ES2689939T3 - Enzimas celulasas optimizadas - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEQ ID NO: 5 en donde el polipéptido se modifica en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Q1, Q2, T7, A8, N10, Q28, E65, S86, D181, E183, D202, P224, S311, N318, T335, D346, Q349, T392, T393 e Y422, y en donde el polipéptido mantiene 50% de su máxima capacidad de transformación del substrato cuando la transformación se realiza durante 60 minutos a una temperatura de 62ºC o superior.
Description
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DESCRIPCION
Enzimas celulasas optimizadas Campo de la invención
La invención divulga enzimas celulasas con propiedades optimizadas para procesar sustratos que contienen celulosa y lignocelulosa. Particularmente, se divulgan enzimas celobiohidrolasas con las características preferidas. La presente invención proporciona variantes de fusión, inserción, deleción y/o sustitución de tales enzimas. Las variantes de las enzimas han mejorado la termoestabilidad, la estabilidad proteolítica, la actividad específica y/o la estabilidad a pH extremo. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican dichas enzimas, una composición que comprende dichas enzimas, un procedimiento para la preparación, y se divulgan el uso para el procesamiento de celulosa y/o para la producción de biocombustibles.
Antecedentes de la invención
El desarrollo de procesos de producción basados en recursos renovables es altamente deseado, por ejemplo, para la generación de etanol a partir de materiales celulósicos y lignocelulósicos.
El material de celulosa en forma pura o conjuntamente con hemicelulosa y/o lignina es una materia prima valiosa y fácilmente disponible para la producción de productos químicos y combustibles. Una etapa clave en el procesamiento de celulosa y lignocelulosa es la hidrólisis de la celulosa con polímero de glucosa ligada en la posición beta-1,4 y la liberación posterior de monómeros de glucosa y oligómeros cortos de glucosa como celobiosa, celotriosa, etc. Las enzimas que catalizan esta reacción se encuentran en diversos organismos, especialmente hongos filamentosos y bacterias, que son capaces de degradar e hidrolizar la celulosa.
Se conocen los procesos continuos para transformar la biomasa lignocelulósica sólida en productos fuel combustibles. El tratamiento para preparar sustratos celulósicos más susceptibles a la degradación enzimática comprende la molienda, el procesamiento químico y/o el procesamiento hidrotérmico. Los ejemplos son oxidación húmeda y/o explosión del vapor. Estos tratamientos aumentan la accesibilidad de fibras de celulosa y las separan de la hemicelulosa y la lignina.
En la documentación se conocen diversas mezclas de enzimas por hidrólisis de biomasa tratada. Típicamente se requiere una mezcla de enzimas endoglucanasa, exoglucanasa y beta-glucosidasa para la degradación de los polímeros de celulosa. Entre estas enzimas celobiohidrolasas (CBH) y, más específicamente, las enzimas celobiohidrolasa I (CBHI), desempeñan una función clave en la etapa de hidrólisis, a medida que proporcionan la actividad enzimática más progresiva. Las enzimas CBHI catalizan la liberación hidrolítica progresiva de celobiosa a partir del terminal reductor de los polímeros de celulosa (Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius IS. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002 Sep; 66 (3): 506-77).
Los materiales celulósicos hidrolizados contienen varias moléculas valiosas de carbohidrato que se pueden aislar de las mezclas. Los hidrolizados de materiales celulósicos que contienen azúcares se pueden utilizar para la producción microbiana de diversos productos de química fina o de biopolímeros, tales como ácidos orgánicos, etanol o alcoholes superiores (también dioles o polioles) o polihidroxialcanoatos (PHA). Uno de los principales usos de los hidrolizados azúcares es la producción de biocombustibles.
Kurabi y col. (2005) describe las preparaciones de celulasas a partir de Trichoderma reesei y otros hongos, tales como Penicillium sp. El rendimiento se ha analizado en abeto Douglas con explosión de vapor y pretratado con organosolv con etanol. Un rendimiento mejorado de las mezclas de enzimas parece ser el resultado de propiedades mejoradas de las enzimas de un solo componente, así como el efecto de cada compuesto en la mezcla, especialmente la presencia de beta-glucosidasa (Kurabi A., Berlín A., Gilkes N., Kilburn D., Bura R., Robinson J., Markov A., Skomarovsky A., Gusakov A., Okunev O., Sinitsyn A., Gregg D., Xie D., Saddler J. (2005) Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolv-pretreated Douglas-fir by novel and commercial fungal cellulases. Appl. Biochem. Biotechnol. 121-124: 219-30).
Las secuencias de celobiohidrolasas de la glucohidrolasa de clase 7 (cel7) se conocen en la técnica a partir de varias fuentes fúngicas. Se conoce la celobiohidrolasa Cel7 de Talaromyces emersonii y la expresión se informó en Escherichia coli (Grassick A., Murray P.G., Thompson R., Collins C.M., Byrnes L., Birrane G., Higgins T.M., Tuohy M.G. Three-dimensional Structure of a termostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular Characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii. Eur J Biochem. 2004 Nov; 271 (22): 4495-506) y Saccharomyces cerevisiae (Voutilainen S.P., Murray P.G., Tuohy M.G., Koivula A. Expression of Talaromyces emersonii cellobiohydrolase Cel7A in Saccharomyces cerevisiae y rational mutagenesis to improve its thermostability and activity. Protein. Eng. Des. Sel. 2010 Feb; 23 (2): 69-79), sin embargo la proteína fue producida en forma inactiva o en rendimientos más bien bajos (menos o igual a 5 mg/l). Celobiohidrolasa I Hypocrea jecorina puede ser producida a partir de cepas de tipo salvaje o de ingeniería genética del género Hypocrea o Trichoderma a altos rendimientos. Las secuencias mejoradas de Cel7A Hypocrea jecorina se divulgan en US7459299B2, US7452707B2, WO2005/030926, WO01/04284A1 o US2009/0162916 A1.
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Las posiciones que conducen a mejoras fueron deducidas de los alineamientos con las secuencias de las enzimas termoestables divulgadas, sugeridas de la información estructural y del barajado de las posiciones identificadas seguidas por registros limitados. Los registros de bibliotecas más grandes en organismos transformables tales como Saccharomyces cerevisiae se informó por la aplicación de sustratos fluorescentes muy sensibles, que se asemejan a sustratos nativos de una manera muy restringida (Percival Zhang Y.H., Himmel M.E., Mielenz J.R. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotecnol Adv. 2006 Sep-Oct; 24 (5): 452-81).
Se informó de la producción de celobiohidrolasas a partir de otros sistemas fúngicos tales como Thermoascus aurantiacus, Chrysosporium lucknowense o Phanerochaete chrysosporium. Se informó de la expresión a partir de celobiohidrolasa Cel7 de levaduras, pero las producciones enzimáticas o las propiedades de las enzimas permanecen no satisfactorias (Penttila M.E., André L., Lehtovaara P., Bailey M., Teeri T.T., Knowles J.K. Efficient secretion of two fungal cellobiohydrolases by Saccharomyces cerevisiae. Gene. 1988; 63 (1): 103-12).
El documento WO03/000941 divulga numerosas CBH y sus secuencias génicas correspondientes. Sin embargo, las propiedades fisiológicas y las aplicaciones no se divulgaron. La fusión de los dominios de unión a celulosa con subunidades catalíticas de celobiohidrolasas se informa para mejorar las propiedades hidrolíticas de proteínas sin un dominio nativo.
El documento US 2009042266 (A1) divulga de las fusiones de Thermoascus aurantiacus Cel7A con los dominios de unión a celulosa a partir de celobiohidrolasa I de Chaetomium termophilus e Hypocrea jecorina.
El documento US5686593 informa de la fusión de regiones enlazadoras especialmente diseñadas y dominios de unión a celobiohidrolasas.
Hong y col. (2003) describen la producción de CBHI Thermoascus aurantiacus en levadura y su caracterización (Hong J., Tamaki H., Yamamoto K., Kumagai H. Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Nov.; 63 (1): 42-50).
Tuohy y col. (2002) informa de la expresión y caracterización de CBH Talaromyces emersonii (Tuohy M.G., Walsh
D.J., Murray P.G., Claeyssens M., Cuffe M.M., Savage A.V., Coughlan M.P.: Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. Biochim Biophys Acta. 2002 Abr 29; 1596 (2): 36680).
Nevoigt y col. (2008) informa sobre la expresión de enzimas celulolíticas en levaduras (Nevoigt E. Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev. 2008 Sep; 72 (3): 379-412).
Fujita y col. (2004) informa sobre una cepa Saccharomyces cerevisiae que expresa una combinación de una endoglucanasa, una beta glucosidasa y una CBHII presentada en la superficie de la célula. Celobiohidrolasa I (Cel7) no se usó en esta configuración (Fujita Y., Ito J., Ueda M., Fukuda H., Kondo A. Synergistic saccharification, and direct fermentation to ethanol, of amorphous cellulose by use of an engineered yeast strain codisplaying three types of cellulolytic enzyme. Appl Environ Microbiol. 2004 Feb; 70 (2): 1207-12).
Boer H. y col. (2000) describe la expresión de enzimas clasificadas GH7 en diferentes anfitrionas de levadura, pero los niveles de proteína expresados eran bajos (Boer H., Teeri T.T., Koivula A. Characterization of Trichoderma reesei cellobiohydrolase Cel7A secreted from Pichia pastoris using two different promoters. Biotecnol Bioeng. 2000 Sep 5; 69 (5): 486-94).
Godbole y col. (1999) y Hong y col. (2003) encontraron que las proteínas de esta clase enzimática expresadas de levadura eran a menudo desdobladas e hiperglicosiladas, y las capacidades hidrolíticas disminuyeron en comparación con la proteína expresada de la anfitriona homóloga (Godbole S., Decker S.R., Nieves R.A., Adney W.S., Vinzant T.B., Baker J.O., Thomas S.R., Himmel M.E. Cloning and expression of Trichoderma reesei cellobiohidrolase I in Pichia pastoris. Biotecnol Prog. 1999 Sep-Oct; 15 (5): 828-33).
Kanokratana y col. (2008), Li y col. (2009) así como CN01757710 describen la expresión eficiente de enzimas CBH I Cel7, sin embargo estas proteínas carecen de dominios de unión de celulosa requeridos para el procesamiento eficiente del sustrato (Kanokratana P., Chantasingh D., Champreda V., Tanapongpipat S., Pootanakit K., Eurwilaichitr L. Identification and expression of cellobiohydrolase (CBHI) gene from and endophytic fungus, Fusicoccum sp. (BCC4124) en Pichia pastoris. LProtein Expr Purif. 2008 Mar; 58 (1): 148-53. Epub 2007 Sep 19; Li Y.L., Li H., Li A.N., Li D.C. Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum and its expression in Pichia pastoris. J. Appl Microbiol. 2009 Jun; 106 (6): 1867-75).
Voutilainen (2008) y Viikari (2007) divulgan enzimas Cel7 que comprenden celobiohidrolasas termoestables, sin embargo con solo niveles de expresión baja a moderada a partir de Trichoderma reesei (Voutilainen S.P., Puranen T., Siika-Aho M., Lappalainen A., Alapuranen M., Kallio J., Hooman S., Viikari L., Vehmaanpera J., Koivula A. Cloning, expression and characterization of novel thermostable family 7 cellobiohydrolases. Biotechnol Bioeng. 2008 Oct 15; 101 (3): 515-28. PubMed PMID: 18512263; Viikari L., Alapuranen M., Puranen T., Vehmaanpera J., Siika- Aho M. Thermostable enzymes in lignocellulose hydrolysis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007; 108:121-45).
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Grassick y col. (2004) divulgan la expresión desdoblada de Celobiohidrolasa I a partir de Talaromyces emersonii in Escherichia coli pero no en levadura (Grassick A., Murray P.G., Thompson R., Collins C.M., Byrnes L., Birrane G., Higgins T.M., Tuohy M.G. Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii. Eur J Biochem. 2004 Nov; 271 (22): 4495-506).
Por lo tanto, hay una necesidad de enzimas de celulasa con mejores características para su uso en los procesos técnicos para la hidrólisis de la celulosa. Particularmente hay una necesidad de enzimas CBH con una mayor actividad catalítica y/o una estabilidad superior en las condiciones de proceso. Además, existe la necesidad de enzimas CBH con mayor productividad en los sistemas de expresión y secreción de hongos y/o levaduras.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa. La invención proporciona un polipéptido termoestable que tiene actividad celobiohidrolasa. Es decir, el polipéptido mantiene el 50% de su máxima capacidad de transformación del sustrato cuando la transformación se realiza durante 60 minutos a 62°C o más. Este polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEQ ID NO: 5. También se ha divulgado un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 85% con la sEq ID NO: 2.
Además, la presente invención divulga un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención, que tiene preferiblemente identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 1, un vector que comprende este ácido nucleico y un anfitrión transformado con dicho vector.
La presente invención proporciona además un procedimiento de producir una proteína celobiohidrolasa codificada por un vector de la presente invención, un procedimiento para identificar polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa, y un procedimiento de preparación de tales polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa. También proporciona un procedimiento para identificar tales polipéptidos que mantienen 50% o más de máxima capacidad de transformación del substrato a temperaturas elevadas tales como a 60°C o más.
También se divulga un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEQ ID NO: 2 en donde uno o más residuos de aminoácidos específicos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2 se modifican mediante mutantes por sustitución o deleción, así como inserción. Los ejemplos de tales mutantes incluyen Q1, G4, A6, T15, Q28, W40, D64, E65, A72, S86, K92, V130, V152, Y155, K159, D181, E183, N194, D202, P224, T243, Y244, I277, K304, N310, S311, N318, D320, T335, T344, D346, Q349, A358, Y374, A375, T392, T393, D410, Y422, P442,
N445, R446, T456, S460, P462, G463, H468 y/o V482 de aminoácidos 1 a 500 de la SEQ ID NO: 2, pero la
invención no se limita de ninguna manera a éstos. A continuación se indican posiciones específicas adicionales.
Por otra parte, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, que puede obtenerse por el procedimiento de preparación de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa según la presente invención, y un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEQ ID NO: 5, en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5 se modifican mutantes por sustitución o deleción, así como inserción. Los ejemplos de tales mutantes incluyen Q1, G4, A6, T15, Q28, W40, D64, E65, A72, S86, K92, V130, V152, Y155, K159, D181, E183, N194, D202, P224, T243, Y244, I277, K304, N310, S311, N318, D320, T335, T344, D346, Q349, A358, Y374, A375, T392, T393, D410 y/o Y422 de
aminoácidos 1 a 440 de la SEQ ID NO: 5, pero la invención no se limita de ninguna manera a estas. A continuación
se indican posiciones específicas adicionales.
La presente invención proporciona además un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de al menos 85% con la SEQ ID NO: 12 en donde uno o más de los siguientes residuos del aminoácido de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 12 se modifican mediante mutantes por sustitución o deleción, así como inserción. Los ejemplos de tales mutantes incluyen Q1, T15, Q28, W40, C72, V133, V155, Y158, T162, Y247, N307, G308, E317, S341, D345, Y370, T389, Q406, N441, R442, T452, S456, P458, G459, H464 y/o V478, pero la invención no se limita de ninguna manera a éstos. A continuación se indican posiciones específicas adicionales.
La presente invención proporciona además el uso de un polipéptido o la composición de la presente invención para la degradación enzimática de biomasa lignocelulósica, y/o para el procesamiento de textiles y/o como ingrediente en detergentes y/o como ingrediente en alimentos o composiciones alimenticias.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Mapas de restricción de pV1 para expresión constitutiva de Proteínas en Pichia pastoris: pUC19-ori: Origen de replicación en E. coli; KanR: Resistencia Kanamicina/G418 con secuencias de los promotores TEF1 y EMZ para selección en Pichia pastoris y E. coli, respectivamente; 5'-GAP: región del promotor gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; 3'-GAP: región del terminador; SP MF-alfa: secuencia de señal del factor alfa de apareamiento con
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Saccharomyces cerevisiae; MCS: sitio de clonación múltiple.
Figura 2: SDS-PAGE de tinción con Coomassie de sobrenadantes concentrados 10 veces de cultivos de matraces agitados de plásmidos de expresión que contienen CBS 7435 de Pichia pastoris con secuencias codificantes para las proteínas CBHI maduras de Trichoderma viride (CBH-f; carril 1), Humicola grisea (CBH-d; carril 2), Talaromyces emersonii (CBH-b; carril 3), Thermoascus aurantiacus (CBH-e; carril 4), así como la fusión de CBHI-CBD de Talaromyces emersonii (CBH-a; carril 6) y la fusión de CBD Humicola grisea (CBH-g; carril 7) en la fusión N-terminal con el péptido señal del factor alfa de apareamiento con Saccharomyces cerevisiae bajo control del promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa Pichia pastoris.
Figura 3: Mapa del plásmido de expresión pV3 para la expresión de proteínas en Pichia pastoris. Replicones: pUC19-ori: Origen de la replicación en E. coli; ZeoR: gen de resistencia Zeocine con secuencias promotoras de los promotores TEF1 y EM7 para expresión en Pichia pastoris y E. coli, respectivamente; promotor AOX I: Región promotora del gen alcohol oxidasa I Pichia pastoris; terminador transcripcional AOX 1: región del terminador; SP MF- alfa: la secuencia de señal alfa del factor de apareamiento de Saccharomyces cerevisiae; MCS: sitio de clonación múltiple.
Figura 4: Análisis de SDS-PAGE de muestras de sobrenadante de cultivo tomadas de la fermentación de una cepa Pichia pastoris con una integración genómica de una casete de expresión AOXI, que expresan el péptido de fusión CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei (CBH-a) en un biorreactor 7I durante la inducción con metanol. Las muestras P1-P7 fueron tomadas al principio de la inducción del metanol y después de 20, 45, 119,5, 142,5, 145,5 y 167 horas, respectivamente.
Figura 5: Mapa del plásmido de expresión pV4 para la expresión del péptido de fusión de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei (CBH-ah) en Trichoderma reesei. Replicón: pUC19 para replicación en E. coli. cbh1 5': región promotora 5' del gen Trichoderma CBHI; péptido de señal de CBHI: Secuencia codificante del péptido líder de Trichoderma reesei CBHI; CBH-a: péptido de fusión de Talaromyces emersonii CBH-a/CBD Trichoderma reesei: región codificante de la SEQ ID NO: 18; Terminador cbh1: región de terminación 3' del locus de Trichoderma reesei CBHI; resistencia a la higromicina: región codificante de la higromicina fosfotransferasa bajo control de un promotor fosfoglicerato cinasa de Trichoderma reesei; 3' cbh1: secuencia de homología con la región de terminación del locus CBHI de Trichoderma reesei para los acontecimientos de doble cruce.
Figura 6: SDS-PAGE de los sobrenadantes del cultivo de Trichoderma reesei. El carril 1 muestra el patrón de expresión de una cepa de sustitución que lleva una fusión de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei (CBH-ah) en lugar del gen CBHI nativo. En comparación, el carril 2 muestra el patrón de la cepa no modificada en las mismas condiciones. M: marcador de tamaño molecular.
Figura 7: determinación de los valores IT50 de los gráficos de Capacidad de transformación del sustrato frente a temperatura después de la normalización. Para la etapa de normalización, los valores máximo y mínimo de la fluorescencia para la temperatura seleccionada se correlacionan con 1 o 0, respectivamente. La interpolación lineal para F'(T) = 0,5 entre los dos puntos de temperatura más cercanos con valores normalizados próximos a 0,5 da como resultado la temperatura IT50 definida.
Figura 8: Gráficos de Capacidad de transformación normalizada frente a temperatura de fusiones de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei de los tipos “wt (abreviatura de “tipo salvaje”)” (CBH-ah: SEQ ID NO: 18 = SEQ ID NO: 2 + Etiqueta 6x His) y mutantes basados en los resultados de hidrólisis de 4-metilumbeliferil-p- D-lactósido evaluados a varias temperaturas. Los valores de fluorescencia se normalizaron según la figura 8 a lo largo del intervalo de temperaturas de 55°C a 75°C
A. .. wt;
B. .. G4C, A72C;
C. .. G4C, A72C, Q349K;
D. .. G4C, A72C, D181N, Q349K;
E. .. Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R;
F. .. Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, D320V, Q349R;
G. .. G4C, A72C, E183K, D202Y, N310D, Q349R;
H. .. Q1L, G4C, A72C, A145T, H203R, Q349K, T403K;
I. .. Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S192S, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
J. .. Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, L119L, D181N, E183M, S192S, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E,
- Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
- K... Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, L119L, D181N, E183M, S192S, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I D202N, _l "3- CM CM CL S311G. , T335I, D346E,
- 5
- L... Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G151GCGRSG, D181N, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I E183M, _l "3- CM CM CL S311G, D320I, D346E, Q349K,
- M... Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, D181N, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K,
Figura 9: Rendimientos de glucosa de hidrólisis de la paja pretratada con proteína de fusión CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei de los tipos wt y mutadas (CBH-ah) después de hidrólisis durante 48 horas en 10 presencia de p-glicosidasa. Las variantes se caracterizan por las mutaciones siguientes con respecto a la SEQ ID NO: 18 y fueron expresadas a partir de Pichia pastoris en cultivos en matraces con agitación y aisladas del sobrenadante por cromatografía de afinidad utilizando Ni-NTA.
A: wt
B: G4C, A72C
15 C: G4C, A72C, Q349R
D: Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R
E: Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
F: Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G151GCGRSG, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, 20 Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Figura 10: Alineamiento de la SEQ ID NO: 2 con la CBHI Trichoderma reesei. Para crear el alineamiento se utilizó la matriz de alineamiento blosum62mt2 con la penalización por apertura de hueco de 10 y la penalización por extensión del hueco de 0,1.
Descripción detallada de la invención
25 La presente invención proporciona polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa. En una realización preferida, la invención proporciona un polipéptido termoestable que tiene actividad celobiohidrolasa. En un aspecto preferido, la invención divulga variantes de la proteína que muestran una alta actividad a alta temperatura durante un período prolongado de tiempo. Preferiblemente, el polipéptido de la presente invención mantiene 50% de su máxima capacidad de transformación de sustrato cuando la transformación se realiza durante 60 minutos a una temperatura 30 de 62°C o superior. La temperatura respectiva también se conoce como el valor IT50. En otras palabras, el valor IT50 es 62°C o superior. Es decir, en esta realización, el polipéptido mantiene el 50% de su máxima capacidad de transformación del sustrato cuando la transformación se realiza durante 60 minutos a 62°C o superior. Además, los polipéptidos de la presente invención tienen preferiblemente un valor IT50 en el intervalo de 62 a 80°C, más preferiblemente de 65 a 75°C.
35 "Capacidad de Transformación de Sustrato" de una enzima se define, en el presente documento, como el grado de transformación de sustrato catalizado por una cantidad de enzima dentro de un cierto período de tiempo en condiciones definidas (concentración de sustrato, valor de pH y concentración de tampón, y temperatura), como se puede determinar por evaluación de los criterios de valoración de la reacción enzimática en dichas condiciones. "Máxima Capacidad de Transformación de Sustrato" de una enzima se define, en el presente documento, como el 40 máximo en la Capacidad de Transformación de Sustrato encontrada para la enzima dentro de un número de mediciones realizadas como se ha descrito anteriormente, cuando se variaba sólo un parámetro, p. ej., la temperatura, dentro de un intervalo definido. Según la presente invención, la evaluación descrita en el ejemplo 8 se utiliza para determinar estos parámetros.
Este polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 90% con la 45 SEQ ID NO: 5. El término "identidad a lo largo de una longitud de secuencia de y residuos" (en donde y es cualquier número entero, tal como, como ejemplo ilustrativo, 200, 255, 256, 300, 400, 437 y 500) significa que y es una parte, preferiblemente continua, de la secuencia parental (en este caso particular la SEQ ID NO: 5, pero lo mismo es cierto a lo largo de esta aplicación, también con respecto a otras secuencias parentales específicamente indicadas con las que las secuencias de esta invención pueden ser comparadas) que se utiliza como base para la comparación de 50 identidad de secuencia. Así pues, para la comparación de la identidad de la secuencia (alineamiento de la secuencia), se toman en consideración preferiblemente 200 o más, más preferiblemente 300 o más, incluso más preferiblemente 400 o más, y lo más preferiblemente 437 posiciones de la secuencia parental dadas en la SEQ ID NO: 5. A continuación se indican los detalles de cómo se calculan los porcentajes de identidades de secuencia. También debe tenerse en cuenta que, a menos que se especifique expresamente lo contrario en esta memoria
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descriptiva, la secuencia completa de la secuencia parental (como, en este caso particular, la SEQ ID NO: 5) (es decir, del primero al último residuo de aminoácido) se utilizará como secuencia padre.
El polipéptido capaz de mantener el 50% de su máxima capacidad de transformación de sustrato cuando la transformación se realiza durante 60 minutos a 62°C o superior, es un polipéptido que difiere de la SEQ ID NO: 5 en al menos una mutación, en el cual la mutación puede ser una inserción, deleción o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos. También se prefieren al menos dos de tales mutaciones, tales como al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 y al menos 10 de tales mutaciones con respecto al polipéptido dado en la SEQ ID NO: 5.
"Celobiohidrolasa" o "CBH" se refiere a las enzimas que escinden la celulosa del extremo de la cadena de glucosa y producen celobiosa como producto principal. Los nombres alternativos son 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasas o celulosa 1,4-beta-celobiosidasas. Las CBH hidrolizan los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos de los extremos reductor o no reductor de un polímero que contiene dichos enlaces. "Celobiohidrolasa I" o "CBH I" actúa desde el extremo reductor de la fibra de celulosa. “Celobiohidrolasa II" o "CBH II" actúa desde el extremo no reductor de la fibra de celulosa. Las celobiohidrolasas tienen típicamente una estructura que consiste en un dominio catalítico y uno o más "dominios de unión a celulosa" o "CBD". Tales dominios se pueden ubicar en el N- o C-terminal del dominio catalítico. Los CBD tiene actividad de unión a carbohidrato y median la unión de la celulasa con la celulosa cristalina y se sabe que la presencia o ausencia de dominios de unión tienen un impacto importante en la capacidad de procesamiento de una enzima especialmente en substratos poliméricos.
Este polipéptido se caracteriza además por comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEQ ID NO: 5, y preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 95% con la SEQ ID NO: 5.
El polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, definido antes, en una realización incluso más preferida, se caracteriza además como sigue: Es el polipéptido definido antes, en donde uno o más de los residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5 se modifican por sustitución o deleción en una o más posiciones que se seleccionan preferiblemente de
Q1, Q2, G4, A6, T7, A8, N10, P12, T15, A21, G23, S24, T26, T27, Q28, N29, G30, A31, V32, N37, W40, V41, G46, Y47, T48, N49, C50, T52, N54, D57, T59, Y60, D64, E65, A68, Q69, A72, V84, S86, S89, S90, K92, S99, Q109, D110, D111, I116, F117, K118, L119, L120, D129, V130, G139, A145, M146, V152, K154, Y155, N157, N158, K159, K163, G167, Q172, F179, I180, D181, E183, E187, G188, Q190, S192, S193, N194, I200, D202, H203, D211, V212, A221, P224, D228, T229, G231, T233, M234, S236, T243, Y244, S245, N246, D247, G251, F260, G266, K275, I276, I277, T280, L290, D293, G294, T295, T297, T299, S301, K304, F306, N310, S311, V313, I314, N318, D320, I321, T325, N327, T335, A340, F341, D343, T344, D345, D346, Q349, H350, A354, K355, A358, Q361, Q362, G363, M364, V367, D373, Y374, A375, A376, P386, T387, D390, T392, T393, P394, T400, P402, T403, D404, D410, N417, S418, T421, Y422 y/o una o más inserciones después de las posiciones G151, K159,
y en una realización más preferida se modifican mediante sustitución o deleción en una o más posiciones seleccionadas de Q1, Q2, G4, A6, T7, A8, N10, A21, S24, T26, T27, Q28, N29, G30, W40, Y47, D64, E65, A68, Q69, A72, S86, K92, K118, Y155, D181, E183, Q190, S192, N194, D202, H203, P224, T229, G231, M234, S236, T243, D247, S311, N318, D320, T335, A340, T344, D346, Q349, K355, Y374, A375, T387, D390, T392, T393, Y422 y/o una o más inserciones de 1-8 aminoácidos después de las posiciones G151, K159
y en una realización incluso más preferida se modifican por sustitución o deleción en una o más posiciones seleccionadas de Q1, Q2, G4, A6, T7, A8, N10, Q28, E65, A72, S86, D181, E183, D202, P224, S311, N318, D320, T335, D346, Q349, T392, T393, Y422 y/o inserciones en una o más después de las posiciones y/o una o más inserciones de 5 aminoácidos después de las posiciones G151, K159
de los aminoácidos 1 a 437 de la SEQ ID NO: 5.
También se prefieren las realizaciones en donde la mutación o mutaciones respectivas dadas antes se introducen en el polipéptido dado en la SEQ ID NO: 2, como se indica a continuación.
La persona experta comprenderá que varias de estas mutaciones dadas se pueden combinar entre sí, es decir, que un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, donde, por ejemplo, Q69 y T232 se sustituyen por otros residuos de aminoácidos, está comprendida en esta realización. La expresión "inserción después de la posición o posiciones x" debe comprenderse que la inserción puede estar en cualquier posición que esté en el lado del C-terminal (más cerca del C-terminal) de la posición x; sin embargo, las inserciones inmediatamente después de la posición x son fuertemente preferidas (donde x es cualquier posición).
También se divulga un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 85% con la SEQ ID NO: 2. Se prefiere que este polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEQ ID NO: 2 sea un polipéptido que tenga también un grado de identidad con la SEQ ID NO: 5 nombrada anteriormente, como de que tenga una identidad de secuencia de al menos 60% (o más, véase antes) con el polipéptido dado en la SEQ ID NO: 5, y/o una cualquiera o más de las realizaciones de identidad más particulares de identidad porcentual con la SEQ ID NO: 5 como se indica
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en detalle anteriormente. Así, el polipéptido que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 es una realización que está comprendida en la invención que se relaciona con un polipéptido que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con el polipéptido dado en la SEQ ID NO: 5. La persona experta reconocerá fácilmente el concepto inventivo común que inspira las variantes termoestables de las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5.
Equivalente a lo que se ha dicho anteriormente para la SEQ ID NO: 5, para el alineamiento de secuencia de la SEQ ID NO: 2 tal como se define en el presente documento, preferiblemente 200 o más, más preferiblemente 300 o más, incluso más preferiblemente 400 o más, y lo más preferiblemente 437 posiciones de la SEQ ID NO: 5 se toman en consideración. A continuación, se indican los detalles de cómo se calculan los porcentajes de identidad de secuencia. En una realización más preferida, el polipéptido respectivo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la sEq ID NO: 2 a lo largo de una longitud de secuencia de 500 residuos de aminoácidos. Incluso más preferiblemente, la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, o incluso más preferiblemente al menos 95% o 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 a lo largo de una longitud de la secuencia de 500 residuos de aminoácidos.
