ES2549328T3 - Enzimas celulasas optimizadas - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con respecto a la SEQ ID NO: 2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado por sustitución o supresión.
Description
Enzimas celulasas optimizadas
5 Campo del invento
El invento divulga unas enzimas celulasas con unas propiedades optimizadas para el tratamiento de unos substratos, que contienen celulosas y lignocelulosas. En particular, se divulgan unas enzimas celobiohidrolasas con unas características preferidas. La presente divulgación proporciona unas variantes de fusión, inserción, supresión
10 (deleción) y/o sustitución de tales enzimas. Las variantes de enzimas tienen unas elevadas propiedades de estabilidad térmica, estabilidad proteolítica, actividad específica y/o una estabilidad frente a un pH extremo. Se divulgan unas moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales enzimas, una composición que comprende tales enzimas, un método para su producción, y el uso para el tratamiento de una celulosa y/o para la producción de combustibles biológicos.
15
El desarrollo de unos procedimientos de producción basados en materias primas renovables es muy deseado, por ejemplo, para la producción de etanol a partir de materiales celulósicos y lignocelulósicos.
20 Un material celulósico en una forma pura o en combinación con una hemicelulosa y/o una lignina es una materia prima valiosa y que está fácilmente disponible para la producción de productos químicos y combustibles. Una etapa clave en el tratamiento de una celulosa y una lignocelulosa es la hidrólisis de la celulosa, que es un polímero de glucosa con enlaces beta-1,4, y la subsiguiente liberación de los monómeros de glucosa y de unos cortos
25 oligómeros de glucosa tales como una celobiosa, una celotriosa, etc. Unas enzimas que catalizan esta reacción son encontradas en diversos organismos, especialmente en ciertos hongos filamentosos y en ciertas bacterias, que son capaces de degradar e hidrolizar a una celulosa.
Son conocidos unos procedimientos continuos para convertir a una biomasa lignocelulósica sólida en unos
30 productos carburantes combustibles. Un tratamiento para hacer a los substratos celulósicos más susceptibles frente a una degradación enzimática comprende una molienda, un tratamiento químico y/o un tratamiento hidrotérmico. Unos ejemplos de éstos son una oxidación en húmedo y/o un reventamiento con vapor. Tales tratamientos aumentan la accesibilidad de las fibras de celulosa y las separan con respecto de una hemicelulosa y una lignina, lo que es requerido para la degradación de los polímeros de celulosa. Entre éstas, unas enzimas celobiohidrolasas
35 (CBH), y más específicamente una celobiohidrolasa I (CBHI) desempeñan un cometido especial en la etapa de hidrólisis y proporcionan la actividad enzimática más favorable para el procedimiento. Las enzimas CBHI catalizan la liberación hidrolítica progresiva de celobiosa desde el extremo reductor de los polímeros de celulosa (Lynd LR, Weimer PJ, van Zyl WH, Pretorius IS. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology [Utilización de la celulosa por microbios: fundamentos y biotecnología]. Microbiol Mol Biol Rev. 2002 Sep;66(3):506-77).
40 Unos materiales celulósicos hidrolizados contienen diversas y valiosas moléculas de hidratos de carbono, que pueden ser aisladas a partir de las mezclas. Unos materiales hidrolizados de materiales celulósicos, que contienen azúcares, pueden ser utilizados para una producción microbiana de una variedad de productos químicos finos o biopolímeros, tales como unos ácidos orgánicos, etanol o unos alcoholes superiores (es decir unos dioles o polioles)
45 o unos poli(hidroxialcanoatos) (PHAs). Uno de los usos principales de los materiales hidrolizados de azúcares se encuentra en la producción de combustibles biológicos.
Kurabi y colaboradores (2005) describen unos preparados de celulasas procedentes de Trichoderma reesei y de otros hongos, tales como Penicillium sp. El rendimiento se ha analizado en abetos Douglas, que habían sido 50 reventados con vapor y tratados previamente con un disolvente orgánico de etanol. Un mejor rendimiento de unas mezclas de enzimas parece ser el resultado de las propiedades mejoradas de unos componentes individuales de enzimas así como del efecto de cada compuesto en la mezcla, especialmente la presencia de una beta-glucosidasa (Kurabi A, Berlin A, Gilkes N, Kilburn D, Bura R, Robinson J, Markov A, Skomarovsky A, Gusakov A, Okunev O, Sinitsyn A, Gregg D, Xie D, Saddler J.(2005) Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolv
55 pretreated Douglas-Fir by novel and commercial fungal cellulases [Hidrólisis enzimática de abetos de Douglas reventados con vapor y tratados previamente con un disolvente orgánico de etanol mediante unas celulasas fúngicas y adquiribles comercialmente]. Appl Biochem Biotechnol. 121-124: 219-30).
Unas secuencias de celobiohidrolasas de la clase de una glucohidrolasa 7 (cel7) son conocidas en la especialidad a
60 partir de varias fuentes fúngicas. Una celobiohidrolasa Cel7 de Talaromayces emersonii es conocida y ya se ha informado acerca de su expresión en Escherichia coli. Grassick y colaboradores han presentado un informe sobre la purificación y la determinación de la estructura en 3D de una proteína CBH de núcleo natural, y de la clonación y sobreexpresión de los correspondientes genes, procedentes de una fuente fúngica termófila. Se encontró que una CBH 16 es extremadamente estable térmicamente con un valor óptimo de la temperatura de 68 °C a pH 5,0 y un
período de tiempo de vida media (t1/2) de 68,0 min a 80 °C y un pH de 5,0. (Grassick A, Murray PG, Thompson R, Collins CM, Byrnes L, Birrane G, Higgins TM, Tuohy MG. Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii [Estructura tridimensional de una celobiohidrolasa natural termoestable, CBH IB, y 5 caracterización molecular del gen cel7 del hongo filamentoso, Talaromyces emersonii]. Eur J Biochem. 2004 Nov;271 (22):4495-4506) y en Saccharomyces cerevisiae (Voutilainen SP, Murray PG, Tuohy MG, Koivula A. Expression of Talaromyces emersonii cellobiohydrolase Cel7A in Saccharomyces cerevisiae and rational mutagenesis to improve its thermostability and activity (Expresión de una celobiohidrolasa de Talaromyces emersonii Cel7A en Saccharomyces cerevisiae y mutagénesis racional para mejorar su estabilidad térmica y su actividad]. 10 Protein Eng Des Sel. 2010 Feb;23(2):69-79), sin embargo, la proteína o bien era producida en una forma inactiva o en unos rendimientos bastante bajos (de menos que o iguales a 5 mg/l). Una celobiohidrolasa I de Hypocrea jecorina puede ser producida a partir de unas cepas de tipo silvestre (wt) o modificadas genéticamente del género Hypocrea
o Trichoderma en unos altos rendimientos. Unas secuencias mejoradas de una Cel7A de Hypocrea jecorina han sido divulgadas en los documentos de patentes de los EE.UU. US7459299B2, US7452707B2, en los documentos de
15 solicitudes de patentes internacionales WO2005/030926, WO01/04284A1 o en el documento de solicitud de patente de los EE.UU.: US2009/0162916 A1.
Unas posiciones que conducen a mejoramientos fueron deducidas a partir de unas alineaciones con unas secuencias procedentes de unas enzimas termoestables reseñadas, y que se han propuesto a partir de una
20 información estructural y una barajadura de unas posiciones identificadas, seguida por unos escrutinios limitados. Se ha informado sobre un escrutinio de unas grandes bibliotecas en ciertos organismos transformables tales como Saccharomyces cerevisiae mediante el uso de unos substratos fluorescentes muy sensibles, que se asemejan a unos substratos naturales de un modo muy restrictivo. (Percival Zhang YH, Himmel ME, Mielenz JR. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies [Perspectivas del mejoramiento de celulasas: escrutinio y
25 estrategias de selección]. Biotechnol Adv. 2006 Sep-Oct;24(5):452-81).
Se ha informado sobre la producción de unas celobiohidrolasas procedentes de otros sistemas fúngicos tales como los de Thermoascus aurantiacus, Chrysosporium lucknowense o Phanerochaete chrysosporium. Se ha informado sobre la expresión de una celobiohidrolasa Cel7 a partir de levaduras, pero los rendimientos enzimáticos o las
30 propiedades enzimáticas siguen siendo insatisfactorios/as. (Penttilä ME, André L, Lehtovaara P, Bailey M, Teeri TT, Knowles JK. Efficient secretion of two fungal cellobiohydrolases by Saccharomyces cerevisiae [Secreción eficiente de dos celobiohidrolasas fúngicas por Saccharomyces cerevisiae]. Gene. 1988;63(1):103-12).
El documento WO03/000941 divulga un cierto número de CBHs y sus correspondientes secuencias génicas. Sin
35 embargo, no se divulgaron propiedades fisiológicas ni aplicaciones. Se ha informado de que la fusión de unos dominios de fijación de celulosa con unas subunidades catalíticas de celobiohidrolasas mejora las propiedades hidrolíticas de unas proteínas sin ningún dominio natural.
El documento US 2009042266 (A1) divulga unas fusiones de Cel7A de Thermoascus aurantiacus con unos dominios 40 de fijación de celulosa procedentes de una celobiohidrolasa I de Chaetomium thermophilum y Hypocrea jecorina.
El documento US5686593 informa acerca de la fusión de unas regiones engarzadoras y de unos dominios de fijación que se han diseñado especialmente, con ciertas celobiohidrolasas.
45 Hong y colaboradores (2003) describen la producción de una CBHI de Thermoascus aurantiacus en levaduras y su caracterización (Hong J, Tamaki H, Yamamoto K, Kumagai H Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast [Clonación de un gen que codifica una celobiohidrolasa termoestable procedente de Thermoascus aurantiacus y su expresión en una levadura]. Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Nov;63(1):42-50).
50 Tuohy y colaboradores (2002) informan acerca de la expresión y la caracterización de una CBH de Talaromyces emersonii. (Tuohy MG, Walsh DJ, Murray PG, Claeyssens M, Cuffe MM, Savage AV, Coughlan MP.: Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii [Parámetros cinéticos y modo de acción de las celobiohidrolasas producidas por Talaromyces emersonii]. Biochim Biophys Acta. 2002 Apr
Nevoigt y colaboradores (2008) informan acerca de la expresión de ciertas enzimas celulolíticas en levaduras. (Nevoigt E. Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae [Progresos en la modificación metabólica de Saccharomyces cerevisiae]. Microbiol Mol Biol Rev. 2008 Sep;72(3):379-412).
60 Fujita y colaboradores (2004) informan acerca de una cepa de Saccharomyces cervisiae que expresa una combinación de una endoglucanasa, una beta glucosidasa y una CBHII presentada gráficamente sobre la superficie celular. No se usó una celobiohidrolasa I (Cel7) en este planteamiento. (Fujita Y, Ito J, Ueda M, Fukuda H, Kondo A. Synergistic saccharification, and direct fermentation to ethanol, of amorphous cellulose by use of an engineered yeast strain codisplaying three types of cellulolytic enzyme [Sacarificación sinérgica, y fermentación directa para dar etanol de una celulosa amorfa mediando utilización de una cepa de una levadura modificada que presenta concomitantemente tres tipos de una enzima celulolítica]. Appl Environ Microbiol. 2004 Feb;70(2):1207-12).
5 Boer H y colaboradores (2000) describen la expresión de unas enzimas clasificadas como GH7 en diferentes anfitriones de levaduras, pero los niveles de las proteínas expresadas fueron bajos. (Boer H, Teeri TT, Koivula A. Characterization of Trichoderma reesei cellobiohydrolase Cel7A secreted from Pichia pastoris using two different promoters [Caracterización de una celobiohidrolasa Cel7A de Trichoderma reesei que ha sido segregada por Pichia pastoris usando dos promotores diferentes]. Biotechnol Bioeng. 2000 Sep 5;69(5):486-94).
10 Godbole y colaboradores (1999) y Hong y colaboradores (2003) encontraron que unas proteínas de esta clase de enzimas expresadas a partir de levaduras frecuentemente estaban mal plegadas e hiperglicosiladas y tenían unas capacidades hidrolíticas disminuidas en comparación con la proteína expresada por el anfitrión homólogo. (Godbole S, Decker SR, Nieves RA, Adney WS, Vinzant TB, Baker JO, Thomas SR, Himmel ME. Cloning and
15 expression of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in Pichia pastoris [Clonación y expresión de una celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei en Pichia pastoris]. Biotechnol Prog. 1999 Sep-Oct;15(5):828-33).
