ES2549405T3 - Anticuerpos y moléculas relacionadas que se unen con proteínas de PSCA - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une específicamente con una proteína PSCA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, y en donde el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de aminoácidos de la región VH de SEC ID Nº: 47 y la región VL de SEC ID Nº: 51.

Description

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pocillo y la incubación continuó durante 4-5 horas adicionales a 37 ºC. La fluorescencia en cada pocillo se leyó usando un fluorímetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados muestran que los anticuerpos de PSCA que tienen un isotipo IgG1 (HA1-4.121) o un isotipo IgG2 (HA1-5.99.1) pero no un isotipo IgG4 (HA1-6.46) fueron capaces de mediar en la lisis dependiente del complemento de células diana. Figura 15. Generación de fragmentos F(ab’)2 de MAb Ha1-4.121 por digestión con pepsina. Se incubaron 20 mg de MAb Ha1-4.121 en tampón de acetato sódico 20 mM pH 4,5 con y sin pepsina inmovilizada (Pierce. Rockford IL) durante los tiempos indicados. Se retiraron MAb intacto y fragmentos Fc digeridos por cromatografía de proteína A. Se muestra un gel teñido con Coomasie SDS-PAGE de MAb no reducido no digerido intacto, alícuotas no reducidas de material digerido tomadas en los tiempos indicados y una muestra reducida del producto de F(ab’)2 digerido final. Figura 16. Unión de mAb humano anti PSCA recombinante con PSCA por citometría de flujo. (16A) se transfectaron células 293T con construcciones de expresión que codificaban las cadenas pesadas y ligeras de mAb humano anti PSCA. Se recogió sobrenadante después de 48 horas y se ensayó con respecto a unión con PSCA. (16B) se purificó mAb humano anti PSCA a partir de sobrenadante de hibridoma y se usó para ensayos de unión a PSCA. La unión con PSCA se ensayó de la siguiente manera. Se incubaron células PC3 parentales o PC3-PSCA con los mAb humanos anti PSCA descritos anteriormente durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron e incubaron con anti Ig humano conjugado con PE durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron y después se ensayaron por citometría de flujo. Figura 17. Detección de la proteína PSCA por inmunohistoquímica. Se detectó la expresión de proteína PSCA en muestras de ensayo tumorales de pacientes con cáncer usando el anticuerpo HA1-4.117. Se cortaron tejidos incluidos en parafina, fijados en formalina en secciones de 4 micrómetros y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se desceraron, se rehidrataron y se trataron con solución de recuperación de antígenos (Solución de Recuperación de Antígenos Citra; BioGenex, 4600 Norris Canyon Road, San Ramon, CA, 94583) a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron después en anticuerpo anti PSCA monoclonal humano conjugado con fluoresceína, Ha1-4.117, durante 16 horas a 4 ºC. Los portaobjetos se lavaron tres veces en tampón y se incubaron además con anti Fluoresceína de Conejo durante 1 hora y, después de lavar en tampón, se sumergieron en anticuerpo secundario de cabra anti inmunoglobulina de conejo conjugado con peroxidasa DAKO EnVision+™ (DAKO Corporation, Carpenteria, CA) durante 30 minutos. Las secciones se lavaron después en tampón, se revelaron usando el kit DAB (SIGMA Chemicals), se contratiñeron usando hematoxilina, y se analizaron por microscopía de campo claro. Los resultados muestran la expresión de PSCA en las células tumorales de adenocarcinoma de próstata (Panel A, Panel B), carcinoma transicional de vejiga (Panel C) y adenocarcinoma ductal pancreático (Panel D). Estos resultados indican que PSCA se expresa en cánceres humanos y que anticuerpos dirigidos a este antígeno son útiles como reactivos de diagnóstico. Figura 18. El MAb de PSCA Ha1-4.120 Inhibe el Crecimiento de Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Subcutáneos. Se inyectaron por vía subcutánea células tumorales LAPC-9AI (2,0 x 106 células) en ratones SCID macho. Los ratones se clasificaron aleatoriamente en grupos (n=10 en cada grupo) y el tratamiento se inició por vía intraperitoneal (i.p.) el Día 0 con MAb HA1-4.120 o de isotipo de control como se indica. Los animales se trataron dos veces por semana para un total de 7 dosis hasta el día del estudio 28. El crecimiento tumoral se controló usando mediciones por calibrador cada 3 a 4 días como se indica. Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal anti PSCA Humano Ha1-4.120 inhibía significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata humana implantados por vía subcutánea en ratones SCID (p< 0,05). Figura 19. El MAb de PSCA Ha1-5.99 Inhibe el Crecimiento de Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Establecidos en ratones SCID. Se inyectaron por vía subcutánea células tumorales LAPC-9AI (2,0 x 106 células) en ratones SCID macho. Cuando el volumen tumoral alcanzó 50 mm3, los ratones se clasificaron aleatoriamente en grupos (n=10 en cada grupo) y el tratamiento se inició por vía intraperitoneal (i.p.) con HA1-5.99.1 o MAb de control de isotipo como se indica. Los animales se trataron dos veces por semana para un total de 5 dosis hasta el día del estudio 14. El crecimiento tumoral se controló usando mediciones por calibrador cada 3 a 4 días como se indica. Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal completamente humano anti PSCA Ha1-5.99 inhibía significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata humana independientes de andrógenos establecidos implantados por vía subcutánea en ratones SCID (p< 0,05). Figura 20. El Mab de PSCA HA1-4.121 Inhibe el Crecimiento de Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Humana dependiente de Andrógenos Establecido. Se inyectaron por vía subcutánea células tumorales LAPC-9AD (2,5 x 106 células) en ratones SCID macho. Cuando el volumen tumoral alcanzó 40 mm3, los ratones se clasificaron aleatoriamente en grupos (n=10 en cada grupo) y el tratamiento se inició por vía intraperitoneal (i.p.) con concentraciones crecientes de HA1-4.121 o MAb de control de isotipo como se indica. Los animales se trataron dos veces por semana con un total de 7 dosis hasta el día del estudio 21. El crecimiento tumoral se controló usando mediciones por calibrador cada 3 a 4 días como se indica. Los resultados de este estudio demostraron que HA1-4.121 inhibió el crecimiento de xenoinjertos de próstata dependientes de andrógenos humanos subcutáneos establecidos en ratones SCID. Los resultados fueron estadísticamente significativos para el grupo de dosis de 300 g los días 14, 17 y 21 (p< 0,05, ensayo de Kruskal-Wallis, de doble cara con =0,05) y para el grupo de dosis de 700 g los días 10, 14, 17 y 21 (p< 0,05, ensayo de Kruskal-Wallis, de doble cara con =0,05). Figura 21. Se inyectaron células tumorales LAPC-9AD, dependientes de andrógeno, derivadas de pacientes (2,0 x 106 células) en los lóbulos dorsales de las próstatas de ratones SCID macho. Se permitió que los tumores crecieran durante aproximadamente 10 días momento en el cual los ratones se clasificaron aleatoriamente en grupos. El tratamiento con 500 g de HA1-4.117, HA1-4.121 o MAb de control de Isotipo humanos se inició 10 días después del implante tumoral. Los anticuerpos se suministraron por vía intraperitoneal dos veces por

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semana para un total de 7 dosis. Cuatro días después de la última dosis, los animales se sacrificaron y los tumores primarios se escindieron y se pesaron. Los resultados muestran que anticuerpos monoclonales humanos anti PSCA Ha1-4.121 (p< 0,01) y Ha1-4.117 (p< 0,05) inhibieron significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-9AD implantados de forma ortotópica en ratones SCID. Figura 22. El MAb de PSCA HA1-4.121 Prolonga la Supervivencia de Ratones SCID con Tumores de Próstata Dependientes de Andrógeno Humanos Ortotópicos Establecidos. Se inyectaron células tumorales LAPC-9AD, dependientes de andrógeno, derivadas de pacientes (2,0 x 106 células) en los lóbulos dorsales de las próstatas de ratones SCID macho. Se permitió que los tumores crecieran durante aproximadamente 9 días momento en el cual los ratones se clasificaron aleatoriamente en grupos. Los animales clasificados aleatoriamente en los grupos de supervivencia incluyen 11 ratones en el MAb de control de isotipo y 12 ratones en el grupo tratado con HA1

4.121. Los animales se trataron i.p. con 1000 g de Ha1-4.121 o 1000 g de MAb de control de isotipo dos veces por semana para un total de 9 dosis. Los resultados demostraron que HA1-4.121 prolongaba significativamente (ensayo de rangos logarítmicos: p<0,01) la supervivencia de ratones SCID con tumores de próstata dependientes de andrógeno humanos. Dos ratones en el grupo tratado con HA1-4.121 permanecieron sin tumores palpables 110 días después del último tratamiento. Figura 23. Inhibición Potenciada del Crecimiento de Tumor de Próstata con HA1-4.21 y Terapia de Combinación de Taxotere. Se inyectaron por vía subcutánea células tumorales LAPC-9AI (2 x 106 células por animal) en ratones SCID macho. Cuando el volumen tumoral alcanzó 65 mm3, los animales se clasificaron aleatoriamente y se asignaron a cuatro grupos diferentes (n=10 en cada grupo) como se indica. Comenzando el día 0, se administraron Ha1-4.121 o MAb de control de isotipo i.p. dos veces por semana a una dosis de 500 g para un total de 6 dosis. La última dosis se proporcionó el día 17. Se proporcionó Taxotere por vía intravenosa a una dosis de 5 mg/kg los días 0, 3 y 7. El crecimiento tumoral se controló cada 3-4 días usando mediciones por calibrador. Los resultados de este estudio demuestran que HA1-4.121 como un único agente inhibía el crecimiento de xenoinjertos de próstata independientes de andrógeno en ratones SCID en un 45 % en comparación con el tratamiento de anticuerpo de control solo el día 28 (ANOVA/ensayo de Tukey: p<0,05). La administración del MAb de control de isotipo más taxotere inhibió el crecimiento tumoral en 28 % en comparación con el tratamiento de anticuerpo de control solamente, que no era estadísticamente significativo. La administración de HA1-4.121 en combinación con Taxotere potenció el efecto y dio como resultado una inhibición del 69 % del crecimiento tumoral en comparación con anticuerpo de control solamente (ANOVA/ensayo de Tukey: p<0,01). También se demostró una diferencia estadísticamente significativa cuando el grupo de combinación de HA1-4.121 más Taxotere se comparó con los grupos de HA1-4.121 o MAb de control de isotipo más Taxotere (ANOVA/ensayo de Tukey: p<0,05). Figura 24. Los MAb de PSCA Humanos Inhiben el Crecimiento de Xenoinjertos de Cáncer Pancreático en ratones SCID/HPAC Humano. Se inyectaron por vía subcutánea células cancerosas pancreáticas (2 x 106/ratón) en ratones ICR SCID inmunodeficientes (Taconic Farm, Germantown, NY). Los ratones se clasificaron aleatoriamente en grupos (n= 10 animales/grupo) y se inició el tratamiento con el anticuerpo monoclonal de PSCA humano indicado el mismo día. Se suministraron por vía intraperitoneal anticuerpos (500 mg/ratón) dos veces por semana para un total de 8 dosis. Los resultados demostraron que los anticuerpos monoclonales anti PSCA humanos Ha1-4.121, Ha1-4.117 y Ha1-1.16 inhibieron significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer pancreático humano implantados por vía subcutánea en ratones SCID. Se realizaron análisis estadísticos usando un ensayo de t (de doble cara, =0,05). Figura 25. El MAb de PSCA HA1-4.121 Inhibe el Crecimiento de Tumores Pancreáticos Implantados de forma Ortotópica en Ratones SCID. Se implantaron células HPAC (3,0 x 106 células) de forma ortotópica en los páncreas de ratones SCID. Los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos (n=9 en cada grupo) como se indica. El tratamiento con HA1-4.121 (250 g o 1000 g) o MAb de control de isotipo (1000 g) se inició el día de la implantación. Los anticuerpos se administraron i.p. dos veces por semana para un total de 10 dosis. Trece días después de la última dosis, los animales se sacrificaron y los tumores primarios se escindieron y se pesaron. Los resultados de este estudio demostraron que HA1-4.121 inhibía significativamente el crecimiento ortotópico de xenoinjertos de cáncer pancreático humano en ratones SCID a ambos niveles de dosis examinados. El tratamiento con 250 g y 1000 g de AGS-PSCA inhibió el crecimiento tumoral en 66 % y 70 %, respectivamente (ensayo de Kruskal-Wallis/Tukey: p<0,01 y p<0,01, respectivamente). Figura 26. El MAb de PSCA HA1-4.121 inhibe las metástasis. En la autopsia, se observaron metástasis visibles a ganglios linfáticos y órganos distantes en el grupo tratado con anticuerpo de control. No se observaron metástasis visibles en ninguno de los grupos tratados con HA1-4.121. Se retiraron los ganglios linfáticos, pulmones e hígados de todos los animales y se examinaron de forma histológica con respecto a la presencia de tumor metastásico. Se tiñeron secciones de los pulmones y ganglios linfáticos retirados de cada animal con respecto a citoqueratina humana y el número de metástasis se determinó de forma microscópica. Los resultados del análisis histológico demostraron una reducción significativa en las metástasis de ganglios linfáticos (LN) en animal tratado con HA1-4.121 (p= 0,0152 como se detectó por ensayo exacto de Fisher). La incidencia de metástasis e invasión también se redujo significativamente en animales tratados con ambas concentraciones de HA1-4.121 (p= 0,0152 como se detectó por ensayo exacto de Fisher). El número de metástasis pulmonares se redujo significativamente en ratones tratados con la dosis de 1,0 mg de HA1-4.121 solamente (p= 0,0498 como se detectó por ensayo exacto de Fisher). Figura 27. Los MAb de PSCA Humanos Inhiben el Crecimiento de Tumores de Vejiga SW780 en Ratones SCID. Se inyectaron por vía subcutánea células cancerosas de vejiga SW780 humanas (2 x 106/ratón) en ratones ICR

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SCID inmunodeficientes (Taconic Farm, Germantown, NY). Los ratones se clasificaron aleatoriamente en grupos (n= 10 animales/grupo) y el tratamiento con el MAb de PSCA humano indicado se inició el mismo día. Se suministraron por vía intraperitoneal anticuerpos (250 mg/ratón) dos veces por semana para un total de 7 dosis. Los resultados demostraron que HA1-4.117 (p= 0,014), HA1-4,37 (p= 0,0056), HA1-1,78 (p= 0,001), Ha1-5,99 (p=0,0002) y HA1-4,5 (p= 0,0008) inhibían significativamente el crecimiento de tumores de vejiga SW780 implantados por vía subcutánea en ratones SCID. Se realizaron análisis estadísticos usando un ensayo de t (doble cara, =0,05).

Descripción detallada de la invención

Resumen de las secciones

I.) Definiciones II.) Polinucleótidos de PSCA

II.A.) Usos de Polinucleótidos de PSCA

II.A.1.) Control de Anomalías Genéticas II.A.2.) Realizaciones Antisentido II.A.3.) Cebadores y Pares de CebadoresII.A.4.) Aislamiento de Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican PSCAII.A.5.) Moléculas de Ácido Nucleico Recombinantes y Sistemas de Vector-Hospedador

III.) Proteínas Relacionadas con PSCA

III.A.) Realizaciones de Proteínas Portadoras de Motivo III.B.) Expresión de Proteínas Relacionadas con PSCA III.C.) Modificaciones de Proteínas Relacionadas con PSCA III.D.) Usos de Proteínas Relacionadas con PSCA

IV.) Anticuerpos de PSCA V.) Respuestas Inmunitarias Celulares de PSCA VI.) Animales Transgénicos para PSCA VII.) Métodos para la Detección de PSCA VIII.) Métodos para el Control del Estado de Genes Relacionados con PSCA y Sus Productos IX.) Identificación de Moléculas Que Interaccionan con PSCA X.) Métodos y Composiciones Terapéuticos

X.A.) Vacunas Antineoplásicas X.B.) PSCA como una Diana para Terapia Basada en Anticuerpos X.C.) PSCA como una Diana para Respuestas Inmunitarias Celulares

X.C.1. Vacunas de Minigenes

X.C.2. Combinaciones de Péptidos de CTL con Péptidos Auxiliares

X.C.3. Combinaciones de Péptidos de CTL con Agentes de Sensibilización de Linfocitos T

X.C.4. Composiciones de Vacunas que Comprenden DC Pulsado con Péptidos de CTL y/o HTL

X.D.) Inmunoterapia Adoptiva X.E.) Administración de Vacunas para Fines Terapéuticos o Profilácticos

XI.) Realizaciones de Diagnóstico y Pronóstico de PSCA. XII.) Inhibición de la Función de Proteína PSCA

XII.A.) Inhibición de PSCA Con Anticuerpos Intracelulares XII.B.) Inhibición de PSCA con Proteínas Recombinantes XII.C.) Inhibición de la Transcripción o Traducción de PSCA XII.D.) Consideraciones Generales para Estrategias Terapéuticas

XIII.) Identificación, Caracterización y Uso de Moduladores de PSCA XIV.) ARNi y uso Terapéutico de ARN de interferencia pequeño (ARNip) XV.) KITS/Artículos de Fabricación

I.) Definiciones:

A no ser que se defina de otro modo, se pretende que todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos

o terminología científicos usados en el presente documento tengan los significados habitualmente entendidos por los

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expertos en la materia a la que pertenece la presente invención. En algunos casos, se definen en el presente documento términos con significados entendidos habitualmente para mayor claridad y/o fácil referencia, y no debería interpretarse necesariamente que la inclusión de dichas definiciones en el presente documento represente una diferencia sustancial sobre lo que se entiende en general en este campo. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o referidos en el presente documento se entienden bien y se emplean habitualmente usando metodología convencional, por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado se llevan a cabo en general de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a no ser que se indique de otro modo.

Las expresiones “cáncer de próstata avanzado”, “cáncer de próstata localmente avanzado”, “enfermedad avanzada” y “enfermedad localmente avanzada” significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula prostática, y se entiende que incluyen enfermedad de estadio C según el sistema de la Asociación Urológica Americana (AUA), enfermedad de estadio C1 -C2 según el sistema de Whitmore-Jewett, y estadio T3 -T4 y enfermedad de N+ según el sistema TNM (tumor, nódulo, metástasis). En general, no se recomienda cirugía para pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen resultados sustancialmente menos favorables en comparación con pacientes que tienen cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado a un órgano). La enfermedad localmente avanzada se identifica clínicamente por pruebas palpables de induración más allá del borde lateral de la próstata, o asimetría o induración por encima de la base prostática. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica en la actualidad patológicamente después de prostatectomía radical si el tumor invade o penetra en la cápsula prostática, se extiende al margen quirúrgico, o invade las vesículas seminales.

Se entiende que “alterar el patrón de glucosilación nativo” para fines del presente documento significa suprimir uno o más restos de carbohidratos hallados en PSCA de secuencia nativa (bien retirando el sitio de glucosilación subyacente o bien suprimiendo la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos) y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el PSCA en la secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos de carbohidratos presentes.

El término “análogo” se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con PSCA). Por ejemplo, un análogo de una proteína PSCA puede unirse específicamente con un anticuerpo o linfocito T que se una específicamente con PSCA.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio a no ser que se indique claramente otra cosa. Por lo tanto, un “anticuerpo” puede ser de origen natural o artificial tal como anticuerpos monoclonales producidos por tecnología de hibridomas convencional. Los anticuerpos anti PSCA comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión a antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a cualquier forma de anticuerpo o fragmento del mismo que se una específicamente con PSCA y/o muestra la actividad biológica deseada y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que se unan específicamente con PSCA y/o muestren la actividad biológica deseada. Puede usarse cualquier anticuerpo específico en los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento. Por lo tanto, en una realización el término “anticuerpo” abarca una molécula que comprende al menos una región variable de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera y al menos una región variable de una molécula de cadena pesada que en combinación forman un sitio de unión específico para el antígeno diana. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos útiles en los presentes métodos y composiciones pueden generarse en cultivo celular, en fagos, o en diversos animales, incluyendo pero sin limitación vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios. Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de mamífero. Pueden usarse técnicas de fagos para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de avidez o especificidad alteradas. Dichas técnicas son rutinarias y se conocen bien en este campo. En una realización, el anticuerpo se produce por medios recombinantes conocidos en este campo. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo recombinante transfectando una célula hospedadora con un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo. Pueden usarse uno o más vectores para transfectar la secuencia de ADN que expresa al menos una región VL y una VH en la célula hospedadora. Las descripciones ejemplares de medios recombinantes de generación y producción de anticuerpos incluyen Delves, ANTI-BODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, edición más reciente). Un anticuerpo de la presente invención puede modificarse por medios recombinantes para aumentar mayor eficacia del anticuerpo al mediar en la función deseada. Por lo tanto, está dentro del alcance de la invención que los anticuerpos puedan modificarse por sustituciones usando medios recombinantes. Normalmente, las sustituciones serán sustituciones conservativas. Por ejemplo, puede remplazarse al menos un

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aminoácido en la región constante del anticuerpo con un resto diferente. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.624.821, Patente de Estados Unidos Nº 6.194.551, Solicitud Nº WO 9958572; y Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). La modificación en aminoácidos incluye deleciones, adiciones, sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, dichos cambios se realizan para reducir actividades no deseadas, por ejemplo, citotoxicidad dependiente de complemento. Frecuentemente, los anticuerpos se marcan uniendo, bien covalente o bien no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y se indican exhaustivamente en la bibliografía tanto científica como de patentes. Estos anticuerpos pueden explorarse con respecto a unión con PSCA normal o defectuoso. Véase, por ejemplo, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996). Pueden identificarse anticuerpos adecuados con las actividades biológicas deseadas en los siguientes ensayos in vitro incluyendo pero sin limitación: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales y los siguientes ensayos in vivo tales como la inhibición del crecimiento tumoral. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, pueden explorarse con respecto a la capacidad para unirse con el antígeno específico sin inhibir la actividad de unión a receptor o biológica del antígeno. Como anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. También pueden usarse para cuantificar el PSCA o su receptor.

Un “fragmento de anticuerpo” se define como al menos una parte de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une con su diana, es decir, la región de unión a antígeno. En una realización abarca específicamente anticuerpos anti PSCA individuales y clones de los mismos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpo anti PSCA con especificidad poliepitópica. El anticuerpo de los presentes métodos y composiciones puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede estar en forma de un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno incluyendo un fragmento Fab, fragmento F(ab’)2, una región variable de cadena ligera y similares. Pueden generarse fragmentos de moléculas intactas usando métodos bien conocidos en la técnica y que incluyen digestión enzimática y medios recombinantes.

Como se usa en el presente documento, puede usarse cualquier forma del “antígeno” para generar un anticuerpo que sea específico para PSCA. Por lo tanto, el antígeno inductor puede ser un epítopo individual, múltiples epítopos

o la proteína completa sola o en combinación con uno o más agentes potenciadores de inmunogenicidad conocidos en este campo. El antígeno inductor puede ser una proteína de longitud completa aislada, una proteína de superficie celular (por ejemplo, que inmuniza con células transfectadas con al menos una parte del antígeno), o una proteína soluble (por ejemplo, que inmuniza solamente con la parte de dominio extracelular de la proteína). El antígeno puede producirse en una célula modificada genéticamente. El ADN que codifica el antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc) y codifica al menos una parte del dominio extracelular. Como se usa en el presente documento, el término “parte” se refiere al número mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea apropiado, para constituir un epítopo inmunogénico del antígeno de interés. Puede emplearse cualquier vector genético adecuado para transformación de las células de interés, incluyendo pero sin limitación vectores adenovirales, plásmidos y vectores no virales, tales como lípidos catiónicos. En una realización, el anticuerpo de los métodos y composiciones del presente documento se une específicamente con al menos una parte del dominio extracelular del PSCA de interés.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento pueden conjugarse con un “agente bioactivo”. Como se usa en el presente documento, la expresión “agente bioactivo” se refiere a cualquier compuesto sintético o de origen natural que se une con el antígeno y/o potencia o media en el efecto biológico deseado para potenciar toxinas destructoras de células.

En una realización, los fragmentos de unión útiles en la presente invención son fragmentos biológicamente activos. Como se usa en el presente documento, la expresión “biológicamente activo” se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de unirse con el epítopo antigénico deseado y directa o indirectamente ejercer un efecto biológico. Los efectos directos incluyen, pero sin limitación, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal de crecimiento, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal antiapoptótica, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal apoptótica o necrótica, la modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de ADCC, y modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de CDC.

Los anticuerpos “biespecíficos” también son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo biespecífico” se refiere a un anticuerpo, normalmente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión para al menos dos epítopos antigénicos diferentes. En una realización, los epítopos son del mismo antígeno. En otra realización, los epítopos son de dos antígenos diferentes. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos biespecíficos de forma recombinante usando la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Milstein et al., Nature 305: 537-39 (1983). Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Véase, por ejemplo, Brennan, et al., Science 229: 81 (1985). Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Véase, por ejemplo, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

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Martek Biosciences, Columbia, MD; etc.).

Como se usa en el presente documento, la expresión “sustitución conservativa” se refiere a sustituciones de aminoácidos que se conocen por los expertos en la materia y pueden realizarse en generar sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en la presente materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4ª Edición 1987)). Dichas sustituciones ejemplares se realizan preferentemente de acuerdo con las expuestas en las Tablas III(a-b). Por ejemplo, dichos cambios incluyen sustituir cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos por cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L); ácido glutámico (E) por ácido aspártico (D) y viceversa; asparagina (N) por glutamina (Q) y viceversa; y treonina (T) por serina (S) y viceversa. Otras sustituciones pueden considerarse también conservativas, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser frecuentemente intercambiables, como lo pueden ser alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y en ocasiones con valina. La lisina (K) y arginina (R) son frecuentemente intercambiables en localizaciones en las que la característica significativa del resto de aminoácidos es su carga y las pK diferentes de estos dos restos de aminoácidos no son significativas. Otros cambios más pueden considerarse “conservativos” en ambientes particulares (véase, por ejemplo, Tabla III(a) en el presente documento; páginas 13-15 “Biochemistry” 2ª ED. Lubert Stryer ed (Universidad de Stanford); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 19 may 1995; 270(20): 11882-6). También son permisibles otras sustituciones y pueden determinarse de forma empírica o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas.

La expresión “agente citotóxico” se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de células, función de células y/o provoca destrucción de células. Se pretende que la expresión incluya isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como moléculas pequeñas tóxicas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, auristatinas, auristatina e, auromicinas, maitansinoides, itrio, bismuto, ricina, cadena A de ricina, combrestatina, duocarmicinas, dolostatinas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, cisplatino, cc1065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi antracin diona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Saponaria officinalis, y glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 o 213, P32 e isótopos radiactivos de Lu incluyendo Lu177. También pueden conjugarse anticuerpos con una enzima activadora de profármaco antineoplásico capaz de convertir el profármaco en su forma activa.

Como se usa en el presente documento, el término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Se describen diacuerpos más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-48 (1993).

El “producto génico” se usa en el presente documento para indicar un péptido/proteína o ARNm. Por ejemplo, un “producto génico de la invención” se denomina en ocasiones en el presente documento una “secuencia de aminoácidos de cáncer”, “proteína de cáncer”, “proteína de un cáncer enumerado en la Tabla I”, un “ARNm de cáncer”, “ARNm de un cáncer enumerado en la Tabla I”, etc. En una realización, la proteína de cáncer está codificada por un ácido nucleico de la Figura 1. La proteína de cáncer puede ser un fragmento o, como alternativa, ser la proteína de longitud completa codificada por los ácidos nucleicos de la Figura 1. En una realización, se usa una secuencia de aminoácidos de cáncer para determinar la identidad o similitud de secuencias. En otra realización, las secuencias son variantes alélicas de origen natural de una proteína codificada por un ácido nucleico de la Figura

1. En otra realización, las secuencias son variantes de secuencia como se describen adicionalmente en el presente documento.

Los anticuerpos “heteroconjugados” son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo heteroconjugado” se refiere a dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos pueden prepararse usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo agentes de reticulación. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980.

Se conocen bien por los expertos en la materia ensayos de “exploración de alto rendimiento” con respecto a la presencia, ausencia, cuantificación u otras propiedades de ácidos nucleicos o productos proteicos particulares. De forma similar, se conocen igualmente bien ensayos de unión y ensayos de genes indicadores. Por lo tanto, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.559.410 desvela métodos de exploración de alto rendimiento para proteínas; la Patente de Estados Unidos Nº 5.585.639 desvela métodos de exploración de alto rendimiento para

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definen en el presente documento.

Los moduladores de cáncer también pueden ser ácidos nucleicos. Los agentes moduladores de ácidos nucleicos pueden ser ácidos nucleicos de origen natural, ácidos nucleicos aleatorios o ácidos nucleicos aleatorios “desviados”. Por ejemplo, pueden usarse productos de digestión de genomas procariotas o eucariotas en un enfoque análogo al indicado anteriormente para proteínas.

La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único epítopo antigénico. Por el contrario, las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) normalmente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) epítopos diferentes. En una realización, el anticuerpo policlonal contiene una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades, afinidades o avideces dentro de un único antígeno que contiene múltiples epítopos antigénicos. El modificador “monoclonal” indica como el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usar de acuerdo con la presente invención pueden realizarse por el método de hibridoma descrito en primer lugar en Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o pueden realizarse por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Estos anticuerpos monoclonales se unirán habitualmente con al menos una Kd de aproximadamente 1 M, más habitualmente al menos aproximadamente 300 nM, normalmente al menos aproximadamente 30 nM, preferentemente al menos aproximadamente 10 nM, más preferentemente al menos aproximadamente 3 nM o mejor, habitualmente determinado por ELISA.

