ES2548146T3 - Secuencias de circovirus asociado con la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP) - Google Patents

Secuencias de circovirus asociado con la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP) Download PDF

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Abstract

1. Procedimiento para la detección y/o identificación en una muestra biológica de un circovirus MAP de tipo B, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto dicha muestra biológica con un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 90% con la secuencia SEC ID Nº 12 y que se corresponde con el ORF'2 de un circovirus de tipo B, comprendiendo dicho polipéptido un epítopo específico del circovirus MAP de tipo B presentado mediante al menos un polipéptido seleccionado entre la SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19 y SEC ID Nº 20, y b) detectar los complejos antígeno-anticuerpo formados eventualmente.

Description

Secuencias de circovirus asociado con la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP)
La invención se refiere a procedimientos de detección de polipéptidos, a kits de diagnóstico de infecciones por el circovirus MAP de tipo B. La descripción tiene por objeto la secuencia genómica y las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos del circovirus MAP, tales como los polipéptidos estructurales y no estructurales de dicho circovirus, así como los vectores que incluyen dichas secuencias y células o animales transformados con dichos vectores. La descripción se refiere a procedimientos de detección de dichos ácidos nucleicos. La invención se refiere finalmente a anticuerpos monoclonales y policlonales que pueden reconocer de forma específica los polipéptidos aislados que tienen las secuencias SEC. ID Nº 17-20.
La invención se refiere a los procedimientos de detección y/o identificación de un circovirus MAP de tipo B en una muestra biológica, que comprende un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia SEC. ID Nº 12 y que corresponde a un ORF’2 de un circovirus de tipo B, comprendiendo dicho polipéptido un epítopo específico de un circovirus MAP de tipo B presentado por al menos un polipéptido seleccionado entre SEC. ID Nº 17, SEC. ID Nº 18, SEC. ID Nº 19, y SEC. ID Nº 20, y la detección de los complejos antígeno-anticuerpo eventualmente formados.
La invención se refiere además a kits de diagnóstico de una infección por circovirus MAP de tipo B es una muestra biológica, que comprende un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia SEC. ID Nº 12 y que corresponde a un ORF’2 de un circovirus de tipo B, comprendiendo dicho polipéptido un epítopo específico de un circovirus MAP de tipo B presentado por al menos un polipéptido seleccionado entre SEC. ID Nº 17, SEC. ID Nº 18, SEC. ID Nº 19, y SEC. ID Nº 20, y la detección de los complejos antígeno-anticuerpo eventualmente formados
La memoria descriptiva se refiere también a un método de selección de compuestos que puedan modular la infección vírica. La memoria descriptiva comprende finalmente composiciones farmacéuticas, especialmente vacunales, para la prevención y/o el tratamiento de infecciones víricas por circovirus MAP así como el uso de un vector de acuerdo con la descripción para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades mediante terapia génica.
Se ha descrito ampliamente la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP) o también denominada decaimiento fatal del lechón (DFP) en América del Norte (Harding, J.C., 1997), y unos autores han relatado la existencia de una relación entre esta patología y la presencia de circovirus porcino (Daft, B. et al., 1996; Clark, E.G., 1997; Harding, J.C., 1997; Harding, J.C. y Clark, E.G., 1997; Nayar, G.P. et al., 1997). Ya se ha demostrado un circovirus porcino en unos cultivos celulares derivados del cerdo establecidos en línea e infectados crónicamente (Tischer, I., 1986, 1988, 1995; Dulac, G.C., 1989; Edwards, S., 1994; Allan, G.M., 1995 y McNeilly, F., 1996). Este virus, durante una infección experimental de lechones, no resultaba ser patógeno para el cerdo (Tischer, I., 1986, Homer, G.W., 1991) y se ha determinado y caracterizado su secuencia nucleotídica (Tischer, I., 1982; Meehan, B. M. et al., 1997; Mankertz, A., 1997). El circovirus porcino, denominado virus PCV, pertenece al género circovirus de la familia de los circoviridae (Murphy, F.A. et al., 1995) cuyo virión posee un ADN circular de tamaño comprendido entre 1,7 y 2,3 kb, ADN que comprende 3 marcos abiertos de lectura (ORF1 a ORF3), que codifica para una proteína de replicación REP implicada en la fase de iniciación y de terminación de la replicación circular desarrolladora (RCR) (Heyraud-Nitschke, F., et al., 1995; Harding, M.R. et al., 1993; Hanson, S.F. et al., 1995; Fontes, E.P.B. et al., 1994), que codifica para una proteína de cápside (Boulton, L.H. et al., 1997; Hackland, A.F. et al., 1994; Chu P.W.G. et al., 1993) y que codifica para una proteína no estructural denominada de diseminación (Lazarowitz, S.G. et al., 1989).
Los autores de la presente invención han observado que las manifestaciones clínicas perceptibles en el cerdo y relacionadas con la infección por el circovirus MAP, están muy individualizadas. Estas manifestaciones aparecen en general en unos cerdos de 8 a 12 semanas de edad, destetados desde 4 a 8 semanas. Las primeras señales son la hipotonía sin que se llegue a hablar de postración. Rápidamente (48 horas) los flancos se ahuecan, se marca la línea de la espalda, los cerdos “blanquean”. Estas señales se acompañan en general de hipertermia, de anorexia y lo más frecuentemente de manifestaciones respiratorias (tos, disnea, polipnea). Pueden aparecer asimismo unas diarreas transitorias. La fase de estado de la enfermedad tarda aproximadamente un mes al final del cual los porcentajes de mortalidad varían de 5 a 20%. A estas mortalidades conviene añadir una proporción variable (5-10%) de animales cadavéricos que ya no pueden presentar ningún futuro económico. Se debe observar que fuera de este estado crítico de fin de post-destetado, no aparece ninguna anomalía en las ganaderías. En particular, la función de reproducción se mantiene perfectamente.
En el plano epidemiológico, las primeras manifestaciones de esta patología han aparecido a principios de 1995 en el Este del departamento de las Côtes d'Armor en Francia, y las ganaderías afectadas se han acantonado sobre todo en esta zona del departamento. En diciembre de 1996, no se puede evaluar con precisión el número de ganaderías afectadas debido a la ausencia de un método de diagnóstico específico en laboratorio ni un dispositivo de epidemiovigilancia del ganado. Basándose en los hechos clínicos así como en los resultados de exámenes necrópsicos suministrados por los veterinarios, se puede estimar este número en varias decenas (80-100). La contagiosidad de la enfermedad es baja a moderada. Se han señalado unos casos fuera de la zona inicial y son el
resultado en su mayoría de la transferencia de animales procedentes de ganaderías que conocen el problema. Sin embargo, una particularidad de la afección es su alta persistencia. Así, unas ganaderías afectadas desde hace un año están todavía afectadas a pesar de la aplicación masiva de terapéuticos. Las ganaderías con expresión clínica se reclutan en las diferentes categorías de especialización (crías-cebadores, post-destetados-cebadores) y diferentes estructuras económicas están afectadas. Por otro lado, los trastornos aparecen incluso en unas ganaderías en las que se respetan las reglas de zootecnia.
Se han realizado numerosos exámenes necrópsicos o bien en las ganaderías o bien en el laboratorio. Los elementos de la tabla relativa a las lesiones son disparatados. Las lesiones macroscópicas más constantes son la neumonía que se presenta a veces en cuadrícula, así como una hipertrofia de los ganglios linfáticos. Las demás lesiones se refieren sobre todo a las vísceras torácicas incluyendo en particular la pericarditis y la pleuresía. Pero se observan asimismo unas artritis y unas úlceras gástricas. Las lesiones reveladas en el examen histológico se sitúan esencialmente a nivel pulmonar (neumonía intersticial), ganglionar (depleción linfoide de los nudos linfáticos, células gigantes) y renal (glomerulonefritis, vascularitis). Los agentes infecciosos han sido objeto de amplias investigaciones. Se ha podido excluir la intervención de los pestivirus y de la enfermedad de Aujeszky. Los trastornos aparecen en los ganados SDRP (síndrome disgenésico y respiratorio porcino, infección relacionada con un arteriovirus) seropositivos, pero no se ha podido establecer la función de este último en la génesis de los trastornos (la mayoría de las ganaderías de Bretaña son SDRP seropositivas).
Los autores de la presente invención, con el objetivo de identificar el agente etiológico responsable de la MAP, han realizado unas pruebas de “contacto” entre lechones manifiestamente “enfermos” y unos cerdos EOPS (Exentos de Organismos Patógenos Específicos) del CNEVA (Centro Nacional de Estudios Veterinarios y Alimenticios, Francia). Estas pruebas han permitido observar el desarrollo en los animalarios protegidos de las manifestaciones comparables con las observadas en ganaderías. Las manifestaciones discretas tales como la hipertermia moderada, la anorexia y la diarrea intermitente, han aparecido después de una semana de contacto. Se debe observar que el virus SDRP únicamente se ha difundido posteriormente a las manifestaciones clínicas. Por otro lado, unas inoculaciones de triturados de órganos de animales enfermos a unos cerdos sanos ha permitido reproducir unas manifestaciones parecidas a las observadas en las ganaderías, con, sin embrago, una incidencia menos fuerte relacionada con las condiciones favorables de mantenimiento de los animales en las instalaciones experimentales.
Así, los autores de la presente invención han podido demostrar que las manifestaciones patológicas se presentan como una entidad bien definida que afecta al cerdo en un estadio particular de su crecimiento.
No se ha descrito nunca esta patología en Francia. Sin embargo, unas informaciones dispersas en particular canadienses relatan unos hechos parecidos.
Los trastornos no se pueden controlar mediante las terapias existentes.
Los datos recogidos tanto en ganaderías como en experimentaciones han permitido resaltar los siguientes puntos:
-
la enfermedad MAP es transmisible pero su contagiosidad es poco elevada, -su origen etiológico es de naturaleza infecciosa y probablemente vírica, -la enfermedad MAP presenta un carácter persistente en las ganaderías afectadas.
Se desprenden de ello unas consecuencias económicas considerables para las ganaderías.
Así, una necesidad importante en la actualidad se refiere a un diagnóstico específico y sensible, de realización práctica y rápida, que permite la detección precoz de la infección. Se desea, por lo tanto, una prueba fiable, sensible y práctica, que permita la distinción entre las cepas de circovirus porcino (PCV).
Por otro lado, una necesidad de tratamiento eficaz, y bien tolerado de las infecciones por circovirus MAP sigue siendo asimismo deseado, al no estar disponible en la actualidad ninguna vacuna contra el circovirus MAP.
Tratándose del circovirus MAP, se necesitará probablemente comprender el papel de la defensa inmunitaria en la fisiología y la patología de la enfermedad para desarrollar unas vacunas satisfactorias.
Una información más amplia referente a la biología de estas cepas, sus interacciones con sus hospedadoras, los fenómenos de infectividad asociados y los de escapatoria a las defensas inmunitarias del hospedador en particular, y por último su implicación en el desarrollo de las patologías asociadas, permitirá una mejor comprensión de estos mecanismos. Teniendo en cuenta lo anterior, y que muestra en particular las limitaciones de los medios de lucha contra la infección por el circovirus MAP, es por lo tanto primordial en la actualidad por un lado desarrollar unas herramientas moleculares, en particular a partir de un mejor conocimiento genético del circovirus MAP, pero también elaborar nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos, nuevos métodos de diagnóstico y nuevas estrategias vacunales específicas, eficaces y toleradas. Esto constituye precisamente el objetivo de la presente invención.
La presente descripción tiene por objeto las secuencias nucleotídicas del genoma de circovirus MAP seleccionadas de entre las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, o uno de sus fragmentos.
Las secuencias nucleotídicas de secuencias SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2 corresponden respectivamente a la secuencia genómica nucleotídica de la Hebra de polaridad (+) y de la Hebra de polaridad (-) del circovirus MAP de tipo A (o PCVA), estando la secuencia SEC ID nº 2 representada según la orientación 5' → 3'.
Las secuencias nucleotídicas de secuencias SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10 corresponden respectivamente a la secuencia genómica de la Hebra de polaridad (+) y de la Hebra de polaridad (-) del circovirus MAP de tipo B (PCVB), estando la secuencia SEC ID nº 10 representada según la orientación 5' → 3'.
La presente descripción tiene asimismo por objeto unas secuencias nucleotídicas caracterizadas porque se seleccionan de entre:
a) una secuencia nucleotídica de fragmento específico de una secuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10 o uno de sus fragmentos; b) una secuencia nucleotídica homóloga a una secuencia nucleotídica tal como la definida en a); c) una secuencia nucleotídica complementaria de una secuencia nucleotídica tal como la definida en a) o b), y una secuencia nucleotídica de su ARN correspondiente; d) una secuencia nucleotídica capaz de hibridarse en unas condiciones rigurosas con una secuencia tal como la definida en a), b) o c); e) una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia tal como la definida en a), b), c) o d); y f) una secuencia nucleotídica modificada de una secuencia nucleotídica tal como la definida en a), b), c), d) o e).
Mediante la expresión secuencia nucleotídica, polinucleótido o ácido nucleico” se entiende, según la presente descripción, tanto un ADN bicatenario como monocaternario en unas formas monoméricas y diméricas (denominadas en tándem) como unos productos de transcripción de dichos ADN.
Se debe comprender que la presente descripción no se refiere a las secuencias nucleotídicas genómicas consideradas en su ambiente natural, es decir en el estado natural. Se trata de secuencias que han podido ser aisladas, purificadas o parcialmente purificadas, a partir de métodos de separación tales como por ejemplo la cromatografía por intercambio de iones, por exclusión basada en el tamaño molecular, o por afinidad, o también las técnicas de fraccionamiento basadas en la solubilidad en diferentes disolventes, o a partir de métodos de ingeniería genética tales como la amplificación, la clonación y la sub-clonación, pudiendo las secuencias de la descripción estar llevadas por vectores.
Las secuencias nucleotídicas SEC ID nº 1 y SEC ID nº 9 han sido obtenidas mediante secuenciación del genoma por el método de Sanger.
Mediante la expresión “fragmento de secuencia nucleotídica” según la descripción, se entenderá designar cualquier fragmento nucleotídico del circovirus MAP, de tipo A o B, de longitud de por lo menos 8 nucleótidos, preferentemente por lo menos 12 nucleótidos, y más preferentemente por lo menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de la cual procede.
Mediante la expresión “fragmento específico de secuencia nucleotídica” según la descripción, se entenderá designar cualquier fragmento nucleotídico del circovirus MAP, de tipo A o B, que presenta, después de la alineación y de la comparación con los fragmentos correspondientes del circovirus porcino conocido, por lo menos un nucleótido o base de naturaleza diferente. Por ejemplo, los fragmentos nucleotídicos específicos de circovirus MAP de tipo A se pueden determinar fácilmente haciendo referencia a la figura 3 de la presente descripción en la que se ponen en evidencia los nucleótidos o bases de la secuencia SEC ID nº 1 (circopordfp) que son de naturaleza diferente, después de la alineación de dicha secuencia SEC ID nº 1 con las otras dos secuencias de circovirus porcino conocidas (circopormeeh y circopormank).
Mediante la expresión “secuencia nucleotídica homóloga” en el sentido de la presente descripción, se entiende una secuencia nucleotídica que presenta por lo menos un porcentaje de identidad con las bases de una secuencia nucleotídica según la descripción de por lo menos 80%, preferentemente 90% y 95%, siendo este porcentaje puramente estadístico y pudiendo las diferencias entre las dos secuencias nucleotídicas ser repartidas al azar y sobre toda su longitud.
Mediante la expresión “secuencia nucleotídica homóloga específica” en el sentido de la presente descripción, se entiende una secuencia nucleotídica homóloga que presenta por lo menos una secuencia nucleotídica de fragmento específico, tal como se ha definido anteriormente. Dichas secuencias homólogas “específicas” pueden comprender, por ejemplo, las secuencias que corresponden a la secuencia genómica o a las secuencias de sus fragmentos representativos de variantes de circovirus MAP de tipo A o B. Así, estas secuencias homólogas específicas pueden corresponder a unas variaciones relacionadas con unas mutaciones en el seno de las cepas de circovirus MAP de tipo A o B, y corresponder en particular a unos truncamientos, a unas sustituciones, a unas deleciones y/o a unas adiciones de por lo menos un nucleótido. Dichas secuencias homólogas pueden corresponder asimismo a unas variaciones relacionadas con la degeneración del código genético.