Kanokratana y colaboradores (2008), Li y colaboradores (2009) así como el documento de patente china CN01757710 describen la expresión eficiente de unas enzimas de CBH I Cel7, sin embargo, estas proteínas 20 carecen de los dominios de fijación de celulosa, que se requieren para un procesamiento eficiente del substrato. (Kanokratana P, Chantasingh D, Champreda V, Tanapongpipat S, Pootanakit K, Eurwilaichitr L. Identification and expression of cellobiohydrolase (CBHI) gene from an endophytic fungus, Fusicoccum sp. (BCC4124) in Pichia pastoris [Identificación y expresión del gen de una celobiohidrolasa (CBHI) a partir de un hongo endofítico, Fusicoccum sp. (BCC4124), en Pichia pastoris]. LProtein Expr Purif. 2008 Mar;58(1):148-53. Epub 2007 Sep 19; Li
25 YL, Li H, Li AN, Li DC. Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from the thermophilic fungus Chaetomiumthermophilum and its expression in Pichia pastoris [Clonación de un gen que codifica una celobiohidrolasa termoestable a partir del hongo termofílico Chaetomium thermophilum y su expresión en Pichia pastoris]. J Appl Microbiol. 2009 Jun;106(6):1867-75).
30 Voutilainen (2008) y Viikari (2007) divulgan unas enzimas Cel7, que comprenden unas celobiohidrolasas termoestables, sin embargo con solamente unos niveles de expresión desde bajos hasta moderados, procedentes de Trichoderma reesei, (Voutilainen SP, Puranen T, Siika-Aho M, Lappalainen A, Alapuranen M, Kallio J, Hooman S, Viikari L, Vehmaanperä J, Koivula A. Cloning, expression, and characterization of novel thermostable family 7 cellobiohydrolases [Clonación, expresión y caracterización de una nueva familia termoestable de celobiohidrolasas
35 7]. Biotechnol Bioeng. 2008 Oct 15;101(3):515-28. PubMed PMID: 18512263; Viikari L, Alapuranen M, Puranen T, Vehmaanperä J, Siika-Aho M. Thermostable enzymes in lignocellulose hydrolysis. [Enzimas termoestables en la hidrólisis de lignocelulosas]. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;108:121-45).
Grassick y colaboradores (2004) divulgan una expresión sin plegamiento de una celobiohidrolasa I de
40 Talaromyces emersonii en Escherichia coli pero no en una levadura. (Grassick A, Murray PG, Thompson R, Collins CM, Byrnes L, Birrane G, Higgins TM, Tuohy MG. Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus [Estructura tridimensional de una celobiohidrolasa natural termoestable, CBH IB, y caracterización molecular del gen cel7 procedente del hongo filamentoso, Talaromyces emersonii]. Eur J Biochem. 2004 Nov;271(22):4495-506).
45 El documento WO 2009/138877 describe un método para una expresión heteróloga de unos polipéptidos codificados por unas variantes de tipo silvestre y optimizadas con codones de CBHI y/o cbh2 a partir de los organismos fúngicos Talaromyces emersonii (T. emersonii), Humicola grisea (H. grisea), Thermoascus aurantiacus (T. aurantiacus), y Trichoderma reesei (T. reesei). Se encontró que la expresión en tales células anfitrionas de los correspondientes
50 genes, y de las variantes y combinaciones de éstos, da como resultado una actividad específica mejorada de las celobiohidrolasas expresadas.
El documento WO 2009/139839 describe unos métodos y una composición para un vector y unas partículas de alfavirus que tienen una gran capacidad. En algunos aspectos se describen unos métodos para proporcionar unas
55 partículas de alfavirus, que comprenden una proteína cápsida modificada.
Por lo tanto, existe una necesidad de encontrar unas enzimas celulasas con unas características mejoradas para el uso en unos procesos técnicos para la hidrólisis de celulosas. En particular, existe una necesidad de unas enzimas CBH con una actividad catalítica más alta y/o con una estabilidad más alta en las condiciones de tratamiento.
60 Además de esto, existe una necesidad de unas enzimas CBH con una productividad más alta en la expresión en hongos y/o levaduras y unos sistemas de segregación.
Resumen del invento
El presente invento proporciona un polipéptido, que tiene una actividad de celobiohidrolasa. Este polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con la 5 SEQ ID NO: 2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 ha sido modificado mediante sustitución o supresión.
Además de esto, el presente invento divulga una ácido nucleico que codifica el polipéptido del presente invento, que tiene de manera preferida una identidad de por lo menos 95 % con la SEQ ID NO: 1, un vector que comprende este
10 ácido nucleico y un anfitrión transformado con tal vector.
La presente solicitud de patente divulga además un método para la producción de una proteína de celobiohidrolasa, que es codificada por un vector del presente invento, un método para la identificación de unos polipéptidos que tienen una actividad de celobiohidrolasa, y un método para la producción de tales polipéptidos, que tienen una
15 actividad de celobiohidrolasa.
El presente invento proporciona también un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con la SEQ ID NO: 2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 ha sido
20 modificado mediante sustitución o supresión, en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2 han sido modificados mediante sustitución o supresión: G4, A6, T15, Q28, W40, D64, E65, A72, S86, K92, V130, V152, Y155, K159, D181, E183, N194, D202, P224, T243, Y244, I277, K304, N310, S311, N318, D320, T335, T344, D346, Q349, A358, Y374, A375, T392, T393, D410, Y422, P442, N445, R446, T456, S460, P462, G463, H468 y/o V482 de los aminoácidos 1 hasta 500 de la SEQ ID NO: 2.
25 Más aún, la presente solicitud de patente divulga un polipéptido, que tiene una actividad de celobiohidrolasa, que es obtenible por el método de preparar un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa de acuerdo con la presente solicitud de patente, y un polipéptido, que tiene una actividad de celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 80 % con la
30 SEQ ID NO: 5, en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5 han sido modificados mediante sustitución o supresión: Q1, G4, A6, T15, Q28, W40, D64, E65, A72, S86, K92, V130, V152, Y155, K159, D181, E183, N194, D202, P224, T243, Y244, I277, K304, N310, S311, N318, D320, T335, T344, D346, Q349, A358, Y374, A375, T392, T393, D410 y/o Y422 de los aminoácidos 1 hasta 440 de la SEQ ID NO: 5.
35 La presente solicitud de patente divulga un polipéptido, que tiene una actividad de celobiohidrolasa, que comprende una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con la SEQ ID NO: 12, en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 12 han sido modificados mediante sustitución o supresión: Q1, T15, Q28, W40, C72, V133, V155, Y158, T162, Y247,
El presente invento divulga además una composición, que comprende un polipéptido del presente invento y una o más endoglucanasas y/o una o más beta-glucosidasas y/o una o más celobiohidrolasas adicionales y/o una o más xilanasas.
45 El presente invento proporciona además el uso de un polipéptido o de la composición del presente invento para la degradación enzimática de una biomasa lignocelulósica, y/o para el tratamiento de materiales textiles y/o como un ingrediente en detergentes y/o como un ingrediente en alimentos o composiciones alimentarias.
Figura 1: Mapas de restricción de pV1 para la expresión constitutiva de proteínas en Pichia pastoris: pUC19 -ori: origen de la replicación en E. coli; KanR: resistencia frente a la kanamicina/G418 con las secuencias promotoras TEF1 y EMZ para la selección en Pichia pastoris y E. coli, respectivamente; 5'GAP: región promotora de la
55 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; 3'-GAP: región terminadora; SP MFalpha: secuencia de señal del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae; MCS: sitio de clonación múltiple.
Figura 2: SDS-PAGE teñida con Commassie de unos materiales sobrenadantes concentrados 10 veces de unos cultivos en matraces de sacudimiento de Pichia pastoris CBS 7435, que contienen unos plásmidos de expresión con
60 las secuencias codificadoras de las proteínas CBHI maduras de Trichoderma viride (CBH-f; pista 2), de Humicola grisea (CBH-d; pista 3), de Talaromyces emersonii (CBH-b; pista 4), de Thermoascus aurantiacus (CBH-e; pista 5), así como la fusión de CBHI-CBD de Talaromyces emersonii (CBH-a; pista 6) y la fusión de CBD de Humicola grisea (CBH-g; pista 7) en una fusión por el terminal de N con el péptido de señal del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae bajo el control del promotor de la gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa de Pichia
pastoris.
Figura 3: Mapa del plásmido de expresión pV3 para la expresión de proteínas en Pichia pastoris. Replicones: pUC19 -ori: origen de la replicación en E. coli, ZeoR: gen de resistencia frente a la zeocina con las secuencias promotoras
5 TEF1 y EM7 para la expresión en Pichia pastoris y E. coli, respectivamente; promotor AOX I: región promotora del gen de la alcohol oxidasa I de Pichia pastoris; AOX 1 terminador de la transcripción: región terminadora: SP MFalpha: secuencia de señal del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae; MCS: sitio de clonación múltiple.
10 Figura 4: Análisis por SDS-PAGE de unas muestras de materiales sobrenadantes del cultivo tomadas a partir de la fermentación de una cepa de Pichia pastoris con una integración genómica de un casete de expresión AOXI, que expresa el péptido de fusión de CBHI de Talaromyces emersonii / -CBD de Trichoderma reesei (CBH-a) en un biorreactor con una capacidad de 7 l mediando una inducción con metanol. Las muestras P1 -P7 se toman al principio de la inducción con metanol y después de 20, 45, 119,5, 142,5, 145,5 y 167 horas, respectivamente.
15 Figura 5: Mapa del plásmido de expresión pV4 para la expresión en Trichoderma reesei.del péptido de fusión de CBHI de Talaromyces emersonii / -CBD de Trichoderma reesei (CBH-ah) Replicón: pUC19 para la replicación en E. coli. cbh1 5': región promotora 5' del gen de CBHI de Trichoderma; péptido de señal cbh1: secuencia codificadora para el péptido director de CBHI de Trichoderma reesei; CBH-a: péptido de fusión de CBHI de Talaromyces
20 emersonii / -CBD de Trichoderma reesei: región codificadora para la SEQ ID NO: 18; terminador de cbh1: región terminadora en el extremo 3' del sitio de CBHI de Trichoderma reesei; resistencia a higromicina: región codificadora de la higromicina fosfotransferasa bajo el control de un promotor de la fosfoglicerato cinasa de Trichoderma reesei; cbh1 3': secuencia de homología con la región terminadora del sitio de CBHI de Trichoderma reesei para los sucesos de cruzamiento doble.
25 Figura 6: SDS-PAGE de unos materiales sobrenadantes de cultivos de Trichoderma reesei. La pista 1 muestra el patrón de expresión de una cepa de reemplazo que lleva una fusión de CBHI de Talaromyces emersonii / -CBD de Trichoderma reesei (CBH-ah) en lugar del gen de CBHI natural. Como comparación, la pista 2 muestra el patrón para la cepa no modificada en las mismas condiciones. M: marcador del tamaño molecular.
30 Figura 7: Determinación de los valores de la IT50 a partir de los diagramas de la capacidad de conversión del substrato frente a la temperatura después de una normalización. Para la etapa de normalización, los valores de las fluorescencias máxima y mínima para la temperatura seleccionada son correlacionados con 1 o 0, respectivamente. La interpolación lineal a F'(T) = 0,5 entre los dos puntos de temperatura más próximos con unos valores
35 normalizados próximos a 0,5 proporciona la temperatura IT50 definida.
Figura 8: Diagramas de la capacidad de conversión normalizada en función de la temperatura de unas fusiones de CBHI de Talaromyces emersonii “wt”/ -CBD de Trichoderma reesei (CBH-ah: SEQ ID NO: 18 = SEQ ID NO: 2 + 6x marca His) y de unos mutantes basados en los resultados de la hidrólisis del 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido, que
40 han sido evaluados a varias temperaturas. Los valores de la fluorescencia fueron normalizados de acuerdo con la Figura 8 a lo largo del intervalo de temperaturas de 55°C a 75°C.
