ES2548700T3 - Inhibición de la vía alternativa del complemento para el tratamiento de lesión cerebral traumática, lesión de médula espinal y afecciones relacionadas - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para uso en la reducción o prevención de al menos un síntoma de daño fisiológico que resulta de lesión cerebral traumática (LCT) o lesión de médula espinal (LME) en un animal o para mejorar la recuperación de LCT o LME en el animal, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une selectivamente a e inhibe la actividad del factor B, el factor D o properdina.

Description

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una proteína de fusión constituida por los segundo y tercer dominios de la repetición consenso corta (SCR) del factor B enlazados a los dominios bisagra, CH2 y CH3 de un isotipo de IgG1 de ratón (véase la figura 1). Estos dominios de SCR se seleccionaros porque son parte el segmento delecionado del gen del factor B en los ratones fB-/-. Los ratones se cribaron para una respuesta inmunitaria al factor B (por ejemplo, usando ELISA), y células esplénicas de 5 uno de los ratones inyectados se fusionaron con células de mieloma. Uno de los hibridomas resultantes, llamado 1379, produce un anticuerpo IgG1 que inhibe la activación de la vía alternativa del complemento in vitro (figuras 2A y 2B) e in vivo (figura 3). Específicamente, este anticuerpo se puso a prueba en dos ensayos in vitro de actividad de la vía alternativa (figuras 2A y 2B), y mostró que el anticuerpo puede inhibir completamente la lisis de eritrocitos por suero humano, confirmando de este modo la capacidad de este reactivo para bloquear completamente la activación 10 de la vía alternativa del complemento. Cuando los ratones se pusieron a prueba para inhibición de la vía alternativa en diversos momentos después de una única inyección del anticuerpo inhibidor, 1 mg de anticuerpo causó completa inhibición en el plazo de una hora cuando se inyectaba IV y en el plazo de dos horas cuando se inyectaba IP (figura 3). Los ratones que recibieron una inyección de un mg IP conservaban la inhibición completa de la vía alternativa a las 24 horas y los que recibieron una inyección de dos mg conservaban la inhibición completa hasta 48 horas

15 después de la inyección. Los inventores también han inyectado 2 mg del anticuerpo 1379 de forma repetitiva i.p. cada dos días durante 14 días y han demostrado que la completa inhibición de la vía alternativa del complemento se mantuvo durante al menos 48 horas después de la última inyección. Además, fragmentos Fab preparados a partir de este anticuerpo también daban como resultado la completa inhibición de la vía alternativa a niveles aproximadamente equimolares como con el anticuerpo 1379 intacto.

20 El anticuerpo 1379 inhibe la activación de la vía alternativa en suero de animales incluyendo, ratones, ratas, seres humanos, babuinos, monos rhesus, monos cyno, cerdos, conejos y caballos (Tabla 1).

Tabla 1

Especies en las que la vía alternativa es completamente inhibida por mAb 1379

• Ratón • Ser humano • Rata • Babuino • Rhesus • Cerdo • Mono Cyno • Caballo

Especies en las que la vía alternativa no es inhibida por el mAb 1379

• Perro • Cobaya

25 Un panel de anticuerpos anti-factor B producidos por los inventores se muestra en la Tabla 2. Tal como se ha descrito anteriormente, los inventores han demostrado que el mAb 1379 se une e inhibe a factor B tanto de ratón como humano. En contraste, el mAb designado 624 puede unirse a factor B tanto de ratón como humano, pero no inhibe la vía alternativa humana. Tal como se revela en un ensayo competitivo, los anticuerpos 624, 691 y 1231 no

30 bloquean la unión por 1379. Estos anticuerpos deben unirse, por lo tanto, a la proteína en un sitio diferente, explicando por qué se unen al factor B sin inhibir su función in vitro. Sin embargo, los anticuerpos 395, 1322 y 1060 son inhibidores competitivos de 1379.

Tabla 2

Clon

Isotipo Se une al fB de ratón Se une al fB humano Inhibe vía alternativa de ratón (ensayo con cimosano) Inhibe la vía alternativa humana (ensayo de lisis de eritrocitos de conejo) Compite con 1379 por la unión a fB humano

1379

IgG1  +++ +++ +++ +++ +++

395

IgG1  +++ ++ ++ +++ +++

1322

IgG2b  +++ +++ + ++ +++

624

IgG1  +++ +++ + - -

691

IgG1  +++ +++ + - -

1060

IgG2b  +++ +++ + ++ ++

1231

IgG1 +++ +++ + - -

E1128

- +++ - 0 NA

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Se usó mapeo epitópico para demostrar que este anticuerpo se une al factor B en el tercer dominio de la repetición consenso corta (SCR), y el anticuerpo prevenía la formación del complejo C3bBb. Además, experimentos para mapear el epítopo para el anticuerpo mAb1379 indicaban que el sitio de unión al epítopo o anticuerpo en el factor B no era lineal. Los experimentos demostraron que la introducción de ciertas sustituciones de alanina en las SCR 2 y 3

5 del factor B humano, pero no SCR1, dio como resultado la pérdida o la pérdida sustancial de unión del anticuerpo 1379 al factor B, que incluía mutantes que sustituían: 139-Tyr-140-Cys-141-Ser por His-Cys-Pro (siendo las posiciones relevantes para el factor B humano maduro representado por la SEC ID Nº 2); y 182-Glu-183-Gly-184-Gly-185-Ser por Gly-Asn-Gly-Val.

La superficie de unión conservada predicha o epítopo del factor B humano que es reconocida por mAb1379 se modeló. En resumen, la estructura terciaria del factor B humano estaba construida en base a la estructura tridimensional resuelta de CR2-SCR1-2 (Id 1GHQ del banco de datos de proteínas (PDB)). La figura 4 muestra el modelo de la estructura del factor B con las posiciones de aminoácidos correspondientes al epítopo de mAb1379 (con respecto a la SEC ID Nº 2) indicadas. Los residuos que se cree que forman el epítopo conformacional para el 15 anticuerpo mAb1379 son: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 y Ser192, aunque el epítopo puede contener solamente unos pocos, sustancialmente todos, o más residuos que como se representa en la figura

4. La figura 5 es un dibujo esquemático que muestra un complejo modelizado de mAB1379 (un fragmento Fab) que se une al factor B, con los lados de unión al antígeno del Fab habiendo sido modelizados para cubrir toda la región epitópica mapeada, tal como se ha definido anteriormente en la figura 4.

Los anticuerpos que han sido producidos por los inventores de la presente invención, descritos en más detalle en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2005-0260198-A1 y en la publicación PCT Nº WO 2005/077417, supra, reconocen un sitio en el factor B que es compartido entre seres humanos y muchas otras especies animales en las que se realizan experimentos preclínicos de prueba preliminar, permitiendo de este modo

25 que descubrimientos en modelos de enfermedad humana se traduzcan rápidamente en terapias humanas. Se cree que estos anticuerpos son los primeros anticuerpos contra el factor B que muestran la amplia inhibición de especies de la proteína. Por lo tanto, también se ha identificado un único sitio en el factor B contra el que pueden desarrollarse nuevos reactivos inhibidores.

En la presente invención, los inventores han descubierto y describen por primer vez en el presente documento que la inhibición de la vía alternativa inhibe el daño fisiológico en lesión cerebral traumática (LCT), y también inhibe el daño fisiológico en lesión de médula espinal (LME) y esta información puede usarse ahora para diseñar, aislar y/o identificar reactivos terapéuticos novedosos para el tratamiento de LCT y LME. Además, los anticuerpos producidos previamente y descritos por los inventores son excelentes agentes para uso en los métodos de la presente

35 invención.

Una realización de la presente invención se refiere a un método para reducir o prevenir al menos un síntoma o afección (incapacidad, deficiencia, daño fisiológico) que resulta de (asociado con) lesión cerebral traumática (LCT) en un animal o mejorar (incrementar) la recuperación del daño causado por LCT, que comprende inhibir selectivamente la vía alternativa del complemento en un animal que ha padecido LCT. Otra realización de la invención se refiere a un método para reducir o prevenir al menos un síntoma o afección (incapacidad, deficiencia, daño fisiológico) que resulta de (asociado con) lesión de médula espinal (LME) en un animal o mejorar (incrementar) la recuperación del daño causado por LME, que comprende inhibir selectivamente la vía alternativa del complemento en un animal que ha padecido LME. En una realización preferida, el método incluye administrar al animal un agente

45 que inhibe la vía alternativa del complemento, y particularmente, un agente que inhibe el factor B. En una realización particularmente preferida, el agente es un anticuerpo anti-factor B o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Por consiguiente, los métodos de la presente invención incluyen una etapa de inhibir selectivamente la vía alternativa del complemento en un animal que ha, o corre el riesgo de desarrollar, daño fisiológico debido a LCT o LME, respectivamente. De acuerdo con la presente invención, inhibir la vía alternativa del complemento en un animal se refiere a inhibir la expresión y/o la actividad biológica de al menos una proteína o molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína que es parte de la vía alternativa del complemento. Dichas proteínas incluyen, aunque sin limitarse a, factor B, factor D o properdina. Inhibir “selectivamente” la vía alternativa del complemento significa que el método de la presente invención inhibe preferente o exclusamente la vía alternativa del

55 complemento, pero no inhibe o al menos no inhibe sustancialmente otras vías para activación del complemento, incluyendo la vía clásica del complemento o la vía de lectina. Por ejemplo, los novedosos anticuerpos para factor B y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención son un ejemplo de un reactivo que inhibe selectivamente la vía alternativa del complemento. Inhibir “selectivamente” una proteína específica significa que el método de la presente invención inhibe preferente o exclusivamente la expresión y/o una actividad biológica de la proteína específica, pero no inhibe o al menos no inhibe sustancialmente la expresión y/o una actividad biológica de otras proteínas (a menos que dicha actividad biológica se una que es compartida, tal como un evento cadena abajo, con la proteína específica).