La secuencia parental se da en la SEQ ID NO: 2. La secuencia deriva de la fusión en el C-terminal del dominio enlazador y del dominio de unión a celulosa de CBHI Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 4) con el dominio catalítico de CBHI Talaromyces emersonii (SEQ ID NO: 5). La invención comprende además otras proteínas de fusión que comprenden cualquier dominio de unión a celulosa y un derivado del dominio catalítico de CBHI Talaromyces emersonii (SEQ ID NO: 5), preferiblemente con las características de estabilidad de temperatura dadas anteriormente. El dominio de unión a celulosa puede ser de cualquier fuente. Los polipéptidos según la invención pueden llevar además una etiqueta de hexahistidina. Así, por medio de la ilustración, variantes de uno cualquiera de los polipéptidos mostrados en las SEQ ID NO: 42, 44, 46, 48 o 50 se incluyen en esta invención. Las variantes son preferiblemente tales que los polipéptidos exhiben estabilidad a la temperatura, según lo descrito y definido anteriormente.
El polipéptido de la presente invención comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. Además, se prefiere particularmente que la secuencia de aminoácidos del polipéptido tenga la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2, o una secuencia tal como se define en la SEQ ID NO: 2 en donde 1 a 75, más preferiblemente 1 a 35 residuos de aminoácidos sean sustituidos, eliminados o insertados.
Particularmente preferidas son las variantes de las proteínas de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 12. "Variantes de proteínas" son polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos difiere en una o más posiciones de su proteína parental, por lo que las diferencias pueden ser sustituciones de un aminoácido por otro, deleciones de uno o varios aminoácidos, o la inserción de aminoácidos adicionales o tramos de aminoácidos en la secuencia parental. Por definición, las variantes del polipéptido parental se distinguirán de otros polipéptidos por comparación de la identidad de secuencia (alineamientos) utilizando el algoritmo ClustalW (Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J. y Higgins D.G. (2007) ClustalW y ClustalX versión 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948). Los procedimientos para la generación de tales variantes de las proteínas incluyen la mutagénesis al azar o dirigida al sitio, mutagénesis por saturación del sitio, montaje de fragmento basado en la PCR, barajamiento del ADN, recombinación homóloga in vitro o in vivo, y procedimientos de síntesis de genes.
La nomenclatura de aminoácidos, péptidos, nucleótidos y ácidos nucleicos se realiza según las sugerencias de la IUPAC. En general, dentro de este documento, los aminoácidos se nombran según el código de una letra.
Los intercambios de aminoácidos individuales se describen nombrando el código de una sola letra del aminoácido original seguido por su número de posición y el código de una sola letra del aminoácido que sustituye, es decir, el cambio de glutamina en la posición uno por una leucina en esta posición se describe como "Q1L". Para las deleciones de posiciones individuales de la secuencia se sustituye el símbolo del aminoácido que sustituye por la abreviatura de tres letras "del" (de la palabra “deleción”) así la deleción de alanina en la posición 3 sería referida como “A3del”. Los aminoácidos adicionales insertados reciben el número de la posición precedente ampliado por una letra pequeña en orden alfabético relativo a su distancia a su punto de la inserción. Así, la inserción de dos triptófanos después de la posición 3 se refiere como "3aW, 3bW" o simplemente como A3AWW (es decir, sustitución formal de "A" en la posición 3 por los residuos de aminoácidos "AWW"). La introducción de codones TAA, TGA y TAG no traducidos, en la secuencia de ácido nucleico se indica como "*" en la secuencia de aminoácidos, así la introducción de un codón de terminación en la posición 4 de la secuencia de aminoácidos se refiere como "G4*".
Las mutaciones múltiples están separadas mediante un signo más o una barra inclinada o una coma. Por ejemplo, dos mutaciones en las posiciones 20 y 21 que sustituyen alanina y ácido glutámico por glicina y serina, respectivamente, se indican como "A20G+E21S" o "A20G/E21S" o "A20G,E21S".
Cuando un residuo de aminoácido en una posición determinada se sustituye por dos o más residuos de aminoácidos alternativos, estos residuos se separan mediante una coma o una barra inclinada. Por ejemplo, la sustitución de alanina en la posición 30 por glicina o ácido glutámico se indica como "A20G,E" o "A20G/E" o "A20G,A20E".
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Cuando una posición adecuada para modificación se identifica en el presente documento sin que se sugiera ninguna modificación específica, debe entenderse que cualquier residuo de aminoácido sustituir al residuo de aminoácido presente en la posición. Así, por ejemplo, cuando una modificación de una alanina en la posición 20 se menciona, pero no se especifica, debe entenderse que la alanina puede ser eliminada o sustituida por cualquier otro residuo de aminoácido (es decir, uno cualquiera de R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y y V).
Las expresiones "mutación similar" o "sustitución similar" se refieren a una mutación de aminoácidos que una persona experta en la técnica consideraría similar a una primera mutación. Similar en este contexto significa un aminoácido que tiene características químicas similares. Si, por ejemplo, una mutación en una posición específica conduce a una sustitución de un residuo de aminoácido no alifático (p. ej., Ser) con un residuo de aminoácido alifático (p. ej., Leu), entonces una sustitución en la misma posición con un aminoácido alifático diferente (p. ej., IIe o Val) se conoce como una mutación similar. Otras características del aminoácido incluyen el tamaño del residuo, hidrofobicidad, polaridad, carga, valor de pK, y otras características del aminoácido conocidas en la técnica. Por consiguiente, una mutación similar puede incluir la sustitución tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. Los conjuntos de aminoácidos así derivados probablemente deberán conservarse por razones estructurales. Estos conjuntos se pueden describir bajo la forma de un diagrama de Venn (Livingstone, C.D. y Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignements: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation” Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756; Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205218). Se pueden hacer sustituciones similares, por ejemplo, según la siguiente agrupación de aminoácidos: Hidrofóbicos: F W Y H K M I L V A G; Aromáticos: F W Y H; Alifáticos: I L V; Polares: W Y H K R E D C S T N; Cargados H K R E D; Cargados positivamente: H K R; Cargados negativamente: E D.
Como convenio para la numeración de aminoácidos y designación de las variantes de las proteínas, para la descripción de las variantes de las proteínas, la primera glutamina (Q) de la secuencia de aminoácidos QQAGTA dentro de la secuencia de la proteína parental dada en la SEQ ID NO: 2 se refiere como número de posición 1 o Q1 o glutamina 1. La numeración de todos los aminoácidos será según su posición en la secuencia parental dada en la SEQ ID NO: 2 relativa a este número de posición 1.
También se divulgan variantes específicas de los polipéptidos de la presente invención como se indica anteriormente, tales como variantes de la SEQ ID NO: 2, con cambios de su secuencia en una o más de las posiciones dadas en adelante. Es decir, la invención proporciona, en una realización particular, el polipéptido como antes, en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2 se modifican preferiblemente por sustitución o deleción en las posiciones Q1, Q2, G4, A6, T7, A8, N10, P12, T15, A21, G23, S24, T26, T27, Q28, N29, G30, A31, V32, N37, W40, V41, G46, Y47, T48, N49, C50, T52, N54, D57, T59, Y60, D64, E65, A68, Q69, A72, V84, S86, S89, S90, K92, S99, Q109, D110, D111, I116, F117, K118, L119, L120, D129, V130, G139, A145, M146, V152, K154, Y155, N157, N158, K159, K163, G167, Q172, F179, I180, D181,
E183, E187, G188, Q190, S192, S193, N194, I200, D202, H203, D211, V212, A221, P224, D228, T229, G231, T233,
M234, S236, T243, Y244, S245, N246, D247, G251, F260, G266, K275, I276, I277, T280, L290, D293, G294, T295,
T297, T299, S301, K304, F306, N310, S311, V313, I314, N318, D320, I321, T325, N327, T335, A340, F341, D343,
T344, D345, D346, Q349, H350, A354, K355, A358, Q361, Q362, G363, M364, V367, D373, Y374, A375, A376, P386, T387, D390, T392, T393, P394, T400, P402, T403, D404, D410, N417, S418, T421, Y422, F427, P429, I430, G431, T433, G434, N435, P436, S437, G439, N440, P441, P442, G443, N445, R446, T448, T449, T450, T451,
R453, P454, A455, T456, T457, G459, S460, S461, P462, G463, P464, T465, S467, H468, G470, C472, G474,
G476, Y477, S478, P480, V482, C483, S485, G486, T488, C489, Q490, V491, L492, N493, Y495, Y496, Q498,
C499, L500 y/o por una o más inserciones después de las posiciones G151, K159, G434, A455 o P464, de
aminoácidos 1 a 500 de la SEQ ID NO: 2.
También se divulgan los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2 se modifican preferiblemente por sustitución o deleción en las posiciones seleccionadas de Q1, Q2, G4, A6, T7, A8, N10, A21, S24, T26, T27, Q28, N29, G30, W40, Y47, D64, E65, A68, Q69, A72, S86, K92, K118, Y155, D181, E183, Q190, S192, N194, D202, H203, P224, T229, G231, M234, S236, T243, D247, S311, N318, D320, T335, A340, T344, D346, Q349, K355, Y374, A375, T387, D390, T392, T393, Y422, P436, P442, N445, R446, T448, T451, R453, P462, G463, H468, P480, V482, S485, y/o por una o más inserciones de 1-8 aminoácidos después de las posiciones G151, K159, G434, A455 o P464, y en una realización incluso más preferida son modificados por sustitución o deleción en una o más posiciones seleccionadas de Q1, Q2, G4, A6, T7, A8, N10, Q28, E65, A72, S86, D181, E183, D202, P224, S311, N318, D320, T335, D346, Q349, T392, T393, Y422, P442, N445, R446, H468, V482, y/o por inserciones en una o más después de las posiciones y/o una o más inserciones de 5 aminoácidos después de las posiciones G151, K159, G434, A455 o P464 de aminoácidos 1 a 500 de la SEQ ID NO: 2.
También se divulgan las mutaciones respectivas en una cualquiera o más de las mutaciones especificadas 1 a 430 de la SEQ ID NO: 5. La persona experta reconocerá que los residuos 1 a 430 de la SEQ ID NO: 5 son equivalentes a las posiciones 1 a 430 de la SEQ Id NO: 2, y por lo tanto pueden transferir fácilmente la enseñanza detallada dada en lo que antecede y en lo sucesivo para las modificaciones preferidas de la SEQ ID NO: 2 para una cualquiera o más de las posiciones 1 a 430 con las respectivas una o más posiciones (1 a 430) de la SEQ ID NO: 5. Como ejemplo ilustrativo y no limitativo, es evidente para la persona experta que, puesto que D390 es una posición particular en la que se prefiere una modificación en la sEq ID NO: 2, del mismo modo D390 es una posición en la que se prefiere una modificación en la SEQ ID NO: 5.
En una realización preferida, la variante del polipéptido de la presente divulgación es un polipéptido como el descrito anteriormente, en donde específicamente uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2 se modifican como se muestra en la Tabla 1. Se muestran las modificaciones preferidas, más preferidas y las más preferidas. Cualesquiera de estas mutaciones pueden combinarse entre sí. Sin 5 embargo, en una realización particular se prefiere que las mutaciones se seleccionen sólo entre las realizaciones más preferidas y las más preferidas que se muestran en la Tabla 1. Incluso más preferiblemente, sólo se eligen las modificaciones indicadas como las más preferidas. La persona experta será consciente de que cualesquiera de las diferentes mutaciones pueden combinarse entre sí.
Tabla 1: Intercambios preferidos y mutaciones similares
- Posición
- Preferidos Más preferidos Los más preferidos
- Q1
- L L L
- Q2
- P, S P, S S
- G4
- C C C
- A6
- G, L, V G, L, V L
- T7
- Q Q Q
- A8
- S S S
- N10
- T, D T, D T, D
- P12
- Q
- T15
- S
- A21
- S, T, C S, T, C
- G23
- A, D, N
- S24
- T, C, N T, C, N
- T26
- I, N I, N
- T27
- S, Q S, Q
- Q28
- L, K, R, N L, K, R, N K, R
- N29
- T, Y T, Y
- G30
- A A
- A31
- S
- V32
- G
- N37
- S
- W40
- R R
- V41
- T
- G46
- S
- Y47
- S, F S, F
- T48
- A
- N49
- S
- Posición
- Preferidos Más pre
- C50
- S
- T52
- D
- N54
- S
- D57
- S
- T59
- M
- Y60
- H
- D64
- N N
- E65
- V, M, K V, M, K
- A68
- T T
- Q69
- K, R K, R
- A72
- V, C V, C
- V84
- A
- S86
- T T
- S89
- N
- S90
- T, F
- K92
- R R
- S99
- T
- Q109
- R
- D110
- G, S, N
- D111
- H, E
- I116
- V, K, E
- F117
- Y
- K118
- A, T, Q A, T, Q
- L119
- L, I
- L120
- P, M
- D129
- N
- V130
- I
- G139
- S
- A145
- T
- M146
- C
- G151
- GCGRSG GCGRS
Los más preferidos
V, M, K
C
T
GCGRSG
- Posición
- Preferidos Más preferidos
- V152
- A, E
- K154
- R
- Y155
- S, C, H S, C, H
- N157
- S
- N158
- D
- K159
- E, KCGRNK KCGRNK
- K163
- C
- G167
- C
- Q172
- Q
- F179
- I
- 1180
- N
- D181
- N N
- E183
- V, M, K V, M, K
- E187
- K
- G188
- C
- Q190
- L, K L, K
- S192
- L, I, P, T, M L, I, P, T, M
- S193
- L, P, T
- N194
- G, L, I, V, S, C, K.R, D, Q, Y G, L, I, V, S, C,
- I200
- N, F
- D202
- G, I, V, N, F, Y G, I, V, N, F, Y
- H203
- R R
- D211
- G
- V212
- L
- A221
- V
- P224
- L L
- D228
- N
- T229
- A, S, M A, S, M
- G231
- D D
- T233
- S
- M234
- L, I, V, T, K L, I, V, T, K
Los más preferidos
KCGRNK
N
V, M, K
G, I, V, N, F, Y
L
- Posición
- Preferidos Más preferidos Los más preferidos
- S236
- >- LL >- LL
- T243
- G, A, L, I, V, P, S, C, M, R, D, Q, F, Y, W G, A, L, I, V, P, S, C, M, R, D, Q, F, Y, W
- Y244
- H, F
- S245
- T
- N246
- S, K, D
- D247
- NN
- G251
- R
- F260
- C
- G266
- S
- K275
- E
- I276
- V
- I277
- V
- T280
- A
- L290
- H
- D293
- R, H
- G294
- A
- T295
- S
- T297
- N
- T299
- I, S
- S301
- C
- K304
- R
- F306
- L, Y
- N310
- D, E
- S311 V313
- G, D, N G, D, N G, D, N I
- I314
- F
- N318
- I, H, D, Y I, H, D, Y I, D, Y
- D320
- I, V, E, N I, V, E, N I, V, N
- I321
- N
- T325
- A, I
- N327
- Y
- Posición
- Preferidos Más preferidos
- T335
- I I
- A340
- G, S, T G, S, T
- F341
- C
- D343
- A
- T344
- M M
- D345
- E
- D346
- G, A, V, E G, A, V, E
- Q349
- K, R K, R
- H350
- Y
- A354
- T
- K355
- Q Q
- A358
- E
- Q361
- R
- Q362
- G, R, H
- G363
- P
- M364
- L, S
- V367
- A
- D373
- E
- Y374
- A, P, S, C, R, H, D A, P, S, C, R, H
- A375
- G, L, V, T, C, M, R, D, E, N, 0, Y G, L, V, T, C, M
- A376
- T
- P386
- L, S
- T387
- A, S A, S
- D390
- G, E G, E
- T392
- S, M, K S, M, K
- T393
- A, I, V, S A, I, V, S
- P394
- C
- T400
- S
- P402
- S
- T403
- K
- D404
- N
Los más preferidos I
G, A, V, E K, R
M
A, I, V
- Posición
- Preferidos Más preferidos Los más preferidos
- D410
- G
- N417
- Y
- S418
- P
- T421
- I
- Y422
- F F F
- F427
- Y
- P429
- C
- I430
- L
- G431
- D
- T433
- S, E
- G434
- S, GAAATG GAAATG GAAATG
- N435
- Q
- P436
- S S
- S437
- P
- G439
- V, D
- N440
- E
- P441
- A, L, S
- P442
- S, Q, del S, Q S
- G443
- D
- N445
- S, D S, D D
- R446
- G, S G, S G, S
- T448
- A A
- T449
- A
- T450
- I
- T451
- A, S A, S
- R453
- G, S, K G, S, K
- P454
- S
- A455
- V, T, AAAAPA AAAAPA AAAAPA
- T456
- A, I
- T457
- P
- G459
- D
- Posición
- Preferidos Más preferidos Los más preferidos
- S460
- P
- S461
- R
- P462
- L, del L
- G463
- V, D V, D
- P464
- L, Q, PTHAAA PTHAAA PTHAAA
- T465
- I, S
- S467
- T
- H468
- L, R, Q L, R, Q L, R, Q
- G470
- D
- C472
- R
- G474
- S
- G476
- D
- Y477
- Y
- S478
- Y
- P480
- S S
- V482
- A, I, T A, I, T A, I, T
- C483
- R
- S485
- T T
- G486
- S, D
- T488
- i
- C489
- R
- Q490
- L
- V491
- I
- L492
- Q
- N493
- D
- Y495
- C
- Y496
- F
- Q498
- K
- C499
- G
- L500
- I
Los autores de las presentes invenciones encontraron, sorprendentemente, que la introducción de estas modificaciones puede producir polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa con valores IT50 elevados, que la persona experta puede aprender de los siguientes ejemplos, en particular del ejemplo 8.
Incluso más preferiblemente, la variante de los polipéptidos de la presente invención como se ha definido generalmente antes comprende, en una realización particular, una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias con mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 2, opcionalmente fusionadas con un C-terminal etiquetado con 6x His, listado en la siguiente Tabla 2.
5 Tabla 2: Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 2:
- Numero consecutivo
- Patrón de mutación con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 1
- G4C, A72C, Q349K
- 2
- G4C, A72C, T344M, Q349K
- 3
- G4C, A72C, T344M, D346G, Q349R
- 4
- G4C, A72C, D320V, Q349K
- 5
- G4C, A72C, P224L, F306Y, Q349R
- 6
- G4C, A72C
- 7
- A72V, D346A, T393A
- 8
- G4C, A72C, Q349R, R446S, T456A
- 9
- G4C, W40R, A72C, T344M, Q349K
- 10
- A72V, D320V, D346A
- 11
- G4C, A72C, N194Y, T243L, Q349R, Y374S, A375R
- 12
- G4C, A72C, Q349K, T448A, T449A
- 13
- G4C, E65V, A72C, Y244H, Q349R
- 14
- G4C, A72C, D202G, D320N, Q349H, A358E
- 15
- G4C, A72C, D320V, Q349R
- 16
- G4C, A72C, Q349K, S86T
- 17
- A72V, T335I, D346A, T393A, P436S
- 18
- G4C, A72C, E183V, K304R, Q349K
- 19
- G4C, A72C, T243G, Q349R, Y374P, A375M
- 20
- G4C, A72C, Q349R, T465I
- 21
- G4C, A72C, Q349R
- 22
- G4C, A72C, N194V, T243M, Q349R, Y374A, A375T
- 23
- G4C, D64N, A72C, Q349R, A358E, P464Q
- 24
- G4C, A72C, Q349K, Q28R, S193T, Q490L
- 25
- G4C, A72C, E183K, Q349K
- 26
- G4C, A72C, S311N, Q349K, A455T
- Numero consecutivo
- Patrón de mutación con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 27
- G4C, A72C, N194K, Q349R, Y374P, A375Q
- 28
- G4C, A72C, D181N, Q349K
- 29
- W40R, D320V, Q349K, T393A, N445D
- 30
- W40R, T335I, D346A, T393A
- 31
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N327Y, Q349R
- 32
- A72C, L119L, T335I, Q349R, G486D
- 33
- G4C, A72C, N194K, T243P, Q349H, Y374H, A375E
- 34
- G4C, A72V, Q349R, P462del
- 35
- G4C, A72C, S236Y, Q349R
- 36
- G4C, A72C, S311G, Q349K
- 37
- A72V, D320V, T335I, D346A, T393A, N445D
- 38
- G4C, A72C, S86T, M234V, Q349K
- 39
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
- 40
- G4C, A72C, G251R, Q349R
- 41
- G4C, A72C, Q349K, D320V
- 42
- A72V, T335I, D346A, T393A
- 43
- G4C, A72C, E183K, Q349R
- 44
- Q1L, G4C, A72C, H203R, Q349K, P442S
- 45
- G4C, A72C, Q349K, G434S, G470D
- 46
- G4C, W40R, A72C, Q349K
- 47
- G4C, A72C, Q349R, V367A
- 48
- Q1L, G4C, A6V, C50S, A72C, I180N, D181N, E183K, Q349R, T457P, C472R, C499G
- 49
- G4C, A72C, S311G, D320V, Q349K
- 50
- W40R, T335I, D346A, T393A, P436S
- 51
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T243S, Q349R, P386S
- 52
- A72V, D346A, T393A, N445D
- 53
- Q1L, G4C, A72C, K154R, Q349K, T393I
- 54
- G4C, A72C, N194G, T243F, Q349R, Y374P, A375R
- Numero consecutivo
- Patrón de mutación con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 55
- A72V, D320V, D346A, T393A, N445D
- 56
- A72C, L119L, Q172Q, Q349K, T488I
- 57
- G4C, A72C, E183V, Q349K
- 58
- G4C, A72C, E183K, N318Y, Q349K
- 59
- W40R, A221V, T449A, C483R
- 60
- G4C, A72C, K92R, Q349K, N493D
- 61
- Q1L, G4C, A72C, S90T, D181N, E183K, Q349R
- 62
- G4C, A72C, Q349R, G459D
- 63
- G4C, A72C, Q349R, Y422F
- 64
- G4C, T48A, A72C, Q349R, P480S
- 65
- E187K, D320V, P442del
- 66
- G4C, S24N, E65K, A72C, Q349R, I430L, G439D
- 67
- A72V, D320V, T335I, D346A, T393A, P436S
- 68
- Q1L, G4C, A72C, S193P, Q349K, V482I
- 69
- G4C, A72C, D320V, Q349K, G443D, L492Q
- 70
- Q1L, G4C, A72C, DV152-K159, D181N, E183K, Q349R
- 71
- Q1L, G4C, A72C, Q349K
- 72
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234L, V313I, Q349R, H468R
- 73
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, I200N, Q349R
- 74
- G4C, A72C, N194K, T243Y, Q349R, A375N
- 75
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, Q349K, H468L
- 76
- G4C, E65V, A72C, G349R
- 77
- D320V, Q349K
- 78
- Q1L, G4C, A72C, S311G, Q349K, H468R
- 79
- G4C, A72C, T243Q, Q349R, Y374P, A375M
- 80
- Q1L, G4C, A72C, D320V, Q349R
- 81
- Q1L, G4C, T15S, A72C, Y244F, Q349K
- 82
- G4C, A72C, E183K, D346E, Q349R
- 83
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, T392M
- Numero consecutivo
- Patrón de mutación con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 84
- G4C, A72C, D202N, S311N, Q349R, N493D
- 85
- G4C, A72C, N194D, T243A, Q349R, Y374P, A375Y
- 86
- G4C, A72C, N194Y, T243V, Q349R, Y374P
- 87
- Q1L, G4C, A72C, Q349R
- 88
- G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D202N, H203R, S311N, D320I, A340G, D346A, Q349K, T393A, Y422F, P442S, R446S, H468L, V482A
- 89
- G4C, A72C, D202N, Q349R
- 90
- G4C, A72C, P224L, Q349R
- 91
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T229M, A340T, Q349R, V491I
- 92
- Q1L, G4C, A72C, D181N, Q349R
- 93
- G4C, A72C, D320V, D346V, Q349K
- 94
- Q1L, G4C, A72C, V152A, Q349K
- 95
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, Q349K
- 96
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, Y422F
- 97
- G4C, A72C, D202V, D320V, Q349K
- 98
- Q1L, G4C, A72C, Y155S, D181N, E183K, Q349R
- 99
- Q1L, G4C, A72C, D181N, D247N, Q349K
- 100
- Q1L, G4C, A68T, A72C, Q349K, G439D, R453S
- 101
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, H468R
- 102
- G1L, G4C, D64N, A72C, Q349K
- 103
- G4C, A72C, E183K, Q349R, P464L
- 104
- G4C, A72C, D181N, P224L, Q349K
- 105
- G4C, A72C, N194I, T243Y, Q349R, Y374P, A375R
- 106
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, P462L
- 107
- Q1L, G4C, A72C, E183K, Q349R
- 108
- G4C, A72C, S311G, Q349R
- 109
- Q1L, G4C, A72C, S311N, Q349K, G463D
- 110
- Q1L, G4C, A72C, S86T, Q349R
- 111
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, G231D, Q349R
- 112
- Q1L, G4C, A72C, S89N, D181N, E183K, Q349R
- Numero consecutivo
- Patrón de mutación con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 113
- Q1L, G4C, E65K, A72C, Q349K
- 114
- Q1L, Q2P, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, S192L, D202N, H203R, S311D, D320I, T335I, D346G, Q349K, T392M, Y422F, R446G
- 115
- Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
- 116
- G4C, A72C, E183K, D202Y, N310D, Q349R
- 117
- G4C, A72C, N194I, T243D, Q349R, Y374P, A375Y
- 118
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, G349R, T456I
- 119
- G4C, Q28R, A72C, S86T, E183K, P224L, S311N, N318Y, T335I, D346G, Q349R, T393I, P441A, P442S, R446G, H468L, V482I
- 120
- Q1L, G4C, A72C, D181N, Q349K, T451S
- 121
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T243I, N246D, Q349R, T488I
- 122
- Q1L, G4C, G23N, A72C, D110G, I116V, L119I, D181N, E183K, D211G, D293R, N310D, Q349R, Q362R, G363P, M364S
- 123
- G439V, N440E, P441S, P442Q
- 124
- G431D, S431V, T433E, G434S, N435Q
- 125
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320i, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
- 126
- Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, Q349R, T393S
- 127
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, S485T
- 128
- Q1L, G4C, G23N, A72C, V84A, D110G, D111H, I116E, F117Y, K118A, D181N, E183K, D293R, T295S, Q349R, M364L
- 129
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, R453K
- 130
- Q1L, G4C, A72C, A145T, H203R, Q349K, T403K
- 131
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, N445S
- 132
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234I, Q349R
- 133
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T465S
- 134
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T297N, Q349R
- 135
- Q1L, G4C, A72C, S311G, Q349K
- 136
- G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, E183K, S192I, H203R, S311N, D346E, Q349K, T392M, T393A, Y422F, N445D, R446S
- 137
- Q1L, G4C, A72C, D202N, Q349K, G486D
- Numero consecutivo
- Patrón de mutación con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 138
- Q1L, G4C, A72C, S99T, D181N, E183K, Q349R, T450I
- 139
- Q1L, G4C, A72C, I200F, Q349K, L500I
- 140
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, G434S
- 141
- Q1L, G4C, A31S, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 142
- Q1L, G4C, Q28L, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 143
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, P436S
- 144
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T233S, Q349R
- 145
- Q1L, G4C, A72C, D202N, Q349K
- 146
- Q1L, G4C, A68T, A72C, Q349K
- 147
- Q1L, G4C, A21T, A72C, D181N, E183K, Q349R, P454S
- 148
- Q1L, G4C, A72C, D346V, G349K
- 149
- Q1L, G4C, Y47F, A72C, D181N, E183K, Q349R, P436S, S461R
- 150
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234T, Q349R
- 151
- Q1L, G4C, A72C, N157S, D181N, E183K, Q349R
- 152
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 153
- G4C, A72C, N194Q, T243V, Q349H, Y374P, A375Y
- 154
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, I314F, Q349R, N445D
- 155
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, T392K
- 156
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T451A
- 157
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234V, Q349R
- 158
- Q1L, G4C, A21S, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 159
- Q1L, GAC, A72C, D181N, E183K, Q349R, N493D
- 160
- Q1L, G4C, A72C, S311N, Q349K
- 161
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183V, D228N, S311N, N318Y, D346E, Q349R, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
- 162
- G4C, A72C, N194C, Q349R, Y374C
- 163
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, A455V
- 164
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T400S
- 165
- Q1L, G4C, T26I, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 166
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N310D, Q349R, T392S, G463D
Nun
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
Q1L, G4C, A72C, D129N, D181N, E183K, Q190L, G266S, I276V, Q349R, P386L, F427Y
Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, D202N, Q349R
Q1L, G4C, A72C, Y155C, D181N, E183K, Q349R
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D3201, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P454PATAAA, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N246K, Q349R
G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, D202I, H203R, S311D, D320N, D346V, Q349R, T392M, T393A, Y422F, P442S, H468Q, V482A
Q1L, G4C, A72C, Y155C, Q349K
Q1L G4C, A68T, A72C, D181N, E183K, Q349R
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, Y47F, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T448A, R453G, H468L, P480S, V482I
Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, S192L, D202N, H203R, S311D, D320I, T335I, D346G, Q349K, T392M, Y422F, R446G
Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, D320V, Q349R
G4C, Q28K, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320N, D346A, Q349R, T392M, T393I, P442S, H468L, V482I
Q1L, Q2P, G4C, Q28R, W40R, E65K, A72C, D181N, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G, D320I, D343A, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, D202I, P224L, D320N, D346V, Q349K, T392M, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183K, D202V, S311G, N318Y, D320I, D346G, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446S, H468Q, V482T
Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, D181N, E183K, S192P, D202N, P224L, S311D, N318Y, D320V, D346G, Q349K, T392M, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, E65V, A72C, D181N, E183K, P224L, S311G, D320N, D346G, Q349R, T392M, T393I, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G151GCGRSG, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, E65M, A72C, D181N, E183M, D202Y, P224L, S311D, N318Y, D320I, T335I, D346A, Q349K, T392M, T393I, N445D, R446G, T448A, H468Q, V482A
Q1L, G4C, G23A, A72C, D110S, D111H, I116V, F117Y, K118A, L120M, D181N, E183K, D293H, G294A, N310E, Q349R, Q362G, M364S
Nun
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T421I, G439D
G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, V152A, D181N, E183V, S192L, D202N, S311N, D320N, D346E, Q349R, T387A, T392M, T393I, Y422F, P442S, R446S, H468L, G476D, V482I
Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, E183V, G188C, S192T, D202Y, H203R, P224L, S311N, D320V, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, T335I, D346G, Q349K, T392M, T393A, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H46BL, P480S, V482I
G4C, W40R, A72C
Q1L, G4C, W40R, E65K, A72C, S86T, E183K, S192L, D202Y, P224L, D320I, D346E, Q349R, P442S, R446G, H468R, V482T
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, P480S, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P464PTHAAA, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, S24T, T27Q, Q28R, N29T, V41T, G46S, Y47S, T52D, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28K, W40R, E65V, A72C, D181N, E183V, S192P, D202V, H203R, S311G, D320N, D346E, Q349K, T392M, T393A, Y422F, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G139S, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, W40R, A72C, S192L, D202N, H203R, P224L, S311N, D320I, T335I, D346V, Q349R, T393I, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, E183M, D202N, P224L, T229S, S311G, D320I, T335I, D346V, Q349R, T393V, H468Q, V482A
Nun
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S68T, E183M, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, D202N, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
T243C, A375C, N194C, Y374C
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, E183M, S311G, D346V, Q349R, T392M, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, S478Y, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, E183K, D202N, P224L, S311G, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, L120P, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, E183M, S311N, N318H, D320V, D346V, Q349K, T392M, T393A, R446S, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D202N, H203R, S311G, T335I, D346V, Q349K, T393A, P442S, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, D202N, H203R, P224L, S311D, D346G, Q349K, P442S, R446S, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, L120P, D181N, E183M, D202N, D247N, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, Y422F, N445D, R446G, T451S, G463V, H468Q, V482T, S485T
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183V, S192T, D202N, S311G, D320V, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, H468R, V482A
Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, D320V, D346E, Q349R, T393I, P442S, R446G, H468R, V482I
Q1L, G4C, Q28R, V41T, G46S, Y47S, T52D, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Nun
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
Q1L, G4C, Q28R, W40R, A72C, S86T, D181N, S192T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349K, T392M, T393I, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, T229M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28K, W40R, A72C, S86T, D181N, E183M, S192I, D202Y, T299S, S311N, N318Y, D320I, D346V, Q349R, T393I, P442S, H468L
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T448A, R453G, H468L, P480S, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, G463V, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28R, W40R, E65V, A72C, S86T, S192T, D202V, H203R, S311N, N318Y, D346A, Q349K, T392M, T393A, Y422F, P442S, N445D, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, G434GAAATG, P442S, N445D, R446G,
T457TAAATT, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, H203R, P224L, S311G, D320V, D346G, Q349K, T392M, T393I, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183M, S311G, N31BY, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V4821
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183K, D2021, P224L, S311G, D320I, Q349K, T393V, P442S, N445D, R446S, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28K, A72C, S86T, D181N, E183V, S192T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346G, Q349R, T392M, Y422F, P442S, N445D, R446S, H468L, V482A
G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, S192L, D202N, H203R, P224L, S311D, D346E, Q349R, T392M, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, P462L, H468L, V482T
Nun
243
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260
261
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, D202N, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349R, T393V, N417Y, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, W40R, E65V, A72C, D202Y, H203R, P224L, T299I, N318Y, D320V, D346A, Q349K, T392M, T393A, P442S, N445D, R446G, H468R, V482T
G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346G, Q349K, T392M, Y422F, R446G, H468Q
Q1L, G4C, Q28K, A72C, S86T, E183K, S311G, D320V, D346A, Q349R, T392M, T393I, Y422F, P442S, R446S, H468Q
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, P224L, S311N, D320N, T335I, D346E, Q349K, T392M, Y422F, N445D, R446S, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, D181N, S192T, D202N, H203R, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346G, Q349K, T392M, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, Q28R, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D346A, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, T280A, S311G, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, D404N, Y422F, N445D, R446G, P462L, G463V, H468Q, V482I, S485T
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183M, D202N, S311D, D320V, T335I, D346G, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, H468L, V482I,
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, P224L, S311N, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Nun
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279
280
G4C, E65K, A72C, S86T, E183M, D202I, P224L, S311N, N318Y, D320N, T335I, D346V, Q349R, T393V, Y422F, P442S, R446S, H468L
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D202N, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, E65V, A72C, D181N, E183K, D202G, Q349R
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, F306L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183K, S192P, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349R, T392M, T393I, Y422F, P442S, H468Q