Un “motivo”, como en motivo biológico de una proteína relacionada con PSCA, se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forme parte de la secuencia primaria de una proteína, que se asocie con una función particular (por ejemplo interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc.) o modificación (por ejemplo, que se fosforila, glucosila o amida), o localización (por ejemplo, secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que se correlaciona con ser inmunogénico, bien de forma humoral o bien celular. Un motivo puede ser contiguo o capaz de alinearse con ciertas posiciones que están en general correlacionadas con una cierta función o propiedad. En el contexto de motivos de HLA, “motivo” se refiere al patrón de restos en un péptido de diferente longitud, habitualmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo de HLA de clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo de HLA de clase II, que se reconoce por una molécula de HLA particular. Los motivos peptídicos para unión de HLA son normalmente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo de HLA humano y difieren en el patrón de los restos de anclaje primarios y secundarios. Se exponen motivos de aparición frecuente en la Tabla V.

Un “excipiente farmacéutico” comprende un material tal como un adyuvante, un vehículo, agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares.

“Farmacéuticamente aceptable” se refiere a una composición no tóxica, inerte que es fisiológicamente compatible con seres humanos u otros mamíferos.

El término “polinucleótido” significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, bien ribonucleótidos o bien desoxinucleótidos o una forma modificada de uno de los tipos de nucleótidos y se entiende que incluye formas mono y bicatenarias de ADN y/o ARN. En la técnica, este término se usa con frecuencia indistintamente con “oligonucleótido”. Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento en la que timidina (T), como se muestra por ejemplo en la Figura 1, también puede ser uracilo (U); esta definición pertenece a las diferencias entre las estructuras químicas de ADN y ARN, en particular la observación de que una de las cuatro bases principales en ARN es uracilo (U) en lugar de timidina (T).

El término “polipéptido” significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. A lo largo de la memoria descriptiva, se usan designaciones convencionales de tres letras o una letra para aminoácidos. En la técnica, este término se usa con frecuencia indistintamente con “péptido” o “proteína”.

Un “resto de anclaje primario” de HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de una secuencia peptídica que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA. De uno a tres, habitualmente dos, restos de anclaje primarios dentro de un péptido de longitud definida definen en general un “motivo” para un péptido inmunogénico. Se entiende que estos restos se ajustan en contacto estrecho con el surco de unión a péptido de una molécula de HLA, con sus cadenas laterales internadas en bolsillos específicos del surco de unión. En una realización, por ejemplo, los restos de anclaje primarios para una molécula de HLA de clase I se localizan en la posición 2 (desde la posición amino terminal) y en la posición carboxilo terminal de un epítopo peptídico de 8, 9, 10, 11 o 12 restos de acuerdo con la invención. Como alternativa, en otra

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realización, los restos de anclaje primarios de un péptido se unen con una molécula de HLA de clase II y se espacian entre sí, en lugar de con el extremo terminal de un péptido, en el que el péptido es generalmente de al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones de anclaje primarias para cada motivo y supermotivo se exponen en la Tabla IV (a). Por ejemplo, pueden crearse péptidos análogos alterando la presencia o ausencia de restos particulares en las posiciones de anclaje primarias y/o secundarias mostradas en la Tabla IV. Dichos análogos se usan para modular la afinidad de unión y/o la cobertura de población de un péptido que comprende un motivo o supermotivo de HLA particular.

Los “radioisótopos” incluyen, pero sin limitación los siguientes (también se exponen usos ejemplares no limitantes en la Tabla IV(I)).

Por “aleatorio” o equivalentes gramaticales como se aplican en el presente documento a ácidos nucleicos y proteínas se entiende que cada ácido nucleico y péptido consiste en nucleótidos y aminoácidos esencialmente aleatorios, respectivamente. Estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos, analizados en el presente documento) pueden incorporar cualquier aminoácido o nucleótido en cualquier posición. El proceso sintético puede diseñarse para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorios, para permitir la formación de todas o la mayoría de las posibles combinaciones a lo largo de la longitud de la secuencia, formando de este modo una biblioteca de agentes proteicos bioactivos candidatos aleatorios.

En una realización, una biblioteca es “completamente aleatoria”, sin preferencias de secuencia o constantes en ninguna posición. En otra realización, la biblioteca es una biblioteca “aleatoria desviada”. Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia se mantienen constantes, o se seleccionan de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, los restos de nucleótidos o aminoácidos se seleccionan aleatoriamente dentro de una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrófobos, restos hidrófilos, restos con desviación estérica (bien pequeños o bien grandes), hacia la creación de dominios de unión de ácido nucleico, la creación de cisteínas, para reticulación, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc., o a purinas, etc.

Una molécula de ADN o ARN “recombinante” es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulación molecular in vitro.

Como se usa en el presente documento, la expresión “Fv monocatenario” o “scFv” o anticuerpo “monocatenario” se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general el polipéptido de Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

Los ejemplos no limitantes de “moléculas pequeñas” incluyen compuestos que se unen con o interacciona con PSCA, ligandos incluyendo hormonas, neuropéptidos, quimiocinas, odorizantes, fosfolípidos y equivalentes funcionales de los mismos que se unen con e inhiben preferentemente la función de proteína PSCA. Dichas moléculas pequeñas no limitantes tienen preferentemente un peso molecular de menos de aproximadamente 10 kDa, más preferentemente por debajo de aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 o aproximadamente 4 kDa. En ciertas realizaciones, las moléculas pequeñas se asocian físicamente con, o se unen con, proteína PSCA; no se encuentran en rutas metabólicas de origen natural; y/o son más solubles en soluciones acuosas que no acuosas.

Como se usa en el presente documento, el término “específico” se refiere a la unión selectiva del anticuerpo con el epítopo de antígeno diana. Los anticuerpos pueden ensayarse con respecto a especificidad de unión comparando la unión con antígeno apropiado con la unión con antígeno irrelevante o mezcla de antígenos en un conjunto de condiciones dado. Si el anticuerpo se une con el antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 y preferentemente 10 veces más que el antígeno irrelevante o la mezcla de antígenos entonces se considera que es específico. En una realización, un anticuerpo específico es uno que solamente se une con el antígeno de PSCA, pero no se une con el antígeno irrelevante. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se une con el antígeno de PSCA humano pero no se une con un antígeno de PSCA no humano con 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor homología de aminoácidos con el antígeno de PSCA. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se une con el antígeno de PSCA humano y se une con el antígeno de PSCA murino, pero con un mayor grado de unión con el antígeno humano. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se une con el antígeno de PSCA humano y se une con el antígeno de PSCA de primate, pero con un mayor grado de unión con el antígeno humano. En otra realización, el anticuerpo específico se une con el antígeno de PSCA humano y cualquier antígeno de PSCA no humano, pero con un mayor grado de unión que el antígeno humano o cualquier combinación de los mismos.

La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación puede determinarse fácilmente por un experto habitual en la materia, y en general es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para hibridación apropiada,

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Los péptidos de HLA de clase I de la invención pueden mezclarse con, o unirse a, péptidos de HLA de clase II, para facilitar la activación tanto de linfocitos T citotóxicos como de linfocitos T auxiliares. Las vacunas de HLA también pueden comprender células presentadoras de antígenos pulsadas por péptidos, por ejemplo, células dendríticas.

El término “variante” se refiere a una molécula que muestra una variación con respecto a un tipo o una norma descritos, tal como una proteína que tiene uno o más restos de aminoácidos diferentes en la posición o las posiciones correspondientes de una proteína específicamente descrita (por ejemplo la proteína PSCA mostrada en la Figura 1. Un análogo es un ejemplo de una proteína variante. Las isoformas de corte y empalme y polimorfismos de un único nucleótido (SNP) son ejemplos adicionales de variantes.

Las “proteínas relacionadas con PSCA” como se desvela en el presente documento incluyen las identificadas específicamente en el presente documento, así como variantes alélicas, variantes de sustitución conservativa, análogos y homólogos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin experimentación indebida siguiendo los métodos destacados en el presente documento o fácilmente disponibles en la técnica. También se incluyen proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas PSCA o fragmentos de las mismas, así como proteínas de fusión de una proteína PSCA y un polipéptido heterólogo. Dichas proteínas PSCA se denominan colectivamente proteínas relacionadas con PSCA, proteínas de la invención o PSCA. La expresión “proteína relacionada con PSCA” se refiere a un fragmento polipeptídico o una secuencia proteica de PSCA de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más de 25 aminoácidos; o al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos.

II.) Polinucleótidos de PSCA

Se desvelan en el presente documento polinucleótidos correspondientes a o complementarios de todo o una parte de un gen de PSCA, ARNm y/o secuencia codificante, preferentemente en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican una proteína relacionada con PSCA y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios de un gen de PSCA o secuencia de ARNm o una parte de la misma, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan con un gen de PSCA, ARNm o con un polinucleótido que codifica PSCA (colectivamente, “polinucleótidos de PSCA”). En todos los casos cuando se haga referencia a esta sección, T también puede ser U en la Figura 1.

Los polinucleótidos de PSCA incluyen: un polinucleótido de PSCA que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1, la secuencia de nucleótidos de PSCA como se muestra en la Figura 1 en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 1; o al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 1 en la que T es U.

Los polinucleótidos que codifican partes relativamente largas de una proteína de PSCA también están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 (o 20, 30 o 40, etc.) a aproximadamente el aminoácido 20, (o 30, 40 o 50, etc.) de la proteína PSCA “o variante” mostrada en la Figura 1 o Figura 3 pueden generarse por diversas técnicas bien conocidas en este campo. Estos fragmentos polinucleotídicos pueden incluir cualquier parte de la secuencia de PSCA como se muestra en la Figura 1.

II.A.) Usos de Polinucleótidos de PSCA

II.A.1. Control de Anomalías Genéticas

Los polinucleótidos de los párrafos precedentes tienen varios usos específicos diferentes. El gen de PSCA humano se mapea en la localización cromosómica expuesta en el Ejemplo titulado “Mapeo Cromosómico de PSCA”. Por ejemplo, debido a que el gen de PSCA se mapea en este cromosoma, se usan polinucleótidos que codifican diferentes regiones de las proteínas PSCA para caracterizar anomalías citogenéticas de esta localización cromosómica, tales como anomalías que se ha identificado que están asociadas con diversos cánceres. En ciertos genes, se ha identificado diversas anomalías cromosómicas incluyendo reordenamientos, como anomalías citogenéticas frecuentes en varios cánceres diferentes (véase por ejemplo Krajinovic et al., Mutat. Res. 382(3-4): 8183 (1998); Johansson et al., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y Finger et al., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). Por lo tanto, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas PSCA proporcionan nuevas herramientas que pueden usarse para delimitar, con mayor precisión de lo que era posible previamente, anomalías citogenéticas en la región cromosómica que codifica PSCA que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad de la técnica de expandir la sensibilidad de exploración cromosómica para identificar anomalías cromosómicas más sutiles y menos comunes (véase por ejemplo Evans et al., Am. J. Obstet. Gynecol 171(4): 1055-1057 (1994)).

Además, como se ha mostrado que PSCA se expresa altamente en próstata y otros cánceres, se usan polinucleótidos de PSCA en métodos que evalúan el estado de productos génicos de PSCA en tejidos normales frente a cáncer. Normalmente, se usan polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas PSCA para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales o

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alteraciones que dan como resultado la pérdida de un antígeno etc.) en regiones específicas del gen de PSCA, tales como regiones que contienen uno o más motivos. Los ensayos ejemplares incluyen ensayos de RT-PCR así como análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) (véase, por ejemplo, Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)), ambos de los cuales utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones dentro de la proteína.

II.A.2. Realizaciones Antisentido

También se desvelan en el presente documento ADN genómico, ADNc, ribozimas y moléculas antisentido, así como moléculas de ácido nucleico basadas en una cadena principal alternativa, o que incluye bases alternativas, bien derivadas de fuentes naturales o bien sintetizadas, e incluyen moléculas capaces de inhibir la expresión de ARN o proteína de PSCA. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o moléculas no de ácido nucleico tales como derivados de fosforotioato que se unen específicamente con ADN o ARN de una manera dependiente de pares de bases. Un experto en la materia puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico usando los polinucleótidos de PSCA y secuencias polinucleotídicas desveladas en el presente documento.

La tecnología antisentido implica la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen con un polinucleótido diana localizado dentro de las células. El término “antisentido” se refiere al hecho de que dichos oligonucleótidos son complementarios de sus dianas intracelulares, por ejemplo, PSCA. Véase por ejemplo, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1: 1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de PSCA de la presente invención incluyen derivados tales como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen, mencionado anteriormente), que muestran acción inhibidora de crecimiento celular de cáncer potenciada. Los S-oligos (nucleósido fosforotioatos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en el que se reemplaza un átomo de oxígeno no enlazador del grupo fosfato por un átomo de azufre. Los S-oligos pueden prepararse por tratamiento de los O-oligos correspondientes con 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase, por ejemplo, Iyer, R.

P. et al., J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); y Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990). Los oligonucleótidos antisentido de PSCA adicionales incluyen oligonucleótidos antisentido morfolino conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).

Los oligonucleótidos antisentido de PSCA desvelados en el presente documento normalmente pueden ser ARN o ADN que es complementario de e hibrida de forma estable con los primeros 100 codones 5’ o los últimos 100 codones 3’ de una secuencia genómica de PSCA o el ARNm correspondiente. No se requiere complementariedad absoluta, aunque se prefieren altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario de esta región permite la hibridación selectiva con ARNm de PSCA y no con ARNm que especifique otras subunidades reguladoras de proteína quinasa. Los oligonucleótidos antisentido de PSCA desvelados en el presente documento pueden ser fragmentos de 15 a 30 unidades de la molécula de ADN antisentido que tiene una secuencia que hibrida con ARNm de PSCA. Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido de PSCA es un oligonucleótido de 30 unidades que es complementario de una región en los primeros 10 codones 5’ o los últimos 10 codones 3’ de PSCA. Como alternativa, las moléculas antisentido se modifican para emplear ribozimas en la inhibición de la expresión de PSCA, véase, por ejemplo, L. A. Couture y D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).

II.A.3. Cebadores y Pares de Cebadores

Otros nucleótidos desvelados en el presente documento incluyen cebadores y pares de cebadores que permiten la amplificación específica de polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que hibridan específicamente o selectivamente con moléculas de ácido nucleico de la invención o cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable, tales como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metálico o enzima. Dichas sondas y cebadores se usan para detectar la presencia de un polinucleótido de PSCA en una muestra y como un medio para detectar una célula que expresa una proteína PSCA.

Los ejemplos de dichas sondas incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ADNc de PSCA humana mostrada en la Figura 1. También se describen ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente ARNm de PSCA en los ejemplos. Como se entenderá por el experto en la materia, pueden prepararse una gran cantidad de cebadores y sondas diferentes basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento y usarse eficazmente para amplificar y/o detectar un ARNm de PSCA.

Los polinucleótidos de PSCA desvelados en el presente documento son útiles para diversos fines, incluyendo pero sin limitación su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del gen o los genes de PSCA, ARNm o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de próstata y otros cánceres; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de polipéptidos de PSCA; como herramientas para modular o inhibir la expresión del gen o los genes de PSCA y/o traducción del transcrito o los transcritos de PSCA; y como agentes terapéuticos.

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Se desvela en el presente documento el uso de cualquier sonda como se describe en el presente documento para identificar y aislar un PSCA o secuencia de ácido nucleico relacionada con PSCA de una fuente de origen natural, tal como seres humanos u otros mamíferos, así como la secuencia de ácido nucleico aislada en sí misma, que comprendería todas o la mayoría de las secuencias halladas en la sonda usada.

II.A.4. Aislamiento de Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican PSCA

Las secuencias de ADNc de PSCA descritas en el presente documento permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican un producto o productos génicos de PSCA, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos de productos génicos de PSCA, isoformas cortadas y empalmadas de forma alternativa, variantes alélicas y formas mutantes de un producto génico de PSCA así como polinucleótidos que codifican análogos de proteínas relacionadas con PSCA. Se conocen bien diversos métodos de clonación molecular que pueden emplearse para aislar ADNc de longitud completa que codifican un gen de PSCA (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Eds., Wiley and Sons, 1995). Por ejemplo, pueden emplearse convenientemente metodologías de clonación de fago lambda, usando sistemas de clonación disponibles en el mercado (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Pueden identificarse clones de fagos que contienen ADNc del gen de PSCA explorando con un ADNc de PSCA marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, puede sintetizarse un ADNc de PSCA (por ejemplo, Figura 1) o una parte del mismo y usarse como una sonda para recuperar ADNc solapantes y de longitud completa que corresponde a un gen de PSCA. Un gen de PSCA en sí mismo puede aislarse explorando bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares, con sondas o cebadores de ADN de PSCA.

II.A.5. Moléculas de Ácido Nucleico Recombinante y Sistemas de Hospedador-Vector

Se desvelan en el presente documento moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido de PSCA, un fragmento, análogo u homólogo del mismo, incluyendo pero sin limitación fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YAC, BAC, así como diversos vectores virales y no virales bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con dichas moléculas de ADN o ARN recombinantes. Se conocen bien métodos para generar dichas moléculas (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, mencionado anteriormente).

También se desvela en el presente documento un sistema de hospedador-vector que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido de PSCA, fragmento, análogo u homólogo del mismo dentro de una célula hospedadora procariota o eucariota adecuada. Los ejemplos de células hospedadoras eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal, o una célula animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula que puede infectarse por baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive). Los ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen diversas líneas celulares de cáncer de próstata tales como DU145 y TsuPr1, otras líneas celulares de cáncer de próstata transfectables o transducibles, células primarias (PrEC), así como varias células de mamífero usadas habitualmente para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de PSCA o un fragmento, análogo u homólogo del mismo puede usarse para generar proteínas PSCA o fragmentos de las mismas usando cualquier variedad de sistemas de hospedador-vector usados habitualmente y conocidos ampliamente en la técnica.

Están disponibles una amplia serie de sistemas de hospedador-vector adecuados para la expresión de proteínas PSCA o fragmentos de las mismas, véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989, mencionado anteriormente; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, mencionado anteriormente. Los vectores preferidos para expresión de mamíferos incluyen pero sin limitación pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSRhtkneo (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785). Usando estos vectores de expresión, puede expresarse PSCA en varias líneas celulares de cáncer de próstata y no de próstata, incluyendo por ejemplo 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPr1. Los sistemas de hospedador-vector son útiles para la producción de una proteína PSCA o fragmento de la misma. Dichos sistemas de hospedador-vector pueden emplearse para estudiar las propiedades funcionales de PSCA y mutaciones o análogos de PSCA.

Puede producirse una proteína PSCA humana recombinante o un análogo u homólogo o fragmento de la misma por células de mamífero transfectadas con una construcción que codifica un nucleótido relacionado con PSCA. Por ejemplo, pueden transfectarse células 293T con un plásmido de expresión que codifica PSCA o un fragmento, análogo u homólogo del mismo, se expresa una proteína relacionada con PSCA en las células 293T, y la proteína PSCA recombinante se aísla usando métodos de purificación convencionales (por ejemplo, purificación de afinidad usando anticuerpos anti PSCA). Como alternativa, se subclona una secuencia codificante de PSCA en el vector retroviral pSRMSVtkneo y se usa para infectar diversas líneas celulares de mamífero, tales como NIH 3T3, TsuPr1, 293 y rat-1 para establecer líneas celulares que expresen PSCA. También pueden emplearse diversos otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. Pueden usarse construcciones de expresión que codifican un péptido líder unido en fase con una secuencia codificante de PSCA para la generación de una forma secretada de proteína PSCA recombinante.

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Como se analiza en el presente documento, la redundancia del código genético permite variación en secuencias génicas de PSCA. En particular, se conoce en la técnica que especies hospedadoras específicas tienen con frecuencia preferencias codónicas específicas, y por lo tanto se puede adaptar la secuencia desvelada según se prefiera para un hospedador deseado. Por ejemplo, secuencias codónicas análogas preferidas normalmente tienen codones poco comunes (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso de menos de aproximadamente el 20 % en secuencias conocidas del hospedador deseado) reemplazados con codones de mayor frecuencia. Las preferencias codónicas para una especie específica se calculan, por ejemplo, utilizando tablas de uso codónico disponibles en INTERNET tal como en la dirección web URL dna.affrc.go.jp/∼nakamura/codon.html.

Se sabe que modificaciones de secuencia adicionales potencian la expresión de proteínas en un hospedador celular. Estas incluyen eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de corte y empalme de intrones/exones, repeticiones de tipo transposón y/u otras de dichas secuencias bien caracterizadas que son deletéreas para expresión génica. El contenido de GC de la secuencia se ajusta a niveles promedios para un hospedador celular dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedadora. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia consenso de inicio de la traducción al comienzo de la fase abierta de lectura, como se describe en Kozak, Mol. Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989). Los expertos en la materia entienden que la regla general de que los ribosomas eucariotas inician la traducción exclusivamente en el codón AUG 5’ próximo se anula solamente en condiciones muy poco habituales (véase, por ejemplo, Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).

III.) Proteínas relacionadas con PSCA

También se desvelan en el presente documento proteínas relacionadas con PSCA. Los ejemplos específicos de proteínas PSCA comprenden un polipéptido que tiene toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de PSCA humana como se muestra en la Figura 1, preferentemente Figura 1A. Como alternativa, los ejemplos de proteínas PSCA comprenden polipéptidos variantes, homólogos o análogos que tiene alteraciones en la secuencia de aminoácidos de PSCA mostrados en la Figura 1.

Un polipéptido de PSCA puede incluir: un polipéptido de PSCA que tenga una secuencia mostrada en la Figura 1, una secuencia peptídica de un PSCA como se muestra en la Figura 1 en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polipéptido que tienen la secuencia como se muestra en la Figura 1; o al menos 10 péptidos contiguos de un polipéptido que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1 en la que T es U.

Se proporcionan abreviaturas de aminoácidos en la Tabla II. Pueden realizarse con frecuencia sustituciones de aminoácidos conservativas en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Las proteínas pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservativas.

Las divulgaciones en el presente documento incluyen una amplia diversidad de variantes o análogos aceptados en la técnica de proteínas PSCA tales como polipéptidos que tienen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Pueden realizarse variantes de PSCA usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida, exploración de alanina y mutagénesis por PCR. Puede realizarse mutagénesis dirigida (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)), mutagénesis de casete (Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)), mutagénesis de selección de restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN variante de PSCA.

También puede emplearse análisis de aminoácidos de exploración para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que está implicada en una actividad biológica específica tal como una interacción proteína-proteína. De entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es normalmente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante. La alanina también se prefiere normalmente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones tanto internadas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)). Si la sustitución de alanina no produce cantidades suficientes de variante, puede usarse un aminoácido isostérico.

Como se define en el presente documento, las variantes, los análogos o los homólogos de PSCA tiene el atributo distintivo de tener al menos un epítopo que es “reactivo de forma cruzada” con una proteína PSCA que tiene una secuencia de aminoácidos de la Figura 1. Como se usa en esta frase, “reactivo de forma cruzada” significa que un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente con una variante de PSCA también se une específicamente con una proteína PSCA que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 1. Un polipéptido deja de ser una variante de una proteína mostrada en la Figura 1, cuando no contiene ya ningún epítopo que pueda reconocerse por un anticuerpo o linfocito T que se una específicamente con la proteína PSCA de partida. Los expertos en la materia entienden que los anticuerpos que reconocen proteínas se unen con epítopos de diversos tamaños, y un agrupamiento del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, se considera un número

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típico de aminoácidos en un epítopo mínimo. Véase, por ejemplo, Nair et al., J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol (1989) 26(9): 865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135(4): 2598-608.

Otras clases de variantes de proteína relacionada con PSCA comparten 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % o más similitud con una secuencia de aminoácidos de la Figura 1, o un fragmento de la misma. Otra clase específica de variantes o análogos de proteína PSCA comprende uno o más de los motivos biológicos de PSCA descritos en el presente documento o conocidos en la actualidad en la técnica. Por lo tanto, las divulgaciones del presente documento abarcan análogos de fragmentos de PSCA (ácido nucleico o aminoácido) que tienen propiedades funcionales alteradas (por ejemplo, inmunogénicas) en relación con el fragmento de partida. Debe apreciarse que los motivos actuales o que pasen a formar parte de la técnica deben aplicarse a las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de la Figura 1.

Como se analiza en el presente documento, los polipéptidos pueden tener menos de la secuencia de aminoácidos completa de una proteína PSCA mostrada en la Figura 1. Por ejemplo, los péptidos/proteínas pueden tener cualquiera de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos de una proteína PSCA mostrada en la Figura 1.

Se generan proteínas relacionadas con PSCA usando tecnología de síntesis peptídica convencional o usando métodos de escisión química bien conocidos en la técnica. Como alternativa, pueden usarse métodos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína relacionada con PSCA. En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico proporcionan un medio para generar fragmentos definidos de una proteína PSCA (o variantes, homólogos o análogos de la misma).

III.A.) Realizaciones de Proteína portadora de Motivos

Divulgaciones ilustrativas adicionales del presente documento incluyen polipéptidos de PSCA que comprenden los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de una secuencia polipeptídica de PSCA expuesta en la Figura 1. Se conocen en la técnica diversos motivos, y puede evaluarse una proteína con respecto a la presencia de dichos motivos por varios sitios de Internet disponibles públicamente (véase, por ejemplo, direcciones URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.utokyo.ac.jp/; cbs.dtu.dk/; ebi.ac.uk/interpro/scan.html; expasy.ch/tools/scnpsitl.html; Epimatrix™ y Epimer™, Universidad Brown, brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).

Se exponen e identifican subsecuencias portadoras de motivos de todas las proteínas variantes de PSCA en las Tablas V-XVIII y XXII-LI.

La Tabla IV(h) expone varios motivos de aparición frecuente basándose en búsquedas de pfam (véase dirección URL pfam.wustl.edu/). Las columnas de la Tabla IV(h) enumeran (1) la abreviatura del nombre del motivo, (2) el porcentaje de identidad hallado entre los diferentes miembros de la familia del motivo, (3) nombre o descripción del motivo y (4) función más común; se incluye información de localización si el motivo es relevante para la localización.

Los polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos de PSCA analizados anteriormente son útiles para dilucidar las características específicas de un fenotipo maligno a la vista de la observación de que los motivos de PSCA analizados anteriormente se asocian con desregulación del crecimiento y porque PSCA se sobreexpresa en ciertos cánceres (véase, por ejemplo, Tabla I). Caseína quinasa II, AMPc y proteína quinasa dependiente de AMPc, y Proteína Quinasa C, por ejemplo, son enzimas que se sabe que están asociadas con el desarrollo del fenotipo maligno (véase por ejemplo Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) y O’Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Además, tanto la glucosilación como la miristoilación son modificaciones de proteínas también asociadas con cáncer y progresión del cáncer (véase por ejemplo Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473(1): 21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). La amidación es otra modificación de proteínas también asociada con el cáncer y la progresión del cáncer (véase por ejemplo Treston et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)).

En otra divulgación, las proteínas pueden comprender uno o más de los epítopos inmunorreactivos identificados de acuerdo con métodos aceptados en la técnica, tales como los péptidos expuestos en las Tablas V-XVIII y XXII-LI. Los epítopos de CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína PSCA que sean capaces de unirse óptimamente con alelos de HLA específicos (por ejemplo, Tabla IV; Epimatrix™ y Epimer™, Universidad Brown, URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). Además, se conocen bien en la técnica procesos para identificar péptidos que tienen suficiente afinidad de unión por moléculas de HLA y que se correlacionan con ser epítopos inmunogénicos, y se llevan a cabo sin experimentación indebida. Además, se conocen bien en la técnica procesos para identificar péptidos que son epítopos inmunogénicos, y se llevan a cabo sin experimentación indebida bien in vitro o bien in vivo.

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También se conocen en la técnica principios para crear análogos de dichos epítopos para modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se comienza con un epítopo que porta un motivo de CTL o HTL (véase, por ejemplo, los motivos/supermotivos de HLA de Clase I y HLA de Clase II de la Tabla IV). El epítopo se hace análogo sustituyendo un aminoácido en una de las posiciones específicas, y remplazándolo con otro aminoácido específico para esa posición. Por ejemplo, basándose en los restos definidos en la Tabla IV, se puede sustituir un resto deletéreo a favor de cualquier otro resto, tal como un resto preferido; sustituir un resto menos preferido con un resto preferido; o sustituir un resto preferido que aparecía originalmente con otro resto preferido. Las sustituciones pueden producirse en posiciones de anclaje primarias o en otras posiciones en un péptido; véase, por ejemplo, Tabla IV.

Diversas referencias reflejan la técnica con respecto a la identificación y generación de epítopos en una proteína de interés así como análogos de la misma. Véase, por ejemplo, documento WO 97/33602 de Chesnut et al.; Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; y Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 16251633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O’Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.