De acuerdo con la presente invención, lesión cerebral traumática (LCT) se define como cualquier lesión, herida o

65 daño causado por cualquier tipo de traumatismo al cráneo, tal como impacto en el cráneo o sacudida. Más específicamente, LCT es una lesión adquirida del cerebro causada por una fuerza física externa, que da como

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pueden incluir, rayos X, exploración por tomografía computarizada (TC), imaginología por resonancia magnética (IRM), o mielografía. También pueden realizarse diversos exámenes neurológicos. Los efectos de LME dependen del tipo de lesión y el nivel de la lesión. La LME puede dividirse generalmente en dos tipos de lesión -completa e incompleta. Una lesión completa significa que no existe ninguna función por debajo del nivel de la lesión (es decir,

5 ninguna sensación y ningún movimiento voluntario). Ambos lados del cuerpo están igualmente afectados. Una lesión incompleta significa que existe cierta funcionalidad por debajo del nivel primario de la lesión. Una persona con una lesión incompleta puede ser capaz de mover un miembro más que otro, puede ser capaz de sentir partes del cuerpo que no se pueden mover, o puede tener más funcionalidad en un lado del cuerpo que en el otro. Con los avances en el tratamiento agudo de LME, las lesiones incompletas se están volviendo más comunes.

El nivel de lesión es muy útil para predecir qué partes del cuerpo podrían estar afectadas por parálisis y pérdida de función en LME. Las lesiones cervicales (del cuello) habitualmente dan como resultado tetraplejia. Las lesiones por encima del nivel de la C-4 pueden requerir un respirador para que la persona respire. Las lesiones en la C-5 a menudo dan como resultado control del hombro y el bíceps, pero no control en la muñeca o la mano. Las lesiones

15 en la C-6 generalmente producen control de la muñeca, pero no función de la mano. Los individuos con lesiones en la C-7 y la T-1 pueden enderezar sus brazos pero seguir teniendo problemas de destreza con las manos y los dedos. Las lesiones a nivel torácico y por debajo dan como resultado paraplejia, con las manos no afectadas. En T-1 a T-8 generalmente existe control de las manos, pero mal control del tronco como resultado de la falta de control de los músculos abdominales. Las lesiones en las T inferiores (T-9 a T-12) permiten buen control del tronco y buen control de los músculos abdominales. El equilibrio sentado es muy bueno. Las lesiones lumbar y sacra producen control disminuido de los flexores de la cadera y las piernas. Las personas con tetraplejia tienen lesiones prolongadas de uno de los ocho segmentos cervicales de la médula espinal; aquellas con paraplejia tienen lesiones en las regiones torácica, lumbar o sacra de la médula espinal.

25 La presente invención se refiere a inhibir el daño fisiológico y los síntomas o afecciones (incapacidades, deficiencias) asociadas con dicho daño, que resultan de LCT o LME tal como se ha descrito en detalle anteriormente. Por lo tanto, no se requiere que el daño fisiológico o todos los efectos de la afección sean completamente prevenidos o invertidos, aunque los efectos del presente método probablemente ser extienden a un beneficio terapéutico significativo para el paciente. Por lo tanto, un beneficio terapéutico no es necesariamente una completa prevención o cura para una afección o daño fisiológico particular que resulta de LCT o LME, sino que en su lugar, puede abarcar un resultado que incluye reducir o prevenir los síntomas o el daño fisiológico que resultan de LCT o LME, reducir o prevenir la aparición de dichos síntomas o daño (cuantitativa o cualitativamente), reduciendo la gravedad de dichos síntomas o efectos fisiológicos, y/o mejorando la recuperación del paciente después de padecer LCT o LME. Específicamente, una composición de la presente invención, cuando se administra a un paciente, preferentemente

35 previene el daño asociado con la lesión cerebral o lesión de médula espinal y/o reduce o alivia síntomas de o afecciones asociadas con (que resultan de) el daño, signos del daño o incluso las causas del daño, así como mejora la recuperación del daño. Por lo tanto, proteger a un paciente de los efectos o síntomas fisiológicos que resultan de LCT o LME (o afecciones relacionadas) incluye prevenir o reducir la aparición y/o gravedad de los efectos del daño y tratar a un paciente en el que los efectos del daño ya se están produciendo o comenzando a producirse. Un efecto beneficioso puede ser evaluado fácilmente por un experto en la materia y/o por un facultativo formado que esté tratando al paciente. Por ejemplo, muchos de los métodos descritos anteriormente para el diagnóstico de LCT o LME pueden usarse para evaluar al paciente antes y después del tratamiento usando un método de la presente invención para evaluar el éxito del tratamiento. Preferentemente, existe una diferencia positiva o beneficiosa en la gravedad o aparición de al menos una puntuación, valor o medida clínica o biológica usada para evaluar a dichos pacientes en

45 aquellos que han sido tratados de acuerdo con la presente invención en comparación con aquellos que no lo han sido.

La inhibición de la vía alternativa del complemento de acuerdo con la presente invención para los fines de inhibir el daño fisiológico, y los síntomas o afecciones (incapacidades, deficiencias) asociadas con dicho daño, que resultan de LCT o LME, puede conseguirse afectando directamente a la expresión (transcripción o traducción) o actividad biológica de una proteína en la vía alternativa del complemento, o afectando directamente a la capacidad de una proteína para unirse a una proteína en la vía alternativa del complemento o para contribuir de otro modo a la activación del complemento mediante la vía alternativa. Por ejemplo, la expresión de una proteína se refiere a la transcripción de la proteína o la traducción de la proteína. Por lo tanto, el método de la presente invención puede

55 inhibir la transcripción y/o la traducción de una proteína en el animal que expresa de forma natural la proteína (por ejemplo, administrando un agente que inhibe la expresión de la proteína y modificando genéticamente un animal para que tenga expresión de proteínas reducidas). En otro ejemplo, la inhibición de la vía alternativa del complemento se define en el presente documento como cualquier reducción (es decir, disminución, regulación negativa, inhibición) medible (detectable) de la actividad de la vía, tal como mediante cualquier reducción medible en la expresión y/o actividad biológica de una proteína dentro de la vía alternativa del complemento, y puede incluir bloquear o inhibir la capacidad de una proteína o molécula para actuar en la vía alternativa del complemento.

Los métodos para inhibir la expresión de una proteína incluyen, aunque sin limitarse a, administrar un agente que inhibe la expresión de la proteína (directa o indirectamente), y modificar genéticamente un animal para que tenga 65 expresión de proteínas reducida (por ejemplo, nótese los ratones fB-/-usados en el presente documento). Preferentemente, la expresión de proteínas es inhibida mediante administración de un agente (reactivo, compuesto,

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difieren en secuencia o tamaño pero que tienen las mismas unidades estructurales) o mediante diseño racional de fármacos. Véase por ejemplo, Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc.,

5 En una estrategia de diversidad molecular, se sintetizan grandes bibliotecas de compuestos, por ejemplo, a partir de péptidos, oligonucleótidos, carbohidratos y/o moléculas orgánicas sintéticas, usando enfoques biológicos, enzimáticos y/o químicos. Los parámetros críticos en el desarrollo de una estrategia de diversidad molecular incluyen diversidad de subunidades, tamaño molecular y diversidad de la biblioteca. El objetivo general de cribar dichas bibliotecas es utilizar aplicación secuencial de selección combinatoria para obtener ligandos de alta afinidad contra una diana deseada, y a continuación optimizar las moléculas de partida mediante estrategias de diseño aleatorio o dirigido. Los métodos de diversidad molecular se describen en detalle en Maulik, et al., supra.

En un procedimiento de diseño racional de fármacos, la estructura tridimensional de un compuesto regulador puede analizarse mediante, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (RMN) o cristalografía de rayos X. Esta estructura

15 tridimensional puede usarse a continuación para predecir estructuras de compuestos potenciales, tales como agentes reguladores potenciales mediante, por ejemplo, modelización por ordenador. La estructura del compuesto predicha puede usarse para optimizar compuestos de partida obtenidos, por ejemplo, mediante métodos de diversidad molecular. Además, la estructura del compuesto predicha puede producirse mediante, por ejemplo, síntesis química, tecnología de ADN recombinante, o aislando un mimetópo a partir de una fuente natural (por ejemplo, plantas, animales, bacterias y hongos).

Diversos otros métodos de diseño de fármacos basado en la estructura se desvelan en Maulik et al., 1997, supra. Maulik et al., desvelan, por ejemplo, métodos de diseño dirigido, en los que el usuario dirige el proceso de crear moléculas novedosas a partir de una biblioteca de fragmentos de segmentos seleccionados apropiadamente; diseño

25 aleatorio, en el que el usuario usa un algoritmo genético u otro para mutar aleatoriamente fragmentos y sus combinaciones mientras que aplica simultánea un criterio de selección para evaluar la idoneidad de ligandos candidatos; y un enfoque basado en cuadrículas en el que el usuario calcula la energía de interacción entre estructuras receptoras tridimensionales y sondas de fragmentos pequeños, seguido por enlazado entre sí de sitios de la sonda favorables.

Una molécula de ácido nucleico aislada que es útil como agente para inhibir una proteína (o su expresión) en la vía alternativa del complemento es una molécula de ácido nucleico antisentido, una ribozima, ARNic, o un aptámero. Tal como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico interferente se define como una molécula de ácido nucleico aislada que reduce la expresión de una proteína por hibridación en condiciones de alta rigurosidad 35 con un gen que codifica la proteína. Dicha molécula de ácido nucleico es suficientemente similar al gen que codifica la proteína que la molécula es capaz de hibridar en condiciones de alta rigurosidad con la cadena codificante o complementaria del gen o ARN que codifica la proteína natural. La interferencia de ARN (iARN) es un proceso mediante el cual ARN bicatenario, y en sistemas de mamífero, ARN interferente corto (ARNic), se usa para inhibir o silenciar la expresión de genes complementarios. En la célula diana, ARNic se desenrollan y se asocian con un complejo silenciador inducido por ARN (RISC), que es guiado a continuación a las secuencias de ARNm que son complementarias al ARNic, con lo que el RISC escinde el ARNm. Una ribozima es un fragmento de ARN que funciona uniéndose a la fracción de ARN diana y la inactiva escindiendo la cadena principal fosfodiéster en un sitio de corte específico. Los aptámeros son cadenas cortas de ácidos nucleicos sintéticos (habitualmente ARN pero también ADN) seleccionadas entre bibliotecas de ácido nucleico combinatorias aleatorizadas en virtud de su

45 capacidad para unirse a una molécula diana específica predeterminada con alta afinidad y especificidad. Los aptámeros asumen una estructura tridimensional definida y son capaces de discriminar entre compuestos con muy pequeñas diferencias en la estructura.

Un gen incluye regiones reguladoras que controlan la producción de la proteína codificada por ese gen (tales como, aunque sin limitarse a, regiones de control de la transcripción, traducción o postraducción) así como la propia región codificante. Los genes que codifican diversas proteínas de la vía alternativa del complemento, incluyendo factor B, factor D o properdina, han sido identificados y son conocidos en la técnica. Una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que ha sido extraída de su medio natural (es decir, que ha sido sometida a manipulación humana) y puede incluir ADN, ARN, o derivados de ADN o ARN. Por lo tanto, “aislada” no refleja la

55 medida en la que la molécula de ácido nucleico ha sido purificada. Una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención puede aislarse de su fuente natural o producirse usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química.