En la presente descripción, se entenderá designar mediante circovirus MAP, los circovirus asociados con la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP) de tipo A (PCVA) o de tipo B (PCVB), definidos a continuación por
su secuencia genómica, así como los circovirus cuyas secuencias nucleicas son homólogas a las secuencias de los circovirus MAP de tipo A o B, tales como en particular los circovirus que corresponden a unas variantes de tipo A o de tipo B.
Mediante la expresión “secuencia nucleotídica complementaria de una secuencia de la descripción”, se entiende cualquier ADN cuyos nucleótidos son complementarios de los de la secuencia de la descripción, y cuya orientación está invertida (secuencia antiparalela).
Mediante la expresión “hibridación en unas condiciones de rigor con una secuencia nucleotídica según la descripción”, se entiende una hibridación en unas condiciones de temperatura y de fuerza iónica elegidas de tal manera que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementarios.
A título ilustrativo, unas condiciones de fuerte rigor de la etapa de hibridación con el fin de definir los fragmentos nucleotídicos descritos anteriormente, son ventajosamente las siguientes.
La hibridación se realiza a una temperatura preferida de 65ºC en presencia de tampón SSC, 1 x SSC que corresponde a 0,15 M de NaCl y 0,05 M de citrato de Na. Las etapas de lavado pueden ser por ejemplo las siguientes:
-
2 x SSC, a temperatura ambiente seguido de 2 lavados a 2 x SSC, 0,5% SDS a 65ºC; 2 x 0,5 x SSC, 0,5% SDS; a 65ºC durante 10 minutos cada uno.
Las condiciones de rigor intermedia, usando por ejemplo una temperatura de 42ºC en presencia de un tampón 2 x SSC, o de baja rigor, por ejemplo una temperatura de 37ºC en presencia de un tampón 2 x SSC, requieren respectivamente para la hibridación entre las dos secuencias una complementariedad global lo menos importante.
Las condiciones rigurosas de hibridación descritas anteriormente para un polinucleótido de tamaño de aproximadamente 350 bases, serán adaptadas por el experto en la materia para unos oligonucleótidos de tamaño más grande o más pequeño, según las enseñanzas de Sambrook et al, 1989.
Entre las secuencias nucleotídicas según la descripción, se prefieren asimismo las que se pueden utilizar como cebador o sonda en unos métodos que permiten obtener las secuencias homólogas según la descripción, siendo estos métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la clonación y la secuenciación de ácido nucleotídico bien conocidos por el experto en la materia.
Entre dichas secuencias nucleotídicas según la descripción, se prefieren también las que se pueden utilizar como cebador o sonda en unos métodos que permiten diagnosticar la presencia de circovirus MAP o una de sus variantes tales como las definidas a continuación.
Se prefieren asimismo las secuencias nucleotídicas según la descripción capaces de modular, de inhibir o de inducir la expresión de gen de circovirus MAP, y/o capaces de modular el ciclo de replicación de circovirus MAP en la célula y/o el organismo hospedadora. Se entenderá designar por ciclo de replicación, la invasión, la multiplicación de circovirus MAP, y su propagación células hospedadoras a células hospedadoras en el organismo hospedadora.
De entre dichas secuencias nucleotídicas según la descripción, se prefieren por último las que corresponden a unos marcos abiertos de lectura, denominados secuencias ORF (ORF por “open reading frame”), y que codifican para unos polipéptidos, tales como, por ejemplo, las secuencias SEC ID nº 3 (ORF1), SEC ID nº 4 (ORF2) y SEC ID nº 5 (ORF3), que corresponden respectivamente a las secuencias nucleotídicas comprendidas entre las posiciones 47 a 985 determinadas con respecto a la posición de los nucleótidos en la secuencia SEC ID nº 1, las posiciones 1723 a 1022 y las posiciones 658 a 38 con respecto a la posición de los nucleótidos en la secuencia SEC ID nº 2 (representada según la orientación 3' → 5'), estando incluidos los extremos, o también las secuencias SEC ID nº 11 (ORF'1), SEC ID nº 12 (ORF'2) y SEC ID nº 13 (ORF'3), que corresponden respectivamente a las secuencias comprendidas entre las posiciones 51 a 995 determinadas con respecto a la posición de los nucleótidos en la secuencia SEC ID nº 9, las posiciones 1734 a 1033 y las posiciones 670 a 357, estando las posiciones determinadas con respecto a la posición de los nucleótidos en la secuencia SEC ID nº 10 (representada según la orientación 3' → 5'), estando incluidos los extremos.
Los fragmentos de secuencia nucleotídica según la descripción se pueden obtener, por ejemplo, mediante amplificación específica, tal como la PCR, o después de la digestión mediante unas enzimas de restricción apropiadas de secuencias nucleotídicas según la descripción; estos métodos se describen en particular en los trabajos de Sambrook et al., 1989. Dichos fragmentos representativos se pueden obtener asimismo mediante síntesis química cuando su tamaño no es demasiado importante y según unos métodos bien conocidos por el experto en la materia.
Mediante la expresión secuencia nucleotídica modificada se entenderá cualquier secuencia nucleotídica obtenida mediante mutagénesis según unas técnicas bien conocidas por el experto en la materia, y que comprenden unas modificaciones con relación a las secuencias normales según la descripción, por ejemplo unas mutaciones en las secuencias reguladoras y/o promotoras de la expresión de polipéptido, que conducen en particular a una
modificación del porcentaje de expresión de dicho polipéptido o a una modulación del ciclo replicativo.
Mediante la expresión “secuencia nucleotídica modificada” se entenderá asimismo cualquier secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido modificado tal como se definirá a continuación.
La presente descripción tiene por objeto unas secuencias nucleotídicas de circovirus MAP, caracterizadas porque se 5 seleccionan de entre las secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, o uno de sus fragmentos.
La descripción se refiere asimismo a las secuencias nucleotídicas caracterizadas porque comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada de entre:
a) una secuencia nucleotídica SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13
10 o uno de sus fragmentos; b) una secuencia nucleotídica de fragmento específico de una secuencia tal como la definida en a); c) una secuencia nucleotídica homóloga que comprende por lo menos el 80% de identidad con una secuencia tal como la definida en a) o b) d) una secuencia nucleotídica complementaria o de ARN que corresponde a una secuencia tal como la definida
15 en a), b) o c); y e) una secuencia nucleotídica modificada de una secuencia tal como la definida en a), b), c), o d).
En lo que se refiere a la homología con las secuencias nucleotídicas SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, o uno de sus fragmentos, se prefieren las secuencias homólogas, en particular específicas, que presentan un porcentaje de identidad con una de las secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID 20 nº 5, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, o uno de sus fragmentos de por lo menos 80%, preferentemente de 90% y de 95%. Dichas secuencias homólogas específicas pueden comprender, por ejemplo, las secuencias que corresponden a las secuencias ORF1, ORF2, ORF3, ORF'1, ORF'2 y ORF'3 de variante de circovirus MAP de tipo A
o de tipo B. Estas secuencias homólogas específicas pueden corresponder de la misma manera a unas variaciones
relacionadas con unas mutaciones en el seno de las cepas de circovirus MAP de tipo A o de tipo B, y corresponder 25 en particular a truncamientos, sustituciones, deleciones y/o adiciones de por lo menos un nucleótido.
De entre las secuencias nucleotídicas según la descripción, se prefiere en particular la secuencia SEC ID nº 11 que presenta una homología que comprende más del 90% de identidad con la secuencia SEC ID nº 3, así como la secuencia SEC ID nº 12.
De manera preferida, la descripción se refiere a las secuencias nucleotídicas según la descripción, caracterizadas 30 porque comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada de entre las secuencias siguientes:
a) 170 5'TGTGGCGA 3'; b) 450 5' AGTTTCCT 3'; c) 1026 5' TCATTTAGAGGGTCTTTCAG 3'; d) 1074 5' GTCAACCT 3';
35 e) 1101 5' GTGGTTGC 3'; f) 1123 5' AGCCCAGG 3'; g) 1192 5' TTGGCTGG 3'; h) 1218 5' TCTAGCTCTGGT 3'; i) 1501 5' ATCTCAGCTCGT 3';
40 j) 1536 5' TGTCCTCCTCTT 3'; k) 1563 5' TCTCTAGA 3'; l) 1632 5' TGTACCAA 3'; m) 1686 5' TCCGTCTT 3'; y su secuencia complementaria.
En la lista de las secuencias nucleotídicas a)-m) anterior, los nucleótidos subrayados están mutados con respecto a 45 las dos secuencias conocidas de circovirus no patógenos para el cerdo. El número que precede a la secuencia nucleotídica representa la posición del primer nucleótido de dicha secuencia en dicha SEC ID nº 1.
La descripción comprende los polipéptidos codificados por una secuencia nucleotídica según la invención, preferentemente un polipéptido cuya secuencia está representada por un fragmento, en particular específico, de una de las 6 secuencias de aminoácidos representadas en la figura 2, correspondiendo estas 6 secuencias de
50 aminoácidos a los polipéptidos que pueden ser codificados según unos de los 3 marcos de lectura posibles de la secuencia SEC ID nº 1 o de la secuencia SEC ID nº 2, o un polipéptido cuya secuencia está representada por un fragmento, en particular específico, de una de las 6 secuencias de aminoácidos representadas en la figura 8, correspondiendo estas 6 secuencias de aminoácidos a los polipéptidos que pueden ser codificados según uno de los 3 marcos de lectura posibles de la secuencia SEC ID nº 9 o de la secuencia SEC ID nº 10.
55 La descripción se refiere también a los polipéptidos caracterizados porque comprenden un polipéptido seleccionado de entre las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 14, SEC ID nº 16, o uno de sus fragmentos.
De entre los polipéptidos según la descripción, se prefiere en particular el polipéptido de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 14 que presenta una homología que comprende más del 80% de identidad con la secuencia SEC ID nº 6, así como el polipéptido de secuencia SEC ID nº 15.
La descripción se refiere también a los polipéptidos caracterizados porque comprenden un polipéptido seleccionado de entre:
a) un fragmento específico de por lo menos 5 aminoácidos de un polipéptido de secuencia de aminoácidos según la descripción; b) un polipéptido homólogo a un polipéptido tal como el definido en a); c) un fragmento específico biológicamente activo de polipéptido tal como el definido en a) o b); y d) un polipéptido modificado de un polipéptido tal como el definido en a), b) o c).
El término “polipéptidos”, como se usa en la presente memoria, designa preferiblemente los polipéptidos de secuencias de aminoácidos SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20, siendo estos polipéptidos en particular capaces de reconocer de manera específica los anticuerpos producidos durante la infección por el circovirus MAP de tipo B. Estos polipéptidos presentan así unos epítopos específicos del circovirus MAP de tipo B y pueden, por lo tanto, ser usados en particular en el campo del diagnóstico o como agente inmunógeno para conferir una protección en el cerdo contra la infección por el circovirus MAP, en particular de tipo B.
En la presente descripción, los términos polipéptido, péptido y proteína son intercambiables.
Se debe entender que la invención no se refiere a los polipéptidos en forma natural, es decir, que no se recogen en su entorno natural sino que se han podido aislar u obtener mediante purificación a partir de fuentes naturales, o bien obtenidos mediante recombinación genética, o también mediante síntesis química, y que pueden comprender entonces unos aminoácidos no naturales, tal como se describirá a continuación.
Mediante la expresión “fragmento de polipéptido” según la descripción, se entiende designar un polipéptido que comprende como mínimo 5 aminoácidos, preferentemente 10 aminoácidos y 15 aminoácidos.
Mediante la expresión “fragmento específico de polipéptido”, se entiende designar, en la presente descripción, un fragmento de polipéptido codificado por una secuencia nucleotídica de fragmento específico según la descripción.
Mediante la expresión polipéptido homólogo se entenderá designar los polipéptidos que presentan, con relación al polipéptido natural, ciertas modificaciones como en particular una deleción, una adición o una sustitución de por lo menos un aminoácido, un truncamiento, un alargamiento, una fusión quimérica y/o una mutación. Entre los polipéptidos homólogos, se prefieren aquéllos cuya secuencia de aminoácidos presenta por lo menos 80%, preferentemente 90%, de homología con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos según la descripción.
Mediante la expresión polipéptido homólogo específico se entenderá designar los polipéptidos homólogos tales como se han definido anteriormente y que presentan un fragmento específico de polipéptido según la descripción.
En el caso de una sustitución, se sustituyen uno o varios aminoácidos consecutivos o no consecutivos por unos aminoácidos “equivalentes”. La expresión aminoácido “equivalente” tiende aquí a designar cualquier aminoácido susceptible de ser sustituido con uno de los aminoácidos de la estructura de base sin modificar sin embargo esencialmente las actividades biológicas de los péptidos correspondientes y tales como se definirán a continuación.
Estos aminoácidos equivalentes pueden ser determinados o bien apoyándose en su homología de estructura con los aminoácidos con los que se sustituyen, o bien en unos resultados de ensayos comparativos de actividad biológica entre los diferentes polipéptidos susceptibles de ser efectuados.
A título de ejemplo, se mencionarán las posibilidades de sustituciones susceptibles de ser efectuadas sin que resulte de ello ninguna modificación profunda de la actividad biológica de los polipéptidos modificados correspondientes, las sustituciones, por ejemplo, de la leucina por la valina o la isoleucina, del ácido aspártico por el ácido glutámico, de la glutamina por la asparagina, de la arginina por la lisina, etc., siendo las sustituciones inversas naturalmente factibles en las mismas condiciones.
Los polipéptidos homólogos específicos corresponden asimismo a los polipéptidos codificados por las secuencias nucleotídicas homólogas específicas tales como se han definido anteriormente y comprenden así en la presente definición los polipéptidos mutados o que corresponden a unas variantes, que pueden existir en circovirus MAP, y que corresponden en particular a truncamientos, sustituciones, deleciones y/o unas adiciones de por lo menos un residuo de aminoácido.
Mediante la expresión fragmento específico biológicamente activo de un polipéptido según la invención, se entenderá designar en particular un fragmento específico de polipéptido, tal como se ha definido anteriormente, que presenta por lo menos una de las características de los polipéptidos según la invención, en particular porque es:
-
capaz de inducir una reacción de inmunogenicidad dirigida contra un circovirus MAP; y/o -capaz de ser reconocido por un anticuerpo específico de un polipéptido según la descripción; y/o
-
capaz de unirse a un polipéptido o a una secuencia nucleotídica de circovirus MAP; y/o -capaz de ejercer una actividad fisiológica, incluso parcial, tal como, por ejemplo, una actividad de diseminación o
estructural (cápside); y/o -capaz de modular, inducir o inhibir la expresión de gen de circovirus MAP o una de sus variantes, y/o capaz de
modular el ciclo de replicación de circovirus MAP en la célula y/o el organismo hospedadora.
Los fragmentos de polipéptido según la descripción pueden corresponder a unos fragmentos aislados o purificados naturalmente presentes en un circovirus MAP o corresponder a unos fragmentos que se pueden obtener mediante escisión de dicho polipéptido por una enzima proteolítica tal como la tripsina o la quimiotripsina o la colagenasa, o mediante un reactivo químico, tal como el bromuro de cianógeno (CNBr) o también disponiendo dicho polipéptido en un entorno muy ácido, por ejemplo a pH 2,5. Dichos fragmentos polipeptídicos se puede preparar asimismo indiferentemente mediante síntesis química, a partir de hospedadores transformados por un vector de expresión según la invención que contienen un ácido nucleico que permite la expresión de dichos fragmentos, dispuesto bajo el control de los elementos de regulación y/o de expresión apropiados.
Mediante la expresión “polipéptido modificado” de un polipéptido según la invención, se entiende designar un polipéptido obtenido mediante recombinación genética o mediante síntesis química tal como se describirá a continuación, que presenta por lo menos una modificación con relación a la secuencia normal. Estas modificaciones podrán apoyarse asimismo sobre unos aminoácidos en el origen de una especificidad, de la patología y/o de virulencia, o en el origen de la conformación estructural, y de la capacidad de inserción membranaria del polipéptido según la invención. Así, se podrán crear unos polipéptidos de actividad equivalente, aumentada o disminuida, y de especificidad equivalente, más estrecha, o más ancha. Entre los polipéptidos modificados, se deben citar los polipéptidos en los que se pueden modificar hasta 5 aminoácidos, truncados en el extremo N-o C-terminal, o bien delecionados, o bien añadidos.
