ES2548214T3 - Variantes del factor de crecimiento de fibroblastos 21 - Google Patents

Abstract

Una variante del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) humano, en la que la secuencia de aminoácidos es**Fórmula**

Description

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23-09-2015

en presencia o ausencia de Tween 80 al 0,02 %. Se prepararon las muestras a 30 mg/ml y se incubaron a 4 ºC, 25 ºC y 40 ºC durante 4 semanas. Las variantes de FGF21 formuladas recientemente (es decir, a tiempo cero) y aquellas incubadas durante 4 semanas se analizaron para el % de PMA mediante el procedimiento CEM. La tabla 6 resume los resultados del análisis, comparando las muestras de tiempo cero ("Iniciales") y aquellas incubadas 4 semanas a 40 ºC.

Tabla 6: Propensión a la agregación y compatibilidad con conservantes a una concentración de laFormulación de 30 mg/ml

variante de FGF21 de SEC ID Nº: 9 (L98L)

variante de FGF21 de SEC ID Nº: 1 (L98D)

Composición de Tampón

(% de PMA) 4 semanas a 40 ºC (% de PMA A) Inicial (% de PMA) 4 semanas a 40 ºC (% de PMA A)

Histidina 10 mM pH 7,0, pH 7,0, NaCl 150 mM

0,97 18,3 6,0 5,6

Histidina 10 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, alcohol bencílico al 0,9 %

11,0 33,9 4,2 6,0

Histidina 10 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, alcohol bencílico al 0,9 % Tween-80 al 0,02 %

11,0 32,1 4,3 5,3

La variante de FGF21 de SEC ID Nº: 1 contenía la sustitución de aminoácidos L98D. La variante de FGF21 de SEC ID Nº: 9 no contenía la sustitución de aminoácidos L98D y en cambio contenía el aminoácido leucina de tipo silvestre en la posición 98. El beneficio de la sustitución de aminoácidos L98D se observó cuando se formuló cada proteína a 30 mg/ml en las condiciones de formulación (Tabla 6). En todas las condiciones ensayadas, el estrés de las variantes FGF21 durante 4 semanas a 40 ºC dio como resultado un % de PMA sustancialmente más alto para la variante de FGF21 de SEC ID Nº: 9 en comparación con la variante de FGF21 de SEC ID Nº: 1. Además, la adición de alcohol bencílico al 0,9 %, un conservante común usado en una preparación farmacéutica multiusos, exacerbó el aumento del % de PMA para la variante de FGF21 de SEC ID Nº: 9 pero no para la variante de FGF21 de SEC ID Nº: 1. Esta incompatibilidad con alcohol bencílico también se observó en el análisis de la preparación de la muestra inicial, en el que el % de PMA en presencia de alcohol bencílico al 0,9 % es del 11 %, en comparación con únicamente el 0,97 % en ausencia de alcohol bencílico. Ni la variante de FGF21 de SEC ID Nº: 9 ni la variante de FGF21 de SEC ID Nº: 1 contienen el resto P115W, por lo tanto, la poca estabilidad física en estas condiciones no puede atribuirse al resto P114W. Después de que se hiciera la sustitución L98D, se observó una estabilidad física aumentada en presencia de alcohol bencílico al 0,9 %.

Estos datos indican que determinadas sustituciones pueden afectar a la estabilidad de la proteína total debido a la agregación en especies de peso molecular alto, particularmente en presencia de determinados conservantes tales como el alcohol bencílico. Se prefiere la minimización de esos agregados de PMA para proteínas terapéuticas. Esto puede llevarse a cabo a través de determinadas sustituciones en las proteínas de las variantes de FGF21, tales como L98D en las variantes mostradas en SEC ID Nº: 1. Otras sustituciones, tales como PI 15W, pueden tener efectos perjudiciales, tales como aumentar el nivel de agregación de las variantes.

Ejemplo 6

Degradación Proteolítica In Vivo

A los monos titís machos, n=2/grupo se les dosificó por vía subcutánea 2 mg/kg de una inyección de la variante FGF21 de SEC ID Nº: 1. Se obtuvo el suero a lo largo del curso de tiempo (extracción después de 0,25 a 12 horas) para una evaluación de 24 horas de la proteólisis in vivo por medio de una espectrometría de masas para cuantificar la cantidad de compuesto activo.

Se realizó un análisis por cromatografía líquida con espectrometría de masas (CL/EM). Se inmunoprecipitó una alícuota de 100 µl de cada muestra con anticuerpos monoclonales anti-FGF21 que se unían covalentemente a esferas magnéticas. Las muestras inmunoprecipitadas se separaron en alícuotas independientes, permitiendo la detección de proteínas intactas y proteínas digeridas con tripsina. Las proteínas intactas se inyectaron en una columna Discovery® Biowide Pore, de 100 x 0,32 mm d.i. que contenía partículas de 3 µm recubiertas con C5. Las muestras digeridas con tripsina se inyectaron en una columna Discovery Biowide Pore, de 100 x 0,32 mm d.i. que contenía partículas de 3 µm recubiertas con C5. La condiciones cromatográficas para todas las inyecciones usaron gradientes binarios que consistían en una fase móvil A (ácido fórmico:agua al 0,1/100) y una fase móvil B (ácido fórmico:acetonitrilo al 0,1/100). El efluente de la CL se conectó directamente con un espectrómetro de masas Micromass Synapt® Q-Tof para la detección del espectro de masas en modo de iones positivos. Los datos del espectrofotómetro de masas Q-Tof se recogieron usando los programas informáticos de deconvolución Masslinx (v 4.1) y MaxEnt1.

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