Tal como se usa en el presente documento, la referencia a las condiciones de hibridación se refiere a condiciones de hibridación convencionales en las que se usan moléculas de ácido nucleico para identificar moléculas de ácido nucleico similares. Dichas condiciones convencionales se desvelan, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al., ibid., (véase específicamente, páginas 9.31-9.62). Además, fórmulas para calcular las condiciones de hibridación y de lavado apropiadas para conseguir hibridación permitiendo diversos grados de discordancia de nucleótidos se desvelan, por ejemplo, en

65 Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth et al., ibid., se incorpora como referencia en el presente documento en su totalidad.

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En una realización preferida de la presente invención, el agente usado para inhibir una proteína de la vía alternativa del complemento con el fin de inhibir el daño fisiológico que resulta de LCT o LME (y los síntomas o afecciones (incapacidades, deficiencias) asociadas con dicho daño), es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Análogamente, un polipéptido de unión al antígeno es también particularmente preferido para uso en la

5 presente invención. En un aspecto, el anticuerpo se une selectivamente a la proteína de la vía alternativa del complemento de una manera tal que se inhibe o se previene que la proteína se una a otra proteína con la que normalmente (en condiciones naturales o fisiológicas) interactúa. En otro aspecto, el anticuerpo se une selectivamente a la proteína de una manera tal que se inhibe o previene que la proteína active a otra proteína con la que normalmente interactúa, incluso aunque la proteína pueda unirse al menos parcialmente a la otra proteína. Anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos particularmente preferidos para uso en la inhibición selectiva de la vía alternativa del complemento con el fin de inhibir el daño fisiológico que resulta de LCT o LME se describen en detalle a continuación (por ejemplo, los anticuerpos para factor B descritos en el presente documento, y particularmente, el anticuerpo mAb1379 descrito en detalle en el presente documento).

15 Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo útil en la presente invención se une a una proteína seleccionada entre factor B, factor D o properdina. De la forma más preferente, la invención incluye un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une al factor B, y su uso con el fin de inhibir el daño fisiológico que resulta de LCT o LME. Los anticuerpos (y fragmentos de unión al antígeno de los mismos) que se unen selectivamente al factor B e inhiben la vía alternativa del complemento de acuerdo con la invención se describen y se ejemplifican en detalle en el presente documento. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a una superficie de unión conservada o epítopo de dicha proteína (por ejemplo, factor B) que está conservado entre especies animales, y particularmente especies de mamífero (es decir, el anticuerpo es reactivo de forma cruzada con la proteína de dos o más especies de mamífero diferentes). En particular, la presente invención incluye un anticuerpo que se une al factor B de al menos dos, y preferentemente,

25 varias especies de mamífero diferentes, incluyendo, aunque sin limitarse a, ser humano, primate no humano, ratón, rata, cerdo, caballo y conejo. Preferentemente, la presente invención incluye un anticuerpo que se une al factor B de ser humano y al menos una especie animal adicional, y preferentemente, al menos una especie de mamífero adicional, incluyendo, aunque sin limitarse a, primate no humano, ratón, rata, cerdo, caballo y conejo. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la tercera repetición consenso corta (SCR) del factor B. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a una región del factor B que previene la escisión del factor B por el factor D. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una realización, el anticuerpo es el anticuerpo denominado en el presente documento como 1379 (es decir, el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma del mismo número, que también tiene la designación de depósito de la ATCC PTA-6230), o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

35 El hibridoma descrito en el presente documento como 1379 (o mAb1379) fue depositado el 21 de septiembre de 2004, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, ubicada en 10801 University Blvd, Manassas, VA 201102209), según los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimiento de Patente, y ha recibido la designación de depósito de la ATCC PTA-6230.

Tal como se describe en el presente documento, el tamaño mínimo de una proteína, sección de una proteína (por ejemplo un fragmento, sección, dominio, etc.), o región o epítopo de una proteína, es un tamaño suficiente para servir como un epítopo o superficie de unión conservada para la generación de un anticuerpo o como diana en un

45 ensayo in vitro. La proteína puede tener al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de longitud (por ejemplo, adecuada para un epítopo de anticuerpo o como un péptido detectable en un ensayo), o al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, y así sucesivamente, en cualquier longitud entre 4 aminoácidos y hasta la longitud completa de una proteína o sección de la misma o más larga, en números enteros (por ejemplo, 8, 9, 10,...25, 26,...500, 501,...).

La secuencia de nucleótidos para el gen y la región codificante que codifica factor B humano y otras proteínas del complemento, así como la secuencia de aminoácidos de dichas proteínas, se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el gen que codifica factor B humano y otras proteínas del complemento se encuentra en el Nº de entrada de 55 la base de datos NCBI NG_000013. La secuencia codificante para el factor B se encuentra en el Nº de entrada de la base de datos NCBI NM_001710 y la secuencia de aminoácidos para la preproteína del factor B se encuentra en el Nº de entrada de la base de datos NCBI NP_001701 o P00751. La secuencia de aminoácidos para el Nº de entrada de la base de datos NCBI P00751, que es una secuencia de preproteína de factor B humano, se representa en el presente documento mediante la SEC ID Nº 1. Secuencias de otras especies animales también son conocidas en la técnica. A modo de comparación, en la secuencia del factor B de ratón (por ejemplo, véase el Nº de entrada de la base de datos NCBI P04186, representada en el presente documento mediante la SEC ID Nº 6), el tercer dominio de la SCR está ubicado en las posiciones 160-217 de esta preproteína de 761 aminoácidos, y la proteína de factor B murino madura abarca las posiciones 23-761 de la SEC ID Nº 6. La secuencia codificante para el factor D humano se encuentra en el Nº de entrada de la base de datos NCBI NM_001928.2 y la secuencia de aminoácidos para la 65 preproteína del factor D humano se encuentra en el Nº de entrada de la base de datos NCBI NP_001919 (representado en el presente documento como la SEC ID N º7). La secuencia codificante para properdina humana

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se encuentra en el Nº de entrada de la base de datos NCBI NM_002621.1 y la secuencia de aminoácidos para properdina humana se encuentra en el Nº de entrada de la base de datos NCBI NP_002612 (representada en el presente documento mediante la SEC ID Nº 8).

5 La preproteína del factor B humano representada mediante la SEC ID Nº 1 es una proteína de 764 aminoácidos con un péptido señal que abarca desde las posiciones de aminoácidos 1-25. La cadena madura del factor B corresponde a las posiciones 26-764 de la SEC ID Nº 1 y está representada en el presente documento mediante la SEC ID Nº 2. Las tres regiones SCR del factor B humano están representadas en el presente documento mediante la SEC ID Nº 3 (SCR1, también conocida como Sushi 1, que abarca desde aproximadamente la posición 35 a aproximadamente la posición 100 de la SEC ID Nº 1 o desde aproximadamente la posición 5 a aproximadamente la posición 75 de la SEC ID Nº 2), la SEC ID Nº 4 (SCR2, también conocida como Sushi 2, que abarca desde aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 160 de la SEC ID Nº 1 o desde aproximadamente la posición 76 a aproximadamente la posición 135 de la SEC ID Nº 2) y la SEC ID Nº 5 (SCR3, también conocida como Sushi 3, que abarca desde aproximadamente la posición 163 a aproximadamente la posición 220 de la SEC ID Nº1 o desde

15 aproximadamente la posición 138 a aproximadamente la posición 195 de la SEC ID Nº 2).

En base al mapeo epitópico del factor B usando los fragmentos descritos por Hourcade, 1995, J. Biol Chem., en una realización preferida, un anticuerpo anti-factor B útil en la presente invención preferentemente se une a un epítopo o superficie de unión conservada dentro de, o que contiene, una parte del tercer dominio de la SCR, y más preferentemente, a un epítopo del factor B humano que incluye al menos una sección de la secuencia que comprende de aproximadamente la posición Tyr139 a aproximadamente la posición Ser185 con respecto a la proteína del factor B madura (SEC ID Nº 2), a un epítopo del factor B humano que incluye al menos una sección de la secuencia que comprende de aproximadamente la posición Tyr139 a aproximadamente la posición Ser141 con respecto a la proteína del B madura (SEC ID Nº 2), a un epítopo del factor B humano que incluye al menos una 25 sección de la secuencia que comprende de aproximadamente la posición Glu182 a aproximadamente la posición Ser185 con respecto a la proteína del B madura (SEC ID Nº 2), a un epítopo del factor B que incluye al menos una sección del factor B humano (SEC ID Nº 2) que comprende una o más cualesquiera de las siguientes posiciones o sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: Tyr139, Cys 140, Ser141, Glu182, Gly184 o Ser185, o a un epítopo del factor B que incluye al menos una sección de las posiciones equivalentes con respecto a especies animales no humanas. Un experto en la materia puede alinear fácilmente la secuencia del factor B humano con la secuencia del factor B de otra especie animal y determinar las posiciones de las regiones SCR y las secciones específicas de las terceras regiones SCR correspondientes a las posiciones de aminoácidos anteriores. Por ejemplo, dos secuencias específicas pueden alinearse entre sí usando la secuencia BLAST 2 tal como se describe en el documento Tatusova y Madden, (1999), “Blast 2 sequences -a new tool for comparing protein and

35 nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250.

En base a modelización y mapeo epitópico adicional de un anticuerpo ejemplar útil en la invención, en otra realización preferida, un anticuerpo anti-factor B útil en la presente invención se une preferentemente a un epítopo (superficie de unión conservada) dentro de, o que contiene, una parte o sección del tercer dominio de la SCR del factor B que incluye al menos una o más de las siguientes posiciones de aminoácidos, con respecto a la SEC ID Nº 2, o sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: A137, Y139, S141, E182, S185, T189, E190 y S192. En un aspecto de la invención, el epítopo está dentro de o contiene una parte o sección del tercer dominio de la SCR del factor B que incluye todas o sustancialmente todas de (al menos cinco, seis o siete de las siguientes posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, o sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor

45 B no humano: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 y Ser192. En otro aspecto más, el epítopo reconocido por un anticuerpo anti-factor B útil en la presente invención está dentro de, o contiene, una parte o sección del tercer dominio de la SCR del factor B que consta de las siguientes posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, o sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 y Ser192.

