ES2552636T3

ES2552636T3 - Insulina estabilizada por halógenos

Info

Publication number: ES2552636T3
Application number: ES09803678.3T
Authority: ES
Inventors: Michael Weiss
Original assignee: Case Western Reserve University
Current assignee: Case Western Reserve University
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2015-12-01
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: KR20110061552A; NZ590792A; BRPI0916560A2; CA2732439A1; EP2318432A2; EP2318432A4; JP5780958B2; WO2010014946A3; CN102171245A; RU2555557C2; AU2009276346A1; AU2009276346B2; RU2011106744A; WO2010014946A2; EP2318432B1; JP2011529692A; JP2015180647A; EP2982687A1; CN102171245B; MX2011001181A

Abstract

Un análogo de insulina que comprende un polipéptido de cadena B que incorpora una fenilalanina monohalogenada en la posición B24.

Description

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similares, sin alejarse de la presente invención. Estos incluyen los aminoácidos hidrófobos neutros: alanina (Ala o A), valina (Val o V), leucina (Leu o L), isoleucina (Ile o I), prolina (Pro o P), triptófano (Trp o W), fenilalanina (Phe o F) y metionina (Met o M). De forma similar, los aminoácidos polares neutros pueden sustituirse entre sí dentro de su grupo de glicina (Gly o G), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), tirosina (Tyr o Y), cisteína (Cys o C), glutamina (Glu o Q), y asparagina (Asn o N). Se considera que los aminoácidos básicos incluyen lisina (Lys o K), arginina (Arg o R) e histidina (His o H). Los aminoácidos ácidos son ácido aspártico (Asp o D) y ácido glutámico (Glu o E). A no ser que se indique de otro modo o siempre que sea obvio a partir del contexto, debería considerarse que los aminoácidos indicados en el presente documento son aminoácidos L. En un ejemplo, el análogo de insulina de la presente invención contiene tres o menos sustituciones conservativas distintas de las sustituciones de Phe monohalogenada de la presente invención. En otro ejemplo, el análogo de insulina de la presente invención contiene una o menos sustituciones conservativas distintas de las sustituciones de Phe monohalogenada de la presente invención.

Como se usa en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, diversos aminoácidos en la insulina o un análogo de insulina pueden indicarse por el resto de aminoácido en cuestión, seguido de la posición del aminoácido, opcionalmente en superíndice. La posición del aminoácido en cuestión incluye la cadena A o B de insulina en la que se localiza la sustitución. Por lo tanto, PheB24 indica una fenilalanina en el vigésimo cuarto aminoácido de la cadena B de insulina, mientras que en PheB25 indica una fenilalanina en el vigésimo quinto aminoácido de la cadena B de insulina, y PheB26 indica una sustitución de tirosina por fenilalanina en el aminoácido vigésimo sexto aminoácido de la cadena B de insulina. Un aminoácido fluorado puede indicarse con el prefijo “F-“, un aminoácido bromado puede indicarse con el prefijo “Br-“ y un aminoácido clorado puede indicarse con el prefijo “CI-“. Por lo tanto, la fenilalanina fluorada puede abreviarse “F-Phe”, la fenilalanina clorada puede abreviarse “Cl-Phe” y la fenilalanina bromada puede abreviarse “Br-Phe”. En el caso de fenilalanina, la posición de los sustituyentes halógenos o sustituyentes en la cadena lateral de fenilo puede indicarse adicionalmente por el número del carbono con el que se une el halógeno. Por lo tanto, orto-monofluoro-fenilalanina (mostrada en la Fig. 2B) se abrevia “2F-Phe”, meta-monofluoro-fenilalanina (mostrada en la Fig. 2C) se abrevia “3F-Phe” y para-monofluoro-fenilalanina (mostrada en la Fig. 2D) se abrevia 4F-Phe. Pentafluoro-fenilalanina (mostrada en la Fig. 2A) se abrevia como “F5-Phe”. De forma similar, orto-monobromofenilalanina puede abreviarse “2Br-Phe”, orto-monocloro-fenilalanina puede abreviarse “2Cl-Phe”.