A...wt; B...G4C,A72C;
45 C...G4C,A72C,Q349K; D...G4C,A72C,D181N,Q349K; E...Q1L,G4C,A72C,D181N,E183K,Q349R; F...QL,G4C,A72C,S86T,D181N,E183K,D320V,Q349R; G...G4C, A72C,E183K,D202Y,N310D,Q349R;
Figure 9: Rendimientos de glucosa de la hidrólisis de una paja tratada previamente con una proteína de fusión de CBHI de Talaromyces emersonii / -CBD de Trichoderma reesei (CBH-ah), wt y mutada, después de haber llevado a cabo una hidrólisis durante 48 horas en presencia de una β-glicosidasa. Las variantes se han caracterizado para las
55 siguientes mutaciones referidas a la SEQ ID NO: 18 y fueron expresadas a partir de Pichia pastoris en unos cultivos en matraces de sacudimiento, y fueron aisladas a partir del material sobrenadante por medio de una cromatografía de afinidad usando Ni-NTA.
A: wt 60 B: G4C,A72C
C: G4C,A72C,Q349K
D: G4C,A72C, D181N,Q349K
E: Q1L,G4C,A72C,D181N,E183K,Q349R
F: Q1L,G4C,A72C,S86T,D181N,E183K,D320V,Q349R G: G4C, A72C, E183K,D202Y,N310D,Q349R
Figura 10: Alineación de la SEQ ID NO: 2 con la secuencia de CBHI de Trichoderma reesei. La matriz de alineación blosum62mt2 con una penalización por apertura de huecos (en inglés "gap opening penalty") de 10 y una 5 penalización por extensión de huecos de 0,1 fue utilizada para crear la alineación.
Descripción detallada del invento
El presente invento divulga un polipéptido, que tiene una actividad de celobiohidrolasa, que comprende una
10 secuencia de aminoácidos con una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con la SEQ ID NO: 2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 ha sido modificado mediante sustitución o supresión. El concepto de "celobiohidrolasa" o "CBH" se refiere a unas enzimas que disocian a una celulosa desde el extremo de la cadena de glucosa, y que producen una celobiosa como el producto principal. Unos nombres alternativos son los de 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasas o celulosa 1,4-beta-celobiosidasas. Las CBHs
15 hidrolizan a los enlaces 1,4-beta-d-glucosídicos de los extremos reductores o no reductores de un polímero que contiene tales enlaces. La "celobiohidrolasa I" o "CBH I" actúa a partir del extremo reductor de la fibra de celulosa. La "celobiohidrolasa II" o "CBH II" actúa a partir del extremo no reductor de la fibra de celulosa. Las celobiohidrolasas tienen típicamente una estructura que consiste en un dominio catalítico y uno o más "dominios de fijación de celulosa" o "CBD" (acrónimo del inglés "cellulose binding domains"). Tales dominios pueden estar
20 localizados o bien junto al extremo terminal de N o C del dominio catalítico. Los CBDs tienen una actividad de fijación de hidratos de carbono y median por la fijación de la celulasa a una celulosa cristalina, y es conocido el hecho de que la presencia o ausencia de los dominios de fijación tiene un impacto importante sobre la aptitud de de una enzima para ser procesada especialmente sobre unos substratos poliméricos.
25 La secuencia parental se ha establecido en la SEQ ID NO: 2. La secuencia se deriva de la fusión junto al extremo terminal de C del dominio engarzador y del dominio de fijación de celulosa de CBHI de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 4) con el dominio catalítico de CBHI de Talaromyces emersonii (SEQ ID NO: 5).
En un aspecto preferido, el invento divulga unas variantes de proteínas que muestran una alta actividad a altas
30 temperaturas durante un prolongado período de tiempo. De manera preferida, el polipéptido del presente invento mantiene un 50 % de su máxima capacidad de conversión del substrato cuando la conversión se realiza durante 60 minutos a una temperatura de 60 °C o más alta. La respectiva temperatura se designa también como el valor IT50. En otras palabras, el valor IT50 es de manera preferida de 60 °C o más alto. La "Capacidad de Conversión del Substrato" de una enzima se define en este contexto como el grado de conversión del substrato, que es catalizada
35 por una cantidad de una enzima en un determinado período de tiempo en unas condiciones definidas (la concentración del substrato, el valor del pH, la concentración del tampón y la temperatura), tal como se pueden determinar mediante un ensayo en el punto final der la reacción enzimática en tales condiciones. La "Capacidad Máxima de Conversión del Substrato" de una enzima se define en este caso como el valor máximo de la capacidad de conversión del substrato que se encuentra para la enzima en un determinado número de mediciones que se
40 efectúan tal como se ha descrito más arriba, en el que sólo se varió un parámetro, p.ej. la temperatura,, dentro de un intervalo definido. De acuerdo con el presente invento, el ensayo descrito en el Ejemplo 8 se utiliza para determinar estos parámetros.
Por lo demás, los polipéptidos divulgados tienen de manera preferida un valor IT50 en el intervalo de 62 a 70 °C, de 45 manera más preferida de 65 a 70 °C.
El polipéptido del presente invento comprende de manera preferida una secuencia de aminoácidos, que tiene identidad entre secuencias de por lo menos 90 %, de manera preferida de por lo menos 95 % y de manera más preferida de por lo menos 99 % con la SEQ ID NO: 2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la 50 SEQ ID NO: 2 se ha modificado mediante sustitución o supresión. Además, se prefiere especialmente que la secuencia de aminoácidos del polipéptido tenga la secuencia como se ha definido por la SEQ ID NO: 2, en donde el resido de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado mediante sustitución o supresión, o una secuencia tal como se ha definido por la SEQ ID NO: 2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado mediante sustitución o supresión, en donde han sido sustituidos, suprimidos o
55 insertados de 1 a 75, de manera más preferida de 1 a 35 residuos de aminoácidos.
Son preferidas particularmente unas variantes de la proteína de la SEQ ID NO: 2, en las que el residuo de aminoácidos en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 ha sido modificado mediante sustitución o supresión. Las "variantes de proteínas" son unos polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos se diferencia en una o más 60 posiciones de esta proteína parental, en donde las diferencias pueden ser un reemplazo de un aminoácido por otro, unas supresiones de uno o más aminoácidos, o una inserción de un aminoácido adicional o unos tramos de aminoácidos en la secuencia parental. Por definición, unas variantes definidas del polipéptido parental deben de ser distinguidas de otros polipéptidos mediante una comparación de la identidad entre secuencias (alineaciones) usando el algoritmo ClustalW (Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin
F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J. y Higgins D.G. (2007) ClustalW and ClustalX versión 2 [ClustalW y ClustalX versión 2]. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948). Los métodos para la generación de tales variantes de proteínas incluyen una mutagénesis aleatoria o dirigida a un sitio, una mutagénesis por saturación de un sitio, un ensamblaje de fragmentos basado en una PCR, una barajadura de los ADN, una
5 recombinación homóloga in-vitro o in-vivo, y unos métodos de síntesis de genes.
La nomenclatura de los aminoácidos, péptidos, nucleótidos y ácidos nucleicos se realiza de acuerdo con las sugerencias de la IUPAC. Generalmente, los aminoácidos son denominados dentro de este documento de acuerdo con el código de una sola letra.
10 Los intercambios de unos aminoácidos individuales son descritos nombrando el código de una sola letra del aminoácido original seguido por su posición y el código de una sola letra del aminoácido que lo ha reemplazado, es decir, el intercambio de una glutamina en la posición 1 por una leucina en esta posición se describe como "Q1L". Para las supresiones de unas posiciones individuales desde la secuencia, el símbolo del aminoácido reemplazador
15 es sustituido por la abreviación de tres letras "del", por lo tanto, la supresión de una alanina en la posición 3 sería designada como "A3del". Unos aminoácidos adicionales insertados reciben el número de la posición precedente prolongado por una letra minúscula en orden alfabético en relación con su distancia con respecto a su sitio de inserción. Por lo tanto, la inserción de dos triptófanos detrás de la posición 3 es designada como "3aW, 3bW". La introducción de unos codones no traducidos, TAA, TGA y TAG dentro de la secuencia de ácidos nucleicos se indica
20 como "*" en la secuencia de aminoácidos, por lo tanto la introducción de un codón terminador en la posición 4 de la secuencia de aminoácidos se indica como "G4*".
Unas mutaciones múltiples son separadas por un signo "más" o por una barra o por una coma. Por ejemplo, dos mutaciones en las posiciones 20 y 21 sustituyendo una alanina y un ácido glutámico por una glicina y una serina,
25 respectivamente, son indicadas como "A20G+E21S" o "A20G/E21S" "A20G,E21S".
Cuando un residuo de aminoácido en una posición determinada es sustituido por dos o más residuos de aminoácidos alternativos, estos residuos son separados por una coma o una barra. Por ejemplo, una sustitución de una alanina en la posición 30 por una glicina o un ácido glutámico es indicada como "A20G,E" o "A20G/E", o
30 "A20G,A20E".
Cuando una posición apropiada para una modificación, es identificada en el presente contexto sin que se sugiera ninguna modificación específica, se ha de entender que un residuo de aminoácido arbitrario puede sustituir al residuo de aminoácido que está presente en esa posición. Así, por ejemplo, cuando se menciona, pero no se 35 específica, una modificación de una alanina en la posición 20, se ha de entender que la alanina puede ser suprimida
o sustituida por cualquier otro residuo de aminoácido (por ejemplo, uno cualquiera de los R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y y V).
Los conceptos de "mutación similar" o "sustitución similar" se refieren a una mutación de un aminoácido que un
40 experto en la especialidad podría considerar como similar a una primera mutación. El concepto de "similar" significa dentro de este contexto que un aminoácido tiene unas características químicas similares. Si, por ejemplo, una mutación en una posición específica conduce a una sustitución de un residuo de aminoácido no alifático (p.ej. Ser) por un residuo de aminoácido alifático (p.ej. Leu), entonces una sustitución en la misma posición por un aminoácido alifático diferente (p.ej. Ile o Val) es referida como una mutación similar. Otras características más de los
45 aminoácidos incluyen el tamaño del residuo, la hidrofobicidad, la polaridad, la carga, el valor de pK, y otras características de los aminoácidos que sean conocidas en la especialidad. De acuerdo con esto, una mutación similar puede incluir una sustitución tal como la de un residuo de carácter básico por otro residuo de carácter básico, la de un residuo de carácter ácido por otro residuo de carácter ácido, la de un residuo polar por otro residuo polar etc. Los conjuntos de aminoácidos que se derivan de esta manera probablemente deben de ser conservados por
50 razones estructurales. Estos conjuntos pueden ser descritos en la forma del diagrama de Venn (Livingstone CD, y Barton GJ. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" [Alineaciones de secuencias de proteínas: una estrategia para el análisis jerárquico de conservación de residuos]. Comput.Appl Biosci. 9: 745-756; Taylor W. R. (1986) "The classification of amino acid conservation" [La clasificación de la conservación de aminoácidos] J.Theor.Biol. 119; 205-218). Unas sustituciones similares se pueden realizar,
55 por ejemplo, de acuerdo con la siguiente agrupación de aminoácidos: hidrófobos: F W Y H K M I L V A G; aromáticos: F W Y H; alifáticos: I L V; polares: W Y H K R E D C S T N; cargados eléctricamente H K R E D; cargados positivamente: H K R; cargados negativamente: E D.
Como una convención para la numeración de aminoácidos y la designación de las variantes de proteínas para la
60 descripción de las variantes de proteínas, la primera glutamina (Q) de la secuencia de aminoácidos QQAGTA en la secuencia de la proteína parental establecida en la SEQ ID NO: 2 se indica como la posición número 1 o Q1 o glutamina 1. La numeración de todos los aminoácidos estará de acuerdo con su posición en la secuencia parental establecida en la SEQ ID NO: 2 en relación con esta posición número 1.
El presente invento divulga además unas variantes de los polipéptidos del presente invento con unos cambios en su secuencia en una o más de las posiciones: G4, A6, T15, Q28, W40, D64, E65, A72, S86, K92, V130, V152, Y155, K159, D181, E183, N194, D202, P224, T243, Y244, I277, K304, N310, S311, N318, D320, T335, T344, D346, Q349, A358, Y374, A375, T392, T393, D410, Y422, P442, N445, R446, T456, S460, P462, G463, H468 y/o V482 de los
5 aminoácidos 1 hasta 500 de la SEQ ID NO: 2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado mediante sustitución o supresión.
En una forma de realización preferida, la variante de los polipéptidos del presente invento comprende uno o más cambios específicos de su secuencia en las siguientes posiciones (intercambio preferido) o una mutación similar.