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E163M, H203R, S311D, D320V, T335I, D346E, Q349R, T393A, N445D, R446G, H468Q, V482A
Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, E183V, D202I, H203R, P224L, S311D, D320V, D346V, Q349R, T392M, T393I, N445D, H468L
Q1L, G4C, Q28K, W40R, E65K, A72C, S86T, D181N, E183K, S192L, D202I, H203R, S311N, D320N, D346V, Q349K, T392M, T393A, Y422F, N445D, R446S
G4C, E65V, A72C, S86T, Y155H, D181N, E183V, Q190K, P224L, S311N, D320V, D346V, Q349K, T392M, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, S311D, N318Y, D320N, T335I, D346A, Q349R, T392M, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D181N, D202N, S311G, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, D202N, S311N, N318Y, D320I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, S24T, T27Q, Q28R, N29T, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q
Nun
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299
300
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183K, D202Y, S311G, D320N, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311N, D320I, T335I, A340S, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, H203R, P224L, S311D, D320I, D346E, Q349R, T392M, Y422F, R446G, H468L
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28K, N29Y, E65K, A72C, D181N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, D202N, S311N, N318Y, D320N, T335I, D346A, Q349K, T392M, T393V, P442S, N445D, R446G, H468Q
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183V, S192T, D202N, S311G, D320V, D346A, Q349K, T393V, P442S, N445D, H468L, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, S24T, Q28R, E65K, A72C, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I, D346G, Q349K, T393I, R446G, H468Q
Nun
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Q1L, G4C, Q28K, A72C, D181N, D202I, S311D, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T392M, Y422F, R446G, H468L
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320N, D346E, Q349K, T393V, Y422F, T433S, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, D202N, S311G, N318Y, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, E183M, D202N, D320I, T335I, D346A, Q349K, T392M, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, H468Q, V482I
Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183V, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, H468R, V482A
Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, E65K, A72C, S86T, D202V, S311N, D320V, T335I, D346V, Q349R, T392M, Y422F, N445D, R446G, H468L
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, E183M, S192T, D202N, H203R, P224L, S311N, T335I, D346V, Q349R, T392M, T393V, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482A
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, D202N, S311N, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I, S485T
G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
G434GAAATG, T457TAAATT, Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Nun
320
321
322
323
324
325
326
327
328
329
330
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333
334
335
336
337
338
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, P224L, S311G, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, E183M, D202N, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, P224L, S311N, N318Y, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S90F, D181N, P224L, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
G4C, Q28R, A72C, S86T, D181N, E183V, S192L, D202V, N246S, S311D, N318Y, D320V, D346A, Q349K, T393V, P442S, N445D, H468L, V482A
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, E183M, S192L, H203R, S311D, D320V, T335I, D346V, Q349K, N445D, H468Q, V482A
Q1L, G4C, Q28R, T59M, E65K, A68T, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, H203R, S311D, D320V, T335I, Q349R, T393A, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, K355Q, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T448A, R453G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, E65M, A72C, E183M, D202I, P224L, S311D, N318Y, D320V, T335I, D346A, Q349K, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I
Nun
339
340
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354
355
356
357
Q1L, G4C, E65V, A72C, D181N, E183M, S192T, P224L, S311G, D320V, T3351, D346G, Q349K, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202F, S311G, N318Y, T335I, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349R, T392M, T3931, Y422F, N445D, R446G, H468R
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, S311N, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V4821
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, S311N, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, E183M, P224L, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, T229M, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, P480S, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, E183M, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, D404N, Y422F, P442S, N445D, R446G, T451S, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P462L, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, T280A, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Nun
358
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371
372
373
374
375
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, A455AAAAPA, H468L, V482I
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, E183M, S311G, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, S311G, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, S24C, Q28R, G30A, E65V, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, P480S, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D3201, D346E, Q349K, T393V, P402S, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, D202N, P224L, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A72C, Y155C, D181N, D202N, P224L, M234T, S311G, D320I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D202N, P224L, S311D, D320N, T335I, D346V, Q349K, T392M, T393V, Y422F, P442S, R446S, H468L
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183K, D202N, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, E183V, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, H468R, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Nun
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393
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, E183M, D202N, S311G, N318Y, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P454PVRPQP, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, E183V, S192M, D202N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346E, Q349R, T393V, Y422F, P442S, R446G, H468L, P480S
Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I, D345E, D346A, Q349K, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, H505Q
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, P224L, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482i
Q1L, G4C, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, T448A, R453G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K92R, L120P, D181N, E183M, D202N, S236F, T280A, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, P402S, D404N, Y422F, N445D, R446G, T451S, G463V, H468Q, V482I, S485T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, S236F, S311G, T335I, D346E, Q349K, T387S, T393V, Y422F, N445D, R446G, G463V, H468Q, V482I, S485T
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183K, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, D202N, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, T448A, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, S311G, T335I, D346A, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, D247N, S311G, D320I, D346E, Q349K, T387S, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, P224L, S311G, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, S236F, S311N, N318I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, D404N, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V4821
Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K118Q, D181N, E183M, D202N, D247N, I277V, S311G, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28R, G30A, E65V, A72C, Y155C, D181N, E183M, D202N, M234T, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, T448A, R453G, H468Q, V482T
Nun
394
395
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397
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399
400
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406
407
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409
410
Q1L, G4C, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K92R, D181N, D202N, D247N, I277V, S311G, N318D, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, Y422F, N445D, R446G, G463V, H468Q, V482I
Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, D202N, S236F, I277V, S311G, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, Y422F, N445D, R446G, G463V, H468Q, V482I
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T387S, T393V, Y422F, N445D, R446G, P462L, H468Q, V482T, S485T
Q1L, G4C, A21T, Q28R, G30A, E65V, A72C, Y155C, D181N, E183M, D202N, M234T, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D3201, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
Q1L, G4C, T26I, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, M234T, S311G, D320I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, E183K, S192L, D202N, D320N, T335I, D346A, Q349R, T393A, Y422F, P442S, R446G, H468R, V482A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S236F, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, T26I, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, D202N, M234T, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A72C, Y155C, D181N, E183M, D202N, P224L, M234T, S311G, D320I, T335I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, T448A, R453G, H468Q, P480S, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D202I, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I, D346A, Q349R, T392M, T393A, N445D, R446G, H468L
Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183V, D202I, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, A72C, K92R, D181N, E183M, D202N, S311G, D346E, Q349K, T387S, T393V, Y422F, N445D, R446G, T451S, P462L, H468Q, V482T
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, T335I, (DeleciónS437-P441), D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Nun
411
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427
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P454PVRPQP, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P464THAAA, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P464PTHAAA, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, G151GCGRSG, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P454ATAAA, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, E65K, A72C, E183M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65M, A72C, S86T, E183M, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65M, A72C, E183M, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65K, A72C, S311N, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F, (Deleción en G439-G444), N445D, R446G, H468Q, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, N29Y, E65K, A72C, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Nun
428
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445
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, Y47F, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, N445D, R446G, T448A, R453G, H468L, P480S, V482I, Y422F, P442S
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E163K, D202V, P224L, S311G, D320V, D346E, Q349R, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159CGRNKE183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, Q28R, E65K, A72C, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65M, A72C, E183K, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, (S437-P441), N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P454PVRPQP, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P464THAAA, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P454PATAAA, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, G434GAAATG, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I, Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P454ATAAA, H468L, V482I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S311N, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F, (DG439-G444)N445D, R446G, H468Q, V482I
Nun
446
447
448
449
450
451
452
453
454
455
456
457
458
459
460
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, Y47F, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, N445D, R446G, T448A, R453G, H468L, P480S, V482I, Y422F, P442S
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, D181N, Q190K, D202N, T229M, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, T448A, H468Q, V482I
Q1L, G4C, N10D, T27S, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, D202N, S236F, I277V, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, D404N, N417Y, Y422F, N445D, R446G, P462L, H468Q, V482I, S485T
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, T229M, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, N10D, T27S, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, D247N, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, T26I, Q28R, G30A, E65V, A72C, Y155C, D181N, D202N, T229M, G231D, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, T448A, R453G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, S24R, T26I, Q28R, G30A, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311N, T335I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
Q1L, G4C, N10D, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, E183M, D202N, S236F, D247N, I277V, S311N, T335I, D346E, Q349K, T387S, T393V, N417Y, Y422F, T433S, N445D, R446G, P462L, H468Q, V482I
Q1L, G4C, A21T, Q28R, E65V, A72C, Y155C, D181N, D202N, P224L, S311G, N318Y, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, T448A, H468Q, V482I
Q1L, G4C, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, D202N, P224L, M234T, S311N, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, T448A, R453G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, D202N, P224L, T229M, M234T, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, P224L, S236F, D247N, F306L, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T393V, D404N, N417Y, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I, S485T
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, S236F, D247N, S311G, N318I, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T393V, Y422F, T433S, N445D, R446G, T451S, G463V, H468Q, V482I
G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, G151GCGRSG, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
- Numero consecutivo
- Patrón de mutación con respecto a la SEQ ID NO: 2
- 461
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, K159KCGRNK, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
- 462
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, G151GCGRSG, K159KCGRNK, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I
- 463
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, G151GCGRSG, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
- 464
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, K159KCGRNK, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
- 465
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, G151GCGRSG, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, G434GAAATG, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
- 466
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, K159KCGRNK, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, G434GAAATG, P442S, N445D, R446G, T457TAAATT, H468L, V482I
- 467
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, G151GCGRSG, K159KCGRNK, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, G434GAAATG, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I, T457TAAATT,
- 468
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
- 469
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, S192L, D202V, S311G, D320I, D346V, Q349R, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I
- 470
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311N, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T
- 471
- Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, D181N, E183M, D202N, T229M, S311G, A340S, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T
En un aspecto, adicional la presente invención divulga un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención. El ácido nucleico es una secuencia de polinucleótidos (ADN o ARN) que, cuando se establece bajo control de un promotor apropiado y se transfiere a un anfitrión biológico o entorno químico adecuados, es procesado 5 con el polipéptido codificado, por lo que el proceso también incluye todas las etapas necesarias después de la traducción y después de la transcripción. La secuencia codificante se puede adaptar fácilmente por la variación de tripletes de base degenerados, alteración de las secuencias de señal, o por introducción de intrones, sin afectar a las propiedades moleculares de la proteína codificada. El ácido nucleico de la presente invención tiene preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 97%, y lo más preferiblemente 100% de identidad con la SEQ ID NO:
10 1. La presente invención proporciona también un vector que comprende este ácido nucleico y un anfitrión
transformado con dicho vector.
La presente invención divulga también procedimientos para la producción de polipéptidos de la presente invención y variantes de los mismos en varias células anfitrionas, incluyendo levadura y anfitriones fúngicos. También se divulga el uso de las cepas resultantes para la mejora de las propiedades de las proteínas por variación de la secuencia.
15 Además, la presente invención divulga procedimientos para la aplicación de tales polipéptidos en la hidrólisis de celulosa.
Otro aspecto de la divulgación describe vectores y procedimientos para la producción de las variantes de las proteínas de la SEQ ID NO: 2, expresándolas en levadura y probando su actividad sobre el material celulósico midiendo las moléculas de monómeros y/u oligómeros de azúcar liberadas
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La presente invención se refiere además a un procedimiento de producir una proteína celobiohidrolasa, que comprende las etapas:
a. obtención de una célula anfitriona, que se ha transformado con un vector que comprende el ácido nucleico de la presente invención;
b. cultivo de la célula anfitriona en condiciones bajo las cuales se expresa la proteína celobiohidrolasa; y
c. recuperación de la proteína celobiohidrolasa.
En una realización particular, este procedimiento de producir una proteína celobiohidrolasa se limita a un procedimiento para la producción de una proteína celobiohidrolasa según lo proporcionado por esta invención, tal como tener el valor IT50 dado anteriormente, y/o ser una de las variantes específicas de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 5 según se estipula en esta aplicación y se describe en detalle en otras partes de esta memoria descriptiva.
En una realización más preferida, la célula anfitriona se deriva del grupo que consiste en Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Candida y Yarrowina. La célula anfitriona es preferiblemente capaz de producir etanol, en donde las levaduras más preferidas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, o una levadura metilotrófica, preferiblemente derivada del grupo de células anfitrionas que comprenden Pichia methanolica, Pichi pastoris, Pichia angusta y Hansenula polymorpha.
Sorprendentemente, se ha encontrado que el polipéptido según la presente invención y las variantes del mismo se puede expresar a partir de levadura a niveles altos. "Levadura" se referirá en el presente documento a todos los organismos eucariotas inferiores que muestren un estado vegetativo unicelular en su ciclo de vida. Esto incluye especialmente organismos de la clase Saccharomycetes, en particular del género Saccharomyces, Pachysolen, Pichia, Candida, Yarrowina, Debaromyces, Klyveromyces y Zygosaccharomyces.
Así, un aspecto de la divulgación se refiere a la expresión del polipéptido reivindicado y variantes de éste en levadura. La expresión eficiente de esta proteína de fusión (SEQ ID NO: 2) y las variantes de las proteínas derivadas de la SEQ ID NO: 2 a partir de levadura se puede lograr por inserción de la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 partiendo de la posición de nucleótido 1 en un vector de expresión bajo control de al menos una secuencia promotora apropiada y fusión de la molécula del nucleótido con un péptido de señal apropiado, por ejemplo, con el péptido de señal del factor alfa de apareamiento de Saccharomyces cerevisiae.
En una realización preferida, el polipéptido de la presente invención y las variantes de éste se expresan y secretan a un nivel de más de 100 mg/l, más preferiblemente de más de 200 mg/l, de forma particularmente preferible de más de 500 mg/l, o lo más preferiblemente de más de 1 g/l en el sobrenadante después de la introducción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia del aminoácido con identidad de secuencia de al menos 85% con la SEQ ID nO: 2 en una levadura. Para determinar el nivel de expresión en levadura, el cultivo y el aislamiento del sobrenadante puede llevarse a cabo como se describe en el Ejemplo 3.
En otro aspecto, la invención divulga procedimientos para la producción de un polipéptido según la presente invención en un hongo filamentoso, preferiblemente en un hongo del género Aspergillus o Trichoderma, más preferiblemente en un hongo del género Trichoderma, lo más preferiblemente en Trichoderma reesei. "Hongos filamentosos" u "hongos" se referirá, en el presente documento, a todos los organismos eucariotas inferiores que muestran crecimiento de la hifa durante al menos un estado en su ciclo de vida. Esto incluye especialmente los organismos del filum Ascomycota y Basidiomycota, en particular del género Trichoderma, Talaromyces, Aspergillus, Penicillium, Chrysosporium, Phanerochaete, Thermoascus, Agaricus, Pleutrus e Irpex. El polipéptido se expresa por fusión de la región codificante de una secuencia de señal compatible con la molécula de ácido nucleico partiendo de la posición del nucleótido 52 de la SEQ ID NO: 3, como se hizo en la SEQ ID NO: 3 con la secuencia de señal de CBHI Trichoderma reesei, y el posicionamiento del péptido de fusión bajo control de un promotor suficientemente fuerte seguido por la transferencia de la construcción genética a la célula anfitriona. En la técnica se han descrito ejemplos de tales promotores y secuencias de señal, así como las técnicas para una transferencia eficiente.
En otro aspecto, la presente divulgación se relaciona además con un procedimiento para identificar un polipéptido o polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa, que comprende las etapas de:
a. Generación de una biblioteca de genes mutantes que codifican proteínas mutantes por mutagénesis de un ácido nucleico según la reivindicación 9 o un ácido nucleico que tiene la secuencia definida por la SEQ ID NO: 6 (que codifica la SEQ ID NO: 5), que tiene preferiblemente la secuencia definida por la SEQ ID NO: 1;
b. Inserción de cada gen mutante en un vector de expresión;
c. Transformación de las células de levadura con cada vector de expresión para proporcionar una biblioteca de transformantes de levadura;
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d. Cultivo de cada transformante de levadura en condiciones bajo las cuales se expresa y secreta la proteína mutada;
e. Incubación de la proteína mutante expresada con un sustrato;
f. Determinación de la actividad catalítica de la proteína mutada;
g. Selección de una proteína mutante según la actividad catalítica determinada.
En concreto, la etapa d. puede realizarse utilizando un formato de placa de pocillos. Este formato permite preferentemente el alto rendimiento de producción del procedimiento de identificación de polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa.
En una realización preferida, este procedimiento para identificar polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa se limita a un procedimiento, en donde el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa es uno o más polipéptidos según lo proporcionado por esta invención, tal como tener el valor IT50 indicado anteriormente, y/o ser una de las variantes específicas de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 5 como se indica a continuación.
Preferiblemente, las etapas de la e. a la g. del procedimiento para identificar polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa se realizan de la siguiente manera:
e. Incubar la proteína mutante expresada con el material celulósico;
f. Determinar la cantidad de azúcar liberado;
g. Seleccionar una proteína mutante según la cantidad de azúcar liberado.
En otra realización, el procedimiento para identificar polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa comprende las etapas adicionales de:
h. Secuenciar el gen o proteína mutante seleccionada;
i. Identificar la modificación o modificaciones de aminoácidos comparando la secuencia de la proteína mutante seleccionada con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
En una realización particular, el procedimiento se caracteriza además por medir el valor IT50 del polipéptido obtenido. El valor IT50 puede medirse como se describe en los ejemplos siguientes. Opcionalmente, esto puede ser seguido por una etapa de selección de los polipéptidos, que muestran el valor IT50 deseado, tal como al menos 60°C, al menos 62°C y similares. Así, en esta realización particular, el procedimiento es adecuado para identificar polipéptidos que exhiben actividad celobiohidrolasa y un valor IT50 elevado, es decir, polipéptidos termoestables con actividad celobiohidrolasa.
La presente divulgación proporciona además un procedimiento de preparación de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, que comprende las etapas:
a. Proporcionar un polipéptido que tenga actividad celobiohidrolasa que comprenda una secuencia amino que tenga una identidad de secuencia de al menos un 54% con el dominio catalítico de la SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 5) (tal como preferiblemente, al menos 60%, al menos 62%, al menos 64%, al menos 66%, al menos 68% o al menos 70%, por lo que al menos el 68% o al menos el 70% son las realizaciones más preferidas);
b. Identificar los aminoácidos de este polipéptido que corresponden a los aminoácidos que se modifican con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, como se identifica en la etapa i. del procedimiento de identificación de polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa; y
c. Preparación de un polipéptido mutante del polipéptido proporcionado en la etapa a. llevando a cabo la modificación o modificaciones de aminoácidos identificados en la etapa b. a través de mutagénesis dirigida al sitio.
En una realización, preferiblemente, el polipéptido proporcionado en la etapa a. del procedimiento de preparación de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa es una celobiohidrolasa de tipo salvaje derivada de Trichoderma reesei.
La presente invención proporciona además polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa, que pueden obtenerse por el procedimiento de preparar un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa según la presente invención.
Además, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido y/o sus variantes de la presente invención y una o más celulasas, p. ej., una o más endoglucanasas y/o una o más beta-glucosidasas y/o una o más celobiohidrolasas adicionales y/o una o más xilanasas. "Celulasas" o "enzimas celulolíticas" se definen
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como enzimas capaces de hidrolizar sustratos o derivados celulósicos o materias primas mixtas que comprenden polímeros celulósicos. Tales enzimas se refieren como de tener "actividad celulolítica", siendo así siendo capaces de hidrolizar las moléculas de celulosa de tal material en oligo- o monosacáridos más pequeños. Las enzimas celulolíticas incluyen celulasas y hemicelulasas, en particular incluyen celobiohidrolasas (CBH), endoglucanasas (EG) y beta-glucosidasas (BGL).
La presente invención proporciona además un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98%, incluso más preferiblemente al menos 99%, y lo más preferiblemente 99,6% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5. Particularmente, se prefiere que un polipéptido de este tipo es un polipéptido en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5 se modifican por sustitución o por deleción de: Q1, Q2, G4, A6, T7, A8, N10, P12, T15, A21, G23, S24, T26, T27, Q28, N29, G30, A31, V32, N37, W40, V41, G46, Y47, T48, N49, C50, T52, N54, D57, T59, Y60, D64, E65, A68, Q69, A72, V84, S86, S89, S90, K92, S99, Q109, D110, D111, I116, F117, K118, L119, L120, D129, V130, G139, A145, M146, V152, K154, Y155, N157, N158, K159, K163, G167, Q172, F179, I180, D181, E183, E187, G188, Q190, S192, S193, N194, I200, D202, H203, D211, V212, A221, P224, D228, T229, G231, T233, M234, S236, T243, Y244, S245, N246, D247, G251, F260, G266, K275, I276, I277, T280, L290, D293, G294, T295, T297, T299, S301, K304, F306, N310, S311, V313, I314, N318, D320, I321, T325, N327, T335, A340, F341, D343, T344, D345, D346, Q349, H350, A354, K355, A358, Q361, Q362, G363, M364, V367, D373, Y374, A375, A376, P386, T387, D390, T392, T393, P394 , T400, P402, T403, D404, D410, N417, S418, T421, Y422 y/o una o más inserciones después de las posiciones G151 y K159.
En una realización preferida, el polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5. Así, el polipéptido dado en la SEQ ID NO: 5 puede, por medio del ejemplo, ser modificado como sigue: Q1L, G4, A6G/V, T15S, Q28Q/R, W40R, D64N, E65K/V, A72V, S86T, K92K/R, V130I/V, V152A/E, Y155C, K159E, D181N, E183V/K, N194C/R/Y/D/K/I/L/G/Q/S/V, D202Y/N/G, P224L, T243I/R/Y/A/F/Q/P/D/V/W/L/M, Y244F/H, I277V, K304R, N310D, S311G/N, N318Y, D320V/E/N, T335I, T344M, D346G/A/E/V, Q349R/K, A358E, Y374C/P/R/H/S/A, A375D/N/Y/R/Q/L/V/E/G/T/M, T392C/D/K, T393A, D410G e Y422F.
Más preferiblemente, el polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 5, como se indica en la Tabla 3 siguiente. Como se ha dicho anteriormente, para las modificaciones específicas de la SEQ ID NO: 2, se pueden combinar entre sí dos o más de estas modificaciones específicas, tal como preferiblemente dos o más de las modificaciones más preferidas o de las más preferidas pueden combinarse entre sí, y lo que es particularmente preferido, pueden combinarse entre sí dos o más de las más preferidas modificaciones según la Tabla 3.
Tabla 3: Mutaciones con respecto a la SEQ ID NO: 5
- Posición
- Preferidas Más preferidas Las más preferidas
- Q1
- L L L
- Q2
- P, S P, S S
- G4
- C C C
- A6
- G, L, V G, L, V L
- T7
- Q Q Q
- A8
- S S S
- N10
- T, D T, D T, D
- P12
- Q
- T15
- S
- A21
- S, T, C S, T, C
- G23
- A, D, N
- S24
- T, C, N T, C, N
- Posición
- Preferidas Más preferidas
- T26
- I, N I, N
- T27
- S, Q S, Q
- Q28
- L, K, R, N L, K, R, N
- N29
- T, Y T, Y
- G30
- A A
- A31
- S
- V32
- G
- N37
- S
- W40
- R R
- V41
- T
- G46
- S
- Y47
- S, F S, F
- T48
- A
- N49
- S
- C50
- S
- T52
- D
- N54
- S
- D57
- S
- T59
- M
- Y60
- H
- D64
- N N
- E65
- V, M, K V, M, K
- A68
- T T
- Q69
- K, R K, R
- A72
- V, C V, C
- V84
- A
- S86
- T T
- S89
- N
- S90
- T, F
- K92
- R R
- S99
- T
Las más preferidas
K, R
V, M, K
C
T
- Posición
- Preferidas Más preferidas Las más preferidas
- Q109
- R
- D110
- G, S, N
- D111
- H, E
- I116
- V, K, E
- F117
- Y
- K118
- A, T, Q A, T, Q
- L119
- L, I
- L120
- P, M
- D129
- N
- V130
- I
- G139
- S
- A145
- T
- M146
- C
- G151
- GCGRSG GCGRSG GCGRSG
- V152
- A, E
- K154
- R
- Y155
- S, C, H S, C, H
- N157
- S
- N158
- D
- K159
- E, KCGRNK KCGRNK KCGRNK
- K163
- C
- G167
- C
- Q172
- Q
- F179
- I
- I180
- N
- D181
- N N N
- E183
- V, M, K V, M, K V, M, K
- E187
- K
- G188
- C
- Q190
- L, K L, K
- S192
- L, I, P, T, M L, I, P, T, M
- Posición
- Preferid
- S193
- L, 1- CL
- N194
- G, L, I,
- I200
- N, F
- D202
- G, I, V,
- H203
- R
- D211
- G
- V212
- L
- A221
- V
- P224
- L
- D228
- N
- T229
- A, S, M
- G231
- D
- T233
- S
- M234
- L, I, V, T
- S236
- F, Y
- T243
- G, A, L,
- Y244
- H, F
- S245
- T
- N246
- S, K, D
- D247
- N
- G251
- R
- F260
- C
- G266
- S
- K275
- E
- I276
- V
- I277
- V
- T280
- A
- L290
- H
- D293
- R, H
- G294
- A
- T295
- S
Más preferidas
G, L, I, V, S, C, K, R, D, Q, Y
G, I, V, N, F, Y R
A, S, M D
L, I, V, T, K F, Y
L
N
Las más preferidas
G, I, V, N, F, Y
L
- Posición
- Preferidas Más preferidas Las más preferidas
- T297
- N
- T299
- I, S
- S301
- C
- K304
- R
- F306
- L, Y
- N310
- D, E
- S311
- G, D, N G, D, N G, D, N
- V313
- I
- I314
- F
- N318
- I, H, D, Y I, H, D, Y I, D, Y
- D320
- I, V, E, N I, V, E, N I, V, N
- I321
- N
- T325
- A, I
- N327
- Y
- T335
- I I I
- A340
- G, S, T G, S, T
- F341
- C
- D343
- A
- T344
- M M
- D345
- E
- D346
- G, A, V, E G, A, V, E G, A, V, E
- Q349
- K, R K, R K, R
- H350
- Y
- A354
- T
- K355
- Q Q
- A358
- E
- Q361
- R
- Q362
- G, R, H
- G363
- P
- M364
- L, S
- V367
- A
- Posición
- Preferidas Más preferidas Las más preferidas
- D373
- E
- Y374
- A, P, S, C, R, H, D A, P, S, C, R, H, D
- A375
- G, L, V, T, C, M, R, D, E, N, Q, Y G, L, V, T, C, M, R, D, E, N, Q, Y
- A376
- T
- P386
- L, S
- T387
- A, S A, S
- D390
- G, E G, E
- T392
- S, M, K S, M, K M
- T393
- A, I, V, S A, I, V, S A, I, V
- P394
- C
- T400
- S
- P402
- S
- T403
- K
- D404
- N
- D410
- G
- N417
- Y
- S418
- P
- T421
- I
- Y422
- F F F
Particularmente, se prefiere un polipéptido como el anteriormente definido, caracterizado además por comprender una modificación de la SEQ ID NO: 5, que es una modificación específica como se indica en la Tabla 3A siguiente. Cada uno de estos polipéptidos define una versión mutada del polipéptido dado en la SEQ ID NO: 5.