La fenilalanina en B24 es un aminoácido invariante en insulina funcional y contiene una cadena lateral aromática. La importancia biológica de PheB24 en insulina se indica por una mutación clínica (SerB24) que provoca diabetes mellitus humana. Como se ilustra en las Figs. 1D y 1E, y sin desear quedar ligado a la teoría, se cree que PheB24 se empaqueta en el borde de un núcleo hidrófobo en la superficie de unión a receptor clásica. Los modelos se basan en un promotor cristalográfico (molécula 1 de 2-Zn; identificador de Banco de Datos de Proteínas 4INS). Dentro de la hebra  C-terminal de la cadena B (restos B24-B28), PheB24 está adyacente a la hélice  central (restos B9-B19). Una cara y borde del anillo aromático quedan dentro de un bolsillo superficial definido por LeuB15 y CysB19; la otra cara y borde se exponen a disolvente (Fig. 1E). Este bolsillo está rodeado en parte por los grupos carbonilo y amida de cadena principal y crea de este modo un ambiente electrostático complejo y asimétrico. Se proporcionan los efectos del sustituyente casi simétrico tetrafluoro-fenilalanina (F5-PheB24) (con sus interacciones generales de fluorarilo-arilo e hidrofobicidad potenciadas); (Fig. 2A) con los de análogos “desequilibrados” que contienen sustituciones orto-, meta-o para-fluorosas individuales (designados 2F-Phe, 3F-Phe, o 4F-Phe, Figs. 2B-2D, respectivamente) en la estabilidad de insulina.

Se cree que PheB25 queda en la superficie del monómero de insulina y en estructuras en solución se proyecta hacia disolvente con menos organización estructural que la de PheB24. Su importancia biológica se indica de modo similar por una mutación clínica (LeuB25) que provoca diabetes humana. TyrB26, como PheB24, queda en el borde del núcleo hidrófobo donde se empaqueta cerca de los restos no polares IleA2, ValA3 y ValB12. Los estudios de fotorreticulación sugieren que cada una de las cadenas laterales de los restos B24, B25 y B26 entra en contacto con el receptor de insulina. En dímeros y hexámeros de restos de insulina, se cree que los restos B24-B26 y los restos relacionados simétricamente B24’-B26’ participan en una lámina  antiparalela intermolecular. Se cree que las cadenas laterales aromáticas en estas posiciones estabilizan el empaquetamiento entre monómeros en esta interfaz de lámina .

Se prevé que las sustituciones de la presente invención pueden realizarse en cualquiera de varios análogos de insulina existentes. Por ejemplo, las sustituciones de fenilalanina monohalogenada (X-Phe) proporcionadas en el presente documento pueden realizarse en análogos de insulina tales como insulina Lispro, insulina Aspart, otras insulinas modificadas o análogos de insulina, o dentro de diversas formulaciones farmacéuticas, tales como insulina regular, insulina NPH, insulina lente o insulina ultralente, además de insulina humana. La insulina Aspart contiene una sustitución de AspB28 y se vende como Novalog mientras que la insulina Lispro contiene sustituciones de LysB28 y Pro329 y se conoce y se vende con el nombre Humalog. Estos análogos se describen en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.149.777 y 5.474.978. Ambos de estos análogos se conocen como insulinas de acción rápida.

También puede introducirse una sustitución de Phe monohalogenada en B24 en análogos de insulina humana que, aunque no se han usado previamente de forma clínica, aún se usan experimentalmente, tales como DKP insulina, descrita en más detalle posteriormente, o mini-proinsulina, un análogo de proinsulina que contiene un enlazador dipeptídico (Ala-Lys) entre las partes de cadena A y cadena B de la insulina en lugar de la región de conexión de 35 aminoácidos normal entre el resto C terminal de la cadena B y el resto N terminal de la cadena A. La incorporación

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R1 es His; y

R6 es His; y

R5 y R6 juntos son His.

