero no se limitan a, un tumor benigno o maligno, hiperplasia, queloide, smdrome de Cushing, aldosteronismo primario, eritroplaquia, policitemia vera, leucoplacia, cicatriz hiperplasica, liquen plano y lentiginosis. Los ejemplos de la enfermedad debida a mutacion de KRAS incluyen, pero no se limitan a, un tumor benigno o maligno (tambien denominado un cancer o una neoplasia maligna). Los ejemplos de la enfermedad debida a sobreexpresion de GST-n incluyen, pero no se limitan a, un tumor benigno o maligno, en particular un tumor maligno resistente a farmacos (por ejemplo, resistente a un agente alquilante tal como melfalan o ciclofosfamida, un antibiotico antitumoral a base de antraciclina tal como adriamicina, un complejo de platino tal como cisplatino, etoposido, etc.). En una realizacion de la presente descripcion, la enfermedad en la que hay apoptosis anomala es un cancer.

Los ejemplos del cancer en la presente descripcion incluyen, pero no se limitan a, sarcomas tales como fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, liposarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiosarcoma, sarcoma sinovial, condrosarcoma y osteosarcoma, carcinomas tales como tumor cerebral, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de mama, carcinoma de pulmon, carcinoma esofagico, carcinoma gastrico, carcinoma duodenal, carcinoma de apendice, carcinoma de colon, carcinoma rectal, carcinoma de hngado, carcinoma pancreatico, carcinoma de vesfcula biliar, carcinoma de conducto biliar, carcinoma anal, carcinoma renal, carcinoma de ureter, carcinoma de vejiga, carcinoma de prostata, carcinoma de pene, carcinoma testicular, carcinoma uterino, carcinoma de ovario, carcinoma vulvar, carcinoma vaginal y carcinoma de piel y, ademas, leucemia y linfoma maligno. En la presente invencion, "cancer" incluye tumor maligno epitelial y tumor maligno no epitelial. El cancer en la presente descripcion puede estar presente en cualquier sitio del cuerpo, por ejemplo, el cerebro, la cabeza y el cuello, el torax, las extremidades, el pulmon, el corazon, el timo, el esofago, el estomago, el intestino delgado (duodeno, yeyuno, Aeon), el intestino grueso (colon, ciego, apendice, recto), el tngado, el pancreas, la vesfcula biliar, el ano, el rinon, el conducto urinario, la vejiga, la prostata, el pene, los testfculos, el utero, el ovario, la vulva, la vagina, la piel, el musculo estriado, el musculo liso, la membrana sinovial, el cartflago, el hueso, el tiroides, la glandula suprarrenal, el peritoneo, el mesenterio, la medula osea, la sangre, el sistema vascular, el sistema linfatico tal como ganglios linfaticos, lfquido linfatico, etc.

En una realizacion de la presente descripcion, el cancer incluye celulas cancerosas que tienen el KRAS mutado definido anteriormente. En una realizacion de la presente descripcion, el cancer incluye celulas cancerosas que presentan proliferacion independiente de hormonas o factores de crecimiento. En una realizacion de la presente descripcion, el cancer incluye celulas cancerosas que presentan sobreexpresion de GST-n. En una realizacion de la presente descripcion, el cancer es resistente a farmacos. En una realizacion de la presente descripcion, el cancer tiene resistencia a un farmaco seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante tal como melfalan o ciclofosfamida, un antibiotico antitumoral a base de antraciclina tal como adriamicina, un complejo de platino tal como cisplatino, y etoposido. En una realizacion de la presente descripcion, el cancer tiene resistencia a un medicamento seleccionado del grupo que consiste en malfalan, ciclofosfamida, adriamicina, cisplatino y etoposido.

La presente descripcion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad en la que hay apoptosis anomala, conteniendo la composicion como principios activos un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia; a un procedimiento para producir una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad en la que hay apoptosis anomala, comprendiendo el procedimiento formular como principios activos un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia; al uso de un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia para la produccion de una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad en la que hay apoptosis anomala; a una combinacion de un farmaco que suprime GST-n y un farmaco que suprime la autofagia para su uso en el tratamiento de una enfermedad en la que hay apoptosis anomala; y a un metodo para tratar una enfermedad en la que hay apoptosis anomala, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica a un sujeto que lo requiere.

El farmaco, la cantidad de formulacion y la enfermedad en la que hay apoptosis anomala en el procedimiento de produccion o uso son tal como se describieron anteriormente. La formulacion de cada farmaco puede llevarse a cabo segun cualquier tecnica conocida.

Los presentes inventores han aclarado ahora que GST-n se une a un receptor tirosina cinasa, que esta en posicion anterior de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR, en particular a su forma fosforilada, y a Raf, que es una molecula constituyente de la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, en particular a su forma fosforilada, inhibiendo asf la ubiquitinacion de estas moleculas, promoviendo se ese modo estas cascadas de senales. Por tanto, la presente descripcion tambien se refiere a un agente o a una composicion para promover la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK (tambien denominado "promotor de la cascada de senales" o "composicion que promueve la cascada de senales"), conteniendo el agente o la composicion como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma. En particular, el agente o la composicion de la presente descripcion puede promover tanto la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR como la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK al mismo tiempo.

Los ejemplos de la "variante funcional de GST-n" usada en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, (i) una variante que tiene una o mas mutaciones, normalmente una o unas pocas, en la secuencia de aminoacidos de GST-n pero tiene todavfa una funcion equivalente a GST-n, (ii) una variante que esta codificada por un acido nucleico que tiene una secuencia de bases de un gen que codifica GST-n o un acido nucleico que tiene una o mas mutaciones, normalmente una o unas pocas, en la secuencia de bases de un acido nucleico que codifica el mismo polipeptido que se codifico mediante el acido nucleico anterior, y tiene una funcion equivalente a GST-n, (iii) una variante que esta codificada por un acido nucleico que se hibrida, en condiciones rigurosas, con una hebra complementaria de un acido nucleico que tiene una secuencia de bases de un gen que codifica GST-n, un acido nucleico que codifica el mismo polipeptido que se codifico mediante el acido nucleico anterior o un acido nucleico que codifica una variante de (ii), o un fragmento de la hebra complementaria, y tiene una funcion equivalente a GST-n, (iv) una variante que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene una homologfa de al menos el 60 %, preferiblemente al menos el 70 %, mas preferiblemente al menos el 80 %, aun mas preferiblemente al menos el 90 % y de manera particularmente preferible al menos el 95 % con la secuencia de aminoacidos de GST-n, y tiene una funcion equivalente a GST-n, y (v) una variante que esta codificada por un acido nucleico que tiene una homologfa de al menos el 60 %, preferiblemente al menos el 70 %, mas preferiblemente al menos el 80 %, aun mas preferiblemente al menos el 90 % y de manera particularmente preferible al menos el 95 % con la secuencia de bases del gen que codifica GST-n, y tiene una funcion equivalente a GST-n.

La secuencia de aminoacidos de GST-n y la secuencia de bases del gen que codifica GST-n se conocen para diversos tipos de animales tal como se describio anteriormente, y un experto en la tecnica puede preparar apropiadamente las variantes funcionales mencionadas anteriormente basandose en la informacion de secuencia mediante cualquier tecnica conocida, por ejemplo, smtesis qmmica, escision o insercion de un acido nucleico mediante una enzima de restriccion, mutagenesis dirigida al sitio, aplicacion de radiacion o rayos UV, etc.

Si una variante dada tiene o no una funcion equivalente a GST-n puede evaluarse analizando una funcion conocida de GST-n incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, union con una protema tal como Raf-1 (en particular Raf-1 fosforilada) o eGf R (en particular eGfR fosforilado) mediante cualquier metodo conocido tal como, por ejemplo, un metodo de inmunoprecipitacion, un metodo de inmunotransferencia de tipo Western, un metodo de analisis de masas, un metodo de precipitacion o un metodo de resonancia de plasmon superficial (SPR), y comparandola con un control negativo apropiado o GST-n como control positivo. Por ejemplo, cuando la funcion de una variante dada es superior a un control negativo, por ejemplo, cuando es superior en al menos el 10 %, al menos el 25 %, al menos el 50 %, al menos el 75 % o al menos el 100 % y/o cuando la funcion es al menos 1/100 de GST-n, al menos 1/50, al menos 1/25, al menos 1/10, al menos 1/5 o al menos 1/2, esta variante se incluye en las variantes funcionales de GST-n.