10 De manera todavía más preferida, la variante de los polipéptidos del presente invento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias con unas mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 2, en la que el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado mediante una sustitución o supresión, y opcionalmente se ha fusionado con una marcación 6x-His en el extremo terminal de C, que se enumeran en la siguiente Tabla.
- Posición
- Intercambio preferido Mutación similar
- Q1
- L I, L, V, A, G,
- G4
- C C, D, E, R, H, K
- A6
- G, V I, L, V, G
- T15S
- S Q, N
- Q28
- R H, K, R
- W40
- R H, K, R
- D64
- N Q, N, S, T, E
- E65
- K, V H, K, R
- A72
- C, V M, I, L, V, G, C
- S86
- T H, K, R, E, D, C, T, N
- K92
- R H, R
- V130
- I F, W, Y, H, K, M, I, L, A, G
- V152
- A, E D, E, A, I, L, G, P
- Y155
- C C, D, E, R, H
- K159
- E D, E
- D181
- N Y, H, K, R, C, S, T, N
- E183
- V, K I, L, V, A, G, R, K, H
- N194
- C, R, Y, D, K, I, L, G, Q, S, V F, W, C, R, Y, D, K, I, L, G, Q, S, V, H
- D202
- Y, N, G A, R, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V
- P224
- L I, L, V, A, G
- T243
- I, C, R, Y, A, F, Q, P,D, V, W, L, M H, K, I, C, R, Y, A, F, Q, P, D, V, W, L, M
- Y244
- F, H F, W, H,
- I277
- V G, A
- K304
- R H, R
- N310
- D C, D, E, R, H
- S311
- G, N I, L, V, A, G, Q, T, D,
- N318
- Y F, W, Y, H
- D320
- V, E, N W, Y, H, K, R, E, C, S, T, N
- T335
- I F, W, Y, H, K, M, I, L, V, A, G
- T344
- M F, W, Y, H, K, M, I, L, V, A, G
- D346
- G, A, E I, L, V, A, G
- Q349
- R, K H, K, R
- A358
- E F, W, Y, H, K, M, I, L, V, G
- Y374
- C, P, R, H, S, A C, P, R, H, S, A, K, E, D, C, F
- A375
- C, D, N, Y, R, G, L, V, E, G, T, M H, K, C, D, N, Y, R, Q, L, V, E, G, T, M
- Posición
- Intercambio preferido Mutación similar
- T392
- C, D, K H, K, R, E, D, C
- T393
- A I, L, V, A, G,
- D410
- G F, W, Y, H, K, M, I, L, V, A, G
- Y422
- F H, F, W
- P442
- S, del S, del, T
- N445
- D D, E, Q
- R446
- S, G A, S, G, V, I, L, C, P
- T456
- A S, A, G, I, L, V, C, P
- S460
- L, P G, A, I, L, P, V
- P462
- L, del G, A, I, L, V, del
- G463
- D D, E
- H468
- L, Q, R K, R, E, D, C, S, T, N
- V482
- A, I G, L, A, I
- imagen10
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 75
- Q1L,G4C,A72C,Q349K
- 88
- Q1L,G4C,A72C,S86T,Q349R
- 89
- Q1L,G4C,A72C,D181N,Q349R
- 90
- Q1L,G4C,A72C,E183K,Q349R
- 91
- Q1L,G4C,A72C,D181N,E183K,Q349R
- 92
- Q1L,G4C,A72C,D320V,Q349R
- 93
- Q1L,G4C,A72C,S86T,D181N,E183K,D320V,Q349R
- 98
- Q1L,G4C,A72C,Q349R
- 148
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,T392M
- 153
- Q1L,G4C,A68T,A72C,Q349K,G439D,R453S
- 154
- Q1L,G4C,A72C,D202N,Q349K
- 155
- Q1L,G4C,A68T,A72C,Q349K
- 156
- Q1L,G4C,A72C,K154R,Q349K,T3931
- 157
- Q1L,G4C,A72C,S193P,Q349K,V482I
- 158
- Q1L,G4C,A72C,H203R,Q349K,P442S
- 159
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,H468R
- 160
- Q1L,G4C,A72C,D202N,Q349K,G486D
- 161
- Q1L,G4C,E65K,A72C,Q349K
- 162
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,Y422F
- 163
- Q1L,G4C,Q28R,A72C,Q349K,H468L
- 164
- Q1L,G4C,A72C,D181N,D247N,Q349K
- 165
- Q1L,G4C,A72C,D181N,Q349K,T451S
- 166
- Q1L,G4C,Q28R,A72C,Q349K
- imagen12
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 167
- Q1L,G4C,A72C,A145T,H203R,Q349K,T403K
- 168
- Q1L,G4C,A72C,I200F,Q349K,L500I
- 169
- Q1L,G4G,D64N,A72C,Q349K
- 170
- Q1L,G4C,A72C,V152A,Q349K
- 171
- Q1L,G4C,T15S,A72C,Y244F,Q349K
- 172
- Q1L,G4C,A6V,A72C,Q349K
- 173
- Q1L,G4C,A72C,S311N,Q349K,G463D
- 174
- Q1L,G4C,A72C,Y155C,0349K
- 175
- Q1L,G4C,A72C,S311N,Q349K
- 176
- Q1L,G4C,A72C,D346V,Q349K
- 177
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,T392K
- 178
- Q1L,G4C,A72C,S311G,Q349K
- 179
- Q1L,G4C,A72C,S311G,Q349K,H468R
- imagen13
-
imagen14
En otro aspecto, el presente invento divulga un ácido nucleico, que codifica el polipéptido del presente invento. El ácido nucleico es una secuencia de polinucleótidos (un ADN o ARN), que, cuando ha sido puesta bajo el control de un promotor apropiado y transferida a un adecuado anfitrión biológico o a un adecuado entorno químico, es 5 procesada para formar el polipéptido codificado, en donde el proceso incluye también todas las etapas posteriores a la traducción y posteriores a la transcripción, que son necesarias. La secuencia codificadora puede ser adaptada fácilmente mediante una variación de unos tripletes de bases degenerados, una alteración de las secuencias de señal, o por la introducción de unos intrones, sin afectar a las propiedades moleculares de la proteína codificada. El ácido nucleico del presente invento tiene de manera preferida una identidad de por lo menos 95 %, de manera más
10 preferida de por lo menos 97 % y de la manera más preferida de 100 % con la SEQ ID NO: 1. El presente invento proporciona también un vector que comprende este ácido nucleico y un anfitrión transformado con tal vector.
La presente solicitud de patente divulga también unos métodos para la producción de los polipéptidos del presente invento y unas variantes de éstos en varias células anfitrionas, que incluyen unas levaduras y unos anfitriones
15 fúngicos. Ella divulga también el uso de las cepas resultantes para el mejoramiento de ciertas propiedades de proteínas mediante una variación de la secuencia. Además de ello, la presente solicitud de patente divulga unos métodos para la aplicación de tales polipéptidos en la hidrólisis de una celulosa.
Un aspecto adicional de la solicitud de patente divulga unos vectores y unos métodos para la producción de unas
20 variantes proteínicas de la SEQ ID NO: 2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado mediante sustitución o supresión, expresándolo en una levadura y ensayando su actividad sobre un material celulósico mediando medición de las moléculas de azúcares mono-y/u oligoméricas segregadas.
La presente solicitud de patente divulga además un método para la producción de una proteína de celobiohidrolasa, 25 que comprende las etapas de:
a. obtener una célula anfitriona, que ha sido transformada con un vector que comprende el ácido nucleico del presente invento
b. cultivar la célula anfitriona en unas condiciones en las que se expresa la proteína de celobiohidrolasa; y 30 c. recuperar la proteína de celobiohidrolasa.
En una forma de realización preferida, la célula anfitriona se deriva del conjunto que se compone de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Candida y Yarrowina. De manera preferida, la célula anfitriona es capaz de producir etanol, en donde las levaduras
35 más preferidas incluyen a Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, o a una levadura metilotrófica, que se deriva de manera preferida del conjunto de células anfitrionas que comprende Pichia methanolica, Pichia pastoris, Pichia angusta y Hansenula polymorpha.
Sorprendentemente, se ha encontrado que el polipéptido de acuerdo con el presente invento y unas variantes de
40 éste se puede(n) expresar a partir de una levadura a altos niveles. El concepto de "levadura" deberá de referirse en el presente caso a todos los organismos eucarióticos inferiores que muestran un estado vegetativo unicelular en su ciclo vital. Esto incluye especialmente a unos organismos de la clase Saccharomycetes, en particular de los géneros
Saccharomyces, Pachysolen, Pichia, Candida, Yarrowina, Debaromyces, Klyveromyces, Zygosaccharomyces.
Por lo tanto, un aspecto de la solicitud de patente divulga la expresión del polipéptido reivindicado y de unas variantes de éste en una levadura. La expresión eficiente de esta proteína de fusión (SEQ ID NO: 2) y de unas
5 variantes de proteínas derivadas de la SEQ ID NO: 2 a partir de una levadura se puede conseguir por inserción de la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 empezando por la posición de nucleótido 1 dentro de un vector de expresión que está bajo el control de por lo menos una apropiada secuencia promotora y por fusión de la molécula de nucleótido con un apropiado péptido de señal, por ejemplo con el péptido de señal del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae.
10 En una forma de realización preferida, el polipéptido del presente invento y unas variantes de éste se expresan y segregan a un nivel de más que 100 mg/l, de manera más preferida de más que 200 mg/l, de manera particularmente preferida de más que 500 mg/l o de una manera sumamente preferida de más que 1 g/l dentro del material sobrenadante, después de la introducción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una
15 secuencia de aminoácidos con una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con respecto a la SEQ ID NO: 2, dentro de una levadura. Para determinar el nivel de expresión en levaduras, la cultivación y el aislamiento del material sobrenadante se pueden llevar a cabo tal como se describe en el Ejemplo 3.
Otro aspecto adicional de la solicitud de patente divulga unos métodos para la producción de un polipéptido de
20 acuerdo con el presente invento en un hongo filamentoso, de manera preferida en un hongo del género Aspergillus o Trichoderma, de manera más preferida en un hongo del género Trichoderma, de manera sumamente preferida en Trichoderma reesei. El concepto de "hongos filamentosos" o de "hongos" deberá de referirse en el presente caso a todos los organismos eucarióticos inferiores que muestran un crecimiento con hifas durante de por lo menos estado en su ciclo vital. Esto incluye especialmente a unos organismos de los filos Ascomycota y Basidiomycota, en
25 particular del género Trichoderma, Talaromyces, Aspergillus, Penicillium, Chrysosporium, Phanerochaete, Thermoascus, Agaricus, Pleutrus o Irpex. El polipéptido es expresado por fusión de la región codificadora de una secuencia de señal compatible con la molécula de ácido nucleico empezando por la posición de nucleótido 52 de la SEQ ID NO: 3, tal como se hizo en la SEQ ID NO: 3 con la secuencia de señal de CBHI de Trichoderma reesei, y mediante la puesta del péptido de fusión bajo el control de un promotor que sea lo suficientemente fuerte, seguida
30 por una transferencia de la construcción genética a la célula anfitriona. Unos ejemplos de tales promotores y secuencias de señal, así como unas técnicas para realizar una transferencia eficiente se han descrito en la especialidad.
En otro aspecto, la presente solicitud de patente divulga además un método para la identificación de unos 35 polipéptidos que tienen una actividad de celobiohidrolasa, que comprende las etapas de:
a. Generar una biblioteca de genes mutantes que codifican unas proteínas mutantes mediando mutagénesis de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o de un ácido nucleico que tiene la secuencia definida por la SEQ ID NO: 6 (que codifica la SEQ ID NO: 5), que tiene de manera preferida la
40 secuencia definida por la SEQ ID NO: 1;
- b.
- Insertar cada gen mutante dentro de un vector de expresión;
- c.
- Transformar unas células de levadura con cada vector de expresión para crear una biblioteca de transformantes de levadura;
d. Cultivar cada transformante de levadura en unas condiciones en las que la proteína mutante es 45 expresada y segregada;
- e.
- Incubar la proteína mutante expresada con un substrato;
- f.
- Determinar la actividad catalítica de la proteína mutante;
- g.
- Seleccionar una proteína mutante de acuerdo con la actividad catalítica determinada.