También puede introducirse una sustitución de Phe monohalogenada en B24 en un análogo de insulina monocatenario como se desvela en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos relacionada n.º 60/828.153.

Se introdujeron sustituciones de flúor dentro de un monómero de insulina modificado técnicamente de alta actividad, designado DKP-insulina, que contiene las sustituciones AspB10 (D), LysB28 (K) y ProB29 (P). Se cree que estas tres sustituciones en la superficie de la cadena B impiden la formación de dímeros y hexámeros. El uso de un monómero modificado técnicamente evita los efectos de confusión de autoensamblaje en los ensayos de estabilidad. La estructura de DKP-insulina se asemeja estrechamente a un protómero cristalográfico. La secuencia del polipéptido de cadena B para DKP insulina se proporciona como SEC ID Nº 8, en la que Xaa es Tyr o Phe.

SEC ID Nº 8 (Secuencia de cadena B de DKP) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Lys-Pro-Thr

Se prepararon análogos de DKP-insulina por semi-síntesis catalizada por tripsina y se purificaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (Mirmira, R.G., y Tager, H.S., 1989. J. Biol. Chem. 264: 6349-6354.). Este protocolo emplea (i) un octapéptido sintético que representa los restos (N)-GF*FYTKPT (incluyendo el resto modificado (F*) y sustituciones “KP” (subrayado); SEC ID Nº 9) y (ii) análogo truncado des-octapéptido [B23-B30]-AspB10-insulina (SEC ID Nº 16). Debido a que el octapéptido difiere de la secuencia de B23-B30 de tipo silvestre (GFFYTPKT; SEC ID Nº 10) por intercambio de ProB28 y LysB29 (en cursiva), no se requiere protección del grupo amino- de lisina durante el tratamiento con tripsina. Brevemente, se disolvieron des-octapéptido (15 mg) y octapéptido (15 mg) en una mezcla de dimetilacetamida/1,4-butanodiol/Tris acetato 0,2 M (pH 8) que contiene acetato cálcico 10 mM y ácido etilendiamin tetra-acético (EDTA) 1 mM (35:35:30, v/v, 0,4 ml). El pH final se ajustó a 7,0 con 10 l de Nmetilmorfolina. La solución se enfrió a 12 ºC, y se añadieron 1,5 mg de TPCK-tripsina y se incubó durante 2 días a 12 ºC. Se añadieron 1,5 mg adicional de tripsina después de 24 h. La reacción se acidificó con ácido trifluoroacético 0,1 % y se purificó por HPLC de fase inversa preparatoria (C4). La espectrometría de masas usando desorción/ionización por láser asistida por matriz tiempo de vuelo (MALDI-TOF; Applied Biosystems, Foster City, CA) en cada caso dio valores esperados (no mostrados). El protocolo general para síntesis de fase sólida es como describe (Merrifield et al., 1982. Biochemistry 21: 5020-5031). Se obtuvieron análogos de fenilalanina protegidos por 9-fluoren-9-il-metoxi-carbonilo (F-moc) de Chem-Impex International (Wood Dale, IL).

Se obtuvieron espectros de dicroísmo circular (DC) a 4 ºC y 25 ºC usando un espectropolarímetro Aviv (Weiss et al., Biochemistry 39: 15429-15440). Las muestras contenían DKP-insulina aproximadamente 25 M o análogos en fosfato potásico 50 mM (pH 7,4); las muestras se diluyeron a 5 M para estudios de desnaturalización inducida por guanidina a 25 ºC. Para extraer energías libres de desplegamiento, se ajustaron las transiciones de desnaturalización por mínimos cuadráticos no lineales a un modelo de dos estados como se describe en Sosnick et al., Methods Enzymol. 317: 393-409. Brevemente, los datos de DC (x), donde x indica la concentración de desnaturalizante, se ajustaron por un programa de mínimos cuadráticos no lineal de acuerdo con

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en la que x es la concentración de guanidina y en la que A y B son valores de línea basal en los estados nativo y desplegado.