En una realización, el epítopo reconocido por un anticuerpo para factor B útil en la invención también puede definirse más particularmente como siendo un epítopo no lineal ubicado dentro de la estructura tridimensional de una sección del tercer dominio de la SCR del factor B. La sección que contiene el epítopo es la estructura tridimensional del factor B que está definida por sustancialmente todas de (por ejemplo, al menos aproximadamente el 90% de) las

55 posiciones de aminoácidos Ala137-Ser192 de la SEC ID Nº 2, o posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano, cuando dicha secuencia está dispuesta conformacionalmente como ocurre en la secuencia del factor B de longitud completa natural. Un modelo de la estructura tridimensional del factor B, que ilustra un epítopo para mAb1379, se ilustra en la figura 4 y la figura 5, por ejemplo. Tal como se usa en el presente documento, la “estructura tridimensional” o “estructura terciaria” de una proteína se refiere a la disposición de los componentes de la proteína en tres dimensiones. Dicha expresión es bien conocida por los expertos en la materia. Tal como se usa en el presente documento, el término “modelo” se refiere a una representación en un medio tangible de la estructura tridimensional de una proteína, polipéptido o péptido. Por ejemplo, un modelo puede ser una representación de la estructura tridimensional en un archivo electrónico, en la pantalla de un ordenador, en un trozo de papel (es decir, en un medio bidimensional) y/o como una figura de bolas y varillas.

65 Tal como se describe en el presente documento, un “epítopo” de una proteína o péptido u otra molécula dada se

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define en general, con respecto a anticuerpos, como parte de o sitio en una molécula más grande al que un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se unirá, y contra el que se producirá un anticuerpo. El término epítopo puede usarse de forma intercambiable con el término “determinante antigénico”, “sitio de unión al anticuerpo” o “superficie de unión conservada” de una proteína o antígeno dado. Más específicamente, un epítopo 5 puede estar definido tanto por los residuos de aminoácidos implicados en la unión al anticuerpo como también por su conformación en el espacio tridimensional (por ejemplo, un epítopo conformacional o la superficie de unión conservada). Un epítopo puede estar incluido en péptidos de tan solo aproximadamente 4-6 residuos de aminoácidos, o puede estar incluido en segmentos más grandes de una proteína, y no es necesario que esté constituido por residuos de aminoácidos contiguos cuando se trata de una estructura tridimensional de un epítopo, particularmente con respecto a un epítopo de unión al anticuerpo. Los epítopos de unión al anticuerpo son frecuentemente epítopos conformacionales en lugar de un epítopo secuencial (es decir, epítopo lineal), o en otras palabras, un epítopo definido por residuos de aminoácidos dispuestos en tres dimensiones sobre la superficie de una proteína o polipéptido al que se une un anticuerpo. Tal como se ha mencionado anteriormente, el epítopo conformacional no está constituido por una secuencia contigua de residuos de aminoácido, sino que en su lugar, los

15 residuos están quizás separados ampliamente en la secuencia primaria de la proteína, y se juntan entre sí para formar una superficie de unión por el modo en que la proteína se pliega en su conformación nativa en tres dimensiones. El epítopo reconocido por el mAb1379 es un epítopo conformacional que no es un epítopo lineal.

Un experto en la materia puede identificar y/o ensamblar epítopos conformacionales y/o epítopos secuenciales usando técnicas conocidas, incluyendo análisis mutacional (por ejemplo, mutagénesis dirigida); protección de la degradación proteolítica (huellas de proteínas); análisis de mimótopo usando, por ejemplo, péptidos sintéticos y pepscan, BIACORE o ELISA; mapeo por competición de anticuerpos; cribado de biblioteca de péptidos combinatorios; espectrometría de masas de tiempo de vuelo y desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF); o modelización tridimensional (por ejemplo, usando cualquier programa informático adecuado, incluyendo,

25 aunque sin limitarse a, MOLSCRIPT 2.0 (Avatar Software AB, Heleneborgsgatan 21C, SE-11731 Estocolmo, Suecia), el programa de visualización gráfica O (Jones et. al., Acta Crystallography, vol. A47, p. 110, 1991), el programa de visualización gráfica GRASP, o el programa de visualización gráfica INSIGHT). Por ejemplo, se puede usar sustitución molecular u otras técnicas y la estructura tridimensional conocida de una proteína relacionada para modelizar la estructura tridimensional del factor B y predecir el epítopo conformacional de anticuerpo que se une a esta estructura. De hecho, se puede usar una o cualquier combinación de dichas técnicas para definir el epítopo de unión al anticuerpo. Las figuras 4 y 5 ilustran el uso de modelización tridimensional, combinado con información de análisis de mimótopo y análisis mutacional, para identificar el epítopo de un anticuerpo para factor B útil en la presente invención.

35 Tal como se usa en el presente documento, la expresión “se une selectivamente a” se refiere a la unión específica de una proteína a otra (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento del mismo, o socio de unión a un antígeno), en el que el nivel de unión, según lo medido mediante cualquier ensayo convencional (por ejemplo, un inmunoensayo), es de forma estadística significativamente mayor que el control de fondo para el ensayo. Por ejemplo, cuando se realiza un inmunoensayo, los controles típicamente incluyen una reacción pocillo/tubo que contienen anticuerpo o fragmento de unión al antígeno en solitario (es decir, en ausencia de antígeno), en el que una cantidad de reactividad (por ejemplo, unión no específica al pocillo) por el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo en ausencia del antígeno se considera que es fondo. La unión puede medirse usando diversos métodos convencionales en la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a: transferencia de Western, inmunotransferencia, ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, resonancia del

45 plasmón superficial, quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, análisis inmunohistoquímico, espectrometría de masas de tiempo de vuelo y desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF), microcitometría, micromatriz, microscopía, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y citometría de flujo.

Una realización de la presente invención incluye el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que es un inhibidor competitivo de la unión del factor B al anticuerpo anti-factor B (por ejemplo, anticuerpo monoclonal 1379) para inhibir el daño fisiológico y los efectos asociados con LCT o LME. De acuerdo con la presente invención, un inhibidor competitivo de la unión del factor B a un anticuerpo anti-factor B de la presente invención es un inhibidor (por ejemplo, otro anticuerpo o fragmento de unión al antígeno o polipéptido) que se une al 55 factor B en el mismo o un epítopo similar que el anticuerpo anti-factor B conocido de la presente invención (por ejemplo, mAb 1379) de modo que la unión del anticuerpo anti-factor B conocido al factor B es inhibida. Un inhibidor competitivo puede unirse a la diana (por ejemplo, el factor B) con una mayor afinidad por la diana que el anticuerpo anti-factor B. Un inhibidor competitivo puede usarse de una manera similar a la descrita en el presente documento para el anticuerpo anti-factor B 1379 (por ejemplo, para inhibir la vía alternativa del complemento, para inhibir el daño fisiológico o los efectos causados por LCT o LME). Por ejemplo, una realización de la invención se refiere al uso de un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al factor B, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe de forma competitiva mAb1379 para unión específica al factor B, y en el que, cuando el anticuerpo o fragmento del mismo se une al factor B, la vía alternativa del complemento es inhibida o como alternativa, la capacidad de mAb1379 para inhibir la vía alternativa del complemento es inhibida. 65 Otra realización se refiere al uso de un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al factor B, en el que el anticuerpo aislado o fragmento del mismo se une de forma competitiva a un segundo

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como fragmentos de unión al antígeno en los que uno o más dominios de anticuerpo están truncados o ausentes (por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab' o F(ab)2), así como anticuerpos manipulados genéticamente o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, incluyendo anticuerpos monocatenarios, anticuerpos humanizados (descritos anteriormente), anticuerpos que pueden unirse a más de un epítopo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), o

5 anticuerpos que pueden unirse a uno o más antígenos diferentes (por ejemplo, anticuerpos bi-o multiespecíficos), también pueden emplearse en la invención.

Los anticuerpos manipulados genéticamente descritos en el presente documento incluyen aquellos producidos mediante técnicas de ADN recombinante convencionales que implican la manipulación y reexpresión de ADN que codifica regiones variables y/o constantes de anticuerpos. Ejemplos particulares incluyen, anticuerpos quiméricos, donde los dominios VH y/o VL del anticuerpo proceden de una fuente diferente en comparación con el resto del anticuerpo, y anticuerpos injertados con CDR (y fragmentos de unión al antígeno de los mismos), en los que al menos una secuencia CDR y opcionalmente al menos un aminoácido de la región marco variable se deriva o derivan de una fuente y las secciones restantes de las regiones variable y constante (según sea apropiado) se derivan de

15 una fuente diferente. La construcción de anticuerpos quiméricos e injertados con CDR se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patente europea: EP-A 0194276, EP-A 0239400, EP-A 0451216 y EP-A 0460617.

En un ejemplo, se producen anticuerpos quiméricos que comprenden dominios variables de anticuerpo que se unen a una proteína en la vía alternativa del complemento (por ejemplo, el factor B) y fusionada a estos dominios, una proteína que sirve como segunda fracción de dirección. Por ejemplo, la fracción de dirección puede incluir una proteína que está asociada con la célula o tejido que será la diana o con un sistema particular en el animal. Por ejemplo, la fracción de dirección puede ser una selectina o una sección de un receptor del complemento. Un receptor del complemento preferido a usar en este aspecto de la invención incluye el receptor del complemento de tipo 2 (CR2). El uso de CR2 y secciones del mismo en una proteína de fusión o quimérica (por ejemplo, como un

25 sistema de administración) se describe en detalle en la Patente de Estados Unidos Nº 6.820.011.

Generalmente, en la producción de un anticuerpo, un animal experimental adecuado, tal como, por ejemplo, aunque sin limitarse a, un conejo, una oveja, un hámster, una cobaya, un ratón, una rata o un pollo, es expuesto a un antígeno contra el que se desea un anticuerpo. Típicamente, un animal es inmunizado con una cantidad eficaz de antígeno que es inyectada en el animal. Una cantidad eficaz de antígeno se refiere a una cantidad necesaria para inducir la producción de anticuerpos por el animal. Al sistema inmunitario del animal se le permite a continuación responder durante un periodo de tiempo predeterminado. El proceso de inmunización puede repetirse hasta que se descubre que el sistema inmunitario produce anticuerpos para el antígeno. Para obtener anticuerpos policlonales específicos para el antígeno, se recoge suero del animal que contiene los anticuerpos deseados (o en el caso de un

35 pollo, el anticuerpo puede recogerse de los huevos). Dicho suero es útil como reactivo. Los anticuerpos policlonales pueden purificarse adicionalmente del suero (o los huevos) tratando, por ejemplo, el suero con sulfato de amonio.