50 Especialmente, la etapa d. se puede realizar mediando utilización de un formato de placa y de pocillos. Este formato permite de manera preferida la realización con alto rendimiento de desarrollo del método para identificar unos polipéptidos que tienen una actividad de celobiohidrolasa.
De manera preferida, las etapas e. hasta g. del método para identificar unos polipéptidos que tienen una actividad de 55 celobiohidrolasa se realizan de la siguiente manera:
- e.
- Incubar la proteína mutante expresada con un material celulósico;
- f.
- Determinar la cantidad del azúcar liberado;
- g.
- Seleccionar una proteína mutante de acuerdo con la cantidad del azúcar liberado.
60 En otra forma de realización, el método para identificar unos polipéptidos que tienen una actividad de celobiohidrolasa comprende las etapas adicionales de:
- h.
- Secuenciar el gen o la proteína mutante que se ha seleccionado;
- i.
- Identificar la(s) modificación(modificaciones) de aminoácidos por comparación de la secuencia de la proteína mutante seleccionada con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
La presente solicitud de patente divulga además un método para la preparación de un polipéptido que tiene una 5 actividad de celobiohidrolasa, que comprende las etapas de:
a. Proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 70 % con el dominio catalítico de la SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 5);
10 b. Identificar los aminoácidos de este polipéptido que corresponden a los aminoácidos que se han modificado con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, tal como se ha identificado en la etapa i. del método para identificar unos polipéptidos que tienen una actividad de celobiohidrolasa; y
c. Preparar un polipéptido mutante del polipéptido que se ha proporcionado en la etapa a. llevando a cabo
la(s) modificación(modificaciones) de aminoácidos que se han identificado en la etapa b. por medio de una 15 mutagénesis dirigida a un sitio.
De manera preferida, el polipéptido proporcionado en la etapa a. del método para preparar un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa es una celobiohidrolasa de tipo silvestre que se deriva de Trichoderma reesei.
20 La presente solicitud de patente divulga además unos polipéptidos que tienen una actividad de celobiohidrolasa, que son obtenibles con ayuda del método para preparar un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa de acuerdo con la presente solicitud de patente.
Además, el presente invento proporciona una composición que comprende un polipéptido y/o unas variantes de éste
25 del presente invento y una o más celulasas, p.ej. una o más endoglucanasas y/o una o más beta-glucosidasas y/o una o más celobiohidrolasas adicionales y/o una o más xilanasas. Los conceptos de "celulasas" o "enzimas celulolíticas" se definen como unas enzimas, que son capaces de hidrolizar a unos substratos celulósicos o unos derivados de éstos o unas materias primas de alimentación mezcladas que comprenden unos polímeros celulósicos. A tales enzimas se hace referencia como que tienen una "actividad celulolítica", siendo ellas por lo tanto capaces de
30 hidrolizar a unas moléculas de celulosa a partir de tal material para dar unos oligo-o monosacáridos más pequeños. Las enzimas celulolíticas incluyen unas celulasas y unas hemicelulasas, en particular ellas incluyen unas celobiohidrolasas (CBHs), unas endoglucanasas (EGs) y unas beta-glucosidasas (BGLs).
La presente solicitud de patente divulga además un polipéptido, que tiene una actividad de celobiohidrolasa, en
35 donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 80 %, de manera preferida de por lo menos 95 %, de manera más preferida de por lo menos 98 %, de manera todavía más preferida de por lo menos 99 %, y de la manera más preferida de 100 % con la SEQ ID NO: 5, en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5 son modificados por sustitución o supresión de: Q1, G4, A6, T15, Q28, W40, D64, E65, A72, S86, K92, V130, V152,
En una forma de realización preferida, el polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa con una secuencia de aminoácidos, que tiene que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 80 % con la SEQ ID NO: 5
45 comprende uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos modificados de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5: Q1L, G4, A6G/V, T15S, Q28Q/R, W40R, D64N, E65K/V, A72V, S86T, K92K/R, V130I/V, V152A/E, Y155C, K159E, D181N, E183V/K, N194C/R/Y/D/K/I/UG/Q/S/V, D202Y/N/G, P224L, T243I/R/Y/A/F/Q/P/D/V/W/L/M, Y244F/H, I277V, K304R, N310D, S311G/N, N318Y, D320V/E/N, T335I, T344M, D346G/A/E/V, Q349R/K, A358E, Y374C/P/R/H/S/A, A375D/N/Y/R/Q/L/V/E/G/T/M, T392C/D/K, T393A, D410G, Y422F.
50 De manera más preferida, el polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5 tal como se indica en la siguiente tabla:
- imagen17
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 1
- G4C,Y163C
- 2
- E183V
- 3
- W40R
- 4
- S311N
- 5
- T335I
- 6
- T48A
- imagen19
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 7
- W40R,M234K
- 8
- E65K
- 9
- T344M
- 10
- A72V
- 11
- I277V
- 12
- D346G
- 13
- S418P
- 14
- G4C,W40R,A72C
- 15
- W40R,T344M
- 16
- W46R,Q349K
- 17
- W40R,T344M,Q349K
- 18
- G4C,A72C,T344M
- 19
- G4C,A72C,Q349K
- 20
- G4C,A72C,T344M,Q349K
- 21
- G4C,W40R,A72C,T344M
- 22
- G4C,W40R,A72C,Q349K
- 23
- G4C,W40R,A72C,T344M,Q349K
- 24
- N54S,N194Y
- 25
- V130I,H350Y
- 26
- K92R
- 27
- T325I
- 28
- Y60H
- 29
- T229A
- 30
- D320E
- 31
- E65V,Q349R
- 32
- T392M
- 33
- G4C,A72C,D346G
- 34
- G4C,A72C,Q349R
- 35
- G4C,A72C,D346G,Q349R
- 36
- G4C,A72C,T344M,D346G,Q349R
- 37
- G4C,A6G,A72C,Q349K
- 38
- G4C,A72C,Q349K,A376T
- 39
- G4C,A72C,Q349K,E65V,Q349R
- 40
- G4C,A72C,Q349K,S24N
- 41
- G4C,P12Q,A72C,Q349K,Q362H
- 42
- N194C,Y374C
- 43
- T243C,A375C,N194C,Y374C
- 44
- G4C,A72C,Q349K,D320V
- 45
- G4C,A72C,Q349K,S86T
- 46
- G4C,A72C,D181N,Q349K
- 47
- G4C,A72C,E183V,K304R,Q349K
- 48
- Q1L,G4C,A72C,Q349K
- imagen21
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 49
- G4C,A72C,S86T,M234V,Q349K
- 50
- G4C,A72C,E183K,Q349K
- 51
- G4C,A72C,S311G,Q349K
- 52
- G4C,D64N,A72C,Q349K
- 53
- G4C,A72C,D181 N,P224L,Q349K
- 54
- G4C,A72C,E183K,N318Y,Q349K
- 55
- G4C,A72C,E183V,Q349K
- 56
- G4C,A72C,N194C,Y374C
- 57
- G4C,A72C,N194C,Q349R,Y374C
- 58
- N194R,Y374D
- 59
- T243R,A375D
- 60
- N194R,T243R,Y374D,A375D
- 61
- Q1L,G4C,A72C,S86T,Q349R
- 62
- Q1L,G4C,A72C,D181N,Q349R
- 63
- Q1L,G4C,A72C,E183K,Q349R
- 64
- Q1L,G4C,A72C,D181N,E183K,Q349R
- 65
- Q1L,G4C,A72C,D320V,Q349R
- 66
- Q1L,G4C,A72C,S86T,D181N,E183K,D320V,Q349R
- 67
- G4C,A72C,Q349R,V367A
- 68
- G4C,A72C,E183K,D202Y,N310D,Q349R
- 69
- Q1L,G4C,A72C,Q349R
- 70
- G4C,A72C,G251R,Q349R
- 71
- G4C,A72C,P224L,F306Y,Q349R
- 72
- G4C,V32G,N49S,A72C,S193L,Q349R
- 73
- G4C,A72C,D181N,Q349R
- 74
- G4C,A72C,D202N,Q349R
- 75
- A72V,T335I,D346A,T393A,P436S
- 76
- A72V,T3351,D346A,T393A
- 77
- W40R,D346A,T393A
- 78
- A72V,D346A,T393A
- 79
- G4C,E65V,A72C,Q349R
- 80
- G4C,A72C,D202G,D320N,Q349R,A358E
- 81
- G4C,A72C,D320V,Q349R
- 82
- G4C,E65V,A72C,Y244H,Q349R
- 83
- G4C,A72C,E183K,Q349R
- 84
- G4C,A72C,E183K,D346E,Q349R
- 85
- G4C,A72C,S311G,Q349R
- 86
- G4C,A72C,P224L,Q349R
- 87
- G4C,A72C,S236Y,Q349R
- 88
- A72V,D320V,D346A
- 89
- A72V,D346A
- 90
- W40R,T3351,D346A,T393A
E10153355 07-10-2015
- imagen22
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 91
- G4C,A72C,D320V,Q349K
- 92
- G4C,A72C,S311G,D320V,Q349K
- 93
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,T392M
- 94
- D320V,Q349K
- 95
- G4C,E172C,D202V,D320V,Q349K
- 96
- G4C,A72C,D320V,D346V,Q349K
- 97
- Q1L,G4C,A72C,D202N,Q349K
- 98
- Q1L,G4C,A68T,A72C,Q349K
- 99
- Q1L,G4C,A72C,K154R,Q349K,T393I
- 100
- Q1L,G4C,E65K,A72C,Q349K
- 101
- Q1L,G4C,A72C,D181N,D247N,Q349K
- 102
- Q1L,G4C,Q28R,A72C,Q349K
- 103
- Q1L,G4C,A72C,A145T,H203R,Q349K,T403K
- 104
- Q1L,G4C,D64N,A72C,Q349K
- 105
- Q1L,G4C,A72C,V152A,Q349K
- 106
- Q1L,G4C,T15S,A72C,Y244F,Q349K
- 107
- Q1L,G4C,A6V,A72C,Q349K
- 108
- Q1L,G4C,A72C,Y155C,Q349K
- 109
- C11L,G4C,A72C,S311N,Q349K
- 110
- Q1L,G4C,A72C,D346V,Q349K
- 111
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,T392K
- 112
- Q1L,G4C,A72C,S311G,Q349K
- 113
- G4C,A72C,N194K,T243Y,Q349R,A375N
- 114
- G4C,A72C,N194D,T243A,Q349R,Y374P,A375Y
- 115
- G4C,A72C,N1941,T243Y,Q349R,Y374P,A375R
- 116
- G4C,A72C,N194K,Q349R,Y374P,A375Q
- 117
- G4C,A72C,N194L,T243Y,Q349R,Y374R,A375L
- 118
- G4C,A72C,N194G,T243F,Q349R,Y374P,A375R
- 119
- G4C,A72C,N194L,T243Q,Q349R,Y374P,A375V
- 120
- G4C,A72C,N194K,T243P,Q349R,Y374H,A375E
- 121
- G4C,A72C,N1941,T243D,Q349R,Y374P,A375Y
- 122
- G4C,A72C,N194Q,T243V,Q349R,Y374P,A375Y
- 123
- G4C,A72C,N194S,T243W,Q349R,Y374S,A375G
- 124
- G4C,A72C,N194Y,T243L,Q349R,Y374S,A375R
- 125
- G4C,A72C,N194V,T243M,Q349R,Y374A,A375T
- 126
- G4C,A72C,T243G,Q349R,Y374P,A375M
- 127
- G4C,A72C,T243Q,Q349R,Y374P,A375M
- 128
- G4C,A72C,N194Y,T243V,Q349R,Y374P
Además, la presente solicitud de patente divulga un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 %, de manera preferida de por lo menos 95 %, de manera más preferida de por lo menos 98 %, de manera aún más preferida de por lo menos 99 %, y de la manera más preferida de 100 % con la SEQ ID NO:12, en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO:12 son modificados mediante
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sustitución o supresión: Q1, T15, Q28, W40, C72, V133, V155, Y158, T162, Y247, N307, G308, E317, S341, D345, Y370, T389, Q406, N441, R442, T452, S456, P458, G459, H464 y/o V478.