Las imagen8líneas basales se aproximaron por las líneas pre-y post-transición

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Los valores de m obtenidos al ajustar las transiciones de desplegamiento variantes son menores que el valor de m obtenido al ajustar la curva de desplegamiento de tipo silvestre. Para ensayar si esta diferencia y el cambio aparente en Gu resultan de una incapacidad para medir la señal DC desde el estado completamente desplegado, se realizaron simulaciones en las que los datos se extrapolaron a valores de DC constantes a mayores concentraciones de guanidina; esencialmente se obtuvieron estimaciones idénticas de Gu y

m.

La actividad relativa se define como la relación de análogo frente a insulina humana de tipo silvestre requerida para desplazar el 50 por ciento de 125I-insulina humana unida específicamente. Se empleó una preparación de membrana placentaria humana que contenía el receptor de insulina (RI) como se conoce en la técnica. Se incubaron

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fragmentos de membrana (0,025 mg de proteína/tubo) con insulina humana marcada con 125I (aprox. 30.000 cpm) en presencia de concentraciones seleccionadas de análogo no marcado durante 18 horas a 4 ºC en un volumen final de 0,25 ml de Tris-HCl 0,05 M y albúmina de suero bovino 0,25 por ciento (p/v) a pH 8. Después de la incubación, las mezclas se diluyen con 1 ml de tampón helado y se centrifugan (10.000 g) durante 5 min a 4 ºC. El sobrenadante se retira después por aspiración, y el sedimento de membrana se recuenta con respecto a radiactividad. Los datos se corrigen para unión no específica (cantidad de radiactividad que permanece en la membrana asociada en presencia de insulina humana 1 M. En todos los ensayos el porcentaje de indicador unido en ausencia de ligando de competición fue menor del 15 % para evitar artefactos de empobrecimiento de ligandos. Se realizó un ensayo de unión a receptor de insulina adicional para controlar los cambios en la actividad durante el transcurso de la incubación del análogo de insulina a 37 ºC usando una captura de anticuerpo de placa de microtitulación como se conoce en la técnica. Se incubaron placas de tira de microtitulación (Nunc Maxisorb) durante una noche a 4 ºC con IgG AU5 (100 l/pocillo de 40 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato). Los datos de unión se analizaron por un modelo secuencial de dos sitios. Se empleó un ensayo de anticuerpo de placas de microtitulación correspondientes usando el receptor de IGF de Tipo I para evaluar la unión cruzada con este receptor homólogo.

Los espectros de dicroísmo circular (DC) de ultravioleta lejano de los análogos fluorados individualmente son esencialmente idénticos a los del análogo parental (Fig. 3); se observa una ligera distorsión en el espectro del análogo de F5-PheB24 (Fig. 3, Panel D). Las estabilidades y actividades de unión a receptor de los análogos se proporcionan en la Tabla 1. Se introdujeron restos de B24 modificados dentro del contexto de DKP-insulina. Los valores de actividad mostrados se basan en la relación de constantes de disociación de receptor-hormona en relación con la insulina humana; la actividad de insulina humana es por lo tanto 1,0 por definición. Los errores típicos en los valores de actividad fueron en general menores del 25 %. Se estimaron las energías libres de desplegamiento (Gu) a 25 % basándose en un modelo de dos estados como se extrapoló hasta concentración desnaturalizante cero. El tiempo de retardo indica el tiempo (en días) requerido para el inicio de la fibrilación de proteínas con agitación suave a 37 ºC en solución salina tamponada con fosfato sin cinc (pH 7,4).