El termino "condiciones rigurosas" usado en el presente documento es un parametro conocido en este campo tecnico y se describe en un protocolo convencional tal como, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Press (2001) o Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992).

Las condiciones rigurosas en la presente descripcion significan, por ejemplo, hibridacion a 65 °C por medio de un tampon de hibridacion que contiene SSC 3,5x (cloruro de sodio 0,l5 M/citrato de sodio 0,15 M, pH 7), Ficoll al 0,02 %, polivinilpirrolidona al 0,02%, seroalbumina bovina al 0,02%, NaH²PO⁴25 mM (pH 7), s Ds al 0,05% y EDTA 2 mM. Tras la hibridacion, se lava una membrana a la que se le ha transferido ADN con SSC 2x a temperatura ambiente, y luego con SSC de 0,1 a 0,5x/SDS 0,1x a una temperatura de hasta 68 °C. Alternativamente, la hibridacion rigurosa puede llevarse a cabo usando un tampon de hibridacion comercial tal como disolucion de hibridacion ExpressHyb(R) (Clontech) en condiciones de hibridacion y lavado descritas por el fabricante. Hay otras condiciones, reactivos, etc. aplicables que pueden dar como resultado el mismo grado de rigurosidad, pero puesto que puede esperarse que un experto en la tecnica este familiarizado con tales condiciones, no se hace referencia espedficamente a las mismas en el presente documento. Sin embargo, es posible manipular las condiciones con el fin de identificar claramente un acido nucleico que codifica una variante de GST-n.

GST-n y/o una variante funcional de la misma en la presente descripcion incluyen, ademas de GST-n y una variante funcional de la misma como protemas, un acido nucleico que codifica GST-n y un acido nucleico que codifica una variante funcional de GST-n.

Cuando se usa en el presente documento, la "cascada de senales" significa la transduccion de senales por medio de la cual una pluralidad de moleculas de senalizacion transmite una senal en secuencia. Por ejemplo, en el caso de la "cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR", se transmite una senal de una manera tal que PI3K se activa en primer lugar, esto provoca entonces que se active Akt, y esto provoca entones que se active mTOR. Esto tambien se aplica en la notacion de otras cascadas de senales. Con respecto a la relacion entre posicion anterior y posterior de la senalizacion, la cadena de activacion puede estar provocada o bien directamente o bien indirectamente. Por ejemplo, se sabe que la activacion de Akt provocada por PI3K esta mediada por moleculas tales como PIP³((3,4,5)trisfosfato de fosfatidilinositol) y PDK1 (protema cinasa 1 dependiente de fosfoinosftido, tambien denominada PDPK1).

La cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR es una cascada de senales que esta dirigida por la activacion de PI3K y se sabe que esta implicada en la senalizacion en supervivencia celular, etc. Los ejemplos del modo en el que se produce la activacion de PI3K incluyen, pero no se limitan a, un ligando que se une a un receptor acoplado a protema G o un receptor tirosina cinasa, y PI3K activada fosforila fosfolfpido de inositol, produciendo por tanto un fosfatidilinositol tal como PIP³. Este se une a PDK1 o Akt en un dominio pH, promoviendo por tanto la localizacion de estas protemas en la membrana. PDK1 se une a PIP3 para que se active por tanto en la membrana, y el PDK1 activado fosforila T en la posicion 308 de Akt. La serina en la posicion 473 de Akt se fosforila mediante mTORC2, que es uno de los complejos de mTOR, y Akt se activa completamente como resultado de la fosforilacion de los aminoacidos en estas dos posiciones.

Aunque la ruta para la activacion de mTOR por Akt no se ha dilucidado completamente, se cree que esta implicado PRAS40 (sustrato de Akt/PKB rico en prolina de 40 kDa). PRAS40 es un sustrato de Akt como indica el nombre y es una molecula que se cree que se une a un complejo de mTOR para suprimir asf su activacion, y se cree que cuando se activa Akt se fosforila PRAS40, provocando de ese modo que se libere PRAS40 del complejo de mTOR para activar asf mTOR. Cuando se activa mTOR, se fosforilan ULK1 y ULK2 (cinasa similar a unc-51) y mAtg13 (protema 13 relacionada con autofagia de mamfferos), inhibiendo por tanto el inicio de la senalizacion de autofagia para suprimir por tanto la autofagia.

Por otro lado, la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK es una cascada de senales que se refiere a proliferacion celular, etc. Cuando un ligando tal como, por ejemplo, un factor de crecimiento se une a un receptor acoplado a protema G o un receptor tirosina cinasa, KRAS, que es una protema G de bajo peso molecular, se activa, y la KRAS activada fosforila Raf (una clase de MAPKKK) para activarla, por tanto. La Raf activada activa MEK (MAPK/ERK cinasa, una clase de MAP2K), y la MEK activada activa ERK (cinasa regulada por senal extracelular, una clase de MAPK). La ERK activada se transloca al nucleo y promueve la transcripcion de diversos ARNm para desencadenar por tanto la proliferacion celular.

En la presente descripcion, la promocion de una cascada de senales significa no solamente potenciar la activacion de la cascada de senales sino tambien la supresion de la inactivacion de la cascada de senales. Si una cascada de senales se promueve o no puede determinarse por la cascada de senales que se inactiva en comparacion con un caso en el que el agente o la composicion de la presente descripcion no se utiliza. La activacion de una cascada de senales puede evaluarse detectando, por ejemplo, pero sin limitarse a, un fenomeno celular que resulta de la activacion de una molecula constituyente de la cascada de senales (por ejemplo, fosforilacion, etc.) o la activacion de una cascada de senales, tal como, por ejemplo, supresion de autofagia, etc., en el caso de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR o proliferacion celular, etc., en el caso de la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK.

La presente descripcion tambien se refiere a un procedimiento para producir un agente o una composicion para promover la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular GST-n y/o una variante funcional de la misma; el uso de GST-n y/o una variante funcional de la misma en la produccion de un agente o una composicion para promover la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK; a GST-n y/o una variante funcional de la misma para su uso en la promocion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK; y a un metodo para promover la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de GST-n y/o una variante funcional de la misma.

El agente o la composicion para promover una cascada de senales de la presente descripcion es util para el tratamiento de una enfermedad asociada con una anomalfa de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, en particular con una supresion de estas cascadas de senales. Los ejemplos de una enfermedad de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad acompanada por supresion de la expresion o actividad y/o aumento en la degradacion o inactivacion de una molecula constituyente de estas cascadas de senales (por ejemplo, debido a una anomalfa genetica de estas moleculas, supresion de la expresion o actividad de GST-n, etc.).

Por tanto, la presente descripcion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, conteniendo la composicion farmaceutica como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma; a un procedimiento para producir una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, incluyendo el procedimiento una etapa de formular GST-n y/o una variante funcional de la misma; al uso de GST-n y/o una variante funcional de la misma en la produccion de una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK; a GST-n y/o una variante funcional de la misma para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con supresion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK; y a un metodo para tratar una enfermedad asociada con supresion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de GST-n y/o una variante funcional de la misma.

La presente descripcion tambien se refiere a un agente o una composicion para suprimir la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK (tambien denominado "agente supresor de la cascada de senales" o "composicion supresora de la cascada de senales"), conteniendo el agente o la composicion como principio activo un farmaco que suprime GST-n.

En la presente descripcion, la supresion de una cascada de senales significa no solamente inducir la inactivacion de la cascada de senales sino tambien suprimir la activacion de la cascada de senales. Si la cascada de senales se suprime o no puede determinarse mediante la cascada de senales que se suprime en comparacion con un caso en el que el agente o la composicion de la presente descripcion no se utiliza. La supresion de una cascada de senales puede evaluarse detectando, por ejemplo, pero sin limitarse a, una reduccion de la activacion (por ejemplo, fosforilacion, etc.) de una molecula constituyente de la cascada de senales o un fenomeno celular que resulta de la supresion de la cascada de senales, tal como, por ejemplo, aumento de la autofagia, etc., en el caso de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR o supresion de la proliferacion celular, etc., en el caso de la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK.

La presente descripcion tambien se refiere a un procedimiento para producir un agente o una composicion para suprimir la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular un farmaco que suprime GST-n; al uso de un farmaco que suprime GST-n en la produccion de un agente o una composicion para suprimir la cascada de senales de Pl3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK; a un farmaco que suprime GST-n para su uso en la supresion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK; y a un metodo para suprimir la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un farmaco que suprime GST-n.