En una forma de realización preferida, el polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con la SEQ ID NO: 12 comprende uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos modificados de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 12:
- imagen23
- Intercambio con respecto a la SEQ ID NO: 12
- 1
- Q1L
- 2
- T15S
- 3
- Q28R
- 4
- W40R
- 5
- C72V
- 6
- V133I
- 7
- V155A,E
- 8
- Y158C
- 9
- T162E
- 10
- Y247F,H
- 11
- N307D
- 12
- G308N
- 13
- E317V,N
- 14
- S341M
- 15
- D345R,K
- 16
- Y370P,R,H,S,A
- 17
- T389A
- 18
- Q406G
- 19
- N441D
- 20
- R442S,G
- 21
- T452A
- 22
- S456L,P
- 23
- P458L,del
- 24
- G459D
- 25
- H464L,Q,R
- 26
- V478A,I
Otro aspecto de la divulgación se refiere a la utilización de los polipéptidos aislados y de las variantes de éstos del
10 presente invento para la hidrólisis completa o parcial de un material celulósico. El material celulósico puede ser de naturaleza natural, procesada o artificial. El concepto de "un material celulósico" debe de ser definido en este contexto como todos los tipos de materiales puros, no puros, mezclados, entremezclados o compuestos de otra manera, que contienen por lo menos una fracción de unos polímeros con D-glucosilo unidos por un enlace β-1-4 de por lo menos 7 subunidades consecutivas. Unos ejemplos sobresalientes de unos materiales celulósicos son todos
15 los tipos de materiales vegetales que contienen celulosa, tales como madera (blanda y dura), paja, granos, hierba de elefante, heno, hojas, algodón y unos materiales procesados a partir de éstos, o unas corrientes de desechos derivadas de tales procesos. A un material celulósico que se usa en una reacción enzimática se hace referencia en este contexto también como un substrato celulósico.
20 La hidrólisis del material celulósico puede ser un proceso secuencial, que sigue a la producción de una celobiohidrolasa o contemporáneo con la producción en la célula de levadura (proceso biológico consolidado). La expresión de unas enzimas celulolíticas en levaduras para fermentar los azúcares (de C6 o C5) liberados para dar etanol u otros metabolitos que interesen.
Otro aspecto de la solicitud de patente se refiere por lo tanto a la aplicación de unas células enteras, que expresan el polipéptido o una variante de éste, de acuerdo con el presente invento para el tratamiento de materiales celulósicos.
En un aspecto particular, la presente solicitud divulga el uso de un polipéptido y de unas variantes de éste o la
5 composición del presente invento para la degradación enzimática de un material celulósico, de manera preferida de una biomasa lignocelulósica, y/o para el tratamiento de materiales textiles y/o como un ingrediente en detergentes y/o como un ingrediente en alimentos o composiciones alimentarias.
10 Ejemplo 1: Producción de un plásmido de expresión en Pichia pastoris
Unos plásmidos de expresión para la expresión constitutiva de una proteína a partir de unos anfitriones transformados de Pichia pastoris son producidos por ensamblaje de un casete de expresión, que se compone de un promotor de la gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAP) de Pichia pastoris, un SPα (péptido de señal del factor 15 de apareamiento alfa) de Saccharomyces cerevisiae, un sitio de clonación múltiple (MCS) y la secuencia de terminador 3'-GAP. Para finalidades de selección, se usa un gen de resistencia frente a la kanamicina puesto bajo el control del promotor EM7 o TEF para finalidades de selección en bacterias o levaduras, respectivamente. Los vectores plasmídicos resultantes son designados como pV1 (Figura 1) y pV2 (MCS alternativo). La transformación y la cultivación con expresión son realizadas esencialmente tal como lo describieron Waterham, H. R., Digan, M. E.,
20 Koutz, P. J., Lair, S. V., Cregg, J. M. (1997). Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter [Aislamiento del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Pichia Pastoris y regulación y uso de su promotor]. Gene, 186, 37-44, y Cregg, J.M.: Pichia Protocols in Methods in Molecular Biology, Second Edition, Humana Press, Totowa New Jersey 2007.
25 Ejemplo comparativo 1: Construcción de unas construcciones artificiales de expresión en Pichia pastoris para unas secuencias de CBHI
Los genes de CBHI de Trichoderma viride (CBH-f), Humicola grisea (CBH-d), Thermoascus aurantiacus (CBH-e), Talaromyces emersonii (CBH-b), y unas fusiones del dominio de fijación de celulosa de CBHI de Trichoderma reesei
30 con la CBHI de Talaromyces emersonii (CBH-a) o la CBHI de Humicola grisea (CBH-g) se amplifican usando unos pares de oligonucleótidos y unos moldes (obtenidos por síntesis de genes) tal como se indica en la tabla. El gen de fusión que codifica la SEQ ID NO: 2 se genera mediante una PCR por extensión del solapamiento mediando utilización de los fragmentos de PCR que se han generado a partir de las SEQ ID NOs: 5 y 11. Para la PCR de amplificación PCR se utiliza la Phusion ADN polymerase (de Finnzymes).
35 Tabla 1: Cebadores y moldes para la amplificación de CBH-a, CBH-b, CBH-d, CBH-e, CBH-f y CBH-g.
- imagen25
- Fragmento Cebador hacia adelante Cebador inverso Molde
- CBH-f
-
CBHI de Trichoderma viride
imagen26 imagen27 SEQID NO. 13
- CBH-d
-
CBHI de Humícola grisea
imagen28 imagen29 SEQID NO. 7
- CBH-e
-
CBHI de Thermoascus aurantiacus
imagen30 imagen31 SEQID NO. 9
- imagen33
- Fragmento Cebador hacia adelante Cebador inverso Molde
- CBH-b
-
CBHI de Talaromyces emersonii
imagen34 imagen35 SEQID NO. 5
- CBH-a parte 1
-
Fragmento de fusión del dominio de fijación de CBHI de Talaromyces emersonii, parte1
imagen36 imagen37 SEQID NO. 5
- CBH-a parte 2
-
Fragmento de fusión del dominio de fijación de CBHI de CBHI de Trichoderma reesei parte 2
imagen38 imagen39 SEQID NO.11
- CBH-a
-
Proteína de fusión de CBHI de Talaromyces emersonii
imagen40 imagen41 5a+5b SEQID NO. 2
- CBH-g part1
-
Fragmento de fusión de CBHI de Humicola grisea, parte 1
imagen42 imagen43 SEQID NO. 19
- CBH-g part2
-
Fragmento de fusión del dominio de fijación de CBHI de Trichoderma reesei, parte 2
imagen44 imagen45 SEQID NO. 11
- CBH-g
-
Proteína de fusión de Humicula grisea
imagen46 imagen47 6a+6b SEQID NO. 15
Unos fragmentos de PCR que tienen la longitud esperada son purificados a partir de unos geles de agarosa después de una electroforesis usando el estuche Promega® SV PCR and Gel Purification kit. Las concentraciones de los 5 fragmentos de ADN son medidas en un espectrofotómetro, y 0,2 pmoles de los fragmentos son tratados con 9 U de la ADN polimerasa de T4 en presencia de 2,5 mM de dATP durante 37,5 min a 22,5 °C, y los fragmentos tratados son reanillados con ADN plasmídico pV1 linealizados con la SmaI y tratados con una ADN polimerasa de T4 / dTTP, y después de esto transformados en el seno de unas células químicamente competentes de Escherichia coli Top10. Apartándose del procedimiento descrito, el producto generado por el par de cebadores de acuerdo con la tabla, pista
10 11, que codifican los fragmentos de la proteína de fusión de Humicula grisea, son clonados por intermedio de los sitios de SphI y SalI que han sido introducidos, para dar el pV2. Los transformantes son controlados mediante secuenciación del ADN plasmídico aislado.
Ejemplo comparativo 2: Expresión de los genes de CBHI en Pichia pastoris
15 Los plásmidos del Ejemplo 2 son transformados en unas células electro-competentes de Pichia pastoris CBS 7435, y los transformantes son utilizados para inocular a unos cultivos en un medio YPD que contiene 200 mg/l, los cuales son incubados durante 5 días a 27°C en un agitador rotatorio a 250 rpm (revoluciones por minuto. Los materiales
sobrenadantes del cultivo fueron separados por centrifugación a 5.000xg durante 30 minutos en una centrífuga Sorvall Avant. Los materiales sobrenadantes fueron concentrados en unas columnas giratorias con un tamaño de exclusión de 10 kDa. El patrón de proteínas de tales materiales sobrenadantes concentrados fue analizado mediante una SDS-PAGE (véase la cita de Laemmli y colaboradores) y unos geles se tiñeron con un colorante Commassie 5 blue coloidal. La actividad enzimática fue determinada por incubación del material sobrenadante con unas soluciones 2 mM de p-nitrofenil-β-D-lactósido o con unas soluciones 200 µM de 4-metil-umbeliferil-β-D-lactósido en un tampón de acetato de sodio 50 mM (de pH 5) durante 1 hora. La reacción se interrumpió por adición de unos volúmenes iguales de una solución de carbonato de sodio 1 M y por determinación del p-nitrofenol liberado o de la 4metil-umbeliferona liberada por medición de la absorbancia a 405 nm o de la fluorescencia a 360 nm/450 nm de
10 excitación/emisión.
Ejemplo comparativo 3: Integración en el genoma y expresión de la secuencia de fusión de CBHI Talaromyces emersonii y de CBHII-CBD de T. reesei en Pichia pastoris
15 El fragmento de ADN del gen de fusión es generado mediante una PCR por extensión de solapamiento de dos etapas utilizando unos pares de oligonucleótidos y unos moldes sintéticos tal como se ha indicado en la tabla (del Ejemplo 2). Un fragmento de longitud plena tratado con la ADN polimerasa de T4 fue reanillado con el fragmento lineal del vector pV3 reduciendo lentamente la temperatura desde 75°C hasta 4°C. El plásmido pV3 contiene una fusión del péptido de señal del factor de apareamiento alfa con un sitio de clonación múltiple, situado corriente abajo
20 del promotor AOXI de Pichia pastoris. La transformación de la solución reanillada en unas células de E. coli químicamente competentes proporciona unos transformantes, que son seleccionados por medio de su resistencia frente a la teocina, comprobados en cuanto a si contienen el plásmido de construcción esperado mediante un análisis por restricción y un secuenciamiento. Unos preparados del plásmido pV3-CBH-a son linealizados con SacI y aproximadamente 1 µg de unos fragmentos de ADN lineal son transformados en unas células electrocompetentes de
25 Pichia pastoris. 94 transformantes procedentes de unas placas de YPD-zeocina son comprobados posteriormente en cuanto a la expresión por cultivación en unos cultivos en placas de 96 pocillos profundos con una capacidad de 500 µl en un medio BMMY que contiene 1 % de metanol y se alimentó 0,5 % de metanol cada 24 h durante 5 días (a 350 rpm/27°C; en un agitador orbital humidificado con una amplitud de 2,5 cm. Los materiales sobrenadantes son ensayados en cuanto a la actividad en 4-MUL, y los clones con los niveles más altos de expresión son
30 seleccionados y evaluados de nuevo en las mismas condiciones.
Para la fermentación en un biorreactor Infors Multifors se selecciona la cepa que produce la concentración más alta de la enzima. Un precultivo en YPD-zeocina (100 g/l) se escoge para realizar la inoculación de un medio Mineral, que se compone de un tampón de fosfato, sulfato y cloruro de magnesio, ciertos elementos traza/biotina y glicerol, 35 con una calibración del valor del pH mediando uso de amoníaco y ácido fosfórico. Después de realizarse el metabolismo de la tanda se mantiene una alimentación de glicerol (2 %) y de glicerol adicional durante 1 día antes de que la alimentación sea cambiada a metanol para desplazarse a unas condiciones inductivas para el promotor de AOXI. En estas condiciones se mantiene la fermentación durante 5 días. Las células son separadas con respecto del líquido de fermentación mediante una centrifugación a 5000xg durante 30 minutos. Los materiales sobrenadantes
40 son analizados en cuanto a la cantidad total de proteínas mediando utilización del reactivo de Bradford y de unos patrones de BSA (de Biorad). Se usa una SDS-PAGE / con una tinción con Coomassie Brillant Blue para analizar el patrón de proteínas en la SDS-PAGE.