Pueden producirse anticuerpos monoclonales de acuerdo con la metodología de Kohler y Milstein (Nature 256: 495497, 1975). Por ejemplo, se recuperan linfocitos B del bazo (o cualquier tejido adecuado) de un animal inmunizado y a continuación se fusionan con células de mieloma para obtener una población de células de hibridoma capaces de crecimiento continuo en medio de cultivo adecuado. Los hibridomas que producen el anticuerpo deseado se seleccionan poniendo a prueba la capacidad del anticuerpo producido por el hibridoma para unirse al antígeno deseado.

45 Un método preferido para producir anticuerpos de la presente invención incluye (a) administrar a un animal una cantidad eficaz de una proteína o péptido (por ejemplo, una proteína o péptido de factor B que incluye dominios del mismo) para producir los anticuerpos y (b) recuperar los anticuerpos. En otro método, los anticuerpos de la presente invención se producen de forma recombinante. Por ejemplo, una vez que se ha obtenido una línea celular, por ejemplo un hibridoma, que expresa un anticuerpo de acuerdo con la invención, es posible clonar a partir de ella el ADNc e identificar los genes de la región variable que codifican el anticuerpo deseado, incluyendo las secuencias que codifican las CDR. A partir de aquí, pueden obtenerse anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la invención preparando uno o más vectores de expresión replicables que contienen al menos la secuencia de ADN que codifica el dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo y opcionalmente otras secuencias de ADN que codifican secciones restantes de las cadenas pesada y/o ligera según se desee, y

55 transformando/transfectando una célula huésped apropiada, en la que tendrá lugar la producción del anticuerpo. Los huéspedes de expresión adecuados incluyen bacterias, (por ejemplo, una cepa de E. coli), hongos, (en particular lavaduras, por ejemplo miembros de los géneros Pichia, Saccharomyces o Kluyveromyces,) y líneas celulares de mamífero, por ejemplo una línea celular que no produce mieloma, tal como una línea NSO de ratón o células CHO. Para obtener transcripción y traducción eficiente, la secuencia de ADN en cada vector debe incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente una secuencia promotora y una líder unidas de forma operativa a la secuencia del dominio variable. Métodos particulares para producir anticuerpos de esta manera son generalmente bien conocidos y usados de forma rutinaria. Por ejemplo, procedimientos básicos de biología molecular son descritos por Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989); la secuencia de ADN puede realizarse tal como se describe en el documento Sanger et al. (PNAS 74, 5463, (1977)) y el manual de

65 secuenciación de Amersham International plc; y la mutagénesis dirigida puede llevarse a cabo de acuerdo con el método de Kramer et al. (Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1984)) y el manual de Anglian Biotechnology Ltd.

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Adicionalmente, existen numerosas publicaciones, incluyendo memorias descriptivas de patentes, que detallan técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación de células apropiadas, por ejemplo según lo revisado por Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10), Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, RU) y

5 en las solicitudes de patente europea mencionadas anteriormente.

Métodos alternativos, que emplean, por ejemplo, tecnología de presentación en fagos (véase por ejemplo los documentos US 5969108, US 5565332, US 5871907, US 5858657) o el método de anticuerpo linfocito seleccionado del documento US 5627052 también puede usarse para la producción de anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo de la invención, tal como será fácilmente evidente para el experto en la materia.

También se describe el uso de polipéptidos no anticuerpos, algunas veces denominados como socios de unión al antígeno o polipéptidos de unión al antígeno, que han sido diseñados para unirse selectivamente a y causar la neutralización o inhibición de una proteína de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos del diseño de dichos

15 polipéptidos, que posee una especificidad por ligando prescrita se dan en el documento Beste et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 1898-1903, 1999).

La presente invención también incluye una formulación o composición para reducir el daño fisiológico asociado con LCT o LME. La formulación comprende: (a) uno o más inhibidores cualesquiera de la vía alternativa del complemento, tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-factor B descrito en el presente documento); y (b) al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

La formulación o composición puede incluir uno o más agentes adicionales, tales como otro agente que es adecuado para tratar al menos un síntoma de, o el daño fisiológico asociado con, LCT (por ejemplo, fármacos osmóticos, 25 sedantes, analgésicos, relajantes musculares, barbitúricos, etc.). Además, la formulación puede administrarse a un paciente junto con otra terapia o protocolo que se usa para tratar o mejorar el daño asociado con LCT. Dichas terapias o protocolos incluyen, aunque sin limitarse a: reducción de lesiones masivas mediante evacuación quirúrgica de hematomas intracraneales; la reducción de la tumefacción cerebral con fármacos osmóticos (por ejemplo, manitol); el drenaje terapéutico de líquido cefalorraquídeo (LCR) a través de catéteres intraventriculares; consecución y mantenimiento de intercambio de gases adecuado y estabilidad circulatoria; prevención de hipoxemia e hipercarbia; exploraciones por TC repetidas para la detección de patología intracraneal secundaria retardada; sedación profunda y analgesia para evitar el estrés y el dolor; consecución y mantenimiento de PPC óptima (> 70 mmHg) y equilibrio del oxígeno cerebral; evitación de hipertermia (< 38°C); prevención de hiperglucemia e hiponatremia; prevención de elevación de la cabeza realizada de forma rutinaria; prevención de úlceras por estrés y

35 mantenimiento de la integridad de la mucosa intestinal; profilaxis para factores de complicación (por ejemplo neumonía o meningitis); terapia dirigida a la presión intracraneal (PIC) (por ejemplo, profundización de la sedación, analgesia, relajación muscular; drenaje de LCR a través de catéteres ventriculares; hiperventilación moderada en ciertas circunstancias; osmoterapia; hipotermia moderada (± 34°C); y/o coma inducido por barbitúricos); y/o atenuación de la neuroinflamación permitida por gases (CO). Diversos tratamientos para LCT son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos Royo et al., 2003, Current Opin. Pharmacol. 3: 27-32; Dutton y McCunn, 2003, Current Opin. Crit. Care 9: 503-509; Elf et al., 2003, Eur. J. Trauma 29: 74-80; Ghajar et al., 2000, Lancet 356: 923-929.

La formulación o composición puede incluir uno o más agentes adicionales, tales como otro agente que es adecuado

45 para tratar al menos un síntoma de, o daño fisiológico asociado con, LME (por ejemplo, esteroides, tales como metilprednisolona). Además, la formulación puede administrarse a un paciente junto con otra terapia o protocolo que se usa para tratar o mejorar el daño asociado con LME. Dichas terapias o protocolos incluyen, aunque sin limitarse

a: inmovilización de la columna; descompresión quirúrgica; cirugía para estabilizar las vértebras; cirugía para realinear las vértebras; tracción. Diversos tratamientos para LME son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento Ramer et al., 2005, Spinal Cord 43(3): 134-61.

De acuerdo con la presente invención, un “portador farmacéuticamente aceptable” incluye excipientes farmacéuticamente aceptables y/o vehículos de administración farmacéuticamente aceptables, que son adecuados para uso en la administración de una formulación o composición a un sitio in vivo adecuado. Un sitio in vivo

55 adecuado es, preferentemente, cualquier sitio en el que la vía alternativa del complemento puede inhibirse, pero en una realización preferida, es en el tejido cerebral de un paciente que presenta o que corre el riesgo de desarrollar, daño fisiológico asociado con LCT o LME. Los portadores farmacéuticamente aceptables preferidos son capaces de mantener a un agente usado en una formulación de la invención en una forma que, en el momento de la llegada del agente al sitio diana en un paciente, el agente es capaz de actuar sobre su diana (por ejemplo, una proteína que es un componente de la vía alternativa del complemento), dando como resultado preferentemente un beneficio terapéutico para el paciente.

Excipientes adecuados de la presente invención incluyen excipientes o especialidades farmacéuticas que transportan o ayudan a transportar, pero no dirigen específicamente una composición a una célula o tejido (también 65 denominada en el presente documento como portadores no directores). Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitarse a agua, solución salina tamponada con fosfato,

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solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, otras soluciones acuosas fisiológicamente equilibradas, aceites, ésteres y glicoles. Los portadores acuosos pueden contener sustancias auxiliares adecuadas que se requiere que se aproximen a las condiciones fisiológicas del receptor, por ejemplo, incrementando la estabilidad química y la isotonicidad. Las sustancias auxiliares adecuadas incluyen, por

5 ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, lactato sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico y otras sustancias usadas para producir tampón fosfato, tampón Tris, y tampón bicarbonato. Las sustancias auxiliares también pueden incluir conservantes, tales como timerosal, m-u o-cresol, formalina y alcohol bencílico. Las formulaciones de la presente invención pueden esterilizarse mediante métodos convencionales y/o liofilizarse.

Un tipo de portador farmacéuticamente aceptable incluye una formulación de liberación controlada que es capaz de liberar lentamente una composición de la presente invención en un animal. Tal como se usa en el presente documento, una formulación de liberación controlada comprende un agente de la presente invención en un vehículo de liberación controlada. Los vehículos de liberación controlada adecuados, aunque sin limitarse a, polímeros biocompatibles, otras matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones en embolada, 15 bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, lipoesferas, y sistemas de administración transdérmica. Otros portadores adecuados incluyen cualquier portador que puede unirse a o incorporarse con el agente que prolonga la semivida del agente a administrar. Dicho portador puede incluir cualquier portador de proteínas adecuado o incluso un segmento de fusión que prolonga la semivida de una proteína cuando se administra in vivo. Los vehículos de administración adecuados se han descrito anteriormente en el presente documento, e incluyen, aunque sin limitarse a liposomas, vectores virales u otros vehículos de administración, incluyendo ribozimas. Los vehículos de administración que contienen lípidos naturales incluyen células y membranas celulares. Los vehículos de administración que contienen lípidos artificiales incluyen liposomas y micelas. Un vehículo de administración tal como se describe en el presente documento puede modificarse para dirigirse a un sitio particular en un paciente, dirigiendo y haciendo uso de este modo de un agente inhibidor en ese sitio. Las modificaciones adecuadas incluyen

25 manipular la fórmula química de la sección lipídica del vehículo de administración y/o introducir en el vehículo un agente de dirección capaz de dirigir específicamente un vehículo de administración a un sitio preferido, por ejemplo, un tipo celular preferido. Otros vehículos de administración adecuados incluyen partículas de oro, conjugados moleculares de poli-L-lisina/ADN, y cromosomas artificiales.