Tabla 1 Actividades y Estabilidades de Análogos de Insulina

análogo: actividad Gu (kcal/mol) Cmid (M) m (kcal mol-1 M-1) tiempo de retardo

DKP-insulina: 2,42 4,0  0,1 5,6  0,1 0,70  0,01 12,4  2,5

F5-PheB24-DKP: 0,013 4,8  0,1 5,8  0,1 0,84  0,02 17,7  2,1

2F-PheB24 -DKP: 0,37 4,9  0,1 5,8  0,1 0,85  0,02 16,0  0,1

3F-PheB24-DKP: 1,02 3,8  0,1 5,5  0,2 0,70  0,02 17,7  3,7

4F-PheB24-DKP: 0,43 3,9  0,1 5,6  0,2 0,70  0,02 11,0  1,6

La sustitución de PheB24 por F5-Phe aumenta la estabilidad de DKP-insulina en 0,8  0,1 kcal/mol a 25 ºC (Fig. 4, Panel D). A pesar de dicho efecto favorable en la estabilidad, la actividad del análogo es insignificante (< 1 % de afinidad de unión a receptor en relación con análogo parental; Tabla 1 y Fig. 5). Esta alteración es más notable que la observada habitualmente en la sustitución de un único aminoácido convencional. Por el contrario, los análogos sustituidos individualmente conservan cada uno actividad significativa: orto (37 % en relación con insulina humana), meta (100 %) y para (43 %). Dichas actividades están cada una por encima del umbral del 10 % (correspondiente a una constante de disociación de receptor-hormona de < 1 nM) generalmente predictivo de eficacia terapéutica. Además, mientras que los análogos de insulina 3F-PheB24 y 4F-PheB24 no son más estables (y posiblemente son ligeramente menos estables) que el análogo parental (Fig. 4 y Tabla 1), 2F-PheB24-DKP-insulina es al menos tan estable como el análogo de F5-Phe (Gu 0,9  0,1 kcal/mol). Las estabilidades físicas de los análogos se evaluaron por triplicado durante la incubación en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 60 M a pH 7,4 a 34 ºC con agitación suave. Las muestras se observaron durante 20 días o hasta que se observaron señales de precipitación o escarchado del vial de vidrio. Los análogos de F5-, 2F-y 3F-PheB24-DKP-insulina (pero no 4F-PheB24-DKP-insulina) muestran cada uno un aumento en el tiempo de retardo (en relación con el análogo parental) antes de la aparición de la fibrilación de proteínas (Tabla 1). Por lo tanto la sustitución de un único átomo de flúor es capaz de aumentar la estabilidad de un análogo de insulina monomérico con retención de actividad reducida pero clínicamente significativa; la modificación también puede extender el tiempo de retardo antes de la fibrilación de proteínas con agitación suave a pH 7,4 y 37 ºC.

Mientras que la sustitución de F5-PheB24 es altamente estabilizante, este análogo de insulina esencialmente no tiene actividad biológica. Notablemente, la modificación regioespecífica 2F-PheB24 es igualmente estabilizante conservando al mismo tiempo afinidad sustancial (aunque reducida) por el receptor de insulina.

También se introdujeron sustituciones de flúor, esencialmente como se ha descrito anteriormente con la excepción de fenilalanina orto-. meta-, para-y penta-fluorada que se introducía en las posiciones B24. B25 y B26 en insulina lispro (es decir, un análogo de insulina que también contiene las sustituciones LysB28, ProB29 (vendido con el nombre Humalog)). Los análogos que contienen sustituciones de fenilalanina orto-. meta-, para-y penta-fluorada en la posición B24 se designan 2F-PheB24-KPinsulina, 3F-PheB24-KP-insulina, 4F-PheB24-KP-insulina, F5-PheB24-KPinsulina, respectivamente. Los análogos que contienen sustituciones de fenilalanina orto-. meta-, para-y pentafluorada en la posición B25 se designan 2F-PheB25-KP-insulina, 3F-PheB25-KP-insulina, 4F-PheB25-KP-insulina, F5

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PheB25-KP-insulina, respectivamente. Los análogos que contienen sustituciones de fenilalanina orto-. meta-, para-y penta-fluorada en la posición B26 (que sustituyen tirosina) se designan 2FPheB26-KP-insulina, 3F-PheB26-KP-insulina, 4F-PheB26-KP-insulina, F5-PheB26-KP-insulina, respectivamente. Adicionalmente, se sustituyó con orto-bromo y ortocloro fenilalanina en insulina lispro en la posición B24. Estos análogos se designan 2Br-PheB24-KP-insulina y 2ClPheB24-KP-insulina, respectivamente. Las designaciones de análogos respectivos de KP-insulina y DKP-insulina se abrevian en las tablas y figuras como KP y DKP con “insulina” omitido para mayor brevedad.