Ejemplo 2: Construcción artificial del vector de expresión en Trichoderma reesei
45 El ADN plasmídico pSCMB100 digerido con SbfI/SwaI fue transformado en el seno de Trichoderma reesei SCF41 esencialmente tal como ha sido descrito por Penttilä y colaboradores, 1997. Se usaron 10 µg de un ADN lineal para la transformación de 107 protoplastos. La selección de los transformantes se realizó mediante un crecimiento de los protoplastos en unas placas con un medio Andreotti de Mandel con un agar de recubrimiento, que contiene
50 higromicina como agente de selección (100 mg/l). Los transformantes fueron purificados ulteriormente por paso sobre unas placas de medio de esporulación y por reselección de las esporas sobre un medio con higromicina. El ADN genómico de los micelios que habían rebrotado fue aislado y el suceso de reemplazo se verificó mediante una PCR. Los transformantes, que se habían verificado por ser unas cepas de reemplazo genuinas, fueron ensayados ulteriormente en cuanto a una segregación de la proteína recombinante.
55 Ejemplo 3: Expresión de la fusión de CBHI de Talaromyces emersonii / -CBD de Trichoderma reesei (CBH-ah) a partir de Trichoderma reesei
La expresión de unas cepas de reemplazo de CBHI recombinante de la fusión de CBHI de Talaromyces emersonii /
60 CBD de Trichoderma reesei con una marcación 6x His en Trichoderma reesei Q6A (ATCC 13631) se llevó a cabo en unos cultivos en matraces con sacudimiento, que contenían 40 ml de un medio Mineral, el cual contenía por su parte 2 % de Avicel, en unos matraces con una capacidad de 300 ml y mediante una cultivación a 30°C/250 rpm durante 6 días. Los materiales sobrenadantes se recuperaron por centrifugación y se analizaron ulteriormente mediante una SDS-PAGE y unos ensayos de Proteínas Bradford.
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ejemplo 4: Escrutinio de unas variantes con una estabilidad térmica
Unas bibliotecas de mutagénesis aleatoria del gen de la fusión de CBHI de Talaromyces emersonii / -CBD de Trichoderma reesei (con una marcación 6x His) se crearon mediando utilización de una PCR propensa a errores, usando unos tampones que contienen manganeso y unas concentraciones desequilibradas de dNTPs en la mezcla de reacción de la ADN polimerasa de Taq, se usaron para la amplificación por PCR, esencialmente tal como se ha descrito por Craig y Joyce (R. Craig Cadwell y G.F. Joyce, 1995. Mutagenic PCR, in PCR Primer: a laboratory manual [PCR mutagénica en cebadores de PCR un manual de laboratorio], coordinadores de edición C. W. Dieffenbach y G. S. Dveksler, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, ME, 583-589). Como un molde se escogió el gen de fusión de tipo silvestre (SEQ ID NO: 17) o unos mutantes de éste. Los fragmentos de PCR mutados se clonaron con el plásmido pKGMe usando las endonucleasas Sphl y HindIII y la ADN ligasa de T4.
Unas bibliotecas de las variantes del gen de la fusión de CBHI de Talaromyces emersonii / -CBD de Trichoderma reesei (con una marcación 6x His) fueron distribuidas en unas placas de 1.536 pocillos con un número de ocupación de los pocillos próximo a 1. La enzima fue expresada durante 7 días en un volumen de 4 µl del medio YPG-G418. Para la evaluación de las propiedades de las variantes, 2 µl de unas muestras de los materiales sobrenadantes del cultivo se transfirieron a unas placas, que contienen una suspensión de paja molida, un tampón de acetato y una beta-glucosidasa. Después de una incubación de las placas de reacción selladas durante 48 horas a unas temperaturas definidas, se determinó la concentración de glucosa usando el rojo Amplex en presencia de GOX y HRP analizando el nivel de fluorescencia. Las muestras (Hits) con los mejores resultados fueron recultivadas y evaluadas de nuevo. Los plásmidos con unas variantes confirmadas de CBH-ah fueron recuperados (con el estuche Pierce ADNzol Yeast genomic ADN Kit) y fueron secuenciados usando unos oligonucleótidos alfa-f (5' TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3') y oli740 (5'-TCAGCTATTTCACATACAAATCG-3').
Ejemplo 5: Determinación de la capacidad de conversión del substrato a diferentes temperaturas para la indicación de la estabilidad térmica de las variantes de CBH-ah mediando utilización del 4-metil-umbeliferil-β-D-lactósido (4-MUL)
Para la comparación exacta de la estabilidad térmica, los materiales sobrenadantes del cultivo, que contenían las variantes de celobiohidrolasa segregadas, fueron diluidos diez veces en un tampón de acetato de sodio (50 mM; pH 5) y unas muestras de 10 µl se incubaron con 90 µl de 4-MUL 200 µM (en el tampón) en el gradiente de temperaturas de un Eppendorff Gradient Thermocycler. Un gradiente de temperaturas de 20°C que se extendía desde 55°C hasta 75°C se aplicó a 12 mezclas de reacción durante una hora para cada muestra. El perfil de temperaturas pudo ser registrado después de la adición de 100 µl de una solución de carbonato de sodio 1 M a cada reacción y la medición de la intensidad de fluorescencia a 360 nm/454 nm en un lector de placas Tecan Infinite M200. Para la comparación de la estabilidad térmica, los valores fueron normalizados entre 1 y 0 para los cómputos de fluorescencia máxima y mínima (Figura 7).
Tabla 2: Lista de los mutantes de la SEQ ID NO: 18 con unos valores IT50 mejorados
- imagen49
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 18 IT50 [°C]
- imagen50
- Ninguna 59,8
- 1
- N194R,Y374D 59,8
- 2
- S467T 60,1
- 3
- G4C,A72C,Q349K,S24N 60,1
- 4
- T392M 60,2
- 5
- W40R,D320V,T393A,N445D 60,2
- 6
- W40R 60,3
- 7
- R446G 60,6
- 8
- D346G,R453G 60,9
- 9
- Y496F 60,9
- 10
- T3351,D346A,T393A,D410G 61,0
- 11
- T2431,T325A,V482A 61,0
- 12
- N194R,T243R,Y374D,A375D 61,1
- 13
- E65K 61,1
- 14
- T48A 61,2
- imagen52
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 18 IT50 [°C]
- 15
- G4C,A72C,T344M 61,2
- 16
- T243R,A375D 61,3
- 17
- W40R,K159E,N445D,A501S 61,3
- 18
- T344M 61,3
- 19
- W40R,M234K 61,3
- 20
- Q349R,T393A,P436S,N445D 61,4
- 21
- Q349R,A354T,D373E,N445D 61,4
- 22
- G4C,W40R,A72C,T344M 61,4
- 23
- G4C,A72C,N194L,T243Y,Q349R,Y374R,A375L 61,5
- 24
- G4C,D64N,A72C,Q349K 61,5
- 25
- W40R,T344M 61,5
- 26
- W40R,D346A,T393A 61,6
- 27
- N158D,G486S,Y495C 61,6
- 28
- D320E 61,6
- 29
- A72V 61,6
- 30
- E183V 61,6
- 31
- Q349R,N445D 61,6
- 32
- W40R,C489R 61,7
- 33
- W40R,Q349K 61,9
- 34
- G4C,A72C,Q349K,E65V,Q349R 61,9
- 35
- S311N 62,0
- 36
- D320V,D346A,Q349R,T393A,N445D 62,1
- 37
- T335I 62,2
- 38
- A72V,D346A 62,2
- 39
- D320V,D346A,T393A,N445D 62,2
- 40
- G4C,A72C,N194S,T243W,Q349R,Y374S,A375G 62,3
- 41
- E65V,Q349R 62,3
- 42
- A72V,T3351,D346A,N445D 62,3
- 43
- G4C,A72C,N194L,T243,Q,Q349R,Y374P,A375V 62,3
- 44
- G4C,A72C,D346G 62,3
- 45
- W40R,T344M,Q349K 62,3
- 46
- G4C,Y163C 62,4
- 47
- G4C,V32G,N49S,A72C,S193L,Q349R 62,4
- 48
- G4C,A72C,D346G,Q349R 62,6
- 49
- W40R,D320V,Q349K,P436S,N445D 62,7
- 50
- G4G,A72C,D181N,Q349R 62,7
- 51
- G4C,A72C,Q349K 62,7
- 52
- A72V,Q349R,N445D 62,8
- 53
- G4C,A72C,T344M,Q349K 62,8
- 54
- G4C,A72C,D320V,Q349K 62,8
- 55
- G4C,A72C,P224L,F306Y,Q349R 62,9
- 56
- A72V,T335I,D346A,T393A,N445D 62,9
E10153355 07-10-2015 E10153355 07-10-2015 E10153355 07-10-2015
- imagen53
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 18 IT50 [°C]
- 57
- G4C,A72C,T344M,D346G,Q349R 63,0
- 58
- A72V,D346A,T393A 63,0
- 59
- G4C,A72C,Q349R,R446S,T456A 63,0
- 60
- G4C,W40R,A72C,T344M,Q349K 63,0
- 61
- A72V,D320V,D346A 63,1
- 62
- G4C,A72C,N194Y,T243L,Q349R,Y374S,A375R 63,1
- 63
- G4C,A72C,Q349K,T448A,T449A 63,2
- 64
- G4C,E65V,A72C,Y244H,Q349R 63,3
- 65
- G4C,A72C 63,3
- 66
- G4C,A72C,P224L,Q349R,S409L,P429S 63,4
- 67
- G4C,A72C,D202G,D320N,Q349R,A358E 63,4
- 68
- G4C,A72C,D320V,Q349R,H508R 63,4
- 69
- G4C,A72C,Q349K,S86T 63,4
- 70
- A72V,T335I,D346A,T393A,P436S 63,4
- 71
- G4C,A72C,E183V,K304R,Q349K 63,5
- 72
- G4C,A72C,T243G,G3349R,Y374P,A375M 63,5
- 73
- G4C,A72C,Q349R,T465I 63,6
- 74
- G4C,A72C,N194V,T243M,Q349R,Y374A,A375T 63,6
- 75
- G4C,D64N,A72C.Q349R,A358E,P464Q 63,6
- 76
- G4C,A72C,Q349K,Q28R,S193T,Q490L 63,6
- 77
- G4C,A72C,E183K,Q349K 63,6
- 78
- G4C,A72C,S311N,Q349K,A455T,H509Q 63,6
- 79
- G4C,A72C,N194K,Q349R,Y374P,A375Q 63,6
- 80
- G4C,A72C,D181N,Q349K 63,6
- 81
- W40R,D320V,Q349K,T393A,N445D 63,7
- 82
- W40R,T3351,D346A,T393A 63,7
- 83
- G4C,A72C,N194K,T243P,Q349R,Y374H,A375E 63,7
- 84
- G4C,A72V,Q349R,P462del 63,8
- 85
- G4C,A72C,S236Y,Q349R 63,8
- 86
- G4C,A72C,S311G,Q349K 63,8
- 87
- A72V,D320V,T335I,D346A,T393A,N445D 63,8
- 88
- G4C,A72C,S86T,M234V,Q349K 63,8
- 89
- G4C,A72C,G251R,Q349R 63,9
- 90
- QIL,G4C,A68T,A72C,Q349K,H505N 63,9
- 91
- A72V,T335I,D346A,T393A 63,9
- 92
- G4C,A72C,E183K,Q349R 63,9
- 93
- G4C,A72C,Q349R 63,9
- 94
- Q1L,G4C,A72C,H203R,Q349K,P442S 63,9
- 95
- G4C,A72C,Q349K,G434S,G470D 64,0
- 96
- G4C,W40R,A72C,Q349K 64,0
- 97
- G4C,A72C,Q349R,V367A 64,0
- 98
- G4C,A72C,S311G,D320V,Q349K 64,0
- imagen54
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 18 IT50 [°C]
- 99
- W40R,T335I,D346A,T393A,P436S 64,0
- 100
- A72V,D346A,T393A,N445D 64,1
- 101
- Q1L,G4C,A72C,D202N,Q349K 64,1
- 102
- G4C,A72C,D320V,Q349R 64,1
- 103
- Q1L,G4C,A72C,K154R,G1349K,T393I 64,1
- 104
- G4C,A72C,N194G,T243F,Q349R,Y374P,A375R 64,1
- 105
- A72V,D320V,D346A,T393A,N445D 64,1
- 106
- G4C,A72C,E183V,Q349K 64,1
- 107
- G4C,A72C,E183K,N318Y,Q349K 64,1
- 108
- G4C,A72C,K92R,Q349K,N493D 64,1
- 109
- Q1L,G4C,A72C,Q349K 64,2
- 110
- M234I,G438deI 64,2
- 111
- G4C,A72C,Q349R,G459D 64,2
- 112
- G4C,A72C,Q349R,Y422F 64,2
- 113
- G4C,T48A,A72C,Q349R,P480S 64,2
- 114
- E187K,D320V,P442del 64,2
- 115
- G4C,S24N,E65K,A72C,Q349R,I430L,G439D 64,2
- 116
- A72V,D320V,T335I,D346A,T393A,P436S 64,3
- 117
- Q1L,G4C,A72C,S193P,Q349K,V482I 64,3
- 118
- G4C,A72C,D320V,Q349K,G443D,L492Q 64,3
- 119
- G4C,A72C,Q349K,D320V 64,4