Un portador farmacéuticamente aceptable que es capaz de dirigir se denomina como un “vehículo de administración de dirección”. Los vehículos de administración de dirección de la presente invención son capaces de administrar una formulación, que incluye un agente inhibidor, a un sitio diana en un paciente. Un “sitio diana” se refiere a un sitio en un paciente al que se desea administrar una formulación terapéutica. Por ejemplo, un sitio diana puede ser cualquier célula o tejido que es una diana mediante inyección directa o administración usando liposomas, vectores virales u 35 otros vehículos de administración, incluyendo ribozimas. Un vehículo de administración tal como se describe en el presente documento puede modificarse para dirigirse a un sitio particular en un animal, dirigiendo y haciendo uso de este modo de una molécula de ácido nucleico en ese sitio. Las modificaciones adecuadas incluyen manipular la fórmula química de la sección lipídica del vehículo de administración y/o introducir en el vehículo un compuesto capaz de dirigir específicamente un vehículo de administración a un sitio preferido, por ejemplo, una célula o tipo de tejido preferido (por ejemplo, al cerebro o al sistema nervioso central). Específicamente, dirigir se refiere a hacer que un vehículo de administración se una a una célula particular mediante la interacción del compuesto en el vehículo con una molécula en la superficie de la célula. Los compuestos de dirección apropiados incluyen ligandos capaces de unirse selectivamente (es decir, específicamente) a otra molécula en un sitio particular. Los ejemplos de dichos ligandos incluyen anticuerpos, antígenos, receptores y ligandos del receptor. Ejemplos particularmente útiles 45 incluyen cualesquiera ligandos que están asociados con la vía del complemento (por ejemplo, CR2, C3, C3d, C3dg, iC3b, C3b) o cualesquiera ligandos (por ejemplo, selectinas) que están asociados con el tipo de célula, tipo de tejido,

o sitio en el animal a tratar.

Manipular la fórmula química de la sección lipídica del vehículo de administración puede modular la dirección extracelular o intracelular del vehículo de administración. Por ejemplo, puede añadirse un producto químico a la fórmula lipídica de un liposoma que altera la carga de la bicapa lipídica del liposoma, de modo que el liposoma se fusione con células particulares que tienen características de carga particulares. En un ejemplo, un vehículo de administración de dirección puede ser una formulación que permite que un compuesto atraviese la barrera hematoencefálica.

55 Un vehículo de administración útil para diversas vías y agentes de administración es un liposoma. Un liposoma es capaz de seguir siendo estable en un animal durante una cantidad de tiempo suficiente para administrar una molécula de ácido nucleico descrita en la presente invención a un sitio preferido en el animal. Un liposoma, de acuerdo con la presente invención, comprende una composición lipídica que es capaz de administrar una molécula de ácido nucleico u otro compuesto a un sitio particular, o seleccionado, en un animal. Un liposoma de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento comprende una composición lipídica que es capaz de fusionarse con la membrana plasmática de la célula diana para administrar una molécula de ácido nucleico al interior de una célula. Los liposomas adecuados para uso con la presente invención incluyen cualquier liposoma. Los liposomas de la presente invención preferidos incluyen aquellos liposomas usados típicamente en, por ejemplo, métodos de

65 administración de genes conocidos por los expertos en la materia. Los liposomas más preferidos comprenden liposomas que tienen una composición lipídica policatiónica y/o liposomas que tienen una estructura principal de

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colesterol conjugada a polietilenglicol. Complejar un liposoma con una molécula de ácido nucleico o agente inhibidor de la presente invención puede conseguirse usando métodos convencionales en la técnica.

Otro vehículo de administración comprende un vector viral. Un vector viral incluye una molécula de ácido nucleico

5 aislada útil en el método de la presente invención, en el que las moléculas de ácido nucleico están empaquetadas en un revestimiento viral que permite la entrada de ADN al interior de una célula. Pueden usarse una serie de vectores virales, incluyendo, aunque sin limitarse a, los basados en alfavirus, poxvirus, adenovirus, herpesvirus, lentivirus, virus adenoasociados y retrovirus.

Los agentes y formulaciones, tal como se describen en el presente documento, pueden administrarse a cualquier animal o paciente, y preferentemente a seres humanos. De acuerdo con la presente invención, la administración de un agente o formulación es útil para inhibir cualquier síntoma de daño fisiológico asociado con LCT, LME o afecciones similares o relacionadas. Los pacientes que son candidatos adecuados para el método de la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a, pacientes que presentan, o que corren el riesgo de desarrollar (por

15 ejemplo, es probable o se ha predicho que desarrollarán), daño fisiológico al cerebro o la médula espinal y afecciones relacionadas con este daño, como resultado de lesión (incluyendo lesión traumática) o enfermedad.

De acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, la determinación de protocolos aceptables para administrar un agente o una composición que incluye el agente, incluyendo la vía de administración y la cantidad eficaz de un agente a administrar a un animal, puede ser conseguida por los expertos en la materia. Un agente o composición tal como se describe en el presente documento puede administrarse in vivo o ex vivo. Las vías de administración in vivo adecuadas pueden incluir, aunque sin limitarse a, vías oral, nasal, por inhalación, tópica, intratraqueal, transdérmica, rectal, cerebral (por ejemplo, intracraneal), medular (por ejemplo, intramedular o al espacio epidural de la médula espinal) y parenteral. Las vías parenterales preferidas pueden incluir, aunque sin 25 limitarse a, vías subcutánea, intradérmica, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal. Las vías tópicas preferidas incluyen inhalación por aerosol (es decir, pulverización) o administración superficial tópica a la piel de un animal. Preferentemente, un agente se administra mediante vías sistémicas (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa), con administración intravenosa siendo particularmente preferida, o mediante administración al cerebro, la médula espinal

o el espacio epidural de la médula espinal. Para lesión cerebral traumática, se prefiere administración mediante administración intravenosa o al cerebro. Para lesión de médula espinal, se prefiere administración por administración intravenosa, administración a la médula espinal o administración al espacio epidural de la médula espinal. Ex vivo se refiere a realizar parte de la etapa de administración fuera del paciente.

Las técnicas para la administración de agentes y composiciones al cerebro y al sistema nervioso central incluyen,

35 aunque sin limitarse a, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intraarterial con alteración de la barrera hematoencefálica, infusión continua de fármacos a través del cerebro usando métodos de administración mejorada por convección, implantación, infusión intratecal, administración intraventricular, administración intersticial y administración intramedular. Las administraciones intravenosa, intraperitoneal, intramuscular e intramedular pueden realizarse usando métodos convencionales en la técnica. La administración mediante aerosol (inhalación) puede realizarse usando métodos convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, el documento Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 189: 11277-11281, 1992. Los portadores adecuados para administración mediante aerosol se han descrito anteriormente. Los dispositivos para administración de formulaciones en aerosol incluyen, aunque sin limitarse a, inhaladores dosificadores presurizados (MDI), inhaladores de polvo seco (DPI), y dispositivos dosificadores de solución (MSI), e incluyen dispositivos que son nebulizadores e

45 inhaladores. La administración oral puede realizarse complejando una composición terapéutica de la presente invención con un portador capaz de resistir la degradación por enzimas digestivas en el intestino de un animal. Los ejemplos de dichos portadores, incluyen cápsulas de plástico o comprimidos, tales como los conocidos en la técnica. Técnicas de inyección directa son particularmente útiles para administrar una molécula de ácido nucleico recombinante a una célula o tejido que es accesible por cirugía, y particularmente, en o cerca de la superficie del cuerpo. La administración de una composición localmente dentro del área de una célula diana se refiere a inyectar la composición a centímetros y preferentemente, a milímetros de la célula o tejido diana.

Diversos métodos de administración y vehículos de administración desvelados en el presente documento han demostrado ser eficaces para la administración de una molécula de ácido nucleico a una célula o tejido diana, con lo 55 que la molécula de ácido nucleico transfectaba la célula y era expresada. En muchos estudios, la administración y expresión con éxito de un gen heterólogo se consiguió en tipos celulares preferidos y/o usando vehículos de administración y vías de administración preferidas de la presente invención. La administración de numerosas secuencias de ácido nucleico a diversos tejidos diana se ha conseguido mediante administración vectores virales que codifican las secuencias de ácido nucleico. (Por ejemplo, véase, de muchos ejemplos, vector retroviral; Blaese et al., 1995, Science 270: 475-480; Bordignon et al., 1995, Science 270: 470-475), administración nasal (vector asociado a CFTR-adenovirus), administración intracoronaria (vector adenoviral y virus hemaglutinante de Japón, véase anteriormente), administración intravenosa (vector viral adenoasociado; Koeberl et al., 1997, Proc Natl Acad Sci EE. UU. 94: 1426-1431). Millecamps et al., describieron la dirección de vectores adenovirales a neuronas usando elementos potenciadores-restrictivos neuronales colocados cadena arriba del promotor para el transgén (promotor 65 de fosfoglicerato). Dichos vectores se administraron a ratones y ratas por vía intramuscular y por vía intracerebral, respectivamente, dando como resultado transfección y expresión específicas de neuronas con éxito del transgén in

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vivo (Millecamps et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 865-869). Bennett et al., describieron el uso de un vector viral adenoasociado para administrar y expresar un gen mediante inyección subretiniana en la retina neural in vivo durante más de 1 año (Bennett, 1999, ibid.).

5 Una dosis individual adecuada de un agente inhibidor a administrar a un animal es una dosis que es capaz de reducir o prevenir al menos un síntoma de daño fisiológico debido a LCT o LME en un animal cuando se administra una o más veces durante un periodo de tiempo adecuado. Una dosis individual preferida de un agente, que incluye proteínas, pequeñas moléculas y anticuerpos, para uso en el método descrito en el presente documento, comprende entre aproximadamente 0,01 microgramos x kilogramo-1 y aproximadamente 10 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una dosis individual más preferida de un agente comprende entre aproximadamente 1 microgramo x kilogramo-1 y aproximadamente 10 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una dosis individual aún más preferida de un agente comprende entre aproximadamente 5 microgramos x kilogramo-1 y aproximadamente 7 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una dosis individual aún más preferida de un agente comprende entre aproximadamente 10 microgramos x kilogramo-1 y aproximadamente 5 miligramos x

15 kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una dosis individual particularmente preferida de un agente comprende entre aproximadamente 0,1 miligramos x kilogramo-1 y aproximadamente 5 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal, si el agente es administrado mediante aerosol. Otra dosis individual particularmente preferida de un agente comprende entre aproximadamente 0,1 microgramos x kilogramo-1 y aproximadamente 10 microgramos x kilogramo-1de peso corporal de un animal, si el agente es administrado por vía parenteral.