5 Tabla 3a: Mutantes específicos con respecto a la SEQ ID NO: 5:
- Número del mutante
- Mutantes con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 1
- G4C, A72C, Q349K
- 2
- G4C, A72C, T344M, Q349K
- 3
- G4C, A72C, T344M, D346G, Q349R
- 4
- G4C, A72C, D320V, Q349K
- 5
- G4C, A72C, P224L, F306Y, Q349R
- 6
- G4C, A72C
- 7
- A72V, D346A, T393A
- Número del mutante
- Mutantes con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 8
- G4C, A72C, Q349R
- 9
- G4C, W40R, A72C, T344M, Q349K
- 10
- A72V, D320V, D346A
- 11
- G4C, A72C, N194Y, T243L, Q349R, Y374S, A375R
- 12
- G4C, E65V, A72C, Y244H, Q349R
- 13
- G4C, A72C, D202G, D320N, Q349R, A358E
- 14
- G4C, A72C, D320V, Q349R
- 15
- G4C, A72C, Q349K, S86T
- 16
- A72V, T335I, D346A, T393A
- 17
- G4C, A72C, E183V, K304R, Q349K
- 18
- G4C, A72C, T243G, Q349R, Y374P, A375M
- 19
- G4C, A72C, N194V, T243M, Q349R, Y374A, A375T
- 20
- G4C, D64N, A72C, Q349R, A358E
- 21
- G4C, A72C, Q349K, Q28R, S193T
- 22
- G4C, A72C, E183K, Q349K
- 23
- G4C, A72C, S311N, Q349K
- 24
- G4C, A72C, N194K, Q349R, Y374P, A375Q
- 25
- G4C, A72C, D181N, Q349K
- 26
- W40R, D320V, Q349K, T393A
- 27
- W40R, T335I, D346A, T393A
- 28
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N327Y, Q349R
- 29
- A72C, T335I, Q349R
- 30
- G4C, A72C, N194K, T243P, Q349R, Y374H, A375E
- 31
- G4C, A72V, Q349R, P462del
- 32
- G4C, A72C, S236Y, Q349R
- 33
- G4C, A72C, S311G, Q349K
- 34
- A72V, D320V, T335I, D346A, T393A
- 35
- G4C, A72C, S86T, M234V, Q349K
- 36
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, D181N, E183M, P224L, S311G, D320f, D346E, Q349K, T393V, Y422F
- Número del mutante
- Mutantes con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 37
- G4C, A72C, G251R, Q349R
- 38
- G4C, A72C, Q349K, D320V
- 39
- G4C, A72C, E183K, Q349R
- 40
- Q1L, G4C, A72C, H203R, Q349K
- 41
- G4C, W40R, A72C, Q349K
- 42
- G4C, A72C, Q349R, V367A
- 43
- Q1L, G4C, A6V, C50S, A72C, I180N, D181N, E183K, Q349R
- 44
- G4C, A72C, S311G, D320V, Q349K
- 45
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T243S, Q349R, P386S
- 46
- Q1L, G4C, A72C, K154R, Q349K, T393I
- 47
- G4C, A72C, N194G, T243F, Q349R, Y374P, A375R
- 48
- A72V, D320V, D346A, T393A
- 49
- A72C, Q349K
- 50
- G4C, A72C, E183V, Q349K
- 51
- G4C, A72C, E183K, N318Y, Q349K
- 52
- W40R, A221V
- 53
- G4C, A72C, K92R, Q349K
- 54
- Q1L, G4C, A72C, S90T, D181N, E183K, Q349R
- 55
- G4C, A72C, Q349R, Y422F
- 56
- G4C, T48A, A72C, Q349R
- 57
- E187K, D320V
- 58
- G4C, S24N, E65K, A72C, Q349R
- 59
- Q1L, G4C, A72C, S193P, Q349K
- 60
- Q1L, G4C, A72C, delV152-K159, D181N, E183K, Q349R
- 61
- Q1L, G4C, A72C, Q349K
- 62
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234L, V313I, Q349R
- 63
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, I200N, Q349R
- 64
- G4C, A72C, N194K, T243Y, Q349R, A375N
- 65
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, Q349K
- Número del mutante
- Mutantes con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 66
- G4C, E65V, A72C, Q349R
- 67
- D320V, Q349K
- 68
- Q1L, G4C, A72C, S311G, Q349K
- 69
- G4C, A72C, T243Q, Q349R, Y374P, A375M
- 70
- Q1L, G4C, A72C, D320V, Q349R
- 71
- Q1L, G4C, T15S, A72C, Y244F, Q349K
- 72
- G4C, A72C, E183K, D346E, Q349R
- 73
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, T392M
- 74
- G4C, A72C, D202N, S311N, Q349R
- 75
- G4C, A72C, N194D, T243A, Q349R, Y374P, A375Y
- 76
- G4C, A72C, N194Y, T243V, Q349R, Y374P
- 77
- Q1L, G4C, A72C, Q349R
- 78
- G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D202N, H203R, S311N, D320I, A340G, D346A, Q349K, T393A, Y422F
- 79
- G4C, A72C, D202N, Q349R
- 80
- G4C, A72C, P224L, Q349R
- 81
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T229M, A340T, Q349R
- 82
- Q1L, G4C, A72C, D181N, Q349R
- 83
- G4C, A72C, D320V, D346V, Q349K
- 84
- Q1L, G4C, A72C, V152A, Q349K
- 85
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, Y422F
- 86
- G4C, A72C, D202V, D320V, Q349K
- 87
- Q1L, G4C, A72C, Y155S, D181N, E183K, Q349R
- 88
- Q1L, G4C, A72C, D181N, D247N, Q349K
- 89
- Q1L, G4C, A68T, A72C, Q349K
- 90
- Q1L, G4C, D64N, A72C, Q349K
- 91
- G4C, A72C, D181N, P224L, Q349K
- 92
- G4C, A72C, N194I, T243Y, Q349R, Y374P, A375R
- 93
- Q1L, G4C, A72C, E183K, Q349R
- 94
- G4C, A72C, S311G, Q349R
- Número del mutante
- Mutantes con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 95
- Q1L, G4C, A72C, S311N, Q349K
- 96
- Q1L, G4C, A72C, S86T, Q349R
- 97
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, G231D, Q349R
- 98
- Q1L, G4C, A72C, S89N, D181N, E183K, Q349R
- 99
- Q1L, G4C, E65K, A72C, Q349K
- 100
- Q1L, Q2P, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, S192L, D202N, H203R, S311D, D320I, T335I, D346G, Q349K, T392M, Y422F
- 101
- Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
- 102
- G4C, A72C, E183K, D202Y, N310D, Q349R
- 103
- G4C, A72C, N1941, T243D, Q349R, Y374P, A375Y
- 104
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 105
- G4C, Q28R, A72C, S86T, E183K, P224L, S311N, N318Y, T335I, D346G, Q349R, T393I
- 106
- Q1L, G4C, A72C, D181N, Q349K
- 107
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T243I, N246D, Q349R
- 108
- Q1L, G4C, G23N, A72C, D110G, I116V, L119I, D181N, E183K, D211G, D293R, N310D, Q349R, Q362R, G363P, M364S
- 109
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
- 110
- Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, Q349R, T393S
- 111
- Q1L, G4C, G23N, A72C, V84A, D110G, D111H, I116E, F117Y, K118A, D181N, E183K, D293R, T295S, Q349H, M364L
- 112
- Q1L, G4C, A72C, A145T, H203R, Q349K, T403K
- 113
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234I, Q349R
- 114
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T297N, Q349R
- 115
- G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, E183K, S192I, H203R, S311N, D346E, Q349K, T392M, T393A, Y422F
- 116
- Q1L, G4C, A72C, D202N, Q349K
- 117
- Q1L, G4C, A72C, S99T, D181N, E183K, Q349R
- 118
- Q1L, G4C, A72C, I200F, G349K
- 119
- Q1L, G4C, A31S, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 120
- Q1L, G4C, Q28L, A72C; D181N, E183K, Q349R
- Número del mutante
- Mutantes con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 121
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T233S, Q349R
- 122
- Q1L, G4C, A21T, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 123
- Q1L, G4C, A72C, D346V, Q349K
- 124
- Q1L, G4C, Y47F, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 125
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234T, Q349R
- 126
- Q1L, G4C, A72C, N157S, D181N, E183K, Q349R
- 127
- G4C, A72C, N194Q, T243V, Q349R, Y374P, A375Y
- 128
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, 1314F, Q349R
- 129
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, T392K
- 130
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234V, Q349R
- 131
- Q1L, G4C, A21S, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 132
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183V, D228N, S311N, N318Y, D346E, Q349R, Y422F
- 133
- G4C, A72C, N194C, Q349R, Y374C
- 134
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T400S
- 135
- Q1L, G4C, T26I, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 136
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N310D, Q349R, T392S
- 137
- Q1L, G4C, A72C, D129N, D181N, E183K, Q190L, G266S, I276V, Q349R, P386L
- 138
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, D202N, Q349R
- 139
- Q1L, G4C, A72C, Y155C, D181N, E183K, Q349R
- 140
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
- 141
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N246K, Q349R
- 142
- G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, D202I, H203R, S311D, D320N, D346V, Q349R, T392M, T393A, Y422F
- 143
- Q1L, G4C, A72C, Y155C, Q349K
- 144
- Q1L, G4C, A68T, A72C, D181N, E183K, Q349R
- 145
- Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, Y47F, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F
- 146
- Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, S192L, D202N, H203R, S311D, D320I, T335I, D346G, Q349K, T392M, Y422F
Nún
147
148
149
150
151
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159
160
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162
163
164
165
166
167
G4C, Q28K, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320N, D346A, Q349R,
T392M, T393I
Q1L, Q2P, G4C, Q28R, W40R, E65K, A72C, D181N, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G, D320I, D343A, D346A, Q349K
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, D202I, P224L, D320N, D346V, Q349K, T392M,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183K, D202V, S311G, N318Y, D320I, D346G,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, D181N, E183K, S192P, D202N, P224L, S311D, N318Y,
D320V, D346G, Q349K, T392M
Q1L, G4C, E65V, A72C, D181N, E183K, P224L, S311G, D320N, D346G, Q349R, T392M,
T393I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G151GCGRSG, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, E65M, A72C, D181N, E183M, D202Y, P224L, S311D, N318Y, D320I, T335I,
D346A, Q349K, T392M, T393I
Q1L, G4C, G23A, A72C, D110S, D111H, I116V, F117Y, K118A, L120M, D181N, E183K, D293H, G294A, N310E, Q349R, Q362G, M364S
Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T421I
G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, V152A, D181N, E183V, S192L, D202N, S311N, D320N, D346E, Q349R, T387A, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, E183V, G188C, S192T, D202Y, H203R, P224L, S311N, D320V, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, T335I, D346G, Q349K, T392M,
T393A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, A340S, D346E,
Q349K, D390E, T393V, Y422F
G4C, W40R, A72C
Q1L, G4C, W40R, E65K, A72C, S86T, E183K, S192L, D202Y, P224L, D320I, D346E,
Q349R
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, S24T, T27Q, Q28R, N29T, V41T, G46S, Y47S, T52D, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K,
T392M, T393I, Y422F
Nún
168
169
170
171
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181
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185
186
187
188
189
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, W40R, E65V, A72C, D181N, E183V, S192P, D202V, H203R, S311G, D320N, D346E, Q349K, T392M, T393A, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G139S, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T3351, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, S311N, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, W40R, A72C, S192L, D202N, H203R, P224L, S311N, D320I, T335I, D346V,
Q349R, T393I
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, E183M, D202N, P224L, T229S, S311G, D320I, T335I,
D346V, Q349R, T393V
Q1L, G4C, Q28R, G30A, E65M, A72C, D181N, D202N, P224L, S311D, N318Y, D346E,
Q349K, T392M, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S68T, E183M, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, D202N, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
T243C, A375C, N194C, Y374C
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, E183M, S311G, D346V, Q349R, T392M, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, S311N, N318Y, D320I, T335I,
D346E, Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, E183K, D202N, P224L, S311G, T335I, D346A,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, L120P, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, E183M, S311N, N318H, D320V, D346V, Q349K,
T392M, T393A
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D202N, H203R, S311G, T335I, D346V, Q349K, T393A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, D202N, H203R, P224L, S311D, D346G, Q349K
Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, L120P, D181N, E183M, D202N, D247N, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, Y422F
Nún
190
191
192
193
194
195
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201
202
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205
206
207
208
209
Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, D320V, D346E,
Q349R, T393I
Q1L, G4C, Q28N, E65K, A72C, D181N, E183M, D202N, H203R, S311G, N318Y, D320N,
Q349R, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, V41T, G46S, Y47S, T52D, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, W40R, A72C, S86T, D181N, S192T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349K, T392M, T393I
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, T229M, S311G, N318Y, D3201, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, W40R, A72C, S86T, D181N, E183M, S192I, D202Y,
T299S, S311N, N318Y, D320I, D346V, Q349R, T393I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28H, W40R, E65V, A72C, S86T, S192T, D202V, H203R, S311N, N318Y, D346A, Q349K, T392M, T393A, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, H203R, P224L, S311G, D320V, D346G, Q349K,
T392M, T393I
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183M, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183K, D202I, P224L, S311G, D320I, Q349K, T393V
Q1L, G4C, Q28K, A72C, S86T, D181N, E183V, S192T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346G, Q349R, T392M, Y422F
G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, S192L, D202N, H203R, P224L, S311D, D346E, Q349R, T392M, T393A, Y422F
Q1L, G4C, W40R, E65K, A72C, G109R, D181N, E183M, S192I, D202I, H203R, S245T,
D346A, Q349R, T393A, Y422F
Nún
210
211
212
213
214
215
216
217
218
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222
223
224
225
226
227
228
229
230
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, D202N, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393I,
Y422F
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349R, T393V, N417Y, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, W40R, E65V, A72C, D202Y, H203R, P224L, T299I, N318Y, D320V,
D346A, Q349K, T392M, T393A
G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346G,
Q349K, T392M, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, A72C, S86T, E183K, S311G, D320V, D346A, Q349R, T392M, T393I,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, P224L, S311N, D320N, T335I, D346E, Q349K,
T392M, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, D181N, S192T, D202N, H203R, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346G, Q349K, T392M, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, Q28R, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D346A,
Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, T280A, S311G, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, D404N, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, E183M, D202N, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K,
T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183M, D202N, S311D, D320V, T335I, D346G,
Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, P224L, S311N, D320I, T335I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
G4C, E65K, A72C, S86T, E183M, D202I, P224L, S311N, N318Y, D320N, T335I, D346V,
Q349R, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D202N, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F
Nún
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
247
248
249
250
251
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, P224L, S311G, D3201, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, F306L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, D346A,
Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183K, S192P, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349R, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, H203R, S311D, D320V, T335I, D346E,
Q349R, T393A
Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, E183V, D202I, H203R, P224L, S311D, D320V, D346V,
Q349R, T392M, T393I
Q1L, G4C, Q28K, W40R, E65K, A72C, S86T, D181N, E183K, S192L, D202I, H203R, S311N, D320N, D346V, Q349K, T392M, T393A, Y422F
G4C, E65V, A72C, S86T, Y155H, D181N, E183V, Q190K, P224L, S311N, D320V, D346V,
Q349K, T392M, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, S311D, N318Y, D320N, T335I, D346A, Q349R, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D181N, D202N, S311G, D346E, Q349K, T393I,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, D202N, S311N, N318Y, D320I, D346E, Q349K,
T393I, Y422F
Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, S24T, T27Q, Q28R, N29T, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D202N, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K,
T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Nún
252
253
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255
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268
269
270
271
Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183K, D202Y, S311G, D320N, T335I, D346A, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311N, D320I, T335I, A340S, D346A, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, H203R, P224L, S311D, D320I,
D346E, Q349R, T392M, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, N29Y, E65K, A72C, D181N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, D202N, S311N, N318Y, D320N, T335I, D346A, Q349K, T392M, T393V
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, S311G, N318Y, T335I,
D346E, Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183V, S192T, D202N, S311G, D320V, D346A, Q349K,
T393V
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, S24T, Q28R, E65K, A72C, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393I,
Y422F
G1L, G4C, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I,
D346G, Q349K, T393I
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K,
T392M, T393I, Y422F
G1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D346A, Q349K,
T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, E183V, S192I, D202V, D320I, T335I, D346V, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, A72C, D181N, D202I, S311D, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T392M,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320N, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
Nún
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276
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288
289
290
291
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, E183M, D202N, D320I, T335I, D346A, Q349K,
T392M, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E,
Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183V, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G, N318Y,
D320V, D346A, Q349K
Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, E65K, A72C, S86T, D202V, S311N, D320V, T335I, D346V, Q349R, T392M,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, E183M, S192T, D202N, H203R, P224L, S311N, T335I,
D346V, Q349R, T392M, T393V
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, D202N, S311N, D346A, Q349K, T393I, Y422F
G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, T3351, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
G434GAAATG, T457TAAATT, Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, D202Y, P224L, S311N, D346A, Q349K,
T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, D202N, P224L, S311G, D320I,
D346E, Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, P224L, S311G, T335I, D346A,
Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, E183M, D202N, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Nún
292
293
294
295
296
297
298
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303
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306
307
308
309
310
311
G4C, Q28R, A72C, S86T, D181N, E183V, S192L, D202V, N246S, S311D, N318Y, D320V,
D346A, Q349K, T393V
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346A, Q349K, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, E183M, S192L, H203R, S311D, D320V, T335I, D346V,
Q349K
Q1L, G4C, Q28R, T59M, E65K, A68T, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, H203R, S311D, D320V, T335I, Q349R, T393A
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K,
K355Q, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, N318Y, T3351, D346A,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, S311N, N318Y, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, E65M, A72C, E183M, D202I, P224L, S311D, N318Y, D320V, T335I, D346A,
Q349K, T393A, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, S311G, N318Y, D346A, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, S24T, T27Q, Q28R, N29T, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, E65V, A72C, D181N, E183M, S192T, P224L, S311G, D320V, T335I, D346G,
Q349K, T393A, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202F, S311G, N318Y, T335I, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349R, T392M, T393I, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, S311N, D320I, T335I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Nún
312
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327
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329
330
331
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, E183M, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K,
T393V, D404N, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, T280A, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, K275E, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, E183K, D202N, P224L, S311N, D320I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K,
T393I, Y422F
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, E183M, S311G, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, S311G, D346E, Q349K, T393I,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, S24C, Q28R, G30A, E65V, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K,
T393V, P402S, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, D202N, P224L, S311N, N318Y, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A72C, Y155C, D181N, D202N, P224L, M234T, S311G, D320I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F
Nún
332
333
334
335
336
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348
349
350
351
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183K, D202N, S311G, N318Y, D320I, D346A,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, E183V, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G,
N318Y, D320V, D346A, Q349K
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K118Q, D181N, E183M, P224L, D247N, S311G, D320I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311N, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, E183M, D202N, S311G, N318Y, D346A, Q349K,
T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F, P454PVRPQP
Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, E183V, S192M, D202N, P224L, S311D, N318Y, D320N,
D346E, Q349R, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I, D345E, D346A, Q349K, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, P224L, S311G, N318Y, D3201,
D346A, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K92R, L120P, D181N, E183M, D202N, S236F, T280A, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, P402S, D404N, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, S236F, S311G, T335I, D346E, Q349K,
T387S, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183K, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, D202N, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, S311G, T335I, D346A, Q349K, T393I,
Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, D247N, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T387S, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, S236F, S311N, N318I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, D404N, Y422F
Nún
352
353
354
355
356
357
358
359
360
361
362
363
364
365
366
367
368
369
370
371
Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K118Q, D181N, E183M, D202N, D247N, I277V, S311G, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K92R, D181N, D202N, D247N, I277V, S311G, N318D, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, Y422F
Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, D202N, S236F, I277V, S311G, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, Y422F
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T387S, T393V, Y422F
Q1L, G4C, A21T, Q28R, G30A, E65V, A72C, Y155C, D181N, E183M, D202N, M234T, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K,
T393V, Y422F, T457TAAATT
Q1L, G4C, T26I, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, M234T, S311G, D320I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422 F
Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, E183K, S192L, D202N, D320N, T335I, D346A,
Q349R, T393A, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S236F, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, T26I, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, D202N, M234T, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A72C, Y155C, D181N, E183M, D202N, P224L, M234T, S311G, D320I, T335I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D202I, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I, D346A,
Q349R, T392M, T393A
Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183V, D202I, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346A,
Q349K
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, A72C, K92R, D181N, E183M, D202N, S311G, D346E,
Q349K, T387S, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K92R, D181N, E183M, P224L, I277V, S311G, D320I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, G151GCGRSG, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Nún
372
373
374
375
376
377
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385
386
387
388
389
390
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, E65K, A72C, E183M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65M, A72C, S86T, E183M, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65M, A72C, E183M, S311G, N318Y, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65K, A72C, S311N, N318Y, D346E, Q349K,
T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, N29Y, E65K, A72C, S311G, T335I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, Y47F, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E,
Q349K, D390E, T393V, Y422F
Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, D202V, P224L, S311G, D320V, D346E, Q349R,
T393A, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159CGRNKE183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, Q28R, E65K, A72C, D202N, S311G, T335I,
D346E, Q349K, T393I, Y422F
Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28R, E65M, A72C, E183K, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, T335I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Nún
391
392
393
394
395
396
397
398
399
400
401
402
403
404
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406
407
408
409
410
Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G151GCGRSG, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E,
Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, Y47F, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V,
Y422F
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, D181N, Q190K, D202N, T229M, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F
Q1L, G4C, N10D, T27S, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, D202N, S236F, I277V, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, D404N, N417Y, Y422F
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, T229M, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, N10D, T27S, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, D247N, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, T26I, Q28R, G30A, E65V, A72C, Y155C, D181N, D202N, T229M, G231D, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, S24R, T26I, Q28R, G30A, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311N, T335I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F
Q1L, G4C, N10D, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, E183M, D202N, S236F, D247N, I277V, S311N, T335I, D346E, Q349K, T387S, T393V, N417Y, Y422F
Q1L, G4C, A21T, Q28R, E65V, A72C, Y155C, D181N, D202N, P224L, S311G, N318Y, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F
Q1L, G4C, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, D202N, P224L, M234T, S311N, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, D202N, P224L, T229M, M234T, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, P224L, S236F, D247N, F306L, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T393V, D404N, N417Y, Y422F
Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, S236F, D247N, S311G, N318I, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T393V, Y422F
G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, G151GCGRSG, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, K159KCGRNK, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I,
D346E, Q349K, T393V, Y422F
G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, G151GCGRSG, K159KCGRNK, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F
5
10
15
20
25
30
35
- Número del mutante
- Mutantes con respecto a la SEQ ID NO: 5
- 411
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, S192L, D202V, S311G, D320I, D346V, Q349R, T393A, Y422F
- 412
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311N, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F
- 413
- Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, D181N, E183M, D202N, T229M, S311G, A340S, D346E, Q349K, T393V, Y422F
Además, la presente divulgación proporciona un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de al menos 85%, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98%, incluso más preferiblemente al menos 99%, y lo más preferiblemente 100% con la SEQ ID NO: 12 en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 12 se modifiquen mediante sustitución o deleción: Q1, S2, P12, T15, S21, G23, T26, Q28, T29, G30, V32, N37, W40, T48, C50, N54, L60, E65, K69, V84, S90, D114, E119, F120, T121, L122, L123, D132, V133, G142, S148, M149, V155, Y158, N161, T162, K166, G170, Q175, F182, I183, G191, I203, D214, I215, A224, T231, G234, I237, S248, G254, W263, G269, L282, T285, G298, Y303, N307, G308, T310, E317, L318, S322, N324, G340, S341, D345, S357, M360, V363, D369, A372, P382, S388, T389, P390, T399, S400, Q406, N413, F423, P425, I426,
G427, T429, P432, G435, N436, P437, G439, N441, R442, T444, T445, T446, T447, R449, P450, A451, T452, T453,
S456, S457, P458, G463, P464, S467, H459, C468, G470, G472, S474, P476, V478, C479, S481, G482, T484, V487, L488, N489, Y491, Y492, Q494, C495, L496. Preferiblemente, este polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 54%, preferiblemente al menos 56%, más preferiblemente al menos 58%, de forma particularmente preferible al menos el 60%, tal como al menos el 62%, en particular al
menos el 64%, tal como al menos el 66%, y más preferiblemente al menos el 68% con la SEQ ID NO: 5. Este
polipéptido también se encuentra preferiblemente dentro de la realización como se ha definido anteriormente, en donde el polipéptido es estable a la temperatura, es decir, tiene un alto valor IT50, tal como se define anteriormente, por ejemplo 62°C o más, como se ha descrito anteriormente (para más realizaciones, véase anteriormente, en relación con la definición de variantes de la SEQ ID NO: 5). La persona experta reconocerá que la SEQ ID NO: 12 tiene aproximadamente el 68% de identidad con la SEQ ID NO: 5. Por lo tanto, un polipéptido derivado del polipéptido definido por la SEQ ID NO: 12, que se diferencia del polipéptido definido por la sEq ID NO: 12, por ejemplo, por intercambio de un aminoácido por otro, como Q1A, por ejemplo, es un polipéptido que también tiene un grado significativo de identidad con la SEQ ID NO: 5, es decir, al menos el 66% o más, como se ha definido anteriormente. Así, la persona experta puede reconocer fácilmente el concepto inventivo común de esta invención, en particular al tomar en consideración la estabilidad a la temperatura de los polipéptidos de esta invención.
En una realización preferida, el polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEQ ID NO: 12, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos se modifican por la substitución o deleción: Q1, S2, P12, T15, S21, G23, T26, Q28, T29, G30, V32, N37, W40, T48, C50, N54, L60, E65, K69, V84, S90, D114, E119, F120, T121, L122, L123, D132, V133, G142, S148, M149, V155, Y158, N161, T162 , K166, G170, Q175, F182, I183, G191, I203, D214, I215, A224, T231, G234, I237, S248, G254, W263, G269, L282, T285, G298, Y303, N307, G308, T310, E317, L318, S322, N324, G340, S341, D345, S357, M360, V363, D369, A372, P382, S388, T389, P390, T399, S400, Q406, N413, F423, P425, I426, G427, T429, P432, G435, N436, P437, G439, N441, R442, T444, T445, T446, T447, R449, P450, A451, T452, T453, S456, S457, P458, G463, P464, S467, H459, C468, G470, G472, S474, P476, V478, C479, S481, G482, T484, V487, L488, N489, Y491, Y492, Q494, C495, L496
- Intercambio con respecto a la SEQ ID NO: 12
- 1
- Q1L
- 2
- T15S
- 3
- Q28R
- 4
- W40R
- 5
- C72V
- Intercambio con respecto a la SEQ ID NO: 12
- 6
- V133I
- 7
- V155A,E
- 8
- Y158C
- 9
- T162E
- 10
- Y247F,H
- 11
- N307D
- 12
- G308N
- 13
- E317V,N
- 14
- S341M
- 15
- D345R,K
- 16
- Y370P,R,H,S,A
- 17
- T389A
- 18
- Q406G
- 19
- N441D
- 20
- R442S,G
- 21
- T452A
- 22
- S456L,P
- 23
- P458L,del
- 24
- G459D
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- H464L,Q,R
- 26
- V478A,I
Otro aspecto de la invención se refiere a la aplicación de los polipéptidos aislados y sus variantes de la presente invención para la hidrólisis completa o parcial de material celulósico. El material celulósico puede ser de naturaleza natural, procesada o artificial. "Material celulósico" se definirá en el presente documento como todos los tipos de 5 material puro, no puro, mixto, mezclado o compuesto de otro modo que contenga al menos una fracción de polímeros D-glucosilo ligados en p-1,4 de al menos 7 subunidades consecutivas. Los ejemplos prominentes de materiales celulósicos son todo tipo de materiales vegetales que contienen celulosa como madera (blanda y dura), paja, granos, hierba elefante, heno, hojas, algodón y materiales procesados desde allí o de corrientes residuales derivadas de tales procesos. El material celulósico utilizado en una reacción enzimática se conoce también en el 10 presente documento como sustrato celulósico.
La hidrólisis del material celulósico puede ser un proceso secuencial después de la producción celobiohidrolasa o contemporáneo con la producción en célula de levadura (bioproceso consolidado). La expresión de enzimas celulolíticas en levadura es de especial interés debido a la capacidad de muchas levaduras para fermentar los azúcares liberados (C6 o C5) a etanol u otros metabolitos de interés.
15 Otra realización de la divulgación se relaciona así con la aplicación de células enteras que expresan el polipéptido o variante del mismo según la presente invención para el procesamiento de materiales celulósicos.
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En una realización particular, la presente invención divulga el uso de un polipéptido y variantes del mismo o la composición de la presente invención para la degradación enzimática de material celulósico, preferiblemente biomasa lignocelulósica, y/o para el procesamiento de textiles y/o como ingrediente en detergentes y/o como ingrediente en alimentos o composiciones de piensos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación del plásmido de expresión de Pichia pastoris
Los plásmidos de expresión de la expresión constitutiva de proteína de las anfitrionas de Pichia pastoris transformadas se preparan mediante el montaje de una casete de expresión consistente en un promotor de la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa (GAP) de Pichia pastoris, un SPa Saccharomyces cerevisiae (péptido de señal del factor alfa de apareamiento), un sitio de clonación múltiple (MCS) y la secuencia terminadora 3'-GAp. Para los fines de la selección se utiliza un gen de resistencia a la kanamicina bajo control del promotor del promotor EM7 o TEF para los fines de selección bacteriana o de levadura, respectivamente. Los vectores plásmidos resultantes se designan como pV1 (Figura 1) y pV2 (MCS alternativa). La transformación y la expresión del cultivo se hacen esencialmente como se describe por Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz, P. J., Lair, S. V., Cregg, J. M. (1997). Isolation of the Pichia pastoris glyceraldeyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene, 186, 37-44 y Cregg, J.M.: Pichia Protocols in Methods in Molecular Biology, Second Edition, Humana Press, Totowa Nueva Jersey 2007.
Ejemplo 2: Construcción de las construcciones de expresión de Pichia pastoris para secuencias CBHI
Genes CBHI de Trichoderma viridis (CBH-f), Humicola grisea (CBH-d), Thermoascus aurantiacus (CBH-e), Talaromyces emersonii (CBH-b), y fusiones del dominio de unión a celulosa de CBHI Trichoderma reesei con CBHI Talaromyces emersonii (CBH-a) o CBHI Humicola grisea (CBH-g) se amplifican utilizando pares de oligonucleótidos y los moldes (obtenidos por síntesis génica) como se indica en la Tabla 4. El gene de fusión que codifica la SEQ ID NO: 2 se genera mediante PCR de extensión de superposición utilizando los fragmentos de PCR generados a partir de las SEQ ID NO: 5 y 11. La ADN polimerasa Phusion (Finnzymes) se utiliza para la amplificación de la PCR.