Las divulgaciones relacionadas incluyen polipéptidos que comprenden combinaciones de los diferentes motivos expuestos en las Tablas IV(a), IV(b), IV(c), IV(d), y IV(h), y/o uno o más de los epítopos de CTL predichos de las Tablas V-XVIII y XXII-LI, y/o uno o más de los epítopos de HTL predichos de las Tablas XLVIII-LI, y/o uno o más de los motivos de unión a linfocitos T conocidos en la técnica. Algunos polipéptidos no contienen inserciones, deleciones o sustituciones dentro de los motivos o dentro de las secuencias intermedias de los polipéptidos. Además, pueden ser deseables polipéptidos que incluyan varios restos de aminoácidos N terminales y/o C terminales en uno de los lados de estos motivos (por ejemplo, para incluir una mayor parte de la arquitectura polipeptídica en la que se localiza el motivo). Normalmente, el número de restos de aminoácidos N terminales y/o C terminales en uno de los lados de un motivo está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 restos de aminoácidos, preferentemente entre 5 y aproximadamente 50 restos de aminoácidos.

Las proteínas relacionadas con PSCA se realizan de muchas formas, preferentemente en forma aislada. Una molécula de proteína PSCA purificada estará sustancialmente sin otras proteínas o moléculas que alteren la unión de PSCA con el anticuerpo, linfocito T u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerán del uso pretendido. Las proteínas relacionadas con PSCA pueden incluir proteínas relacionadas con PSCA purificadas y proteínas relacionadas con PSCA solubles, funcionales. En una divulgación, una proteína PSCA soluble, funcional, o fragmento de la misma conserva la capacidad para unirse con el anticuerpo, linfocito T u otro ligando.

Las divulgaciones del presente documento también proporcionan proteínas PSCA que comprenden fragmentos biológicamente activos de una secuencia de aminoácidos de PSCA mostrada en la Figura 1. Dichas proteínas muestran propiedades de la proteína PSCA de partida, tal como la capacidad para inducir la generación de anticuerpos que se unen específicamente con un epítopo asociado con la proteína PSCA de partida; para unirse con dichos anticuerpos; para inducir la activación de HTL o CTL; y/o para reconocerse por HTL o CTL que también se unen específicamente con la proteína de partida.

Pueden predecirse y/o identificarse polipéptidos relacionados con PSCA que contienen estructuras particularmente interesantes usando diversas técnicas analíticas bien conocidas en este campo, incluyendo, por ejemplo, los métodos de análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf,

o basándose en inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen dichas estructuras son particularmente útiles en la generación de anticuerpos anti PSCA específicos de subunidad o linfocitos T o en la identificación de factores celulares que se unen con PSCA. Por ejemplo, pueden generarse perfiles de hidrofilia e identificarse fragmentos peptídicos inmunogénicos, usando el método de Hopp, T. P. y Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828. Pueden generarse perfiles de hidropaticidad, e identificarse fragmentos peptídicos inmunogénicos usando el método de Kyte, J. y Doolittle, R. F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132. Pueden generarse perfiles de Porcentaje ( %) de Restos Accesibles e identificarse fragmentos peptídicos inmunogénicos usando el método de Janin J., 1979, Nature 277: 491-492. Pueden generarse perfiles de Flexibilidad Promedio e identificarse fragmentos peptídicos inmunogénicos, usando el método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res.

32: 242-255. Pueden generarse perfiles de giro beta, e identificarse fragmentos peptídicos inmunogénicos, usando el método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294.

Pueden determinarse epítopos de CTL usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína PSCA que son capaces de unirse óptimamente con alelos de HLA específicos (por ejemplo, usando el sitio SYFPEITHI en la URL de la Web syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; los listados en la Tabla IV(A)-(E); Epimatrix™ y Epimer™, Universidad Brown, URL (brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). Ilustrando esto, se han predicho epítopos peptídicos de PSCA que se presentan en el contexto de moléculas del MHC de Clase I humano, por ejemplo, HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 y B35 (véase, por ejemplo,

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Las proteínas relacionadas con PSCA también pueden modificarse para formar una molécula quimérica que comprende PSCA fusionado con otra secuencia de aminoácidos o polipeptídica heteróloga. Dicha molécula quimérica puede sintetizarse químicamente o de forma recombinante. Una molécula quimérica puede tener una proteína como se desvela en el presente documento fusionada con otro antígeno asociado a tumor o fragmento del mismo. Como alternativa, una proteína de acuerdo con las divulgaciones del presente documento puede comprender una fusión de fragmentos de una secuencia de PSCA (aminoácidos o ácido nucleico) de modo que se crea una molécula que, en toda su longitud, no es homóloga directamente de las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos mostradas en la Figura 1. Dicha molécula quimérica puede comprender múltiples de la misma subsecuencia de PSCA. Una molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con PSCA con un marcador epitópico de polihistidina, que proporciona un epítopo con el que puede unirse selectivamente el níquel inmovilizado, con citocinas o con factores de crecimiento. El marcador epitópico se coloca en general en el extremo amino o carboxilo terminal de una proteína PSCA. En un ejemplo alternativo, la molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con PSCA con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada “inmunoadhesina”), dicha fusión podría ser con la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones de Ig preferentemente incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana suprimido o inactivado) de un polipéptido de PSCA en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. La fusión de inmunoglobulina puede incluir las regiones bisagra, CH2 y CH3 o las bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgGI. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº

5.428.130 expedida el 27 de junio de 1995.

III.D.) Usos de Proteínas relacionadas con PSCA

Las proteínas desveladas en el presente documento tienen varios usos específicos diferentes. Como PSCA está altamente expresado en cánceres de próstata y otros, se usan proteínas relacionadas con PSCA en métodos que evalúan el estado de productos génicos de PSCA en tejidos cancerosos frente a normales, dilucidando de este modo el fenotipo maligno. Normalmente, se usan polipéptidos de regiones específicas de una proteína PSCA para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en esas regiones (tales como regiones que contienen uno o más motivos). Los ensayos ejemplares utilizan anticuerpos o linfocitos T que se dirigen a proteínas relacionadas con PSCA que comprenden los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de una secuencia polipeptídica de PSCA para evaluar las características de esta región en tejidos normales frente a cancerosos o para inducir una respuesta inmunitaria al epítopo. Como alternativa, se usan proteínas relacionadas con PSCA que contienen los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos en una proteína PSCA para explorar con respecto a factores que interaccionan con esa región de PSCA.

Los fragmentos/subsecuencias de proteínas PSCA son particularmente útiles para generar y caracterizar anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracelular de una proteína PSCA), para identificar agentes o factores celulares que se unen con PSCA o un dominio estructural particular del mismo, y en diversos contextos terapéuticos y de diagnóstico, incluyendo pero sin limitación ensayos de diagnóstico, vacunas de cáncer y métodos para preparar dichas vacunas.

Las proteínas codificadas por los genes de PSCA, o por análogos, homólogos o fragmentos de los mismos, tienen diversos usos, incluyendo pero sin limitación generar anticuerpos y en métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen con un producto génico de PSCA. Los anticuerpos inducidos contra una proteína PSCA o fragmento de la misma son útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico, y metodologías de captura de imágenes en el tratamiento de cánceres humanos caracterizados por la expresión de proteína PSCA, tales como los enumerados en la Tabla I. Dichos anticuerpos pueden expresarse de forma intracelular y usarse en métodos para tratar a pacientes con dichos cánceres. También se usan proteínas o ácidos nucleicos relacionados con PSCA en la generación de respuestas de HTL o CTL.

Se usan diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas PSCA, incluyendo pero sin limitación diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos y similares. Los anticuerpos pueden marcarse y usarse como reactivos de captura de imágenes inmunológicos capaces de detectar células que expresan PSCA (por ejemplo, en métodos de captura de imágenes radioescintigráficos). Las proteínas PSCA también son particularmente útiles en la generación de vacunas de cáncer, como se describe adicionalmente en el presente documento.

IV.) Anticuerpos de PSCA

Un aspecto de la invención proporciona anticuerpos que se unen con proteínas relacionadas con PSCA. Los anticuerpos preferidos se unen específicamente con una proteína relacionada con PSCA y no se unen (o se unen débilmente) con péptidos o proteínas que no son proteínas relacionadas con PSCA en condiciones fisiológicas. En este contexto, los ejemplos de condiciones fisiológicas incluyen: 1) solución salina tamponada con fosfato; 2) solución salina tamponada con Tris que contiene Tris 25 mM y NaCl 150 mM; o solución salina normal (NaCl 0,9 %);

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4) suero animal tal como suero humano; o 5) una combinación de cualquiera de 1) a 4); estas reacciones tienen lugar preferentemente a pH 7,5, como alternativa en un intervalo de pH 7,0 a 8,0, o como alternativa en un intervalo de pH de 6,5 a 8,5; teniendo además estas reacciones lugar a una temperatura entre 4 ºC y 37 ºC. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen con PSCA pueden unirse con proteínas relacionadas con PSCA tales como los homólogos

o análogos de las mismas.

Los anticuerpos de PSCA de la invención son particularmente útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico de cáncer (véase, por ejemplo, Tabla I) y metodologías de captura de imágenes. De forma similar, dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de cánceres de próstata y otros, en la medida en que PSCA también se expresa o sobreexpresa en estos otros cánceres. Además, los anticuerpos expresados de forma intracelular (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios) son terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres en los que está implicada la expresión de PSCA, tales como cánceres de próstata avanzados o metastásicos u otros cánceres avanzados o metastásicos.

Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de PSCA y proteínas relacionadas con PSCA mutantes. Dichos ensayos pueden comprender uno o más anticuerpos de PSCA capaces de reconocer y unirse con una proteína relacionada con PSCA, según sea apropiado. Estos ensayos se realizan dentro de diversos formatos de ensayo inmunológicos bien conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitación diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA) y similares.

Los ensayos inmunológicos no de anticuerpo también comprenden ensayos de inmunogenicidad de linfocitos T (inhibidores o estimuladores) así como ensayos de unión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

Además, también se desvelan en el presente documento métodos de captura de imágenes inmunológicos capaces de detectar cáncer de próstata y otros cánceres que expresan PSCA, incluyendo pero sin limitación métodos de captura de imágenes radioescintigráficos que usan anticuerpos de PSCA marcados. Dichos ensayos son clínicamente útiles en la detección, control y pronóstico de cánceres que expresan PSCA tales como cáncer de próstata.

También se usan anticuerpos de PSCA en métodos para purificar una proteína relacionada con PSCA y para aislar homólogos de PSCA y moléculas relacionadas. Por ejemplo, un método para purificar una proteína relacionada con PSCA comprende incubar un anticuerpo de PSCA, que se ha acoplado con una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene una proteína relacionada con PSCA en condiciones que permitan que el anticuerpo de PSCA se una con la proteína relacionada con PSCA; lavar la matriz sólida para eliminar impurezas; y eluir la proteína relacionada con PSCA del anticuerpo acoplado. Otros usos de anticuerpos de PSCA incluyen generar anticuerpos antiidiotípicos que imitan una proteína PSCA.

Se conocen bien en la técnica diversos métodos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos inmunizando un hospedador mamífero adecuado usando una proteína, un péptido o un fragmento relacionado con PSCA, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también pueden usarse proteínas de fusión de PSCA, tales como una proteína de fusión de PSCA GST. En una realización particular, se produce una proteína de fusión de GST que comprende toda o la mayoría de la secuencia de aminoácidos de la Figura 1, y después se usa como un inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otra realización, se sintetiza una proteína relacionada con PSCA y se usa como un inmunógeno.

Además, se usan técnicas de inmunización de ADN desnudo conocidas en este campo (con o sin proteína relacionada con PSCA purificada o células que expresen PSCA) para generar una respuesta inmunitaria al inmunógeno codificado (para una revisión, véase Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).

La secuencia de aminoácidos de una proteína PSCA como se muestra en la Figura 1 puede analizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína PSCA para generar anticuerpos. Por ejemplo, se usan análisis de hidrofobicidad e hidrofilia de una secuencia de aminoácidos de PSCA para identificar regiones hidrófilas en la estructura de PSCA. Pueden identificarse fácilmente regiones de una proteína PSCA que muestran estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, usando diversos otros métodos conocidos en la técnica, tales como análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Pueden generarse perfiles de hidrofilia usando el método de Hopp, T. P. y Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 78: 3824-3828. Pueden generarse perfiles de hidropaticidad usando el método de Kyte, J. y Doolittle, R. F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132. Pueden generarse perfiles de Porcentaje ( %) de Restos Accesibles usando el método de Janin J., 1979, Nature 277: 491-492. Pueden generarse perfiles de flexibilidad promedio usando el método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255. Pueden generarse perfiles de giro beta usando el método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294. Por lo tanto, cada región identificada por cualquiera de estos programas o métodos está dentro del alcance de la presente invención. Los métodos preferidos para la generación de anticuerpos de PSCA se ilustran adicionalmente por medio de los ejemplos proporcionados en el presente documento. Se conocen bien en la técnica métodos para preparar

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una proteína o polipéptido para su uso como un inmunógeno. También se conocen bien en la técnica métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo, tales como BSA, KLH u otra proteína vehículo. En algunas circunstancias, se usa conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos son eficaces reactivos de enlace tales como los proporcionados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL, are effective. Se realiza con frecuencia administración de un inmunógeno de PSCA mediante inyección durante un periodo de tiempo adecuado y con uso de un adyuvante adecuado, como se entiende en la técnica. Durante el programa de inmunización, pueden tomarse títulos de anticuerpos para determinar la adecuación de la formación de anticuerpos.

Pueden producirse anticuerpos monoclonales de PSCA por diversos medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se preparan líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado usando la tecnología de hibridoma convencional de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan linfocitos B productores de anticuerpos, como se conoce en general. Se exploran líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados por inmunoensayo en el que el antígeno es una proteína relacionada con PSCA. Cuando el cultivo celular inmortalizado apropiado se identifica, las células pueden expandirse y los anticuerpos producirse bien a partir de cultivos in vitro o bien de líquido ascítico.

Los anticuerpos o fragmentos de la invención también pueden producirse, por medios recombinantes. También pueden producirse regiones que se unen específicamente con las regiones deseadas de una proteína PSCA en el contexto de anticuerpos con injertos de región quimérica o determinante de complementariedad (CDR) de múltiples orígenes de especie. También puede producirse anticuerpos de PSCA humanizados o humanos y se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Se conocen bien métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros no humanos, sustituyendo con una o más de las CDR de anticuerpo no humano secuencias de anticuerpo humano correspondientes (véase por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Véase también Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 y Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.

Los métodos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen métodos de presentación en fagos y transgénicos (para una revisión, véase Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Pueden generarse anticuerpos monoclonales de PSCA completamente humanos usando tecnologías de clonación que emplean bibliotecas combinatorias de genes de Ig humanos grandes (es decir, presentación en fagos) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Misma referencia., pp 65-82). También pueden producirse anticuerpos monoclonales de PSCA completamente humanos usando ratones transgénicos modificados técnicamente para contener loci de genes de inmunoglobulina humana como se describe en la Solicitud de Patente de PCT WO98/24893, Kucherlapati y Jakobovits et al., publicado el 3 de diciembre de 1997 (véase también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; patentes de Estados Unidos

6.162.963 expedida el 19 de diciembre de 2000; 6.150.584 expedida el 12 de noviembre de 2000; y 6.114.598 expedida el 5 de septiembre de 2000). Este método evita la manipulación in vitro requerida con tecnología de presentación en fagos y produce eficazmente anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.

La reactividad de anticuerpos de PSCA con una proteína relacionada con PSCA puede establecerse por varios medios bien conocidos, incluyendo transferencia de Western, inmunoprecipitación, ELISA y análisis de FACS usando, según sea apropiado, proteínas relacionadas con PSCA, células que expresan PSCA o extractos de las mismas. Un anticuerpo de PSCA o fragmento del mismo puede marcarse con un marcador detectable o conjugarse con una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero sin limitación, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Además, se generan anticuerpos biespecíficos específicos para dos o más epítopos de PSCA usando métodos conocidos en general en la técnica. También pueden generarse anticuerpos homodiméricos por técnicas de entrecruzamiento conocidas en este campo (por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).

En una realización, la invención proporciona anticuerpos monoclonales identificados como Hal-4.121, se envió (mediante Federal Express) a la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 4 de mayo de 2005 y se le asignó el número de Referencia PTA-6701. También se desvelan en el presente documento anticuerpos monoclonales identificados como Ha1-1.16, Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.20, Ha1-4.37 que se enviaron (mediante Federal Express) a la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 4 de mayo de 2005 y se les asignaron los números de Referencia PTA-6698, PTA-6703, PTA-6699, PTA-6700 y PTA-6702 respectivamente.

V.) Respuestas Inmunitarias Celulares a PSCA

El mecanismo por el que los linfocitos T reconocen antígenos se ha delimitado. Las composiciones de vacuna de epítopos peptídicos eficaces desveladas en el presente documento inducen respuestas inmunitarias terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población mundial. Para un entendimiento del valor y la eficacia de las composiciones que inducen respuestas inmunitarias celulares, se proporciona una breve revisión de la tecnología

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relacionada con inmunología.

Un complejo de una molécula de HLA y un antígeno peptídico actúa como el ligando reconocido por linfocitos T restringidos por HLA (Buus, S. et al., Cell 47: 1071, 1986; Babbitt, B. P. et al., Nature 317: 359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7: 601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11: 403, 1993). A lo largo del estudio de análogos de antígenos con aminoácidos individuales sustituidos y la secuenciación de péptidos procesados de forma natural, unidos de forma endógena, se han identificado restos críticos que corresponden a motivos requeridos para unión específica con moléculas de antígeno de HLA y se exponen en la Tabla IV (véase también, por ejemplo, Southwood, et al., J. Immunol. 160: 3363, 1998; Rammensee, et al., Immunogenetics 41: 178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, acceso a través de la Web en la URL (134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm); Sette, A. y Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10: 478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6: 13, 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4: 79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol. 6: 52, 1994; Ruppert et al., Cell 74: 929-937, 1993; Kondo et al., J. Immunol. 155: 4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immunol. 157: 3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45: 79-93, 1996; Sette, A. y Sidney, J. Immunogenetics nov 1999; 50(3-4):201-12, Revisión).

Además, los análisis cristalográficos de rayos x de complejos de HLA-péptido han revelado bolsillos dentro de la hendidura/surco de unión del péptido de moléculas HLA que acomodan, de una manera específica de alelo, restos portados por ligandos peptídicos; estos restos a su vez determinan la capacidad de unión de HLA de los péptidos en los que están presentes. (Véase, por ejemplo, Madden, D. R. Annu. Rev. Immunol. 13: 587, 1995; Smith, et al., Immunity 4: 203, 1996; Fremont et al., Immunity 8: 305, 1998; Stern et al., Structure 2: 245, 1994; Jones, E. Y. Curr. Opin. Immunol. 9: 75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364: 33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

90: 8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 360: 364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360: 367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257: 927, 1992; Madden et al., Cell 70: 1035, 1992; Fremont, D. H. et al., Science 257: 919,1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. y Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219: 277, 1991).

En consecuencia, la definición de motivos de unión a HLA específicos de alelo de clase I y clase II o supermotivos de clase I o clase II permite la identificación de regiones dentro de una proteína que están correlacionadas con la unión a un antígeno o antígenos de HLA particulares.

Por lo tanto, por un proceso de identificación de motivo de HLA, se han identificado candidatos para vacunas basadas en epítopos; dichos candidatos pueden evaluarse adicionalmente por ensayos de unión de HLA-péptido para determinar la afinidad de unión y/o el periodo de tiempo de asociación del epítopo y su molécula de HLA correspondiente. Puede realizarse trabajo de confirmación adicional para seleccionar, entre estos candidatos a vacuna, epítopos con características preferidas con respecto a cobertura de población y/o inmunogenicidad.

Pueden utilizarse diversas estrategias para evaluar la inmunogenicidad celular, incluyendo:

1) Evaluación de cultivos de linfocitos T primarios a partir de individuos normales (véase, por ejemplo, Wentworth, P. A. et al., Mol. Immunol. 32: 603, 1995; Celis, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105, 1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 158: 1796, 1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59: 1, 1998). Este procedimiento implica la estimulación de linfocitos de sangre periférica (PBL) de sujetos normales con un péptido de ensayo en presencia de células presentadoras de antígeno in vitro durante un periodo de varias semanas. Los linfocitos T específicos para el péptido se activan durante este tiempo y se detectan usando, por ejemplo, un ensayo de liberación de linfocinas o 51Cr que implica células diana sensibilizadas a péptido. 2) Inmunización de ratones transgénicos para HLA (véase, por ejemplo, Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26: 97, 1996; Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol. 8: 651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol. 159: 4753, 1997). Por ejemplo, en dichos métodos los péptidos en adyuvante incompleto de Freund se administran por vía subcutánea a ratones transgénicos para HLA. Varias semanas después de la inmunización, los esplenocitos se retiran y se cultivan in vitro en presencia de péptido de ensayo durante aproximadamente una semana. Se detectan linfocitos T específicos de péptido usando, por ejemplo, un ensayo de liberación de 51Cr que implica células diana sensibilizadas a péptido y células diana que expresan antígeno generado de forma endógena. 3) Demostración de respuestas de linfocitos T de recuerdo de individuos inmunitarios que se han vacunado con éxito y/o de pacientes crónicamente enfermos (véase, por ejemplo, Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181: 1047, 1995; Doolan, D. L. et al., Immunity 7: 97, 1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest. 100: 503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J. Immunol. 159: 1648, 1997; Diepolder, H. M. et al., J. Virol. 71: 6011, 1997). En consecuencia, se detectan respuestas de recuerdo cultivando PBL de sujetos que se han expuesto al antígeno debido a una enfermedad y por lo tanto han generado una respuesta inmunitaria “de forma natural” o de pacientes que se han vacunado contra el antígeno. Se cultivan PBL de sujetos in vitro durante 1-2 semanas en presencia de péptido de ensayo más células presentadoras de antígeno (APC) para permitir la activación de linfocitos T de “memoria”, en comparación con linfocitos T “vírgenes”. Al final del periodo de cultivo, la actividad de linfocitos T se detecta usando ensayos incluyendo liberación de 51Cr que implica dianas sensibilizadas a péptido, proliferación de linfocitos T o liberación de linfocinas.

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VI.) Animales Transgénicos para PSCA

También pueden usarse ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con PSCA para generar animales transgénicos o animales “knock out” que, a su vez, son útiles en el desarrollo y exploración de reactivos terapéuticamente útiles. De acuerdo con técnicas establecidas, puede usarse ADNc que codifica PSCA para clonar ADN genómico que codifica PSCA. Las secuencias genómicas clonadas pueden usarse después para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica PSCA. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han hecho convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.736.866 expedida el 12 de abril de 1988 y 4.870.009 expedida el 26 de septiembre de 1989. Normalmente, se dirigiría incorporación de transgenes de PSCA a células particulares con potenciadores específicos de tejido.

Pueden usarse animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica PSCA para examinar el efecto de expresión aumentada de ADN que codifica PSCA. Dichos animales pueden usarse como animales de ensayo para reactivos que se cree que confieren protección de, por ejemplo, afecciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con la presente divulgación, un animal se trata con un reactivo y una incidencia reducida de una afección patológica, en comparación con animales no tratados que porten el transgén, indicaría una intervención terapéutica potencial para la afección patológica.

Como alternativa, pueden usarse homólogos no humanos de PSCA para construir un animal “knock out” para PSCA que tenga un gen defectuoso o alterado que codifique PSCA como resultado de recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica PSCA y ADN genómico alterado que codifica PSCA introducido en una célula embrionaria de animal. Por ejemplo, puede usarse ADNc que codifica PSCA para clonar ADN genómico que codifica PSCA de acuerdo con técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica PSCA puede suprimirse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifique un marcador seleccionable que pueda usarse para controlar la integración. Normalmente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los extremos tanto 5’ como 3’) en el vector (véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno (véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)). Las células seleccionadas se inyectan después en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.

J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). Después puede implantarse un embrión quimérico en un animal sustituto hembra seudoembarazada adecuado, y el embrión se lleva a término para crear un animal “knock out”. La descendencia que alberga el ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede identificarse por técnicas convencionales y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de forma homóloga. Los animales knock out pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas afecciones patológicas o por su desarrollo de afecciones patológicas debido a ausencia de un polipéptido de PSCA.

VII.) Métodos para la detección de PSCA

Otra divulgación del presente documento se refiere a métodos para detectar polinucleótidos de PSCA y proteínas relacionadas con PSCA, así como métodos para identificar una célula que expresa PSCA. El perfil de expresión de PSCA lo hace un marcador de diagnóstico para enfermedad metastatizada. En consecuencia, el estado de productos génicos de PSCA proporciona información útil para predecir diversos factores incluyendo susceptibilidad a enfermedad de estadio avanzado, tasa de progresión y/o agresividad del tumor. Como se analiza en detalle en el presente documento, el estado de los productos génicos de PSCA en muestras de pacientes puede analizarse por diversos protocolos que se conocen bien en la técnica incluyendo análisis inmunohistoquímico, la diversidad de técnicas de transferencia de Northern incluyendo hibridación in situ, análisis de RT-PCR (por ejemplo en muestras microdiseccionadas de captura por láser), análisis de transferencia de Western y análisis de matriz tisular.

Más particularmente, la divulgación proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos de PSCA en una muestra biológica, tal como suero, hueso, próstata y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los polinucleótidos de PSCA detectables incluyen, por ejemplo, un gen de PSCA o fragmento del mismo, ARNm de PSCA, ARNm de PSCA variante de corte y empalme alternativo y moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido de PSCA. Se conocen bien en la técnica varios métodos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos de PSCA y pueden emplearse en la práctica de este aspecto de la invención.

Un método para detectar un ARNm de PSCA en una muestra biológica puede comprender producir ADNc de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc producido de este modo usando polinucleótidos de PSCA como cebadores con sentido y antisentido para amplificar ADNc de PSCA en los mismos; y detectar la presencia del ADNc de PSCA amplificado. Opcionalmente, puede determinarse la secuencia del ADNc de PSCA amplificado.

Un método para detectar un gen de PSCA en una muestra biológica puede comprender aislar en primer lugar ADN

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genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico aislado usando polinucleótidos de PSCA como cebadores con sentido y antisentido; y detectar la presencia del gen de PSCA amplificado. Puede diseñarse cualquier variedad de combinaciones de sondas con sentido y antisentido apropiadas a partir de una secuencia de nucleótidos de PSCA (véase, por ejemplo, Figura 1) y usarse para este fin.

También se desvelan en el presente documento ensayos para detectar la presencia de una proteína PSCA en un tejido u otra muestra biológica tal como suero, semen, hueso, próstata, orina, preparaciones celulares y similares. También se conocen bien métodos para detectar una proteína relacionada con PSCA e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de transferencia de Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, un método para detectar la presencia de una proteína relacionada con PSCA en una muestra biológica comprende poner en contacto en primer lugar la muestra con un anticuerpo de PSCA, un fragmento reactivo a PSCA del mismo, o una proteína recombinante que contiene una región de unión a antígeno de un anticuerpo de PSCA; y después detectar la unión de la proteína relacionada con PSCA en la muestra.

También están dentro del alcance de las divulgaciones métodos para identificar una célula que exprese PSCA. Un ensayo para identificar una célula que exprese un gen de PSCA puede comprender detectar la presencia de ARNm de PSCA en la célula. Se conocen bien métodos para la detección de ARNm particulares en células e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementario (tales como hibridación in situ usando ribosondas de PSCA marcadas, transferencia de Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para PSCA, y otros métodos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Como alternativa, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de PSCA comprende detectar la presencia de proteína relacionada con PSCA en la célula o secretada por la célula. Se conocen bien en la técnica diversos métodos para la detección de proteínas y se emplean para la detección de proteínas relacionadas con PSCA y células que expresan proteínas relacionadas con PSCA.

El análisis de expresión de PSCA también es útil como una herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresión génica de PSCA. Por ejemplo, la expresión de PSCA se regula positivamente de forma significativa en cáncer de próstata y se expresa en cánceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. La identificación de una molécula o un agente biológico que inhibe la expresión o sobreexpresión de PSCA en células cancerosas tiene valor terapéutico. Por ejemplo, dicho agente puede identificarse usando una exploración que cuantifica la expresión de PSCA por RT-PCR, hibridación de ácido nucleico o unión a anticuerpo.

VIII.) Métodos para Controlar el Estado de Genes relacionados con PSCA y Sus Productos

Se sabe que la oncogénesis es un proceso multietapa en el que el crecimiento celular se desregula progresivamente y las células progresan de un estado fisiológico normal a precanceroso y después estados cancerosos (véase, por ejemplo, Alers et al., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) y Isaacs et al., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica con respecto a pruebas de crecimiento celular desregulado (tal como expresión de PSCA aberrante en cánceres) permite la detección temprana de dicha fisiológica aberrante, antes de que un estado patológico tal como cáncer halla progresado a un estadio en el que las opciones terapéuticas estén más limitadas y/o el pronóstico sea peor. En dichos exámenes, puede compararse el estado de PSCA en una muestra biológica de interés, por ejemplo, con el estado de PSCA en una muestra normal correspondiente (por ejemplo una muestra de ese individuo o como alternativa otro individuo que no se ve afectado por una patología). Una alteración en el estado de PSCA en la muestra biológica (en comparación con la muestra normal) proporciona pruebas del crecimiento celular desregulado. Además de usar una muestra biológica que no se ve afectada por una patología como una muestra normal, también se puede usar un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de expresión de ARNm (véase, por ejemplo, Grever et al., J. Comp. Neurol. 9 dic 1996; 376(2): 306-14 y Patente de Estados Unidos Nº 5.837.501) para comparar el estado de PSCA en una muestra.