- 120
- G4C,A72C,N194K,T243Y,Q349R,A375N 64,4
- 121
- Q1L,G4C,Q28R,A72C,Q349K,H468L 64,5
- 122
- G4C,E65V,A72C,Q349R 64,5
- 123
- D320V,Q349K 64,5
- 124
- G4C,A72C,D181N,P224L,Q349K 64,5
- 125
- G4C,A72C,T243Q,Q349R,Y374P,A375M 64,5
- 126
- Q1L,G4C,A72C,D320V,Q349R 64,5
- 127
- Q1L,G4C,T15S,A72C,Y244F,Q349K 64,5
- 128
- G4C,A72C,E183K,D346E,Q349R 64,6
- 129
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,T392M 64,6
- 130
- G4C,A72C,D202N,S311N,Q349R,N493D 64,6
- 131
- G4C,A72C,N194D,T243A,Q349R,Y374P,A375Y 64,6
- 132
- G4C,A72C,N194Y,T243V,Q349R,Y374P 64,7
- 133
- Q1L,G4C,A72C,Q349R 64,7
- 134
- G4C,A72C,D202N,Q349R,H507Y 64,7
- 135
- G4C,A72C,P224L,Q349R,A503V 64,7
- 136
- N194C,Y374C 64,7
- 137
- Q1L,G4C,A72C,D181N,Q349R 64,8
- 138
- G4C,A72C,D320V,D346V,Q349K 64,8
- 139
- Q1L,G4C,A72C,V152A,Q349K 64,8
- 140
- G4C,A72C,E183K,D202Y,N310D,Q349R 64,8
- imagen55
- Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 18 IT50 [°C]
- 141
- Q1L,G4C,Q28R,A72C,Q349K 64,8
- 142
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,Y422F 64,8
- 143
- G4C,A72C,D202V,D320V,Q349K,H504Y 64,8
- 144
- Q1L,G4C,A72C,D181N,D247N,Q349K,S502T 64,8
- 145
- Q1L,G4C,A68T,A72C,Q349K,G439D,R453S 64,9
- 146
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,H468R 64,9
- 147
- Q1L,G4C,D64N,A72C,G1349K 64,9
- 148
- G4C,A72C,E183K,Q349R,P464L 64,9
- 149
- G4C,A72C,N1941,T243Y,Q349R,Y374P,A375R 65,0
- 150
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,H508L 65,0
- 151
- Q1L,G4C,A72C,E183K,Q349R 65,0
- 152
- G4C,A72C,S311G,Q349R 65,0
- 153
- Q1L,G4C,A72C,S311N,Q349K,G463D 65,1
- 154
- Q1L,G4C,A72C,S86T,Q349R 65,1
- 155
- Q1L,G4C,E65K,A72C,Q349K 65,2
- 156
- Q1L,G4C,A72C,D181N,Q349K,T451S 65,2
- 157
- Q1L,G4C,A6V,A72C,Q349K 65,3
- 158
- G4C,A72C,N1941,T243D,Q349R,Y374P,A375Y 65,3
- 159
- G4C,A72C,N194C,Y374C 65,6
- 160
- Q1L,G4C,A72C,A145T,H203R,Q349K,T403K 65,8
- 161
- Q1L,G4C,A72C,S311G,Q349K 66,0
- 162
- Q1L,G4C,A72C,D202N,Q349K,G486D 66,0
- 163
- Q1L,G4C,A72C,I200F,Q349K,L500I 66,0
- 164
- Q1L,G4C,A68T,A72C,Q349K 66,1
- 165
- Q1L,G4C,A72C,D346V,Q349K 66,2
- 166
- G4C,A72C,N194Q,T243V,Q349R,Y374P,A375Y 66,3
- 167
- Q1L,G4C,A72C,Q349K,T392K 66,3
- 168
- Q1L,G4C,A72C,D181N,E183K,Q349R 66,4
- 169
- Q1L,G4C,A72C,S311N,Q349K 66,5
- 170
- G4C,A72C,N194C,Q349R,Y374C 66,5
- 171
- Q1L,G4C,A72C,Y155C,Q349K,A503T 67,0
- 172
- Q1L,G4C,A72C,S86T,D181N,E183K,D320V,Q349R 67,0
Ejemplo 6: Caracterización de las variantes de la fusión de CBHI de Talaromyces emersonii / -CBD de Trichoderma reesei (con una marcación 6x His)
Se concentraron 80 ml del caldo de fermentación hasta un volumen final de aprox. 1 ml. Después de la 5 determinación de la concentración de proteínas (con el reactivo de Bradford, Biorad, Alemania, el patrón es BSA de Sigma-Aldrich, Alemania), 1,2 mg de la proteína fueron purificados con el estuche Ni-NTA Spin (de Qiagen, Alemania). La fracción purificada de CBH1 se ensayó a continuación llevando a cabo una reacción de hidrólisis con una paja de trigo que había sido tratada previamente (tratamiento previo con un ácido). 12,5 mg (masa seca) de la paja de trigo tratada previamente se mezclan con 0,0125 mg de CBH1 purificada y con 40CBU Novo188 (de 10 Novozymes Dinamarca) por cada mg de CBH1. Se añade acetato de sodio 50 mM (de Sigma-Aldrich, Alemania) hasta llegar a un volumen de 500 µl. El ensayo se lleva a cabo a unas temperaturas que se extienden desde 50°C hasta 65°C durante 48 horas y se analiza mediante una HPLC para determinar el contenido de glucosa dependiente de la temperatura.
Claims (9)
-
imagen1 REIVINDICACIONES1. Un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia deaminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con respecto a la SEQ ID NO: 2, en 5 donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado por sustitución o supresión. - 2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido conserva un 50 % de su máxima capacidad de conversión del substrato cuando la conversión se realiza durante 60 minutos a una temperatura de 60°C o más alta.10
- 3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde este polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 90 %, de manera preferida de por lo menos 95 %, de manera muy especialmente preferida de por lo menos 99 % con la SEQ ID NO: 2.
- 15 4. El polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2, o una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en donde de 1 a 75 residuos de aminoácidos, de manera preferida más preferida de 1 a 35 residuos de aminoácidos, son sustituidos, suprimidos o insertados.
- 20 5. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, en el que adicionalmente uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2 son modificados por sustitución o supresión: en las posiciones G4, A6, T15, Q28, W40, D64, E65, A72, S86, K92, V130, V152, Y155, K159, D181, E183, N194, D202, P224, T243, Y244, I277, K304, N310, S311, N318, D320, T335, T344, D346, Q349, A358, Y374, A375, T392, T393, D410, Y422, P442, N445, R446, T456, S460, P462, G463, H468 y/o V482 de los aminoácidos 1 hasta 500 de la
25 SEQ ID NO: 2. -
- 6.
- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el polipéptido comprende uno o más de los siguientes intercambios preferidos con respecto a la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2:
-
- 7.
- El polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos escogida entre la lista de las siguientes mutaciones de la SEQ ID NO: 2:
-
- 8.
- El polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, que es expresado y segregado dentro del material sobrenadante hasta un nivel de más que 100 mg/l, de manera más preferida de más que 200 mg/l, de manera especialmente preferida de más que 500 mg/l y de manera máximamente preferida de más que 1
- Posición
- Intercambio preferido
- Q1
- L
- G4
- C
- A6
- G,V
- T15
- S
- Q28
- Q,R
- W40
- R
- D64
- N
- E65
- K, V
- A72
- C, V
- S86
- T
- K92
- K, R
- V130
- I, V
- V152
- A, E
- Y155
- C
- K159
- E
- D181
- N
- E183
- V, K
- N194
- C, R, Y, D, K, I, L, G, Q, S, V
- D202
- Y,N,G
- P224
- L
- T243
- I, C, R, Y, A, F, Q, P, D, V, W, L, M
- Y244
- F, H
56 57imagen2 - Posición
- Intercambio preferido
- I277
- V
- K304
- R
- N310
- D
- S311
- G, N
- N318
- Y
- D320
- V, E, N
- T335
- I
- T344
- M
- D346
- G, A, E, V
- Q349
- R, K
- A358
- E
- Y374
- C, P, R, H, S, A
- A375
- C, D, N, Y, R, Q, L, V, E, G, T, M
- T392
- C, D, K
- T393
- A
- D410
- G
- Y422
- F
- P442
- S, del
- N445
- D
- R446
- S, G
- T456
- T, A
- S460
- L, P
- P462
- L, del
- G463
- D
- H468
- L, Q, R
- V482
- A, I
- 75
- Q1L, G4C, A72C, Q349K
- 88
- Q1L, G4C, A72C, S86T, Q349R
- 89
- Q1L, G4C, A72C, D181N, Q349R
- 90
- Q1L, G4C, A72C, E183K, Q349R
- 91
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 92
- Q1L, G4C, A72C, D320V, Q349R
- 93
- Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, D320V, Q349R
- 98
- Q1L, G4C, A72C, Q349R
- 148
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, T392M
- 153
- Q1L, G4C, A68T, A72C, Q349K, G439D, R453S
- 154
- Q1L, G4C, A72C, D202N, Q349K
- 155
- Q1L, G4C, A68T, A72C, Q349K
- 156
- Q1L, G4C, A72C, K154R, Q349K, T393I
imagen3 - 157
- Q1L, G4C, A72C, S193P, Q349K, V482I
- 158
- Q1L, G4C, A72C, H203R, Q349K, P442S
- 159
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, H468R
- 160
- Q1L, G4C, A72C, D202N, Q349K, G486D
- 161
- Q1L, G4C, E65K, A72C, Q349K
- 162
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, Y422F
- 163
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, Q349K, H468L
- 164
- Q1L, G4C, A72C, D181N, D247N, Q349K
- 165
- Q1L, G4C, A72C, D181N, Q349K, T451S
- 166
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, Q349K
- 167
- Q1L, G4C, A72C, A145T, H203R, Q349K, T403K
- 168
- Q1L, G4C, A72C, 1200F, Q349K, L500I
- 169
- Q1L, G4C, D64N, A72C, Q349K
- 170
- Q1L, G4C, A72C, V152A, Q349K
- 171
- Q1L, G4C, T15S, A72C, Y244F, Q349K
- 172
- Q1L, G4C, A6V, A72C, Q349K
- 173
- Q1L, G4C, A72C, S311N, Q349K, G463D
- 174
- Q1L, G4C, A72C, Y155C, Q349K
- 175
- Q1L, G4C, A72C, S311N, Q349K
- 176
- Q1L, G4C, A72C, D346V, Q349K
- 177
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, T392K
- 178
- Q1L, G4C, A72C, S311G, Q349K
- 179
- Q1L, G4C, A72C, S311G, Q349K, H468R
5 g/l después de la introducción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con la SEQ ID NO: 2, dentro de una levadura, en donde el residuo de aminoácido situado en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 tiene que ser modificado por sustitución o supresión.10 9. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 hasta 8, que tiene de manera preferida una identidad de por lo menos 95 % con la SEQ ID NO: 1. - 10. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.15 11. Una célula anfitriona que ha sido transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 10.
- 12. La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 11, en donde esta célula anfitriona se deriva del conjunto que se compone de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Pichia, Hansenula, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Candida y Yarrowina.20
- 13. Una composición que comprende el polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 hasta 9 y una o más endoglucanasas y/o una o más beta-glucosidasas y/o una o más otras celobiohidrolasas y/o una o más xilanasas.25 14. Uso del polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 hasta 9 o de la composición de acuerdo con la reivindicación 13 para la degradación enzimática de una biomasa lignocelulósica, y/o para el tratamiento de materiales textiles y/o como un ingrediente en detergentes y/o como un ingrediente en alimentos o composiciones alimentarias.3058
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