Tal como se indica, las modificaciones del polipéptido tendrán como objetivo en particular:
-
hacer que sea capaz de modular, inhibir o inducir la expresión de gen de circovirus MAP y/o capaz de modular el
ciclo de replicación de circovirus MAP en la célula y/o el organismo hospedadora, -permitir su incorporación en unas composiciones vacunales, -modificar su biodisponibilidad como compuesto de uso terapéutico.
Los métodos que permiten demostrar dichas modulaciones sobre unas células eucariotas o procariotas son bien conocidos por el experto en la materia. Se entiende asimismo que las secuencias nucleotídicas que codifican para dichos polipéptidos modificados se podrán usar para dichas modulaciones, por ejemplo por medio de vectores según la descripción y descritos a continuación, con el fin, por ejemplo, de prevenir o tratar las patologías relacionadas con la infección.
Los polipéptidos modificados anteriores se pueden obtener usando la química combinatoria, en la que es posible hacer variar sistemáticamente unas partes de polipéptido antes de ensayarlas sobre unos modelos, cultivos celulares o microorganismos por ejemplo, para seleccionar los compuestos más activos o que presentan las propiedades buscadas.
La síntesis química presenta asimismo la ventaja de poder usar:
-
unos aminoácidos no naturales, o -unas uniones no peptídicas.
Así, con el fin de mejorar la duración de vida de los polipéptidos según la invención, podrá ser interesante usar unos aminoácidos no naturales, por ejemplo en forma D, o bien unos análogos de aminoácidos, en particular unas formas azufradas por ejemplo.
Por último, la estructura de los polipéptidos según la invención, sus formas homólogas específicas o modificadas, se podrá integrar en unas estructuras químicas de tipo polipeptídica u otras. Así, puede ser interesante prever en los extremos N y C-terminales unos compuestos no reconocidos por las proteasas.
Asimismo, forman parte de la descripción las secuencias nucleotídicas que codifican para un polipéptido según la invención.
La descripción se refiere asimismo a las secuencias nucleotídicas que se pueden utilizar como cebador o sonda, caracterizadas porque dichas secuencias se seleccionan de entre las secuencias nucleotídicas según la descripción.
De entre los pares de secuencias nucleotídicas que se pueden utilizar como par de cebadores según la descripción, se prefieren los pares de cebadores seleccionados de entre los pares siguientes:
a) 5' GTG TGC TCG ACA TTG GTG TG 3', y 5' TGG AAT GTT AAC GAG CTG AG 3';
b) 5' GTG TGC TCG ACA TTG GTG TG 3', y 5' CTC GCA GCC ATC TTG GAA TG 3';
c) 5' CGC GCG TAA TAC GAC TCA CT 3', y 5' GTG TGC TCG ACA TTG GTG TG 3';
d) 5' CGC GCG TAA TAC GAC TCA CT 3', y 5' CTC GCA GCC ATC TTG GAA TG 3'; y
e) 5' CCT GTC TAC TGC TGT GAG TAC CTT GT 3', y 5' GCA GTA GAC AGG TCA CTC CGT TGT CC 3'.
La clonación y la secuenciación del circovirus MAP, de tipo A y B, ha permitido identificar, tras el análisis comparativo con las secuencias nucleotídicas de los otros circovirus porcinos, cuáles eran de entre las secuencias de fragmentos de estos ácidos nucleicos, las que son estrictamente específicas del circovirus MAP de tipo A, de tipo B o de tipo A y B, y las que corresponden a una secuencia consenso de circovirus porcinos diferentes de los circovirus MAP de tipo A y/o B.
Existe asimismo una gran necesidad para poder disponer de secuencias nucleotídicas que se pueden utilizar como cebador o sonda específicos del conjunto de circovirus porcinos diferentes conocidos y no patógenos.
Dichas secuencias nucleotídicas consenso específicas del conjunto de circovirus, diferentes de los circovirus MAP de tipo A y B, son fácilmente identificables a partir de la figura 3 y de la secuencia SEC ID nº 9, y forman parte de la descripción.
De entre dichas secuencias nucleotídicas consenso, se prefiere la caracterizada porque forma parte del par de cebadores siguiente:
a) 5' GTG TGC TCG ACA TTG GTG TG 3', y
5' TGG AAT GTT AAC TAC CTC AA 3'.
La descripción comprende asimismo un secuencia nucleotídica según la descripción, caracterizada porque dicha secuencia es una secuencia consenso específica de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B y porque es uno de los cebadores del par de cebadores siguiente:
a) 5' GGC GGC GCC ATC TGT AAC GGT TT 3', y
5' GAT GGC GCC GAA AGA CGG GTA TC 3'.
Se entiende que la presente invención tiene asimismo por objeto los polipéptidos específicos de circovirus porcinos conocidos diferentes de los circovirus MAP, codificados por dichas secuencias nucleotídicas consenso, susceptibles de ser obtenidos por purificación a partir de los polipéptidos naturales, por recombinación genética o por síntesis química mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia y tales como los descritos en particular a continuación. Del mismo modo, los anticuerpos mono o policlonales, marcados o no marcados dirigidos contra dichos polipéptidos específicos codificados por dichas secuencias nucleotídicas consenso, forman parte también de la descripción.
Dichas secuencias nucleotídicas consenso, dichos polipéptidos correspondientes, así como dichos anticuerpos dirigidos contra dichos polipéptidos, se podrán utilizar en procedimientos o estuches de detección y/o de identificación tales como los descritos a continuación, en lugar o además de las secuencias nucleotídicas, de los polipéptidos o de los anticuerpos según la descripción, específicos de circovirus MAP de tipo A y/o B.
Estos protocolos se han mejorado para detectar de manera diferencial las formas monoméricas circulares de formas replicativas específicas del virión o del ADN en replicación y las formas diméricas encontradas en las construcciones moleculares denominadas en tándem.
La descripción se refiere además a la utilización de una secuencia nucleotídica según la descripción, como cebador
o sonda, para la detección y/o la amplificación de secuencias de ácido nucleico.
Las secuencias nucleotídicas según la descripción se pueden utilizar así para amplificar secuencias nucleotídicas, en particular mediante la técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (Erlich, 1989; Innis et al., 1990; Rolfs et al., 1991; et White et al., 1997)
Estos cebadores oligodesoxirribonucleicos u oligorribonucleicos tienen ventajosamente una longitud de por lo menos 8 nucleótidos, preferentemente de por lo menos 12 nucleótidos, y también más preferentemente por lo menos 20 nucleótidos.
Se pueden emplear ventajosamente otras técnicas de amplificación del ácido nucleico como alternativas a la PCR.
Las secuencias nucleotídicas de la descripción, en particular los cebadores según la descripción, se pueden utilizar en otros procedimientos de amplificación de un ácido nucleico diana, tales como:
-la técnica TAS (Transcription-based Amplification System), descrita por Kwoh et al. en 1989; -la técnica 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), descrita por Guatelli et al. en 1990; -la técnica NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), descrita por Kievitis et al. en 1991; -la técnica SDA (Strand Displacement Amplification) o técnica de amplificación con desplazamiento de hebra
(Walker et al., 1992); -la técnica TMA (Transcription Mediated Amplification).
Los polinucleótidos de la descripción se pueden utilizar también en técnicas de amplificación o de modificación del ácido nucleico que sirve de sonda, tales como
-
la técnica LCR (Ligase Chain Reaction), descrita por Landegren et al. en 1988 y perfeccionada por Barany et al.
en 1991, que emplea una ligasa termoestable; -la técnica de RCR (Repair Chain Reaction), descrita por Segev en 1992; -la técnica CPR (Cycling Probe Reaction), descrita por Duck et al. en 1990; -la técnica de amplificación con Q-beta-replicasa, descrita por Miele et al. en 1983 y perfeccionada en particular
por Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988, y después por Burg et al., así como por Stone et al. en 1996.
En el caso en que el polinucleótido diana a detectar es un ARN, por ejemplo un ARNm, se podrá utilizar, previamente a la realización de una reacción de amplificación con ayuda de por lo menos un cebador según la descripción o a la realización de un procedimiento de detección con ayuda de por lo menos una sonda de la descripción, una enzima de tipo transcriptasa inversa con el fin de obtener un ADNc a partir del ARN contenido en la muestra biológica. El ADNc obtenido servirá entonces de diana para el o los cebadores o la o las sondas utilizadas en el procedimiento de amplificación o de detección según la descripción.
La sonda de detección se elegirá de tal manera que se hibride con la secuencia diana o el amplicón generado a partir de la secuencia diana. Una sonda de detección de este tipo tendrá ventajosamente por secuencia una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, en particular de por lo menos 20 nucleótidos, y preferentemente de por lo menos 100 nucleótidos.
La descripción comprende también las secuencias nucleotídicas que se pueden utilizar como sonda o cebador según la descripción, caracterizadas porque están marcadas por un compuesto radioactivo o por un compuesto no radioactivo.
Se pueden utilizar las secuencias nucleotídicas no marcadas como sondas o cebadores, sin embargo las secuencias están marcadas generalmente por un elemento radioactivo (32P, 35S, 3H, 125I) o por una molécula no radioactiva (biotina, acetilaminofluoreno, digoxigenina, 5-bromo-desoxiuridina, fluoresceína) para obtener unas sondas que se pueden utilizar para numerosas aplicaciones.
Unos ejemplos de marcado no radioactivos de secuencias nucleotídicas están descritos, por ejemplo, en la patente francesa nº 78.10975 o por Urdea et al. o por Sanchez-Pescador et al. en 1988.
En este último caso, se podrá utilizar también uno de los métodos de marcado descritos en las patentes FR 2 422 956 y FR-2 518 755.
La técnica de hibridación se puede realizar de varias maneras (Matthews et al. 1988). El método más general consiste en inmovilizar el ácido nucleico extraído de las células sobre un soporte (tal como nitrocelulosa, nailon, poliestireno) y en incubar, en condiciones bien definidas, el ácido nucleico diana inmovilizado con la sonda. Después de la hibridación, se retira el exceso de sonda y las moléculas híbridas formadas se detectan mediante el método apropiado (medición de la radioactividad, de la fluorescencia o de la actividad enzimática relacionada con la sonda).
La descripción comprende asimismo las secuencias nucleotídicas según la descripción, caracterizadas porque están inmovilizadas sobre un soporte, de manera covalente o no covalente.
Según otra realización ventajosa de las secuencias nucleotídicas según la descripción, estas últimas se pueden utilizar inmovilizadas sobre un soporte y servir así para capturar la hibridación específica del ácido nucleico diana obtenido a partir de la muestra biológica a ensayar. Si es necesario, el soporte sólido se separa de la muestra y el complejo de hibridación formado entre la sonda denominada de captura y el ácido nucleico diana se detecta a continuación gracias a una segunda sonda, denominada sonda de detección, marcada por un elemento fácilmente detectable.
Otro objeto de la presente descripción es un vector para la clonación y/o la expresión de una secuencia, caracterizado porque contiene una secuencia nucleotídica según la descripción.
Los vectores según la descripción, caracterizados porque comprenden los elementos que permiten la expresión y/o la secreción de dichas secuencias nucleotídicas en una célula hospedadora forman parte asimismo de la descripción.
El vector debe entonces comprender un promotor, unas señales de iniciación y de terminación de la traducción, así como unas regiones apropiadas de regulación de la transcripción. Debe poder ser mantenido de manera estable en la célula hospedadora y puede eventualmente poseer unas señales particulares que especifican la secreción de la proteína traducida. Estos diferentes elementos se eligen en función del hospedadora celular usado. Con este fin, las secuencias nucleotídicas según la descripción se pueden insertar en unos vectores de replicación autónoma en el seno del hospedador elegido, o en unos vectores integradores del hospedador elegido.
Dichos vectores se prepararán según los métodos usados habitualmente por el experto en la materia, y los clones resultantes se podrán introducir en un hospedador apropiado mediante unos métodos estándares, tales como, por ejemplo, la lipofección, la electroporación, el choque térmico.
Los vectores según la descripción son, por ejemplo, unos vectores de origen plasmídico o vírico.
Un vector preferido para la expresión de los polipéptidos de la descripción es el baculovirus.
Se prefiere asimismo el vector pBS KS en el que se inserta la secuencia de ADN en tándem del circovirus MAP de tipo A (o DFP), tal como el depositado en la CNCM el 3 de julio de 1997, con el número I-1891.
Estos vectores son útiles para transformar unas células hospedadoras con el fin de clonar o expresar las secuencias nucleotídicas de la descripción.
La descripción comprende asimismo las células hospedadoras transformadas por un vector según la descripción.
Estas células se pueden obtener mediante la introducción en unas células hospedadoras de una secuencia nucleotídica insertada en un vector tal como se ha definido anteriormente, y después el cultivo de dichas células en unas condiciones que permiten la replicación y/o la expresión de la secuencia nucleotídica transfectada.
El hospedadora celular se puede seleccionar de entre unos sistemas procariotas o eucariotas, tal como, por ejemplo, las células bacterianas (Olins y Lee, 1993), pero también las células de levadura (Buckholz, 1993), al igual que las células animales, en particular los cultivos de células de mamíferos (Edwards y Aruffo, 1993), y en particular las células de ovario de hámster chino (CHO), pero también las células de insectos en las que se pueden usar unos procedimientos que usan unos baculovirus por ejemplo (Luckow, 1993).
Una célula hospedadora preferida para la expresión de las proteínas de la descripción está constituida por las células de insectos sf9.
Una célula hospedadora preferida también según la descripción es E. coli, tal como está depositada en la CNCM el 3 de julio de 1997, con el número I-1891.
La descripción se refiere asimismo a los animales que comprenden una de dichas células transformadas según la descripción.
La obtención de animales transgénicos según la descripción que sobreexpresan uno o varios genes de circovirus MAP o parte de genes se realizará de manera preferida sobre unas ratas, unos ratones o unos conejos según unos métodos bien conocidos por el experto en la materia, tales como mediante transfecciones, víricas o no víricas. Los animales transgénicos que sobreexpresan uno o varios de dichos genes se podrán obtener mediante la transfección de copias múltiples de dichos genes bajo el control de un potente promotor de naturaleza ubicua, o selectivo de un tipo de tejido. Los animales transgénicos se podrán obtener asimismo mediante recombinación homóloga sobre células cepas embrionarias, transferencia de estas células cepas a unos embriones, selección de las quimeras afectadas a nivel de las líneas reproductoras, y crecimiento de dichas quimeras.
Las células transformadas así como los animales transgénicos según la descripción se pueden utilizar en unos procedimientos de preparación de polipéptido recombinante.
En la actualidad es posible producir unos polipéptidos recombinantes en cantidad relativamente importante mediante ingeniería genética usando las células transformadas por unos vectores de expresión o usando unos animales transgénicos según la descripción.
Los procedimientos de preparación de un polipéptido de la descripción en forma recombinante, caracterizados porque usan un vector y/o una célula transformada por un vector y/o un animal transgénico que comprende una de dichas células transformadas según la descripción, están comprendidos a su vez en la presente descripción.
Entre dichos procedimientos de preparación de un polipéptido de la descripción en forma recombinante, se prefieren los procedimientos de preparación que usan un vector y/o una célula transformada por dicho vector y/o un animal transgénico que comprende una de dichas células transformadas, que contiene una secuencia nucleotídica según la descripción que codifica para un polipéptido de circovirus MAP.
Los polipéptidos recombinantes obtenidos como se ha indicado anteriormente, se pueden presentar tanto en forma glucosilada como no glucosilada, y pueden presentar o no la estructura terciaria natural.
Una variante preferida consiste en producir un polipéptido recombinante fusionado con una proteína “portadora” (proteína quimera). La ventaja de este sistema es que permite una estabilización y una disminución de la proteólisis del producto recombinante, un aumento de la solubilidad durante la renaturalización in vitro y/o una simplificación de la purificación cuando la pareja de fusión posee una afinidad para un ligando específico.
Más particularmente, la descripción se refiere a un procedimiento de preparación de un polipéptido de la descripción que comprende las siguientes etapas:
a) cultivar las células transformadas en unas condiciones que permiten la expresión de un polipéptido recombinante de secuencia nucleotídica según la descripción; b) llegado el caso, recuperar dicho polipéptido recombinante.
Cuando el procedimiento de preparación de un polipéptido de la descripción usa un animal transgénico según la descripción, el polipéptido recombinante se extrae a continuación de dicho animal.
La descripción tiene asimismo por objeto un polipéptido susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento de la descripción tal como el descrito anteriormente.