El término “estado” en este contexto se usa de acuerdo con su significado aceptado en la técnica y se refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Normalmente, los expertos en la materia usan varios parámetros para evaluar la condición o el estado de un gen y sus productos. Estos incluyen, pero sin limitación, la localización de productos génicos expresados (incluyendo la localización de células que expresan PSCA) así como el nivel, y la actividad biológica de productos génicos expresados (tales como ARNm de PSCA, polinucleótidos y polipéptidos). Normalmente, una alteración del estado de PSCA comprende un cambio en la localización de PSCA y/o células que expresan PSCA y/o un aumento en la expresión de ARNm y/o proteína de PSCA.

El estado de PSCA en una muestra puede analizarse por varios medios bien conocidos en la técnica, incluyendo sin limitación, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis por RT-PCR en muestras microdiseccionadas con captura por láser, análisis de transferencia de Western y análisis de matrices tisulares. Se encuentran protocolos típicos para evaluar el estado de un gen y productos génicos de PSCA, por ejemplo, en Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Transferencia de Northern), 4 (Transferencia de Southern), 15 (Inmunotransferencia) y 18 (análisis de PCR). Por lo tanto, el estado de PSCA en una muestra biológica se evalúa por diversos métodos utilizados por expertos en la materia incluyendo, pero sin limitación análisis de Southern

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genómico (para examinar, por ejemplo perturbaciones en un gen de PSCA), análisis de Northern y/o análisis de PCR de ARNm de PSCA (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias polinucleotídicas o niveles de expresión de ARNm de PSCA), y análisis de Western y/o inmuohistoquímica (para examinar, por ejemplo alteraciones en secuencias polipeptídicas, alteraciones en localización polipeptídica dentro de una muestra, alteraciones en niveles de expresión de proteínas PSCA y/o asociaciones de proteínas PSCA con compañeros de unión polipeptídicos). Los polinucleótidos de PSCA detectables incluyen, por ejemplo, un gen de PSCA o fragmento del mismo, ARNm de PSCA, variantes de corte y empalme alternativo, ARNm de PSCA y moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido de PSCA.

El perfil de expresión de PSCA lo hace un marcador de diagnóstico para enfermedad local y/o metastatizada, y proporciona información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de PSCA proporciona información útil para predecir la susceptibilidad a estadios de enfermedad particulares, progresión y/o agresividad tumoral. Se desvelan en el presente documento métodos y ensayos para determinar el estado de PSCA y diagnosticar cánceres que expresan PSCA, tales como cánceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el ARNm de PSCA se expresa en tan alta medida en próstata y otros cánceres en relación con el tejido de próstata normal, pueden usarse ensayos que evalúen los niveles de transcritos de ARNm o proteínas de PSCA en una muestra biológica para diagnosticar una enfermedad asociada con la desregulación de PSCA, y pueden proporcionar información de pronóstico útil para definir opciones terapéuticas apropiadas.

El estado de expresión de PSCA proporciona información incluyendo la presencia, el estadio y la localización de células displásicas, precancerosas y cancerosas, que predicen la susceptibilidad a diversos estadios de enfermedad y/o para calibrar la agresividad tumoral. Además, el perfil de expresión lo hace útil como un reactivo de captura de imágenes para enfermedad metastatizada. En consecuencia, se desvelan en el presente documento diversos métodos de pronóstico y diagnóstico moleculares para examinar el estado de PSCA en muestras biológicas tales como las de individuos que padecen, o se sospecha que padecen una patología caracterizada por crecimiento celular desregulado, tal como cáncer.

Como se ha descrito anteriormente, el estado de PSCA en una muestra biológica puede examinarse por varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estado de PSCA en una muestra biológica tomada de una localización específica en el cuerpo puede examinarse evaluando la muestra con respecto a la presencia o ausencia de células que expresen PSCA (por ejemplo las que expresan ARNm o proteínas de PSCA). Este examen puede proporcionar pruebas de crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando se encuentren células que expresen PSCA en una muestra biológica que no contenga normalmente dichas células (tal como un ganglio linfático), porque dichas alteraciones en el estado de PSCA en una muestra biológica se asocian con frecuencia con crecimiento celular desregulado. Específicamente, un indicador del crecimiento celular desregulado es las metástasis de células cancerosas de un órgano de origen (tal como la próstata) a un área diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfático). En este contexto, son importantes las pruebas de crecimiento celular desregulado por ejemplo porque pueden detectarse metástasis de ganglios linfático ocultas en una proporción sustancial de pacientes con cáncer de próstata, y dichas metástasis se asocian con predictores conocidos de progresión de enfermedad (véase, por ejemplo, Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) y Freeman et al., J Urol Ago 1995 154(2 Pt 1): 474-8).

Se desvelan en el presente documento métodos para controlar los productos génicos de PSCA determinando el estado de los productos génicos de PSCA expresados por células de un individuo que se sospecha que tiene una enfermedad asociada con crecimiento celular desregulado (tal como hiperplasia o cáncer) y comparando después el estado determinado de este modo con el estado de productos génicos de PSCA en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos génicos de PSCA aberrantes en la muestra de ensayo en relación con la muestra normal proporciona una indicación de la presencia del crecimiento celular desregulado dentro de las células del individuo.

Se desvelan en el presente documento ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprenden detectar un aumento significativo en la expresión de proteína o ARNm de PSCA en una muestra celular

o tisular de ensayo en relación con los niveles de expresión en la célula o el tejido normal correspondiente. La presencia de ARNm de PSCA puede evaluarse, por ejemplo, en tejidos incluyendo pero sin limitación los enumerados en la Tabla I. La presencia de la expresión de PSCA significativa en cualquiera de estos tejidos es útil para indicar la aparición, presencia y/o gravedad en un cáncer, ya que los tejidos normales correspondientes no expresan ARNm de PSCA o lo expresan a niveles menores.

En una divulgación relacionada, el estado de PSCA se determina al nivel de proteínas en lugar de al nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, dicho método comprende determinar el nivel de proteína de PSCA expresada por células en una muestra tisular de ensayo y comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de PSCA expresado en una muestra normal correspondiente. La presencia de proteína PSCA puede evaluarse, por ejemplo, usando métodos inmunohistoquímicos. Se usan anticuerpos de PSCA o compañeros de unión capaces de detectar expresión de la proteína PSCA en diversos formatos de ensayo bien conocidos en la técnica para este fin.

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Se puede evaluar el estado de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PSCA en una muestra biológica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Dichas evaluaciones son útiles porque se observan perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en un gran número de proteínas asociadas con un fenotipo de crecimiento desregulado (véase, por ejemplo, Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378). Por ejemplo, una mutación en la secuencia de PSCA puede ser indicativa de la presencia o promoción de un tumor. Dichos ensayos tienen por lo tanto valor diagnóstico o predictivo en el que una mutación en PSCA indica una pérdida potencial de función o aumento del crecimiento tumoral.

Se conocen bien en la técnica una amplia diversidad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de secuencias de ácido nucleico o aminoácidos de productos génicos de PSCA se observan por los protocolos de secuenciación de Northern, Southern, Western, PCR y ADN analizados en el presente documento. Además, se conocen bien en la técnica otros métodos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y aminoácidos tales como el análisis se polimorfismo de conformación monocatenaria (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 5.382.510 expedida el 7 de septiembre de 1999 y 5.952.170 expedida el 17 de enero de 1995).

Adicionalmente, se puede examinar el estado de metilación de un gen de PSCA en una muestra biológica. Se produce desmetilación aberrante y/o hiperventilación de islas de CpG en regiones reguladoras 5’ génicas que aparecen frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas, y puede dar como resultado expresión alterada de diversos genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de glutatión S-transferasa de clase pi (una proteína expresada en próstata normal pero no expresada en > 90 % de carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica más frecuentemente detectada en carcinomas de próstata (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70 % de casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN) (Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7: 531-536). En otro ejemplo, se induce expresión del gen específico de tumor de LAGE-I (que no se expresa en próstata normal pero se expresa en el 25-50 % de cánceres de próstata) por desoxi-azacitidina en células linfoblastoides, lo que sugiere que la expresión tumoral se debe a la desmetilación (Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). Se conocen bien en la técnica diversos ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, se puede utilizar, en enfoques de hibridación de Southern, enzimas de restricción sensibles a metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios de CpG metilados para evaluar el estado de metilación de islas de CpG. Además la MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios de CpG presentes en una isla de CpG de un gen dado. Este procedimiento implica modificación inicial de ADN por bisulfito sódico (que convertirá todas las citosinas no metiladas a uracilo) seguido de amplificación usando cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. También pueden encontrarse protocolos que implican interferencia de metilación por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995.

La amplificación génica es un método adicional para evaluar el estado de PSCA. La amplificación génica se mide en una muestra directamente, por ejemplo, por transferencia de Southern o transferencia de Northern convencionales para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201 5205), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Como alternativa, se emplean anticuerpos que reconocen dobles cadenas específicas, incluyendo dobles cadenas de ADN, dobles cadenas de ARN, y dobles cadenas híbridas de ADN ARN o dobles cadenas de proteína y ADN. Los anticuerpos a su vez se marcan y se lleva a cabo el ensayo en el que la doble cadena se une a una superficie, de modo que tras la formación de la doble cadena a la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido a la doble cadena.

Puede ensayarse convenientemente tejido de biopsia o sangre periférica con respecto a la presencia de células cancerosas usando por ejemplo, análisis de Northern, transferencia puntual o RT-PCR para detectar la expresión de PSCA. La presencia de ARNm de PSCA amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Se conocen bien en la técnica ensayos de RT-PCR. Se están evaluando en la actualidad ensayos de detección de RT-PCR para células tumorales en sangre periférica para su uso en el diagnóstico y tratamiento de varios tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos de RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995,

J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688).

Se desvela en el presente documento una evaluación de la susceptibilidad que un individuo tiene para desarrollar cáncer. Un método para predecir la susceptibilidad al cáncer puede comprender detectar ARNm de PSCA o proteína PSCA en una muestra tisular, indicando su presencia susceptibilidad al cáncer, en el que el grado de expresión de ARNm de PSCA se correlaciona con el grado de susceptiblidad. En un método, se examina la presencia de PSCA en próstata u otro tejido, proporcionando la presencia de PSCA en la muestra una indicación de la susceptibilidad al cáncer de próstata (o la aparición o existencia de un tumor prostático). De forma similar, se puede evaluar la integridad de secuencias de aminoácidos y nucleótidos de PSCA en una muestra biológica, para identificar perturbaciones de la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones en productos génicos de PSCA en la muestra es una indicación de la

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susceptibilidad al cáncer (o la aparición o existencia de un tumor).

También se desvelan en el presente documento métodos para calibrar la agresividad tumoral. Un método para calibrar la agresividad de un tumor puede comprender determinar el nivel de ARNm de PSCA o proteína PSCA expresados por células tumorales, comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de ARNm de PSCA o proteína PSCA expresado en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en el que el grado de expresión de ARNm de PSCA o proteína PSCA en la muestra tumoral en relación con la muestra normal indica el grado de agresividad. En un método, la agresividad de un tumor se evalúa determinando el grado en el que se expresa PSCA en las células tumorales, indicando mayores niveles de expresión tumores más agresivos. Otro método es la evaluación de la integridad de secuencias de aminoácidos y nucleótidos de PSCA en una muestra biológica, para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más agresivos.

Se desvelan en el presente documento métodos para observar la progresión de un tumor maligno en un individuo a lo largo del tiempo. Los métodos para observar la progresión de un tumor maligno de un individuo a lo largo del tiempo pueden comprender determinar el nivel de ARNm de PSCA o proteína PSCA expresado por células en una muestra del tumor, comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de ARNm de PSCA o proteína PSCA expresado en una muestra tisular equivalente tomada del mismo individuo en un momento diferente, en el que el grado de expresión de ARNm de PSCA o proteína PSCA en la muestra tumoral a lo largo del tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. En un método, la progresión de un cáncer se evalúa determinando la expresión de PSCA en las células tumorales a lo largo del tiempo, en el que una expresión aumentada a lo largo del tiempo indica una progresión del cáncer. También se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PSCA en una muestra biológica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, en el que la presencia de una o más perturbaciones indica una progresión del cáncer.

Los enfoques de diagnóstico anteriores pueden combinarse con uno cualquiera de una amplia diversidad de protocolos de pronóstico y diagnóstico conocidos en la técnica. También se desvelan en el presente documento métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de PSCA y productos génicos de PSCA (o perturbaciones en el gen de PSCA y productos génicos de PSCA) y un factor que está asociado con la malignidad, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra tisular. Puede utilizarse una amplia diversidad de factores asociados con la malignidad, tales como la expresión de genes asociados con la malignidad (por ejemplo, expresión de PSA, PSCA y PSM para cáncer de próstata, etc.) así como observaciones citológicas generales (véase, por ejemplo, Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2): 74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2): 223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6): 543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8): 91824). Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de PSCA y productos génicos de PSCA (o perturbaciones en el gen de PSCA y productos génicos de PSCA) y otro factor que se asocia con la malignidad son útiles, por ejemplo, porque la presencia de un conjunto de factores específicos que coinciden con la enfermedad proporciona información crucial para diagnosticar o pronosticar el estado de una muestra tisular.

Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de PSCA y productos génicos de PSCA (o perturbaciones en el gen de PSCA y productos génicos de PSCA) y otro factor asociado con la malignidad pueden implicar detectar la sobreexpresión de ARNm o proteína de PSCA en una muestra tisular, detectar la sobreexpresión de ARNm o proteína de PSA en una muestra tisular (o expresión de PSCA o PSM) y observar una coincidencia de la sobreexpresión de ARNm o proteína de PSCA y ARNm y proteína de PSA (o expresión de PSCA o PSM). Puede examinarse la expresión de ARNm de PSCA y PSA en tejido de próstata, en el que la coincidencia de la sobreexpresión de ARNm de PSCA y PSA en la muestra indica la existencia de cáncer de próstata, susceptibilidad a cáncer de próstata o en la aparición o estado de un tumor prostático.

Se describen en el presente documento métodos para detectar y cuantificar la expresión de ARNm o proteína de PSCA, y se conocen bien en la técnica tecnologías de detección y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas convencionales. Métodos convencionales para detección y cuantificación de ARNm de PSCA incluyen hibridación in situ usando ribosondas de PSCA marcadas, transferencia de Northern y técnicas relacionadas usando sondas polinucleotídicas de PSCA, análisis de RT-PCR usando cebadores específicos para PSCA y otros métodos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realización específica, se usa RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de PSCA. Puede usarse cualquier variedad de cebadores capaces de amplificar PSCA para este fin, incluyendo pero sin limitación los diversos conjuntos de cebadores específicamente descritos en el presente documento. Pueden usarse anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína PSCA de tipo silvestre en un ensayo inmunohistoquímico de tejido de biopsia.

IX.) Identificación de Moléculas Que Interaccionan Con PSCA

Las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos de PSCA desveladas en el presente documento permiten a un experto en la materia identificar proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interaccionan con PSCA, así

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conoce bien en la técnica y se ha empleado en cáncer de próstata usando PSMA humano e inmunógenos de PAP de roedor (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117).

Dichos métodos pueden practicarse fácilmente empleando una proteína relacionada con PSCA o una molécula de ácido nucleico que codifica PSCA y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno de PSCA (que normalmente comprende varios epítopos de linfocitos T o anticuerpo). Los expertos en la materia entienden que se conocen en la técnica una amplia diversidad de sistemas de vacuna para suministro de epítopos inmunorreactivos (véase, por ejemplo, Heryln et al., Ann Med feb 1999 31(1): 66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother jun 2000 49(3): 123-32). Brevemente, dichos métodos para generar una respuesta inmunitaria (por ejemplo mediada por células y/o humoral) en un mamífero, comprenden las etapas de: exponer el sistema inmunitario del mamífero a un epítopo inmunorreactivo (por ejemplo un epítopo presente en una proteína PSCA mostrado en la Figura 1 o análogo u homólogo del mismo) de modo que el mamífero genere una respuesta inmunitaria que es específica para ese epítopo (por ejemplo genera anticuerpos que reconocen específicamente ese epítopo).

La proteína PSCA completa, regiones inmunogénicas o epítopos de la misma pueden combinarse y suministrarse por diversos medios. Dichas composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (por ejemplo, Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95: 341, 1995), composiciones peptídicas encapsuladas en microesferas de poli(DLlactida-co-glicolida) (“PLG”) (véase, por ejemplo, Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28: 287-294, 1991: Alonso et al., Vaccine 12: 299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13: 675-681, 1995), composiciones peptídicas contenidas en complejos inmunoestimulantes (ISCOM) (véase, por ejemplo, Takahashi et al., Nature 344: 873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113: 235-243, 1998), sistemas de múltiples péptidos antigénicos (MAP) (véase por ejemplo Tam,

J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5409-5413, 1988; Tam, J. P., J. Immunol. Methods 196: 17-32, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para su uso en sistemas de suministro balísticos, normalmente péptidos cristalizados, vectores de suministro viral (Perkus, M. E. et al., En: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320: 535, 1986; Hu, S. L. et al., Nature 320: 537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4: 790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect. Dis. 124: 148, 1971; Chanda, P. K. et al., Virology 175: 535, 1990), partículas de origen viral o sintético (por ejemplo, Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192: 25, 1996; Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30: 16, 1993; Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7: 649, 1995), adyuvantes (Warren, H. S., Vogel, F. R., y Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4: 369, 1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11: 293, 1993), liposomas (Reddy, R. et al., J. Immunol. 148: 1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today 17: 131, 1996), o ADNc desnudo o absorbido en una partícula (Ulmer, J. B. et al., Science 259: 1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L. A., y Webster, R. G., Vaccine 11: 957, 1993; Shiver, J. W. et al., En: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12: 923, 1994 y Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30: 16, 1993). También pueden usarse tecnologías de suministro dirigidas a toxina, también conocidas como dirección mediada por receptor, tales como las de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts).

En pacientes con cáncer asociado con PSCA, las composiciones de vacuna también pueden usarse junto con otros tratamientos usados para cáncer, por ejemplo, cirugía, quimioterapia, terapias farmacológicas, radioterapias, etc. incluyendo uso en combinación con adyuvantes inmunitarios tales como IL-2, IL-12, GM-CSF, y similares.

Vacunas celulares:

Los epítopos de CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de la proteína PSCA que se unen con alelos de HLA correspondientes (véase por ejemplo, Tabla IV; Epimer™ y Epimatrix™, Universidad Brown (URL brown.edu/Re-search/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); y, BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI en URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/). Un inmunógeno de PSCA puede contener una o más secuencias de aminoácidos identificadas usando técnicas bien conocidas en este campo, tales como las secuencias mostradas en las Tablas V-XVIII y XXII-LI o un péptido de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos especificados por un motivo/supermotivo de HLA de Clase I (por ejemplo, Tabla IV (A), Tabla IV (D), o Tabla IV (E)) y/o un péptido de al menos 9 aminoácidos que comprende un motivo/supermotivo de HLA de Clase II (por ejemplo, Tabla IV (B) o Tabla IV (C)). Como se aprecia en la técnica, el surco de unión de HLA de Clase I está esencialmente cerrado de modo que solamente péptidos de un intervalo de tamaños particular puedan caber en el surco y unirse, generalmente los epítopos de HLA de Clase I son de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos de longitud. Por el contrario, el surco de unión de HLA de Clase II está esencialmente abierto; por lo tanto puede unirse un péptido de aproximadamente 9

o más aminoácidos con una molécula de HLA de Clase II. Debido a las diferencias del surco de unión entre HLA de Clase I y II, los motivos de HLA de Clase I son específicos de longitud, es decir, la posición dos de un motivo de Clase I es el segundo aminoácido en una dirección amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de aminoácidos en un motivo de Clase II son solamente relativas entre sí, no al péptido general, es decir, pueden unirse aminoácidos adicionales con los extremos amino y/o carboxilo terminales de una secuencia portadora de motivos. Los epítopos de HLA de Clase II son con frecuencia de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud, o de más de 25 aminoácidos.

Se conocen en la técnica una amplia diversidad de métodos para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero (por ejemplo como la primera etapa en la generación de hibridomas). Los métodos para generar una respuesta

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Vacunas ex vivo

Pueden emplearse también diversas estrategias ex vivo para generar una respuesta inmunitaria. Un enfoque implica el uso de células presentadoras de antígenos (APC) tales como células dendríticas (DC) para presentar el antígeno PSCA al sistema inmunitario de un paciente. Las células dendríticas expresan moléculas del MHC de clase I y II, coestimulador de B7 e IL-12, y son por lo tanto células presentadoras de antígenos altamente especializadas. En cáncer de próstata, se están usando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) en un ensayo clínico de Fase I para estimular los sistemas inmunitarios de los pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Por lo tanto, pueden usarse células dendríticas para presentar péptidos de PSCA a linfocitos T en el contexto de moléculas del MHC de clase I o II. En un método, se pulsan células dendríticas autólogas con péptidos de PSCA capaces de unirse con moléculas del MHC de clase I y/o clase II. En otro método, se pulsan células dendríticas con la proteína PSCA completa. Otra estrategia más implica la modificación técnica de la sobreexpresión de un gen de PSCA en células dendríticas usando diversos vectores de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56:3763-3770), lentivirus, virus adenoasociado, transfección de ADN (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 28652869), o transfección de ARN derivado de tumor (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182). También pueden modificarse técnicamente células que expresan PSCA para expresar moduladores inmunitarios, tales como GM-CSF, y usarse como agentes de inmunización.

X.B.) PSCA como una Diana para Terapia basada en Anticuerpos

PSCA es una diana atractiva para estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Se conocen en la técnica varias estrategias de anticuerpos para dirigir moléculas tanto extracelulares como intracelulares (véase, por ejemplo, destrucción mediada por complemento y ADCC así como el uso de intracuerpos). Debido a que PSCA se expresa por células cancerosas de diversos linajes en relación con células normales correspondientes, se prepara la administración sistémica de composiciones inmunorreactivas a PSCA que muestran excelente sensibilidad sin efectos tóxicos, no específicos y/o no de diana uniendo la composición inmunorreactiva con órganos y tejidos no diana. Los anticuerpos específicamente reactivos con dominios de PCA son útiles para tratar cánceres que expresan PSCA de forma sistémica, bien como conjugados con una toxina o agente terapéutico o bien como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o función celular.

Pueden introducirse anticuerpos de PSCA en un paciente de modo que el anticuerpo se una con PSCA y module una función, tal como una interacción con un compañero de unión, y en consecuencia medie en la destrucción de las células tumorales y/o inhiba el crecimiento de las células tumorales. Los mecanismos por los que dichos anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir citolisis mediada por complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, modulación de la función fisiológica de PSCA, inhibición de la unión de ligando o rutas de transducción de señales, modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de perfiles de factores de angiogénesis tumoral y/o apoptosis. Los ejemplos incluyen Rituxan® para Linfoma No de Hodgkin, Herceptin® para cáncer de mama metastásico y Erbitux® para cáncer colorrectal.

Los expertos en la materia entienden que los anticuerpos pueden usarse para dirigirse específicamente a y unirse con moléculas inmunogénicas tales como una región inmunogénica de una secuencia de PSCA mostrada en la Figura 1. Además, los expertos en la materia entienden que es rutinario conjugar anticuerpos con agentes citotóxicos (véase, por ejemplo, Slevers et al. Blood 93: 11 3678-3684 (1 de junio de 1999)). Cuando se suministran agentes citotóxicos y/o terapéuticos directamente a células, tal como conjugándolos con anticuerpos específicos para una molécula expresada por esa célula (por ejemplo, PSCA), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (es decir citotoxicidad) en esas células.

Se conocen en la técnica una amplia diversidad de composiciones y métodos para usar conjugados de anticuerpoagente citotóxico para destruir células. En el contexto de cánceres, los métodos típicos implican administrar a un animal que tenga un tumor una cantidad biológicamente eficaz de un conjugado que comprende un agente citotóxico y/o terapéutico seleccionado unido a un agente de dirección (por ejemplo un anticuerpo anti PSCA) que se une con un marcador (por ejemplo PSCA) expresado, accesible a la unión o localizado en las superficies celulares. Una realización típica es un método para suministrar un agente citotóxico y/o terapéutico a una célula que expresa PSCA, que comprende conjugar el agente citotóxico con un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente con un epítopo de PSCA y exponer la célula al conjugado de anticuerpo-agente. Otra realización ilustrativa es un método para tratar a un individuo que se sospecha que padece cáncer metastatizado, que comprende una etapa de administrar por vía parenteral a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico y/o terapéutico.

Pueden realizarse inmunoterapia de cáncer usando anticuerpos anti PSCA de acuerdo con diversos enfoques que se han empleado con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, incluyendo pero sin limitación cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18: 133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771-2776), linfoma de linfocitos B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101), leucemia

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carboplatino, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, interferón alfa, leuprolide, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromán, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, clorambucilo, taxol y combinaciones de los mismos.

La fuente de radiación, usada en combinación con un anticuerpo de PSCA, puede ser externa o interna al paciente que se trata. Cuando la fuente es externa al paciente, la terapia se conoce como terapia de radiación de haz externo (EBRT). Cuando la fuente de radiación es interna al paciente, el tratamiento se denomina braquiterapia (BT).

La radiación se administra de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas usando equipamiento convencional fabricado para este fin, tal como AECL Theratron y Varian Clinac. La dosis de radiación depende de numerosos factores como se conoce bien en la técnica. Dichos factores incluyen el órgano que se trata, los órganos sanos en la ruta de la radiación que podrían verse afectados inadvertidamente de forma adversa, la tolerancia del paciente para radioterapia y el área del cuerpo que necesite tratamiento. La dosis será normalmente de entre 1 y 100 Gy y más particularmente entre 2 y 80 Gy. Algunas dosis que se han indicado incluyen 35 Gy para la médula espinal, 15 Gy para los riñones, 20 Gy para el hígado y 65-80 Gy para la próstata. Debería enfatizarse, sin embargo, que la invención no se limita a ninguna dosis particular. La dosis se determinará por el médico tratante de acuerdo con los factores particulares en una situación dada, incluyendo los factores mencionados anteriormente.

La distancia entre la fuente de la radiación externa y el punto de entrada en el paciente puede ser cualquier distancia que representa un equilibrio aceptable entre destrucción de células diana y minimización de efectos secundarios. Normalmente, la fuente de radiación externa está entre 70 y 100 cm del punto de entrada en el paciente.

La braquiterapia se lleva a cabo en general colocando la fuente de radiación en el paciente. Normalmente, la fuente de radiación se coloca a aproximadamente 0-3 cm del tejido que se trate. Las técnicas conocidas incluyen braquiterapia intersticial, intercavitaria y de superficie. Las semillas radiactivas pueden implantarse de forma permanente o temporal. Algunos átomos radiactivos típicos que se han usado en implantes permanentes incluyen yodo 125 y radón. Algunos átomos radiactivos típicos que se han usado en implantes temporales incluyen radio, cesio 137 e iridio 192. Algunos átomos radioactivos adicionales que se han usado en braquiterapia incluyen americio 241 y oro 198. La dosis de radiación para braquiterapia puede ser la misma que se ha mencionado anteriormente para terapia de radiación de haz externo. Además de los factores mencionados anteriormente para determinar la dosis de radioterapia de haz externo, la naturaleza el átomo radiactivo usado también se tiene en cuenta para determinar la dosis de braquiterapia.

X.C.) PSCA como una Diana para Respuestas Inmunitarias Celulares

Se desvelan además en el presente documento vacunas y métodos para preparar vacunas que contienen una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o más péptidos de unión a HLA como se describe en el presente documento. Además, las vacunas de acuerdo con las divulgaciones del presente documento abarcan composiciones de uno o más de los péptidos desvelados. Un péptido puede estar presente en una vacuna individualmente. Como alternativa, el péptido puede existir como un homopolímero que comprende múltiples copias del mismo péptido, o como un heteropolímero de diversos péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de relación inmunológica aumentada y, cuando se usen diferentes epítopos peptídicos para componer el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionen con diferentes determinantes antigénicos del organismo patógeno o péptido relacionado con tumor al que se dirige una respuesta inmunitaria. La composición puede ser una región de origen natural de un antígeno o puede prepararse, por ejemplo, de forma recombinante o por síntesis química.

Se conocen bien en la técnica vehículos que pueden usarse con vacunas desveladas en el presente documento, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoide del tétanos, poliaminoácidos tales como poli L-lisina, poli L-ácido glutámico, gripe, proteína del núcleo del virus de hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) tal como agua,

o solución salina, preferentemente solución salina tamponada con fosfato. Las vacunas también incluyen normalmente un adyuvante. Adyuvantes tales como adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre son ejemplos de materiales bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, como se desvela en el presente documento, las respuestas de CTL pueden iniciarse conjugando péptidos de la invención con lípidos tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilseril-serina (P3CSS). Además, se ha descubierto que un adyuvante tal como oligonucleótidos que contienen citosina-guanina fosforotiolada (CpG) sintéticos aumentan las respuestas de CTL de 10 a 100 veces (véase, por ejemplo, Davila y Celis, J. Immunol. 165: 539-547 (2000)).

Tras la inmunización con una composición peptídica, mediante las vías de inyección, aerosol, oral, transdérmica, transmucosa, intrapleural, intratecal u otras adecuadas, el sistema inmunitario del hospedador responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL y/o HTL específicas para el antígeno deseado. En consecuencia, el hospedador se hace al menos parcialmente inmune al desarrollo posterior de células que expresan o sobreexpresan antígeno PSCA, o deriva al menos algún beneficio terapéutico cuando el antígeno estaba asociado a tumor.