Tabla 4: Cebadores y moldes para la amplificación de CBH-a, CBH-b, CBH-d, CBH-e, CBH-f y CBH-g
- Fragmento Cebador directo Cebador inverso Molde
- CBH-f
- CBHI Trichoderma viride GAGGCGGAAGCACCC T CT caatctgcttgcaccttgca ote GGAGACGCAGAGCC Cttattacaggcactgcgagt agí SEQ ID NO: 13
- CBH-d
- CBHI Humicola grisea GAGGCGGAAGCACCC TCTcagcaggcíggtactatía ctgc GGAGACGCAGAGCC Cttacacgítcacggtagaac cgattgggc SEQ ID NO: 7
- CBH-e
- CBHI Thermoascus aurantiacus GAGGCGGAAGCACCC TCTcacg aggccggtaccgta accgc GGAGACGCAGAGCC CTT Attagttggcggtgaag gtcgagt SEQ ID NO: 9
- CBH-b
- CBHI Talaromyces emersonii GAGGCGGAAGCACCC TCTcagcaggccggcacggc gacggc GGAGACGCAGAGCC CTT Atcacgaagcggtgaa ggtcgagt SEQ ID NO: 5
- CBH-a parte 1
- Fragmento de fusión a CBH Talaromyces emersonii parte 1 GAGGCGGAAGCACCC TCTcagcaggccggcacggc gacggc ATT ACCT GTGCTACC gaícggaccaaacttaatgtíc g SEQ ID NO: 5
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- Fragmento Cebador directo Cebador inverso Molde
- CBH-a parte 2
- fragmento de fusión del dominio de unión a CBHI de Trichoderma reesei parte 2 AAGTTTGGTCCGATCg gtagcacaggtaatccttcagg GGAGACGCAGAGCC CTTATTAtagacactgíga gtagtaagggt SEQ ID NO: 11
- CBH-a
- Proteína de fusión a CBHI Talaromyces emersonii GAGGCGGAAGCACCC T CT cagcagg ccggcacggc gacggc GGAGACGCAGAGCC CTT Atcattaatggtggtggt gatgatgag 5a+5b SEQ ID NO: 2
- CBH-g parte 1
- Fragmento de fusión a CBHI de Humicola grisea parte 1 aggcggaagcatgctcgcagc aggcíggtacaattactgc ggattacctgttaagctíccaat tggtccgaatctgatgtt SEQ ID NO: 19
- CBH-g parte 2
- Fragmento de fusión del dominio de unión a CBHI de Trichoderma reesei parte 2 accaattggaagctlaacaggta atccttcaggíggtaatcc atcttgcaggtcg acttatcatt aatgatgatgatgatggtgtgc a SEQ ID NO: 11
- CBH-g
- Proteína de fusión Humicula grisea aggcggaagcatgctcgcagc aggcíggtacaattactgc atcttgcaggtcgacttatcati aatgatgatgatgatggtgtgc a 6a+6b SEQ ID NO: 15
Los fragmentos de la PCR de longitud prevista son purificados en geles de agarosa después de la electroforesis mediante el kit de PCR SV Promega® y de purificación en gel. La concentración de los fragmentos de ADN se mide en un espectrofotómetro y 0,2 pmol de fragmentos se tratan con 9U de la T4-ADN polimerasa en presencia de 2,5 mM dATp durante 37,5 min a 22,5°C y los fragmentos tratados son apareados con la T4-ADN-polimerasa/ADN del plásmido pV1 linealizado Smal tratado con dTTP y se transforman luego en células Top10 de Escherichia coli químicamente competentes. Desviado del procedimiento descrito, el producto generado por el par de cebadores según el carril 11 de la tabla que codifica los fragmentos de la proteína de fusión Humicula grísea se clonan a través del sitio Sphl y SalI introducido con pV2. Los transformantes son controlados por la secuenciación del AND plásmido aislado.
Ejemplo 3: Expresión de genes CBHI en Pichia pastoris
Los plásmidos del Ejemplo 2 se transforman en células CBS 7435 de Pichia pastoris electrocompetentes y transformantes se utilizan para inocular cultivos en medio YPD que contiene 200 mg/l, que se incuban durante 5 días a 27°C en un agitador rotativo a 250 rpm. Los sobrenadantes del cultivo se separaron por centrifugación a 5000 x g durante 30 minutos en una centrífuga Sorvall Avant. Los sobrenadantes se concentraron en columnas de centrifugación con un tamaño de corte de 10 kDa. Los patrones de las proteínas de tales sobrenadantes concentrados se analizaron por SDS-PAGE (Laemmli y col.) y los geles se tiñeron con tinte azul Coomassie coloidal. La actividad enzimática se determinó mediante incubación del sobrenadante con soluciones 2 mM de p-nitrofenil-p- D-lactósido o soluciones 200 pM de 4-metil-umbeliferil-p-D-lactósido en tampón de acetato sódico 50 mM (pH 5) durante 1 hora. La reacción se detuvo por adición de volúmenes iguales de solución de carbonato sódico 1 M y determinación del p-nitrofenol o de la 4-metil-umbeliferona liberados por medición de la absorbancia a 405 nm o la fluorescencia a 360 nm/450 nm de excitación/emisión.
Ejemplo 4: Integración del genoma y expresión de la secuencia de fusión de CBHI Talaromyces emersonii-CBHII T. reesei-CBD en Pichia pastoris
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Tabla 5
- Fragmento Cebador directo Cebador inverso Molde
- Fragmento de fusión CBH de Talaromyces emersonii parte 1 GAGGCGGAAGCACCCTCTc agcaggccggcacggcgacggc ATTACCTGTGCTACCg atcggaccaaacttaaigltcg SEQ ID NO: 5
- Fragmento de fusión del dominio de unión CBHI Trichoderma reesei con etiqueta 6x His parte 2 AAGTTTGGTCCGATCggtagc acaggtaatccftcagg GGAGACGCAGAGCC Cttatcattaatggtggtggtgat gatgag SEQ ID NO: 11
- Proteína de fusión CBHI de Talaromyces emersonii con etiqueta 6x His parte 2 GAGGCGGAAGCACOCTCTc ageaggccggcacggegacggc GGAGACGCAGAGCC Cttaicattaatgglggtggtgaí gatgag OE 1a+1b: SEQ ID NO: 17
Los fragmentos de ADN del gen de fusión son generados por la PCR de extensión de la superposición de 2 etapas utilizando los pares de oligonucleótidos y moldes sintéticos como se indica en la Tabla 4 (del Ejemplo 2). El fragmento de longitud completa tratado con T4-ADN polimerasa se apareó con el fragmento del pV3 lineal disminuyendo lentamente la temperatura de 75°C a 4°C. El plásmido pV3 contiene una fusión del péptido de señal del factor alfa de apareamiento con un sitio de clonación múltiple, situado aguas abajo de un promotor AOXI de Pichia pastoris. La transformación de la solución de apareamiento en células de E. coli químicamente competentes produce transformantes, que son seleccionados por su resistencia a Teocine verificada por contener plásmido de construcción esperada mediante análisis de restricción y secuenciación. Las preparaciones de plásmido pV3-CBH-a son linealizadas con SacI y aproximadamente 1 |jg de fragmentos lineales de DNA se transforman en células electrocompetentes de Pichia pastoris. Después, se comprueban 94 transformantes de placas YPD-Zeocin para expresión por cultivo en 500 jl de cultivos en placa de 96 pocillos profundos en medio BMMY que contiene 1% de metanol y 0,5% de metanol se alimentó cada 24 h durante 5 días (350 rpm/27°C; agitador orbital humidificado con 2,5 cm de amplitud. Los sobrenadantes se ensayan en cuanto a la actividad en 4-MUL y los clones con los niveles de expresión más altos se seleccionan y de nuevo se evalúan en las mismas condiciones.
Para la fermentación en un biorreactor Multifors de Infors se selecciona la cepa que produce la más alta concentración de enzima. Un pre-cultivo de YPD-Zeocin (100 g/l) se escoge para la inoculación de medio Mineral que consiste en tampón fosfato, sulfato y cloruro de magnesio, elementos traza/biotina y glicerol, con calibración del pH utilizando amoníaco y ácido fosfórico. Después del metabolismo de glicerol por lotes se mantuvo alimentación de glicerol adicional (2%) durante 1 día antes de que la alimentación sea cambiada a metanol para cambiar a condiciones inductivas para el promotor AOXI. En estas condiciones, la fermentación se mantiene durante 5 días. Las células son separadas del líquido de fermentación por centrifugación a 5000 * g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se analizan en cuanto a proteína total utilizando reactivo Bradford y estándares BSA (Biorad). SDS- PAGE/Tinción con azul brillante Coomassie se utiliza para analizar el patrón de la proteína en SDS-PAGE.
Ejemplo 5: Construcción de vector de expresión Trichoderma reesei
ADN del plásmido pSCMB100 digerido con Sbfl/Swal se transformó en SCF41 de Trichoderma reesei esencialmente según lo descrito por Penttila y col. 1997. Se utilizaron 10 jg de ADN lineal para la transformación de 107 protoplastos. La selección de transformantes se realizó por crecimiento de protoplastos en placas con medio Andreotti de Mandel con agar de recubrimiento, que contiene higromicina como agente selectivo (100 mg/l). Los transformantes se purificaron además por el paso sobre placas de medio de esporulación y re-selección de esporas en medio de higromicina. A partir de micelios reproducidos, se aisló ADN genómico y el episodio de sustitución se verificó por PCR. Los transformantes verificados de ser verdaderas cepas de sustitución se ensayaron además en cuanto a la secreción de proteína recombinante.
Ejemplo 6: Expresión de fusión de (CBH-ah) con la fusión de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei con etiqueta 6x His de Trichoderma reesei
Expresión de cepas de sustitución de CBHI recombinante de la fusión de CBHI Talaromyces emersom/CBD Trichoderma reesei con etiqueta 6x His en Q6A Trichoderma reesei (ATCC 13631) se realizó en cultivos de matraz agitado que contienen 40 ml de medio Mineral que contiene 2% de Avicel en matraces de 300 ml y cultivo a 30°C/250 rpm durante 6 días. Los sobrenadantes se recuperaron por centrifugación y se analizaron además por ensayos en SDS-PAGE y proteína de Bradford.
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Ejemplo 7: Cribado de variantes de termoestabilidad
Las bibliotecas de mutagénesis al azar del gen de la fusión (con etiqueta 6x His) de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei se generaron utilizando PCR propensa a errores aplicando tampones que contienen manganeso y concentraciones de dNTP no equilibradas en la mezcla de reacción de la ADN polimerasa Taq, usada para la amplificación por PCR, esencialmente según lo descrito por Craig y Joyce (R. Craig Cadwell y G.F. Joyce, 1995. Mutagenic PCR, in PCR Primer: a laboratory manual, ed. C. W. Dieffenbach y G. S. Dveksler, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, ME, 583-589). Como molde se escogieron el gen de fusión de tipo salvaje (SEQ ID NO: 17) o los mutantes del mismo. Los fragmentos de la PCR mutados se clonaron al plásmido pPKGMe utilizando endonucleasas SphI y HindIII y T4-ADN-ligasa.
Las bibliotecas de variantes del gen de fusión CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei (con etiqueta 6x His) se distribuyeron en placas de 1536 pocillos con el número de ocupación de pocillos cerca de 1. La enzima se expresó durante 7 días en un volumen de 4 pl de medio YPG-G418. Para la evaluación de las propiedades de las variantes se transfirieron muestras de 2 pl de sobrenadantes de cultivo a placas que contenían una suspensión de paja molida, tampón de acetato y beta-glucosidasa. Después de la incubación de las placas de reacción selladas durante 48 horas a temperaturas definidas, la concentración de glucosa se determinó utilizando Amplex rojo en presencia de GOX y HRP analizando el nivel de fluorescencia. Los resultados de mejor desempeño se volvieron a cultivar y a evaluar. Los plásmidos de las variantes CBH-ah confirmadas se recuperaron (Kit de ADN genómico de levadura ADNzol de Pierce) y se secuenciaron utilizando oligonucleótidos alfa-f (5-TACTATTGCCAGCATTGCTGC- 3') y oli740 (5-TCAGCTATTTCACATACAAATCG-3').
Ejemplo 8: Determinación de la capacidad de transformación del sustrato a diferentes temperaturas por indicación de la termoestabilidad de variantes CBH-ah utilizando 4-metilumbeliferil-p-D-lactósido (4-MUL)
Para la comparación exacta de la termoestabilidad, los sobrenadantes del cultivo que contienen las variantes celobiohidrolasa secretadas se diluyeron diez veces en el tampón de acetato de sodio (5o mM, pH 5) y muestras de 10 pl se incubaron con 90 pl de 4-MUL (en tampón) 200 pM en el gradiente de temperatura de un termociclador Eppendorff de gradiente. Un gradiente de temperatura de 20°C que alcanzaba de 55°C a 75°C se aplicó a 12 mezclas de reacción para cada muestra durante una hora. El perfil de temperatura se podía registrar después de la adición de 100 pl de solución de carbonato de sodio 1 M a cada reacción y medición de la intensidad de la fluorescencia a 360 nm/454 nm en un lector de placa M200 Infinite de Tecan. Para la comparación de la termoestabilidad, los valores se normalizaron entre 1 y 0 para el conteo máximo y mínimo de la fluorescencia (Figura 7).
Tabla 6: Lista de mutantes de la SEQ ID NO: 18 con valores de IT50 mejorados.
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 1
- wt 60,4 ± 0,6
- 2
- R446G 60,6
- 3
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, E183M, D202V, S311N, D320N, T335I, D346E, Q349R, P442S, N445D, R446G, H468Q 60,7
- 4
- D346G, R453G 60,9
- 5
- Y496F 60,9
- 6
- T335I, D346A, T393A, D410G 61
- 7
- T243I, T325A, V482A 61
- 8
- N194R, T243R, Y374D, A375D 61,1
- 9
- Q1L, G4C, Q28R, W40R, E65V, A72C, S86T, E183K, S192I, D202I, H203R, F260C, S311N, D320N, T335I, D346G, Q349K, T392M, P442S, R446G, H468L, V482A 61,1
- 10
- E65K 61,1
- 11
- T48A 61,2
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 12
- G4C, A72C, T344M 61,2
- 13
- T243R, A375D 61,3
- 14
- W40R, K159E, N445D 61,3
- 15
- T344M 61,3
- 16
- W40R, M234K 61,3
- 17
- Q349R, T393A, P436S, N445D 61,4
- 18
- Q349R, A354T, D373E, N445D 61,4
- 19
- G4C, W40R, A72C, T344M 61,4
- 20
- G4C, A72C, N194L, T243Y, Q349R, Y374R, A375L 61,5
- 21
- G4C, D64N, A72C, Q349K 61,5
- 22
- Q349R, N445D 61,5 ± 0,1
- 23
- W40R, T344M 61,5
- 24
- W40R, D346A, T393A 61,6
- 25
- N158D, G486S, Y495C 61,6
- 26
- D320E 61,6
- 27
- A72V 61,6
- 28
- E183V 61,6
- 29
- W40R, C489R 61,7
- 30
- A72V, T335I, D346A, T393A, N445D 61,7
- 31
- G4C, W40R, A72C, V313I, Q349R 61,8
- 32
- W40R, Q349K 61,9
- 33
- Q1L, G4C, T26N, A72C, D181N, E183K, Q349R 61,9
- 34
- G4C, A72C, Q349K, E65V, Q349R 61,9
- 35
- S311N 62
- 36
- D320V, D346A, Q349R, T393A, N445D 62,1
- 37
- T335I 62,2
- 38
- A72V, D346A 62,2
- 39
- D320V, D346A, T393A, N445D 62,2
- 40
- G4C, A72C, N194S, T243W, Q349R, Y374S, A375G 62,3
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 41
- E65V, Q349R 62,3
- 42
- Q1L, G4C, A72C, F179I, D181N, E183K, L290H, S301C, Q349R, Q361R, D390G, G474S, Q498K 62,3
- 43
- A72V, T335I, D346A, N445D 62,3
- 44
- G4C, A72C, N194L, T243Q, Q349R, Y374P, A375V 62,3
- 45
- Q1L, G4C, G23D, A72C, D111E, 1116V, K118A, D181N, E183K, V212L, Q349R, Q362G 62,3
- 46
- G4C, A72C, D346G 62,3
- 47
- W40R, T344M, Q349K 62,3
- 48
- G4C, Y163C 62,4
- 49
- G4C, V32G, N49S, A72C, S193L, Q349R 62,4
- 50
- A72V, Q349R, N445D 62,4 ± 0,4
- 51
- G4C, A72C, D346G, Q349R 62,5 ± 0,1
- 52
- Q1L, G4C, A72C, D181N, N, E183K, I321N, Q349R 62,6
- 53
- W40R, D320V, Q349K, P436S, N445D 62,7
- 54
- G4C, A72C, D181N, Q349R 62,7
- 55
- G4C, A72C, Q349K 62,7
- 56
- G4C, A72C, T344M, Q349K 62,8
- 57
- G4C, A72C, T344M, D346G, Q349R 62,8 ± 0,2
- 58
- G4C, A72C, D320V, Q349K 62,8
- 59
- G4C, A72C, P224L, F306Y, Q349R 62,9
- 60
- G4C, A72C 62,9 ± 0,6
- 61
- A72V, D346A, T393A 63
- 62
- G4C, A72C, Q349R, R446S, T456A 63
- 63
- G4C, W40R, A72C, T344M, Q349K
- 63
- 64
- A72V, D320V, D346A 63,1
- 65
- G4C, A72C, N194Y, T243L, Q349R, Y374S, A375R 63,1
- 66
- G4C, A72C, Q349K, T448A, T449A 63,2
- 67
- G4C, E65V, A72C, Y244H, Q349R 63,3
- 68
- G4C, A72C, D202G, D320N, Q349R, A358E 63,4
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 69
- G4C, A72C, D320V, Q349R 63,4
- 70
- G4C, A72C, Q349K, S86T 63,4
- 71
- A72V, T335I, D346A, T393A, P436S 63,4
- 72
- G4C, A72C, E183V, K304R, Q349K 63,5
- 73
- G4C, A72C, T243G, Q349R, Y374P, A375M 63,5
- 74
- G4C, A72C, Q349R, T465I 63,6
- 75
- G4C, A72C, Q349R 63,6 ± 0,5
- 76
- G4C, A72C, N194V, T243M, Q349R, Y374A, A375T 63,6
- 77
- G4C, D64N, A72C, Q349R, A358E, P464Q 63,6
- 78
- G4C, A72C, Q349K, Q28R, S193T, Q490L 63,6
- 79
- G4C, A72C, E183K, Q349K 63,6
- 80
- G4C, A72C, S311N, Q349K, A455T 63,6
- 81
- G4C, A72C, N194K, Q349R, Y374P, A375Q 63,6
- 82
- G4C, A72C, D181N, Q349K 63,6
- 83
- W40R, D320V, Q349K, T393A, N445D 63,7
- 84
- W40R, T335I, D346A, T393A 63,7
- 85
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N327Y, Q349R 63,7
- 86
- A72C, L119L, T335I, Q349R, G486D 63,7
- 87
- G4C, A72C, N194K, T243P, Q349R, Y374H, A375E 63,7
- 88
- G4C, A72V, Q349R, P462del 63,8
- 89
- G4C, A72C, S236Y, Q349R 63,8
- 90
- G4C, A72C, S311G, Q349K 63,8
- 91
- A72V, D320V, T335I, D346A, T393A, N445D 63,8
- 92
- G4C, A72C, S86T, M234V, Q349K 63,8
- 93
- Inserción en las posiciones K159 (CGRNK) y T457 (AAATT), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 63,9
- 94
- G4C, A72C, G251R, Q349R 63,9
- 95
- G4C, A72C, Q349K, D320V 63,9 ± 0,7
- 96
- A72V, T335I, D346A, T393A 63,9
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 97
- G4C, A72C, E183K, Q349R 63,9
- 98
- Q1L, G4C, A72C, H203R, Q349K, P442S 63,9
- 99
- G4C, A72C, Q349K, G434S, G470D 64
- 100
- G4C, W40R, A72C, Q349K 64
- 101
- G4C, A72C, Q349R, V367A 64
- 102
- Q1L, G4C, A6V, C50S, A72C, I180N, D181N, E183K, Q349R, T457P, C472R, C499G 64
- 103
- G4C, A72C, S311G, D320V, Q349K 64
- 104
- W40R, T335I, D346A, T393A, P436S 64
- 105
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T243S, Q349R, P386S 64,1
- 106
- A72V, D346A, T393A, N445D 64,1
- 107
- Q1L, G4C, A72C, K154R, Q349K, T393I 64,1
- 108
- G4C, A72C, N194G, T243F, Q349R, Y374P, A375R 64,1
- 109
- A72V, D320V, D346A, T393A, N445D 64,1
- 110
- A72C, L119L, Q172Q, Q349K, T488I 64,1
- 111
- G4C, A72C, E183V, Q349K 64,1
- 112
- G4C, A72C, E183K, N318Y, Q349K 64,1
- 113
- W40R, A221V, T449A, C483R 64,1
- 114
- G4C, A72C, K92R, Q349K, N493D 64,1
- 115
- M234I, G438del 64,2
- 116
- Q1L, G4C, A72C, S90T, D181N, E183K, Q349R 64,2
- 117
- G4C, A72C, Q349R, G459D 64,2
- 118
- G4C, A72C, Q349R, Y422F 64,2
- 119
- G4C, T48A, A72C, Q349R, P480S 64,2
- 120
- E187K, D320V, P442del 64,2
- 121
- G4C, S24N, E65K, A72C, Q349R, I430L, G439D 64,2
- 122
- A72V, D320V, T335I, D346A, T393A, P436S 64,3
- 123
- Q1L, G4C, A72C, S193P, Q349K, V482I 64,3
- 124
- G4C, A72C, D320V, Q349K, G443D, L492Q 64,3
- 125
- Q1L, G4C, A72C, DV152-K159, D181N, E183K, Q349R 64,4
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 126
- Q1L, G4C, A72C, Q349K 64,4 ± 0,5
- 127
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234L, V313I, Q349R, H468R 64,4
- 128
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, I200N, Q349R 64,4
- 129
- G4C, A72C, N194K, T243Y, Q349R, A375N 64,4
- 130
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, Q349K, H468L 64,5
- 131
- G4C, E65V, A72C, Q349R 64,5
- 132
- D320V, Q349K 64,5
- 133
- Q1L, G4C, A72C, S311G, Q349K, H468R 64,5
- 134
- G4C, A72C, T243Q, Q349R, Y374P, A375M 64,5
- 135
- Q1L, G4C, A72C, D320V, Q349R 64,5
- 136
- Q1L, G4C, T15S, A72C, Y244F, Q349K 64,5
- 137
- G4C, A72C, E183K, D346E, Q349R 64,6
- 138
- T243C, A375C 64,6
- 139
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, T392M 64,6
- 140
- G4C, A72C, D202N, S311N, Q349R, N493D 64,6
- 141
- G4C, A72C, N194D, T243A, Q349R, Y374P, A375Y 64,6
- 142
- G4C, A72C, N194Y, T243V, Q349R, Y374P 64,7
- 143
- Q1L, G4C, A72C, Q349R 64,7
- 144
- G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D202N, H203R, S311N, D320I, A340G, D346A, Q349K, T393A, Y422F, P442S, R446S, H468L, V482A 64,7
- 145
- G4C, A72C, D202N, Q349R 64,7
- 146
- G4C, A72C, P224L, Q349R 64,7
- 147
- N194C, Y374C 64,7
- 148
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T229M, A340T, Q349R, V491I 64,7
- 149
- Q1L, G4C, A72C, D181N, Q349R 64,8
- 150
- G4C, A72C, D320V, D346V, Q349K 64,8
- 151
- Q1L, G4C, A72C, V152A, Q349K 64,8
- 152
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, Q349K 64,8
- 153
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, Y422F 64,8
- 154
- G4C, A72C, D202V, D320V, Q349K 64,8
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 155
- Q1L, G4C, A72C, Y155S, D181N, E183K, Q349R 64,8
- 156
- Q1L, G4C, A72C, D181N, D247N, Q349K 64,8
- 157
- Q1L, G4C, A68T, A72C, Q349K, G439D, R453S 64,9
- 158
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, H468R 64,9
- 159
- Q1L, G4C, D64N, A72C, Q349K 64,9
- 160
- G4C, A72C, E183K, Q349R, P464L 64,9
- 161
- G4C, A72C, D181N, P224L, Q349K 65 ± 0,6
- 162
- G4C, A72C, N194I, T243Y, Q349R, Y374P, A375R 65
- 163
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, P462L 65
- 164
- Q1L, G4C, A72C, E183K, Q349R 65
- 165
- G4C, A72C, S311G, Q349R 65
- 166
- Q1L, G4C, A72C, S311N, Q349K, G463D 65,1
- 167
- Q1L, G4C, A72C, S86T, Q349R 65,1
- 168
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, G231D, Q349R 65,1
- 169
- Q1L, G4C, A72C, S89N, D181N, E183K, Q349R 65,2
- 170
- Q1L, G4C, E65K, A72C, Q349K 65,2
- 171
- Q1L, Q2P, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, S192L, D202N, H203R, S311D, D320I, T335I, D346G, Q349K, T392M, Y422F, R446G 65,2
- 172
- Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 65,2
- 173
- G4C, A72C, E183K, D202Y, N310D, Q349R 65,3 ± 0,7
- 174
- G4C, A72C, N194I, T243D, Q349R, Y374P, A375Y 65,3
- 175
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T456I 65,3
- 176
- G4C, Q28R, A72C, S86T, E183K, P224L, S311N, N318Y, T335I, D346G, Q349R, T393I, P441A, P442S, R446G, H468L, V482I 65,3
- 177
- Q1L, G4C, A72C, D181N, Q349K, T451S 65,3 ± 0,1
- 178
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T243I, N246D, Q349R, T488I 65,4
- 179
- Q1L, G4C, G23N, A72C, D110G, I116V, L119I, D181N, E183K, D211G, D293R, N3100, Q349R, Q362R, G363P, M364S 65,4
- 180
- G439V, N440E, P441S, P442Q 65,4
- 181
- G431D, S431V, T433E, G434S, N435Q 65,5
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 182
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 65,6
- 183
- G4C, A72C, N194C, Y374C 65,6
- 184
- Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, Q349R, T393S 65,6
- 185
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, S485T 65,7
- 186
- Q1L, G4C, G23N, A72C, V84A, D110G, D111H, I116E, F117Y, K118A K118A, D181N, E183K, D293R, T295S, Q349R, M364L 65,7
- 187
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, R453K 65,8
- 188
- Q1L, G4C, A72C, A145T, H203R, Q349K, T403K 65,8
- 189
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, N445S 65,8
- 190
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234I, Q349R 65,8
- 191
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T465S 65,9
- 192
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T297N, Q349R 66
- 193
- Q1L, G4C, A72C, S311G, Q349K 66
- 194
- G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, E183K, S192I, H203R, S311N, D346E, Q349K, T392M, T393A, Y422F, N445D, R446S 66
- 195
- Q1L, G4C, A72C, D202N, Q349K, G486D 66
- 196
- Q1L, G4C, A72C, S99T, D181N, E183K, Q349R, T450I 66
- 197
- Q1L, G4C, A72C, I200F, Q349K, L500I 66
- 198
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, G434S 66
- 199
- Q1L, G4C, A31S, A72C, D181N, E183K, Q349R 66
- 200
- Q1L, G4C, Q28L, A72C, D181N, E183K, Q349R 66
- 201
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, P436S 66,1
- 202
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, T233S, Q349R 66,1
- 203
- Q1L, G4C, A72C, D202N, Q349K 66,1 ± 0,1
- 204
- Q1L, G4C, A68T, A72C, Q349K 66,1
- 205
- Q1L, G4C, A21T, A72C, D181N, E183K, Q349R, P454S 66,1 ± 0,1
- 206
- Q1L, G4C, A72C, D346V, Q349K 66,2
- 207
- Q1L, G4C, Y47F, A72C, D181N, E183K, Q349R, P436S, S461R 66,2
- 208
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234T, Q349R 66,3
- 209
- Q1L, G4C, A72C, N157S, D181N, E183K, Q349R 66,3
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 210
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R 66,3 ± 0,4
- 211
- Como 1-72 de T. reesei, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 66,3
- 212
- G4C, A72C, N194Q, T243V, Q349R, Y374P, A375Y 66,3
- 213
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, 1314F, Q349R, N445D 66,3
- 214
- Q1L, G4C, A72C, Q349K, T392K 66,3
- 215
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K; Q349R, T451A 66,4
- 216
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, M234V, Q349R 66,4
- 217
- Q1L, G4C, A21S, A72C, D181N, E183K, Q349R 66,5
- 218
- A21C, P429C 66,5 ± 0,4
- 219
- Q1L, G4C, A72C, D18fN, E183K, Q349R, N493D 66,5
- 220
- Q1L, G4C, A72C, S311N, Q349K 66,5
- 221
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183V, D228N, S311N, N318Y, D346E, Q349R, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 66,5
- 222
- G4C, A72C, N194C, Q349R, Y374C 66,5
- 223
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, A455V 66,5 ± 0,3
- 224
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T400S 66,6
- 225
- Q1L, G4C, T26I, A72C, D181N, E183K, Q349R 66,6 ± 0
- 226
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N310D, Q349R, T392S, G463D 66,7
- 227
- Q1L, G4C, A72C, D129N, D181N, E183K, Q190L, G266S, I276V, Q349R, P386L, F427Y 66,7 ± 0,2
- 228
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, D202N, Q349R 66,7
- 229
- Q1L, G4C, A72C, Y155C, D181N, E183K, Q349R 66,8
- 230
- Inserción en la posición P454 (ATAAA), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 66,8
- 231
- Inserción en la posición K159 (CGRNK), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 66,8
- 232
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, N246K, Q349R 67 ± 0,6
- 233
- G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, D202I, H203R, S311D, D320N, D346V, Q349R, T392M, T393A, Y422F, P442S, H468Q, V482A 67 ± 0,5
- 234
- Q1L, G4C, A72C, Y155C, Q349K 67 ± 0,4
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 235
- Q1L, G4C, A68T, A72C, D181N, E183K, Q349R 67 ± 0,3
- 236
- Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, Y47F, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T448A, R453G, H468L, P480S, V482I 67,3
- 237
- Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, S192L, D202N, H203R, S311D, D320I, T335I, D346G, Q349K, T392M, Y422F, R446G 67,3
- 238
- Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, D320V, Q349R 67,3 ± 0,4
- 239
- G4C, Q28K, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320N, D346A, Q349R, T392M, T393I, P442S, H468L, V482I 67,4
- 240
- Q1L, Q2P, G4C, Q28R, W40R, E65K, A72C, D181N, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G, D320I, D343A, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, V482A 67,4
- 241
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, D202I, P224L, D320N, D346V, Q349K, T392M, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 67,4
- 242
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183K, D202V, S311G, N318Y, D320I, D346G, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446S, H468Q, V482T 67,4
- 243
- Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, D181N, E183K, S192P, D202N, P224L, S311D, N318Y, D320V, D346G, Q349K, T392M, N445D, R446G, H468L, V482T 67,4
- 244
- Q1L, G4C, E65V, A72C, D181N, E183K, P224L, S311G, D320N, D346G, Q349R, T392M, T393I, R446G, H468L, V482I 67,6
- 245
- Inserción en la posición G151 (CGRSG), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 67,6
- 246
- Q1L, G4C, E65M, A72C, D181N, E183M, D202Y, P224L, S311D, N318Y, D320I, T335I, D346A, Q349K, T392M, T393I, N445D, R446G, T448A, H468Q, V482A 67,6
- 247
- Q1L, G4C, G23A, A72C, D110S, D111H, I116V, F117Y, K118A, L120M, D181N, E183K, D293H, G294A, N310E, Q349R, Q362G, M364S 67,6
- 248
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R, T421I, G439D 67,7
- 249
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, V152A, D181N, E183V, S192L, D202N, S311N, D320N, D346E, Q349R, T387A, T392M, T393I, Y422F, P442S, R446S, H468L, G476D, V482I 67,7 ± 0,3
- 250
- Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, E183V, G188C, S192T, D202Y, H203R, P224L, S311N, D320V, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 67,7
- 251
- Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, T335I, D346G, Q349K, T392M, T393A, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482A 67,7
- 252
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311Q, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, P480S, V482I 67,8
- 253
- Q1L, G4C, W40R, E65K, A72C, S86T, E183K, S192L, D202Y, P224L, D320I, D346E, Q349R, P442S, R446G, H468R, V482T 67,9 ± 0,4
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 254
- Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, P480S, Y482I 67,9
- 255
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 68
- 256
- Inserción en la posición P464 (THAAA), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68
- 257
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68
- 258
- Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, S24T, T27Q, Q28R, N29T, V41T, G46S, Y47S, T52D, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 68
- 259
- Inserción en las posiciones K159 (CGRNK) y T457 (AAATT), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,1 ± 1,9
- 260
- Q1L, G4C, Q28K, W40R, E65V, A72C, D181N, E183V, S192P, D202V, H203R, S311G, D320N, D346E, Q349K, T392M, T393A, Y422F, V482I 68,1
- 261
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G139S, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,1
- 262
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I 68,2
- 263
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, S311N, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 68,2 ± 0,7
- 264
- Q1L, G4C, W40R, A72C, S192L, D202N, H203R, P224L, S311N, D320I, T335I, D346V, Q349R, T393I, N445D, R446G, H468Q, V482T 68,2 ± 0
- 265
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, E183M, D202N, P224L, T229S, S311G, D320I, T335I, D346V, Q349R, T393V, H468Q, V482A 68,2
- 266
- Q1L, G4C, Q28R, G30A, E65M, A72C, D181N, D202N, P224L, S311D, N318Y, D346E, Q349K, T392M, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446S 68,2
- 267
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S68T, E183M, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 68,2
- 268
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, D202N, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,3
- 269
- T243C, A375C, N194C, Y374C 68,3
- 270
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, E183M, S311G, D346V, Q349R, T392M, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, S478Y, V482I 68,3
- 271
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,3
- 272
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 68,4
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 273
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, E183K, D202N, P224L, S311G, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 68,4
- 274
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, L120P, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,4
- 275
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, E183M, S311N, N318H, D320V, D346V, Q349K, T392M, T393A, R446S, H468L, V482I 68,4
- 276
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D202N, H203R, S311G, T335I, D346V, Q349K, T393A, P442S, R446G, H468L, V482I 68,4
- 277
- M146C, G167C 68,5
- 278
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,5
- 279
- G1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, D202N, H203R, P224L, S311D, D346G, Q349K, P442S, R446S, H468Q, V482T 68,5
- 280
- G1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T 68,5
- 281
- Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, Q69R, A72C, L120P, D181N, E183M, D202N, D247N, S311G, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, Y422F, N445D, R446G, T451S, G463V, H468Q, V482T, S485T 68,5
- 282
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183V, S192T, D202N, S311G, D320V, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, H468R, V482A 68,6 ± 0,6
- 283
- Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, D320V, D346E, Q349R, T393I, P442S, R446G, H468R, V482I 68,6
- 284
- Q1L, G4C, Q28N, E65K, A72C, D181N, E183M, D202N, H203R, S311G, N318Y, D320N, Q349R, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,6
- 285
- Q1L, G4C, Q28R, V41T, G46S, Y47S, T52D, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 68,6
- 286
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,6
- 287