La descripción comprende asimismo un procedimiento de preparación de un polipéptido sintético, caracterizado porque utiliza una secuencia de aminoácidos de polipéptidos según la descripción.
La descripción se refiere asimismo a un polipéptido sintético obtenido mediante un procedimiento según la descripción.
Los polipéptidos según la descripción se pueden preparar asimismo mediante las técnicas clásicas, en el campo de la síntesis de los péptidos. Esta síntesis se puede realizar en solución homogénea o en fase sólida.
Por ejemplo, se recurrirá a la técnica de síntesis en disolución homogénea descrita por Houbenweyl en 1974.
Este método de síntesis consiste en condensar sucesivamente de dos en dos los aminoácidos sucesivos en el orden requerido, o en condensar unos aminoácidos y unos fragmentos previamente formados y que contienen ya varios aminoácidos en el orden apropiado, o también varios fragmentos previamente preparados así, entendiéndose que se habrá tenido el cuidado de proteger previamente todas las funciones reactivas contenidas por estos aminoácidos o fragmentos, con la excepción de las funciones aminas de uno y carboxilos del otro o viceversa, que deben intervenir normalmente en la formación de las uniones peptídicas, en particular después de la activación de la función carboxilo, según los métodos bien conocidos en la síntesis de los péptidos.
Según otra técnica preferida de la descripción, se recurre a la descrita por Merrifield.
Para fabricar una cadena peptídica según el procedimiento de Merrifield, se recurre a una resina polímera muy porosa, sobre la cual se fija el primer aminoácido C-terminal de la cadena. Este aminoácido se fija sobre una resina por medio de su grupo carboxílico y se protege su función amina. Así se fijan, unos detrás de otros, los aminoácidos que constituirán la cadena peptídica sobre el grupo amina cada vez desprotegido previamente de la porción de la cadena peptídica ya formada, y que está ligada a la resina. Cuando la totalidad de la cadena peptídica deseada está formada, se eliminan los grupos protectores de los diferentes aminoácidos que constituyen la cadena peptídica y se suelta el péptido de la resina con la ayuda de un ácido.
La descripción se refiere además a polipéptidos híbridos que presentan por lo menos un polipéptido según la descripción, y una secuencia de un polipéptido susceptible de inducir una respuesta inmunitaria en el ser humano o el animal.
Ventajosamente, el determinante antigénico es tal que es susceptible de inducir una respuesta humoral y/o celular.
Dicho determinante podrá comprender un polipéptido según la invención en forma glucosilada utilizado con vistas a obtener unas composiciones inmunógenas susceptibles de inducir la síntesis de anticuerpos dirigidos contra unos epítopos múltiples. Dichos polipéptidos o sus fragmentos glucosilados forman parte asimismo de la invención.
Estas moléculas híbridas pueden estar constituidas en parte por una molécula portadora de polipéptidos o de sus fragmentos según la descripción, asociada a una parte eventualmente inmunógena, en particular un epítopo de la toxina diftérica, la toxina tetánica, un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (patente FR 79 21811), el antígeno VP1 del virus de la poliomielitis o cualquier otra toxina o antígeno vírico o bacteriano.
Los procedimientos de síntesis de las moléculas híbridas engloban los métodos utilizados en ingeniería genética para construir unas secuencias nucleotídicas híbridas que codifican para las secuencias polipeptídicas buscadas. Se podrá hacer referencia, por ejemplo, ventajosamente a la técnica de obtención de genes que codifican para unas proteínas de fusión descrita por Minton en 1984.
Dichas secuencias nucleotídicas híbridas que codifican para un polipéptido híbrido así como los polipéptidos híbridos según la descripción caracterizados porque se trata de polipéptidos recombinantes obtenidos por la expresión de dichas secuencias nucleotídicas híbridas, forman parte asimismo de la descripción.
La descripción comprende asimismo los vectores caracterizados porque contienen una de dichas secuencias nucleotídicas híbridas. Las células hospedadoras transformadas por dichos vectores, los animales transgénicos que comprenden una de dichas células transformadas así como los procedimientos de preparación de polipéptidos
recombinantes que utilizan dichos vectores, dichas células transformadas y/o dichos animales transgénicos evidentemente forman parte asimismo de la descripción.
Los polipéptidos según la invención, los anticuerpos según la descripción descritos a continuación y las secuencias nucleotídicas según la descripción se pueden utilizar ventajosamente en unos procedimientos para la detección y/o
5 la identificación de circovirus MAP, o de circovirus porcinos diferentes de un circovirus MAP, en una muestra biológica (tejido o fluido biológico) susceptible de contenerlos. Estos procedimientos, según la especificidad de los polipéptido, de los anticuerpos y de las secuencias nucleotídicas según la descripción que se utilizarán, podrán detectar y/o identificar en particular un circovirus MAP o un circovirus porcino diferente de un circovirus MAP o diferente del circovirus MAP de tipo B.
10 Los polipéptidos según la invención se pueden utilizar ventajosamente en un procedimiento para la detección y/o la identificación de circovirus MAP de tipo A, de tipo B, de tipo A o B, de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, o de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo A o B, en una muestra biológica (tejido o fluido biológico) susceptible de contenerlos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) puesta en contacto de esta muestra biológica con un polipéptido o uno de sus fragmentos según la descripción
15 (en unas condiciones que permiten una reacción inmunológica entre dicho polipéptido y los anticuerpos eventualmente presentes en la muestra biológica); b) puesta en evidencia de los complejos antígeno-anticuerpo eventualmente formados.
En la presente descripción, por circovirus MAP se designará, salvo que se indique lo contrario, un circovirus MAP de tipo A o de tipo B, y por circovirus porcino diferente de MAP, salvo que se indique lo contrario, un circovirus porcino
20 diferente de un circovirus MAP de tipo A y B.
Preferentemente, la muestra biológica está constituida por un fluido, por ejemplo un suero de cerdo, sangre completa
o biopsias.
Se puede utilizar cualquier procedimiento habitual para realizar dicha detección de los complejos antígenoanticuerpo eventualmente formados.
25 A título de ejemplo, un método preferido emplea unos procesos inmunoenzimáticos según la técnica ELISA, por inmunofluorescencia, o radio-inmunológicos (RIA) o equivalente.
De esta manera, la descripción se refiere asimismo a los polipéptido según la descripción, marcados con la ayuda de un marcador adecuado tal como del tipo enzimático, fluorescente, radioactivo.
Dichos métodos comprenden por ejemplo las etapas siguientes:
30 -depositar cantidades determinadas de una composición polipeptídica según la descripción en los pocillos de una placa de microtitulación, -introducir en dichos pocillos disoluciones crecientes de suero, o de muestra biológica diferente tal como se ha definido anteriormente, que se debe analizar, -incubar la microplaca,
35 -introducir en los pocillos de la placa de microtitulación anticuerpos marcados dirigidos contra unas inmunoglobinas de cerdo, habiendo sido realizado el marcado con la ayuda de una enzima seleccionada de entre las capaces de hidrolizar un sustrato modificando la absorción de las radiaciones de este último, por lo menos a una longitud de onda determinada, por ejemplo a 550 nm, -detectar, en comparación con un testigo de control, la cantidad de sustrato hidrolizado.
40 La invención se refiere asimismo a un kit o estuche para la detección y/o la identificación de circovirus MAP, de circovirus de porcino diferente de un circovirus MAP o de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, caracterizado porque comprende los elementos siguientes:
-
un polipéptido según la descripción,
-
llegado el caso, los reactivos para la constitución del medio propicio a la reacción inmunológica o específica,
45 -llegado el caso, los reactivos que permiten la detección de los complejos antígeno-anticuerpo producidos por la reacción inmunológica entre el o los polipéptidos de la descripción y los anticuerpos eventualmente presentes en la muestra biológica, pudiendo estos reactivos llevar asimismo un marcador, o ser susceptibles de ser reconocidos a su vez por un reactivo marcado, más particularmente en el caso en que el polipéptido según la descripción no está marcado,
50 -llegado el caso, una muestra biológica de referencia (testigo negativo) desprovisto de anticuerpos reconocidos por un polipéptido según la descripción, -llegado el caso, una muestra biológica de referencia (testigo positivo) que contiene una cantidad predeterminada de anticuerpos reconocidos por un polipéptido según la descripción.
Los polipéptidos según la descripción permiten preparar unos anticuerpos monoclonales o policlonales caracterizados porque reconocen específicamente los polipéptidos según la invención. Los anticuerpos monoclonales se podrán preparar ventajosamente a partir de hibridomas según la técnica descrita por Kohler y Milstein en 1975. Los anticuerpos policlonales se podrán preparar, por ejemplo, por inmunización de un animal, en particular un ratón, con un polipéptido según la invención o un ADN según la descripción, asociado a un adyuvante de la respuesta inmunitaria, y después purificación de los anticuerpos específicos contenidos en el suero de los animales inmunizados sobre una columna de afinidad sobre la que se ha fijado previamente el polipéptido que ha servido de antígeno. Los anticuerpos policlonales según la descripción también se pueden preparar por purificación, sobre una columna de afinidad, sobre la que se ha inmovilizado previamente un polipéptido según la descripción, de los anticuerpos contenidos en el suero de cerdos infectados por un circovirus MAP.
La descripción tiene asimismo por objeto anticuerpos mono o policlonales o sus fragmentos, o anticuerpos quiméricos, que pueden reconocer específicamente un polipéptido aislado que tiene una secuencia seleccionada entre las secuencias SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20.
La descripción tiene asimismo por objeto anticuerpos monoclonales o sus fragmentos, o anticuerpos quiméricos, que pueden reconocer específicamente un polipéptido aislado que tiene una secuencia seleccionada entre las secuencias SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20.
Los anticuerpos de la descripción podrán ser marcados asimismo de la misma manera que se ha descrito anteriormente para las sondas nucleicas de la descripción tales como un marcado de tipo enzimático, fluorescente o radioactivo.
La descripción prevé además un procedimiento para la detección y/o la identificación de circovirus MAP, de circovirus porcino diferente de un circovirus MAP, o diferente del circovirus MAP de tipo B, en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto la muestra biológica (tejido o fluido biológico) con un anticuerpo mono o policlonal según la descripción (en unas condiciones que permiten una reacción inmunológica entre dichos anticuerpos y los polipéptidos de circovirus MAP, de circovirus porcino diferente de un circovirus MAP, de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, eventualmente presentes en la muestra biológica); b) poner en evidencia el complejo antígeno-anticuerpo eventualmente formado.
Entra asimismo en el marco de la descripción, un kit o estuche para la detección y/o la identificación de circovirus MAP, de circovirus porcino diferente de un circovirus MAP o de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, caracterizado porque comprende los elementos siguientes:
-un anticuerpo policlonal o monoclonal según la descripción, llegado el caso marcado; -llegado el caso, un reactivo para la constitución del medio propicio para realizar la reacción inmunológica; -llegado el caso, un reactivo que permite la detección de los complejos antígeno-anticuerpo producidos por la
reacción inmunológica, pudiendo también este reactivo llevar un marcador, o ser susceptible de ser reconocido a
su vez por un reactivo marcado, más particularmente en el caso en que dicho anticuerpo monoclonal o policlonal
no está marcado; -llegado el caso, unos reactivos para realizar la lisis de las células de la muestra ensayada.
La presente descripción tiene asimismo por objeto un procedimiento para la detección y/o la identificación de MAP, de circovirus porcino diferente de un circovirus MAP o de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, en una muestra biológica, caracterizado porque utiliza una secuencia nucleotídica según la descripción.
Más particularmente, la descripción se refiere a un procedimiento para la detección y/o la identificación de circovirus MAP, de circovirus porcino diferente de un circovirus MAP o de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) llegado el caso, aislar el ADN a partir de la muestra biológica a analizar; b) amplificación específica del ADN de la muestra con la ayuda de por lo menos un cebador, o un par de cebadores, según la descripción; c) puesta en evidencia de los productos de amplificación.
Éstos pueden ser detectados por ejemplo mediante la técnica de hibridación molecular utilizando una sonda nucleica según la descripción. Esta sonda estará ventajosamente marcada por un elemento no radioactivo (sonda fría) o radioactivo.
En el sentido de la presente descripción, se entenderá por "ADN de la muestra biológica" o "ADN contenido en la muestra biológica", o bien el ADN presente en la muestra biológica considerada, o bien eventualmente el ADNc obtenido tras la acción de una enzima de tipo transcriptasa inversa sobre el ARN presente en dicha muestra biológica.
Otro objeto de la presente descripción consiste en un procedimiento según la descripción, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) puesta en contacto de una sonda nucleotídica según la descripción con una muestra biológica, habiendo sido el ADN contenido en la muestra biológica, llegado el caso, previamente hecho accesible para la hibridación, en unas condiciones que permiten la hibridación de la sonda al ADN de la muestra; b) puesta en evidencia del híbrido formado entre la sonda nucleotídica y el ADN de la muestra biológica.
La presente descripción se refiere también a un procedimiento según la descripción, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) puesta en contacto de una sonda nucleotídica inmovilizada sobre un soporte según la descripción con una muestra biológica, habiendo sido el ADN contenido en la muestra biológica, llegado el caso, previamente hecho accesible para la hibridación, en unas condiciones que permiten la hibridación de la sonda al ADN de la muestra; b) puesta en contacto del híbrido formado entre la sonda nucleotídica inmovilizada sobre un soporte y el ADN contenido en la muestra biológica, llegado el caso tras la eliminación del ADN de la muestra biológica que no se ha hibridado con la sonda, con una sonda nucleotídica marcada según la descripción; c) puesta en evidencia del nuevo híbrido formado en la etapa b).
Según un modo de realización ventajoso del procedimiento para la detección y/o la identificación definido anteriormente, éste está caracterizado porque, previamente a la etapa a), el ADN de la muestra biológica está previamente amplificado con la ayuda de por lo menos un cebador según la descripción.
La descripción prevé además un kit o estuche para la detección y/o la identificación de circovirus MAP, de circovirus porcino diferente del circovirus MAP o de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, caracterizado porque comprende los elementos siguientes:
a) una sonda nucleotídica según la descripción; b) llegado el caso, los reactivos necesarios para la realización de una reacción de hibridación; c) llegado el caso, por lo menos un cebador según la descripción así como los reactivos necesarios para una reacción de amplificación del ADN.
La descripción se refiere asimismo a un kit o estuche para la detección y/o la identificación de circovirus MAP, de circovirus porcino diferente de un circovirus MAP o de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, caracterizado porque los elementos siguientes:
a) una sonda nucleotídica, denominada sonda de captura, según la descripción; b) una sonda oligonucleotídica, denominada sonda de revelación, según la descripción; c) llegado el caso, por lo menos un cebador según la descripción así como los reactivos necesarios para una reacción de amplificación del ADN.
La descripción se refiere también a un kit o estuche necesario para la detección y/o la identificación de circovirus MAP, de circovirus porcino diferente de un circovirus MAP o de circovirus porcino diferente del circovirus MAP de tipo B, caracterizado porque comprende los elementos siguientes:
a) por lo menos un cebador según la descripción; b) llegado el caso, los reactivos necesarios para efectuar una reacción de amplificación de ADN; c) llegado el caso, un componente que permite verificar la secuencia del fragmento amplificado, más particularmente una sonda oligonucleotídica según la descripción.
Se puede utilizar un anticuerpo según la descripción para seleccionar el compuesto orgánico o inorgánico capaz de modular, inducir o inhibir la expresión de los genes, y/o de modificar la replicación celular del circovirus MAP o capaz de inducir o de inhibir las patologías vinculadas a una infección por un circovirus MAP.
La descripción comprende asimismo un método de selección de compuestos capaces de unirse a un polipéptido o a uno de sus fragmentos según la descripción, capaces de unirse a una secuencia nucleotídica según la descripción, o capaces de reconocer un anticuerpo según la descripción, y/o capaces de modular, de inducir o de inhibir la expresión de genes, y/o de modificar la replicación celular de circovirus MAP o capaces de inducir o de inhibir las patologías relacionadas con una infección por un circovirus MAP, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) puesta en contacto de dicho compuesto con dicho polipéptido, dicha secuencia nucleotídica, con una célula transformada según la descripción y/o administración de dicho compuesto a un animal transformado según la descripción; b) determinación de la capacidad de dicho compuesto para unirse con dicho polipéptido o dicha secuencia nucleotídica, o modular, inducir o inhibir la expresión de genes, o modular el crecimiento o la replicación de circovirus MAP, o inducir o inhibir en dicho animal transformado las patologías relacionadas con una infección por circovirus MAP (denominada actividad de dicho compuesto)
Los compuestos susceptibles de ser seleccionados pueden ser unos compuestos orgánicos tales como unos polipéptidos o hidratos de carbono o cualquier otro compuesto orgánico o inorgánico ya conocidos, o unos compuestos orgánicos nuevos elaborados a partir de técnicas de modelización molecular y obtenidos por síntesis química, siendo estas técnicas conocidas por el experto en la materia.