El agente o la composicion para suprimir una cascada de senales de la presente descripcion es util para el tratamiento de una enfermedad asociada con una anomalfa de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, en particular con la activacion de estas cascadas de senales. Los ejemplos de una enfermedad de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad asociada con un aumento en la expresion o actividad y/o supresion de la degradacion o inactivacion de una molecula constituyente de estas cascadas de senales (por ejemplo, debido a una anomalfa genetica de estas moleculas, un aumento en la expresion o actividad de GST-n) y una enfermedad asociada con la activacion de la cascada de senales por medio de un factor distinto de una molecula constituyente de estas cascadas de senales (por ejemplo, activacion de receptor tirosina cinasa, etc.).

Por tanto, la presente descripcion se refiere ademas a una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con la activacion de la cascada de senales de Pl3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, conteniendo la composicion farmaceutica como principio activo un farmaco que suprime GST-n; a un procedimiento para producir una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con la activacion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular un farmaco que suprime GST-n; al uso de un farmaco que suprime GST-n en la produccion de una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con la activacion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK; a un farmaco que suprime GST-n para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la activacion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK; y a un metodo para tratar una enfermedad asociada con la activacion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un farmaco que suprime GST-n. La presente descripcion tambien se refiere a un agente o una composicion para suprimir la ubiquitinacion (tambien denominado "agente supresor de la ubiquitinacion" o "composicion supresora de la ubiquitinacion"), conteniendo el agente o la composicion como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma.

La ubiquitinacion significa que la ubiquitina se une a una protema y esta implicada en el proceso de desechar una protema que se vuelve innecesaria en una celula. Una protema ubiquitinada se degrada en un proteasoma.

En una realizacion de la presente descripcion, la protema para la que se suprime la ubiquitinacion es una protema a la que pude unirse GST-n. Ademas, en una realizacion de la presente descripcion, la protema para la que se suprime la ubiquitinacion se selecciona del grupo que consiste en una protema que constituye la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, una protema que constituye la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y un receptor tirosina cinasa. En una realizacion preferida de la presente descripcion, la protema para la que se suprime la ubiquitinacion se selecciona del grupo que consiste en ^eG^fR y Raf-1, en particular una forma fosforilada de las mismas.

En la presente descripcion, la supresion de la ubiquitinacion puede determinarse mediante la ubiquitinacion que se suprime en comparacion con un caso en el que el agente o la composicion de la presente descripcion no se utiliza. La supresion de la ubiquitinacion puede evaluarse mediante cualquier tecnica conocida, por ejemplo, pero sin limitarse a, un metodo de inmunoprecipitacion, un metodo de inmunotransferencia de tipo Western, un metodo de analisis de masas, un metodo de precipitacion, etc.

La presente descripcion tambien se refiere a un procedimiento para producir un agente o una composicion para suprimir la ubiquitinacion, comprendiendo el procedimiento una etapa de formulacion de GST-n y/o una variante funcional de la misma; al uso de GST-n y/o una variante funcional de la misma en la produccion de un agente o una composicion para suprimir la ubiquitinacion; a GST-n y/o una variante funcional de la misma para su uso en la supresion de la ubiquitinacion; y a un metodo para suprimir la ubiquitinacion, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de GST-n y/o una variante funcional de la misma.

El agente o la composicion para suprimir la ubiquitinacion de la presente descripcion es util en el tratamiento de una enfermedad asociada con hiperubiquitinacion. Los ejemplos de una enfermedad de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad acompanada por un aumento en la expresion o actividad y/o una supresion de la degradacion o inactivacion de ubiquitina ligasa (por ejemplo, debido a una anomalfa genetica de ubiquitina ligasa, supresion de expresion o actividad de GST-n, etc.).

Por tanto, la presente descripcion se refiere ademas a una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con hiperubiquitinacion, conteniendo la composicion farmaceutica como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma; a un procedimiento para producir una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con hiperubiquitinacion, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular GST-n y/o una variante funcional de la misma; al uso de GST-n y/o una variante funcional de la misma en la produccion de una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con hiperubiquitinacion; a GST-n y/o una variante funcional de la misma para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con hiperubiquitinacion; y a un metodo para tratar una enfermedad asociada con hiperubiquitinacion, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de GST-n y/o una variante funcional de la misma.

La presente descripcion tambien se refiere a un agente o una composicion para promover la ubiquitinacion (tambien denominado "agente promotor de la ubiquitinacion" o "composicion promotora de la ubiquitinacion"), conteniendo el agente o la composicion como principio activo un farmaco que suprime GST-n.

En una realizacion de la presente descripcion, la protema para la que se promueve la ubiquitinacion es una protema a la que puede unirse GST-n. Ademas, en una realizacion de la presente descripcion, la protema para la que se promueve la ubiquitinacion se selecciona del grupo que consiste en una protema que constituye la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK, una protema que constituye la cascada de senales de Pl3K/Akt/mTOR y un receptor tirosina cinasa. En una realizacion preferida de la presente descripcion, la protema para la que se promueve la ubiquitinacion se selecciona del grupo que consiste en EGFR y Raf-1, en particular una forma fosforilada de las mismas.

En la presente descripcion, la promocion de la ubiquitinacion puede determinarse mediante la ubiquitinacion que se promueve en comparacion con un caso en el que el agente o la composicion de la presente descripcion no se utiliza. La promocion de la ubiquitinacion puede evaluarse mediante cualquier tecnica conocida, por ejemplo, pero sin limitarse a, un metodo de inmunoprecipitacion, un metodo de inmunotransferencia de tipo Western, un metodo de analisis de masas, un metodo de precipitacion, etc.

La presente descripcion tambien se refiere a un procedimiento para producir un agente o una composicion para promover la ubiquitinacion, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular un farmaco que suprime GST-n; al uso de un farmaco que suprime GST-n en la produccion de un agente o una composicion para promover la ubiquitinacion; a un farmaco que suprime GST-n para su uso en la promocion de la ubiquitinacion; y a un metodo para promover la ubiquitinacion, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un farmaco que suprime GST-n.

El agente o la composicion para promover la ubiquitinacion de la presente descripcion es util en el tratamiento de una enfermedad asociada con supresion de la ubiquitinacion. Los ejemplos de una enfermedad de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad asociada con supresion de la expresion o actividad y/o un aumento en la degradacion o inactivacion de ubiquitina ligasa (por ejemplo, debido a una anomalfa genetica de ubiquitina ligasa, un aumento en la expresion o actividad de GST-n, etc.).

Por tanto, la presente descripcion se refiere ademas a una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de ubiquitinacion, conteniendo la composicion farmaceutica como principio activo un farmaco que suprime GST-n; a un procedimiento para producir una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de la ubiquitinacion, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular un farmaco que suprime GST-n; al uso de un farmaco que suprime GST-n en la produccion de una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de la ubiquitinacion; a un farmaco que suprime GST-n para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con supresion de la ubiquitinacion; y a un metodo para tratar una enfermedad asociada con supresion de la ubiquitinacion, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un farmaco que suprime GST-n.

La presente descripcion tambien se refiere a un agente o una composicion para suprimir la autofagia (tambien denominado "agente supresor de la autofagia" o "composicion supresora de la autofagia"), conteniendo el agente o la composicion como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma. Los presentes inventores han aclarado ahora que GST-n se une a un receptor tirosina cinasa, en particular una forma fosforilada del mismo, que esta en posicion anterior de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR, para inhibir por tanto la ubiquitinacion del mismo, promoviendo de ese modo la cascada de senales; se sabe que la activacion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR suprime la autofagia (por ejemplo, Yang y Klionsky, 2010 citado anteriormente).

En la presente descripcion, la supresion de la autofagia puede determinarse mediante la autofagia que se suprime en celulas en comparacion con un caso en el que el agente o la composicion de la presente descripcion no se utiliza. La tecnica para evaluar la autofagia es tal como se describio anteriormente.

La presente descripcion se refiere ademas a un procedimiento para producir un agente o una composicion para suprimir la autofagia, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular GST-n y/o una variante funcional de la misma; al uso de GST-n y/o una variante funcional de la misma en la produccion de un agente o una composicion para suprimir la autofagia; a GST-n y/o una variante funcional de la misma para su uso en la supresion de la autofagia; y a un metodo para suprimir la autofagia, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de GST-n y/o una variante funcional de la misma.