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X.C.1. Vacunas de Minigenes

Están disponibles varios enfoques diferentes que permiten el suministro simultáneo de múltiples epítopos. Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos desvelados en el presente documento son una realización particularmente útil de la invención. Los epítopos para inclusión en un minigén se seleccionan preferentemente de acuerdo con las directrices expuestas en la sección previa. Un medio preferido para administrar ácidos nucleicos que codifican los péptidos desvelados usa construcciones de minigenes que codifican un péptido que comprende uno o múltiples epítopos de la invención.

El uso de minigenes multiepitópicos se describe posteriormente y en Ishioka et al., J. Immunol. 162: 3915-3925, 1999; An, L. y Whitton, J. L., J. Virol. 71: 2292, 1997; Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157: 822, 1996; Whitton, J.

L. et al., J. Virol. 67: 348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16: 426, 1998. Por ejemplo, puede obtenerse por ingeniería genética un plásmido de ADN multiepitópico que codifica PSCA derivado de epítopos portadores de motivo y/o supermotivo, el epítopo de linfocitos T auxiliares universal PADRE™ o múltiples epítopos de HTL de PSCA (véase por ejemplo, Tablas V-XVIII y XXII a LI) y una secuencia señal de translocación al retículo endoplásmico. Una vacuna también puede comprender epítopos que derivan de otros TAA.

La inmunogenicidad de un minigén multiepitópico puede confirmarse en ratones transgénicos para evaluar la magnitud de respuestas de inducción de CTL contra los epítopos ensayados. Además, la inmunogenicidad de epítopos codificados por ADN in vivo puede correlacionarse con las respuestas in vitro de líneas de CTL específicas contra células diana transfectadas con el plásmido de ADN. Por lo tanto, estos experimentos pueden mostrar que el minigén sirve tanto para: 1.) generar una respuesta de CTL como para 2.) que los CTL inducidos reconozcan células que expresen los epítopos codificados.

Por ejemplo, para crear una secuencia de ADN que codifique los epítopos seleccionados (minigén) para expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopos pueden traducirse de forma inversa. Puede usarse una tabla de uso codónico humano para guiar la elección de codones para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican epítopos pueden unirse directamente, de modo que cuando se traduzcan, se cree una secuencia polipeptídica continua. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, pueden incorporarse elementos adicionales en el diseño del minigén. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden traducirse de forma inversa e incluirse en la secuencia del minigén incluyen: epítopos de HLA de clase I, epítopos de HLA de clase II, epítopos de anticuerpos, una secuencia señal de ubiquitinación, y/o una señal de dirección de retículo endoplásmico. Además, puede mejorarse la presentación de HLA de epítopos de CTL y HTL incluyendo secuencias flanqueantes sintéticas (por ejemplo de poli alanina) o de origen natural adyacentes a los epítopos de CTL o HTL; estos péptidos mayores que comprenden el epítopo o los epítopos están dentro del alcance de la invención.

La secuencia del minigén puede convertirse a ADN ensamblando oligonucleótidos que codifiquen las cadenas más y menos del minigén. Los oligonucleótidos solapantes (30-100 bases de longitud) pueden sintetizarse, fosforilarse, purificarse e hibridarse en condiciones apropiadas usando técnicas bien conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos pueden unirse, por ejemplo, usando ADN ligasa T4. Este minigén sintético, que codifica el polipéptido epitópico, puede después clonarse en un vector de expresión deseado.

Se incluyen preferentemente secuencias reguladoras convencionales bien conocidas por los expertos en la materia en el vector para asegurar la expresión en las células diana. Son deseables varios elementos de vector: un promotor con un sitio de clonación cadena abajo para inserción del minigén; una señal de poliadenilación para terminación de la transcripción eficaz; un origen de replicación de E. coli; y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo, resistencia a ampicilina o kanamicina). Pueden usarse numerosos promotores para este fin, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus humano (hCMV). Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias promotoras adecuadas.

Pueden desearse modificaciones de vectores adicionales para optimizar la expresión de minigenes e inmunogenicidad. En algunos casos, se requieren intrones para expresión génica eficaz, y podrían incorporarse uno

o más intrones sintéticos o de origen natural en la región transcrita del minigén. La inclusión de secuencias de estabilización del ARNm y secuencias para replicación en células de mamífero también puede tenerse en cuenta para expresión de minigenes creciente.

Una vez que se ha seleccionado un vector de expresión, el minigén se clona en la región polienlazadora cadena abajo del promotor. Este plásmido se transforma en una cepa de E. coli apropiada, y se prepara ADN usando técnicas convencionales. La orientación y secuencia de ADN del minigén, así como los otros elementos incluidos en el vector, se confirman usando mapeo de restricción y análisis de secuencia de ADN. Las células bacterianas que albergan el plásmido correcto pueden almacenarse como un banco de células maestro y un banco de células de trabajo. Además, las secuencias inmunoestimuladoras (ISS o CpG) parecen desempeñar un papel en la inmunogenicidad de vacunas de ADN. Estas secuencias pueden incluirse en el vector, fuera de la secuencia codificante de minigén, si se desea potenciar la inmunogenicidad.

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En algunas realizaciones, puede usarse un vector de expresión bicistrónico que permite la producción tanto de epítopos codificados por minigenes como de una segunda proteína (incluida para potenciar o reducir la inmunogenicidad). Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían potenciar beneficiosamente la respuesta inmunitaria si se coexpresaran incluyen citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas inductoras de citocinas (por ejemplo, LeIF), moléculas coestimuladoras o para respuestas de HTL, proteínas de unión pan DR (PADRE™, Epimmune, San Diego, CA). Los epítopos auxiliares (HTL) pueden unirse con señales de dirección intracelular y expresarse por separado a partir de epítopos de CTL expresados; esto permite la dirección de los epítopos de HTL a un compartimiento celular diferente del de los epítopos de CTL. Si se requiere, esto podría facilitar una entrada más eficaz de epítopos de HTL en la ruta de HTL de clase II, mejorando de este modo la inducción de HTL. A diferencia de la inducción de HTL o CTL, la reducción específica de la respuesta inmunitaria por coexpresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo TGF-) puede ser beneficiosa en ciertas enfermedades.

Pueden producirse cantidades terapéuticas de ADN plasmídico por ejemplo, por fermentación en E. coli, seguido de purificación. Las alícuotas del banco de células de trabajo se usan para inocular medio de cultivo, y cultivar hasta saturación en matraces de agitación o en un biorreactor de acuerdo con técnicas bien conocidas. Puede purificarse ADN plasmídico usando tecnologías de bioseparación convencionales tales como resinas de intercambio aniónico de fase sólida proporcionadas por QIAGEN, S.A. (Valencia, California). Si es necesario, puede aislarse ADN superenrollado de las formas lineal y circular abierta usando electroforesis en gel u otros métodos.

Puede prepararse ADN plasmídico purificado para inyección usando diversas formulaciones. La más sencilla de estas es la reconstitución de ADN liofilizado en una solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Este enfoque, conocido como “ADN desnudo” se usa en la actualidad para administración intramuscular (IM) en ensayos clínicos. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de vacunas de ADN de minigenes, puede ser deseable un método alternativo para formular ADN plasmídico purificado. Se ha descrito diversos métodos, y pueden ponerse a disposición nuevas técnicas. También pueden usarse lípidos catiónicos, glucolípidos y liposomas fusogénicos en la formulación (véase, por ejemplo, como se describe en el documento WO 93/24640 Mannino y Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682 (1988); Patente de Estados Unidos Nº 5.279.833; documento WO 91/06309; y Felgner, et al., Proc. Nat´l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987)). Además, los péptidos y compuestos denominados colectivamente compuestos protectores, interactivos, no condensadores (PINC) también podrían formar complejo con ADN plasmídico purificado para influir en variables tales como la estabilidad, la dispersión intramuscular o tráfico a órganos o tipos celulares específicos.

Puede usarse sensibilización de células diana como un ensayo funcional para la expresión y presentación de HLA de clase I de epítopos de CTL codificados por minigenes. Por ejemplo, el ADN plasmídico se introduce en una línea celular de mamífero que es adecuada como una diana para ensayos de liberación de cromo de CTL convencionales. El método de transfección usado dependerá de la formulación final. La electroporación puede usarse para ADN “desnudo”, mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección directa in vitro. Un plásmido que expresa proteína verde fluorescente (GFP) puede cotransfectarse para permitir el enriquecimiento de células transfectadas usando separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Estas células se marca después con cromo 51 (51Cr) y se usan como células diana para líneas de CTL específicas de epítopo; la citolisis, detectada por liberación de 51Cr indica tanto producción de, como presentación de HLA de epítopos de CTL codificados por minigenes. La expresión de epítopos de HTL puede evaluarse de una manera análoga usando ensayos para evaluar la actividad HTL.

La inmunogenicidad in vivo es un segundo enfoque para ensayos funcionales de formulaciones de ADN de minigén. Los ratones transgénicos que expresan proteínas de HLA humanas apropiadas se inmunizan con el producto de ADN. La dosis y vía de administración son dependientes de la formulación (por ejemplo, IM para ADN en PBS, intraperitoneal (i.p.) para ADN en complejo con lípidos). Veintiún días después de la inmunización, los esplenocitos se recogen y se reestimulan durante una semana en presencia de péptidos que codifican cada epítopo que se ensaya. A continuación para células efectoras de CTL, se realizan ensayos para citolisis de células diana marcadas con 51Cr, cargadas con péptidos usando técnicas convencionales. La lisis de células diana que se sensibilizaron por HLA cargado con epítopos peptídicos, correspondientes a epítopos codificados por minigenes, demuestra la función de vacuna de ADN para inducción in vivo de CTL. La inmunogenicidad de epítopos de HTL se confirma en ratones transgénicos de una manera análoga.

Como alternativa, los ácidos nucleicos puede administrarse usando suministro balístico como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.204.253. Usando esta técnica, se administran partículas comprendidas solamente de ADN. En una realización alternativa adicional, el ADN puede adherirse a partículas, tales como partículas de oro.

Los minigenes también pueden suministrarse usando otros sistemas de suministro bacterianos o virales bien conocidos en la técnica, por ejemplo, una construcción de expresión que codifica epítopos como se desvela en el presente documento puede incorporarse en un vector viral tal como vaccinia.

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X.C.2. Combinaciones de Péptidos de CTL con Péptidos Auxiliares

Pueden modificarse composiciones de vacuna que comprenden péptidos de CTL como se desvela en el presente documento, por ejemplo, hacerse análogas, para proporcionar atributos deseados, tales como semivida en suero mejorada, cobertura de población ampliada o inmunogenicidad potenciada.

Por ejemplo, la capacidad de un péptido para inducir actividad de CTL puede potenciarse uniendo el péptido con una secuencia que contiene al menos un epítopo que es capaz de inducir una respuesta de linfocitos T auxiliares. Aunque un péptido de CTL puede estar unido directamente con un péptido auxiliar T, con frecuencia los conjugados de epítopo de CTL/epítopo de HTL se unen por una molécula espaciadora. El espaciador está comprendido normalmente por moléculas neutras, relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o miméticos de aminoácidos, que están sustancialmente sin carga en condiciones fisiológicas. Los espaciadores se seleccionan normalmente de, por ejemplo, Ala, Gly u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que no es necesario que el espaciador opcionalmente presente esté comprendido por los mismos restos y por lo tanto pueda ser un hetero u homo oligómero. Cuando esté presente, el espaciador será habitualmente de al menos uno o dos restos, más habitualmente de tres a seis restos y en ocasiones de 10 o más restos. El epítopo peptídico de CTL puede unirse con el epítopo peptídico T auxiliar bien directamente o bien mediante un espaciador en el extremo amino o carboxilo terminal del péptido de CTL. El extremo amino terminal del péptido inmunogénico o el péptido auxiliar T puede acilarse.

Los epítopos peptídicos de HTL también pueden modificarse para alterar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, pueden modificarse para incluir aminoácidos D para aumentar su resistencia a proteasas y de este modo extender su semivida en suero, o pueden conjugarse con otras moléculas tales como lípidos, proteínas, carbohidratos y similares para aumentar su actividad biológica. Por ejemplo, un péptido T auxiliar puede conjugarse con una o más cadenas de ácido palmítico en el extremo amino o carboxilo terminal.

X.C.3. Combinaciones de Péptidos de CTL con Agentes de Sensibilización de Linfocitos T

Puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas como se desvela en el presente documento al menos un componente que sensibilice linfocitos B o linfocitos T. Se han identificado lípidos como agentes capaces de sensibilizar CTL in vivo. Por ejemplo, pueden unirse restos de ácidos palmítico con los grupos  y  amino de un resto de lisina y después unirse, por ejemplo, mediante uno o más restos de enlace tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, o similares, con un péptido inmunogénico. El péptido lipidado puede después administrarse directamente en una micela o partícula, incorporarse en un liposoma, o emulsionarse en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund. Una composición inmunogénica particularmente eficaz puede comprender ácido palmítico unido a grupos  y  amino de Lys, que se une mediante enlace, por ejemplo, Ser-Ser, con el extremo amino terminal del péptido inmunogénico.

Como otro ejemplo de sensibilización por lípidos de respuestas de CTL, pueden usarse lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-gliceril-cisteinilseril-serina (P3CSS) para sensibilizar CTL específicos de virus cuando se unen covalentemente con un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres, et al., Nature 342: 561, 1989). Los péptidos pueden acoplarse con P3CSS, por ejemplo y el lipopéptido administrarse a un individuo para sensibilizar específicamente una respuesta inmunitaria al antígeno diana. Además, debido a que la inducción de anticuerpos neutralizadores también puede sensibilizarse con epítopos conjugados con P3CSS, pueden combinarse dos de dichas composiciones para inducir más eficazmente respuestas tanto humorales como mediadas por células.

X.C.4. Composiciones de Vacuna que Comprenden DC Pulsadas con Péptidos de CTL y/o HTL

Un ejemplo de una composición de vacuna de acuerdo con las divulgaciones del presente documento comprende la administración ex vivo de un cóctel de péptidos portadores de epítopos a PBMC, o DC aisladas de las mismas, de la sangre del paciente. Puede usarse un producto farmacéutico para facilitar la recogida de DC, tal como Progenipoietin™ (Pharmacia-Monsanto, San Louis, Missouri) o GM-CSF IL-4. Después de pulsar las DC con péptidos y antes de la reinfusión en pacientes, las DC se lavan para retirar péptidos no unidos. Una vacuna puede comprender DC pulsadas por péptidos que presentan los epítopos peptídicos pulsados en complejo con moléculas de HLA en sus superficies.

Las DC pueden pulsarse ex vivo con un cóctel de péptidos, algunos de los cuales estimulan respuestas de CTL a PSCA. Opcionalmente, un péptido de linfocito T auxiliar (HTL), tal como un péptido de HLA de Clase II natural o artificial poco restringido, puede incluirse para facilitar la respuesta de CTL. Por lo tanto, una vacuna puede usarse para tratar un cáncer que expresa o sobreexpresa PSCA.

X.D.) Inmunoterapia Adoptiva

Se usan péptidos relacionados con PSCA antigénicos para inducir una respuesta de CTL y/o HTL ex vivo también. Las células de CTL o HTL resultantes pueden usarse para tratar tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o no responderán a péptido de vacuna terapéutica o ácido nucleico de acuerdo

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patrón específico de expresión tisular como su sobreexpresión en ciertos cánceres como se describe por ejemplo en el Ejemplo titulado “Análisis de expresión de PSCA en tejidos normales, y muestras de ensayo de pacientes”).

El PSCA puede hacerse análogo a un antígeno asociado a próstata PSA, el marcador arquetípico que se ha usado por los practicantes médicos durante años para identificar y controlar la presencia de cáncer de próstata (véase, por ejemplo, Merrill et al., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik et al., J. Urol. Aug; 162(2): 293-306 (1999) y Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640(1999)). También se usa otros diversos marcadores de diagnóstico en contextos similares incluyendo p53 y K-ras (véase, por ejemplo, Tulchinsky et al., Int J Mol Med Jul 1999 4(1): 99102 y Minimoto et al., Cancer Detect Prev 2000; 24(1): 1-12). Por lo tanto, la presente divulgación de polinucleótidos y polipéptidos de PSCA (así como sondas polinucleotídicas de PSCA y anticuerpos anti PSCA usados para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades permite a los expertos en la materia utilizar estas moléculas en métodos que son análogos a los usados, por ejemplo, en diversos ensayos de diagnóstico dirigidos a examinar las condiciones asociadas con el cáncer.

Son ejemplos típicos de métodos de diagnóstico que utilizan los polinucleótidos de PSCA, polipéptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos los análogos a los métodos de ensayos de diagnóstico bien establecidos que emplean, por ejemplo, polinucleótidos de PSA, polipéptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos. Por ejemplo, al igual que los polinucleótidos de PSA se usan como sondas (por ejemplo en análisis de Northern, véase, por ejemplo, Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3): 567-74(1994)) y cebadores (por ejemplo en análisis de PCR, véase, por ejemplo, Okegawa et al., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de ARNm de PSA en métodos de control de la sobreexpresión de PSA o la metástasis de cánceres de próstata, los polinucleótidos de PSCA descritos en el presente documento pueden utilizarse de la misma manera para detectar la sobreexpresión de PSCA o la metástasis de próstata y otros cánceres que expresan este gen. Como alternativa, al igual que los polipéptidos de PSA se usan para generar anticuerpos específicos para PSA que pueden usarse después para observar la presencia y/o el nivel de proteínas PSA en métodos para controlar la sobreexpresión de proteína PSA (véase, por ejemplo, Stephan et al., Urology 55(4): 560-3 (2000)) o la metástasis de células prostáticas (véase, por ejemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-7 (1996)), los polipéptidos de PSCA descritos en el presente documento pueden utilizarse para generar anticuerpos para su uso en la detección de sobreexpresión de PSCA o la metástasis de células de próstata y células de otros cánceres que expresan este gen.

Específicamente, debido a que las metástasis implican el movimiento de células cancerosas de un órgano de origen (tal como el pulmón o la glándula prostática, etc.) a un área diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfático), pueden usarse ensayos que examinan una muestra biológica con respecto a la presencia de células que expresan polinucleótidos y/o polipéptidos de PSCA para proporcionar pruebas de metástasis. Por ejemplo, cuando se descubre que una muestra biológica de tejido que no contiene normalmente células que expresan PSCA (ganglios linfáticos) contiene células que expresan PSCA tal como la expresión de PSCA vista en LAPC4 y LAPC9, xenoinjertos aislados de metástasis de ganglios linfáticos y hueso, respectivamente, este hallazgo es indicativo de metástasis.

Como alternativa pueden usarse polinucleótidos y/o polipéptidos de PSCA para proporcionar pruebas de cáncer, por ejemplo, cuando se descubre que las células en una muestra biológica que no expresan normalmente PSCA o expresan PSCA a un nivel diferente expresan PSCA o tienen una expresión aumentada de PSCA (véase, por ejemplo, la expresión de PSCA en los cánceres enumerados en la Tabla I y en muestras de pacientes etc. mostradas en las Figuras adjuntas). En dichos ensayos, los expertos en la materia pueden desear además generar pruebas complementarias de metástasis ensayando la muestra biológica con respecto a la presencia de un segundo marcador restringido a tejido (además de PSCA) tales como PSA, PSCA etc. (véase, por ejemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).

El uso de inmunohistoquímica para identificar la presencia de un polipéptido de PSCA dentro de una sección tisular puede indicar un estado alterado de ciertas células dentro de ese tejido. Se entiende bien en la técnica que la capacidad de un anticuerpo para localizarse en un polipéptido que se expresa en células cancerosas es un modo de diagnosticar la presencia de enfermedad, estadio de enfermedad, progresión y/o agresividad del tumor. Dicho anticuerpo también puede detectar una distribución alterada del polipéptido dentro de las células cancerosas, en comparación con tejido no maligno correspondiente.

El polipéptido de PSCA y composiciones inmunogénicas también son útiles a la vista de los fenómenos de la localización de proteína subcelular alterada en patologías. La alteración de células del estado normal al enfermo provoca cambios en la morfología celular y se asocia con frecuencia con cambios en la localización/distribución de proteínas subcelulares. Por ejemplo, las proteínas de membrana celular que se expresan de una manera polarizada en células normales pueden alterarse en enfermedad, dando como resultado la distribución de la proteína de una manera no polar sobre la superficie celular completa.

El fenómeno de la localización de proteína subcelular alterada en una patología se ha demostrado con expresión de proteínas MUC1 y Her2 mediante el uso de medios inmunohistoquímicos. Las células epiteliales normales tienen una distribución apical típica de MUC1, además de alguna localización supranuclear de la glucoproteína, mientras que las lesiones malignas demuestran con frecuencia un patrón de tinción apolar (Diaz et al, The Breast Journal, 7;

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40-45 (2001); Zhang et al, Clinical Cancer Research, 4; 2669-2676 (1998): Cao, et al, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45: 1547-1557 (1997)). Además, el epitelio de mama normal es negativo para la proteína Her2 o muestra solamente una distribución basolateral mientras que las células malignas pueden expresar la proteína sobre la superficie celular completa (De Potter, et al, International Journal of Cancer, 44; 969-974 (1989): McCormick, et al, 117; 935-943 (2002)). Como alternativa, la distribución de la proteína puede alterarse desde una localización solo en superficie para incluir la expresión citoplasmática difusa en la patología. Dicho ejemplo puede verse con MUC1 (Diaz, et al, The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)).

La alteración en la localización/distribución de una proteína en la célula, como se detecta por métodos inmunohistoquímicos, también puede proporcionar información valiosa con respecto a la favorabilidad de ciertas modalidades de tratamiento. Este último punto se ilustra por una situación en la que una proteína puede ser intracelular en tejido normal, pero de superficie celular en células malignas; la localización de superficie celular hace a las células favorablemente susceptibles a regímenes de diagnóstico y tratamiento basados en anticuerpos. Cuando dicha alteración de la localización proteica aparece para PSCA, la proteína PSCA y respuestas inmunitarias relacionadas con la misma son muy útiles. En consecuencia, la capacidad de determinar si la alteración de la localización de proteína subcelular se ha producido para 24P4C12 hace a la proteína PSCA y respuestas inmunitarias relacionadas con la misma muy útiles. El uso de las composiciones de PSCA permite que los expertos en la materia tomen decisiones de diagnóstico y terapéuticas importantes.

Los reactivos inmunohistoquímicos específicos para PSCA también son útiles para detectar metástasis de tumores que expresan PSCA cuando el polipéptido aparece en tejidos en los que normalmente no se produce PSCA.

Por lo tanto, los polipéptidos de PSCA y anticuerpos resultantes de respuestas inmunitarias a los mismos son útiles en diversos contextos importantes tales como fines de diagnóstico, pronóstico, preventivo y/o terapéutico conocidos por los expertos en la materia.

Igual que los fragmentos de polinucleótidos y variantes de polinucleótidos de PSA se emplean por los expertos en la materia para su uso en métodos para controlar PSA, se usan fragmentos de polinucleótidos y variantes de polinucleótidos de PSCA de una manera análoga. En particular, los polinucleótidos de PSA típicos usados en métodos para controlar PSA son sondas o cebadores que consisten en fragmentos de la secuencia de ADNc de PSA. Ilustrando esto, los cebadores usados para amplificar por PCR un polinucleótido de PSA deben incluir menos de la secuencia de PSA completa para actuar en la reacción de cadena de la polimerasa. En el contexto de dichas reacciones de PCR, los expertos en la materia crean en general diversos fragmentos polinucleotídicos diferentes que pueden usarse como cebadores para amplificar partes diferentes de un polinucleótido de interés o para optimizar reacciones de amplificación (véase, por ejemplo, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98: 121-154 (1998)). Una ilustración adicional del uso de dichos fragmentos se proporciona en el Ejemplo titulado “Análisis de expresión de PSCA en tejidos normales y muestras de ensayo de pacientes”, en el que se usa un fragmento de polinucleótido de PSCA como una sonda para mostrar la expresión de ARN de PSCA en células cancerosas. Además, se usan normalmente secuencias polinucleotídicas variantes como cebadores y sondas para los ARNm correspondientes en análisis de PCR y Northern (véase, por ejemplo, Sawai et al., Fetal Diagn. Ther. Nov-Dic 1996 11(6): 407-13 y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 2, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995)). Los fragmentos y variantes de polinucleótidos son útiles en este contexto cuando son capaces de unirse con una secuencia polinucleotídica diana (por ejemplo, un polinucleótido de PSCA mostrado en la Figura 1 o variante del mismo) en condiciones de alta rigurosidad.

Además, los polipéptidos de PSA que contienen un epítopo que puede reconocerse por un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente con ese epítopo se usan en métodos para controlar PSA. También pueden usarse fragmentos de polipéptidos y análogos o variantes de polipéptidos de PSCA de una manera análoga. Esta práctica de uso de los fragmentos de polipéptidos o variantes de polipéptidos para generar anticuerpos (tales como anticuerpos o linfocitos T anti PSA) es típica en la técnica con una amplia diversidad de sistemas tales como proteínas de fusión que se usan por los practicantes (véase, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995). En este contexto, cada epítopo o epítopos actúan para proporcionar la arquitectura con la que es reactivo un anticuerpo o linfocito T. Normalmente, los expertos en la materia crean diversos fragmentos polipeptídicos diferentes que pueden usarse para generar respuestas inmunitarias específicas para diferentes partes de un polipéptido de interés (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.840.501 y Patente de Estados Unidos Nº 5.939.533). Por ejemplo puede ser preferible utilizar un polipéptido que comprende uno de los motivos biológicos de PSCA analizados en el presente documento o una subsecuencia portadora de motivos que se identifica fácilmente por un experto en la materia basándose en motivos disponibles en la técnica. Los fragmentos, variantes o análogos de polipéptidos son normalmente útiles en este contexto siempre que comprendan un epítopo capaz de generar un anticuerpo o linfocito T específico para una secuencia polipeptídica diana (por ejemplo un polipéptido de PSCA mostrado en la Figura 1).

Como se muestra en el presente documento, los polinucleótidos y polipéptidos de PSCA (así como las sondas polinucleotídicas de PSCA y anticuerpos o linfocitos T anti PSCA usados para identificar la presencia de estas moléculas) muestran propiedades específicas que los hacen útiles en el diagnóstico de cánceres tales como los enumerados en la Tabla I. Se usan ensayos de diagnóstico que miden la presencia de productos génicos de PSCA,

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WO98/16628 y la Patente de Estados Unidos 6.107.540 describen diversos modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata humano capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de metástasis osteoblásticas características de enfermedad de estadio tardío. La eficacia puede predecirse usando ensayos que miden la inhibición de la formación de tumores, regresión de tumores o metástasis, y similares.

Los ensayos in vivo que evalúan la promoción de la apoptosis son útiles en la evaluación de las composiciones terapéuticas. En un ejemplo, pueden examinarse xenoinjertos de ratones que portan tumores tratados con la composición terapéutica con respecto a la presencia de focos apoptóticos y compararse con ratones que portan xenoinjertos de control no tratados. El grado en que se encuentran focos apoptóticos en los tumores de los ratones tratados proporciona un indicio de eficacia terapéutica de la composición.

Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los métodos anteriores pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el método de suministro deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier material que cuando se combine con la composición terapéutica conserve la función antitumoral de la composición terapéutica y es en general no reactivo con el sistema inmunitario del paciente. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, cualquiera de varios vehículos farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato estériles, agua bacteriostática y similares (véase, en general, Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, A. Osal., Ed., 1980).

Pueden solubilizarse formulaciones terapéuticas y administrarse mediante cualquier vía capaz de suministrar la composición terapéutica al sitio tumoral. Las vías de administración potencialmente eficaces incluyen, pero sin limitación, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica y similares. Una formulación preferida para inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática conservada, agua no conservada estéril y/o diluida en bolsas de polivinilcloruro o polietileno que contienen Cloruro Sódico para inyección estéril 0,9 %, USP. Las preparaciones de proteínas terapéuticas pueden liofilizarse y almacenarse como polvos estériles, preferentemente al vacío, y después reconstituirse en agua bacteriostática (que contiene, por ejemplo, conservante de alcohol bencílico) o en agua estéril antes de inyección.

Las dosificaciones y protocolos de administración para el tratamiento de cánceres usando los métodos anteriores variarán según el método y el cáncer diana, y dependerán en general de varios otros factores apreciados en la técnica.

XIII.) Identificación, Caracterización y Uso de Moduladores de PSCA

Métodos para identificar y usar moduladores

Puede realizarse exploración para identificar moduladores que inducen o suprimen un perfil de expresión particular, suprimen o inducen rutas específicas, generando preferentemente el fenotipo asociado con los mismos. En otro ejemplo, habiendo identificado genes expresados diferencialmente importantes en un estado particular; se realizan exploraciones para identificar moduladores que alteren la expresión de genes individuales, bien aumentando o bien reduciendo. Puede realizarse exploración para identificar moduladores que alteren una función biológica del producto de expresión de un gen expresado diferencialmente. De nuevo, habiendo identificado la importancia de un gen en un estado particular, se realizan exploraciones para identificar agentes que se unan con y/o modulen la actividad biológica del producto génico.

Además, se realizan exploraciones para genes que se inducen en respuesta a un agente candidato. Después de identificar un modulador (uno que suprime un patrón de expresión de cáncer que conduce a patrón de expresión normal, o un modulador de un gen de cáncer que conduce a expresión del gen como en el tejido normal) se realiza una exploración para identificar genes que se modulan específicamente en respuesta al agente. La comparación de perfiles de expresión entre tejido normal y tejido canceroso tratado con agente revela genes que no se expresan en tejido normal o tejido canceroso, pero se expresan en tejido tratado con agente y viceversa. Estas secuencias específicas de agente se identifican y se usan por métodos descritos en el presente documento para genes o proteínas de cáncer. En particular estas secuencias y las proteínas que codifican se usan en el marcaje o identificación de células tratadas con agente. Además, se inducen anticuerpos contra proteínas inducidas por agente y se usan para dirigir productos terapéuticos nuevos a la muestra tisular de cáncer tratada.