- Q1L, G4C, Q28R, W40R, A72C, S86T, D181N, S192T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349K, T392M, T393I, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 68,6 ± 1
- 288
- Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, T229M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I 68,6
- 289
- Q1L, G4C, Q28K, W40R, A72C, S86T, D181N, E183M, S192I, D202Y, T299S, S311N, N318Y, D320I, D346V, Q349R, T393I, P442S, H468L 68,6 ± 0,4
- 290
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,6
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 291
- Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, E183M, Q190K, P224L, T229M, G231D, M234T, S311G, D320I, A340S, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T448A, R453G, H468L, P480S, V482I 68,7
- 292
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, G463V, H468L, V482I 68,7
- 293
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,7
- 294
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 68,7
- 295
- Q1L, G4C, Q28R, W40R, E65V, A72C, S86T, S192T, D202V, H203R, S311N, N318Y, D346A, Q349K, T392M, T393A, Y422F, P442S, N445D, V482A 68,7
- 296
- Inserción en las posiciones K159 (CGRNK), G434 (AAATG) y T457 (AAATT), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,7 ± 1,1
- 297
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, H203R, P224L, S311G, D320V, D346G, Q349K, T392M, T393I, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A 68,7 ± 0
- 298
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,8
- 299
- , , 68,8 ± 0,2
- 300
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183K, D202I, P224L, S311G, D320I, Q349K, T393V, P442S, N445D, R446S, H468L, V482I 68,8
- 301
- Q1L, G4C, Q28K, A72C, S86T, D181N, E183V, S192T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346G, Q349R, T392M, Y422F, P442S, N445D, R446S, H468L, V482A 68,8
- 302
- G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, S192L, D202N, H203R, P224L, S311D, D346E, Q349R, T392M, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, P462L, H468L, V482T 68,8
- 303
- Q1L, G4C, W40R, E65K, A72C, Q109R, D181N, E183M, S192I, D202I, H203R, S245T, D346A, Q349R, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468R, V482A 68,8 ± 0,2
- 304
- Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, D202N, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 68,9
- 305
- Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349R, T393V, N417Y, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,9
- 306
- Q1L, G4C, Q28R, W40R, E65V, A72C, D202Y, H203R, P224L, T299I, N318Y, D320V, D346A, Q349K, T392M, T393A, P442S, N445D, R446G, H468R, V482T 68,9
- 307
- G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346G, Q349K, T392M, Y422F, R446G, H468Q 68,9
- 308
- Q1L, G4C, Q28K, A72C, S86T, E183K, S311G, D320V, D346A, Q349R, T392M, T393I, Y422F, P442S, R446S, H468Q 68,9
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 309
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D1 81N, P224L, S311N, D320N, T335I, D346E, Q349K, T392M, Y422F, N445D, R446S, H468L, V482T 68,9
- 310
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 68,9
- 311
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I 68,9
- 312
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,9
- 313
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69
- 314
- Q1L, G4C, W40R, E65V, A72C, S86T, D181N, S192T, D202N, H203R, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346G, Q349K, T392M, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q 69 ± 0,3
- 315
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T 69
- 316
- Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, Q28R, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69
- 317
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D346A, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T 69 ± 0,9
- 318
- Q1L, G4C, N10D, Q28R, E65V, Q69R, A72C, K92R, K118Q, D181N, E183M, D202N, T280A, S311G, T335I, D346E, Q349K, K355Q, T387S, T393V, D404N, Y422F, N445D, R446G, P462L, G463V, H468Q, V482I, S485T 69
- 319
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, E183M, D202N, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69
- 320
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183M, D202N, S311D, D320V, T335I, D346G, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, H468L, V482I 69
- 321
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, P224L, S311N, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H46SQ, V482T 69
- 322
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T 69
- 323
- G4C, E65K, A72C, S86T, E183M, D202I, P224L, S311N, N318Y, D320N, T335I, D346V, Q349R, T393V, Y422F, P442S, R446S, H468L 69
- 324
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D202N, S311N, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 69
- 325
- Q1L, G4C, E65V, A72C, D181N, E183K, D202G, Q349R 69 ± 1,2
- 326
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69
- 327
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, F306L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 328
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69
- 329
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183K, S192P, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349R, T392M, T393I, Y422F, P442S, H468Q 69 ± 0,1
- 330
- Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, H203R, S311D, D320V, T335I, D346E, Q349R, T393A, N445D, R446G, H468Q, V482A 69
- 331
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, E183V, D202I, H203R, P224L, S311D, D320V, D346V, Q349R, T392M, T393I, N445D, H468L 69
- 332
- Q1L, G4C, Q28K, W40R, E65K, A72C, S86T, D181N, E183K, S192L, D202I, H203R, S311N, D320N, D346V, Q349K, T392M, T393A, Y422F, N445D, R446S 69
- 333
- G4C, E65V, A72C, S86T, Y155H, D181N, E183V, Q190K, P224L, S311N, D320V, D346V, Q349K, T392M, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A 69,1
- 334
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, S311D, N318Y, D320N, T335I, D346A, Q349R, T392M, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A 69,1
- 335
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 69,1
- 336
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D181N, D202N, S311G, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I 69,1
- 337
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, D202N, S311N, N318Y, D320I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 69,1 ± 0,6
- 338
- Q1L, G4C, T7Q, A8S, N10T, S24T, T27Q, Q28R, N29T, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, G349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,1
- 339
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D202N, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I 69,1
- 340
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, S311G, N318Y, D320V, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q 69,1
- 341
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,1
- 342
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,1
- 343
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,1
- 344
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,2
- 345
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,2
- 346
- Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183K, D202Y, S311G, D320N, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, R446G, H468Q, V482T 69,2
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 347
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311N, D320I, T335I, A340S, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,2
- 348
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, H203R, P224L, S311D, D320I, D346E, Q349R, T392M, Y422F, R446G, H468L 69,2
- 349
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,2 ± 0,5
- 350
- Q1L, G4C, Q28K, N29Y, E65K, A72C, D181N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,2 ± 0,1
- 351
- Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, E183M, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 69,3
- 352
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, D202N, S311N, N318Y, D320N, T335I, D346A, Q349K, T392M, T393V, P442S, N445D, R446G, H468Q 69,3
- 353
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,3
- 354
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183V, S192T, D202N, S311G, D320V, D346A, Q349K, T393V, P442S, N445D, H468L, V482A 69,3 ± 0,3
- 355
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 69,3
- 356
- Q1L, G4C, S24T, Q28R, E65K, A72C, D202N, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,3 ± 0,1
- 357
- Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I, D346G, Q349K, T393I, R446G, H468Q 69,3
- 358
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,4 ± 0,5
- 359
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D346A, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 69,4
- 360
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, E183V, S192I, D202V, D320I, T335I, D346V, Q349K, T392M, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468R, V482A 69,4 ± 0,1
- 361
- Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,4 ± 0,2
- 362
- Q1L, G4C, Q28K, A72C, D181N, D202I, S311D, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T392M, Y422F, R446G, H468L 69,4
- 363
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320N, D346E, Q349K, T393V, Y422F, T433S, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,4
- 364
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,4 ± 0,2
- 365
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, D202N, S311G, N318Y, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,4 ± 0,5
- 366
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, E183M, D202N, D320I, T335I, D346A, Q349K, T392M, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 69,4
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 367
- Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, S311N, N318Y, D3201, T335I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, H468Q, V482I 69,4
- 368
- Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183V, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, H468R, V482A 69,4 ± 0, 1
- 369
- Q1L, G4C, T7Q, A8S, N1 0T, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,4
- 370
- Q1L, G4C, E65K, A72C, S86T, D202V, S311N, D320V, T335I, D346V, Q349R, T392M, Y422F, N445D, R446G, H468L 69,4
- 371
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,4
- 372
- Q1L, G4C, Q28R, D57S, D64N, E65V, Q69K, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,4
- 373
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, E183M, S192T, D202N, H203R, P224L, S311N, T335I, D346V, Q349R, T392M, T393V, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482A 69,4
- 374
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, D202N, S311N, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,4 ± 0,8
- 375
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I, S485T 69,5
- 376
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,5
- 377
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, G434 (AAATG) P442S, N445D, R446G, T457 (AAATT), H468L, V482I 69,5 ± 0,4
- 378
- G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, D202Y, P224L, S311N, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446S, H468Q, V482A 69,5
- 379
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,5 ± 1,8
- 380
- Q1L, G4C, T27S, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,5
- 381
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, P224L, S311G, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,5
- 382
- Como 1-10 de T. reesei, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,5
- 383
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,5
- 384
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, E183M, D202N, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,6 ±0,1
- 385
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D181N, P224L, S311N, N318Y, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I 69,6
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 386
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S90F, D181N, P224L, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,6
- 387
- G4C, Q28R, A72C, S86T, D181N, E183V, S192L, D202V, N246S, S311D, N318Y, D320V, D346A, Q349K, T393V, P442S, N445D, H468L, V482A 69,6
- 388
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311N, N318Y, D320I, T335I, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,6
- 389
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, E183M, S192L, H203R, S311D, D320V, T335I, D346V, Q349K, N445D, H468Q, V482A 69,6
- 390
- Q1L, G4C, Q28R, T59M, E65K, A68T, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, H203R, S311D, D320V, T335I, Q349R, T393A, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A 69,6
- 391
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,6
- 392
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, K355Q, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,6
- 393
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 69,6
- 394
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, T448A, R453G, H468L, V482I 69,6
- 395
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, S86T, D181N, E183M, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,6 ± 0,5
- 396
- Q1L, G4C, E65M, A72C, E183M, D202I, P224L, S311D, N318Y, D320V, T335I, D346A, Q349K, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I 69,6
- 397
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,7
- 398
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183M, S311G, N318Y, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 69,7 ± 1
- 399
- Q1L, G4C, S24T, T27Q, Q28R, N29T, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,7
- 400
- Q1L, G4C, E65V, A72C, D181N, E183M, S192T, P224L, S311G, D320V, T335I, D346G, Q349K, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 69,7
- 401
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,8 ± 0,8
- 402
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202F, S311G, N318Y, T335I, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q 69,8
- 403
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349R, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468R 69,8
- 404
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, S311N, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,8 ± 0
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 405
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 69,8
- 406
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,8
- 407
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, S311N, T335I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 69,8
- 408
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, S86T, E183M, P224L, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,8
- 409
- Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, T229M, S311G, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, P480S, V482I 69,9
- 410
- Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, E183M, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 69,9
- 411
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, D404N, Y422F, P442S, N445D, R446G, T451S, H468L, V482I 69,9
- 412
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P462L, H468L, V482I 69,9
- 413
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I 69,9
- 414
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, T280A, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,9
- 415
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, Q69R, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,9
- 416
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, K275E, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 69,9
- 417
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, E183K, D202N, P224L, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 69,9
- 418
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 69,9 ± 0,2
- 419
- Inserción en la posición A455 (AAAPA), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70
- 420
- Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70
- 422
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, E183M, S311G, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 70
- 423
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, S311G, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 70,1
- 424
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,1
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 425
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E183M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 70,1 ± 0,2
- 426
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 70,1
- 427
- Q1L, G4C, S24C, Q28R, G30A, E65V, A72C, Y155C, D181N, Q190K, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, P480S, V482I 70,1
- 428
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, P402S, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,1
- 429
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, E183M, D202N, P224L, S311N, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 70,1
- 430
- Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, N29Y, E65V, A72C, Y155C, D181N, D202N, P224L, M234T, S311G, D320I, D346E, Q349K, D390E, T393V, Y422F, N445D, R446G, R453G, H468Q, V482I 70,1
- 431
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, S86T, D202N, P224L, S311D, D320N, T335I, D346V, Q349K, T392M, T393V, Y422F, P442S, R446S, H468L 70,2
- 432
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183K, D202N, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 70,2
- 433
- Q1L, G4C, W40R, E65M, A72C, S86T, E183V, S192L, D202I, H203R, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, H468R, V482A 70,2 ± 0,3
- 434
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,2
- 435
- Inserción en las posiciones G434 (AAATG) y T457 (AAATT), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,2 ± 0,2
- 436
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K118Q, D181N, E183M, P224L, D247N, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,3
- 437
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311N, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 70,4 ± 0
- 438
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D202N, P224L, S311G, N318Y, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 70,4 ± 0,9
- 439
- Q1L, G4C, Q28K, E65M, A72C, D181N, E183M, D202N, S311G, N318Y, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482T 70,4 ± 0,5
- 440
- Inserción en la posición P454 (VRPQP), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,5
- 441
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, D181N, E183V, S192M, D202N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346E, Q349R, T393V, Y422F, P442S, R446G, H468L, P480S 70,5
- 442
- Q1L, G4C, Q28R, A72C, S86T, D181N, S192L, D202N, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I, D345E, D346A, Q349K, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, H505Q 70,5
- Mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 18 Valor IT50 (4-MUL)
- 443
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, P224L, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,6 ± 0
- 444
- Q1L, G4C, Q28R, E65M, A72C, D181N, E183K, D202N, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 70,6 ± 0,6
- 445
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, S311G, T335I, D346A, Q349K, T393I, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,7 ± 0,5
- 446
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, D247N, S311G, D320I, D346E, Q349K, T387S, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,7
- 447
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, D202N, P224L, S311G, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I 70,8 ± 0,4
- 448
- Inserción en G434 (AAATG), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,9
- 449
- Inserción en T457 (AAATT), Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,9
- 450
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, E183K, S192L, D202N, D320N, T335I, D346A, Q349R, T393A, Y422F, P442S, R446G, H468R, V482A 71
- 451
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S236F, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 71
- 452
- Q1L, G4C, Q28R, E65K, A72C, D202I, P224L, S311G, N318Y, D320V, T335I, D346A, Q349R, T392M, T393A, N445D, R446G, H468L 71,1
- 453
- Q1L, G4C, E65M, A72C, S86T, E183V, D202I, P224L, S311G, N318Y, D320V, D346A, Q349K, P442S, N445D, R446G, H468L, V482A 71,1
- 454
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K92R, D181N, E183M, P224L, I277V, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 71,1
- 455
- Q1L, G4C, A72C, S86T, D181N, E183K, D202V, P224L, S311G, D320V, D346E, Q349R, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L 71,1
- 456
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, D181N, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 71,1 ± 0
- 457
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, S86T, D181N, E183K, S192L, D202V, S311G, D320I, D346V, Q349R, T393A, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V482I 71,1
- 458
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, D181N, D202N, P224L, S311N, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482T 71,2 ± 0
- 459
- Q1L, G4C, A21T, T26I, Q28R, G30A, E65V, A68T, A72C, D181N, E183M, D202N, T229M, S311G, A340S, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 71,3
Ejemplo 9: Caracterización de variantes de la fusión de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei (con etiqueta 6x His)
Hasta un volumen final de aprox. 1 ml se concentraron 80 ml de caldo de fermentación. Después de la 5 determinación de la concentración de la proteína (reactivo de Bradford, Biorad, Alemania, el estándar es BSA de
Sigma-Aldrich, Alemania), se purificaron 1,2 mg de proteína con el kit de centrifugación Ni-NTA (Qiagen, Alemania). La fracción CBH1 purificada se ensayó posteriormente realizando una reacción de hidrólisis en la paja de trigo pretratada (pretratamiento ácido). Se mezclan 12,5 mg (masa seca) de paja de trigo pretratada con 0,0125 mg de CBH1 purificado y 40CBU Novo188 (Novozymes, Dinamarca) por mg de CBH1. Acetato del sodio 50mM (Sigma- 5 Aldrich, Alemania) se agrega hasta 500 pl. El ensayo se mantiene a temperaturas que varían de 50°C a 65°C durante 48 horas y se analiza por HPLC para determinar el contenido de glucosa dependiente de la temperatura.
Ejemplo 10: Hidrólisis de paja con proteínas variantes de la SEQ ID NO: 2 expresadas de Trichoderma reesei
Las secuencias de celobiohidrolasa seleccionadas (Tabla 7) se expresan de Trichoderma reesei como se describe en el Ejemplo 5 por sustitución del marco de lectura de CBHI nativo con las fusiones de secuencia correspondientes 10 al péptido de señal CBHI. Las muestras de las proteínas mutantes se aíslan del sobrenadante del cultivo y se purifican por cromatografía de afinidad Ni-NTA. La caracterización de las proteínas se realiza mediante incubación de las proteínas (E) con sustrato (S) de paja pretratada con ácido (contenido de materia seca del 2,5% y E/S = 0,1% peso/peso en la reacción) a temperaturas entre 50°C y 75°C durante 48 horas en presencia de una cantidad no limitante de beta-glucosidasa seguido de la determinación por HPLC de la concentración de glucosa liberada. Los 15 resultados se muestran en la Tabla 7. Como indicación del comportamiento, se tomó la liberación de glucosa después de 48 horas a 60°C y se encontró significativamente aumentada en comparación con la proteína de tipo salvaje. En la Tabla 7 se dan las temperaturas donde se alcanza todavía 50% de la máxima producción de glucosa.
Tabla 7: Comportamiento de Celobiohidrolasas expresadas de Trichoderma en paja
- Mutación con respecto a la SEQ ID NO:2 Temperatura [°C] de liberación óptima mitad de azúcar de paja pretratada con ácido (48 h 0,1% Relación de Enzima frente a Sustrato (40 CBU/mg de Celulasa BGL añadida)
- 1
- 59,3 ± 0,4
- 2
- Q1L, G4C, A72C, D181N, E183K, Q349R 61,3
- 3
- Q1L, G4C, A72C, Y155C, Q349K 64,3
- 4
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 73,0
- 5
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, Q349K, T392M, T393I, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 68,7
- 6
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D 346E, Q349K, T393V, Y422F, P442 69,3
- S, N445D, R446G, H468L, V482I
- 7
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, D202N, P224L, S311G, N318Y, T3351, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468L, V482I 69,5
- 8
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, S86T, E183K, D202N, S311G, N318Y, D320I, D346A, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468Q, V4 82I 67,5
- 9
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,2
- 10
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 68,4
- Mutación con respecto a la SEQ ID NO:2 Temperatura [°C] de liberación óptima mitad de azúcar de paja pretratada con ácido (48 h 0,1% Relación de Enzima frente a Sustrato (40 CBU/mg de Celulasa BGL añadida)
- 11
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D202N, S311N, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446 G, H468Q, V482T 67,8
- 12
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72C, E183M, D202N, S311G, N318Y, D346E, Q349K, T393I, Y422F, N445D, R446 G, H468Q, V482I 68,0
- 13
- G2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, E65K, A72C, E183M, S311G, N 318Y, D320I, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H46 8Q, V482T 72,0
- 14
- Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, E65V, A72C, E183M, D202N, P 224L, S311G, T3351, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R44 6G, H468Q, V482I 73,8
- 15
- Q2S, G4C, A6LJ7Q, A8S, N10T, Q28R, E65V, A72C, P224L, S311D, N318Y, D320N, D346A, G349K, T392M, T3931, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482I 73,6
- 16
- Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, Q28K, N29Y, E65K, A72C, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482T 71,9
- 17
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K159KCGRNK, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, T433TGAAAT, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,5
- 18
- Q2S, G4C, A6L, T7Q, A8S, N10T, S24T, Q28R, E65K, A72C, D202N, S3 11G, T335I, D346E, Q349K, T3931, Y422F, N445D, R446G, H468Q, V482 T 72,2
- 19
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, P454PVRPQP, H468L, V482I 69,1
- 20
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, K15 9KCGRNK, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V 4821 68,2
- 21
- Q1L, G4C, S24T, T26I, Q28R, N29Y, G30A, E65V, A68T, A72C, E183M, Q190K, P224L, S311G, D320I, D34 6E, Q349K, T393V, Y422F, P442S, N445D, R446G, H468L, V482I 70,2
- 22
- SEQ ID NO: 12 58,6 ± 0,4
Ejemplo 11: Rendimiento de las variantes de la SEQ ID NO: 5 con termoestabilidad mejorada
Las técnicas de PCR se usaron para la transferencia de mutaciones seleccionadas en el esqueleto de la SEQ ID NO: 5, tal como se deduce de las mutantes cribadas de la SEQ ID NO: 2 con rendimiento superior. La proteína 5 expresada de Pichia pastoris se tomó del sobrenadante del cultivo y se probó su Capacidad de Transformación del Sustrato por el procedimiento dado en el ejemplo 8. En la tabla se dan los valores IT5ü calculados para el substrato 4-MUL. En estas condiciones se encontró una estabilidad ligeramente superior de las proteínas sin CBD en comparación con las proteínas de fusión. Los resultados se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8: Comparación de los valores IT50 de las mutantes de la SEQ ID NO: 5 y de la SEQ ID NO: 2
- Patrón de mutación con respecto a la SEQ ID NO: 5 IT50 de la mutante de la SEQ ID NO: 5 original IT50 de la mutante de la SEQ ID NO: 2 original
- 1
- wt 61,3 60,4 ± 0,5
- 2
- G4C, Q28K, E65M, A72C, S86T, E183M, D 202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349 K, T393V, Y422F 70,0 69,5
- 3
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, D181N, E18 3M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F 72,0 69,8 ± 0,8
- 4
- Q1L, G4C, Q28K, E65K, A72C, D181N, E18 3M, S311G, N318Y, D320I, T335I, D346E, Q 349K, T393V, Y422F 70,3 70,1 ± 0,2
- 5
- Q1L, G4C, Q28K, E65V, A72G, D181N, E18 3M, D202N, P224L, S311G, T335I, D346E, Q349K, T393V, Y422F 71,9 71,1 ± 0
- 6
- Q1L, G4C, Q28R, E65V, A72C, G 151GCGR SG, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F 72,7 68,2
Ejemplo 12: Influencia de diferentes dominios de unión a celulosa sobre los valores de IT50
Para evaluar la intercambiabilidad de las CBD un mutante estabilizado de la SEQ ID NO: 5 (Q1L, G4C, Q28R, E65V, 5 A72C, D181N, E183M, P224L, S311G, D320I, D346E, Q349K, T393V, Y422F) se conectó con una serie de dominios
de unión a celulosa y regiones enlazadoras de celobiohidrolasas de diferentes fuentes por OE-PCR. Las secuencias codificantes resultantes (SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27 y 29) se clonan con un vector de expresión de Pichia pastoris para la expresión de las correspondientes proteínas de fusión según las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 y 28). Los valores de IT50 para las variantes se evalúan como se describió anteriormente y se enumeran en el Tabla 9. 10 Solamente se observaron pequeñas influencias de diferentes módulos de CBD sobre la estabilidad.
Tabla 9: Comparación del comportamiento de diferentes fusiones CBD con sus enlazadores con variantes estabilizadas y no estabilizadas de la SEQ ID NO: 5
- Listado de secuencias de ADN Listado de secuencias de proteínas Origen de enlazador y CBD IT50 [°C] (ensayo 4- MUL) Temperatura [°C] de liberación óptima mitad de azúcar de la celulosa (48 h, relación de enzima frente a sustrato del 0,1% (40 CBU/mg de BGL celulasa añadida) Observación
- 1
- 1
- 2 T. reesei 60,4 ± 0,5 57,4 ± 0,5 Núcleo no estabilizado (tipo salvaje)
- 2
- 21 20 C. thermophilum 69,5 ± 0,5 65,6
- 3
- 23 22 P. chrysosporium 69,3 ± 0,2 65,6
- 4
- 25 24 P. janthinellum 68,4 ± 1,2 65,0
- 5
- 27 26 I. lacteus 68,8 ± 0,1 65,2
- 6
- 29 28 T. reesei 69,8 ± 0,8 65,0 ± 0,7 Núcleo estabilizado y región enlazadora de CBD
Tabla 10: Listados de secuencias (Perspectiva)
- SEQ ID NO
- Ácido nucleico [N] /Proteína [P] Descripción ID
- SEQ ID NO 1
- [N] Secuencia codificante para la fusión CBH Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei que incluye el péptido de señal de factor alfa.
- SEQ ID NO 2
- [P] Secuencia madura de CBH Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei CBH-a
- SEQ ID NO 3
- [N] Secuencia codificante de la fusión de CBH-a con péptido de señal CBHI Trichoderma reesei
- SEQ ID NO 4
- [P] Dominio de unión a celulosa CBHI Trichoderma reesei y secuencia enlazadora
- SEQ ID NO 5
- [P] CBHI Talaromyces emersonii CBH-b
- SEQ ID NO 6
- [N] CBHI Talaromyces emersonii
- SEQ ID NO 7
- [N] CBHI Humicola grisea
- SEQ ID NO 8
- [P] CBHI Humicola grisea CBH-d
- SEQ ID NO 9
- [N] CBHI Thermoascus aurantiacus
- SEQ ID NO 10
- [P] CBHI Thermoascus aurantiacus CBH-e
- SEQ ID NO 11
- [N] CBHI Trichoderma reesei
- SEQ ID NO 12
- [P] CBHI Trichoderma reesei CBH-c
- SEQ ID NO 13
- [N] CBHI Trichoderma viridae
- SEQ ID NO 14
- [P] CBHI Trichoderma viridae CBH-f
- SEQ ID NO 15
- [N] Fusión CBHI Humicola grisea/CBD Trichoderma reesei
- SEQ ID NO 16
- [P] Fusión CBHI Humicola grisea/CBD Trichoderma reesei CBH-g
- SEQ ID NO 17
- [N] Secuencia codificante para la CBH Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei que incluye péptido de señal de factor alfa y etiqueta 6x His.