El agente o la composicion para suprimir la autofagia de la presente descripcion es util para el tratamiento de una enfermedad asociada con autofagia potenciada. Los ejemplos de una enfermedad de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad asociada con supresion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR (por ejemplo, debido a una anomalfa genetica de una molecula constituyente de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o una molecula en posicion anterior de la misma, supresion de la expresion o actividad de GST-n, etc.), miopatfa, dano hepatico, danos por reperfusion, etc.

Por tanto, la presente descripcion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con autofagia potenciada, conteniendo la composicion farmaceutica como principio activo GST-n y/o una variante funcional de la misma; a un procedimiento para producir una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con autofagia potenciada, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular GST-n y/o una variante funcional de la misma; al uso de GST-n y/o una variante funcional de la misma en la produccion de una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con autofagia potenciada; a GST-n y/o una variante funcional de la misma para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con autofagia potenciada; y a un metodo para tratar una enfermedad asociada con autofagia potenciada, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de GST-n y/o una variante funcional de la misma a un sujeto que lo requiere.

Ademas, los presentes inventores han aclarado ahora que la autofagia se promociona suprimiendo GST-n. Por tanto, la presente descripcion tambien se refiere a un agente o una composicion para promover la autofagia (tambien denominado un "agente promotor de la autofagia" o una "composicion promotora de la autofagia") que contiene como principio activo un farmaco que suprime GST-n. La presente descripcion se refiere ademas a un procedimiento para producir un agente o una composicion para promover la autofagia, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular un farmaco que suprime GST-n; al uso de un farmaco que suprime GST-n en la produccion de un agente o una composicion para promover la autofagia; a un farmaco que suprime GST-n para su uso en la promocion de la autofagia; y a un metodo para promover la autofagia, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un farmaco que suprime GST-n.

El agente o la composicion para promover la autofagia de la presente descripcion es util en el tratamiento de una enfermedad asociada con supresion de la autofagia, etc. Los ejemplos de una enfermedad de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad asociada con activacion de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR (por ejemplo, debido a una anomalfa genetica de una molecula constituyente de la cascada de senales de PI3K/Akt/mTOR y/o una molecula en posicion anterior de la misma, un aumento en la expresion o actividad de GST-n, etc.), envejecimiento y una enfermedad isquemica.

Por tanto, la presente descripcion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de autofagia, conteniendo la composicion farmaceutica como principio activo un farmaco que suprime GST-n; a un procedimiento para producir una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de la autofagia, comprendiendo el procedimiento una etapa de formular un farmaco que suprime GST-n; al uso de un farmaco que suprime GST-n en la produccion de una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad asociada con supresion de la autofagia; a un farmaco que suprime GST-n para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con supresion de la autofagia; y a un metodo para tratar una enfermedad asociada con supresion de la autofagia, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un farmaco que suprime GST-n a un sujeto que lo requiere.

La cantidad de formulacion del principio activo de los diversos tipos de agente o composicion de la presente descripcion relacionados con la supresion/promocion de una cascada de senales, ubiquitinacion o autofagia puede ser una cantidad que logra un efecto deseado (es decir, supresion/promocion de la cascada de senales, ubiquitinacion o autofagia) cuando se administra el agente o la composicion. Ademas, es preferiblemente una cantidad que no provoca un efecto adverso que excede el beneficio de la administracion. Una cantidad de este tipo se conoce o puede determinarse apropiadamente por medio de una prueba in vitro usando celulas cultivadas, etc., o una prueba en un animal modelo tal como un raton, una rata, un perro, o un cerdo, y un metodo de prueba de este tipo lo conoce bien un experto en la tecnica. La inhibicion/promocion de una cascada de senales, ubiquitinacion o autofagia puede evaluarse mediante diversas tecnicas conocidas, incluyendo las descritas anteriormente. La cantidad de formulacion de principio activo puede variar segun el modo de administracion del agente o la composicion. Por ejemplo, cuando se usa una pluralidad de unidades de la composicion para una administracion, la cantidad de principio activo que va a formularse en una unidad de la composicion puede ser una obtenida dividiendo la cantidad de principio activo necesaria para una administracion entre dicha pluralidad de unidades. El ajuste de una cantidad de formulacion de este tipo puede llevarla a cabo apropiadamente un experto en la tecnica.

El farmaco y la cantidad de formulacion del mismo en el procedimiento de produccion o uso de los diversos tipos de agente o composicion relacionados con la supresion/promocion de una cascada de senales, ubiquitinacion o autofagia son tal como se describio anteriormente. La formulacion de cada farmaco puede llevarse a cabo segun cualquier tecnica conocida.

Todos los diversos tipos de metodos relacionados con la supresion/promocion de una cascada de senales, ubiquitinacion o autofagia pueden ser un metodo in vitro o un metodo in vivo. Ademas, la cantidad eficaz de farmaco en los metodos anteriores puede ser una cantidad que logra un efecto deseado (es decir, supresion/promocion de una cascada de senales, ubiquitinacion o autofagia) en celulas a las que se administra. Ademas, es preferiblemente una cantidad que no provoca un efecto adverso que excede el beneficio de la administracion. Una cantidad de este tipo se conoce o puede determinarse apropiadamente mediante una prueba in vitro, etc., usando celulas cultivadas, etc., y un metodo de prueba de este tipo lo conoce bien un experto en la tecnica. El logro de un efecto deseado puede evaluarse mediante diversas tecnicas conocidas, incluyendo las descritas anteriormente. No es necesario que la cantidad eficaz anterior sea necesariamente una que induzca un efecto deseado en todas las celulas de una poblacion de celulas a la que se administra el farmaco. Por ejemplo, la cantidad eficaz anterior puede ser una cantidad que induce un efecto deseado en, de la poblacion de celulas, al menos el 1 % de las celulas, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 %, al menos el 5 %, al menos el 6 %, al menos el 8 %, al menos el 10 %, al menos el 12 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, etc.

Cuando el principio activo en los diversos agentes o composiciones, metodos de tratamiento, etc., de la presente invencion descritos en el presente documento es un acido nucleico, por ejemplo, una molecula de iARN, una ribozima, un acido nucleico antisentido, un polinucleotido de quimera de ADN/ARN, etc., puede usarse como acido nucleico desnudo tal cual, pero puede portarse tambien mediante diversos vectores. Como vector, puede usarse cualquier vector conocido tal como un vector de plasmido, un vector de fago, un vector de fagomido, un vector de cosmido o un vector de virus. El vector contiene preferiblemente al menos un promotor que potencia la expresion del acido nucleico portado, y en este caso el acido nucleico preferiblemente esta operativamente unido a un promotor de este tipo. El acido nucleico que esta operativamente unido a un promotor al que se hace referencia en el presente documento significa que el acido nucleico y el promotor estan situados de modo que se produce apropiadamente una protema codificada por el acido nucleico mediante la accion del promotor. El vector puede replicarse o no en una celula huesped, y la transcripcion de un gen puede llevarse a cabo fuera del nucleo o dentro del nucleo de una celula huesped. En este ultimo caso, el acido nucleico puede incorporarse en el genoma de una celula huesped.

Ademas, el principio activo puede estar transportado mediante diversos vehmulos protemicos o lipfdicos no virales. Los ejemplos de tales vehmulos incluyen, pero no se limitan a, colesterol, un liposoma, un protomero de anticuerpo, nanopartmulas de ciclodextrina, un peptido de fusion, un aptamero, un copolfmero de poli(acido lactico) biodegradable y polfmero; la eficacia de incorporacion en celulas puede potenciarse (vease, por ejemplo, Pirollo y Chang, Cancer Res. 2008; 68 (5): 1247-50, etc.). En particular, es util un liposoma cationico o un polfmero (por ejemplo, polietilenimina, etc.). Los ejemplos adicionales de polfmeros utiles como vehmulo de este tipo incluyen los descritos en los documentos US 2008/0207553, US 2008/0312174, etc.

Con respecto a las diversas composiciones farmaceuticas de la presente invencion descritas en el presente documento, el principio activo puede combinarse con otro componente opcional siempre que el efecto del principio activo no se vea alterado. Los ejemplos de un componente opcional de este tipo incluyen otro agente terapeutico qrnmico, un vehmulo farmacologicamente aceptable, un excipiente, un diluyente, etc. Ademas, dependiendo de la via de administracion, el modo de liberacion del farmaco, etc., la composicion puede recubrirse con un material apropiado tal como, por ejemplo, un recubrimiento enterico o un material de disgregacion temporal, o puede incorporarse en un sistema de liberacion de farmacos apropiado.