Ensayos de identificación y exploración relacionados con modulador:

Ensayos relacionados con la expresión génica

Pueden usarse en ensayos de exploración proteínas, ácidos nucleicos y anticuerpos de la invención y como se desvela de otro modo en el presente documento. Las proteínas, los anticuerpos, los ácidos nucleicos, las proteínas modificadas y las células que contienen estas secuencias asociados a cáncer se usan en ensayos de exploración, tales como evaluar el efecto de candidatos farmacológicos en un “perfil de expresión génica”, perfil de expresión de polipéptidos o alteración de función biológica. En un ejemplo, se usan los perfiles de expresión, preferentemente

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junto con técnicas de exploración de alto rendimiento para permitir el control para genes de perfiles de expresión después del tratamiento con un agente candidato (por ejemplo, Davis, GF, et al, J Biol Screen 7: 69 (2002); Zlokarnik, et al., Science 279: 84-8 (1998); Heid, Genome Res 6: 986-94,1996).

Las proteínas, los anticuerpos, los ácidos nucleicos, las proteínas modificadas de cáncer y células que contienen las proteínas de cáncer nativas o modificadas o genes de cáncer se usan en ensayos de exploración. Es decir, se desvelan en el presente documento métodos para explorar con respecto a composiciones que modulen el fenotipo canceroso o una función fisiológica de una proteína de cáncer de la invención. Esto se realiza en un gen en sí mismo o evaluando el efecto de candidatos farmacológicos en un “perfil de expresión génica” o función biológica. Pueden usarse perfiles de expresión, preferentemente junto con técnicas de exploración de alto rendimiento para permitir el control después del tratamiento con un agente candidato, véase Zlokamik, mencionado anteriormente.

Se ejecuta diversos ensayos dirigidos a los genes y proteínas de la invención. Se procesan ensayos en un nivel de ácido nucleico o proteína individual. Es decir, habiendo identificado un gen particular como regulado positivamente en cáncer, se exploran compuestos de ensayo con respecto a la capacidad de modular la expresión génica o con respecto a unión con la proteína de cáncer como se desvela en el presente documento. La “modulación” en este contexto incluye un aumento o una reducción de la expresión génica. La cantidad preferida de modulación dependerá del cambio original de la expresión génica en tejido normal frente a tejido que experimenta cáncer, con cambios de al menos 10 %, preferentemente 50 %, más preferentemente 100-300 % y en algunas realizaciones 300-1000 % o más. Por lo tanto, si un gen muestra un aumento cuádruple en el tejido canceroso en comparación con tejido normal, se desea con frecuencia una reducción aproximadamente cuádruple; de forma similar, una reducción décuple en tejido canceroso en comparación con tejido normal, se desea con frecuencia un valor diana de un aumento décuple de la expresión por el compuesto de ensayo. También son útiles moduladores que exacerban el tipo de expresión génico visto en cáncer, por ejemplo, como una diana regulada positivamente en análisis adicionales.

La cantidad de expresión génica se controla usando sondas de ácido nucleico y se controla la cuantificación de niveles de expresión génica, o, como alternativa, un producto génico en sí mismo, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos para la proteína del cáncer e inmunoensayos convencionales. La proteómica y técnicas de separación también permiten la cuantificación de la expresión.

Control de la expresión para identificar compuestos que modifican la expresión génica

El control de la expresión génica, es decir, un perfil de expresión, puede controlarse simultáneamente con respecto a varias entidades. Dichos perfiles implicarán normalmente uno o más de los genes de la Figura 1. En este ejemplo, por ejemplo, se unen sondas de ácido nucleico de cáncer con biomicroplacas para detectar y cuantificar secuencias de cáncer en una célula particular. Como alternativa, puede usarse PCR. Por lo tanto, puede usarse una serie, por ejemplo, pocillos de una placa de microtitulación con cebadores repartidos en pocillos deseados. Puede después realizarse una reacción de PCR y analizarse para cada pocillo.

Se realiza control de la expresión para identificar compuestos que modifiquen la expresión de una o más secuencias asociadas a cáncer, por ejemplo, una secuencia polinucleotídica expuesta en la Figura 1. En general, se añade un modulador de ensayo a las células antes de su análisis. Además, también se proporcionan exploraciones para identificar agentes que modulan el cáncer, modulan proteínas del cáncer de la invención, se unen con una proteína de cáncer como se desvela en el presente documento, o interfieren con la unión de una proteína de cáncer y un anticuerpo u otro compañero de unión.

Los métodos de exploración de alto rendimiento pueden implicar proporcionar una biblioteca que contenga un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos candidatos). Dichas “bibliotecas químicas combinatorias” se exploran después en uno o más ensayos para identificar los miembros de la biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que presentan una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden actuar como “compuestos candidatos” convencionales, como compuestos para exploración o como productos terapéuticos.

Pueden explorarse bibliotecas combinatorias de moduladores potenciales con respecto a una capacidad para unirse con un polipéptido de cáncer o para modular la actividad. Convencionalmente, se generan nuevas entidades químicas con propiedades útiles identificando un compuesto químico (denominado un “compuesto candidato”) con alguna actividad o propiedad deseable, por ejemplo, actividad inhibidora, creando variantes del compuesto candidato, y evaluando la propiedad y actividad de esos compuestos variantes. Con frecuencia, se emplean métodos de exploración de alto rendimiento (HTS) para dicho análisis.

Como se ha observado anteriormente, el control de la expresión génica se usa convenientemente para ensayar moduladores candidatos (por ejemplo, proteína, ácido nucleico o molécula pequeña). Después de haberse añadido el agente candidato y permitirse que las células se incuben durante un periodo, la muestra que contiene una secuencia diana para analizar se añade, por ejemplo, a una biomicroplaca.

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ortotópica células que expresan secuencias asociadas con cáncer. Los ratones se separan después en grupos, incluyendo grupos de control y grupos experimentales tratados (por ejemplo tratados con un modulador). Después de un periodo de tiempo adecuado, preferentemente 4-8 semanas, se mide el crecimiento tumoral (por ejemplo, por volumen o por sus dos dimensiones mayores, o peso) y se compara con el control. Se dice que los tumores que tienen una reducción estadísticamente significativa (usando, por ejemplo, ensayo de T de Student) tienen crecimiento inhibido.

Ensayos in vitro para identificar y caracterizar moduladores

Pueden realizarse ensayos para identificar compuestos con actividad moduladora in vitro. Por ejemplo, un polipéptido de cáncer se pone en contacto primero con un modulador potencial y se incuba durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo, de 0,5 a 48 horas. En un ejemplo, los niveles de polipéptidos de cáncer se determinan in vitro midiendo el nivel de proteína o ARNm. El nivel de proteína se mide usando inmunoensayos tales como transferencia de Western, ELISA y similares con un anticuerpo que se une selectivamente con el polipéptido de cáncer o un fragmento del mismo. Para medición de ARNm, se prefiere amplificación, por ejemplo, usando ensayos de PCR, LCR o hibridación, por ejemplo, hibridación de Northern, protección de RNAsa, transferencia puntual. El nivel de proteína o ARNm se detecta usando agentes de detección marcados directa o indirectamente, por ejemplo, ácidos nucleicos marcados con fluorescencia o radiactividad, anticuerpos marcados con radiactividad o enzimáticamente y similares, como se describe en el presente documento.

Como alternativa, puede idearse un sistema de gen indicador usando un promotor de proteína de cáncer unido operativamente con un gen indicador tal como luciferasa, proteína verde fluorescente, CAT, o P-gal. La construcción indicadora se transfecta normalmente a una célula. Después del tratamiento con un modulador potencial, se mide la cantidad de transcripción, traducción, o actividad del gen indicador de acuerdo con técnicas conocidas por los expertos en la materia (Davis GF, mencionado anteriormente; Gonzalez, J. y Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechnol. 1998: 9:624).

Como se ha perfilado anteriormente se realizan exploraciones in vitro en genes y productos génicos individuales. Es decir, habiendo identificado que un gen expresado diferencialmente particular es importante en un estado particular, se realiza exploración de moduladores de la expresión del gen o el producto génico en sí mismo.

Puede realizarse exploración con respecto a moduladores de la expresión de un gen o genes específicos. Normalmente, se evalúa la expresión de solamente uno o algunos genes. Pueden diseñarse exploraciones para encontrar en primer lugar compuestos que se unan con proteínas expresadas diferencialmente. Estos compuestos se evalúan después con respecto a la capacidad para modular la actividad expresada diferencialmente. Además, una vez que se han identificado compuestos candidatos iniciales, pueden explorarse adicionalmente variantes para evaluar mejor las relaciones de actividad estructural.

Ensayos de unión para identificar y caracterizar moduladores

En ensayos de unión de acuerdo con las divulgaciones del presente documento, se usa en general un producto génico purificado o aislado de invención. Por ejemplo, se generan anticuerpos para una proteína de la invención, y se procesan inmunoensayos para determinar la cantidad y/o localización de la proteína. Como alternativa, se usan en los ensayos células que comprenden las proteínas de cáncer.

Por lo tanto, los métodos comprenden combinar una proteína de cáncer como se desvela en el presente documento y un compuesto candidato tal como un ligando, y determinar la unión del compuesto con la proteína de cáncer de la invención. Algunos ejemplos utilizan la proteína de cáncer humano; también pueden desarrollarse y usarse modelos animales de enfermedad humana. Además, también pueden usarse otras proteínas de mamífero análogas como se aprecia por los expertos en la materia. Además, en algunas realizaciones se usan proteínas de cáncer variantes o derivadas.

En general, la proteína de cáncer como se desvela en el presente documento, o el ligando, se une de forma no difundible a un soporte insoluble. El soporte puede, por ejemplo, ser uno que tenga áreas que reciben muestras aisladas (una placa de microtitulación, una matriz, etc.). Los soportes insolubles pueden realizarse de cualquier composición con la que puedan unirse las composiciones, se separa fácilmente del material soluble, y es de otro modo compatible con el método de exploración general. La superficie de dichos soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente.

Los ejemplos de soportes insolubles adecuados incluyen placas de microtitulación, matrices, membranas y perlas. Estos se realizan normalmente de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacárido, nylon, nitrocelulosa, o Teflón™, etc. Las placas de microtitulación y matrices son especialmente convenientes porque pueden llevarse a cabo un gran número de ensayos simultáneamente, usando cantidades pequeñas de reactivos y muestras. El modo particular de unión de la composición con el soporte no es crucial siempre que sea compatible con los reactivos y métodos generales desvelados en el presente documento, mantenga la actividad de la composición y no sea difundible. Los métodos preferidos de unión incluyen el uso de anticuerpos que no bloquean de forma estérica el

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ese sitio, agentes que generalmente no se unen con proteínas modificadas en sitio. Además, dichos candidatos farmacológicos que afectan a la actividad de una proteína de cáncer nativa también se identifican explorando fármacos con respecto a la capacidad para potenciar o reducir la actividad de dichas proteínas.

Pueden usarse controles positivos y controles negativos en los ensayos. Se realizan preferentemente muestras de control y de ensayo al menos por triplicado para obtener resultados estadísticamente significativos. La incubación de todas las muestras se produce durante un tiempo suficiente para permitir la unión del agente con la proteína. Después de incubación, se retira por lavado material unido de forma no específica de las muestras y se determina la cantidad de agente unido, generalmente marcado. Por ejemplo, cuando se emplea un radiomarcador, las muestras pueden contarse en un contador de centelleo para determinar la cantidad de compuesto unido.

Puede incluirse otros diversos reactivos en los ensayos de exploración. Estos incluyen reactivos como sales, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, etc. Que se usan para facilitar la unión proteína-proteína óptima y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. También pueden usarse reactivos que de otro modo mejoran la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc., La mezcla de componentes se añade en un orden que posibilita la unión requerida.

Uso de polinucleótidos para regular negativamente o inhibir una proteína como se desvela en el presente documento

Pueden introducirse moduladores polinucleotídicos de cáncer en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, como se describe en el documento WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero sin limitación, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas u otros ligandos que se unen con receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando para unirse con su molécula o receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido con sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. Como alternativa, puede introducirse un modulador polinucleotídico de cáncer en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo, mediante formación de un complejo de polinucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. Se entiende que el uso de moléculas antisentido o modelos knock out y knock in también pueden usarse en ensayos de exploración como se ha analizado anteriormente, además de métodos de tratamiento.

Nucleótidos inhibidores y antisentido

La actividad de una proteína asociada a cáncer puede regularse negativamente, o inhibirse completamente, mediante el uso de polinucleótido antisentido o ARN nuclear pequeño inhibidor (ARNnp), es decir, un ácido nucleico complementario de, y que puede hibridar preferentemente de forma específica con una secuencia de ácido nucleico de ARNm codificante, por ejemplo, una proteína de cáncer como se desvela en el presente documento, ARNm o una subsecuencia de los mismos. La unión del polinucleótido antisentido con el ARNm reduce la traducción y/o estabilidad del ARNm.

En el contexto de la presente divulgación, los polinucleótidos antisentido pueden comprender nucleótidos de origen natural o especies sintéticas formada a partir de subunidades de origen natural o sus homólogos cercanos. Los polinucleótidos antisentido también pueden tener restos de azúcares alterados o enlaces entre azúcares. Son ejemplos entre estos el fosforotioato y otras especies que contienen azufre que se conocen para su uso en la técnica. La presente invención comprende análogos siempre que actúen eficazmente para hibridar con nucleótidos como se desvela en el presente documento. Véase, por ejemplo, Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc., Natick, MA.

Dichos polinucleótidos antisentido puede sintetizarse fácilmente usando medios recombinantes, o pueden sintetizarse in vitro. El equipamiento para dicha síntesis se vende por varios proveedores, incluyendo Applied Biosystems. La preparación de otros oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados también se conoce bien por los expertos en la materia.

Las moléculas antisentido como se usa en el presente documento incluyen oligonucleótidos antisentido o con sentido. Los oligonucleótidos con sentido pueden emplearse, por ejemplo, para bloquear la transcripción mediante unión con la cadena antisentido. El oligonucleótido antisentido y con sentido comprende una secuencia de ácido nucleico monocatenaria (ARN o ADN) capaz de unirse con secuencias de ARNm (con sentido) o ADN (antisentido) diana para moléculas de cáncer. Los oligonucleótidos antisentido o con sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento generalmente de al menos aproximadamente 12 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 12 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o con sentido, basándose en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen (Cancer Res. 48: 2659 (1988 y van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958 (1988)).

Ribozimas

Además de polinucleótidos antisentido, pueden usarse ribozimas para dirigir e inhibir la transcripción de secuencias de nucleótidos asociadas a cáncer. Una ribozima es una molécula de ARN que escinde catalíticamente otras moléculas de ARN. Se han descrito diferentes tipos de ribozimas, incluyendo ribozimas de grupo I, ribozimas de cabeza de martillo, ribozimas en horquilla, RNasa P, y ribozimas de cabeza de hacha (véase, por ejemplo, Castanotto et al., Adv. in Pharmacology 25: 289-317 (1994) para una revisión general de las propiedades de diferentes ribozimas).

Las características generales de ribozimas en horquilla se describen, por ejemplo, en Hampel et al., Nucl. Acids Res.

18: 299-304 (1990); Publicación de Patente Europea Nº 0360257; Patente de Estados Unidos Nº 5.254.678. También se conocen por los expertos en la materia métodos de preparación (véase, por ejemplo, documento WO 94/26877; Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6340-6344 (1993); Yamada et al., Human Gene Therapy 1: 39-45 (1994); Leavitt et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: 699-703 (1995); Leavitt et al., Human Gene Therapy 5: 1151-120 (1994); y Yamada et al., Virology 205: 121-126 (1994)).

Uso de moduladores en exploración fenotípica

Un compuesto de ensayo puede administrarse a una población de células cancerosas, que tienen un perfil de expresión de cáncer asociado. Por “administración” o “puesta en contacto” en el presente documento se entiende que el modulador se añade a las células de tal manera que permita que el modulador actúe sobre la célula, bien por captación y acción intracelular o bien por acción en la superficie celular. Un ácido nucleico que codifica un agente proteico (es decir, un péptido) puede ponerse en una construcción viral tal como una construcción adenoviral o retroviral, y añadirse a la célula, de modo que se consiga la expresión del agente peptídico, por ejemplo, documento PCT US97/01019. También pueden usarse sistemas de terapia génica regulables. Una vez que se ha administrado el modulador a las células, las células se lavan si se desea y se permite que se incuben en condiciones preferentemente fisiológicas durante algún tiempo. Después se recogen las células y se genera un nuevo perfil de expresión génica. Por lo tanto, por ejemplo, el tejido de cáncer se explora con respecto a agentes que modulan, por ejemplo, inducen o suprimen, el fenotipo de cáncer. Un cambio en al menos un gen, preferentemente muchos, del perfil de expresión indica que el agente tiene un efecto en la actividad del cáncer. De forma similar, la alteración de una función biológica o una ruta de señalización es indicativa de actividad moduladora. Definiendo dicha identificación para el fenotipo de cáncer, se idean exploraciones para nuevos fármacos que alteren el fenotipo. Con este enfoque, no es necesario que se conozca la diana farmacológica y no es necesario que se represente en la plataforma de exploración de expresión de proteínas/genes original, ni es necesario que cambie el nivel de transcrito para la proteína diana. La función inhibidora de modulador actuará como un marcador sustituto.

Como se ha perfilado anteriormente, se realizan exploraciones para evaluar genes o productos génicos. Es decir, habiendo identificado que un gen expresado diferencialmente particular es importante en un estado particular, se realiza exploración de moduladores de la expresión del gen o el producto génico en sí mismo.

Uso de moduladores para afectar a péptidos

Se realizan mediciones de actividad de polipéptido de cáncer, o del fenotipo de cáncer usando diversos ensayos. Por ejemplo, los efectos de moduladores sobre la función de un polipéptido o polipéptidos de cáncer se miden examinando parámetros descritos anteriormente. Se usa un cambio fisiológico que afecta a la actividad para evaluar la influencia de un compuesto de ensayo en los polipéptidos como se desvela en el presente documento. Cuando se determinan los resultados funcionales usando células intactas o animales, puede evaluarse diversos efectos tales como, en el caso de un cáncer asociado con tumores sólidos, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, neovascularización, liberación de hormonas, cambios transcripcionales a marcadores genéticos tanto conocidos como no caracterizados (por ejemplo, por transferencias de Northern), cambios en el metabolismo celular tales como cambios en el crecimiento celular o del pH, y cambios en segundos mensajeros intracelulares tales como cGNIP.

Métodos para identificar secuencias asociadas a cáncer de caracterización

La expresión de diversas secuencias génicas se correlaciona con cáncer. En consecuencia, se determinan trastornos basados en genes de cáncer mutantes o variantes. En un ejemplo, existen métodos para identificar células que contienen genes de cáncer variantes, por ejemplo, determinar la presencia de, completa o en parte, la secuencia de al menos un gen de cáncer endógeno en una célula. Esto se consigue usando cualquier variedad de técnicas de secuenciación. Se desvelan en el presente documento métodos para identificar el genotipo de cáncer de un individuo, por ejemplo, determinar toda o parte de la secuencia de al menos un gen de la invención en el individuo. Esto se realiza generalmente en al menos un tejido del individuo, por ejemplo, un tejido expuesto en la Tabla I, y puede incluir la evaluación de varios tejidos o muestras diferentes del mismo tejido. El método puede incluir comparar la secuencia del gen secuenciado con un gen de cáncer conocido, es decir, un gen de tipo silvestre para determinar la presencia de miembros de la familia, homologías, mutaciones o variantes. La secuencia de todo o parte del gen puede compararse después con la secuencia de un gen de cáncer conocido para determinar si existe alguna diferencia. Esto se realiza usando cualquier variedad de programas de homología conocida, tales como BLAST, Bestfit, etc. La presencia de una diferencia en la secuencia entre el gen de cáncer del paciente y el gen de cáncer conocido se correlaciona con una patología o una propensión a una patología, como se perfila en el presente documento.

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Ejemplos:

Se describen adicionalmente diversos aspectos de la invención y se ilustran por medio de los varios ejemplos a continuación, ninguno de los cuales se pretende que limite el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Análisis de expresión de variantes de PSCA en tejidos normales y muestras de ensayo de pacientes

Previamente, PSCA, indicado en el presente documento como PSCA v.1, se ha identificado como un antígeno expresado en cáncer de próstata. Su expresión se detectó en más del 80 % de cánceres de próstata primarios y en la mayoría de metástasis de próstata. También se ha mostrado que se expresa en cáncer de vejiga, cáncer de ovario y cáncer pancreático; estos cánceres se enumeran en la Tabla I. Por análisis inmunohistoquímico, se ha mostrado que PSCA se sobreexpresa en la superficie celular de la mayoría de carcinomas de transición uroteliales, y en el 60 % de adenocarcinomas pancreáticos primarios. Se han presentado datos de expresión de PSCA en publicaciones de patente (documentos PCT/US98/04664, PCT/US/28883, PCT/US00/19967) y en artículos con revisión por pares (Saffran et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 27 feb 2001; 98(5): 2658-2663; Amara et al., Cancer Res. 15 jun 2001; 61(12): 4660-65; Reiter et al., Proc Natl Acad Sci USA. 17 feb 1998; 95(4): 1735-40; Argani et al., Cancer Res. 1 jun 2001; 61(11): 4320-24).

La expresión específica de diferentes variantes de PSCA se estudia en muestras de ensayo de paciente normales y con cáncer. Los cebadores se diseñaron para diferenciar entre PSCA v.1/v.2/v.4, PSCA v.3 y PSCA v.5. PSCA v.1/v.2/v.4 conducen a un producto de PCR de 425 pb, PSCA v.3 conduce a un producto de PCR de 300 pb, mientras que PSCA v.5 conduce a un producto de PCR de 910 pb de tamaño (Figura 1I(a)).

Se preparaba ADNc de primera cadena a partir de vejiga, cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, próstata, bazo, músculo esquelético, testículo, páncreas, colon, estómago normales, grupos de cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de mama, metástasis de cáncer y cáncer de páncreas (Figura 1I(b)). Se realizó normalización por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semicuantitativa, usando los cebadores específicos variantes a 30 ciclos de amplificación.

Los resultados muestran expresión de PSCA v.5 principalmente en cáncer de mama, metástasis de cáncer y cáncer del páncreas y a menor nivel en cáncer de colon y cáncer de pulmón. Se detectó producto de PCR de PSCA v.1/v.2/v.4 en cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de mama, metástasis de cáncer y cáncer de páncreas. Entre tejidos normales, se detectó producto de PCR de PSCA v.1/v.2/v.4 solamente en próstata, estómago y a menor nivel en riñón y pulmón, mientras que no se detectó PSCA v. 5 en ningún tejido normal. No se detectó producto detectado por PCR de PSCA v.3 en ninguna de las muestras ensayadas.

Las cebadores se diseñaron para diferenciar entre PSCA v.4 y PSCA v.5 (Figura 1J(a)). PSCA v.4 conduce a un producto de PCR de 460 pb, mientras que PSCA v.5 conduce a un producto de PCR de 945 pb de tamaño.

Se preparó ADNc de primera cadena a partir de vejiga, cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, próstata, bazo, músculo esquelético, testículo, páncreas, colon, estómago normales, grupos de cáncer de próstata, cáncer de vejiga y grupo de multixenoinjerto (xenoinjertos de cáncer de próstata, cáncer de riñón y cáncer de vejiga) (Figura 1J(b)). Se realizó normalización por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semicuantitativa, usando los cebadores específicos variantes a 30 ciclos de amplificación.

Los resultados muestran la expresión de PSCA v.4 en cáncer de próstata, cáncer de vejiga y grupo de multixenoinjerto, riñón y próstata normales. Se detectó PSCA v.5 solamente en próstata normal y cáncer de vejiga.

La expresión restringida de variantes de PSCA en tejidos normales y la expresión detectada en muestras de ensayo de paciente con cáncer indican que las variantes de PSCA son dianas terapéuticas, de pronóstico, de laboratorio, profilácticas y de diagnóstico para cánceres humanos. Ejemplo 2

Variantes de corte y empalme de PSCA

Como se usa en el presente documento, el término variante incluye variantes de transcrito y polimorfismos de un único nucleótido (SNP). Las variantes de transcrito son variantes de ARNm maduro del mismo gen que surgen por transcripción alternativa o corte y empalme alternativo. Los transcritos alternativos son transcritos del mismo gen pero inician la transcripción en diferentes puntos. Las variantes de corte y empalme son variantes de ARNm cortadas y empalmadas de forma diferente a partir del mismo transcrito. En eucariotas, cuando se transcribe un gen multiexónico a partir de ADN genómico, el ARN inicial se corta y empalma para producir ARNm funcional, que tiene solamente exones y se usa para traducción en una secuencia de aminoácidos. En consecuencia, un gen dado puede tener de cero a muchos transcritos alternativos y cada transcrito puede tener de cero a múltiples variantes de

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incluyendo dieta y fármacos entre individuos. Por lo tanto, la existencia de un SNP y/o combinaciones de alelos (llamados haplotipos) tienen muchas aplicaciones útiles, tales como diagnóstico de enfermedades hereditarias, determinación de reacciones farmacológicas y dosificación, identificación de genes responsables de enfermedades, y análisis de la relación genética entre individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon y A. M. Goate, “SNP analysis to dissect human traits”, Curr. Opin. Neurobiol. oct 2001; 11(5): 637-641; M. Pirmohamed y B. K. Park, “Genetic susceptibility to adverse drug reactions”, Trends Pharmacol. Sci. jun 2001; 22(6): 298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai y A. Roses, “The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes”, Pharmacogenomics. feb 2000; 1(1): 39-47; R. Judson, J. C. Stephens y A. Windemuth, “The predictive power of haplotypes in clinical response”, Pharmacogenomics. Feb 2000; 1(1): 15-26).

Se identifican SNP por diversos métodos aceptados en la técnica (P. Bean, “The promising voyage of SNP target discovery,” Am. Clin. Lab. oct-nov 2001; 20(9): 18-20; K. M. Weiss, “In search of human variation,” Genome Res. jul 1998; 8(7): 691-697; M. M. She, “Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies,” Clin. Chem. feb 2001; 47(2): 164-172). Por ejemplo, se identifican SNP secuenciando fragmentos de ADN que muestran polimorfismo por métodos basados en gel tales como polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). También se han descubierto por secuenciación directa de muestras de ADN agrupadas de diferentes individuos o comparando secuencias de diferentes muestras de ADN. Con la acumulación rápida de datos de secuencia en bases de datos públicas y privadas, también se descubren SNP comparando secuencias usando programas informáticos (Z. Gu, L. Hillier y P. Y. Kwok, “Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace,” Hum. Mutat. 1998; 12(4): 221-225). Los SNP pueden verificarse y el genotipo o haplotipo de un individuo puede determinarse por diversos métodos incluyendo secuenciación directa y micromatrices de alto rendimiento (P. Y. Kwok, “Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms,” Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2: 235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines y A. Duesterhoeft, “High-throughput SNP genotyping with the Masscode system,” Mol. Diagn. dic 2000; 5(4): 329-340).

Usando los métodos descritos anteriormente, se han identificado trece SNP en el transcrito para PSCA v.2. Se usó la variante 2, en lugar de por ejemplo la variante 1, porque tenía menos bases ambiguas que la variante 1. En consecuencia, se identificaron SNP en PSCA v.2, en las posiciones 57 (t/c), 367 (c/t), 424 (a/c), 495 (c/g), 499 (c/t), 563 (c/t), 567 (g/a), 627 (g/a), 634 (t/g), 835 (g/a), 847 (g/a), 878 (g/a) y 978 (c/g). Los transcritos o proteínas con alelos alternativos se designaron variante PSCA v.6 a v.18, como se muestra en la Figura 1B y Figura 1G.

El cambio de nucleótido en v.6 cambió el codón de inicio de v.1 y por lo tanto, la traducción no comenzaría hasta el siguiente ATG (AUG en ARNm), dando como resultado una proteína 9 AA más corta que la proteína v.1. Los cambios de nucleótidos para v.7 y v.8 fueron silenciosos al nivel de proteínas.

Doce de estos 13 SNP también estaban presentes en la variante 4. Los 12 SNP variantes en relación con PSCA v. 4 se designan PSCA v. 19 a v.30. Las variantes 19 a 27 codifican aminoácidos alternativos como se muestra en la Figura 1H.

Ejemplo de referencia 4

Producción de PSCA recombinante en sistemas procariotas

Para expresar PSCA recombinante y variantes de PSCA en células procariotas, se clonan las secuencias de PSCA de longitud completa o parcial y secuencias de ADNc variantes de PSCA en uno cualquiera de diversos vectores de expresión conocidos en la técnica. Se expresan una o más de las siguientes regiones de variantes de PSCA: la secuencia de longitud completa presentada en la Figura 1, u 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos cualesquiera de PSCA, variantes o análogos del mismo.