Más específicamente, para sustituciones de fenilalanina halogenada en B24, se usaron un octapéptido sintético que representaba los restos (N)-GF*FYTKPT (resto de fenilalanina halogenado indicado como “F*” y sustituciones “KP” (subrayado); SEC ID Nº 9) y análogo truncado des-octapéptido[B23-B30]-insulina (tipo silvestre en la posición B10; SEC ID Nº 17). Para sustituciones de fenilalanina fluorada en B25, se usaron un octapéptido sintético que representaba los restos (N)-GFF*YTKPT (fenilalanina fluorada indicada de nuevo como “F*” y sustituciones “KP” (subrayado); SEC ID Nº 9) y análogo truncado des-octapéptido[B23-B30]-insulina (tipo silvestre en la posición B10; SEC ID Nº 17). Para sustituciones de fenilalanina fluorada en B26, se usaron un octapéptido sintético que representaba los restos (N)-GFFF*TKPT (fenilalanina fluorada indicada de nuevo como “F*” y sustituciones “KP” (subrayado); SEC ID Nº 18) y análogo truncado des-octapéptido[B23-B30]-insulina (tipo silvestre en la posición B10; SEC ID Nº 17). De forma similar, para sustituciones de cloro-y bromo-fenilalanina en B24 (2Cl y 2Br), se usaron un octapéptido sintético que representaba los restos (N)-GF*FYTKPT (resto de fenilalanina halogenada indicado como “F*” y sustituciones “KP” (subrayado); SEC ID Nº 9) y análogo truncado des-octapéptido[B23-B30]-insulina (tipo silvestre en la posición B10; SEC ID Nº 17). Típicamente, se disolvieron des-octapéptido (15 mg) y octapéptido (15 mg) en una mezcla de dimetilacetamida/1,4-butandiol/Tris acetato 0,2 M (pH 8) que contenía acetato cálcico 10 mM y ácido etilendiamin tetra-acético (EDTA) 1 mM (35:35:30 v/v, 04, ml). El pH final se ajustó a 7,0 con 10 l de Nmetilmorfolina. La solución se enfrió a 12 ºC, y se añadieron 1,5 mg de TPCK-tripsina y se incubaron durante 2 días a 12 ºC. Se añadieron 1,5 mg adicionales de tripsina después de 24 h. La reacción se acidificó con ácido trifluoroacético 0,1 % y se purificó por HPLC (C4) de fase inversa. La espectrometría de masas usando desorción/ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF; Applied Biosystems, Foster City, CA) en cada caso proporcionó valores esperados. La actividad relativa y las constantes de disociación se determinaron como se ha descrito anteriormente.

Los datos resultantes se presentan en la Tabla 2 para sustitución de una fenilalanina fluorada en la posición B24 de insulina. Para fines de comparación, se ensayaron insulina de tipo silvestre y 2F-PheB24-DKP-insulina en las mismas condiciones a 37 ºC. Los datos para ensayo a 37 ºC se presentan posteriormente en la Tabla 3. Los datos para sustituciones de fenilalanina fluorada en las posiciones B24, B25 y B26 y fenilalanina bromo-y cloro-sustituida en un fondo de análogo de insulina lispro se presentan posteriormente en la Tabla 4.