En un ejemplo, una dosis individual apropiada de un complejo de ácido nucleico:liposoma de la presente invención es de aproximadamente 0,1 g a aproximadamente 100 g por kg de peso corporal del paciente al que está siendo administrado el complejo. En otra realización, una dosis individual apropiada es de aproximadamente 1 g a aproximadamente 10 g por kg de peso corporal. En otra realización, una dosis individual apropiada de complejo de

25 ácido nucleico:lípido es al menos aproximadamente 0,1 g de ácido nucleico, más preferentemente al menos aproximadamente 1 g de ácido nucleico, aún más preferentemente al menos aproximadamente 10 g de ácido nucleico, aún más preferentemente al menos aproximadamente 50 g de ácido nucleico, y aún más preferentemente al menos aproximadamente 100 g de ácido nucleico.

Una dosis individual preferida de un anticuerpo comprende entre aproximadamente 1 ng x kilogramo-1 y aproximadamente menos de 1 mg x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una dosis individual más preferida de un anticuerpo comprende entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 600 g x kilogramo-1 de peso corporal del animal. Una dosis individual aún más preferida de un anticuerpo, particularmente cuando la formulación del anticuerpo se administra por nebulización, comprende entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y

35 aproximadamente 600 g x kilogramo-1 de peso corporal del animal, y más preferentemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 500 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 400 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 300 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 200 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 100 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 50 g x kilogramo-1 de peso corporal del animal.

Otra dosis individual preferida de un anticuerpo, particularmente cuando la formulación del anticuerpo se administra por nebulización, comprende entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 600 g x kilogramo-1

45 de peso corporal del animal, y más preferentemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 500 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 400 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 300 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 200 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 100 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 50 g x kilogramo-1 de peso corporal del animal.

Otra dosis individual preferida de un anticuerpo, particularmente cuando la formulación del anticuerpo se administra por inhalación directa desde un inhalador, comprende entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente

55 100 g x kilogramo-1 de peso corporal del animal, y más preferentemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 50 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 10 g x kilogramo-1 , y más preferentemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 5 g x kilogramo-1 , y más preferentemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 1 g x kilogramo-1 , y más preferentemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 0,5 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 0,25 g x kilogramo-1, y más preferentemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 0,1 g x kilogramo-1 de peso corporal del animal.

El anticuerpo puede administrarse a una dosis de menos de aproximadamente 500 g de anticuerpo por mililitro de

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formulación, y preferentemente, menos de aproximadamente 250 g de anticuerpo por mililitro de formulación, y más preferentemente, menos de aproximadamente 100 g de anticuerpo por mililitro de formulación, y más preferentemente, menos de aproximadamente 50 g de anticuerpo por mililitro de formulación, y más preferentemente, menos de aproximadamente 40 g de anticuerpo por mililitro de formulación, y más

5 preferentemente, menos de aproximadamente 30 g de anticuerpo por mililitro de formulación, y más preferentemente, menos de aproximadamente 20 g de anticuerpo por mililitro de formulación, y más preferentemente, menos de aproximadamente 10 g de anticuerpo por mililitro de formulación, y aún más preferentemente, entre aproximadamente 5 g de anticuerpo y aproximadamente 10 g de anticuerpo por mililitro de formulación.

10 De acuerdo con el método descrito en el presente documento, una cantidad eficaz de un agente que inhibe el daño fisiológico debido a LCT o LME a administrar a un animal comprende una cantidad que es capaz de reducir al menos un síntoma o indicador de daño fisiológico debido a LCT o LME, o es capaz de mejorar la recuperación de LCT o LME, sin ser tóxico para el animal. Una cantidad que es tóxica para un animal comprende cualquier cantidad que

15 casa daño a la estructura o función de un animal (es decir, venenosa).

En un animal que ha padecido LCT o LME, una cantidad eficaz de un agente a administrar a un animal puede ser una cantidad que reduce de forma medible al menos un síntoma o indicador de daño fisiológico debido a LCT o LME en el animal en comparación con antes de la administración del agente o en comparación con en ausencia de 20 administración del agente. Una cantidad eficaz de un agente a administrar a un animal puede ser una cantidad que reduce de forma medible al menos un síntoma o indicador de daño debido a LCT o LME en el animal en comparación con un nivel del síntoma en una población de animales que han padecido LCT o LME sustancialmente similar, en la que el agente no se administró. El agente es, preferentemente, capaz de reducir al menos un síntoma o indicador de daño fisiológico debido a LCT (por ejemplo, daño cerebral) o LME (por ejemplo, daño a la médula 25 espinal) en un animal, incluso cuando el agente es administrado después de la aparición de los síntomas físicos del daño. De la forma más preferente, una cantidad eficaz del agente es una cantidad que reduce el síntoma o síntomas

o el indicador o indicadores de daño debido a LCT o LME hasta el punto en que el síntoma o síntomas o el indicador

o indicadores ya no se detectan en el paciente. En una realización, una cantidad eficaz del agente puede ser una cantidad que mejora la recuperación del paciente de LCT o LME, según lo medido mediante el cese o la inversión de

30 un síntoma o indicador de daño fisiológico, o según lo medido mediante una mejora en una puntuación biológica, valor o medida de funciones neurales o relacionadas en el paciente, medible o detectable.

Una dosis adecuada de un agente de la presente invención es una dosis eficaz para inhibir la expresión o actividad biológica de al menos una proteína en la vía alternativa del complemento, tal como se describe en el presente 35 documento (por ejemplo, factor B, factor D o properdina), en comparación con en ausencia de la administración del agente. Métodos de medición de la expresión o actividad biológica de una proteína se han descrito anteriormente. En otra realización, una dosis adecuada de un agente de la presente invención es una dosis que inhibe de forma medible la vía alternativa del complemento de la invención. La activación del complemento y la inhibición del mismo pueden medirse usando técnicas/ensayos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede realizarse un

40 análisis in vitro de deposición de C3 sobre partículas de cimosano A tal como se describe en los ejemplos. También se puede poner a prueba la capacidad del agente para inhibir la lisis de eritrocitos insensibilizados por suero humano. La extrapolación de los resultados in vitro a dosis in vivo en base a estos ensayos está dentro de la capacidad de los expertos en la materia.

45 Un experto en la materia será capaz de determinar que el número de dosis de un agente a administrar a un animal depende del alcance de la LCT o LME y el daño fisiológico previsto o asociado con la lesión, así como la respuesta de un paciente individual al tratamiento. Métodos para diagnosticar tanto LCT como LME, incluyendo la gravedad de las afecciones, se describen anteriormente y son conocidos en la técnica. Además, el facultativo será capaz de determinar la temporización adecuada para la administración del agente de una manera eficaz para reducir el

50 síntoma o síntomas asociados con o que resultan de LCT o LME en el animal. Preferentemente, el agente es administrado en el plazo de 48 horas, y más preferentemente 36 horas, y más preferentemente 24 horas, y más preferentemente en el plazo de 12 horas, y más preferentemente en el plazo de 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora, o incluso minutos después del evento que causó la LCT o LME. En un ejemplo, el agente es administrado en cuando es reconocido (es decir, inmediatamente) por el paciente, facultativo u otra persona que el

55 paciente ha sufrido LCT o LME. En otra realización, el agente es administrado en cuanto aparece el primer signo de desarrollo de un síntoma de daño cerebral o neural que puede estar asociado con LCT o LME, y preferentemente, en el plazo de al menos 2 horas desde el desarrollo del síntoma o síntomas, y más preferentemente, en el plazo de al menos 1 hora, y más preferentemente en el plazo de al menos 30 minutos, y más preferentemente en el plazo de al menos 10 minutos, y más preferentemente en el plazo de al menos 5 minutos del desarrollo del síntoma o

60 síntomas. Los síntomas de daño fisiológico asociado con LCT o LME y métodos para medir o detectar dichos síntomas se han descrito en detalle anteriormente. Preferentemente, dichas administraciones se dan hasta que aparecen signos de reducción del daño fisiológico o reducción de los síntomas del potencial de daño fisiológico, y a continuación según sea necesario hasta que los síntomas desparecen o se detienen.

65 El método de la presente invención puede usarse en cualquier animal, y particularmente, en cualquier animal de la

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longitudinal en el cuero cabelludo en la línea media. Se dejó caer un peso de 333 g sobre el cráneo fijado desde una altura de 2 cm, dando como resultado un traumatismo contuso focal en el hemisferio izquierdo. Después del traumatismo, los ratones recibieron oxigenación de apoyo con O2 al 100% hasta que estaban completamente despiertos y a continuación fueron devueltos a sus celdas. En puntos temporales definidos (t = 4 h, 24 h y 7 días),

5 los ratones se sacrificaron y los hemisferios cerebrales se extrajeron para análisis mediante inmunohistoquímica, histoquímica TUNEL y análisis por SDS-PAGE/transferencia de Western. Además, se recogieron muestras de suero para determinación de niveles de anafilatoxina C5a del complemento mediante análisis de ELISA y transferencia de Western de Bcl-2 (véase a continuación).

Los ratones operados de forma simulada se mantuvieron en condiciones idénticas que el grupo de traumatismo y se sometieron a los mismos procedimientos (anestesia e incisión en el cuero cabelludo) excepto que no se aplicó traumatismo craneal.

ELISA para C5a de ratón. Para la determinación de los niveles de anafilatoxina C5a del complemento en muestras

15 de suero de ratones C57BL/6 con traumatismo craneal y normales de control, se usó un ELISA desarrollado en el laboratorio del Dr. P.A. Ward (Ann Arbor, MI, EE. UU.). En resumen, placas de ELISA (Immulon 4HBX, Thermo Labsystems, Milford, MA, EE. UU.) se revistieron con IgG monoclonal anti-C5a de ratón (5 g/ml, BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.). Después del bloqueo de sitios de unión inespecíficos con leche al 1% (Roth, Karlsruhe, Alemania) en PBS (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) que contenía TWEEN 20 al 0,05% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), la placa se revistió con 100 ml de suero diluidos a 1:20 (en leche al 0,1% en PBS que contenía TWEEN al 0,05%) y C5a de ratón recombinante murina a concentraciones definidas para establecer la curva patrón. Después de la incubación y posteriores etapas de lavado, se añadió anticuerpo monoclonal biotinilado anti-C5a de ratón a 500 ng/ml (BD Pharmingen) seguido por etapas de lavado e incubación con estreptavidina-peroxidasa a 400 ng/ml (Sigma). Para reacción colorimétrica, el sustrato (0,4 mg/ml de OPD con 0,4 mg/ml de urea peróxido de

25 hidrógeno en tampón fosfato citrato 0,05 M; Sigma) se añadió y la reacción de color se interrumpió con ácido sulfúrico 3 M. La absorbancia se leyó a 490 nm (lector “SpectraMax 190”, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU. Todas las muestras se analizaron en pocillos por duplicado y los resultados se calcularon a partir de las medias de análisis de muestras por duplicado. La curva patrón era lineal de 50 ng/ml a 0,1 ng/ml, que representa el límite inferior de detección de este ensayo.