Los diversos agentes y composiciones (incluyendo las diversas composiciones farmaceuticas) de la presente invencion descritos en el presente documento pueden administrarse por medio de diversas vfas incluyendo vfas tanto oral como parenteral, por ejemplo, sin limitacion, vfas oral, intravenosa, intramuscular, subcutanea, local, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosa, transdermica, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonar e intrauterina, y pueden formularse para dar una forma de dosificacion adecuada para cada via de administracion. Con respecto a tales formas de dosificacion y metodos de formulacion, puede emplearse cualquier metodo o forma conocida apropiadamente (vease, por ejemplo, Hyojun yakuzaigaku (Standard Pharmaceutical Science), ed. por Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003, etc.).

Los ejemplos de la forma de dosificacion adecuada para administracion oral incluyen, pero no se limitan a, un polvo, granulos, un comprimido, una capsula, un lfquido, una suspension, una emulsion, un gel y un jarabe, y los ejemplos de la forma de dosificacion adecuada para administracion parenteral incluyen una inyeccion tal como una inyeccion de disolucion, una inyeccion de suspension, una inyeccion de emulsion o una inyeccion en una forma que se prepara en el momento de su uso. Una formulacion para administracion parenteral puede estar en forma de una suspension o disolucion esteril isotonica acuosa o no acuosa.

Los diversos agentes o composiciones (incluyendo diversas composiciones farmaceuticas) de la presente descripcion descritos en el presente documento pueden dirigirse a un tejido o celulas espedficas. El direccionamiento puede lograrse mediante cualquier tecnica conocida. Cuando se intenta la administracion a un cancer, por ejemplo, sin limitacion, puede usarse una tecnica tal como direccionamiento pasivo en la que se prepara una formulacion para dar un tamano de 50 a 200 |im de diametro, en particular de 75 a 150 |im, etc., que es adecuado para que presente un efecto de EPR (permeabilidad y retencion potenciados), o direccionamiento activo en el que un ligando de CD19, HER2, un receptor de transferrina, un receptor de acido folico, un receptor de VIP, EGFR (Torchilin, AAPS J. 2007; 9 (2): E128-47), RAAG10 (documento JP, A (PCT) 2005-532050), PIPA (documento JP, A (PCT) 2006-506071) o KID3 (documento JP, A (PcT) 2007-529197), etc., un peptido que tiene un motivo de RGD o un motivo de NGR, F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6): 759-68), etc., se usa como agente de direccionamiento. Ademas, puesto que se sabe que el retinoide es util como agente de direccionamiento para celulas cancerosas (documento WO 2008/120815), tambien puede usarse un vehmulo que contiene un retinoide como agente de direccionamiento. Tales vehmulos se describieron en la bibliograffa anteriormente, asf como en los documentos WO 2009/036368, WO 2010/014117, etc.

Los diversos agentes o composiciones (incluyendo diversas composiciones farmaceuticas) de la presente invencion descritos en el presente documento pueden suministrarse en cualquier forma, y desde el punto de vista de la estabilidad en almacenamiento, pueden proporcionarse en una forma que puede prepararse en el momento de uso, por ejemplo, una forma que permite que un medico y/o farmaceutico, una enfermera, otro paramedico, etc., lo preparen en el sitio medico o sus proximidades. Una forma de este tipo es particularmente util cuando el agente o la composicion de la presente invencion contiene un componente que es diffcil de almacenar de manera estable, tal como un lfquido, una protema o un acido nucleico. En este caso, el agente o la composicion de la presente invencion se proporciona en uno o mas recipientes que contienen al menos uno de los constituyentes esenciales, y la preparacion se lleva a cabo antes de su uso, por ejemplo, en el plazo de 24 horas, preferiblemente en el plazo de 3 horas, y de manera mas preferible inmediatamente antes de su uso. Cuando se lleva a cabo la preparacion, puede usarse un reactivo, un disolvente, equipo de preparacion, etc., que estan disponibles habitualmente en el lugar de la preparacion segun sea apropiado.

Por tanto, la presente descripcion tambien se refiere a un kit para preparar una composicion, conteniendo el kit uno o mas recipientes, conteniendo el recipiente individualmente o en combinacion principios activos que van a estar contenidos en los diversos agentes o composiciones de la presente descripcion y constituyentes esenciales de los diversos agentes o composiciones proporcionadas en forma de un kit de este tipo. El kit de la presente descripcion puede incluir, ademas de lo anterior, instrucciones tales como una explicacion escrita o un medio de grabacion electronica tal como un CD o DVD que describe un metodo de preparacion, un metodo de administracion, etc., para los diversos agentes o composiciones de la presente descripcion. Ademas, el kit de la presente descripcion puede contener todos los constituyentes para completar los diversos agentes o composiciones de la presente descripcion, pero no es necesario que contenga necesariamente todos los constituyentes. Por tanto, no es necesario que el kit de la presente descripcion contenga un reactivo o un disolvente que esta disponible habitualmente en un sitio medico, un laboratorio experimental, etc., tal como agua esteril, solucion salina fisiologica o una disolucion de glucosa.

La cantidad eficaz de los diversos metodos de tratamiento de la presente descripcion descrita en el presente documento es por ejemplo una cantidad que reduce los smtomas de una enfermedad o retrasa o detiene el progreso de una enfermedad, y es preferiblemente una cantidad que suprime o cura una enfermedad. Tambien es preferiblemente una cantidad que no provoca un efecto adverso que excede el beneficio de la administracion. Una cantidad de este tipo puede determinarse apropiadamente mediante una prueba in vitro usando celulas cultivadas, etc., o una prueba en un animal modelo tal como un raton, una rata, un perro o un cerdo, y tales metodos de prueba los conoce bien un experto en la tecnica. Ademas, la dosis de un farmaco usado en el metodo de tratamiento de la presente descripcion lo conoce un experto en la tecnica o puede determinarse apropiadamente mediante las pruebas descritas anteriormente, etc.

La dosis espedfica del principio activo que va a administrarse en el metodo de tratamiento de la presente descripcion descrita en el presente documento puede determinarse teniendo en consideracion diversas condiciones relacionadas con el sujeto que requiere tratamiento, tal como, por ejemplo, la gravedad de los smtomas, el estado de salud general del sujeto, la edad, el peso corporal, el genero del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de administracion, los productos farmaceuticos simultaneos, la sensibilidad al tratamiento, la forma de dosificacion y el cumplimiento del tratamiento.

Los ejemplos de la via de administracion incluyen diversas vfas, incluyendo vfas tanto oral como parenteral, tales como vfas oral, intravenosa, intramuscular, subcutanea, local, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosa, transdermica, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonar e intrauterina.

La frecuencia de administracion depende de las propiedades del agente o la composicion usada y el estado del sujeto, incluyendo los descritos anteriormente, y puede ser una pluralidad de veces al dfa (es decir, dos, tres, cuatro, cinco o mas veces al dfa), una vez al dfa, cada pocos dfas (es decir, cada dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete dfas, etc.), cada semana, cada pocas semanas (es decir, cada dos, tres, cuatro semanas, etc.), etc.

Cuando se usa en el presente documento, el termino "sujeto" significa cualquier individuo biologico y es preferiblemente un animal, mas preferiblemente un mairnfero, y aun mas preferiblemente un individuo humano. En la presente invencion, el sujeto puede estar o bien sano o bien afectado por alguna enfermedad, pero cuando se hace un intento de tratar una enfermedad espedfica, significa normalmente un sujeto afectado por una enfermedad de este tipo o que corre el riego de verse afectado.

Ademas, cuando se usa en el presente documento, el termino "tratamiento" incluye todos los tipos de intervenciones preventivas y/o terapeuticas medicamente permitidas para el fin de curado, remision temporal, prevencion, etc., de una enfermedad. Por ejemplo, el termino "tratamiento" incluye intervenciones medicamente permisibles para diversos tipos de fines incluyendo retraso o detencion del progreso de una enfermedad, realizar una regresion o desaparicion de una lesion, prevenir el inicio o inhibir la reaparicion.

Ejemplos

La presente invencion se explica adicionalmente a continuacion basandose en los ejemplos, pero tales ejemplos son unicamente ilustraciones de la presente invencion y no deben interpretarse como limitativos de la presente invencion.