Dichos compuestos seleccionados se podrán utilizar para modular la replicación celular de circovirus MAP y para contralar así la infección por este virus. Los métodos que permiten determinar dichas modulaciones son muy conocidos por el experto en la materia.
Esta modulación se puede realizar por ejemplo por un agente capaz de unirse a una proteína e inhibir o potenciar así su actividad biológica, o capaz de unirse a una proteína de cubierta de la superficie externa de dicho virus y bloquear la penetración de dicho virus en la célula hospedadora o favorecer la acción del sistema inmunitario del organismo infectado dirigido contra dicho virus. Esta modulación se puede realizar asimismo mediante un agente capaz de unirse a una secuencia nucleotídica de un ADN de dicho virus y bloquear por ejemplo la expresión de un polipéptido cuya actividad biológica o estructural es necesaria para la replicación o para la proliferación de dicho virus células hospedadoras a células hospedadoras en el animal hospedadora.
La descripción se refiere a los compuestos susceptibles de ser seleccionados por un método de selección según la descripción.
La descripción se refiere asimismo a una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado de entre los compuestos siguientes:
a) una secuencia nucleotídica según la descripción;
b) un polipéptido según la descripción;
c) un vector, una partícula vírica o una célula transformada según la descripción;
d) un anticuerpo según la descripción;
e) un compuesto susceptible de ser seleccionado mediante un método de selección según la descripción;
eventualmente en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, llegado el caso, con uno o varios adyuvantes de la inmunidad apropiados.
La descripción se refiere asimismo a una composición inmunógena o vacunal caracterizada comprende un compuesto seleccionado de entre los compuestos siguientes:
a) una secuencia nucleotídica según la descripción;
b) un polipéptido según la descripción;
c) un vector o una partícula vírica según la descripción; y
d) una célula según la descripción;
La descripción se refiere además a una composición vacunal según la invención, caracterizada porque comprende una mezcla de los dos compuestos a) y b) anteriores, y porque uno de dichos dos compuestos se refiere al circovirus MAP de tipo A y el otro se refiere al circovirus MAP de tipo B.
Por compuesto relativo al circovirus MAP de tipo A o de tipo B, se entiende designar en este caso respectivamente un compuesto obtenido a partir de la secuencia genómica del circovirus MAP de tipo A o de tipo B.
La descripción prevé una composición inmunógena y/o vacunal, caracterizada porque comprende por lo menos uno de los siguientes compuestos:
-una secuencia nucleotídica SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, o uno de sus fragmentos; -un polipéptido de secuencia SEC ID nº 14, uno de sus fragmentos, o un fragmento del polipéptido de secuencia
SEC ID nº 15, -un vector o una partícula vírica que comprende una secuencia nucleotídica SEC ID nº 11, uno de sus fragmentos
o un fragmento de la secuencia SEC ID nº 12, o -una célula transformada capaz de expresar un polipéptido de secuencias SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, o uno de
sus fragmentos; o -una mezcla de por lo menos dos de dichos compuestos.
La descripción comprende asimismo una composición inmunógena y/o vacunal según la invención, caracterizada porque comprende dicha mezcla de por lo menos dos de dichos compuestos como producto de combinación para un uso simultáneo, separado o espaciado en el tiempo para la prevención o el tratamiento de infecciones por un circovirus MAP, en particular de tipo B.
En una realización preferida, la composición vacunal según la invención comprende la mezcla de los siguientes compuestos:
-
un plásmido pcDNA3 que contiene un ácido nucleico de secuencia SEC ID nº 11; -un plásmido pcDNA3 que contiene un ácido nucleico de secuencia SEC ID nº 12;
-
un plásmido pcDNA3 que contiene un ácido nucleico que codifica para la proteína GM-CSF; -un baculovirus recombinante que contiene un ácido nucleico de secuencia SEC ID nº 11; -un baculovirus recombinante que contiene un ácido nucleico de secuencia SEC ID nº 12; y -llegado el caso, un adyuvante de la inmunidad apropiado, en particular el adyuvante AIFTM
La descripción prevé asimismo una composición farmacéutica según la descripción, para la prevención o el tratamiento de una infección por un circovirus MAP.
La descripción prevé también una composición farmacéutica según la descripción, para la prevención o el tratamiento de una infección por un circovirus MAP de tipo B.
La descripción se refiere asimismo al uso de una composición según la descripción para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de una infección por un circovirus MAP, preferentemente por el circovirus MAP de tipo B.
Según otro aspecto, la descripción tiene por objeto un vector, una partícula vírica o una célula según la descripción, para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad por terapia génica.
Por último, la descripción comprende la utilización de un vector, de una partícula vírica o de una célula según la descripción, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una enfermedad por terapia génica.
Los polipéptidos de la descripción que entran en las composiciones inmunógenas o vacunales según la invención se pueden seleccionar mediante unas técnicas conocidas por el experto en la materia como por ejemplo sobre la capacidad de dichos polipéptidos para estimular las células T, que se traduce por ejemplo por su proliferación o la secreción de interleucinas, y que desemboca en la producción de anticuerpos dirigidos contra dichos polipéptidos.
En el cerdo, tal como en el ratón, en los que se administra una dosis ponderal de la composición vacunal comparable con la dosis usada en el ser humano, la reacción de anticuerpos se ensaya mediante la extracción del suero seguido por un estudio de la formación de un complejo entre los anticuerpos presentes en el suero y el antígeno de la composición vacunal, según las técnicas habituales.
Las composiciones farmacéuticas según la descripción contendrán una cantidad eficaz de los compuestos de la descripción, es decir, en cantidad suficiente de dicho o de dichos compuestos que permite obtener el efecto deseado, tal como por ejemplo la modulación de la replicación celular de circovirus MAP. El experto en la materia sabrá determinar esta cantidad, en función por ejemplo de la edad y del peso del individuo a tratar, del estado de desarrollo de la patología, de los efectos secundarios eventuales y por medio de un ensayo de evaluación de los efectos obtenidos sobre una muestra de población, siendo estos ensayos conocidos en estos campos de aplicaciones.
Según la descripción, dichas composiciones vacunales estarán preferentemente en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, llegado el caso, con uno o varios adyuvantes de la inmunidad apropiados.
En la actualidad, diversos tipos de vacunas están disponibles para proteger el animal o el ser humano contra unas enfermedades infecciosas: microorganismos vivos atenuados (M. bovis -BSG para la tuberculosis), microorganismos desactivados (virus de la gripe), unos extractos acelulares (Bordetella pertussis para la tos ferina), proteínas recombinadas (antígeno de superficie del virus de la hepatitis B), unos poliósidos (neumococos). Unas vacunas preparadas a partir de péptidos de síntesis o de microorganismos genéticamente modificados que expresan unos antígenos heterólogos están en curso de experimentación. Más recientemente todavía, se han propuesto unos ADN plasmídicos recombinados que comprenden unos genes que codifican para unos antígenos protectores como estrategia vacunal alternativa. Este tipo de vacunación se realiza con un plásmido particular que se deriva de un plásmido de E. coli que no se replica in vivo y que codifica únicamente para la proteína vírica. Se han inmunizado unos animales inyectando simplemente el ADN plasmídico desnudo en el músculo. Esta técnica conduce a la expresión de la proteína vírica in situ y a una respuesta inmunitaria de tipo celular (CTL) y de tipo humoral (anticuerpo). Esta doble inducción de la respuesta inmunitaria es una de las principales ventajas de la técnica de vacunación con ADN desnudo.
Las composiciones vacunales que comprenden secuencias nucleotídicas o vectores en los que se insertan dichas secuencias, se describen en particular en la solicitud internacional WO 90/11092 y asimismo en la solicitud internacional WO 95/11307.
La secuencia nucleotídica constitutiva de la composición vacunal según la descripción se puede inyectar al hospedador después de haber sido acoplada a unos compuestos que favorecen la penetración de este polinucleótido en el interior de la célula o su transporte hasta el núcleo celular. Los conjugados resultantes se pueden encapsular en unas micropartículas polímeras, tal como se describe en la solicitud internacional WO 94/27238 (Medisorb Technologies International).
Según otra realización de la composición vacunal según la invención, la secuencia nucleotídica, preferentemente un ADN, se compleja con un DEAE-dextrano (Pagano et al., 1967) o con unas proteínas nucleares (Kaneda et al., 1989), con unos lípidos (Felgner et al., 1987) o se encapsula en unos liposomas (Fraley et al., 1980) o también se introduce en forma de un gel que facilita su transfección en las células (Midoux et al., 1993, Pastore et al., 1994). El polinucleótido o el vector según la invención pueden estar asimismo en suspensión en una disolución tampón o estar asociado con unos liposomas.
Ventajosamente, dicha vacuna se preparará según la técnica descrita por Tacson et al. O Huygen et al. en 1996 o también según la técnica descrita por Davis et al. en la solicitud internacional WO 95/11307.
Dicha vacuna se puede preparar asimismo en forma de una composición que contiene un vector, dispuesta bajo el control de elementos de regulación que permiten su expresión en el ser humano o en el animal. Se podrá usar, por ejemplo, como vector de expresión in vivo del antígeno polipeptídico de interés, el plásmido pcDNA3 o el plásmido pcDNAl/neo, ambos comercializados por Invitrogen (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). También se puede usar el plásmido VIJns.tPA, descrito por Shiver et al. en 1995. Dicha vacuna comprenderá ventajosamente, además del vector recombinante, una disolución salina, por ejemplo una disolución de cloruro de sodio.
Mediante la expresión vehículo farmacéuticamente aceptable, se entiende designar un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica o vacunal que no provoca reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, facilitar la administración del compuesto activo, el aumento de su duración de vida y/o de su eficacia en el organismo, el aumento de su solubilidad en disolución o también la mejora de su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la materia en función de la naturaleza y del modo de administración del compuesto activo elegido.
En lo que se refiere a las formulaciones vacunales, éstas pueden comprender unos adyuvantes de la inmunidad apropiados que son conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo el hidróxido de aluminio, un representante de la familia de los péptidos muramilo como de los derivados peptídicos del N-acetil-muramilo, un lisado bacteriano, o también el adyuvante incompleto de Freund.
Estos compuestos se pueden administrar por vía sistémica, en particular por vía intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica o sub-cutánea, o por vía oral. De manera más preferida, la composición vacunal que comprende unos polipéptidos según la invención, se administrará por vía intramuscular, a través de la alimentación o mediante vaporización en varias veces, de manera espaciada en el tiempo.
Sus modos de administración, posologías y formas galénicas óptimas se pueden determinar según los criterios tenidos en cuenta generalmente en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un animal como, por ejemplo, la edad o el peso, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios constatados.
La presente descripción tiene asimismo por objeto la utilización de las secuencias nucleotídicas de circovirus MAP según la descripción, para la construcción de vectores retrovíricos autorreplicativos y las aplicaciones terapéuticas de éstas, en particular en el campo de la terapia génica humana in vivo.
Ya no hace falta demostrar la factibilidad de la terapia génica aplicada al ser humano y esto se refiere a numerosas aplicaciones terapéuticas como las enfermedades genéticas, las enfermedades infecciosas y los cánceres. Numerosos documentos de la técnica anterior describen los medios para realizar una terapia génica, en particular por medio de vectores víricos. De una manera general, los vectores se obtienen por deleción de por lo menos una parte de los genes víricos que son sustituidos por los genes de interés terapéutico. Dichos vectores se pueden propagar en una línea de complementación que proporciona en trans las funciones víricas delecionadas para generar una partícula de vector vírico defectivo para la replicación pero capaz de infectar una célula hospedadora. En la actualidad, los vectores víricos se encuentran entre los más utilizados y sus modos de infección están descritos ampliamente en la bibliografía accesible para el experto en la materia.
El principio de la terapia génica es suministrar un gen funcional, denominado gen de interés, cuyo ARN o proteína correspondiente producirá el efecto bioquímico deseado en las células o tejidos diana. Por una parte, la inserción de genes permite la expresión prolongada de moléculas complejas e inestables como unos ARN o unas proteínas que pueden ser extremadamente difíciles, incluso imposible, de obtener o de administrar directamente. Por otra parte, la inserción controlada del gen deseado en el interior de células específicas localizadas permite regular el producto de expresión en tejidos definidos. Para ello, es necesario poder insertar el gen terapéutico deseado en el interior de células seleccionadas y por lo tanto disponer de un método de inserción capaz de apuntar específicamente las células o los tejidos seleccionados.
De entre los métodos de inserción de genes, como por ejemplo la micro-inyección, en particular la inyección de ADN plasmídico desnudo (Derse, D. et al., 1995, et Zhao, T.M. et al., 1996), la electroporación, la recombinación homóloga, la utilización de partículas víricas, como los retrovirus, está ampliamente extendida. Sin embargo, aplicados in vivo, los sistemas de transferencia de gen de tipo retrovírico recombinante presentan al mismo tiempo un bajo poder infeccioso (concentración insuficiente de partículas víricas) y una falta de especificidad con respecto a las células diana seleccionadas.
La realización de vectores víricos células específicas, que presentan un tropismo tejido-específico, y cuya transducción del gen de interés se puede efectuar de manera adecuada mediante las células diana, se puede realizar por ejemplo fusionando un ligando específico de las células hospedadoras diana en la parte N-terminal de una proteína de superficie de la cubierta de circovirus MAP. Se puede citar por ejemplo la construcción de partículas retrovíricas que presentan la molécula CD4 en la superficie de la cubierta de manera que se apunte a las células humanas infectadas por el virus VIH (YOUNG, J.A.T. et al., Sciences 1990, 250, 1421-1423), de partículas víricas que presentan una hormona peptídica fusionada con una proteína de cubierta para infectar específicamente las células que expresan el receptor correspondiente (KASAHARA, N. et al., Sciences 1994, 266, 1373-1376) o también de partículas víricas que presentan un polipéptido fusionado capaz de fijarse sobre el receptor del factor de crecimiento de la epidermis (EGF) (COSSET, F.L. et al., J. of Virology 1995, 69, 10, 6314-6322). En otro enfoque, unos fragmentos monocatenarios de anticuerpos dirigidos contra antígenos de superficie de las células diana, se insertan por fusión en la parte N-terminal de la proteína de cubierta (VALSESIA-WITTMAN, S. et al., J. of Virology 1996, 70, 3, 2059-2064; TEARINA CHU, T. H. et al., J. of Virology 1997, 71, 1, 720-725).
En el sentido de la presente descripción, un gen de interés de uso en la descripción se puede obtener de un organismo eucariota, procariota o de un virus mediante cualquier técnica convencional. Preferentemente, es capaz de producir un producto de expresión que tiene un efecto terapéutico y puede tratarse de un producto homólogo a la célula hospedadora o, de manera alternativa, heterólogo. En el marco de la presente descripción, un gen de interés puede codificar para un producto (i) intracelular (ii) membranario presente en la superficie de la célula hospedadora o
(iii) segregado fuera de la célula hospedadora. Puede comprender por lo tanto unos elementos adicionales apropiados como, por ejemplo, una secuencia que codifica para una señal de secreción. Estas señales son conocidas por el experto en la materia.
De acuerdo con los objetivos pretendidos por la presente invención, un gen de interés puede codificar para una proteína aislada que corresponde a la totalidad o a parte de una proteína natural tal como se encuentra en la naturaleza. Puede tratarse asimismo de una proteína quimérica, por ejemplo procedente de la fusión de polipéptidos de orígenes diversos o de un mutante que presenta unas propiedades biológicas mejoradas y/o modificadas. Un mutante de este tipo se puede obtener mediante unas técnicas de biología habituales por sustitución, deleción y/o adición de uno o varios residuos aminoácidos.