Tabla 2

Estabilidad y Actividad de PheB24-DKP

Muestra Gu (Kcal/mol) Gu (Kcal/mol) Cmid (M Gu-HCl) m (Kcal/mol/M) unión a receptor

DKP-insulina 4,3  0,06 / 5,4  0,1 0,80  0,01 161

2F-PheB24-DKP 4,9  0,1 0,6 5,8  0,1 0,85  0,02 37

3F-PheB24-DKP 3,8  0,1 -0,5 5,5  0,2 0,70  0,02 102

4F-PheB24-DKP 3,9  0,1 -0,4 5,6  0,2 0,70  0,02 43

F5-PheB24-DKP 4,84  0,1 0,54 5,8  0,1 0,85  0,02 1

Tabla 3

Muestra: Estabilidad y Actividad de Insulina y PheB24-DKP-insulina [37 ºC]. Gu (Kcal/mol) Gu (Kcal/mol) Cmid (M Gu-HCl) m (Kcal/mol/M) unión a receptor

insulina wt: 2,4  0,10 - 4,1  0,17 0,57  0,06 100

2F-PheB24-DKP: 3,1  0,1 0,7 4,9  0,1 0,64  0,03

Tabla 4 Estabilidad y Actividad del Análogo de Phe Halogenada de Insulina Lispro

Gu Gu Cmid m Muestra de receptor (Kcal/mol) (Kcal/mol) (M Gu-HCl) (Kcal/mol/M) unión KP-insulina 3,0  0,06 / 4,5  0,1 0,61  0,01 92 2F-PheB24-KP 3,8  0,1 1,0  0,16 4,9  0,1 0,76  0,02 17 3F-PheB24-KP 3,0  0,1 0,2  0,16 4,5  0,15 0,67  0,02 12 4F-PheB24-KP 2,75  0,1 0,05  0,16 4,4  0,1 0,62  0,02 32 F5-PheB24-KP 3,8  0,1 1,0  0,16 5,0  0,1 0,76  0,01 0,04

2F-PheB25-KP: 3,3  0,1 0,5  0,16 4,3  0,2 0,76  0,03 15

3F-PheB25-KP: 2,9  0,1 0,1  0,16 4,5  0,2 0,65  0,02 41

4F-PheB25-KP: 2,9  0,1 0,1  0,16 4,5  0,1 0,65  0,01 78

F5-PheB25-KP: 2,9  0,1 0,1  0,16 4,5  0,2 0,65  0,03 0,4

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Tabla 7 Unión cruzada de análogos de insulina con el receptor de IGF

proteína: Kd (nM) relación a insulina

IGF-I: 0,037  0,003 260

insulina humana: 9,6  0,3 1

KP-insulina: 10,6  1 1

AspB10-insulina ArgB31, ArgB32, GlyA21-insulina DKP-insulina: 4,2 3,1 1,6  0,1 2 3 6

2F-PheB24-KP 2Br-PheB24-KP 2Cl-PheB24-KP 2F-PheB24-DKP: 34 10,1 9,6 9,2 < 0,3 1 1 1

Las mediciones de unión cruzada de análogos de insulina seleccionados con el receptor de IGF se resumen en la Tabla 7. La insulina humana en estas condiciones se une con IGFR-260 veces menos estrechamente que con IGF-I. La unión cruzada de AspB10-insulina aumenta el doble mientras que la unión cruzada por un análogo en uso clínico amplio, ArgB31, ArgB32, GlyA21-insulina (insulina glargine™; Lantus™), aumenta el triple. Dicho aumento de la unión cruzada con IGFR es indeseable ya que el tratamiento de las ratas Sprague-Dawley con AspB10-insulina se asocia con una incidencia aumentada de tumores mamarios mientras que los estudios clínicos recientes sugieren la posibilidad de que el uso humano de Lantus confiera un aumento dependiente de la dosis en el riesgo de diversos cánceres. (La secuencia de IGF-I contiene Glu en la posición B10, similar en carga negativa a AspB10. Aunque sin desear quedado ligado a la teoría, se cree que la unión cruzada por Lantus aumenta por los dos restos básicos en el extremo C terminal de la cadena B. Debido a que IGF-I también contiene Lys en la posición B28 y Pro en la posición B29, es posible que KP-insulina pueda mostrar un pequeño aumento en la unión cruzada pero los datos anteriores no son suficientemente precisos para establecerlo). DKP-insulina muestra un aumento seis veces en la unión cruzada de IGFR. De forma significativa, este aumento se contrarresta por una sustitución de orto-monofluoro en B24: 2F-PheB24-DKP-insulina muestra el mismo nivel bajo de unión cruzada que la insulina humana de tipo silvestre. Su potencia hipoglucémica en ratas diabéticas también es igual que la de insulina humana (Tabla 6). Debido que 2FPheB24-DKP-insulina es monomérica incluso a concentraciones proteicas > 0,5 mM, este análogo tiene por lo tanto utilidad potencial como una formulación de insulina de acción ultra-rápida y ultra-estable para uso clínico. Las afinidades de unión cruzada de 2Cl-PheB24-KP-insulina y 2Br-PheB24-KP-insulina también tienen un nivel bajo similar al de insulina humana. Estos análogos también son completamente activos en ratas diabéticas (Tabla 5).