Ejemplo 1: Efecto de la desactivacion de GST-n sobre la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK

(1) Cultivo celular

Se cultivo la lmea celular de carcinoma de colon positiva para mutacion de K-RAS M7609 en medio RPMI-1640 que contema suero bovino fetal (FBS) al 10 % a 37 °C bajo una atmosfera que contema el 5 % de CO2. Ademas, se anadieron penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 |ig/ml como antibioticos al medio.

(2) Transfeccion de ARNip de GST-n

El d^ a antes de la transfeccion, se sembraron en placa celulas M7609 en una placa de cultivo tisular de 100 mm usando medio RPMI-1640 que contema FBS al 10 % que no contema antibiotico para dar 1 x 106 celulas/10 ml. Se anadieron 600 pmol de ARNip de GST-n (SEQ ID No: 1: GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, ID de ARNip n.° 2385, Ambion) a 1 ml de medio reducido en suero Opti-MEM I (GIBCO) y se mezclo suavemente. Se diluyeron posteriormente 35 |il de Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) en 1 ml de medio reducido en suero Opti-MEM I y se mezclo suavemente. El ARNip de GST-n diluido y la Lipofectamine RNAiMAX diluida se combinaron y mezclaron suavemente, y luego se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Durante este tiempo, se reemplazo el medio por 10 ml de medio reducido en suero Opti-MEM I. Tras los 10 min de incubacion, se anadio el complejo entre ARNip de GST-n y Lipofectamine RNAiMAX a las celulas y se incubo a 37 °C bajo una atmosfera que contema el 5 % de CO2. Tras 5 horas de incubacion, se reemplazo por 10 ml de medio RPMI-1640 que contema FBS al 10 % que no contema antibiotico. Como experimento de control, se repitio el mismo procedimiento usando ARNip revuelto (SEQ ID No: 2: CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, Hokkaido System Science Co., Ltd.). Los dfas 1.°, 2.°, 3.° y 4.° tras la transfeccion con ARNip de GST-n, se conto el numero de celulas, y se examino la desactivacion de GST-n. Se analizo la desactivacion de GST-n mediante un metodo de inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe a continuacion.

(3) Analisis de inmunotransferencia de tipo Western de la desactivacion de GST-n

Se llevo a cabo analisis de inmunotransferencia de tipo Western de la desactivacion de GST-n usando celulas recogidas en cada uno de los puntos de tiempo mencionados anteriormente tras la transfeccion con ARNip de GST-n. Se cultivaron las celulas recogidas durante 16 horas en un medio libre de suero. Tras lavarse las celulas con PBS fno, se anadio a lo mismo tampon de lisis fno (NP-40 al 1 %, Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Mini EDTA-libre completo (Roche), PhosSTOP (Roche), pH 7,5), y se llevo a cabo la solubilizacion incubando durante 30 min mientras se enfriaba con hielo. Se llevo a cabo la centrifugacion a 4 °C y 15000 rpm durante 15 min., dando por tanto un extracto celular. Se sometio el extracto celular asf obtenido a analisis de protemas cuantitativo usando un kit de ensayo de protema Micro BCA (Thermo SCIENTIFIC) (transfectante de ARNip de GST-n: 4,35 |ig/|il, transfectante de ARNip revuelto: 4,56 |ig/|il). Posteriormente, se desnaturalizaron 20 |ig del extracto celular en condiciones reductoras, y se separo la protema llevando a cabo SDS-PAGE usando multi gel II Mini 4/20 (13W) (Cosmo Bio Co., Ltd.). Tras completarse la SDS-PAGE, se llevo a cabo la transferencia a una membrana de PVDF electricamente usando un sistema de transferencia de tipo tanque. Se bloqueo la membrana de transferencia incubando con leche desnatada al 5 %/Tween20 al 0,05 % en PBS (abreviado a PBS-T) a 4 °C durante 16 horas. Posteriormente, se llevo a cabo una reaccion con anticuerpo anti-GST-n diluido con PBS-T (MBL) a 4 °C durante 16 horas. Se llevo a cabo una reaccion de anticuerpo secundario usando anticuerpo de conejo marcado con peroxidasa del rabano (HRP) a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces se llevo a cabo una reaccion con un sustrato quimioluminiscente a temperatura ambiente durante 1 min., y luego se detecto esta quimioluminiscencia usando una pelmula de rayos X. Se llevo a cabo el lavado entre operaciones tres veces mediante agitacion durante 5 min usando PBS-T. Ademas, tras la transfeccion con ARNip, se llevo a cabo la siembra en placa sobre una placa de cultivo tisular de plastico de 60 mm para dar 1,0 x 105 celulas/5 ml, y se midio el recuento de celulas total en la placa usando un hemocitometro hasta el 4.° dfa.

(4) Analisis de inmunotransferencia de tipo Western de la protema implicada en la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK

Se llevo a cabo un analisis de inmunotransferencia de tipo Western para la protema principal implicada en la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK del mismo modo que para (3) anterior usando celulas recogidas el 2.° dfa tras la transfeccion con ARNip de GST-n. Como anticuerpos, ademas de anticuerpo anti-GST-n, se usaron anticuerpo anti-p-Raf-1 (Ser338) (MILLIPORE), anticuerpo anti-Raf-1 (Santa Cruz), anticuerpo anti-p-MEK1/2 (Ser217/221) (Cell Signaling), anticuerpo anti-MEK1/2 (Cell Signaling), anticuerpo anti-p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling), anticuerpo anti-ERK (Cell Signaling) y anticuerpo anti-GAPDH (Abcam).

Los resultados se muestran en las figuras 1 y 2. En la figura 1 a), se observo que la expresion de GST-n se supriirna mediante ARNip de GST-n, pero no se supriirna mediante ARNip revuelto. En la figura 1 b), se encontro que incluso en el punto de tiempo cuando habfan transcurrido 4 dfas tras la transfeccion, la expresion de GST-n se suprimfa todavfa de manera estable mediante ARNip de GST-n y, ademas, en el caso de que se suprima la expresion de GST-n, el numero de celulas tras cultivar durante 4 dfas era notablemente menor que en el caso de ausencia de supresion. Ademas, tambien era evidente a partir de la figura 2 que en el grupo tratado con ARNip de GST-n, la fosforilacion de todas las protemas implicadas en la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK disminuyo en comparacion con el grupo tratado con ARNip revuelto. Queda por tanto claro que, debido a la supresion de la expresion de GST-n, se suprimieron la cascada de senales de RAS/Raf/MAPK y la anomalfa de proliferacion celular.

Ejemplo 2: Efecto de la desactivacion de GST-n sobre la ubiquitinacion

(1) Efecto de la desactivacion de GST-n sobre la ubiquitinacion de Raf-1

Se llevaron a cabo el cultivo de celulas M7609 y la transfeccion con ARNip de GST-n segun los procedimientos del ejemplo 1 (1) y (2).

Del mismo modo que para el ejemplo 1 (3), el 2.° dfa tras la transfeccion de ARNip se llevo a cabo el cultivo durante 16 horas en un medio libre de suero, y se recogio un extracto celular. Se sometio el extracto celular asf obtenido a analisis de protemas cuantitativo usando un kit de ensayo de protemas Micro BCA (ARNip revuelto: 8,88 |ig/|il, ARNip de GST-n: 7,18 |ig/ml). Se mezclaron 0,5 |ig del extracto celular con anticuerpo anti-Raf-1 conjugado con protema G Dynabeads (Invitrogen), se llevo a cabo la incubacion a 4 °C durante 2 horas mientras se mezclaba suavemente en un agitador para aislar asf protema Raf-1, y entonces se llevo a cabo un analisis de inmunotransferencia de tipo Western del mismo modo que para el ejemplo 1 (3) usando un anticuerpo anti-ubiquitina (Santa Cruz). Se investigo la modificacion de la fosforilacion de Ser621, que esta implicada en la inhibicion de la degradacion de Raf-1 por el proteasoma, de la misma manera usando un anticuerpo anti-p-Raf-1 (Ser621) (MILLIPORE).