A. Construcciones de transcripción y traducción in vitro:

pCRII: para generar sondas de ARN con sentido y antisentido de PSCA para investigaciones in situ de ARN, se generan construcciones de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) que codifican todo el o fragmentos del ADNc de PSCA. El vector pCRII tiene promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para conducir la transcripción de ARN de PSCA para su uso como sondas en experimentos de hibridación in situ de ARN. Estas sondas se usan para analizar la expresión celular y tisular de PSCA al nivel de ARN. Se usa ARN de PSCA transcrito que representa la región codificante de aminoácidos de ADNc del gen de PSCA en sistemas de traducción in vitro tales como el Sistema de Reticulolisado Acoplado TnT™ (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar proteína PSCA.

B. Construcciones bacterianas:

Construcciones de pGEX: para generar proteínas PSCA recombinantes en bacterias que se fusionan con la proteína Glutatión S-Transferasa (GST), se clonan toda o partes de la secuencia codificante de proteína de ADNc de PSCA en la familia pGEX de vectores de fusión de GST (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construcciones permiten la expresión controlada de secuencias de proteína PSCA recombinante con GST fusionado

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fisiología humana.

La estructura secundaria de las variantes de proteína PSCA 1, 3, 4 y 6, concretamente la presencia y localización predichas de hélices alfa, cadenas extendidas y bucles aleatorios, se predice a partir de la secuencia de aminoácidos primaria usando el método de HNN, Red Neural Jerárquica (NPS@: Network Protein Sequence Analysis TIBS marzo 2000 Vol. 25, Nº 3 [291]: 147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. y Deléage G., http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html), al que se accede desde el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la web en (.expasy.ch/tools/). El análisis indica que la variante 1 de PSCA está compuesta de 30,89 % de hélice de alfa, 21,95 % de cadena extendida y 47,15 % de bucle aleatorio. La variante 3 de proteína PSCA está compuesta de 14,89 % de hélice de alfa, 8,51 % de cadena extendida y 76,60 % de bucle aleatorio. La variante 4 de proteína PSCA está compuesta de 9,52 % de hélice de alfa, 8,99 % de cadena extendida, 81,48 % de bucle aleatorio. La variante 6 de proteína PSCA está compuesta de 24,56 % de hélice de alfa, 21,93 % de cadena extendida y 53,51 % de bucle aleatorio.

Se llevó a cabo análisis con respecto a la presencia potencial de dominios transmembrana en las proteínas variantes de PSCA usando diversos algoritmos de predicción transmembrana a los que se accede desde el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la web en (.expasy.ch/tools/).

Ejemplo 7

Generación de anticuerpos policlonales de PSCA

Pueden inducirse anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizador y, si se desea, un adyuvante. Normalmente, se inyectará un agente inmunizador y/o adyuvante en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Además de inmunizar con una variante de proteína PSCA de longitud completa, se emplean algoritmos informáticos en el diseño de inmunógenos que, basándose en el análisis de secuencia de aminoácidos contiene características de ser antigénicos y estar disponibles para el reconocimiento por el sistema inmunitario del hospedador inmunizado (véase el ejemplo titulado “Perfiles de Antigenicidad y Estructura Secundaria”). Se predeciría que dichas regiones son hidrófilas, flexibles, en conformaciones de giro beta y están expuestas en la superficie de la proteína.

Por ejemplo, se usan proteínas o péptidos de fusión bacterianos recombinantes que contienen regiones hidrófilas, flexibles, de giro beta de variantes de proteína PSCA como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos Blancos de Nueva Zelanda o anticuerpos monoclonales como se describen en el ejemplo titulado “Generación de Anticuerpos Monoclonales (MAb) de PSCA”. Por ejemplo, en la variante 1 de PSCA, dichas regiones incluyen, pero sin limitación, los aminoácidos 28-56 y aminoácidos 66-94. Para la variante 3, dichas regiones incluyen, pero sin limitación, los aminoácidos 7-39 y aminoácidos 70-94. Para la variante 4 dichas regiones incluyen, pero sin limitación, los aminoácidos 6-18, aminoácidos 27-39, aminoácidos 103-133 y 177-189. Para la variante 6, dichas regiones incluyen, pero sin limitación, los aminoácidos 19-35 y aminoácidos 57-85. Es útil conjugar al agente inmunizador con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que se inmunice. Los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen, pero sin limitación, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. En una realización, un péptido que codifica los aminoácidos 103-133 de la variante 4 de PSCA se conjuga con KLH y se usa para inmunizar un conejo. Como alternativa el agente inmunizador puede incluir todas o partes de las proteínas variantes de PSCA, análogos o proteínas de fusión de las mismas. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de variantes de PSCA pueden fusionarse usando técnicas de ADN recombinante con uno cualquiera de diversos compañeros de proteínas de fusión que se conocen bien en la técnica, tales como glutatión-S-transferasa (GST) y proteínas de fusión marcadas con His. En una realización, la secuencia de variante 1 de PSCA, los aminoácidos 18-98 se fusionaron con GST usando técnicas recombinantes en el vector de expresión pGEX, se expresaron, purificaron y se usaron para inmunizar tanto conejos como ratones para generar anticuerpos policlonales y monoclonales respectivamente. Dichas proteínas de fusión se purifican a partir de bacterias inducidas usando la matriz de afinidad apropiada.

Otras proteínas de fusión bacterianas recombinantes que pueden emplearse incluyen proteína de unión a maltosa, LacZ, tiorredoxina, NusA, o una región constante de inmunoglobulina (véase la sección titulada “Producción de PSCA en Sistemas Procariotas” y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995; Linsley, P. S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N., y Ledbetter, L. (1991) J. Exp. Med. 174, 561-566).

Además de proteínas de fusión derivadas de bacterias, también se usan antígenos de proteínas expresadas por mamíferos. Estos antígenos se expresan a partir de vectores de expresión de mamíferos tales como los vectores de fusión de Tag5 y Fc (véase la sección titulada “Producción de PSCA Recombinante en Sistemas Eucariotas”) y conservan modificaciones postraduccionales tales como glucosilaciones halladas en proteína nativa. En una realización, el ADNc de la variante 1 de PSCA, menos el péptido líder N terminal y anclaje de GPI C terminal se clonó en el vector de secreción de mamífero Tag5, y se expresó en células 293T. La proteína recombinante se purificó por cromatografía de quelado metálico a partir de sobrenadantes de cultivo tisular de células 293T que expresan de forma estable el vector recombinante. Después se usó la proteína PSCA Tag5 purificada como

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fusión electrocelular (BTX, ECM2000).

En una realización, la invención proporciona anticuerpos monoclonales designados Ha1-1.16, Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.120, Ha1-4.121 y Ha1-4.37. Los anticuerpos se identificaron y se ha mostrado que reaccionan y se unen con superficie celular o PSCA inmovilizado.

Se generaron MAb para PSCA usando tecnología XenoMouse® en la que los loci de cadena ligera kappa y pesada murina se han inactivado y una mayoría de los loci de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y pesada humana se han insertado: se generó Hal-1.16 después de inmunizar Xenomice que producían gamma 1 humana (13 veces con PSCA-GST); se generó Ha1-5.99 después de inmunizar Xenomice que producían gamma 2 humana 6 veces con células Rat1-PSCA seguido de dos inyecciones con PSCA-tag5; se generaron Ha1-4.117, HA1-4.37, Ha1-4.120, y Ha1-4.121 después de inmunizar Xenomice que producían gamma 1 humana 6 veces con células Rat1-PSCA seguido de 4 inyecciones con PSCA-tag5. Los MAb anti PSCA, Ha1-1.16, Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.120 y Ha1

4.121 se unen con PSCA de superficie celular endógeno expresado en células de xenoinjerto de cáncer de próstata.

Los anticuerpos designados Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.120, Ha1-4.37, Ha1-1.16 y Ha1-4.121 se enviaron (a través de Federal Express) a la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 4 de mayo de 2004 y se les asignaron los números de Referencia PTA-6703, PTA-6699, PTA-6700, PTA-6702, PTA-6698 y PTA-6701 respectivamente.

Se determinaron las secuencias codificantes de ADN para MAb anti PSCA Ha1-1.16, Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha14.120, Ha1-4.121 y Ha1-4.37, después de aislar ARNm de las células de hibridoma respectivas con reactivo de Trizol (Life Technologies, Gibco BRL). Se purificó y cuantificó el ARN total. Se generaron ADNc de primera cadena de ARN total con sensibilización con oligo (dT) 12 18 usando el sistema de Preamplificación Superscript Gibco BRL. Se amplificó ADNc de primera cadena usando cebadores de cadena pesada variable de inmunoglobulina humana, y cebadores de cadena ligera variable de inmunoglobulina humana. Se clonaron productos de PCR en el vector pCRScript (Stratagene, La Jolla). Se secuenciaron varios clones y se determinaron las regiones de cadena pesada y ligera variable. Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de las regiones de cadena pesada y ligera variables se enumeran en la Figura 2 y la Figura 3. Se muestra alineamiento de anticuerpos de PSCA para secuencias V-D-J de línea germinal en la Figura 4A -Figura 4M.

Ejemplo 9

Exploración e identificación de anticuerpos de PSCA

Se exploraron anticuerpos generados usando los procedimientos expuestos en el ejemplo titulado “Generación de Anticuerpos Monoclonales (MAb) de PSCA” y se identificaron usando una combinación de ensayos incluyendo ELISA, FACS, agrupamiento de epítopos y afinidad por PSCA expresado en la superficie celular.

A. Exploración de MAb humano de PSCA por FACS.

Se realizó exploración de hibridoma primario para MAb para PSCA por FACS. El protocolo fue el siguiente: se añadieron 50 l/pocillo de sobrenadante de hibridoma (puro) o anticuerpos purificados (en diluciones en serie) a placas de FACS de 96 pocillos y se mezclaron con células que expresaban PSCA (endógenas o recombinantes,

50.000 células/pocillo). La mezcla se incubó a 4 ºC durante dos horas. Al final de la incubación, las células se lavaron con tampón FACS y se incubaron con 100 l de anticuerpo de detección (anti hIgG-PE) durante 45 minutos a 4 ºC. Al final de la incubación, las células se lavaron con tampón de FACS, se fijaron con Formaldehído y se analizaron usando FACScan. Los datos se analizaron usando software CellQuest Pro. Los histogramas rellenos indican datos de células de control negativo, y los histogramas abiertos representan datos de células positivas para PSCA (Figura 9).

Se transfirieron hibridomas positivos identificados a partir de exploraciones primarias a placas de 24 pocillos y sobrenadantes recogidos para exploraciones de confirmación. Las exploraciones de confirmación incluyeron análisis de FACS en B300.19-PSCA/300.19-neo, Rat1-PSCA/Rat1-neo, PC3-PSCA/neo, SW780 (línea celular de cáncer de vejiga), LAPC9AI (línea celular de cáncer de próstata), HPAC (línea celular de cáncer pancreático) y ensayo de ELISA usando Tag5-PSCA, GST-PSCA, GST-PSCA N-term, Med. C-Term, y pET-PSCA.

B. Análisis de afinidad relativa de MAb humano de PSCA

Los sobrenadantes de hibridoma se ensayaron para determinar su afinidad de unión relativa por PSCA de superficie celular. Los sobrenadantes de hibridoma se diluyeron en serie en tampón de FACS (FB), de g/ml a sub ng/ml; y se evaluaron en un ensayo de unión de FACS usando células LAPC9AI. Anticuerpos de alta afinidad proporcionaron valores de IFM altos. Los valores de IFM de cada punto se obtuvieron usando software CellQuest Pro y se usaron para cálculo de afinidad usando software Graphpad Prism (Tabla VII y Tabla VIII): ecuación de Respuesta a Dosis Sigmoidea (pendiente variable). Los resultados del análisis de afinidad relativa se exponen en la Figura 10.

C. Agrupamiento de epítopos

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toxina saporina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) a cada pocillo. Se permitió que las células se incubaran durante 5 días a 37 grados C. Al final del periodo de incubación, se añadió MTS (Promega) a cada pocillo y se continuó la incubación durante 4 horas adicionales. Se determinó la DO a 450 nm. Los resultados en la Figura 13(A) muestran que los anticuerpos de PSCA HA1-4.121 y HA1-4.117 mediaban en la citotoxicidad dependiente de saporina en células B300.19-PSCA mientras que un anticuerpo de control, IgG1 humano no específico, no tenía ningún efecto. Los resultados en la Figura 13(B) muestran que la adición de un anticuerpo conjugado con saporina secundaria que no reconocía Fc humano, no conseguía mediar en la citotoxicidad (Figura 13(A) y Figura 13(B)). Estos resultados indican que los fármacos o las proteínas citotóxicas pueden suministrarse de forma selectiva a células que expresan PSCA usando un MAb anti PSCA apropiado.

Ejemplo 13

Citotoxicidad mediada por inmunidad de anticuerpos

Se evaluaron anticuerpos de PSCA para determinar su capacidad para mediar en la citotoxicidad dependiente de inmunidad. Se diluyeron anticuerpos de PSCA (0-50 g/ml) con tampón de RHB (RPMI 1640, Gibco Life Technologies, HEPES 20 mM). Se lavaron células que expresaban B300.19-PSCA en tampón de RHB y se resuspendieron a una densidad de 106 células/ml. En un ensayo típico, se añadieron 50 l de anticuerpo de PSCA, 50 l de suero de complemento de conejo diluido (Cedarlane, Ontario, Can) y 50 l de una suspensión celular juntos en una placa de 96 pocillos de cultivo tisular de fondo plano. La mezcla se incubó durante 2 h a 37 ºC en un incubador de CO2 al 5 % para facilitar la lisis celular mediada por complemento. A continuación, se añadieron 50 l de Azul de Alamar (Biosource Intl. Camarillo, CA) a cada pocillo y la incubación continuó durante 4-5 horas adicionales a 37 ºC. La fluorescencia en cada pocillo se leyó usando un fluorímetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados muestran que los anticuerpos de PSCA que tenían un isotipo Ig1 (HA14.121) o un isotipo IgG2 (HA1-5.99.1) pero no un isotipo IgG4 (HA1-6.46) fueron capaces de mediar en la lisis dependiente de complemento (Figura 14).

La ADCC (Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo) es un ataque lítico mediado por inmunidad en células unidas con un anticuerpo dirigido a un antígeno se superficie celular específico. En este caso es PSCA. Las células inmunitarias reconocen la parte Fc del anticuerpo mediante unión con receptores Fc en la superficie de leucocitos, monocitos y linfocitos NK que desencadenan un ataque lítico que da como resultado la muerte celular. La capacidad de los anticuerpos de PSCA para mediar en esta reacción puede evaluarse marcando células tumorales in vitro con 51cromo, europio o una molécula fluorescente e incubándolas en presencia de MAb de PSCA humanos junto con células mononucleares de sangre periférica. La lisis específica de las células tumorales puede determinarse midiendo el porcentaje de lisis de las células tumorales diana. Criterios de valoración comunes que se determinan incluyen la liberación de radiactividad, europio o colorante fluorescente de las células muertas usando un método de detección apropiado. Como alternativa, puede medirse la liberación de una enzima intracelular tal como lactato deshidrogenasa (LDH).

Ejemplo 14

Generación de fragmentos F(Ab’)2

La generación de fragmentos F(Ab’)2 de MAb es útil para estudiar los efectos de moléculas de MAb que conservan su sitio de unión a antígeno bivalente pero carecen del dominio Fc efector inmunitario en modelos terapéuticos in vitro e in vivo. Se incubaron 20 mg de MAb Ha1-4.121 en tampón de acetato sódico 20 mM pH 4,5 con y sin pepsina inmovilizada (Perfore. Rockford IL) durante los tiempos indicados. Se retiraron MAb intacto y fragmentos Fc digeridos por cromatografía de proteína A. Se muestra en la Figura 15 un gel teñido con Coomasie de SDS-PAGE de MAb no reducido no digerido intacto, alícuotas no reducidas de material digerido tomado en los momentos indicados y una muestra reducida del producto de F(ab’)2 digerido final. Este reactivo puede usarse para tratar animales que portan tumores de expresión de PSCA. La actividad antitumoral observada con este fragmento de anticuerpo puede distinguir la actividad biológica intrínseca de la actividad mediada por mecanismos dependientes de inmunidad.

Ejemplo 15

Expresión de anticuerpos humanos usando métodos de ADN recombinante

Para expresar MAb anti PSCA de forma recombinante en células transfectadas, se clonaron secuencias de cadena pesada y ligera variables anti PSCA cadena arriba de las regiones constantes de cadena pesada humana IgG1 y cadena ligera Ig respectivamente. Los casetes de cadena pesada y cadena ligera humanas anti PSCA completos se clonaron cadena abajo del promotor/potenciador de CMV en un vector de clonación. Se incluyó un sitio de poliadenilación cadena abajo de la secuencia codificante de MAb. Las construcciones que expresaban MAb anti PSCA recombinantes se transfectaron en células 293T, Cos y CHO. El anticuerpo HA1-4.121 secretado de las células 293-T recombinantes se evaluó con respecto a unión con PSCA de superficie celular en la Figura Pia-3A y

se comparó con el mismo anticuerpo producido a partir del hibridoma original (Figura 16).

Ejemplo de referencia 16

Ensayos de unión de HLA de clase I y clase II

Se realizaron ensayos de unión de HLA de clase I y clase II usando moléculas de HLA purificadas de acuerdo con protocolos desvelados (por ejemplo, publicaciones de PCT WO 94/20127 y WO 94/03205; Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol. 154: 247 (1995); Sette, et al., Mol. Immunol. 31: 813 (1994)). Brevemente, se incuban moléculas del MHC purificadas (de 5 a 500 nM) con diversos inhibidores peptídicos no marcados y péptidos sonda radiomarcados con 125I 1-10 nM. Después de la incubación, se separan los complejos de MHC-péptido de péptido libre por filtración en gel y se determina la fracción de péptido unido. Normalmente, en experimentos preliminares, cada preparación de MHC se titula en presencia de cantidades fijas de péptidos radiomarcados para determinar la concentración de moléculas de HLA necesarias para unirse con el 10-20 % de la radiactividad total. Todos los ensayos posteriores de inhibición y unión directa se realizan usando estas concentraciones de HLA.

Ya que en estas condiciones [marcador]<[HLA] y CI50[HLA], los valores de CI50 medidos son aproximaciones razonables de los verdaderos valores de KD. Los inhibidores peptídicos se ensayan normalmente a concentraciones que varían de 120 g/ml a 1,2 ng/ml, y se ensayan en de dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en diferentes experimentos, se calcula una cifra de unión relativa para cada péptido dividiendo la CI50 de un control positivo para inhibición por CI50 para cada péptido ensayado (normalmente versiones no marcadas del péptido sonda radiomarcado). Para fines de la base de datos, y comparaciones entre experimentos, se compilan valores de unión relativos. Estos valores pueden posteriormente convertirse de nuevo a valores de CI50 nM dividiendo la CI50 nM de los controles positivos para inhibición por la unión relativa del péptido de interés. Este método de compilación de datos es preciso y uniforme para comparar péptidos que se han ensayados en diferentes días, o con diferentes lotes de MHC purificado.

Pueden usarse ensayos de unión como se ha perfilado anteriormente para analizar péptidos portadores de supermotivo de HLA y/o motivo de HLA (véase Tabla IV).

Ejemplo de referencia 17

Construcción de plásmidos de ADN multiepitópicos de “minigén”

Este ejemplo analiza la construcción de un plásmido de expresión de minigén. Los plásmidos de minigenes pueden, por supuesto, contener diversas configuraciones de epítopos o análogos epitópicos de linfocitos B, CTL y/o HTL como se describe en el presente documento.

Un plásmido de expresión de minigén incluye normalmente múltiples epítopos peptídicos de CTL y HTL. En el presente ejemplo, se usan epítopos peptídicos que portan supermotivos de HLA-A2, A3, B7 y epítopos peptídicos que portan motivos de HLA-A1 y A24 junto con epítopos portadores de supermotivo de DR y/o epítopos DR3. Se seleccionan PSCA derivados de epítopos peptídicos portadores de supermotivos o motivos de HLA de clase I de modo que se representen múltiples motivos/supermotivos para asegurar una cobertura de población amplia. De forma similar, se seleccionan epítopos de HLA de clase II de PSCA para proporcionar cobertura de población amplia, es decir tanto epítopos portadores de supermotivo de HLA DR-1-4-7 como epítopos portadores de motivos de HLA DR-3 se seleccionan para inclusión en la construcción de minigén. Los epítopos de CTL y HTL seleccionados se incorporan después en un minigén para expresión en un vector de expresión.

Dicha construcción puede incluir adicionalmente secuencias que dirigen los epítopos de HTL al retículo endoplásmico. Por ejemplo, la proteína Ii puede fusionarse con uno o más epítopos de HTL como se describe en la técnica, en los que la secuencia CLIP de la proteína Ii se retira y se reemplaza con una secuencia epitópica de HLA de clase II de modo que el epítopo de HLA de clase II se dirija al retículo endoplásmico, en el que el epítopo se une con una molécula de HLA de clase II.

Este ejemplo ilustra los métodos para usar para la construcción de un plásmido de expresión portador de minigén. Otros vectores de expresión que pueden usarse para composiciones de minigenes están disponibles y se conocen por los expertos en la materia.

El plásmido de ADN de minigén de este ejemplo contiene una secuencia Kozak consenso y una secuencia señal de cadena ligera Ig kappa murina consenso seguida de epítopos de CTL y/o HTL seleccionados de acuerdo con principios desvelados en el presente documento. La secuencia codifica una fase abierta de lectura fusionada con el marcador epitópico de anticuerpo Myc y His codificado por el vector pcDNA 3.1 Myc-His.

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resultados indican la magnitud de la respuesta de HTL, demostrando de este modo la inmunogenicidad in vivo del minigén.

Los minigenes de ADN, construidos como se ha descrito en el ejemplo previo, también pueden confirmarse como una vacuna en combinación con un agente de refuerzo usando un protocolo de sensibilización y refuerzo. El agente de refuerzo puede consistir en proteína recombinante (por ejemplo, Barnett et al., Aids Res. and Human Retroviruses 14, Suplemento 3: S299-S309, 1998) o vaccinia recombinante, por ejemplo, que expresa un minigén o ADN que codifica la proteína completa de interés (véase, por ejemplo, Hanke et al., Vaccine 16: 439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 7648-53, 1998; Hanke y McMichael, Immunol. Letters 66: 177-181, 1999; y Robinson et al., Nature Med. 5: 526-34, 1999).

Por ejemplo, la eficacia del minigén de ADN usado en un protocolo de sensibilización y refuerzo se evalúa inicialmente en ratones transgénicos. En este ejemplo, se inmunizan ratones transgénicos A2.1/Kb IM con 100 g de un minigén de ADN que codifica los péptidos inmunogénicos incluyendo al menos un péptido portador de supermotivo de HLA-A2. Después de un periodo de incubación (que varía de 3 a 9 semanas), los ratones se refuerzan IP con 107 ufp/ratón de un virus vaccinia recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigén de ADN. Los ratones de control se inmunizan con 100 g de ADN o vaccinia recombinante sin la secuencia de minigén, o con ADN que codifica el minigén, pero sin el refuerzo de vaccinia. Después de un periodo de incubación adicional de dos semanas, los esplenocitos de los ratones se ensayan inmediatamente con respecto a actividad específica de péptido en un ensayo ELISPOT. Adicionalmente, los esplenocitos se estimulan in vitro con los epítopos peptídicos restringidos a A2 codificados en el minigén y vaccinia recombinante, después se ensayan con respecto a actividad específica de péptido en un ELISA de IFN alfa, beta y/o gamma.

Se ha descubierto que el minigén utilizado en un protocolo de sensibilización-refuerzo induce mayores respuestas inmunitarias hacia los péptidos del supermotivo HLA-A2 que con ADN solamente. Dicho análisis también puede realizarse usando modelos de ratón transgénicos HLA-A11 o HLA-B7 para evaluar la inducción de CTL por epítopos de motivo o supermotivo HLA-A3 o HLA-B7. El uso de protocolos de sensibilización y refuerzo en seres humanos se describe posteriormente en el ejemplo titulado “Inducción de Respuestas de CTL Usando un Protocolo de Sensibilización y Refuerzo)”.

Ejemplo de referencia 19

Composiciones de vacuna poliepitópicas de múltiples antígenos

Los epítopos peptídicos de PSCA de la presente invención se usan junto con epítopos de otros antígenos asociados a tumor diana, para crear una composición de vacuna que es útil para la prevención o el tratamiento de cáncer que expresa PSCA y otros antígenos tales. Por ejemplo, puede proporcionarse una composición de vacuna como un único polipéptido que incorpora múltiples epítopos de PSCA así como antígenos asociados a tumor que con frecuencia se expresan con un cáncer diana asociado con la expresión de PSCA, o puede administrarse como una composición que comprende un cóctel de uno o más epítopos discretos. Como alternativa, la vacuna puede administrarse como una construcción de minigén o como células dendríticas que se han cargado con los epítopos peptídicos in vitro. Ejemplo de referencia 20

Uso de péptidos para evaluar una respuesta inmunitaria

Pueden usarse péptidos de la invención para analizar una respuesta inmunitaria con respecto a la presencia de anticuerpos, CTL o HTL específicos dirigidos a PSCA. Dicho análisis puede realizarse de una manera descrita en Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998. En este ejemplo, se usan péptidos de acuerdo con la invención como un reactivo para fines de diagnóstico o pronóstico, no como un inmunógeno.

En este ejemplo se usan complejos tetraméricos de antígenos de leucocitos humanos altamente sensibles (“tetrámeros”) para un análisis de sección transversal de, por ejemplo, frecuencias de CTL específicos de PSCA HLA-A*0201 de individuos positivos para HLA A*0201 en estadios diferentes de enfermedad o después de inmunización que comprende un péptido de PSCA que contiene un motivo A*0201. Se sintetizan complejos tetraméricos como se ha descrito (Musey et al., N. Engl. J. Med. 337: 1267, 1997). Brevemente, se sintetizan cadena pesada de HLA purificada (A*0201 en este ejemplo) y microglobulina 2 por medio de un sistema de expresión procariota. La cadena pesada se modifica por deleción de la cola citosólica transmembrana y adición COOH terminal de una secuencia que contiene un sitio de biotinilación enzimática BirA. La cadena pesada, microglobulina 2, y péptido se repliegan por dilución. El producto replegado de 45 kD se aísla por cromatografía líquida de proteínas rápida y después se biotinila por BirA en presencia de biotina (Sigma, St. Louis, Missouri), adenosin 5’ trifosfato y magnesio. Se añade conjugado de estreptavidina-ficoeritrina en una relación molar 1:4, y el producto tetramérico se concentra a 1 mg/ml. El producto resultante se denomina tetrámero-ficoeritrina.

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Ejemplo 24

Identificación de moléculas que interaccionan con PSCA

PSCA, o fragmentos biológicamente activos del mismo, se marcan con reactivo 121 1 Bolton-Hunter. (Véase, por ejemplo, Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133: 529). Se incuban moléculas candidatas previamente dispuestas en los pocillos de una placa multipocillo con el PSCA marcado, se lavan y se ensaya cualquier pocillo con complejo de PSCA marcado. Se usan los datos obtenidos usando concentraciones diferentes de PSCA para calcular los valores con respecto al número, afinidad y asociación de PSCA con las moléculas candidatas.

Ejemplo de referencia 25

Ensayo in vivo para promoción del crecimiento tumoral de PSCA

El efecto de la proteína PSCA en el crecimiento de células tumorales se evalúa in vivo evaluando el desarrollo y crecimiento tumoral de células que expresan o carecen de PSCA. Por ejemplo, se inyecta a ratones SCID por vía subcutánea en cada flanco 1 x 106 de las líneas celulares 3T3, o de cáncer de próstata (por ejemplo células PC3) que contienen vector vacío tkNeo o PSCA. Pueden usarse al menos dos estrategias: (1) expresión de PSCA constitutiva bajo la regulación de un promotor tal como un promotor constitutivo obtenido de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus, (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus de Simio 40 (SV40) o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras, y (2) expresión regulada bajo el control de un sistema de vector inducible, tal como ecdisona, tetraciclina, etc., siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras. Después se controla el volumen tumoral por medición por calibrador en el momento de aparición de tumores palpables y se sigue a lo largo del tiempo para determinar si las células que expresan PSCA crecen a una velocidad más rápida y si los tumores producidos por células que expresan PSCA demuestran características de agresividad alterada (por ejemplo metástasis potenciada, vascularización, sensibilidad reducida a fármacos quimioterapéuticos).

Además, pueden implantarse a ratones 1 x 105 de las mismas células de forma ortotópica para determinar si PSCA tiene un efecto en el crecimiento local en la próstata, y si PSCA afecta a la capacidad de las células para metastatizar, específicamente a ganglios linfáticos, y hueso (Miki T et al, Oncol Res. 2001; 12: 209; Fu X et al, Int J Cancer. 1991, 49: 938). El efecto de PSCA en la formación de tumores de hueso y el crecimiento puede evaluarse inyectando células tumorales de próstata por vía intratibial.

El ensayo también es útil para determinar el efecto inhibidor de PSCA de composiciones terapéuticas candidatas, tales como por ejemplo intracuerpos de PSCA, moléculas antisentido de PSCA y ribozimas.

Ejemplo 26

Inhibición mediada por anticuerpo monoclonal de PSCA de tumores in vivo

La expresión significativa de PSCA en la superficie celular de tejidos tumorales, junto con su expresión restrictiva en tejidos normales hace a PSCA una buena diana para la terapia de anticuerpos. De forma similar, PSCA es una diana para inmunoterapia basada en linfocitos T. Por lo tanto, la eficacia terapéutica de MAb anti PSCA en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer de próstata humana y modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer pancreático humano se evalúa usando líneas celulares recombinantes tales como PC3-PSCA y 3T3-PSCA (véase, por ejemplo, Kaighn, M.E., et al., Invest Urol, 1979. 17(1): 16-23), así como modelos de xenoinjerto de próstata humana tales como LAPC 9AD (Saffran et al PNAS 1999, 10: 1073-1078).