Transferencia de Western. Todos los ratones usados en este estudio se cribaron mediante análisis por transferencia de Western para la presencia de factor B en el suero, como control de calidad interno. Los niveles de proteína del mediador anti-apoptótico mitocondrial Bcl-2 y del receptor Fas pro-apoptótico se determinaron en cerebros de ratón homogeneizados y se emparejaron con muestras de suero a 4 h, 24 h y 7 d después de traumatismo craneal u 35 operación simulada en ratones fB-/-y fB+/+. La técnica de transferencia de Western se describió previamente [32]. En resumen, se extrajeron cerebros de ratón bajo anestesia, se separaron en hemisferios izquierdo y derecho, y se homogeneizaron inmediatamente en tampón de lisis (Sigma) que contenía TRIS-HCl 100 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,5%, Nonidet P-40 al 0,5%, 10 mg/ml de aprotinina, 10 mg/ml de leupeptina, 5 mg/ml de pepstatina, fluoruro de fenil-metil-sulfonilo 1 mM en agua desionizada, usando un homogeneizador Ultra Turrax Homogenizer® (IKA Werke, Staufen, Alemania). Después de 15 minutos de centrifugado a 13.000 x g, el contenido de proteínas de los sobrenadantes se determinó mediante el ensayo de proteínas colorimétrico disponible en el mercado (“BCA Protein Assay”, Pierce/Perbio Science, Bonn, Alemania). Una muestra de 60 g de proteínas totales se desnaturalizó en tampón de carga y se separó en condiciones reductoras en geles de SDS-poliacrilamida al 12% en paralelo con un estándar de proteína de SDS-PAGE preteñido de amplio rango (Bio-Rad, Múnich, 45 Alemania). Las proteínas se transfirieron a continuación a membranas de nitrocelulosa Protran BA 83 (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) mediante electrotransferencia (Bio-Rad). Las transferencias se bloquearon durante una noche y a continuación se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-Bcl-2 de ratón (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), diluido a 1:500, anticuerpo de conejo policlonal anti-Fas de ratón (clon A-20, Santa Cruz), diluido a 1:200, anticuerpo policlonal de pollo anti-factor B de ratón, diluido a 1:8.000 (suministrado amablemente por el Dr. Scott R. Barnum, Universidad de Alabama en Birmingham, AL, EE. UU.) como anticuerpos primarios, y con un anticuerpo monocloncal anti--actina (clon AC-15, Sigma) diluido a 1:10.000, como control interno para establecer una carga igual de las bandas. Después de la incubación con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (Dako, Hamburgo, Alemania, y Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), diluida a 1:5.000, la unión a anticuerpos se visualizó mediante una técnica de quimioluminiscencia no radiactiva usando un kit de transferencia

55 de Western ECL® disponible en el mercado (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania). La transferencia de proteínas por igual a la membrana de transferencia se confirmó mediante tinción con rojo Ponceau (Sigma).

Inmunohistoquímica. Para valoración de la morfología, integridad y apoptosis neuronales, cerebros de ratón extraídos se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido, se incluyeron en compuesto OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA) y se almacenaron a -80°C hasta que se usaron para análisis. Se cortaron secciones de tejido coronal de seis a ocho micrómetros de grosor con un criostato a -20°C. Para inmunohistoquímica, se fijaron portaobjetos en acetona y a continuación se analizaron mediante una técnica con biotina/avidina/peroxidasa convencional con DABtetraclorhidrato como cromógeno (Vector, Burlingame, CA), tal como se ha descrito previamente [13, 32]. Los siguientes anticuerpos primarios se usaron como marcadores celulares: monoclonal anti-NeuN, a una dilución 65 valorada cuantitativamente de 1:2.000 (Chemicon, Hampshire, RU) para neuronas; policlonal de conejo anti-GFAP,

1:100 (Shandon Immunon, Pittsburgh, PA, EE. UU.) para astrocitos; monoclonal de rata anti-CD11b, 1:100,

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(Accurate Chemical, Westbury, NY, EE. UU.) para microglia; policlonal de cabra anti CD144, 1:200 (Santa Cruz) para células endoteliales. Se usó IgG no inmunizada (Vector) como control negativo a diluciones iguales que el anticuerpo específico omitido.

5 Para determinar el alcance de la muerte celular neuronal intracerebral, se realizó histoquímica TUNEL usando un “kit de detección de muerte celular in situ con fluoresceína” (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, tal como se ha descrito previamente [38]. En resumen, los portaobjetos se secaron durante 30 minutos, seguido por fijación en solución al 10% de formalina a temperatura ambiente. Después de lavar en PBS (tres veces durante 3 minutos), las secciones se incubaron en solución de etanol-ácido acético enfriada con hielo (2:1) durante 5 minutos a -20°C. Seguidamente, se lavaron en PBS y se incubaron en una solución de permeabilización con Triton X-100 al 3% en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente, a continuación se incubaron con la enzima TdT en un tampón de reacción que contenía fluoresceína-dUTP durante 90 minutos a 37°C. Se realizó un control negativo usando solamente el tampón de reacción sin enzima TdT. Se realizaron controles positivos digiriendo secciones de cerebro iguales con solución de ADNasa de grado I (500 U/ml;

15 Roche) durante 20 minutos a temperatura ambiente y se mantuvieron siempre separadas de las otras muestras en lo sucesivo. Después del marcado, las secciones se lavaron de nuevo en PBS y para visualizar las células no teñidas (negativas en TUNEL), las secciones se cubrieron con medio de montaje VectashieldO para fluorescencia con DAPI (Vector). Todas las muestras se evaluaron inmediatamente después de la tinción usando un microscopio de fluorescencia Axioskop 40 (Zeiss, Alemania) a 460 nm para DAPI y 520 nm para fluorescencia TUNEL y se analizaron mediante el software Alpha digi doc 1201 (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE. UU.).

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó usando software disponible en el mercado (SPSS 9.0 para Windows®). Las diferencias en los niveles de C5a del complemento en suero de ratones fB-/-y fB+/+ se determinaron mediante el prueba de la t de Student para datos no emparejados. Un valor P < 0,05 se consideró

25 estadísticamente significativo.

Resultados

La activación del complemento está atenuada en ratones fB-/-con lesión cerebral.

El cribado de muestras de suero de todos los ratones fB-/-y miembros de la misma camada de tipo silvestre (fB+/+) usados en el presente estudio reveló que el factor B solamente era detectable en suero de animales fB+/+, pero no en los ratones fB-/-. Estos experimentos de control se realizaron para valorar que los ratones knockout están completamente desprovistos de factor B en suero (no se muestran los datos).

35 Con referencia a la figura 10, muestras de suero de ratones fB+/+ y fB-/-con lesión cerebral de la estirpe C57BL/6 (n=6 por grupo y punto temporal) y de ratones C57BL/6 normales (control; n=4) se analizaron mediante ELISA específico para C5a de ratón (los datos en la figura 10 se muestran como niveles medios ±SD; *P<0,05, ratones fB+/+ frente a control y fB+/+ frente a fB-/-. LCT, lesión cerebral traumática). El traumatismo craneal cerrado experimental en ratones C57BL/6 de tipo silvestre dio como resultado una activación sistémica de la cascada del complemento, según lo determinado mediante niveles en suero significativamente elevados del producto de activación del complemento C5a en todos los puntos temporales evaluados de 4 horas a 7 días (P<0,05 frente a suero de ratón normal, prueba de la t de Student para datos no emparejados; figura 10). En contraste, los niveles en suero de anafilatoxina C5a se reducían drásticamente en ratones fB-/-en todos los puntos temporales

45 correspondientes después de traumatismo craneal, llegando a niveles iniciales en ratones normales (P<0,05 frente a ratones fB+/+ con lesión cerebral, prueba de la t de Student para datos no emparejados; figura 10). Estos datos implican que la vía alternativa es la fuente para activación del complemento después de lesión cerebral, una noción que solamente se ha sustanciado previamente para enfermedades fuera del SNC, tales como artritis reumatoide, nefritis autoinmunitaria, e isquemia/lesiones por reperfusión [33, 37].

La falta de factor B causa muerte celular neuronal reducida después de traumatismo craneal.

Tal como se ha descrito previamente, se observó muerte celular neuronal en cerebros lesionados de ratones C57BL/6 de tipo silvestre durante hasta 7 días después de traumatismo craneal cerrado [38]. Con referencia a las 55 figuras 12-14, criosecciones coronales del hemisferio izquierdo (lesionado) de ratones de tipo silvestre (fB+/+, paneles A-E en cada figura) y knockout para el factor B (fB-/-, paneles F-J en cada figura) se analizaron mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo específico para el marcador neuronal NeuN (A, B, F, G en cada figura) o mediante TUNEL-histoquímica de secciones adyacentes (D, E, I, J en cada figura). La morfología celular global de las secciones TUNEL se revela mediante tinción nuclear DAPI (C, H en cada figura). Los paneles B, E, G, J en cada figura representan un aumento de 4 veces de los respectivos paneles A, D, F, I en cada figura (aumentos originales: 100x (A, C, D, F, H, I), 400x (B, E, G, J)). Un incremento de células positivas en TUNEL se detectó en los hemisferios lesionados de ratones fB+/+ en el plazo de 4 a 24 horas después del traumatismo (figuras 12 y 13, respectivamente), persistiendo durante hasta 7 días (figura 14). La tinción nuclear con 4',6'-diamino-2-fenilindol (DAPI; paneles C y H de las figuras 12-14) mostraba la morfología celular en secciones adyacentes a las valoradas 65 por histoquímica TUNEL. Las neuronas se determinaron como el principal tipo celular positivo en TUNEL mediante tinción inmunohistoquímica de secciones adyacentes con el marcador celular específico NeuN (paneles A, B, F y G

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Claims (1)

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