(2) Efecto del inhibidor del proteosoma sobre la expresion de Raf-1 con desactivacion de GST-n

Se llevaron a cabo el cultivo de celulas M7609 y la transfeccion con ARNip de GST-n segun los procedimientos del ejemplo 1 (1) y (2). El 2.° dfa tras la transfeccion de ARNip de GST-n, se llevo a cabo el cultivo durante 16 horas en un medio libre de suero. Tras tratar con MG1325 |iM durante 4 horas, se recogio un extracto celular. Como control para el tratamiento con MG132, se llevo a cabo el tratamiento con DMSO al 0,05 % de la misma manera. Se sometio el extracto celular asf obtenido a analisis de protemas cuantitativo usando un kit de ensayo de protemas Micro BCA Protein (grupo tratado con ARNip revuelto-DMSO: 3,36 |ig/|il, grupo tratado con ARNip revuelto-MG132: 3,16 |ig/|il, grupo tratado con ARNip de GST-n-DMSO: 3,12 |ig/|il, grupo tratado con ARNip de GST-n-MG132: 3,16 |ig/|il). Se sometieron 20 |ig del extracto celular a SDS-PAGE, y luego se llevo a cabo analisis de inmunotransferencia de tipo Western del mismo modo que para el ejemplo 1 (3) usando un anticuerpo anti-p-Raf-1 (Ser338) y un anticuerpo anti-Raf-1.

(3) Coinmunoprecipitacion de p-Raf-1 y GST-n

Se llevo a cabo el cultivo de celulas M7609 segun el procedimiento del ejemplo 1 (1). Posteriormente, despues de que las celulas con GST-n desactivada obtenidas mediante el procedimiento del ejemplo 1 (2) se lavaran con PBS fno, se anadio un tampon de coinmunoprecipitacion fno (NP-40 al 0,5%, HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, MgCl21,5 mM, Mini EDTA-libre completo, PhosSTOP, pH 7,5), y se llevo a cabo la solubilizacion incubando durante 30 min mientras se enfriaba con hielo. Se llevo a cabo la centrifugacion a 4 °C y 15000 rpm durante 15 min., dando por tanto un extracto celular. Se sometio el extracto celular asf obtenido a analisis de protemas cuantitativo usando un kit de ensayo de protemas Micro BCA (12,1 |ig/|il). Se mezclo 1 mg del extracto celular con anticuerpo anti-p-Raf-1 (Ser338) (US Biological) conjugado con protema G Dynabeads, y se llevo a cabo la incubacion a 4 °C durante 16 horas mientras se mezclaba suavemente en un agitador, llevando a cabo por tanto la coinmunoprecipitacion. Posteriormente, se llevo a cabo un analisis de inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpo anti-GST-n.

Los resultados se muestran en las figuras 3 a 5. Quedaba claro a partir de la figura 3 que en el grupo tratado con ARNip de GST-n la cantidad de ubiquitina coprecipitada con Raf-1 era grande en comparacion con el grupo tratado con ARNip revuelto, y se potencio la ubiquitinacion de Raf-1. Ademas, puede observarse a partir de la figura 4 que el proteasoma estaba implicado en la reduccion de la expresion de p-Raf-1 por ARNip de GST-n, y puede observarse a partir de la figura 5 que GST-n estaba unido a p-Raf-1. Los resultados anteriores sugieren que GST-n se une a p-Raf-1 para inhibir por tanto su ubiquitinacion, y debido a la supresion de GST-n, se promueve la ubiquitinacion de p-Raf-1, y se reduce la abundancia de p-Raf-1.

Ejemplo 3: Analisis de induccion de autofagia y apoptosis mediante desactivacion de GST-n

(1) Analisis de induccion de autofagia mediante tincion de inmunofluorescencia

Se analizo la induccion de autofagia mediante desactivacion de GST-n mediante tincion de inmunofluorescencia con LC3, que es una protema marcadora espedfica de autofagia. Se sembraron en placa celulas con desactivacion de GST-n obtenidas mediante el procedimiento del ejemplo 1 (2) sobre un cubreobjetos colocado en una placa de cultivo tisular de plastico de 35 mm para dar 1 x 105 celulas/2 ml. Tras aspirarse el medio, se anadio paraformaldelddo al 4 % en PBS, y se llevo a cabo la incubacion a temperatura ambiente durante 10 min, fijando por tanto las celulas. Se llevo a cabo la permeabilizacion de las celulas usando Triton X-100 al 0,5 % en PBS sobre hielo durante 5 min. Tras lavar con PBS fno durante 10 min, se llevo a cabo una reaccion con anticuerpo anti-LC3B (Invitrogen) diluido con PBS que contema BSA al 1 % dentro de una camara de humedad a 37 °C durante 1 hora. Se llevo a cabo una reaccion de anticuerpo secundario usando anticuerpo de conejo marcado con Alexa Fluor488 (Invitrogen) a 37 °C durante 1 hora. Se llevo a cabo el montaje sobre un portaobjetos de vidrio usando un reactivo antidesvanecimiento Prolong Gold con DAPI, y se llevo a cabo la incubacion a 4 °C durante 16 horas. Se llevo a cabo el lavado tras la reaccion de los anticuerpos tres veces usando PBS a 37 °C durante 5 min. Se definieron las celulas positivas para autofagia en el momento del examen con un microscopio de fluorescencia como las celulas que teman una senal de LC3 similar a un punto presente en el citoplasma.

(2) Analisis de induccion de autofagia mediante inmunotransferencia de tipo Western

Se analizo adicionalmente la induccion de autofagia en celulas con GST-n desactivada mediante un analisis de inmunotransferencia de tipo Western de LC3. Se sembraron en placa celulas con GST-n desactivada obtenidas mediante el procedimiento del ejemplo 1 (2) sobre un cubreobjetos colocado en una placa de cultivo tisular de plastico de 35 mm para dar 1 x 105 celulas/2 ml. Tras incubar durante un tiempo predeterminado, se recogio un extracto celular y se sometio a analisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se llevo a cabo una reaccion con una membrana de transferencia a 4 °C durante 16 horas usando anticuerpo anti-LC3B (SIGMA) como anticuerpo primario. Se llevo a cabo la deteccion de moleculas de LC3 usando un reactivo quimioluminiscente tras una reaccion con anticuerpo secundario marcado con HRP. Si se indujo autofagia o no se evaluo mediante un desplazamiento de LC3 de tipo I (18 kDa) a tipo II (16 kDa).

(3) Analisis de induccion de autofagia mediante examen con microscopio electronico

El 1.° dfa tras la transfeccion de ARNip en el ejemplo 1 (2), se sembraron en placa las celulas sobre un portaobjetos de cultivo de 8 pocillos para cultivo tisular para dar 0,4 x 105 celulas/0,5 ml. Se llevo a cabo fijacion usando glutaraldetndo al 2,5 % en tampon de acido cacodflico 0,1 M (pH 7,4) durante 1 hora, y tras enjuagar con tampon de acido cacodflico 0,1 M se llevo a cabo la fijacion posterior usando OsO4 al 1 % y ferrocianuro de potasio al 1,5 % durante 2 horas. Tras llevarse a cabo la deshidratacion tres veces con etanol durante 10 min, se llevo a cabo la incrustacion en una resina epoxfdica (TAAB Laboratories Equipment). Se preparo una seccion ultrafina usando una cuchilla de diamante, se llevo a cabo la tincion electronica usando acetato de uranilo y citrato de plomo, y se examino la seccion usando un microscopio electronico (microscopio electronico de transmision Hitachi H-7500, Hitachi High-Technologies Corporation).

(4) Analisis de induccion de apoptosis mediante tincion TUNEL

Se llevo a cabo un metodo de TUNEL tal como sigue usando un kit de deteccion de muerte celular in situ, POD (Roche). Se sembraron en placa celulas con GST-n desactivada obtenidas mediante el procedimiento del ejemplo 1 (2) sobre un cubreobjetos colocado en una placa de cultivo tisular de plastico de 35 mm para dar 1 x 105 celulas/2 ml. Tras aspirarse el medio, se anadio paraformaldetndo al 4 % en PBS, y se llevo a cabo la incubacion a temperatura ambiente durante 60 min, fijando por tanto las celulas. Con el fin de llevar a cabo el bloqueo de la peroxidasa endogena, se llevo a cabo la incubacion con H2O2 al 3 % en metanol a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente, se llevo a cabo la permeabilizacion de las celulas mediante tratamiento con Triton X-100 al 0,1 % en citrato de sodio al 0,1 % sobre hielo durante 2 min. Se llevo a cabo la reaccion de TUNEL en una camara de humedad a 37 °C durante 60 min. Se llevo a cabo la deteccion de celulas positivas para TUNEL mediante una reaccion de coloracion usando un sustrato de DAB tras hacer reaccionar un anticuerpo anti-fluorescema marcado con peroxidasa a 37 °C durante 30 min. Se llevo a cabo la contratincion usando hematoxilina, se examinaron las celulas tenidas bajo un microscopio optico y se evaluaron las celulas positivas para TUNEL como celulas apoptoticas. Se llevo a cabo el lavado entre las operaciones aclarando con PBS.