Se estudia la eficacia de anticuerpo en el crecimiento tumoral y la formación de metástasis, por ejemplo, en un modelo de xenoinjerto de cáncer pancreático o de próstata ortotópico de ratón. Los anticuerpos pueden no estar conjugados, como se analiza en el este ejemplo, o pueden conjugarse con una modalidad terapéutica, como se aprecia en la técnica. Los MAb anti PSCA inhiben la formación de xenoinjertos tanto pancreáticos como de próstata. Los MAb anti PSCA también retardan el crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y supervivencia prolongada de ratones portadores de tumores. Estos resultados indican la utilidad de MAb anti PSCA en el tratamiento de cáncer de próstata de estadios locales y avanzados, cáncer pancreático y los cánceres expuestos en la Tabla I (véase, por ejemplo, Saffran, D., et al., PNAS 10: 1073-1078 o la URL web pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698).

La administración de los MAb anti PSCA condujo al retardo del crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y la inhibición de la metástasis a sitios distantes, dando como resultado una prolongación significativa de la supervivencia de ratones portadores de tumores. Estos estudios indican que PSCA es una diana atractiva para inmunoterapia y demuestran el potencial terapéutico de MAb anti PSCA para el tratamiento de cáncer de próstata y

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II.) Monoterapia: en relación con el uso de anticuerpos anti PSCA en monoterapia de tumores, los anticuerpos se administran a pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En una realización, se realiza monoterapia clínicamente en pacientes con cáncer de estadio final con enfermedad metastásica extensiva. Los pacientes muestran algo de estabilización de enfermedad. Los ensayos demuestran un efecto en pacientes refractarios con tumores cancerosos.

III.) Agente de captura de imágenes: mediante la unión de un radionúclido (por ejemplo, yodo o itrio (I131, Y90) con anticuerpos anti PSCA, los anticuerpos radiomarcados se utilizan como un agente de diagnóstico y/o de captura de imágenes. En dicho papel, los anticuerpos marcados se localizan en ambos tumores sólidos, así como lesiones metastásicas de células que expresan PSCA. En relación con el uso de anticuerpos anti PSCA como agentes de captura de imágenes, los anticuerpos se usan como un complemento para el tratamiento quirúrgico de tumores sólidos, tanto como una exploración prequirúrgica como un seguimiento postoperatorio para determinar qué tumor permanece y/o vuelve. En una realización, se usa un anticuerpo de PSCA-(111In) como un agente de captura de imágenes en un ensayo clínico humano de Fase I en pacientes que tengan un carcinoma que exprese PSCA (por analogía véase, por ejemplo, Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83: 97-104 (1991)). Los pacientes se siguen con cámara convencional anterior y posterior gamma. Los resultados indican que se identifican lesiones primarias y lesiones metastásicas.

Dosis y vía de administración

Como se apreciará por los expertos habituales en la materia, las consideraciones de dosificación pueden determinarse mediante comparación con los productos análogos que están en la clínica. Por lo tanto, pueden administrarse anticuerpos anti PSCA con dosis en el intervalo de 5 a 400 mg/m2, con las dosis menores usadas, por ejemplo, en relación con estudios de seguridad. La afinidad de anticuerpos anti PSCA en relación con la afinidad de un anticuerpo conocido por su diana es un parámetro usado por los expertos en la materia para determinar regímenes de dosis análogos. Además, los anticuerpos anti PSCA que son anticuerpos completamente humanos, en comparación con el anticuerpo quimérico, tienen eliminación más lenta; en consecuencia, la dosificación en pacientes con dichos anticuerpos anti PSCA completamente humanos puede ser menor, quizás en el intervalo de 50 a 300 mg/m2, y aún ser eficaces. La dosificación en mg/m2, a diferencia de la medición convencional de dosis en mg/kg, es una medición basada en el área de superficie y es una medida de dosificación conveniente que se diseña para incluir pacientes de todos los tamaños de niños a adultos.

Tres enfoques de suministro distintos son útiles para suministro de anticuerpos anti PSCA. El suministro intravenoso convencional es una técnica de suministro convencional para muchos tumores. Sin embargo, en relación con tumores en la cavidad peritoneal, tales como tumores de los ovarios, conducto biliar, otros conductos y similares, la administración intraperitoneal puede demostrar ser favorable para obtener alta dosis de anticuerpo en el tumor y también para minimizar la eliminación de anticuerpos. De manera similar, ciertos tumores sólidos poseen vasculatura que es apropiada para perfusión regional. La perfusión regional permite una alta dosis de anticuerpo en el sitio de un tumor y minimiza la eliminación a corto plazo del anticuerpo.

Plan de desarrollo clínico (CDP)

Visión de conjunto: el CDP sigue y desarrolla tratamientos de anticuerpos anti PSCA en relación con terapia complementaria, monoterapia y como un agente de captura de imágenes. Los ensayos demuestran inicialmente seguridad y a continuación confirman la eficacia en dosis repetidas. Los ensayos son abiertos y comparan la quimioterapia convencional con terapia convencional más anticuerpos anti PSCA. Como se apreciará, un criterio que puede utilizarse en relación con la admisión de pacientes es los niveles de expresión de PSCA en sus tumores como se determina por biopsia.

Como con cualquier proteína o producto terapéutico basado en infusión de anticuerpo, las preocupaciones de seguridad están relacionadas principalmente con (i) síndrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, temblor, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, el desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente para el producto terapéutico de anticuerpo o respuesta de HAHA); y (iii) toxicidad a células normales que expresan PSCA. Se utilizan ensayos convencionales y seguimiento para controlar cada una de estas preocupaciones de seguridad. Se ha descubierto que los anticuerpos anti PSCA son seguros tras su administración a seres humanos.

Ejemplo 29

Ensayo clínico humano: monoterapia con anticuerpo anti PSCA humano

Los anticuerpos anti PSCA son seguros en relación con el ensayo complementario anteriormente analizado, un ensayo clínico humano de Fase II confirma la eficacia y dosificación óptima para monoterapia. Dicho ensayo se consigue e implica los mismos análisis de seguridad y resultado, que el ensayo complementario anteriormente descrito con la excepción de que los pacientes no reciben quimioterapia simultáneamente con la recepción de dosis de anticuerpos anti PSCA.

Ejemplo 30

Ensayo clínico humano: captura de imágenes de diagnóstico con anticuerpo anti PSCA

De nuevo, como la terapia complementaria analizada anteriormente es segura dentro de los criterios de seguridad analizados anteriormente, se realiza un ensayo clínico humano con respecto al uso de anticuerpos anti PSCA como un agente de captura de imágenes de diagnóstico. El protocolo se diseña de una manera sustancialmente similar a las descritas en la técnica, tal como en Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83: 97-104 (1991). Se ha descubierto que los anticuerpos son tanto seguros como eficaces cuando se usan como una modalidad de diagnóstico.

Ejemplo 31

Terapia complementaria de ensayo clínico humano con anticuerpo anti PSCA humano y terapia quimioterapéutica, radioterapia y/o terapia de ablación hormonal

Se inicia un ensayo clínico humano de fase I para evaluar la seguridad de seis dosis intravenosas de un anticuerpo anti PSCA humano en relación con el tratamiento de un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I. En el estudio, se evalúa la seguridad de dosis individuales de anticuerpos anti PSCA cuando se utilizan como una terapia complementaria a un producto antineoplásico o quimioterapéutico o agente de ablación hormonal como se define en el presente documento, tal como, sin limitación: cisplatino, topotecán, doxorrubicina, adriamicina, taxol, Lupron, Zoladex, Eulexina, Casodex, Anandrón o similares. El diseño de ensayo incluye suministro de aproximadamente seis dosis individuales de un anticuerpo anti PSCA con dosificación de anticuerpo que aumenta de aproximadamente 25 mg/m2 a aproximadamente 275 mg/m2 durante el transcurso del tratamiento de acuerdo con el siguiente programa o uno similar:

Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Día 28 Día 35 Dosis de MAb 25 mg/m2 75 mg/m2 125 mg/m2 175 mg/m2 225 mg/m2 275 mg/m2 Quimioterapia (dosis convencional) + + + + + +

Los pacientes se siguen estrechamente durante una semana después de cada administración de anticuerpo y quimioterapia. En particular, los pacientes se evalúan con respecto a las preocupaciones de seguridad mencionadas anteriormente: (i) síndrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, temblor, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, el desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente al producto terapéutico de anticuerpo humano, o respuesta de HAHA); y (iii) toxicidad a células normales que expresan PSCA. Se utilizan ensayos convencionales y seguimiento para controlar cada una de estas preocupaciones de seguridad. Los pacientes también se evalúan con respecto al resultado clínico, y particularmente la reducción de la masa tumoral como se demuestra por IRM u otro método de captura de imágenes.

Se ha demostrado que los anticuerpos anti PSCA son seguros y eficaces. Los ensayos de fase II confirman la eficacia y refinan la dosificación óptima.

Ejemplo de referencia 32

Interferencia de ARN (ARNi)

Se implementa la tecnología de interferencia de ARN (ARNi) a diversos ensayos celulares relevantes para la oncología. ARNi es un mecanismo de silenciamiento génico posttranscripcional activado por ARN bicatenario (ARNbc). ARNi induce degradación de ARNm específica que conduce a cambios en la expresión de proteínas y posteriormente en la función génica. En células de mamífero, estos ARNbc denominados ARN de interferencia cortos (ARNip) tienen la composición correcta para activar la ruta de ARNi que se dirige a degradación, específicamente algunos ARNm. Véase, Elbashir S. M., et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs Mediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells, Nature 411(6836): 494-8 (2001). Por lo tanto, se usa tecnología de ARNi con éxito en células de mamífero para silenciar genes diana.

La pérdida de control de la proliferación celular es un distintivo de las células cancerosas; por lo tanto, la evaluación del papel de PSCA en los ensayos de supervivencia/proliferación celular es relevante. En consecuencia, se usa ARNi para investigar la función del antígeno PSCA. Para generar ARNip para PSCA, se usaron algoritmos que predecían oligonucleótidos que mostraban los parámetros moleculares críticos (contenido de G:C, temperatura de fusión, etc.) y tiene la capacidad de reducir significativamente los niveles de expresión de la proteína PSCA cuando se introducen en células. De acuerdo con este ejemplo, se usan composiciones de ARNip de PSCA que comprenden ARNip (ARN de interferencia corto, bicatenario) que corresponde a la secuencia de ORF de ácido nucleico de la proteína PSCA o subsecuencias de la misma. Por lo tanto, se usan subsecuencias de ARNip de esta manera que son generalmente de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o más de 35 nucleótidos de ARN de longitud. Estas secuencias de ARNip son complementarias y no complementarias de al menos una parte de la secuencia codificante de ARNm. En una realización preferida, las subsecuencias son de 19-25 nucleótidos de longitud, más preferentemente 21-23 nucleótidos de longitud. En realizaciones preferidas, estos ARNip consiguen la supresión de antígeno PSCA en células que expresan la proteína y tienen efectos funcionales como se describe posteriormente.

El ARNip seleccionado (oligo PSCA.b) se ensayó en numerosas líneas celulares en el ensayo de MTS de supervivencia/proliferación (que mide la actividad metabólica celular). Los ensayos colorimétricos basados en tetrazolio (es decir, MTS) detectan células viables exclusivamente, ya que las células vivas son metabólicamente activas y por lo tanto pueden reducir las sales de tetrazolio a compuestos de formazán coloreados; las células muertas, sin embargo, no. Además, este oligo PSCA.b consiguió supresión del antígeno PSCA en células que expresaban la proteína y tenían efectos funcionales como se describe posteriormente usando los siguientes protocolos.

Transfecciones de ARNip de mamífero: el día antes de la transfección de ARNip, las diferentes líneas celulares se sembraron en placas en medios (RPMI 1640 con FBS 10 % sin antibióticos) a 2 x 103 células/pocillo en 80 l (formato de placa de 96 pocillos) para el ensayo de supervivencia/MTS. En paralelo con el oligo de ARNip específico de PSCA, se incluyeron las siguientes secuencias en cada experimento como controles: a) células transfectadas con simulación con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y tampón de hibridación (sin ARNip); b) ARNip específico de Luciferasa 4 (secuencia diana: 5’-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3’) (SEC ID Nº: 77); y c) ARNip específico de Eg5 (secuencia diana: 5’-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3’) (SEC ID Nº: 78). Se usaron ARNip a 10 nM y Lipofectamine 2000 1 g/ml de concentración final.

El procedimiento fue el siguiente: los ARNip se diluyeron en primer lugar en OPTIMEM (medio de transfección sin suero, Invitrogen) a 0,1 M (concentrado 10 veces) y se incubó a TA 5-10 minutos. Se diluyó Lipofectamine 2000 a 10 g/ml (concentrado 10 veces) para el número total de transfecciones y se incubó 5-10 minutos a temperatura ambiente (TA). Se mezclaron cantidades apropiadas de Lipofectamine 2000 concentrado 10 veces 1:1 con ARNip concentrados 10 veces diluido y se incubó a TA durante 20-30 segundos (solución de transfección concentrada 5 veces). Se añadieron 20 l de las soluciones de transfección concentradas 5 veces a las muestras respectivas y se incubó a 37 ºC durante 96 horas antes de su análisis.

Ensayos de MTS: el ensayo de MTS es un método colorimétrico para determinar el número de células viables en ensayos de proliferación, citotoxicidad o quimiosensibilidad basándose en un compuesto de tetrazolio [3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS(b)] y un reactivo de acoplamiento de electrones (etosulfato de fenacina; PES). Se realizaron ensayos añadiendo una cantidad pequeña del reactivo de solución directamente a pocillos de cultivo, incubando durante 1-4 horas y después registrando la absorbancia a 490 nm con un lector de placas de 96 pocillos. La cantidad de producto de formazán coloreado como se mide por la cantidad de absorbancia a 490 nm es directamente proporcional a la actividad mitocondrial y/o el número de células vivas en cultivo.

Para abordar la función de PSCA en células, se silencia PSCA transfectando las líneas celulares de PSCA que expresan de forma endógena.

Otra realización de la invención es un método para analizar la proliferación celular relacionada con PSCA, que es la medición de la síntesis de ADN como un marcador para proliferación. Se usan precursores de ADN marcados (es decir 3H-Timidina) y se cuantifica su incorporación a ADN. La incorporación del precursor marcado a ADN es directamente proporcional a la cantidad de división celular que se produce en el cultivo. Otro método usado para medir la proliferación celular es realizar ensayos clonogénicos. En estos ensayos, se siembran en placas un número definido de células en la matriz apropiada y se cuenta el número de colonias formadas después de un periodo de crecimiento después del tratamiento con ARNip.

En la validación de diana de cáncer de PSCA, se consideran la complementación del análisis de supervivencia/proliferación celular con apoptosis y estudios de realización de perfiles de ciclo celular. El distintivo bioquímico del proceso apoptótico es la fragmentación de ADN genómico, un acontecimiento irreversible que compromete a la célula a morir. Un método para observar ADN fragmentado en células es la detección inmunológica de fragmentos de ADN en complejo con histona mediante un inmunoensayo (es decir ELISA de detección de muerte celular) que mide el enriquecimiento de fragmentos de ADN en complejo con histona (mono y oligonucleosomas) en el citoplasma de células apoptóticas. Este ensayo no requiere el premarcaje de las células y puede detectar la degradación de ADN en células que no proliferan in vitro (es decir células tumorales recién aisladas).

Las moléculas efectoras más importantes para desencadenar la muerte celular apoptótica son caspasas. Las caspasas son proteasas que cuando se activan escinden numerosos sustratos en el sitio carboxilo terminal de un resto de aspartato que media en los estadios muy tempranos de la apoptosis tras su activación. Todas las caspasas se sintetizan como proenzimas y su activación implica escisión en restos de aspartato. En particular, la caspasa 3 parece desempeñar un papel central en el inicio de acontecimientos celulares de la apoptosis. Los ensayos para determinación de la activación de caspasa 3 detectan acontecimientos tempranos de la apoptosis. Después de los tratamientos con ARNi, la detección con transferencia de Western de presencia de caspasa 3 activa o escisión proteolítica de productos (es decir PARP) hallados en células apoptóticas apoya adicionalmente una inducción activa de la apoptosis. Debido a que los mecanismos celulares que dan como resultado la apoptosis son complejos, cada uno tiene sus ventajas y limitaciones. La consideración de otros criterios/puntos finales tales como morfología celular, condensación de cromatina, formación de ampollas de la membrana, cuerpos apoptóticos ayudan a apoyar adicionalmente que la muerte celular es apoptótica. Ya que no todas las dianas génicas que regulan el crecimiento

5 celular son antiapoptóticas, el contenido de ADN de células permeabilizadas se mide para obtener el perfil de contenido de ADN o perfil de ciclo celular. Los núcleos de células apoptóticas contienen menos ADN debido a la fuga fuera del citoplasma (población sub G1). Además, el uso de tinciones de ADN (es decir, yoduro de propidio) también diferencia entre las diferentes fases del ciclo celular en la población celular debido a la presencia de diferentes cantidades de ADN en G0/G1, S y G2/M. En estos estudios pueden cuantificarse las subpoblaciones.

10 Para el gen de PSCA, los estudios de ARNi facilitan el entendimiento de la contribución del producto génico en rutas de cáncer. Dichas moléculas de ARNi activas tienen uso en la identificación de ensayos para explorar con respecto a MAb que son productos terapéuticos antitumorales activos. Además, se administran ARNip como productos terapéuticos a pacientes de cáncer para reducir el crecimiento maligno de varios tipos de cáncer, incluyendo los

15 enumerados en la Tabla 1. Cuando el PSCA desempeña un papel en la supervivencia celular, proliferación celular, tumorogénesis o apoptosis, se usa como una diana para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.

Ejemplo de referencia 33

20 Detección de proteína PSCA en muestras de ensayos de paciente con cáncer por IHC

Se detectó expresión de la proteína PSCA en muestras de ensayo tumorales de pacientes con cáncer usando el anticuerpos HA1-4.117. Se cortaron tejidos incluidos en parafina, fijados en formalina, en secciones de 4

25 micrómetros y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se desceraron, se rehidrataron y se trataron con solución de recuperación de antígenos (Solución Citra de Recuperación de Antígenos; BioGenex, 4600 Norris Canyon Road, San Ramon, CA, 94583) a alta temperatura. Las secciones se incubaron después en anticuerpo anti PSCA monoclonal humano conjugado con fluoresceína, Ha1-4.117, durante 16 horas a 4 ºC. Los portaobjetos se lavaron tres veces en tampón y se incubaron adicionalmente con antifloresceína de Conejo durante una 1 hora y,

30 después de lavar en tampón, se sumergieron en anticuerpo secundario de cabra antiinmunoglobulina de conejo conjugado con peroxidasa DAKO EnVision+™ (DAKO Corporation, Carpenteria, CA) durante 30 minutos. Las secciones se lavaron después en tampón, se revelaron usando el kit DAB (SIGMA Chemicals), se contratiñeron usando hematoxilina, y se analizaron por microscopía de campo claro. Los resultados muestran la expresión de PSCA en las células tumorales de adenocarcinoma de próstata (A, B), carcinoma transicional de vejiga (C) y

35 adenocarcinoma ductal pancreático (D). Estos resultados indican que PSCA se expresa en cánceres humanos y que los anticuerpos dirigidos a este antígeno son útiles como reactivos de diagnóstico (Figura 17).

Estos resultados indican que PSCA es una diana para aplicaciones de diagnóstico, pronóstico y terapéuticas en cáncer.

40 A lo largo de la presente solicitud, se hace referencia a diversos contenidos de datos de sitios web, publicaciones, solicitudes de patente y patentes. (Los sitios web se indican por su Localizador Uniforme de Recursos, o URL, direcciones en la Web).

45 Tablas

Tabla I: tejidos que expresan PSCA cuando son malignos.

Próstata Páncreas Vejiga Riñón Colon Pulmón Ovario Mama

TABLA II: abreviaturas de aminoácidos

UNA LETRA

TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO

F

Phe fenilalanina

L

Leu leucina

S

Ser serina

imagen43

imagen44

TABLA IV: Motivos/Supermotivos de HLA de Clase I/II TABLA IV (A): supermotivos/motivos de HLA de Clase I

SUPERMOTIVO

POSICIÓN POSICIÓN POSICIÓN

2 (Anclaje Primario)

3 (Anclaje Primario) C Terminal (Anclaje Primario)

A1

TILVMS FWY

A2

LIVMATQ IVMATL

A3

VSMATLI RK

A24

YFWIVLMT FIYWLM

B7

P VILFMWYA

B27

RHK FYLWMIVA

B44

ED FWYLIMVA

B58

ATS FWYLIVMA

B62

QLIVMP FWYMIVLA

MOTIVOS

A1

TSM Y

A1

DEAS Y

A2.1

LMVQIAT VLIMAT

A3

LMVISATFCGD KYRHFA

A11

VTMLISAGNCDF KRYH

A24

YFWM FLIW

A*3101

MVTALIS RK

A*3301

MVALFIST RK

A*6801

AVTMSLI RK

B*0702

P LMFWYAIV

B*3501

P LMFWYIVA

B51

P LIVFWYAM

B*5301

P IMFWYALV

B*5401

P ATIVLMFWY

Se prefieren los restos en negrita, se prefieren menos los restos en cursiva. Un péptido se considera portador de motivo si tiene anclajes primarios en cada posición de anclaje primaria para un motivo o supermotivo como se especifica en la tabla anterior.

TABLA IV (B): supermotivo de HLA de Clase II

1

6 9

W, F, Y, V,.I, L

A, V, I, L, P, C, S, T A, V, I, L, C, S, T, M, Y

imagen45

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imagen48

imagen49

TABLA IV (F):Sumario de supertipos de HLA

Frecuencias fenotípicas globales de supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas Especificidad Frecuencia fenotípica

Supertipo Posición 2 Extremo C Caucásico Negro Japonés Chino Hispan Promedio

Terminal N.A. o

B7 P AILMVFWY 43,2 55,1 57,1 43,0 49,3 49,5

A3 AILMVST RK 37,5 42,1 45,8 52,7 43,1 44,2

A2 AILMVT AILMVT 45,8 39,0 42,4 45,9 43,0 42,2

A24 YF FI (YWLM) 23,9 38,9 58,6 40,1 38,3 40,0

(WIVLMT)

B44 E (D) FWYLIMVA 43,0 21,2 42,9 39,1 39,0 37,0

A1 TI (LVMS) FWY 47,1 16,1 21,8 14,7 26,3 25,2

B27 RHK FYL (WMI) 28,4 26,1 13,3 13,9 35,3 23,4

B62 QL (IVMP) FWY (MIV) 12,6 4,8 36,5 25,4 11,1 18,1

B58 ATS FWY (LIV) 10,0 25,1 1,6 9,0 5,9 10,3

TABLA IV (G):

Cobertura de población calculada proporcionada por diferentes combinaciones de supertipo de HLA Supertipos de HLA Frecuencia fenotípica

Caucásicos Negros N.A Japoneses Chinos Hispanos Promedio

83,0 86,1 87,5 88,4 86,3 86,2

A2, A3 y B7 99,5 98,1 100,0 99,5 99,4 99,3

A2, A3, B7, A24, 99,9 99,6 100,0 99,8 99,9 99,8

844 y A1

A2, A3, B7, A24,

B44, A1, 827,

B62, y B 58

Los motivos indican los restos que definen especificidades de supertipo. Los motivos incorporan restos que se han determinado basándose en datos publicados que se reconocen por múltiples alelos dentro del supertipo. Los restos entre paréntesis son restos adicionales que también se ha predicho que se toleran por múltiples alelos dentro del supertipo.

Tabla V: motivos de aparición frecuente

Nombre

% de identidad promedio Descripción Función Potencial

zf-C2H2

34 % Dedo de cinc, tipo C2H2 La proteína de unión a ácido nucleico actúa como factor de transcripción, probable localización nuclear

citocromo_b_N

68 % Citocromo b(Nterminal)/b6/petB oxidasa unida a membrana, genera superóxido

Ig

19 % dominio de inmunoglobulina los dominios son de cien aminoácidos de longitud e incluyen un enlace disulfuro intradominio conservado.

WD40

18 % dominio WD, repetición Gbeta repeticiones en tándem de aproximadamente 40 restos, conteniendo cada una un motivo Trp-Asp. Actúan en la transducción de señales e interacción de proteínas

PDZ

23 % dominio PDZ puede actuar en la dirección de moléculas de señalización a sitios submembrana

LRR

28 % Repetición Rica en Leucina motivos de secuencia corta implicados en interacciones proteína-proteína

Pquinasa

23 % Dominio proteína quinasa núcleo catalítico conservado común para tanto serina/treonina como para proteínas tirosina quinasas que contienen un sitio de unión a ATP y un sitio catalítico

PH

16 % Dominio PH homología de plextrina implicada en señalización intracelular o como constituyentes del citoesqueleto

EGF

34 % Dominio de tipo EGF 30-40 aminoácidos de longitud hallado en el dominio extracelular de proteínas unidas a membrana o en proteínas secretadas

Rvt

49 % Transcriptasa inversa (ARN polimerasa dependiente de ARN)

Ank

25 % repetición de Ank Proteína citoplasmática, asocia proteínas integrales de membrana con el citoesqueleto

Oxidored_q1

32 % NADHUbiquinona/plastoquinona (complejo I), diversas cadenas asociado a membrana. Implicado en la traslocación de protones a través de la membrana

mano Ef

24 % mano EF dominio de unión a calcio, consiste en un bucle de 12 restos flanqueado en ambos lados por un dominio alfa helicoidal de 12 restos

Rvp

79 % Aspartil proteasa retroviral Aspartil proteasas o proteasas ácidas, centradas en un resto de aspartilo catalítico

Colágeno

42 % Repetición de triple hélice de colágeno (20 copias) proteínas estructurales extracelulares implicadas en la formación de tejido conectivo. La secuencia consiste en la G-X-Y y las cadenas polipeptídicas forman una triple hélice.

Fn3

20 % Dominio de fibronectina de tipo III Localizado en la región de unión a ligando extracelular de receptores y es de aproximadamente 200 restos de aminoácidos de longitud con dos pares de cisteínas implicados en enlaces disulfuro

7tm_1

19 % 7 dominios transmembrana (familia de rodopsina) siete regiones transmembrana hidrófobas, con el receptor localizado en el extremo N terminal de forma extracelular mientras que el extremo C terminal es citoplasmático. Señaliza a través de proteínas G.

Tabla VI: límites exónicos del transcrito PSCA v.1

Número Exón

de Inicio Final Longitud

1

10 69 60

2

70 177 108

3

178 985 808

Tabla VII: valores de IFM de cada punto de datos usado para cálculo de afinidad.

Valores de IFM

nM

PSCA PSCA PDP3 T=8+4 PDP3 T=8+4

40

869,3 777,06 795,24 661,66

20

875,19 835,94 816,34 824,07

10

856,28 847,83 777,85 842,72

5

866,94 817,45 758,15 818,83

2,5

835,47 769,79 742,45 783,5

1,25

813,12 782,84 806,2 792,44

0,625

766,52 689,3 683,64 666,28

imagen50

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3

   imagen4

   imagen5

   Figura 1E-2

   imagen6

   Figura 1F. La secuencia de ADNc (SEC ID Nº: 11) y aminoácidos (SEC ID Nº: 12) de PSCAv.6 La secuencia Kozak se muestra en negrita, la metionina de partida está subrayada.

   imagen7

   150

   Figura 1F-2

   imagen8

   Figura 1G. Variantes de SNP de PSCA v.2, PSCA v.7 a v.18

   Variante

   Posición de ácido nucleico Variación de ácido nucleico Variación de aminoácido

   PSCA v.7

   367 C/T Variante silenciosa

   PSCA v.8

   424 A/C Variante silenciosa

   PSCA v.9

   495 C/G Variante silenciosa

   PSCAv.10

   499 C/T Variante silenciosa

   PSCAv.11

   563 C/T Variante silenciosa

   PSCA v. 12

   567 G/A Variante silenciosa

   PSCA v.13

   627 G/A Variante silenciosa

   PSCAv.14

   634 T/G Variante silenciosa

   PSCA v.15

   835 G/A Variante silenciosa

   PSCA v.16

   847 G/A Variante silenciosa

   PSCAv.17

   878 G/A Variante silenciosa

   PSCA v.18

   978 C/G Variante silenciosa

   151 Figura 1H. Variantes de SNP de PSCA v.4, PSCA v.19 a v.30

   Variante

   Posición de ácido nucleico Variación de ácido nucleico Posición de aminoácido Variación de aminoácido

   PSCA v.19

   521 CAT 33 P/L

   PSCA v.20

   578 A/C 52 Y/S

   PSCA v.21

   649 C/G 76 H/D

   PSCAv.22

   653 CAT 77 P/L

   PSCA v.23

   717 C/T 98 Variante silenciosa

   PSCAv.24

   721 G/A 100 A/T

   PSCAv.25

   781 G/A 120 G/S

   PSCAv.26

   788 T/G 122 I/S

   PSCAv.27

   989 G/A 189 R/Q

   PSCA v.28

   1001 G/A Variante silenciosa

   PSCA v.29

   1032 G/A Variante silenciosa

   PSCA v.30

   1132 C/G Variante silenciosa

   152

   imagen9

   imagen10

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