Se previere muy particularmente utilizar un gen de interés terapéutico que codifica para un producto de expresión capaz de inhibir o retrasar el establecimiento y/o el desarrollo de una enfermedad genética o adquirida. Un vector según la descripción está destinado particularmente a la prevención o al tratamiento de la mucovisdosis, de la hemofilia A o B, de la miopatía de Duchenne o de Becker, del cáncer, del SIDA y de otras bacterias o enfermedades infeccionas debidas a un organismo patógeno: virus, bacteria, parásito o prión. Los genes de interés que se pueden utilizar en la presente descripción, son los que codifican por ejemplo para las proteínas siguientes:
-
una citocina y en particular una interleucina, un interferón, un factor de necrosis tisular y un factor de crecimiento
y en particular hematopoyética (G-CSF, GM-CSF), -un factor o un cofactor implicado en la coagulación y en particular el factor VIII, el factor von Willebrand, la
antitrombina III, la proteína C, la trombina y la hirudina, -una enzima o un inhibidor de enzima tal como los inhibidores de proteasas víricas, -un producto de expresión de un gen suicida como la timidina quinasa del virus HSV (virus del herpes) de tipo 1, -un activador o un inhibidor de canales iónicos, -una proteína de la cual la ausencia, la modificación o la desregulación de la expresión es responsable de una
enfermedad genética, tal como la proteína CFTR, la distrofina o minidistrofiina, la insulina, la ADA (adenosina
diaminosa), la glucocerebrosidasa y la fenilhidroxilasa, -una proteína capaz de inhibir la iniciación o la progresión de cánceres, tal como los productos de expresión de
los genes supresores de tumores, por ejemplo los genes P53 y Rb, -una proteína capa de estimular una respuesta inmunitaria o un anticuerpo, y -una proteína capaz de inhibir una infección vírica o su desarrollo, por ejemplo los epítopos antigénicos del virus
en cuestión o unas variantes alteradas de proteínas víricas susceptibles de entrar en competición con las
proteínas víricas naturales.
La descripción se refiere así a los vectores caracterizados porque comprenden una secuencia nucleotídica de circovirus MPA según la descripción, y porque comprenden además un gen de interés.
La presente descripción se refiere asimismo a unas partículas víricas generadas a partir de dicho vector según la descripción. Se refiere además a unos métodos para la preparación de partículas víricas según la descripción, caracterizadas porque utilizan un vector según la descripción, incluyendo las pseudopartículas víricas (VLP, Virus-Like Particles).
La descripción tiene asimismo por objeto células animales transfectadas por un vector según la descripción.
Están comprendidas asimismo en la descripción las células animales, en particular de mamíferos, infectadas por una partícula vírica según la descripción.
La presente descripción se refiere asimismo a un vector, a una partícula vírica o a una célula según la descripción, para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad genética o de una enfermedad adquirida como el cáncer o una enfermedad infecciosa. La descripción se refiere asimismo a una composición farmacéutica que comprende a título de agente terapéutico o profiláctico un vector o una célula según la descripción, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otras características y ventajas de la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos y de las figuras siguientes:
Leyendas de las figuras
Figura 1: Esquema experimental que ha permitido llegar al aislamiento y a la identificación del circovirus asociado con el MAP de tipo A o B.
Ensayo 1: reproducción experimental del MAP mediante inoculación de triturados de órganos de cerdos de ganaderías que padecen MAP. Ensayo 2: reproducción experimental del MAP. Ensayo 3: reproducción experimental del MAP. Ensayo 4: ninguna reproducción experimental del MAP.
Figura 2: Organización del genoma de circovirus asociado con el MAP de tipo A (PCVA)
-Hebra de polaridad (+) (SEC ID nº 1); -Hebra de polaridad (-) (SEC ID nº 2, representada según la orientación 3' → 5'); -secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por las dos hebras de ADN en los tres marcos de
lectura posibles.
Figura 3: Alineación de la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 del circovirus MAP de tipo A (PCVA) y de los circovirus cepa MEEHAN y cepa MANKERTZ de las líneas celulares porcinas. Figura 4: Alineación de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 6 de polipéptido codificado por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 3 (ORF1) del circovirus MAP de tipo A (PCVA) y de las secuencias nucleotídicas correspondientes de los circovirus cepa MEEHAN y cepa MANKERTZ de las líneas celulares porcinas. Figura 5: Alineación de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7 de polipéptido codificado por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 4 (ORF2) del circovirus MAP de tipo A (PCVA) y de las secuencias nucleotídicas correspondientes de los circovirus cepa MEEHAN y cepa MANKERTZ de las líneas celulares porcinas. Figura 6: Alineación de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 8 de polipéptido codificado por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 5 (ORF3) del circovirus MAP de tipo A (PCVA) y de las secuencias nucleotídicas correspondientes de los circovirus cepa MEEHAN y cepa MANKERTZ de las líneas celulares porcinas. Figura 7: Análisis mediante transferencia Western de las proteínas recombinantes del circovirus MAP de tipo A (PCVA). Los análisis se han realizado sobre unos extractos celulares de células Sf9 obtenidos después de la infección por el baculovirus recombinante PCV ORF1. Figura 8: Organización del genoma del circovirus asociado a MAP de tipo B (PCVB)
-Hebra de polaridad (+) (SEC ID nº 9); -Hebra de polaridad (-) (SEC ID nº 10, representada según la orientación 3' → 5'); -secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por las dos hebras de ADN en los tres marcos de
lectura posibles.
Figura 9: Evolución de la ganancia media diaria (GMQ) de cerdos de ganaderías que padecen la enfermedad de adelgazamiento del lechón (MAP o DFP), puestos en las condiciones experimentales. Figura 10: GMQ comparada para los 3 lotes de cerdos (F1, F3 y F4) calculada sobre un periodo de 28 días después del ensayo de vacunación. Figura 11: Hipertermia superior a 41ºC, expresada en porcentaje comparado para los 3 lotes de cerdos (F1, F3 y F4) calculada sobre un periodo de 28 días después del ensayo de vacunación. Figura 12: Membranas de los puntos peptídicos que corresponden a los ORF2 reveladas con la ayuda de un suero de cerdo infectado, procedente de una ganadería convencional. Los números de péptidos específicos del circovirus de tipo B así como sus homólogos no reactivos (tipo A) se indican en negrita. Los péptidos inmunógenos no específicos se indican en cursiva. Figura 13: Alineación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por el ORF2 del circovirus MAP de tipo A y por el ORF'2 del circovirus MAP de tipo B. La posición de 4 péptidos que corresponden a unos epítopos específicos del circovirus MAP de tipo B se indica sobre la secuencia correspondiente en trazo en negrita, su homólogo sobre la secuencia del circovirus MAP de tipo A se indica asimismo mediante un trazo simple.
Ejemplos (los ejemplos 1 a 5 son ilustrativos)
Ejemplo 1: Clonación, secuenciación y caracterización del circovirus MAP de tipo A (PCVA)
1 -Procedimientos experimentales
Reproducción experimental de la infección y de su síndrome (véase la figura 1). Se ha efectuado un primer ensayo con unos cerdos procedentes de una ganadería muy bien atendida, pero afectada por la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP) o denominada asimismo DFP (Decaimiento fatal del lechón). Unas pruebas de contacto con unos cerdos EOPS (exento de organismos patógenos específicos) han mostrado una transferencia de contaminante(s) que se traduce por una patología compleja que asocia la hipertermia, la disminución del crecimiento, diarrea y conjuntivitis. El virus SDRP (síndrome disgenésico y respiratorio porcino, enfermedad infecciosa debida a un arterivirus) se ha aislado rápidamente a partir de los cerdos de ganadería y de los cerdos de contacto. El conjunto de las señales clínicas podría haber sido atribuido a la presencia del virus SDRP. Sin embargo, dos cerdos de ganadería han presentado unas señales de DFP sin que el virus SDRP haya sido aislado. Los análisis histológicos y las fórmulas sanguíneas han mostrado, sin embargo, que estos cerdos padecían un proceso infeccioso de origen vírico.
En un segundo ensayo, se han inoculado unos cerdos EOPS de 8 semanas por vía intra-traqueal con los triturados de órganos procedentes de dos cerdos de ganaderías que padecen DFP. Los cerdos inoculados han presentado hipertermia 8 a 9 días post-infección, y después su crecimiento se ha ralentizado. Otros cerdos EOPS, puestos en contacto, han presentado unas señales similares, atenuadas, 30 días después de la prueba inicial. No se ha observado ninguna seroconversión frente a una cepa europea o canadiense de virus SDRP en estos animales.
Un tercer ensayo ha permitido reproducir el síndrome a partir de extracciones efectuadas sobre los cerdos del segundo ensayo.
Conclusión
El síndrome se reproduce en las condiciones experimentales. Se determina mediante por lo menos un agente infeccioso, transmisible por contacto directo. Las constantes clínicas son una hipertermia a veces elevada (superior o igual a 41,5ºC) que se desarrolla 8 a 10 días después de la infección. Se puede observar una disminución del crecimiento. Las demás manifestaciones son una inversión de la fórmula sanguínea (inversión de la relación linfocito/polinuclear de 70/30 a 30/70) y unas lesiones frecuentes sobre los ganglios, en particular los que drenan el aparato respiratorio (hipertrofia ganglionar, pérdida de estructura con necrosis e infiltración por unas células mononucleadas o polinucleadas gigantes).
2 -Estudios en laboratorio
Se han usado diversos soportes celulares que incluyen unas células de riñón de cerdo primarias o en línea, unas células de testículo de cerdo, unas células de riñón de monos, unos linfocitos de cerdo, unos macrófagos alveolares de cerdos, unos monocitos de la sangre circulante, para demostrar la presencia eventual de un virus. No se ha demostrado ningún efecto citopático sobre estas células. En cambio, el uso de un suero de cerdo enfermo después de la infección experimental ha permitido revelar un antígeno intracelular en los monocitos, los macrófagos y aproximadamente 10% de las células de riñón de cerdo (RP) infectadas con los triturados de órgano. Esta revelación indirecta ha sido realizada en cinética en diferentes momentos de cultivo. De ello se desprende que el antígeno aparece inicialmente en el núcleo de las células infectadas antes de expandirse en el citoplasma. Los pasos sucesivos en cultivo celular no han permitido amplificar la señal.
En microscopia electrónica sobre unos triturados de órganos, se han visualizado unas partículas esféricas marcadas específicamente por el suero de cerdos enfermos, infectados en las condiciones experimentales. El tamaño de estas partículas se estima en 20 nm.
Después de dos pasos de estos triturados de órganos sobre unos linfocitos de cerdo y después de tres pasos sobre células de riñón o de testículo de cerdo, se ha desarrollado y amplificado un efecto citopático. En el microscopio electrónico se ha visualizado un adenovirus que, en las condiciones experimentales, no ha reproducido el DFP (se observa sólo un pico de hipertermia 24 a 48 horas después de la infección, y después nada más).
Se han podido demostrar unas bandas de ADN en ciertas extracciones de cerdos infectados en las condiciones experimentales y que han presentado unas señales de la enfermedad (resultados no representados). Existe una cierta correspondencia entre las extracciones que dan un resultado positivo en cultivo celular y los que presentan una banda de ADN.
Conclusión
Por lo menos dos tipos de virus se han demostrado en los triturados de órganos procedentes de cerdos enfermos de DFP. Uno es un adenovirus, pero no reproduce por sí mismo la enfermedad. El otro tipo de virus es un circovirus y está asociado al DFP. Este circovirus, del cual se han aislado y secuenciado dos tipos, denominados a continuación
circovirus MAP de tipo A (o PCVA) y circovirus MAP de tipo B (o PCVB) presentan unas mutaciones con relación a las secuencias conocidas de circovirus no patógenas para el cerdo.
3 -Clonación y secuenciación del ADN de circovirus MAP de tipo A
Extracción del ADN forma replicativa (RF), escisión por la enzima Kpn I y amplificación mediante un par de cebadores que flanquean el sitio de restricción Kpn I. Secuenciación de las dos hebras por lo menos dos veces mediante el método de Sanger.
La secuencia nucleica de la Hebra de polaridad (+) del genoma de circovirus MAP de tipo A (o PCVA), cepa DFP, está representada por la secuencia SEC ID nº 1 en el listado de las secuencias, estando la secuencia nucleica de la Hebra de polaridad (-) del genoma del circovirus MAP de tipo A (o PCVA) representada por la secuencia nucleica 3'
→ 5' de la figura 3 o por la secuencia SEC ID nº 2 (representada según la orientación 5' → 3') en el listado de secuencias.
Las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 6, SEC ID nº 7 y SEC ID nº 8 del listado de secuencias representan respectivamente las secuencias de las proteínas codificadas por las secuencias nucleicas de los 3 marcos abiertos de lectura SEC ID nº 3 (ORF1), que corresponde a la proteína REP, SEC ID n º4 (ORF2) y SEC ID nº 5 (ORF3), determinadas a partir de la secuencia SEC ID nº 1 de la Hebra de polaridad (+) o de la secuencia nucleica SEC ID nº 2 de la Hebra de polaridad (-) del genoma del circovirus MAP de tipo A.
4 -Comparación de las secuencias nucleotídicas y de los aminoácidos del circovirus MAP de tipo A (o asociado a MAP) obtenidas con las secuencias correspondientes de circovirus MEEHAN y MANKERTZ de líneas celulares porcinas
Uso del programa de análisis de secuencia de ADN, DNASIS.
Secuencia de los oligonucleótidos usados como cebadores o sondas en los procedimientos de detección y/o de identificación
1.
detección específica del circovirus MAP de tipo A:
cebador PCV5: 5' GTG TGC TCG ACA TTG GTG TG 3'; cebador PCV10: 5' TGG AAT GTT AAC GAG CTG AG 3';
2.
detección específica del circovirus de las líneas celulares:
cebador PCV5: 5' GTG TGC TCG ACA TTG GTG TG 3'; cebador MEE1: 5' TGG AAT GTT AAC TAC CTC AA 3';
3.
detección diferencial:
los pares de cebadores usados son los descritos por ejemplo en los párrafos 1 y 2 anteriores;
4.
detección de las formas replicativas RF (replicative forms) circulares monoméricas:
cebador PCV5: 5' GTG TGC TCG ACA TTG GTG TG 3'; cebador PCV6: 5' CTC GCA GCC ATC TTG GAA TG 3';
5.
detección de los vectores que comprenden los dímeros en tándem:
dímero Nar:
cebador KS 620: 5' CGC GCG TAA TAC GAC TCA CT 3';
cebador PCV5: 5' GTG TGC TCG ACA TTG GTG TG 3'; dímero Kpn:
cebador KS 620: 5' CGC GCG TAA TAC GAC TCA CT 3';
cebador PCV 6: 5' CTC GCA GCC ATC TTG GAA TG 3';
6. detección diferencial:
los pares de cebadores usados son los descritos, por ejemplo, en los párrafos 4 y 5 anteriores.
Los procedimientos que usan los pares de cebadores descritos en los párrafos 4 y 5 son particularmente interesantes para detectar de manera diferencial las formas monoméricas circulares de formas replicativas específicas del virión o del ADN en replicación y las formas diméricas encontradas en las construcciones moleculares denominadas en tándem.
Las construcciones en tándem del genoma vírico (dímeros) tales como las construcciones usadas para la preparación del vector pBS KS+ Tándem PCV Kpn 1, depositado en la CNCM con el número I-1891, el 3 de julio de 1997 (E. coli transformado por dicho vector) son muy interesantes para su uso en unos métodos de producción en
cantidad suficiente de un inóculo constituido por ADN, destinado a la producción de virus, y esto en ausencia de protocolo satisfactorio de producción de virus en sistema celular. Dichos métodos de producción que usan estas construcciones en tándem del genoma vírico permitirán estudiar mediante mutación los factores de virulencia y por consiguiente, se podrán usar para la fabricación de una colección de virus que comprenden las mutaciones indicadas en la construcción de los vectores que presentarán el tropismo y la virulencia apropiados. Estos vectores con estructura autorreplicativa presentan unas propiedades buscadas en transferencia de genes, en particular para sus aplicaciones en terapia génica, y en vacunología.
Análisis mediante trasferencia Western de las proteínas recombinantes del circovirus MAP de tipo A
Los resultados han sido obtenidos usando un antisuero específico del circovirus MAP producido durante el ensayo 1 (véase la figura 1).
Tipo de productos analizados
Se han realizado los análisis sobre unos extractos celulares de células Sf9 obtenidos después de la infección por el baculovirus recombinante PCV ORF 1.
El cultivo de las células Sf9 se ha realizado en caja de Petri de 25 cm2 según los métodos de cultivo estándares para estas células. Después de la centrifugación, los residuos celulares se recogen mediante 300 μl de tampón PBS (tampón fosfato salino).