- SEQ ID NO 18
- [P] Secuencia madura de péptido de fusión de CBH Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei con etiqueta 6x His CBH-ah
- SEQ ID NO 19
- [N] CBHI Humicola grisea, secuencia codificante alternativa
- SEQ ID NO: 20 a 41
- [N] Cebadores de oligonucleótidos utilizados con esta invención
- SEQ ID NO 42
- [P] Mutante de CBH Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa I Chaetomium thermophilum con etiqueta 6x His
- SEQ ID NO 43
- [N] Secuencia codificante para la CBH Talaromyces emersonii con etiqueta 6x His Mutante de CBD celobiohidrolasa I Chaetomium thermophilum
- SEQ ID NO
- Ácido nucleico [N] /Proteína [P] Descripción ID
- SEQ ID NO 44
- [P] Mutante de CBH Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Phanerochaete chrysosporium con etiqueta 6x His
- SEQ ID NO 45
- [N] Secuencia codificante para el mutante de la CBH Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Phanerochaete chrysosporium con etiqueta 6x His
- SEQ ID NO 46
- [P] Mutante de CBH Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Penicillium jantinellum con etiqueta 6x His
- SEQ ID NO 47
- [N] Secuencia codificante para el mutante de la CBH Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Penicillium jantinellum con etiqueta 6x His
- SEQ ID NO 48
- [P] Mutante de CBH Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Irpexlacteus con etiqueta 6x His
- SEQ ID NO 49
- [N] Secuencia codificante para el mutante de la CBH Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Irpex lacteus con etiqueta 6x His
- SEQ ID NO 50
- [P] Mutante de la CBH Talaromyces emersonii con CBD Trichoderma reesei mutado con etiqueta 6x His
- SEQ ID NO51
- [N] Secuencia codificante para el mutante de la CBH Talaromyces emersonii con CBD Trichoderma reesei mutado con etiqueta 6x His
SEQ ID NO: 1
cagcaggccggcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgcgagctgc accaaccagaacggggcggtcgctc'tgatgcgaactggcgttggcrtgcacgai:gtgaacggatacascaactgc: ta cacggycast acc tg gy ae ce eacgtact gcectgacga.cgcia.it ce tgcgccc ay a actgtgcgctggacggc gcggattacgagggcacctacggegtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaac gtcggaioccgtctctacctgctgcaggacgactogacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgacttcagc tttgacgtcgatgtctccaatctcccgtgcggattgaacggcgctctgfcaccttgtcgccatggacgcrgacgge ggcgtgiccaagtacccgaacaacaaggcüggtgccaagtacggaaccgggtattgccactcccaatgcccacgg gacctcaagttcatcgacggcgaggccaacgt.egagggctggcagccgtcttcgaacaacgccaacaccggaatt ggccaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcazctccaatgcggtcactccgcan ccgtgcgacacqccaggccagacgatgtgctccggagacq'actgeggtggcacatactctaacgatcgccacgcq ggaacctgcgatcctgacggccgtgact.tcaacccttaccgcatgggcaacact.t.ctt rctacgggcctggcaag atcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctca.ctgatgatggtacggatactggaactete agcgagatcaagegcttctacaeceagaacagcaacgtcaecccgcagcccaactcgg&cateagLgycgtgacc ggcaactcgatcacgacggagt.c.ctgcactgct cagaagcaggccttc.ggcgacacggacg acta etc teageac ggr.ggcctggccaagatgggagcqgccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagrtLgtgggacgactacgcc gcgca-gatgctgtggltggattccgactacccgacggatgcggaccccacgacccctggtattgcccgtggaacg tgtccgacggactcggqcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccasctcctacctgacctactccaacatt aagrttggtccgatcggtagc£caggr.aatccttcaggtgCTtaatcctacaggtggaaacagaggaac:aacgaca
actagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaactcoatcacac^acggtcaatgtggtggtata
ggttactctggtcccactgt.tt.gtgcttctggtactacttgccaagttctgaaccctt actactcacagtgtcta taat.gataa
5 Secuencia codificante para la CBH-a (madura)
SEQ ID NO: 2
5
10
QQAGTATAENHPPLTW-QECTAPGSCTTQNG.WVLDANKRKVHDVNGYTNCYTGNTWDPTYCPDDETCA.QNCAI.DG ADYEGTYC-VTSSGSSLKLNPVTGSN1/GSRLYLLQDDSTYQIFKLLNR3FSFDVDVSNLPC3LNGALYFVÍAIDADG gvskypnnkagakygtgycdsqcprdlkf idgeanvegwqpssnnantgigdhgsccaemdvwsansishavtph
PCDTPGQTMCSGDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFHPYRMGNTSFYGPGKIIDTTKPPTWTQFLTDDGTDTGTL SEIKEFYIQNSWIPQPNSDISGVTGKSITTYFCTAQKQAFGDTDDFSQHGGL.AKMGAAMQQGt'ÍVL'/MSLWDDYA AQMLÍÍLDSDYPTDADPTTPGIARGTCPTDSGVPSDVESQSPNSYVTYSHTKFGPIGSTGNFSGGNPPGGNRGCTT TRRPATTTC-SSPCtPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL
Secuencia madura de CBH-a
SEQ ID NO: 3
atgtatcggaagttggccgtcatctcggccttcttggccscagctcgtgctcagcaggccggcacggcgacggca
gagaaccocccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccccgggagctgcaccaeccagaacggggcggtcgtx
cTtgatgcgaactggcgttgggtgcaegatgtgaacgga'acaccaactgctacacgggcaatacctgggacccc acgtactgccctgacgacgaaacctgcgcccagaactgtgcgctggacggcgcggaptacgagggcacctacggc gtgactt.cgr.cgggcagctccttgaaacccaatttcgtcaocgggtcgaacctcggatcccgtctct:acc:~gctg caggacga~-cgacctatcagatctacaagctcctgaaccgagagttcagctttgacgtcgaYgtctccaatatt ccgtgcagattgaacggcgctctgtact.ttgtcgccñtacacgccgacggcggcgtgr.ccaagtacccgaacsac aaggct.ggtgccaag“acggaaccgggtaAtgcgactcccaat.güecacgggacctcaagttcatcgacggcgag gccaacgt.cgagggctggcagccgtcttcgaacaacgccaacaccggaaTtggcgaccacggcacctacr.gf.gc’g gagatggatgtctgggaagcaaacaccatctccaatgcgatcactccgcacccgtgagacacgccaggccagacg atg'.gcLctggagatgaczgcggtggcacatactcza&cgatcgcfcacgcgggaacctgcgar.cctgacggctgt gaccticaacectiaccgcat gggcaacacttcttt.ctacgggccc.ggcaagatcatcgataccaccaagccctcc actgcogtgacgcagttcctcaccgatgatggtacggatactgcaactctcagcgagatcaagcgctvctacatc c&caacagcaacgtcattccgcagcccaactcggacatcagtggcgtgaccggcaactccatcacgacggagttc tgcactgcacsgaagcaggcctttggcgacacggacgacttctctcagcacggtggcctggccaagstgggagcg gccatgcagcagggt-atggtccr.ggtgatgagtttgtgggacgaatr.acgccgcgcagatgctgtggYtggattcc gactaccsgacggac.gcggaccccacgaeccctggtattgcccgtggaacgT;g:.ccgacg5actcgggcgtceca acggatgtagagtcgcagagccccaac"ccaacgtgacctactccaacattaactttggtcagar, cggtagcaca ggtaatcctccaggtggtaatcc'tcaaggtggaaacagaggaacáacgacaactagaagaccagctactacaact ggttcaagtccaggtccaactcaatoacactacggtcaatg“ggtggtataggttactctggtcccactgr.r.tgc gcttctggtactacttgccaagttctgaacccatactactcacagYgtctagcttctgcacatcatcaccaccac cattaa
Secuencia codificante de la fusión de CBH-a con péptido de señal de CBHI Trichoderma reesei SEQ ID NO: 4
GSTGNPSGGNPPGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL Dominio de unión a celulosa CBHI Trichoderma reesei y secuencia enlazadora SEQ ID NO: 5
qqagtataeiíhppltwqectapgscttqngawldakwrvjvkdvngytncytgntwdptycpddetcaqncaldg
ADYEGTYGVTSSGSSLKLKFVTGS.WGSRLYLLQDDSTYQIFKLLNREFSFCVDVSNLPC3LNGALYFVAMDADC GVSK-YPNNKAGAKYGTGY'CDSQCPRDLKF IDGSANYrEGWÜ?3SNNANTGIGDHGSCCAEMDVW3AN£ ISNAVTPH PCDTPGQTMCSGDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFNPYRMGNTSFYGFGKIIDTTKPFT’A'TQFLTDDGTDTGTL
SEIKRFYIQNSKVIPQPNSDISGVTGNSITTEP'CTAQKQAFC-DTDDFSQKGGLAKMGAAMQQGMVLVMSLWDDYA
AQMIjWLDSDYPTDADFTTPGIARGTCPTDSGVPSDVESQSPNSYVTYS'NIKFGPINSTFTAS
Secuencia CBHI Talaromyces emersonii (CBH-b)
SEQ ID NO: 6
atgagatttccttcaatctttastgcagttttattcgcagcatcctccccattagctgctccagtcaac&ctaca
acagaagatgaaacggcacaaattceggcigaagctgtcatcggttacttagatttagaaggggatt.tcgatgtt gctgttttgceat t.tt-ccaacagcacaaacaacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgct
aaagaagaaggcgtat
ggar.aaacg;gaggcggaagcaccctctcagcaggccggcacggcgacggcagag
aaccacccgcccctgacatggcaggaaígcaccgcccctgggagctgcaccacccagaacggggegglcgttctt
gatgcgaactggcgttgggtgcatígatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacc
tactgccctgacgacgaaacatgcgcacagaactgLgcgctggacggceciygattacgagggcacctacggcgtg acttcgtcgggcagctccttgaaactcaacttcgtcaccggctcgaacgtcggatcccgtccctacctgctgcaq gacgactcgacctatcagatcttcaagcttctgaaccgcgagttcagctttgacgtogatgtctccaatcttccg tgcggattgaacggcgc“ct.gt.actttgtcgccatggacgccgacggcggog:gtscaagtacccgaacaacaa9 gctggtgccaactacggaaccgggt.ati-gcgact.ccoa?.t.gc-Ccacgggacc~.ca3gt t cat cgacggcgaggcc aacg Lcgagggctggcagccgtcttcgaacaacgccaacaccgcaattcgcgaccacggctoctgctgtgcggac atggatgtctgggaagcaaacagcatetcca&cgcggteactccgcacccgtgcgacacgccaggccagacgacg tgctctggagatgactgcggcggcaca'c.actctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatccrgacggctgtgac ttcaacccttaccgcatgggcaacaottctttccacgggcctggcaagatcaccgataccaccaagccctccact gtcgtgacgcagttcctcaccgatgatggtacggatactggaacLCLe&gegayatcaagcgcttccacacccag aacagcaacgtcatcccgcagcccaacccgg&eatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagtrctgc actgctcagaagcaggccttuggcgacacggacgacttctctcagcacggtggcctggccaagatgggagcG-gcc atgoagoagggtar.ggtcotggtgacgagtttgcgggacgacfcacgccgcgcagatgctgtggttggattccgfic tacccgacggatgcggaccccacgaccectggtattgcccgtggaacgtgtccgacggacccgggcgtcccatcg gatgtcgagtcgcagagccccaactcccacgtgacctactcgaacattaagt.trggtccgatcaactccracctte accgcttcgtgataa
Secuencia codificante de CBHI Talaromyces emersonii fusionado con el péptido de señal de factor alfa SEQ ID NO: 7
QQAGTITñENHPRKTWKRCSGPGNCQTVGSEVVIiJAíJWRX'lliHNMGüKCYEGNKWTSCCSSATDCAQRCALDGANY QSTYGASTSC-DS LTLKFVT KHE YGTNIGS RFYLMANQN KYQMFTLMKK3FAFDVDLSKVECGINSALYFVAMSSD GGMASYPSMPJkGAKYGTGYCDACGARDLKFIGGKANIEGVfRPSTNDPKAGVGFMGACCAEIDVWHSNAYAYAFTP HACGSKMRYHICETt:NCGGTYSCDRFAGYGDANGCDyN?YRMGNKDFYGIÍGKTtrBTKRKFTV\73RES3YIRL3QFF VQDGRKIEVFP PTW FGLPN SAD-IT PELCDAQFRVFDDRBRF AETGGFD ALKE ALT IPMVLVMSI WtQHH 3NM1.WL DSSYPPEKAGLPGGDRGFCFTTSGVPAEV3AQYPDAQWÍÍSNIRFGPIGSTVNV
CBHI Humicola grisea (CBH-d)
SEQ ID NO: 8
atgagatLtccttcaattctcactgcaqttttattcgcaqcatcct.ccgcatpagct-gctccagtcaacactaca acagaagatgañacggcacaaAtT.ccggctg&agctqt.catcggttacttaqattcagaaqgqgatttcgatgtt cctgttttgccattctccaacagcacaaacaacggcttattqtttataaatactactactgccagcattc-ctgct aaagaagaaggggtatctttggataaacgrgaggcggaagcaccctctcagcaggcítggtacpattactgctgs.q aaccacccaagaatgacctggaagagatgctctggtccaggaaactgteagaccgtccagggcgaggttgtyatt gacgctaattggagacggr. tgcacaacaacggccagaactgt t.acgagaqt aacaagrqgacctctcaqtgttct tctgctaccgactgtgctcagagatgtgccttggacggtgccaactaccagtctacctacggágcatctacctct ggtgactctcr.gaccctgaagt 7cgttaccaagcacgagtacggaaccaacar.cggct.ctagattaaacc t gatg gccaaccagaacaagtaceagatgttcaccctgatgaacaacgagttcgcctttgaegttgacctgtct&agctg gagtgcggtatcaactctgccctgtactr.cgttgctatggaagaggaccgtggaatggcttcttacecatctaac agagccgctgctaagcacggtaccggttactgtgacgcccagtgtgotagagacctgaagttcatcggtgg&aag gccaacatf.gagggtp.ggagacc!at.ctacc:ancgacccaaacgctggtgttggrccaatgggagcttgttgtgc’c gaga t.tgatgc.gt.gggagr.cr.aacgcttacgcctacgcttttaccccacacgcttgcggtcctaagaacsga tac cacatotgcgagaccaacaactgtggtggaacctactctcacgacagattcgctggatactgcgacgctaacggt
tgtgactacaacccatacagaatgggcaacaaggacr.t.ctacggcaagggaaagaccgttgacaccaacagaaag ttcaccgtggtgccgagat“cgagagaaacacactgtcgcagttctttgtgcaggacggcagaaagattgaggtc ccaccaccaacttggccaggattgccaaactccgccgacattaccccagagttgtgtgaogctcagttcagagtg ttcgacgacagaaacagatítgctgagaceggtggttttgacgctttgaacgaggctctgaceattccaatggtg ctgctgatgtctatttgggacgaccaccactctaacatgttgtggctggactcttcttacccaccagagaaggct ggattgccaggtggtgacagaggaccEitgtccaactacttcgggtgttccagctgaggttgaggctcagtaccca gacgctcaggttgtgr.ggtcgaacatcagattcggcccaatcggttctaccgtgaacgtgtaa
Secuencia codificante de CBHI Humicola grisea fusionada con el péptido de señal de factor alfa
SEQ ID NO: 9
heagtvtaenhpsltwqqcssggscttqngkwidanwrwhtcsgytacytgntwdtsicpddvtcaqncaldg adysgfcygvttsgnalrlnfvtqssgkaigsrlylIqddttyqi fkllgqef t fdvdvsnlpcglngalyfvamd adgnlskypgnkagakygtgycdsqcprdlkfinggar.vegwqpsandpnagvgnhg3scaemdvweausistav
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5
CBHI Thermoascus auratiacus (CBH-e) SEQ ID NO: 10
atgagatttcc¿tcaatttttactgc.agttttat.t.cgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaaeactaca acagaagacgaaacggcacaaattccagctgaagctgccatcggttaci.tagatctagaaggggatttcgat.gtt gctgttttgccatfcrr.ccaacagcacaaataacgggttattctttahaaat.actae!r.attgccagcattgctgct aaagaagaaggggtacctttggataaacgtgaggcggaagcaccctctcacgaggccggtaccgtaaccgcagag aatcacccttccctgacctggcagcaatgctccagcggcggtagttgtaccacgcagaatggaaaagtcg”tatc gatgcca&cLggcgttgggtccataccacctccggatacaccasctgctacacgggcaatacgtgggacaccagt atctgtccc3acgacgtgacccgcgc!tcagaat.tgtgccttggatggagcggattacagtggcacccatggrgtt acgaccagtggcaacgcccr.gagact.ga a ctttgtcaccce.aagctcagggaagaacattggct.cgcgcczgtac ctgctgcaggacgacaccacccatcagatctfccaagctgctgggt-.caggagtctaccttcgatgtcqacgtctcc aacctcccttgcgggctgaacggcgccccccaccttgtggccatggacgccgacggcaat.ttgtccaaataccct ggcaacaagycaggcgctaagtacggcacuggtcactgcgactctcagtgccctcgggatctcaagtteatcaac ggtcaggccaacgttgaaggctggcagccgcctgccaacgacccaaatgccggcgttggtaaccacggttcctcg Lgcgctgagatggatgtctgggaagccaacagcatcccr.actgcggtgacgcctcacccatgcgacacccccggc cagaccatgtgccaggcagacgactgtggtggaacccacccctccactcgatatgctggtacctgcgacaccgat ggctgcgacttcaatccttaccagccaggcaaccactcgttctacggccccgggaagatcgtcgacactagccec aaart caccgtcgtcacccagttcatcaccgacgacgggacaccct ccggcaccctgacggagatcaaacgcttc tacgtccagaacggcaaggtgatcccccagfccggagtcgacgaccagcggcgtcaccgacaactcaatcaccacc gagr.attgcacggcccagaaggcagccttcgacaacaccggcttcttcacgcacggcgggcttcagaagatcagi caggctccggctcagggcatggtcctcgtcatgagcctgtgggacgatcacgccgccaacatgctctggetggac agcacctacccgactgatgcggacccggacacccctggcgtcgcgcgcggtaeccgccccacgacctccggcgtc ccggccgacgtggagtcgcagaaccccaattcatatgctatezastecaacateaaggtcggacccatcaactcg acctt cacogc^sactaa
Secuencia codificante de CBHI Thermoascus auratiacus fusionada con el péptido de señal de factor alfa 5 SEQ ID NO: 11
atgagatttccttcaatttttactgcagttttatccgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacsctaca acagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttágatttagaaggggatttcgatgtt gctgtttcgccattttccaacagcacaaataacgggctactgtttataaatactactatt-.gccagnattgctgcc aaagaagaaggggtatctttggataaacgfcgaggcggaagcaccctcctcagcttgtacactgcaatccgagact cat.ccacctctaacgtggeaaaagtgtagttctggcggaacttgtactcaacagactggtagtgccgtgatagat-. gctaactggagatggacacatgaaacgaactcctcaactaactgctacgaíggtaacacc!tggr.ct.tctacattg tgtcctgacaacgaaacctgcgctaagaactgttgtcttgaLggsgcagcttaegcaagtacatatggtgtgcict acctctggtaacagcctttccattggttrtgtaacccagtcggctcagaagaatgttggtgctagattg-acctg
atggcttcagacaccacataccaggagttUacctc.gttgggsaacgagtcctecttcgacgtagatgtgtcccag
ctaccatgtggattgaatggagcctagtactttgtctcaatgcaGgcagacggaggtgtttcaaagtaccctact aacacagctggtgctaagtatggaadtggatactgcgattctcaatgcocaagagacctgaagttcatcaacgga caagctaacgttgaaggttgggaaccctctagcaacaacgcaaacactggaat.tggtggtcatggttcttgctgu tcagagatggacatttgggaagccaactccatcagtgaagctttgactccacacccatgcacaaetgttgggcaa gaaatttgcgaaygtgatggttgtggtggcacttactctgataacayatacggcggaacatgtgatecagatgga tgtgattggaacccatacagactgggtaacacttcgttttacggaccaggttettccctcactctagacactacg aagaagttgactgtggtcacccaatttgagacctctggtgccattaaccgatactacgcgcagaacggagttact ttccaacagccaaacgccgaattgggtagtcactcaggcaacgagcttaacgatgaetactgcactgctgaagaa gcagaatttggtggatcttccttttcggataagggtggattgacgcagtdcaagaaagctacctctggtgcaatg gttctagtcacgagtctgtgggacgattactacgctaacatgctttggctggactctacttaccctacaaacgag acatettctactcctggcgctgtaagaggtaget.gtcctacatcttctggagttccagcccaagttgagagtcaa agtccaaatgccaaggtcaccctctccaaeatcaagttcggaccaattggtagcacaggtaatccttcaggtggt aatcctccaggtggaaacagaggaacaacgacaactagaagaccagctactacaactggttcaagteeaggtcca actcaatcacactacggteaatgtggtagtatagyttactctggtcccactgtttgtgcttccggcaccacttgc caagttctgaaccct tactactcacagtgtctagcttctgcacaccatcñtcatcatcñttaatgat.aa
Secuencia codificante para la CBHI Trichoderma reesei (CBH-c), que incluye péptido de señal de factor alfa y etiqueta 6x His.
10 SEQ ID NO: 12
QSACTLQSETKPPLTKCKCSS-SGTCTQQTGSWIDAWWRVíTHATNSSTNCYDGKTWSSTLCPDNETCAKNCCLDG AAYASTYGVTTSGNS LSI GFVTQSAQKNVGARL, YLMASDTTYQ Y FTLLGNE FS FDVDVSQLPCGLNGALYFVGMD ADGGVSKYPTRYAGAKYGTGYCDSQCFEDLKFINGQANVEGWEPSSKNANIGIGGHSSGCSEMDIWEANSISEAL TPHPCTTVGQEICBGDGCGGTYSDRRYGGTCDPDGCDWKFYRIjGKTSFYGPGSSFTLDTTKKLTVVTQFETSGAI NRYYVQNGVTFQQPNAELGSYSGNELHDDYCTAEEAEFGGSSFSDKGGLTQFKKATSGGMV jVMSLWDDYYAI'IML WLDSTYPTNETSSTPGAVRG3CSTSSGVPAQVESQ3PHAKVTFSNIKFGPIGSTGNP3GGNPPGGTIRGTTTTRRP ATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL
CBHI Trichoderma reesei (CBH-c)
atgagazttcctccaatttttacwgcagttitattcgcaccatcctocgcattagctgc-ccagtcaacaczaca acacaagatgaaacggcacaaat"ccggctgaagcfcgtcatcggttacttagaf.T:tagaaggggat-tcgatgtt gctgtt t cgccattttccaacagcacaaataacgggt.t.attgtttataaatactactactgccagcartgct gct aaagaagaaggggiatcrttcgataaacgngaggcggaagcaccctc^caatctgcttgcaccttgcagr.ctgaa ac-cacccaccattgacctggcagaagtgttottctggcggtacttgtactcagcagaccggttctgttgttatc gacqccaactggagatggactcacgctaccaactctcctaccaactcccacgscggtaacaettggtcgtctacc ttgtgtcoagacaacgagacctgtgccaagaactgtr.gtcr.ggacggtgctgcttacgcttctacctacggtgtt accacctctgataactcgctgtctatcggttí:cgttacccagtccgccca9aaaaatgttggtgccagacr.gcac ttgatggcttctgacaccacctaocaagagcttaccctgctgggraacgagttctccttcgacgtggacgtttct caactgccatgtggactgaacggtgccctgtactccgttcctarggacgctgacggtggtgtttctaagtaccca accaacaccgctggtgctaaatacggaaccgg^tacr.gcgattc'Lcagtgaccaagagacctgaagttcatcaac ggacaggctaaogttgaaggatgggagocatc£cctaacaacgccaacaccggtattggtggtcacgcttcttgc tgttctgacatggacatctgggaggc2aact.cr.att£ctgaacctt:gaccccacacccatgtactac£gtgggt; caagagatctgtgagggtgatggttgr.ggtgg-aot£.actcggacaacagatacggtggtacttgtgaoccagac ggttgtgattgggacccatacagactgggtaacasctctttctacggr.ccaggatcttcttttaccctggacacc
accaagaagttgaccgttgtzacccagtttgag&cctctggtgccatcaacagacactacgtgcagaacggtgtt actttccagcagccaaacgctgaaccgggatc:ttactctggcaacggactgaacgacgacr.actgtactgatgag gaagctgagttcggtggttcrtc-ttctctqacaagggtggact.gacccsgtttaagaagactacc-ctggcgga a£ggtgc£ggctatgtc¡tttgtgggacgac£actacgctaacatgctgr.ggcttgactcfcacctacccaactaac gagacctcttctaccccaggCgcZgttagaggatct tgct ctacatcttctggtgttccagctcaggttgagtct cagtctccaaacgccaaggtgacctrctcr.aaqatcaagttcggtccaatcggztctaqtggtgacccatctggt ggtaacccaccaggí.ggaaacccacctggtactaccactaccagaagavcagctaacac:uadtg9ttcttctcca ggtccaacccaaCcccactacggtcagtgtggtggtattggttactctggdccaaccgtttgtgcttctggaacc aeccgtcaggttctgaacccatactactcgcagtgcctgtaa
Secuencia codificante para la CBHI Trichoderma viride, que incluye péptido de señal de factor alfa. SEQ ID NO: 14
QSACTLCSETHPPLTWQKCSSaCTCTQQTGSWIDAHWRWTKATNSSTNCYDGNTWSSTLCPDNETCAKNCCLDG
AAYASTYGVTTSGIJSLSIGFVTgSAQíOyVGAREYLMASDTTYQEFTLLGHEFSFDVGVSQLPCGLNGALYFVSKD ADGGVSKYPTNTAGAKYGTGYCDSQCFRDLKFINGQANYEGWEPSSNNAH'TC-IGGHGSCCSEMDIWEANSISEAL TPH PCTTVGQ31CEGDGCC-GT Y 3DNRYGGTCDPDGCDWD P YRtGYfTS F'íGPGSS FTLDTTKKLTVVTQFETSGAI NRYYVQNGVTPQQPNAELC-SYSGNGLNDDYCTAEEAEFGGSSFSDKGGLTQFKICB.TSGGHVLVMSLWDDYYAl'IML VÍLDSTYPTNET3STPGAVRGSCSTSSGVPAQVESQSPNAKVTFSPTIKFGPIC-STGDPSGGEFPGC-NPPGTTTTRR 5 PAPTTGSSPGPTQSHYGCCGGiGYSGPTVCASGTTCQVLISPYYSQeE
CBHI Trichoderma viride (CBH-f)
SEQ ID NO: 15
atgagattqccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactaca
acagÉaqaGgaaacggcacaaattccggctgaagccgtcaccggttacttagacttagaaggggattccgatgtt gctgttttgccattttcc&acagcacaa-ataacgggttatcgtttat&aa-accactattgccagcatcgctgct aaagaagaaggggtatctttggataaacgtgaggcggaagcatgctcgcagcaggctggtacaattactgctgac aaccatccaagaatgacgtggsagagadgtagtggtcsagqaaactgtcagactgttcagggtgaggtcgdgata gatgctaa.ctggagatggttgcataacaacggccagaactgctacgagggcaacaagcggacctctcagtgt.tct cctgctaccgactgcgctcagacatgr.gotctt.gatggagnaaactaccagagr.acatatggtgcir.t ctacctct ggtgacagccttaccctgaagtttgtaaccaagcacgagtacggaaccaatatcggttctagattctaccegato gctaaccagaacaagtaccagatgtttaetttgabgacicaacgac'ttccccttcgacgtagatctgt-í;taaggtg gagtgtggaatcaattctgccttgtactttgtcgctatggaagaggacggaggtatggcttcttaccctcctaac agagctggtgctaaqtatgq&actggatactgeqatgcccaacgcgctagagacctgaagttcateggtggaaag gctaacattgaaggttggagaccttctaccaacgacccaaacgctggagttggtccaatgggtgcttgctgtgcc gagattgacgtgtgggaatctaa tgcreacgcctacgct r.t tac t.ccaca tacé tgcggtt.ctaagaacaga tac eacatLtgcga&acca&caactgtggtggcacctactctgatgacagattcgccggacactgtgatgctaacgga tgtgattacaacccatacagag.tgggtaacaaggact£ttacggasagggtaagactgttgacactaacagasag ttcactgtggcctcgagatt tgagagaaacagactgtcgcagltctttgtgcaggacggaagaaagactgaggtc ccaccaccaacttggccaggattgccaaactct.gccgacar.taccGcagagtt.gt.gcgacgctcagtccagagtg tttgacgacagaaacagatttgctgagaccggtggatctgacgctttgaacgaggctctgaccatcccaacggtt ctagtcatgagtatttqggacgatcaccactctaacacgctttggctggactectctcaccctccagagaaqgct ggattgcctggtggtgacagaggtccaagtccaacaac ttctggagttccagccgaggt tgageietcaacaccca gacgcccaggtcgtgtggtccaacatcagattcggaccaattggaagcttaacaggtaatccttcaggtggtaat cctccaggtggaaacaaaggaacaacgacaactagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaact caatcacaccacggtcaatgtggtggcataggttaccctggtc-ccactgttcgtgcttctggtactactcgccaa gttctgaaeecttactactcacagtgtctagettctgcacaccatcatcateatcattaa
Secuencia codificante para la proteína de fusión del dominio de unión a celulosa CBHI Humicola grisea - CBHI 10 Trichoderma reesei que incluye el péptido de señal de factor alfa y etiqueta 6x His.
SEQ ID NO: 16
qqagtitaenhprm'wkrcegpgncqtvqgewidaiiwrwlhraiggncyegnkwtsqcssatdcaqrcaldgany
qstygastsgdsltlkf vt.kheygt.rii cari y ImanqnkyqirLS tirarme fafúvdlskvecg iris al yf vtime ed ggmasypsnragakygtgysda.ffca.ro.] kf i ggkan.isgwrpst.ndpHagvgpmgascaeidvT*.'asnayayaf t.p hacgskr.ryhicetnncggcysddrfagycdangcclynpyrmgnkclfyckgktvdtnrkftvvsrfera.rlsqf f vqdgrkievppptwpglpnsaditpelcdaqf rvf ddmif aetggf daliisaltipiT'vlvmsiwddhhsnniIwl dssyppekaglpyg<Jrgpcpptsgvpaeveaqypdaqwwsnirígpigsitgnpsggnppggn.rgtPttrrpat
Ltgsspgptqshygqcggigysgptvcasgttcqvlnpyysqclasahhkhhh.
Proteína de fusión de dominio de unión a celulosa CBHI Humicola grísea - CBHI Trichoderma reesei que incluye una etiqueta 6x His (CBH-g)
5 SEQ ID NO: 17
atgagatttccttcaatttttaccgcagttttattcgcagcascctccgcattagctgctccagtcaacactaca acagaagatgaaacggcacaaatrccggctgaagctgtcarsggttacttagatttagaagaggatttcgatgtt gctgtttpgccactttccaacagcacaaataacgggttaptgtttataaatactactattgccagcattgccgct aaagaagaaggggtatcttt.ggar.aaacgt.gaggcggaagcatgctcgcagcaggocggcacggcgacggcagag aaccaccsgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcascacccagaacggggcggtcgttsst gatgcgaactggcgttgggfcgsacgatgtga&cggatacaccaactgctac&cgggcaatacctgggaccccacg tactgscctgacgacgaaaüctgcgcocagaactgtgcgctggacggcgüggattacgagggcac:ctacggcgtg acttcgtcgggcagctcctsgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcscgtctctacctgctgcag gacgastcgacctatcagascctcaagctcctgaaccgcgagstcagctttgacgtsgatgtctccaatcttccg tgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaag gctggtgcoaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacaggacctcaagttcatcgacggcgaggcc aacgtcgagggctggcagccgscstcgaacaacgccaacacsggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggag atggatgtctgggaagcaaacagcatctcca.at.gcggtcacsccgcacccgtgcgacacgccaggccagacga:g tgctc-ggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgc"acgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgac t. tcaacccttaccgcatgggcaaca ct t ctttctacgggcctggcaagat.cstcgataccaccaagcccttcact gtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccag aacagcaacgtcattccgcagcccaact-cggacatcagtggcgtgaccggcaactcgaLcacgacggagttccgc actgstcagaagcaggcctttggcgacacggacgastt.ctctcagcacggtggcctggccaagatgggagcggcc atgcagcagggtatggtcctggtgatgaqtttgtggqacgactacgccccgcagacgctgtggttggattcggac tacccgacggatgcggaccccacgacccctggtattgccdgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcg gatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgaccsactcgaacattaagtttggtccgatcggtagcacaggt aatCCtscagctggtaatcstscaggtggaaacagaggaacaacgacaast,agaagaccagct.a.ctacaact.ggt. tcaagcccaggtccaactsaatcacactacggtca.atgtggsggtataggttactccggtcccactqtttgtgct tctggpactacttgccaagptctgaacccttactactcacagtgtctagcttctgcacatcatcaccaccaocat ta.atga.taa
Secuencia codificante para la fusión de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei que incluye péptido de señal de factor alfa y etiqueta 6x His.