Se determinaron los espectros de DC para insulina humana, KP-insulina (lispro) y análogos de insulina de PheB24 halogenada como se ha descrito anteriormente. Se proporciona desnaturalización de proteína detectada por DC en función de la concentración de clorhidrato de guanidina en las Figs. 7A y 7B. La Fig. 7A proporciona una comparación de insulina humana (línea continua) y KP-insulina (línea discontinua; “parental”) con análogos de KPinsulina que contienen sustitución monofluorosa de PheB24 en la posición 2, 3 o 4 (triángulos rellenos, cuadrados rellenos y círculos abiertos, respectivamente). La Fig. 7B proporciona una comparación de insulina humana (línea continua) y KP-insulina (línea discontinua; “parental”) con análogos que contienen una modificación 2-Cl o 2-Br de PheB24 (triángulos invertidos rellenos y triángulos abiertos, respectivamente). Se han proporcionado anteriormente parámetros termodinámicos inferidos en la Tabla 4.El desplegamiento fraccional se controló por la elipticidad residual media a 222 nm a 25 ºC.

Se han obtenido estructuras de RMN de análogos de insulina seleccionados para demostrar que las sustituciones de halógenos se acomodan bien en insulina y no provocan alteraciones conformacionales transmitidas. Se proporcionan espectros de 1H-RMN en las Figs. 8A y 8B. La estructura de RMN de 2Cl-PheB24-KP-insulina como un monómero en solución es por lo tanto similar a la de KP-insulina; de forma similar, la estructura de RMN de 2FPheB24-DKP-insulina (también como un monómero en solución) es similar a la de DKP-insulina. El análisis cualitativo de los espectros de RMN de 2F-PheB24-KP-insulina y de 2Br-PheB24-KP-insulina indican de forma similar estructuras de tipo nativo.

Se han determinado las estructuras cristalinas de 2F-PheB24-KP-insulina y 4F-PheB24-KP-insulina como hexámeros estabilizados por cinc en presencia del conservante fenol (datos no mostrados). Las estructuras son similares a las previamente indicadas para KP-insulina como un hexámero estabilizado por cinc en presencia de fenol. En cada caso la conformación del hexámero es T3Rf3 que contiene dos iones de cinc axiales y tres moléculas de fenol unidas. Se observa fácilmente la densidad electrónica para los átomos de halógeno. La estructura de las superficies formadoras de dímeros y trímeros se conserva en los análogos halogenados, lo que sugiere que pueden obtenerse formulaciones farmacéuticas similares a las empleadas para KP-insulina y otros análogos de insulina de acción rápida.

El análogo de insulina de la invención encuentra utilidad en un método para tratar a un paciente, que comprende administrar un análogo de insulina sustituido con monohalógeno al paciente. En un ejemplo, el análogo de insulina sustituido con halógeno es un análogo de insulina que contiene fenilalanina sustituida con halógeno, tal como una

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Claims

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