Electroforesis (PAGE-SDS)
La electroforesis se realiza sobre los extractos celulares Sf9 obtenidos anteriormente sobre 5 muestras (véase la tabla 1 a continuación) en las siguientes condiciones:
% de gel de poliacrilamida: 8%; Condiciones: desnaturalizantes;
Voltaje: 80V; duración: 135 min.
Tabla 1: Naturaleza de las muestras sometidas a la electroforesis
Nº de pocillo
1 2 3 4 5
Depósitos
PM Rainbow Raoul 24h Raoul 48h Raoul 72h Raoul 96 h
μl muestra
10 15 15 15 15
μl Laemli 4X
0 5 5 5 5
Leyendas de la tabla 1: Laemli 4X: tampón de carga PM Rainbow: marcadores de peso molecular (35, 52, 77, 107, 160 y 250 kD) Raoul 24h, 48h, 72h y 96h: productos de expresión del ORF1 del circovirus MAP de tipo A
Transferencia western
Después de la electroforesis, se transfieren las bandas obtenidas en los diferentes pocillos sobre una membrana de nitrocelulosa durante 1h a 100v en un tampón TGM (Tris-glicina-metanol). La transferencia western se realiza en las siguientes condiciones:
1) Saturación mediante una disolución que contiene 5% de leche desnatada; 0,05% de Tween 20 en un tampón TBS 1X (Tris buffer saline) durante 30 min. 2) 1er anticuerpo:
se añaden 10 ml de anticuerpo anticircovirus MAP de tipo A diluidos a 1/100, y el medio de reacción se incuba a continuación una noche a 4ºC. Se efectúan tres lavados de 10 min. en TBS 1X.
3) 2º anticuerpo: se añaden 10 ml de anticuerpo P164 de conejo anti-inmunoglobulinas de cerdo, acoplados con la peroxidasa (Dakopath) diluidos a 1/100, y se incuba a continuación el medio de reacción durante 3 horas a 37ºC. Se efectúan tres lavados de 10 min. en TBS 1X.
4) Revelado Se usa el sustrato 4-cloro-1-naftol, en presencia de agua oxigenada para el revelado.
Resultados Los resultados se representan en la figura 7. Cinética de aparición de los anticuerpos específicos de la proteína recombinante REP del circovirus MAP de tipo A
expresado en baculovirus después de la infección de los cerdos por el circovirus MAP de tipo A (ensayo 4, véase la
5 figura 1) Después de la infección de los cerdos, se extrae una muestra de suero de cada uno de los cerdos infectados en diferentes periodos en la tabla por fecha de extracción (efectuada en este caso el mismo año) y después se analiza mediante transferencia western.
El revelado de los anticuerpos específicos se realiza de la manera descrita anteriormente. 10 Los resultados obtenidos se representan en la tabla 2 siguiente. Tabla 2: Cinética de aparición de los anticuerpos específicos
Muestra
Cerdos 10/06 16/06 23/06 01/07 08/07 15/07 21/07
A3
1
Testigo
2
B2
1 Neg Neg Neg + + ++ +++
infec
2 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg
RP+
3 Neg Neg Neg Neg + + +
4
Neg Neg Neg Neg Neg Neg +
Leyendas de la tabla 2: A3 Control: animales de control no infectados; B2 Infec. RP+: animales infectados con unas células de riñón de cerdos (RP) que contienen el circovirus; Neg.: negativo; +, ++, +++: escala de intensidad de la reacción positiva; 10/06, 16/06, 23/06, 01/07, 08/07, 15/07, 21/07: fecha expresadas en día/mes en las que se han efectuado las diferentes extracciones de suero.
Ejemplo 2: Clonación, secuenciación y caracterización del circovirus MAP de tipo B (PCVB)
Las técnicas usadas para la clonación, la secuenciación y la caracterización del circovirus MAP de tipo B (PCVB) 15 son las usadas en el ejemplo 1 anterior para el circovirus MAP de tipo A (PCVA).
La secuencia nucleica de la Hebra de polaridad (+) del genoma del circovirus MAP de tipo B (o PCVB) está representada por la secuencia SEC ID nº 9 en el listado de secuencias, estando la secuencia nucleica de la Hebra de polaridad (-) del genoma del circovirus MAP de tipo B (o PCVB) representada por la secuencia nucleica 3' → 5' de la figura 8 o por la secuencia SEC ID nº 10 (representada según la orientación 5' → 3') en el listado de secuencias.
20 Las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 y SEC ID nº 16 del listado de secuencias representan respectivamente las secuencias de las proteínas codificadas por las secuencias nucleicas de los 3 marcos abiertos de lectura SEC ID nº 11 (ORF'1), que corresponden a la proteína REP, SEC ID nº 12 (ORF'2) y SEC ID nº 13 (ORF'3), determinadas a partir de la secuencia SEC ID nº 9 de la Hebra de polaridad (+) o de la secuencia nucleica SEC ID nº 10 de la Hebra de polaridad (-) del genoma del circovirus MAP de tipo B.
25 Ejemplo 3: Análisis comparativo de las secuencias nucleotídicas (ORF1, ORF2 y genómica) y de las secuencias de aminoácidos codificados por ORF1 y ORF2 de los circovirus MAP de tipo A (PCVA) o de tipo B (PCVB).
Los resultados expresados en % de homología se representan en las tablas 3 y 4 siguientes.
Tabla 3: Análisis comparado de las secuencias de aminoácidos
% de homología
ORF1 ORF2
PCVA/PCVB
80,4 56,2
Tabla 4: Análisis comparado de las secuencias nucleotídicas
% de homología
Genómica ORF1 ORF2 Resto
PCVA/PCVB
70,4 80,4 60,1 66,1
Ejemplo 4: Observación de la enfermedad y reproducción de la enfermedad en las condiciones experimentales
5 a) Ensayo nº 1: Observación de la enfermedad
El objetivo es seleccionar unos animales de ganaderías al principio de la enfermedad y disponerlos en las condiciones experimentales para seguir la evolución de la patología y describir todas las manifestaciones clínicas. Este primer ensayo se ha efectuado sobre 3 cerdos de ganadería de 10 semanas de edad de los cuales 2 ya estaban enfermos (afectados de decaimiento), y sobre 3 otros cerdos de 13 semanas de edad, que no presentaban 10 ninguna señal de enfermedad. La observación clínica se ha desplegado sobre un periodo de 37 días. Dos cerdos de 10 semanas han decaído rápidamente (cerdo 1 y 2, figura 9) y fueron eutanasiados 5 y 6 días después de su llegada. Uno solo ha presentado hipertermia en 5 días y diarrea. Otros dos cerdos han presentado disnea y tos, de los cuales uno ha tenido además hipertermia, superior a 41ºC, los dos primeros días de su estancia. Otro cerdo ha tenido un crecimiento ralentizado en la segunda semana (cerdo 6, figura 9), sin que haya revelado ninguna otra
15 señal clínica. En el plano lesional, 5 cerdos de 6 han presentado unas lesiones macroscópicas de neumonía gris, y el sexto presentaba unas lesiones cicatriciales sobre el pulmón.
b) Ensayo nº 2: Reproducción de la enfermedad a partir de inóculos preparados sobre cerdos de ganadería.
Los dos cerdos enfermos del ensayo 1 han servido para preparar unos inóculos que se ha ensayado en el ensayo 2 sobre unos cerdos exentos de organismos patógenos específicos (EOPS, SPF en versión anglo-sajona). Los cerdos 20 EOPS tenían 9 semanas de edad en el momento de la inoculación. Los resultados clínicos y lesionales se representan en la tabla 5.
En este ensayo, no ha habido ningún decaimiento, como mucho una ralentización del crecimiento en la segunda, tercera o cuarta semana después de la infección. Estos datos ilustran que ciertas condiciones de ganadería favorecen probablemente la expresión de la enfermedad.
c) Ensayos nº 3 a nº 7: Reproducción de los ensayos experimentales
La multiplicación de los ensayos experimentales sobre cerdos ha tenido como objetivo dominar y caracterizar mejor el modelo experimental. El conjunto de los resultados se presenta en la tabla 5.
En las condiciones experimentales, el MAP se caracteriza así por una larga incubación, de 8 a 14 días, unas verdaderas hipertermias de 2 a 8 días, una disminución del consumo alimenticio y una ralentización del crecimiento ponderal en la segunda, tercera o cuarta semana post-infección. La tabla lesional asociada a esta expresión clínica comprende esencialmente unas hipertrofias ganglionarias y unas lesiones de neumonía.
Conclusión
La realización de este modelo experimental permite demostrar de manera indiscutible el papel etiológico directo del circovirus MAP en la enfermedad. Además, este modelo es la herramienta indispensable para la comprensión de los mecanismos patogénicos y el estudio de futuros candidatos a vacunas.
Ejemplo 5: Demostración de la eficacia protectora de una composición vacunal según la invención realizada a partir de fragmentos nucleicos de secuencia de circovirus
MAP
1) Animales usados para el estudio
Se han usado unos lechones que presentan la enfermedad MAP, reproducida en las condiciones experimentales descritas en el párrafo c) del Ejemplo 4, en un protocolo de evaluación de la eficacia de la composición vacunal que comprende unos fragmentos nucleicos de secuencia de circovirus MAP.
2) Composición vacunal ensayada y protocolo de vacunación a) Componentes usados para el estudio
Se han obtenido los plásmidos a partir del plásmido pcDNA3 de INVITROGENE
-
Plásmidos pcDNA3 ORF-
Estos plásmidos son unos plásmidos que no comprenden ninguna inserción de ácido nucleico de circovirus MAP y se usan a título de plásmido de control negativo.
-
Plásmido pcDNA3ORF1+ y plásmido pcDNA3ORF2+
Los plásmidos pcDNA3ORF1+ y pcDNA3ORF2+ son unos plásmidos que comprenden una inserción de ácido nucleico de la secuencia del circovirus MAP de tipo B, respectivamente un inserción que comprende el fragmento de ácido nucleico SEC ID nº 11 (ORF'1) que codifica para la proteína Rep de secuencia SEC ID nº 14 y una inserción que comprende el fragmento de ácido nucleico SEC ID nº 12 (ORF'2) que codifica para la proteína de secuencia SEC ID nº 15, que corresponde probablemente a la proteína de cápside, comprendiendo estas construcciones nucleicas el codón ATG de iniciación de la secuencia que codifica la proteína correspondiente.
-
Plásmido GMCSF+
El GM-CSF (Granulocyte/macrophage-colony stimulating factor) es una citocina que interviene en el desarrollo, la maduración y la activación de los macrófagos, de los granulocitos y de las células dendríticas presentadoras de antígeno. Se estima que la aportación beneficiosa del GM-CSF en la vacunación es una activación celular en particular con el reclutamiento y la diferenciación de células presentadoras de antígeno.
Este plásmido pcDNA3-GMCSF+ comprende una inserción de ácido nucleico que codifica para el factor de estimulación de colonias granulocitos/macrófago, la proteína GM-CSF.
El gen que codifica para esta proteína GM-CSF ha sido clonado y secuenciado por Inumaru et al. (Immunol. Cell. Biol., 1995, 73(5), 474-476). El plásmido pcDNA3-GMCSF ha sido obtenido del Dr. B. Charley del INRA de Jouy-en-Josas (78, Francia).
-
Baculovirus recombinantes
Los baculovirus denominados ORF-son unos virus que no presenta ninguna inserción que comprende un fragmento de ácido nucleico capaz de expresar una proteína de circovirus MAP.
Los baculovirus denominados ORF1+ (BAC ORF1+) u ORF2+(BAC ORF2+) son unos baculovirus recombinantes que presentan respectivamente una inserción que comprende un fragmento de ácido nucleico SEC ID nº 11 (ORF'1)
y una inserción que comprende el fragmento de ácido nucleico SEC ID nº 12 (ORF'2). -Adyuvante El adyuvante suministrado por la Compañía Seppic filial de AIR LIQUIDE es el adyuvante que corresponde a la
referencia AIF SEPPIC. b) Protocolo de vacunación Se reparten unos lechones destetados de 3 semanas de edad en cuatro lotes A, B, C y D comprendiendo cada uno
8 lechones. Los lotes A, B y C, de 3 semanas de edad, reciben cada uno una primera inyección (inyección M1) de 1 ml que contiene 200 microgramos de plásmidos (ADN desnudo) en PSB, pH: 7,2, por vía intramuscular para cada uno de los plásmidos mencionados a continuación para cada lote, y después, a las 5 semanas de edad una segunda inyección (inyección M2) que comprende estos mismos plásmidos. Se practica una tercera inyección
simultáneamente por el otro lado del cuello. Esta tercera inyección comprende 1 ml de una suspensión que contiene 5·106 células infectadas por baculovirus recombinantes y 1 ml de adyuvante AIF SEPPIC. Lote A (F1) (lote de control): -primera inyección Plásmido pcDNA3ORF1-, plásmido pcDNA3ORF2-y plásmido GMCSF+, -segunda y tercera inyección (simultáneas) Plásmido pcDNA3ORF1-, plásmido pcDNA3ORF2-y plásmido GMCSF+; Células transformadas por baculovirus que
no contiene ninguna inserción de ácido nucleico que codifica para una proteína de circovirus MAP; Adyuvante AIF SEPPIC. Lote B (F2) (Lote de control): -primera inyección Plásmido pcDNA3ORF1-, plásmido pcDNA3ORF2-y plásmido GMCSF+;
-segunda y tercera inyección (simultáneas) Plásmido pcDNA3ORF1-, plásmido pcDNA3ORF2-y plásmido GMCSF+; Células transformadas por baculovirus que no contiene ninguna inserción de ácido nucleico que codifica para una proteína de circovirus MAP; Adyuvante AIF SEPPIC.
Lote C (F3): -primera inyección Plásmido pcDNA3ORF1-, plásmido pcDNA3ORF2+ y plásmido GMCSF+; -segunda y tercera inyección (simultáneas) Plásmido pcDNA3ORF1+, plásmido pcDNA3ORF2+ y plásmido GMCSF+; Células transformadas por unos baculovirus recombinantes BAC ORF1+ y BAC ORF2+ capaces de expresar
respectivamente la proteína Rep de secuencia SEC ID nº 14 y la proteína de secuencia SEC ID nº 15 del circovirus MAP de tipo B. Lote D (F4) (lote de control): ninguna inyección
Los lotes de lechones B, C y D se inyectan (puesta a prueba) a las 6 semanas de edad mientras que el lote A no está sometido a la prueba.
3) Seguimiento de los lotes -recuento tos-estornudos: 15 minutos/lote/día; -consistencia de las materias fecales: todos los días; -registros habituales: Toma de sangre semanal, pesaje; -pesajes de los rechazos alimenticios: 3 veces por semana; -cálculo de la ganancia diaria en peso (gmq);
Las ganancias medias diarias se han calculado para cada uno de los lotes en un periodo de 28 días tras la puesta a prueba (véase la figura 10), y se ha efectuado asimismo un cálculo intermedio de la gmq para cada uno de los lotes en el primer y el segundo periodo de 14 días. Los resultados obtenidos se indican a continuación en la tabla 6.
Tabla 6: Ganancias medias diarias
F1
F2 F3 F4
d1-d14
411 g 450 g 511 g 461 g
d14-d28
623 g 362 g 601 g 443 g
d0-d28
554 g 406 g 556 g 452 g
-
Medición de la hipertermia
La medición de la hipertermia, superior a 41ºC (véase la figura 11) y superior a 40,2ºC, se ha efectuado para cada uno de los lotes en un periodo total de 28 días tras la puesta a prueba. Los resultados obtenidos, que corresponden a la relación expresada en porcentaje entre el número de registros térmicos superiores a 41ºC (o superiores a
10 40,2ºC) y entre el número total de registros térmicos efectuados sobre el conjunto de los cerdos por periodos de una semana, se indican a continuación en las tablas 7 y 8, respectivamente para las mediciones de hipertermia superior a 41ºC y superior a 40,2ºC.