Los resultados se muestran en las figuras 6 a 10. La figura 6 es una imagen de tincion de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-LC3, y en las celulas mostradas mediante flechas se observo una senal similar a un punto que muestra LC3. Puesto que esta senal de LC3 similar a un punto sena un autofagosoma, puede observarse que en las celulas con GST-n desactivada se indujo autofagia.

La figura 7 muestra imagenes del examen con microscopio electronico de las celulas con GST-n KD 2 dfas tras la transfeccion de ARNip de GST-n. La imagen a mano derecha es una ampliacion de la parte A rodeada por un recuadro en la imagen a mano izquierda. En la imagen a mano derecha, puede observarse que en las partes mostradas mediante flechas, se formo un autofagosoma que rodeaba la mitocondria.

La figura 8 muestra los resultados de la inmunotransferencia de tipo Western de LC3. Hay dos tipos de protema LC3 que reconoce un anticuerpo anti-LC3. Cuando se produce autofagia y se incorpora LC3 en una membrana lipfdica doble, LC3 cambia del tipo I al tipo II. Por tanto, es posible confirmar si se ha inducido o no autofagia a partir de un cambio en la cantidad de LC3 de tipo II detectada. A partir del resultado de la figura 8, puede observarse que en el grupo tratado con ARNip de GST-n, se indujo la expresion de LC3 tanto de tipo I como de tipo II y el tipo II estaba notablemente aumentado, mientras que en el grupo tratado con ARNip revuelto, la expresion era baja para tanto el tipo I como el tipo II y el nivel de expresion del tipo I era inferior al del tipo II.

A partir de estos resultados, puede observarse que se induce autofagia suprimiendo la expresion de GST-n.

La figura 9 muestra el resultado de tincion TUNEL. La fila superior muestra imagenes del grupo tratado con ARNip revuelto, la fila inferior muestra imagenes del grupo tratado con ARNip de GST-n; en las celulas en las que se desactivo GST-n, se observaron celulas positivas para TUNEL, es decir, apoptosis.

La figura 10 es un grafico que muestra el cambio a lo largo del tiempo de las proporciones de celulas positivas para autofagia y celulas positivas para apoptosis en el grupo tratado con ARNip de GST-n y el grupo tratado con ARNip revuelto. La proporcion de celulas positivas para autofagia indica la proporcion de celulas que tienen una senal de LC3 similar a un punto por 500 celulas en el experimento de tincion de inmunofluorescencia usando el anticuerpo anti-LC3 en (1) anterior, y la proporcion de celulas positivas para apoptosis indica la proporcion de celulas positivas para TUNEL por 1000 celulas en el experimento de tincion TUNEL en (4) anterior. Puede observarse a partir de esto que la proporcion de celulas positivas para autofagia aumento rapidamente tras el tratamiento, alcanzo un pico el 2.° dfa y luego disminuyo, mientras que la proporcion de celulas positivas para apoptosis aumento de manera gradual pero continua hasta el 4.° dfa.

Ejemplo 4: Efecto de la desactivacion de GST-n sobre la cascada de senales de EGFR/PI3K/Akt/mTOR

(1) Analisis de inmunotransferencia de tipo Western de la senal de EGFR/PI3K/Akt/mTOR

Se analizo la expresion de cada protema que constituye la cascada de senales de EGFR/PI3K/Akt/mTOR del mismo modo que para el ejemplo 1 (1), (2) y (4) excepto porque, como anticuerpos primarios, se usaron anticuerpo anti-p-EGFR (Tyr1068) (Cell Signaling), anticuerpo anti-EGFR (Santa Cruz), anticuerpo anti-p-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) (Cell Signaling), anticuerpo anti-PI3K, p85 (MILLIPORE), anticuerpo anti-p-Akt (Ser473) (Cell Signaling), anticuerpo anti-Akt (Cell Signaling), anticuerpo anti-p-p70S6K (Thr389) (Cell Signaling), anticuerpo anti-p-p70S6K (Thr421/Ser424) (Cell Signaling) y anticuerpo anti-p70S6K (Cell Signaling).

(2) Efecto del inhibidor del proteosoma sobre la expresion de p-EGFR con desactivacion de GST-n

Se llevaron a cabo el cultivo de celulas M7609 y la transfeccion con ARNip de GST-n segun los procedimientos del ejemplo 1 (1) y (2). El 2.° dfa tras la transfeccion con ARNip de GST-n, se cultivaron las celulas en medio libre de suero durante 16 horas. Tras el tratamiento con MG1325 |iM durante 2 horas, se recogio un extracto celular. Como control para el tratamiento con MG132, se llevo a cabo tratamiento con DMSO al 0,05 % de la misma manera. Se sometio el extracto celular asf obtenido a analisis de protemas cuantitativo usando un kit de ensayo de protemas Micro BCA (grupo tratado con ARNip revuelto-DMSO: 11,98 |ig/|il, grupo tratado con ARNip revuelto-MG132: 12,29 |ig/|il, grupo tratado con ARNip de GST-n-DMSO: 8,91 |ig/|il, grupo tratado con ARNip de GST-n-MG132: 9,24 |ig/|il). Tras someterse 80 |ig del extracto celular a SDS-PAGE, se llevo a cabo un analisis de inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpo anti-p-EGFR (Tyr1068) y anticuerpo anti-EGFR.

(3) Coinmunoprecipitacion de p-EGFR y GST-n

Se llevo a cabo el cultivo de las celulas M7609 segun el procedimiento del ejemplo 1 (1). Posteriormente, tras lavarse las celulas con PBS fno, se anadio un tampon de coinmunoprecipitacion fno (Triton X-100 al 1,0 %, Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Mini EDTA-libre completo, PhosSTOP, pH 7,5), y se llevo a cabo la solubilizacion incubando durante 30 min mientras se enfriaba con hielo. Se llevo a cabo la centrifugacion a 4 °C y 12000 rpm durante 10 min, dando por tanto un extracto celular. Se sometio el extracto celular asf obtenido a analisis de protemas cuantitativo usando un kit de ensayo de protemas Micro BCA (9,08 |ig/|il). Se mezclo 1 mg del extracto celular con anticuerpo anti-p-EGFR (Tyr1068) (Calbiochem) conjugado con protema G Dynabeads, y se llevo a cabo la coinmunoprecipitacion incubando en un agitador a 4 °C durante 16 horas mientras se mezclaba suavemente. Se llevo a cabo posteriormente un analisis de inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpo anti-GST-n. Los resultados se muestran en las figuras 11 a 13. La figura 11 muestra que en el grupo tratado con ARNip de GST-n la fosforilacion de cada protema que constituye la cascada de senales de EGFR/PI3K/Akt/mTOR se redujo en comparacion con el grupo tratado con ARNip revuelto, la figura 12 muestra que esta implicado el proteasoma en la reduccion de la expresion de p-EGFR por ARNip de GST-n, y la figura 13 muestra que GST-n se une a p-EGFR. Los resultados anteriores sugieren que GST-n se une a p-EGFR contribuyendo por tanto a la estabilizacion del mismo, se promueve la ubiquitinacion de p-EGFR mediante la supresion de GST-n y la abundancia de p-EGFR disminuye.

Ejemplo 5: Efecto del inhibidor de GST-n sobre la proliferacion celular, etc.

(1) Efecto del inhibidor de GST-n sobre la fosforilacion de EGFR y Raf-1

Se llevo a cabo el cultivo de celulas M7609 segun el procedimiento del ejemplo 1 (1). Se sembraron en placa las celulas sobre una placa de cultivo tisular de plastico de 60 mm para dar 4,0 x 105 celulas/5 ml. Se anadio el inhibidor de GST-n C16C2 (preparado por Teijin Pharma Limited a peticion) para dar 10, 50 y 100 |iM, y tras 24 horas se recogio un extracto celular. Se sometio el extracto celular asf obtenido a analisis de protemas cuantitativo usando un kit de ensayo de protemas Micro BCA (no tratado: 8,5 |ig/|il, 10 |il: 8,49 |ig/|il, 50 |iM: 7,68 |ig/|il, 100 |iM: 6,4 |ig/|il).

Claims

REIVINDICACIONES