SEQ ID NO: 18
QQAGTATAENHPPLTWOECTAPGSCTTGNGAVAGíDAKKRWVHDVNGYTIÍCYTGNTWDPTYCPDDETCACNCALDG ADYEGTYGVTSSSSSLKnNFVTGSIJVGSRLYLLQDDSTYQrFKLLNREFSE’DVDVSNLPCGYNtíALYFVAMDADC- GV£KYPHHK,Y3AKYGTGYCDSQC?RDLKFIDGEAEVEGk'QPS33aJANTGIGDHGSCCA.EMDWEAKS:SNAVTPH pCDTPGgTMCSGDDCGGTYSKDRYAGTCDPDGCDFISFyRKGNTSFYGPGKIIDTTKPFTWTQFIiTDDGTDTGTL SEIKRFYIQYSN’v'IPQPIMSDXSGV'rGNSI YTEFCTAOKOAFGDTDDFSQHGGLAKMGAAMQQGMVLYMSLWDDYA AQMLWLDSDYPTDADPTTPGIAS.GTCPTDSGVPSDVESQSPHSYVTYSNI KFGFIGSYGNPSGGNPPGGNRGTTT 10 TRRFATTTGSSPGPTGSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCC-VLNPYYSQCLASAHHHHHH
Secuencia madura de la fusión de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei con etiqueta 6x-His (CBH- ah)
SEQ ID NO:19
atggccagCgatctgg oacaqeaggc tggtacaat LactgcLgagd.acca.Lcco.agciatgcicgtggaagagatqt agtggtccaggaaactgtcagac^gtt^agggtgaggtcgtgatagatgctaactggagatggttgcataacaac ggccaga.actgctacgagggtaacaagrggacctctcagtgttcttctgctaccgactgcgctcagcTgaf.gf.gct cttgatggagcaaact.accauagi:aca'i.atggtgc:tt.ct.acct ctggtgacagccttaccctgaagt t tgtaacc aag£aegagtr>cggaac cao tat-cgqttcr.ogact^caoctgatggcr.aaccagaa-caagtac caga t.gt. cese c tcgacgaacaacgagtt cgccttcgacgtagacc tgtct&aggtggagtgtgga&tcaai:t;ct.gccctgCACt:L L gtcgctatggaagaggacggaggtatggcttcttacccttctaacagagctggtgctaagtatggaactggatac tgcgatgqccaavgcgccagagacct.gaagttcatqggtggaaaggctaacattgaaggttggagaccttctacc aacgacccaaacgctggagttggtccaatgggcgcttgctcrgccgagattga-cgtgtgggaat-ctaacgcttac gcctacgcctttactocacatgettgcggttceaagaacagaLaccaeatttgcgaaaecaacaaecgtgghggc rinttacta^igíih-^tíeaeaL L ccjc ¿.'.ggaaactgt:ga l:.gc taacggaf:g‘hgat t.a cía a cena t.a caga aágqgt.a ac aaggactttr.acggaaagggtaagactgttgacaet.aacagaaagr.t.cactgtggtc'r.^gagat.txga.gagaaac a_gaetgtcgcagatctttgtgcaggacggaagaaagattqaggtcccaccaccaact:aggccaggautgccaaac tctgccgacatt accccagagt-t gtyegacye i: cay tit cay aylg'-t egacgacagaaacagatttgctyagacc g^tggatttgacgctttgaacgaggcxetgaccactceaatgg'ctctagtcatgaytatttgggacgatcaccac teLaacacgcttrggctggactcttctcacccrccagagaaggctggattgcctggaggcgacagaggteeaLqt ■
coaacaacttctggagttccagccgaggttgaggctcaatacccagacgcccaggtcgtgtggaccaacatcaca
ttcggaccaat-Cggtagcacagt-gaat-gr-ggctt:-ct-gcacaccaL-catcatcatcattga
Secuencia codificante alternativa de CBHI Humicola grísea con secuencia de señal
SEQ ID NO 42 [P]
LQACTA.TAENHPPLTWQECTAPGSCTTFA'GAVVLDANWRWVHDVNGYTNCYTGNTWDPTYCPDDVTCAQNCCLDG ADYEGTYGVTSSGSSLKLKFVT38NVGSRLYLLQDDSTYQIFKLLHREFSFDVDVSNLFCGLNGALYFVAMDADG GYSKYPNNEGIGAKYGTGYCDSQCPRDLKFINGMANVEGWQPSSNNANTGiaDHGSCCAEKDVWEñNSISNAVTLE PCDTFGQTMCSÜDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFNPYRMGNTSFYGPGKIIDTTKPFTVVTQFLTDDGTDTGTL SEIKRFYFQNGNVIPQPKSIISGVTGNSITTEFCTAQKQAFGDTDEFSKHGGLAKMGAAMQQGMVLVMSLWDDYA AQMLWLDSDYPTDADFTVFGIARGTCPTDSGVPSDVESQSPNSYVTFSKIKFGPiMSTVEC-LDGSTPSaPTATVA 5 PPTSTTTSVRSSTTQISTFTSQPGGCTTQKKGQCGGIGYTGCTKCVAGTTGTELNPWYSQCLAñAHHHHHK
Mutante de CBHI Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa I Chaetomium thermophilum con etiqueta 6x His
SEQ ID NO 43 [N]
ctgcaggcctgcacggcgacggcétgagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgc
accacaaggaacggggcggtagttct.tgatgcgaac;tggcgAtgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgc
tacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgtaacctgcgcccagaactgttgcctggacggc gcggat cacgaggqcacctacggcgLgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaaattcqtcacccggtcgaac gtcggaccccgtct ct acctgccgcaggacgactcgacctat cagatcthcaagcr.cctgaaccgcgagt.t.cagc tttgaogtcgatgtctccaa"cztcc3"gcgcattgaacggcgctctgtactttgAcgccatggacgccgacggc ggfigtgr.ccaagtacccgaa^aacaaggctggtgcsaagtacggaaccgggtat tgcgactcccaatgcccasgg gacctcaagttcatcaacggcaeggccaacgtcgagggctggcagccgtcatcgaacaacgccaacaecggaact ggcgaccacggctcctgetgcgcggagatggatgttcgggasgcasacageatctccaatgcggtcactctgcac ccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctcLggagatgaotgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcg ggaacctgc.gatcctgscggcogtgactccaacccttaccgcatgggaaacñ otf-ccttttacgggcctggcaaq atcatcgacaccaccaagcccctcacagacgtgacgcagttcctcact.gatgafgg-.acggatactggaaccctc agcgagar.caffgcQcttctacatccagaacggcaacgtCñtT.ccgcagcccc.actcgatcatcagtggcgagacc ggcaactcgatcacgacggagrtctgcactgctcagaagcaggcctttggegacacggacgaatLctctaagcac ggtggcctggccaagatgggagcggccargcagcagggtatggtcctggtgatgagtttctgggacgactacgcc gcgcagacgctgL-ggl. tggatr.cegacLacccgacggatgcggaccccacggtccc;ggtattgcccgtggaacg tgtccgaogqactcgggcgtcccatcggatgtcgagccgcagagccccaactcctacgtgaccttctcgaacatt aagtttggtccgatcaactcgaccgtccctggcct-.cgacggcagcacccccagcaacccgaccgccaccgTtgct cctcccacttctaccaccaccagcgtgagaagcagcactactcagatttccaccecgactagccacocaggaggc tgcaccacccagaagtggggccagtgcggtggtatcggctacaccggctgcactaactgcgttgctggcactacc tqcaCi-gagctCc.acccctggtacagccagtgccuggcL.tccgctcat-catcaccatcaccac
Secuencia codificante para el mutante de la CBHI Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa I Chaetomium 10 thermophilum con etiqueta 6x His
SEQ ID NO 44 [P]
LQACTATAENHPPLTWQEGTAPGSCTTRNGA/AELDANWRWVHDYFIüY'TFIGYTGNTWDPTYCPDDVTCAQNCCLDG
adyec-tygvtssgsslklnfvtgsnvgsrgyllqddstyqifkllnrefsfdvdvsnlpcglngalyfvamdadg
GVSKYPNNItñGAKYGTGYGDSQCPRDLKFIKGKANVEGWQPSSNHAHTGIGDRGSCCAEMEY'WEAYSISNAVTLH PCDTPGQTMCSGDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFMPYRMGYTSFYGPGKIIDTTKPFTVVTQFLTDDGTDTGTL SEIKEFYTONGNVIPOPnSIISGVTGNSITTEFCTAQKCAFGDTDEFSKHGGLAKf-IGAAMQQGKVIjVMSLWDD’iA &QKLKLESDy?7DADPTVI*CIARGTCPT3SGVP$CVESCSPNSYVTFSKIK2’3PINSTYlrGTVSSSSVSSSHSST STSSSHSSSSTPPTQPTGVTVPQWGQCGGIGYTGE PTCAS PYTCHVLKPYYSQCYASAHHHHEII
Mutante de CBHI Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Phanerochaete chrysosporium con etiqueta 6x
His
SEQ ID NO 45 [N]
ctQcaggccrgcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatc'caccgcccctgqgagítgc aecaccaggaaeggggcggtcgttctt-gatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaocggatacaccaactgc tac&cgggcaatacctgggaccccacgtactgcíc-gacgacgcaacctgcgcccagaactgttgcct.ggacggc gcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtsgaac gtcggatcccgtctcLacctgctgcaggaegactcgacctatcagatcrtcaagctect-gaaccgcgagttcagc tttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggc ggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggrgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgg cscctcgagttcatcaacggcatggccaacgtcgagggctggcagccgtcatcgaacaacgccaacaccggaart ggcgaccacggct.catgcc.gt.gcggagatggatgt ctgggaagcaaacagcatctccaatgoggt cactotgcac ccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgGtczggacaúgactgcggtggcacatacrctaaagatcgctñCgcg ggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttc-acgggcct.ggcaag atcatcgataccaccaagcccttcae LgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggUacggaíactggaactctc agcgagaccaagcgcttcaacatccagaacggcaacgtcattccgcagcccaactcgatcatcagtggcgtgacc ggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcct. ttggcgacacggacgaattctrtaagcac ggtggcctggccsagatgggagcggccatgcagoagggtatggtcctggtgatgagttígtgggacgactacgcc gcgcagatgctgtgg-r.ggattccgact.scccgacggatgcggaccccacggtccctggtar.tgcccgtggaacg tgtccgaeggactcgggcgtcccatcgqstgtcgagtcgcagagccccaactcctacqtgaccttctcga.acaut aagtttggrccgatcaactcgacctacactggaactgtttcttcarcctccgtttcatcttctcactcctccact tctacttGatctteccattoctcatcttccactccaccaactcaaccaactgctgttactgtLcoacaatgggga caatgtggtggtattggttacactggttccactacttgtgcttccccatacacttgtcacgttttgaacccatac tactcccaatgtcacgcttctgctcatcstcaccatcaccacraa
Secuencia codificante para el mutante de la CBHI Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Phanerochaete 5 chrysosporium con etiqueta 6x His
SEQ ID NO 46 [P]
lqactataenhppltwgectapgsíitírpgavvldanwrwvhdviigytncyLgntwdptycrpddvtcaqnccldg adyegtygvtssgselklnfvtgonvgsrlyllqdástyqiCkllnrefsfdvdvsnlpcglngalyfvamdadg
gvskypnnkaga kyg tgycdsqoprdlkf ingraanvegwqps snnantg igdhgsc ca emdvweans i snavt1h
pcdtpgqtrncsgddcggtysndryag-cápdgccfr.pynignrsfygpqkiidttkpf twcqf ltddgtdtgtl seikrfyigngnvrpqpn.siisgvzgn.sitteÉctaq)íqaf gdtdef skhcglakmgaamgqgmvlvmslwddya aqmlwldsdypí;dadptvpgiarg-cptdsgvpeávesqBpnsyvtfsi:ikfgpiiistftggrtsesstttttsk ststsEsskttttsvtttttspgasgtgaahwaqcggngwtgpttcvspytatkqridwvsqclaeahhhlihh
Mutante de la CBHI Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Penicillium janthinellum con etiqueta 6x His
SEQ ID NO 47 [N]
ctgcaggcccgcacggcgacggcagagaaccaecjcgccectgacatggcagg&atgcaccgcccctgggagergc
accaccaggaacggggsggtcgttcttgatgcgaact.ggcgtcgggtgcacgatgtgaacggatacaccaacpgc
tacacgggcaatacctgggaccccacgtsctgc2=tgacgacgtaaccr.gcgcccagaa=tgttgcctggacggc
gcggattacgagggcaccr.acggcgt.gíietl.dg'.'.cgggcsgctccttgaa.actcaatttcgtcaccgggtcga.ac gtcggatcccgtctetacccgctgcagc&cgac: regacetatcagatctt caagctcctgaaccgcgagttíage tttcacgr.cgatgtctccaatcttccgtgcggattgaaegccgctctgLactt tgtcgc=atggacgccgacggc ggcgt.gtccaagtaccggaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattccgactcccaatgcccacgg gacctcaagttcatcaacggcatggccaacgtcgagggctggcagccgtcatcgaacaacgccaacaccggaatt ggcgaccacggctcctgcígtgcggagatggatgcctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactí-gcac ccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcg ggaacstgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcargggcaacacttcr.r.tctacgggcctggcaag atcatcgataccaccaaqcccttcactgtcgtgacgeagtLccrca.ctcatcfatqqt-acgqa'ractggaaccctc agcgagatcaagecct t. crac ate cagaacggcaacgtcattccgcagcccaact.cga.tcat cagtggcgtgacc ggcaactcgatcacgacggagttctgcactgcrtcagaagcaggcctttggcgacaoggaogaattctctaagcac ggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggwcctggtgatgagtt^gtgggacgactacgcc gcgcagatgctgtggi.t.ggattccgactacccgacggatgc:ggaccccacggrccctggtaítQCCCgtggaacg tgtccgacggactcgggegtcceatcgg&tgtcgagtcgcagagccccaactcetacgrgaccttctcgaacatt aeqitttggtccgatcaactcgaccttcactggtggtaetacttcatcctcctccsctaccactacaactteeaaq tccactcccacttcatcttcatccaagactac.aactacttccgteacaactsctactacrtcctctggttctecL ggtactggtgctgctcattgggctcaatgtggrggtaatggatggactggtccaactacttgtgtttcecearae 10 acttgtactaagcagaacgactggtactctcaatgtttgccttccgctcíitcatcacearcaccac
Secuencia codificante para el mutante de la CBHI Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Penicillium janthinellum con etiqueta 6x His
SEQ ID NO 48 [P]
lq&ctataenhppltwqectapgscttrngavvldanwrw-7hdvngy-n.cytgntwdptycpddvtcaqnocIdg
adyegtygvtsflgsglklnfc'vtgsnvgssrlyllqddstyqifkllnrefsfdvdvsnlpcglngalyfvamdadg
gvskypniikagakyqtgycdsgcprdlkfingmanvegwqpsBnnar¡ cgigdhggccaemávweansísnavtlh pcdtpgqtmcsgddcggty sndryagtcdpdgcdfr.pyrnignt síygpgkiidttkpf twt.qf 1 tddgtdt.gt.1 seikrfycqngnvipqpnaiisgvtgnsittef ctaqkqáf gdcdef skhggIakmgaatr.qcjgriLvivm3lwddya aqmiwldsdyptdadptvpgiargtcptdsgvpsdvesqspnsyvtfsni.kfgpxnstftgtgetspsapagpva
sstsvasqptqpaqatvaqwgqcggtgítgptvcacpftclivvnpyysqcyasalihhhhh
Mutante de CBHI Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Irpex lacteus con etiqueta 6x His SEQ ID NO 49 [N]
ctgcaggcctgcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagnr.gc
accaccaggaasggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgitgggcgcacgatgtgaacggatacaccaacr.gc
tacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgtaacctgcgcccagaactgttgcctggacggc
gcggattacgagggcacctacggcgtg&ctt cgtcgggcagcr.ee t.r.gaaaatcaattt.cgtcaccgggtcgaa.c gtcggatcecgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcctcaagctcctgaaccgcgagttcagc
tttgacgtcgaegtctccaatcttccg tgoqgattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacaecgacggc ggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaeogggtattgcgactcccaatqcccacgg gacctcaagttcatcaacggcatggccaacgtcgagggctggcageegtcatcgaacaacgceaaeaccggaatt ggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcacgctgcac eegtgeqacaegeeaggceagacgatgtgctctggagatgact.gcggtggcacatactctaacgatcgetaegeg ggaacctgcgaccrtgacggctqtgacttcaaccatt-accgcatgggcaacacttct.ttctacgggecrggcaag atcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagtrcctcactgacgatqgtaaggatactggaaer ct c agcgaya.Lcaáqeycttctacateeaqaacygcaacgtcarcccgcagcccasctcgatcatcagrggcgtgacc ggcaactcgatcacgacggagttctgcacugcccagaaecaggcctttggcgacacggaccjaattctczaagcac ggtggcccggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtectggtyatgagtltgLgggacgactacgcc
gcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacggtccctggtattgcecgtggaacq tqtccgacggactegggcgecccatcggatgtcgagtcgcagagccccaaetcctacgtgacettctcgaacatt aagtt.t.ggtccgat.caact.cgacctr.cactggt.act.3gt.t.etact.tcí.ccatcttctccagctggt:rcagtttct tett ceacttccgtrgcttcccaaccaactcaaccagctcaaggta.eT.gtagttí'-aat.ggggaaaacgtggtggr actggtttcactggtccaactgtttgtgcttccccatrcacrtgtcacgtrgttaacccat.act.aereccagtgt tacgcttctgctcaccatcatcaccatcac
5 Secuencia codificante para el mutante de la CBHI Talaromyces emersonii con CBD celobiohidrolasa Irpex lacteus con etiqueta 6x His
SEQ ID NO 50 [P]
Iqactataenhppltwqectapgscttrngavvldanwrwvhdvngytncytgntwdptycpddvtcaqnccldg sdyegtygvtssgssIklr.fvtgsr.vgsrlyLlgddstyqifkllnref sfdvdvsnlpcglngaLyfvamdadg gvskypnrikagakygtgycdsqcprdl 3c f ingmanvsgwqps snnant gigdhgsccaemdvweans i snavtlh pcdtpgqtmcsgddcggtysndryagtcdpdgcdfnpyrrtgntsfygpgkiídttkpftvvcgfltddgtdtctl seikrfyiqngnvipqpnsiisgvtgnsittefctaqkqaígdtdefskhgglakmgaamqqgmvlvmslwdáya aqn'.lwldsdypedadptvpgiargtcp Ldsgvpadveaqspiisyvtf snikfgpigstgnpsggnpsggdggttt trrpatttgsspgptqslygqcggigysgpticasgttcqvinpyysqciasahhhlihh
Mutante de la CBHI Talaromyces emersonii con CBD Trichoderma reesei mutada con etiqueta 6x His 10 SEQ ID NO 51 [N]
5
10
15
20
25
ctgcaggcctgcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgc accaccaggaacggggcggt cgtt ct tgatgcgaactggcgc rgggtgcacgatgtgaacggat-acaccaactgc tacacgggcaaíacctgggaccccacgtactgccctgacg&cgtaacctgcgcccagaaccgttgcctggacggc gcggatr.acgagggaacctacggccr.gact.tcgt.cgggcagctcct tgaaactcaatttcgacaccggg- cgaac gtcggatcccgtctccacctgctgcaggacgactcgacc7atcagatcttcaagctcctgaaccgcgagTtcagc tttc'acqtcgacgtí tCCaaL-CttCCgtqcggacty-iacggcgctctgtactt t-gt.cgccatggacgccgacggc ggcgtg7ccaagtacccgaacaacaaggctggLgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgg gacctcaagttcateaacggcatggccaacgtcgagggctggcagecgtcatcgaacaacgccaacaccggaatt ggcgaccacggctcctgctgagcggagatggatgtccgggaagcaaacagcatccccaatgcggtcacLctgcae ccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgacagcggtggcacatactctaacgatcgccacqcg ggañcc7gcgatcc-.gacggctgtgacttcaaccct-7accgcatgggcaacacttctt.t ctacgggcctggcaag atcatcgataccaccaagccct tcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggataccggaactctc agcgagatcaagcgcttctacatccagaacggcaacgtcattccgcageccaactcgatcateagtggcgtcacc ggcaactcgatcacgacggagttccgcactgctcagaagcaggcet Ltggcoacacggacgaattctctaagcac ggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggcatggtcctggtgatgagtLtgcgggacgacfcacgcc gcgcagatgctgt.ggr. t.ggattccqactacccgacggacgcggaccecacggt ccctggtattgcccgtggascg tgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcccacgtgacc-tctcgaacatt aaett. tggtccgatcggtagcacaggta.atcc7tcaggtggtaatcct-tcaggt.ggagacggcggaacaacgaca actagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaactcaatcacr.ac acggtcaat.gtggt.ggtata ggttactctggtcccactatttgtqcttctggtactacctgccaacttctgaacccttaccactcacagcgtcta gcttctccacatcatcaccaccaccat
Secuencia codificante para el mutante de la CBHI Talaromyces emersonii con CBD Trichoderma reesei mutada con etiqueta 6x His
Listado de secuencias
<110> Süd-Chemie AG
<120> Enzimas de celulasa optimizadas
<130> 139 202
<150> EP10153355 <151> 2010-02-11
<160> 51
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1 <211>1509 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia codificante para la fusión de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei (CBH-a madura)
<400> 1
cagcaggccg
gcccctggga
gtgcacgatg
tgccctgacg
acctacggcg
gtcggatccc
aaccgcgagt
ctgtactttg
ggtgccaagt
gacggcgagg
ggcgaccacg
gcggtcactc
ggtggcacat
aacccttacc
aagcccttca
agcgagatca
atcagtggcg
tttggcgaca
cagcagggta
ttggattccg
tgtccgacgg
acctactcga
cctccaggtg
agtccaggtc
actgtttgtg
taatgataa
gcacggcgac
gctgcaccac
tgaacggata
acgaaacctg
tgacttcgtc
gtctctacct
tcagctttga
tcgccatgga
acggaaccgg
ccaacgtcga
gctcctgctg
cgcacccgtg
actctaacga
gcatgggcaa
ctgtcgtgac
agcgcttcta
tgaccggcaa
cggacgactt
tggtcctggt
actacccgac
actcgggcgt
acattaagtt
gaaacagagg
caactcaatc
cttctggtac
ggcagagaac
ccagaacggg
caccaactgc
cgcccagaac
gggcagct.cc
gctgcaggac
cgtcgatgtc
cgccgacggc
gtattgcgac
gggctggcag
tgcggagatg
cgacacgcca
tcgctacgcg
cacttctttc
gcagttcctc
catccagaac
ctcgatcacg
ctctcagcac
gatgagtttg
ggatgcggac
cccatcggat
tggtccgatc
aacaacgaca
acactacggt
tacttgccaa
cacccgcccc
gcggtcgttc
tacacgggca
tgtgcgctgg
ttgaaactca
gactcgacct
tccaatcttc
ggcgtgtcca
tcccaatgcc
ccgtcttcga
gatgtctggg
ggccagacga
ggaacctgcg
tacgggcctg
actgatgatg
agcaacgtca
acggagttct
ggtggcctgg
tgggacgact
cccacgaccc
gtcgagtcgc
ggtagcacag
actagaagac
caatgtggtg
gttctgaacc
tgacatggca
ttgatgcgaa
atacctggga
acggcgcgga
atttcgtcac
atcagatctt
cgtgcggatt
agtacccgaa
cacgggacct
acaacgccaa
aagcaaacag
tgtgctctgg
atcctgacgg
gcaagatcat
gtacggatac
ttccgcagcc
gcactgctca
ccaagatggg
acgccgcgca
ctggtattgc
agagccccaa
gtaatccttc
cagctactac
gtataggtta
cttactactc
ggaatgcacc
ctggcgttgg
ccccacgtac
ttacgagggc
cgggtcgaac
caagctcctg
gaacggcgct
caacaaggct
caagttcatc
caccggaatt
catctccaat
agatgactgc
ctgtgacttc
cgataccacc
tggaactctc
caactcggac
gaagcaggcc
agcggccatg
gatgctgtgg
ccgtggaacg
ctcctacgtg
aggtggtaat
aactggttca
ctctggtccc
acagtgtcta
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1509
5 <210>2
<211> 500 <212> PRT <213> Artificial
10 <220>
<223> Secuencia madura de CBHI Talaromyces emersonii/CBD Trichoderma reesei (CBH-a madura) <400>2
Claims (10)
- REIVINDICACIONES1. Un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEQ ID NO: 5 en donde el polipéptido se modifica en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Q1, Q2, T7, A8, N10, Q28, E65, S86,5 D181, E183, D202, P224, S311, N318, T335, D346, Q349, T392, T393 e Y422, y en donde el polipéptido mantiene50% de su máxima capacidad de transformación del substrato cuando la transformación se realiza durante 60 minutos a una temperatura de 62°C o superior.
- 2. El polipéptido según la reivindicación 1, que comprende además la modificación en uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos por sustitución o deleción en las posiciones G4, P12, T15, A21, G23, S24, T26, T27, N29,10 G30, A31, V32, N37, W40, V41, G46, Y47, T48, N49, C50, T52, N54, D57, T59, Y60, D64, A68, Q69, A72, V84, S89,S90, K92, S99, Q109, D110, D111, 1116, F117, K118, L119, L120, D129, V130, G139, A145, M146, V152, K154, Y155, N157, N158, K159, K163, G167, Q172, F179, 1180, E187, G188, Q190, S192, S193, N194, 1200, H203, D211, V212, A221, D228, T229, G231, T233, M234, S236, T243, Y244, S245, N246, D247, G251, F260, G266, K275, I276, I277, T280, L290, D293, G294, T295, T297, T299, S301, K304, F306, N310, V313, I314, D320, I321, T325, N327, 15 A340, F341, D343, T344, D345, H350, A354, K355, A358, Q361, Q362, G363, M364, V367, D373, Y374, A375,A376, P386, T387, D390, T392, P394, T400, P402, T403, D404, D410, N417, S418, T421, F427, P429, I430, G431, T433, G434, N435, P436, S437 o una o más inserciones de 5 aminoácidos después de las posiciones G151, o K159.
- 3. El polipéptido según la reivindicación 2, en donde uno o más de los siguientes residuos de aminoacidos son 20 modificados como sigue:
- Posición
- Modificado a.
- Q1
- L
- Q2
- P, S
- G4
- C
- A6
- G, L, V
- T7
- Q
- A8
- S
- N10
- T, D
- P12
- Q
- T15
- S
- A21
- S, T, C
- G23
- A, D, N
- S24
- T, C, N
- T26
- I, N
- T27
- S, Q
- Q28
- L, K, R, N
- N29
- T, Y
- G30
- A
- A31
- S
- Posición
- Modificado a.
- V32
- G
- N37
- S
- W40
- R
- V41
- T
- G46
- S
- Y47
- S, F
- T48
- A
- N49
- S
- C50
- S
- T52
- D
- N54
- S
- D57
- S
- T59
- M
- Y60
- H
- D64
- N
- E65
- V, M, K
- A68
- T
- Q69
- K, R
- A72
- V, C
- V84
- A
- S86
- T
- S89
- N
- S90
- T, F
- K92
- R
- S99
- T
- Q109
- R
- D110
- G, S, N
- D111
- H, E
- 1116
- V, K, E
- Posición
- Modificado a.
- F117
- Y
- K118
- A, T, Q
- L119
- L, I
- L120
- P, M
- D129
- N
- V130
- I
- G139
- S
- A145
- T
- M146
- C
- G151
- GCGRSG
- V152
- A, E
- K154
- R
- Y155
- S, C, H
- N157
- S
- N158
- D
- K159
- E, KCGRNK
- K163
- C
- G167
- C
- Q172
- Q
- F179
- I
- I180
- N
- D181
- N
- E183
- V, M, K
- E187
- K
- G188
- C
- Q190
- L, K
- S192
- L, I, P, T, M
- S193
- L, P, T
- N194
- G, L, I, V, S, C, K, R, D, Q, Y
- Posición
- Modificado a.
- I200
- N, F
- D202
- G, I, V, N, F, Y
- H203
- R
- D211
- G
- V212
- L
- A221
- V
- P224
- L
- D228
- N
- T229
- A, S, M
- G231
- D
- T233
- S
- M234
- L, I, V, T, K
- S236
- F, Y
- T243
- G, A, L, I, V, P, S, C, M, R, D, Q, F, Y, W
- Y244
- H, F
- S245
- T
- N246
- S, K, D
- D247
- N
- G251
- R
- F260
- C
- G266
- S
- K275
- E
- I276
- V
- I277
- V
- T280
- A
- L290
- H
- D293
- R, H
- G294
- A
- T295
- S
- Posición
- Modificado a.
- T297
- N
- T299
- I, S
- S301
- C
- K304
- R
- F306
- L, Y
- N310
- D, E
- S311
- G, D, N
- V313
- I
- I314
- F
- N318
- I, H, D, Y
- D320
- I, V, E, N
- I321
- N
- T325
- A, I
- N327
- Y
- T335
- I
- A340
- G, S, T
- F341
- C
- D343
- A
- T344
- M
- D345
- E
- D346
- G, A, V, E
- Q349
- K, R
- H350
- Y
- A354
- T
- K355
- Q
- A358
- E
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- R
- Q362
- G, R, H
- G363
- P
- Posición
- Modificado a.
- M364
- L, S
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- A
- D373
- E
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- A, P, S, C, R, H, D
- A375
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- T
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- A, I, V, S
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- S
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- K
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- F
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- L
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- D
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- S, E
- G434
- S, GAAATG
- N435
- Q
- P436
- S
51015202530- Posición
- Modificado a.
- S437
- P
- 4. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de una o más de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene preferiblemente al menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1.
- 5. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.
- 6. Una célula anfitriona transformada con un vector de la reivindicación 5, en donde opcionalmente(i) la célula anfitriona se deriva del grupo que consiste en Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Pichia, Hansenula, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Chrysosporium, Chaetomium, Acremonium, Candida y Yarrowina,y/o(ii) la célula anfitriona es capaz de producir etanol, preferiblemente una levadura derivada del grupo de células anfitrionas que comprenden Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilusy/o(iii) la célula anfitriona es una levadura metilotrófica, preferentemente derivada del grupo de células anfitrionas que comprenden Pichia methanolica, Pichiia pastoris, Pichia angusta, Hansenula polymorphay/o(iv) la célula anfitriona es un hongo filamentoso, preferiblemente seleccionado de las células anfitrionas que comprenden miembros del género Trichoderma, Aspergillus, Chaetomium, Chrysosporium Penicillium o Acremonium, siendo más preferiblemente seleccionados de una de las especies Trichoderma sp., Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chaetomium termophilum o Chrysosporium lucknowense.
- 7. Un procedimiento para producir una proteína celobiohidrolasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas:a. Obtención de una célula anfitriona, que se ha transformado con un vector que comprende el ácido nucleico definido en la reivindicación 4;b. Cultivo de la célula anfitriona en condiciones bajo las cuales se expresa la proteína celobiohidrolasa; yc. Recuperación de la proteína celobiohidrolasa.
- 8. Composición que comprende el polipéptido de una o más de las reivindicaciones 1 a 3 y uno o más endoglucanasas y/o una o más beta-glucosidasas y/o una o más celobiohidrolasas y/o una o más xilanasas.
- 9. Uso del polipéptido según una o más de las reivindicaciones 1 a 3 o de la composición de la reivindicación 8 para la degradación enzimática de la biomasa lignocelulósica, y/o para el procesamiento de textiles y/o como ingrediente en detergentes y/o como ingrediente en alimentos o composiciones de piensos.
imagen1 pUCISoriAvrll (223)______5GAPMf-alfaMCS3,6 kb3'GAPKanRpromotor TEF1promotor EM72»1501007550372520imagen2 1 Vector de control2 CBHI Trichoderma viride3 CBHI Humicola grísea4 CBHI Talaromyces emersonii5 CBHI Thermoascus aurantíacus6 Fusión de CBHI Talaromyces emersonii con CBD T. reesei7 Fusión de CBHI Humicola grisea con CBD T. reeseiimagen3 pUCO oríSad (¿09)promotor AOX 1 - 3.4 kbMf alfa (S.c.)ZeoRMCSpromotor EM7terminador de transcripción AOX 1promotor TEF13,6 kb
imagen4 100 ^50 :37^ . ■■ ■Sí P1 P2 P3 P4 P5 PS P7/RecolecciónkDa150imagen5 «Da M 1 225 i15 te*imagen6 imagen7 37 m252015■mimagen8 imagen9 imagen10 Valores normalizados de las UFRimagen11 Glucosa [g/l]Figura 9imagen12 Figura 10r.T LT.t.r.T.T.T.- j. SeqID
- _C3HI NO. 2 i CSACTL5SBT CQAGTATAEN HPPLTW&KÍS HPPLTWQEOT SMTCTÜQrG APgSCTTQHG $WlDAHHIUr AWLDAHHRri 50 TtlATMSSTTíC VHOVWGYTNC
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