Tabla 7: Hipertermias > 41ºC
F1
F2 F3 F4
S1
4,1 0, 0, 0,
S2
10,7 16, 0, 8,9
S2
4,7 27, 0, 45,
S4
0, 0, 0, 7,5
Tabla 8: Hipertermias > 40,2ºC
F1
F2 F3 F4
S1
29,1 10,41 29,1 20,8
S2
28,5 39,2 10,7 37,5
S2
14,3 68,7 25,0 81,2
S4
3,3 17,5 20,0 55
4) Conclusión
Los registros efectuados muestran claramente que los animales que han recibido las tres inyecciones de una composición vacunal que comprende unos fragmentos de ácido nucleico de circovirus MAP según la invención y/o
20 capaces de expresar unas proteínas recombinantes de circovirus MAP, en particular de tipo B, no han presentado ninguna hipertermia (véase la figura 10). Estos animales no han conocido además ninguna disminución de su crecimiento, siendo las gmq comparables a las de los animales de control no infectados (véase la figura 9). No han presentado ninguna señal clínica particular.
Estos resultados demuestran la protección eficaz de los lechones contra la infección por un circovirus MAP de la
25 invención, agente primario responsable de la MAP o DFP, aportada por una composición vacunal preparada a partir de un fragmento de ácido nucleico de la secuencia nucleica de circovirus MAP según la invención, en particular de tipo B, y/o a partir de proteínas recombinantes codificadas por estos fragmentos de ácidos nucleicos.
Estos resultados muestran en particular que las proteínas aisladas codificadas por ORF1 y ORF2 de circovirus MAP según la descripción son unas proteínas inmunógenas que inducen una respuesta protectora eficaz para la
30 prevención de la infección por un circovirus MAP en una composición vacunal según la invención.
Ejemplo 6: Diagnóstico serológico de circovirus MAP mediante inmunodosificación usando unas proteínas recombinantes o unos péptidos de síntesis de circovirus MAP
A -Diagnóstico serológico mediante proteínas recombinantes
La identificación y la secuenciación de circovirus porcino MAP permiten producir mediante las técnicas de recombinación genética bien conocidas por el experto en la materia unas proteínas recombinantes de circovirus MAP.
Mediante estas técnicas, se han expresado unas proteínas recombinantes codificadas en particular por el ORF'2 del circovirus MAP, de tipo B, mediante unas células de insecto Sf9 transformadas y después aisladas.
Se extraen estas proteínas recombinantes codificadas por el ORF'2, después del cultivo de las células Sf9 transformadas, mediante lisis celular térmica gracias a 3 ciclos de congelación/descongelación -70ºC/+37ºC. Se lisan asimismo unas células Sf9 sanas o Sf9 de control no transformadas.
Estas dos fracciones antigénicas procedentes de células Sf9 de control no transformadas y de células Sf9 que expresan el ORF'2 se precipitan a 4ºC mediante una disolución al 60% más o menos 5% de sulfato de amonio saturado. Se realiza una dosificación de proteínas totales con la ayuda del kit Biorad. Se adsorben 500 ng de proteínas Sf9 de control y de proteínas Sf9 que expresan el ORF'2 semipurificadas, en disolución en tampón bicarbonato 0,05 M pH 9,6, de forma pasiva en el fondo de 3 cúpulas diferentes de una microplaca Nunc Maxisorp mediante incubación durante una noche a +4ºC.
La reactividad de los sueros de cerdos frente a cada una de estas fracciones antigénicas se evalúa mediante una reacción ELISA indirecta cuyo protocolo experimental se detalla a continuación:
-Etapa de saturación: 200 μl/cúpula de PBS1X/leche semidesnatada 3%, incubación durante 1h30 a 37ºC. -Lavado: 200 μl/cúpula de PBS1X/Tween 20: 0,05%, 3 lavados rápidos. -Etapa de incubación de los sueros: 100 μl/cúpula de suero diluido al 1/100 en PBS1X/leche semidesnatada,
1%/Tween 20: 0,05%, incubación durante 1 h a 37ºC. -Lavado: 200 μl/cúpula de PBS1X/Tween 20: 0,05%, 2 lavados rápidos seguidos de 2 lavados de 5 min. -Etapa de incubación del conjugado: 50 μl/cúpula de conjugado de conejo anti-cerdo diluido al 1/1000 en
PBS1X/leche semidesnatada, 1%/Tween 20: 0,05%, incubación durante 1h a 37ºC. -Lavado: 200 μl/cúpula de PBS1X/Tween 20: 0,05%, 2 lavados rápidos seguidos de 2 lavados de 5 min. -Etapa de revelado: 100 μl/cúpula de sustrato OPD/Tampón de citrato/H2O2, incubación durante 15 min. a 37ºC. -Detención de la reacción: 50 μl/cúpula H2SO41N. -Lectura con el espectrofotómetro a 490 nm.
Resultados
Los resultados obtenidos se presentan a continuación en la tabla 9.
Tabla 9
Antígenos
Reactividad del suero de cerdo no inoculado por el circovirus Reactividad del suero de cerdo inoculado por el circovirus
Sf9 de control purificado
0,076 0,088
Sf9 que expresa ORF'2 purificado
0,071 1,035
Los resultados se expresan en densidad óptica medida con el espectrofotómetro a 490 nm durante el análisis mediante ELISA de la reactividad de sueros de cerdo inoculado o no por el circovirus MAP de tipo B según el protocolo indicado anteriormente.
B -Diagnóstico serológico mediante péptido de síntesis
La cartografía epitópica de las proteínas codificadas, por ejemplo, por las secuencias nucleicas ORF1 y ORF2 de los dos tipos de circovirus MAP (tipos A y B) ha permitido entre otros identificar unos epítopos circovíricos inmunógenos sobre las proteínas codificadas por las secuencias nucleicas ORF'1 y ORF'2 así como los epítopos específicos de la proteína codificada por la secuencia nucleica ORF'2 del circovirus MAP de tipo B. Se han sintetizado en forma de péptido cuatro epítopos específicos del circovirus MAP de tipo B y un epítopo común a los dos tipos de circovirus MAP situados sobre la proteína codificada por la secuencia nucleica ORF'2. Se han sintetizado asimismo los péptidos equivalentes en el circovirus de tipo A. Todos estos péptidos han sido evaluados como antígenos de diagnóstico en el ámbito de la realización de un ensayo serológico.
Resultados
Los resultados obtenidos se representan en la tabla 10 a continuación.
Ejemplo 7: Caracterización de los epítopos específicos del circovirus MAP de tipo B
Se han elegido para este estudio las proteínas codificadas por el ORF2 de los circovirus porcinos de tipo A y B. Para cada una de las ORF2 (tipos A y B), se han sintetizado 56 péptidos de 15 aminoácidos que se solapan cada 4 aminoácidos, recubriendo así la totalidad de la proteína (véase la tabla 11 a continuación).
Tabla 11: Secuencia de aminoácidos de los 56 péptidos de 15 aminoácidos sintetizados a partir de la secuencia nucleica ORF'2 (tipo B) y ORF2 (tipo A) de circovirus MAP con su número de spot correspondiente (véase la figura 12)
ORF'2 tipo B
ORF2 tipo A
Spot nº
Secuencia Spot nº Secuencia
104
MTYPRRRYRRRRHRP 160 MTWPRRRYRRRRTRP
105
RRRYRRRRHRPRSHL 161 RRRYRRRRTRPRSHL
106
RRRRHRPRSHLGQIL 162 RRRRTRPRSHLGNIL
107
HRPRSHLGQILRRRP 163 TRPRSHLGNILRRRP
108
SHLGQILRRRPWLVH 164 SHLGNILRRRPYLVH
109
QILRRRPWLVHPRHR 165 NILRRRPYLVHPAFR
110
RRPWLVHPRHRYRWR 166 RRPYLVHPAFRNRYR
111
LVHPRHRYRWRRKNG 167 LVHPAFRNRYRWRRK
112
RHRYRWRRKNGIFNT 168 AFRNRYRWRRKTGIF
113
RWRRKNGIFNTRLSR 169 RYRWRRKTGIFNSRL
114
KNGIFNTRLSRTFGY 170 RRKTGIFNSRLSREF
115
FNTRLSRTFGYTVKR 171 GIFNSRLSREFVLTI
116
LSRTFGYTVKRTTVR 172 SRLSREFVLTIRGGH
117
FGYTVKRTTVRTPSW 173 REFVLTIRGGHSQPS
118
VKRTTVRTPSWAVDM 174 LTIRGGHSQPSWNVN
119
TVRTPSWAVDMMRFN 175 GGHSQPSWNVNELRF
120
PSWAVDMMRFNINDF 176 QPSWNVNELRFNIGQ
121
VDMMRFNINDFLPPG 177 NVNELRFNIGQFLPP
122
RFNINDFLPPGGGSN 178 LRFNIGQFLPPSGGT
123
NDFLPPGGGSNPRSV 179 IGQFLPPSGGTNPLP
124
PPGGGSNPRSVPFEY 180 LPPSGGTNPLPLPFQ
125
GSNPRSVPFEYYRIR 181 GGTNPLPLPFQYYRI
126
RSVPFEYYRIRKVKV 182 PLPLPFQYYRIRKAK
127
FEYYRIRKVKVEFWP 183 PFQYYRIRKAKYEFY
128
RIRKVKVEFWPCSPI 184 YRIRKAKYEFYPRDP
129
VKVEFWPCSPITQGD 185 KAKYEFYPRDPITSN
130
FWPCSPITQGDRGVG 186 EFYPRDPITSNQRGV
131
SPITQGDRGVGSSAV 187 RDPITSNQRGVGSTV
132
QGDRGVGSSAVILDD 188 TSNQRGVGSTVVILD
(continuación)
ORF'2 tipo B
ORF2 tipo A
Spot nº
Secuencia Spot nº Secuencia
133
GVGSSAVILDDNFVT 189 RGVGSTVVILDANFV
134
SAVILDDNFVTKATA 190 STVVILDANFVTPST
135
LDDNFVTKATALTYD 191 ILDANFVTPSTNLAY
136
FVTKATALTYDPYVN 192 NFVTPSTNLAYDPYI
137
ATALTYDPYVNYSSR 193 PSTNLAYDPYINYSS
138
TYDPYVNYSSRHTIT 194 LAYDPYINYSSRHTI
139
YVNYSSRHTITQPFS 195 PYINYSSRHTIRQPF
140
SSRHTITQPFSYHSR 196 YSSRHTIRQPFTYHS
141
TITQPFSYHSRYFTP 197 HTIRQPFTYHSRYFT
142
PFSYHSRYFTPKPVL 198 QPFTYHSRYFTPKPE
143
HSRYFTPKPVLDFTI 199 YHSRYFTPKPELDQT
144
FTPKPVLDFTIDYFQ 200 YFTPKPELDQTIDWF
145
PVLDFTIDYFQPNNK 201 KPELDQTIDWFQPNN
146
FTIDYFQPNNKRNQL 202 DQTIDWFQPNNKRNQ
147
YFQPNNKRNQLWLRL 203 DWFQPNNKRNQLWLH
148
NNKRNQLWLRLQTAG 204 PNNKRNQLWLHLNTH
149
NQLWLRLQTAGNVDH 205 RNQLWLHLNTHTNVE
150
LRLQTAGNVDHVGLG 206 WLHLNTHTNVEHTGL
151
TAGNVDHVGLGTAFE 207 NTHTNVEHTGLGYAL
152
VDHVGLGTAFENSIY 208 NVEHTGLGYALQNAT
153
GLGTAFENSIYDQEY 209 TGLGYALQNATTAQN
154
AFENSIYDQEYNIRV 210 YALQNATTAQNYVVR
155
SIYDQEYNIRVTMYV 211 NATTAQNYVVRLTIY
156
QEYNIRVTMYVQFRE 212 AQNYVVRLTIYVQFR
157
IRVTMYVQFREFNFK 213 VVRLTIYVQFREFIL
158
MYVQFREFNFKDPPL 214 TIYVQFREFILKDPL
159
VQFREFNFKDPPLNP 215 YVQFREFILKDPLNE
5 Estos péptidos han sido sintetizados según el método “spot” que consiste en una síntesis simultánea de un gran número de péptidos sobre un soporte sólido de celulosa, constituyendo a cada lugar de síntesis de un péptido un spot (Synt:em, NIMES). Este método implica una orientación de los péptidos sobre la placa, estando éstos fijados de manera covalente por el extremo carboxi. Un spot representa aproximadamente 50 nmoles de péptido.
La referencia de los spot y de las secuencias peptídicas correspondientes se proporciona en la tabla 11.
Estas membranas han sido usadas para unos ensayos de inmunorreactividad frente a sueros de cerdos EOPS infectados o no experimentalmente por la cepa circovírica MAP de tipo B así como frente a sueros de cerdos infectados, procedentes de ganaderías convencionales (ganaderías convencionales 1 o 2). Este estudio ha permitido demostrar unos péptidos inmunorreactivos específicos del circovirus de tipo B que corresponde a los spot nº 121, nº 132, nº 133 y nº 152 (respectivamente de secuencias de aminoácidos SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20). Se presenta una ilustración en la figura 12 en la que las membranas se revelan con un suero de cerdo infectado, procedente de una ganadería convencional. Se han demostrado asimismo unos péptidos inmunorreactivos no específicos de tipo, entre los cuales se considerará el péptido nº 146 que es altamente inmunógeno.
Una comparación entre las secuencias peptídicas de los circovirus de tipo A y B (figura 13) indica una divergencia comprendida entre 20 y 60% para los péptidos inmunorreactivos específicos de tipo B, y una divergencia más baja (13%) entre los péptidos no específicos.
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<160> 20
<170> PatentIn Vers. 2.0
<210> 1
<211> 1759
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo A
<220>
<223> Hebra de polaridad + (5'-3')
<400> 1
<210> 2
<211> 1759
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo A
<220>
<223> Hebra de polaridad -(5'-3')
<400> 2
<210> 3
<211> 939
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo A
<220>
<223> ORF1
<400> 3
<210> 4
<211> 702
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo A
<220>
<223> ORF2
<400> 4
<210> 5
<211> 621
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo A
10 <220>
<223> ORF3
<400> 5
<210> 6 15 <211> 312
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo A
<400> 6
<210> 7
<211> 233
<212> PRT
<213> Circovirus MAP tipo A
<400> 7
<210> 8
<211> 206
<212> PRT
<213> Circovirus MAP tipo A
<400> 8
<210> 9
<211> 1767
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo B
<220>
<223> Hebra de polaridad + (5'-3')
<400> 9
<210> 10
<211> 1767
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo B
<220>
<223> Hebra de polaridad -(5'-3')
<400> 10
10 <210> 11
<211> 945
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo B
<220> 15 <223> ORF1
<400> 11
<210> 12
<211> 702
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo B
<220>
<223> ORF2
<400> 12
10 <210> 13
<211> 315
<212> ADN
<213> Circovirus MAP tipo B
<220> 15 <223> ORF3
<400> 13
<210> 14
<211> 314 20 <212> PRT
<213> Circovirus MAP tipo B
<400> 14
<210> 15
<211> 233
<212> PRT
<213> Circovirus MAP tipo B
<400> 15
5 <210> 16
<211> 104
<212> PRT
<213> Circovirus MAP tipo B
<400> 16
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> Circovirus MAP tipo B
<400> 17
10 <210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> Circovirus MAP tipo B
<400> 18
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Circovirus MAP tipo B
20 <400> 19
<210> 20
<211> 15
<212> PRT 25 <213> Circovirus MAP tipo B
<400> 20

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la detección y/o identificación en una muestra biológica de un circovirus MAP de tipo B, caracterizado porque comprende:
    a) poner en contacto dicha muestra biológica con un polipéptido aislado codificado por una secuencia de
    5 nucleótidos que tiene al menos una identidad del 90% con la secuencia SEC ID Nº 12 y que se corresponde con el ORF’2 de un circovirus de tipo B, comprendiendo dicho polipéptido un epítopo específico del circovirus MAP de tipo B presentado mediante al menos un polipéptido seleccionado entre la SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19 y SEC ID Nº 20, y
    b) detectar los complejos antígeno-anticuerpo formados eventualmente.
    10 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido aislado comprende al menos una secuencia seleccionada entre: SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19 y SEC ID Nº 20.
  2. 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho polipéptido está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 95% con la secuencia SEC ID Nº 12
  3. 4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polipéptido está codificado por 15 una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia SEC ID Nº 12.
  4. 5.
    Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia SEC ID Nº 15.
  5. 6.
    Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia idéntica a la secuencia SEC ID Nº 15.
    20 7. Kit o estuche para la detección y/o identificación en una muestra biológica de un circovirus MAP de tipo B, que comprende:
    a) un polipéptido aislado definido según una de las reivindicaciones 1 a 6, y b) un reactivo para la creación de un medio adecuado para la realización de una reacción antigénica.
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