ES2549760T3

ES2549760T3 - Anticuerpos de c-Met

Info

Publication number: ES2549760T3
Application number: ES09752708.9T
Authority: ES
Inventors: Julian Davies; Ling Liu; Jirong Lu; Peter Edward Vaillancourt; Mark Andrew Wortinger; Wei Zeng
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2009-11-18
Publication date: 2015-11-02
Anticipated expiration: 2029-11-18
Also published as: CY1116886T1; DK2358755T3; KR20110074612A; AU2009316742B2; NZ592215A; TWI477284B; KR101334450B1; ES2663825T3; BRPI0922800A2; MX2011005400A; CN102216333A; PA8849001A1; US8398974B2; TW201023885A; CA2743508C; ZA201103586B; WO2010059654A1; JP5688027B2; AR074360A1; EP2963058A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal de c-Met, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR), en el que LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53) , LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54), LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos QVYSGYPLT (SEC ID Nº 56), HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65), HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 68), y HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos ANWLDY (SEC ID Nº 69).

Description

Anticuerpos de c-Met

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a c-Met y a su uso en el tratamiento de afecciones y trastornos en los que la patogenia está mediada por este receptor.

c-Met, un miembro de la superfamilia de tirosina quinasa, es el receptor para el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). La unión de HGF a c-Met conduce a la dimerización o multimerización del receptor, la fosforilación de múltiples residuos de tirosina en la región intracelular, la activación catalítica, y la señalización aguas abajo. c-Met también se activa a través de mecanismos independientes de ligando, incluyendo sobreexpresión del receptor, amplificación y mutación. La activación de c-Met aumenta la proliferación celular, la migración, la morfogénesis, la supervivencia (incluyendo la protección de la apoptosis) y la síntesis de la proteasa, las características que están asociadas con el fenotipo de células invasoras y desenlaces clínicos malos y la resistencia a fármacos en pacientes con cáncer. La vía de señalización de c-Met es una de las vías mal reguladas con más frecuencia en los cánceres humanos, y se produce en casi todos los tipos de tumores sólidos.

La publicación internacional PCT WO 09/007427 divulga anticuerpos frente c-Met humanizados con injertos de CDR. El anticuerpo murino 224G11 divulgado en dicha publicación no se unía al dominio c-Met Sema. Otras propiedades funcionales del derivado de IgG1 humanizada de este anticuerpo murino denominado Mab h224G11, se comunican en los resúmenes nº 835 (datos in vitro) y 2792 (datos in vivo) y sus pósteres adjuntos presentados en la reunión de la American Association for Cancer Research (Denver, CO) en Abril de 2009. Estos resúmenes y pósteres divulgan que el Mab h224G11 bivalente está desprovisto de propiedades agonistas, se comporta como antagonista completo de c–Met, y disminuye potencialmente la dimerización de c–Met. Se notifica que 224G11 murino regula por disminución c–Met y bloquea la fosforilación de c–Met in vivo. En el caso de otros receptores, la dimerización es un requisito previo para la internalización y degradación del receptor. Estos resúmenes y pósteres no divulgan datos relativos a la internalización de c-Met. Además, el epítopo al que el anticuerpo humanizado se une dentro de c-Met no se identifica.

La publicación internacional PCT WO 05/016382 También divulga anticuerpos c-Met, pero no identifica el epítopo (s) al que se unen los anticuerpos. Se proporciona un ejemplo de mapeo de epítopos, sin embargo, los resultados presentados indican simplemente que anticuerpos frente a c-Met se unen a un epítopo común, mientras el séptimo anticuerpo frente a c-Met se une a un epítopo distinto. Los epítopos particulares a los que se unen estos anticuerpos c-Met no se proporcionan.

Existe una necesidad de anticuerpos antagonistas humanos frente a c-Met, cuya unión a la cadena α de c-Met humano facilita la internalización del receptor de la superficie celular, en presencia y / o ausencia de HGF. Existe una necesidad de anticuerpos antagonistas frente a c-Met humanos, cuya unión a la cadena α de c-Met humano facilita la internalización del receptor de la superficie celular, en células que comprenden variantes de c-Met que contienen ganancia de mutaciones de función. También hay una necesidad de anticuerpos antagonistas frente a c-Met humanos que inducen la degradación de c-Met y la reducción de c-Met fosforilados. Tales actividades antagonistas podrían disminuir el número de sitios de unión disponibles para HGF en las superficies de células tumorales, y terminar la activación de la vía causada por la sobreexpresión, amplificación, o mutación de c-Met. Al mismo tiempo, dichos anticuerpos antagonistas deben inhibir la unión de HGF a c-Met y la activación de c-Met inducida por HGF, e inducir poca o ninguna actividad agonista de sí mismos.

Los compuestos anticuerpos de la presente invención satisfacen estas necesidades. Se unen a epítopos en la cadena el α del dominio Sema de c-Met humano, inhibiendo la unión de HGF a c-Met y la activación del receptor, mientras que induce poca o ninguna actividad agonista. Los anticuerpos de la presente invención también inducen la internalización del receptor en presencia o ausencia de HGF y también en células que comprenden variantes de c-Met que contienen ganancia de mutaciones de funciones. Inducen la degradación de c-Met e inducen la reducción de c-Met humano fosforilado e inhiben la proliferación dependiente de HGF y e independiente e HGF de las células tumorales que expresan este receptor. En vista de estas propiedades, estos compuestos de anticuerpos deben ser terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres mediados por c-Met a través de una variedad de diferentes mecanismos.

Además, los presentes compuestos de anticuerpos poseen un número de otras propiedades deseables. Exhiben una afinidad (KD) alta por c-Met, bloquean la fosforilación de c-Met mediada por HGF y la señalización corriente abajo, la proliferación celular y la migración celular; e inducen únicamente fosforilación débil de c-Met, mientras inducen poca

o ninguna actividad agonista biológica similar a HGF, tal como la inducción de la proliferación de células tumorales, motilidad, invasión, tubulogénesis, angiogénesis, o efectos antiapoptóticos. Inhiben la activación de la vía de c-Met tanto dependiente de ligando (HGF) como independiente y de ligando. Adicionalmente, los compuestos de anticuerpos de la presente invención se unen preferentemente al dominio extracelular (DEC) de c-Met humano en comparación con los DEC de los receptores estrechamente relacionados Ron y Plexina A2, y no causan "desprendimiento" del DEC de c-Met.

Según la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal frente a c-Met, o fragmento de unión a

antígeno del mismo, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR), en el que LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53), LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54), LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos QVYSGYPLT (SEC ID Nº 56), HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65), HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 68), y HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos ANWLDY (SEC ID Nº 69).

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención se une a un epítopo dentro de la cadena α de c-Met humano e induce la internalización de c-Met humano de la superficie celular.

Más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención induce internalización independiente del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) del c-Met de la superficie celular.

Incluso más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención se une dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) 121VVDTYYDDQL130 (SEC ID Nº 77),

b) 131ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 78),

c) 179ALGAKVLSSVKDRFINF195 (SEC ID Nº 79), y

d) 216VRRLKETKDGFM227 (SEC ID Nº 80).

Se prefiere que el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención se une dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a.: 123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81),

b.: 144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82),

c.: 192FINF195 (SEC ID Nº 83), y

d.: 220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84).

Aún más preferido es un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención que se une una secuencia de aminoácidos dentro del epítopo conformacional que se caracteriza por 123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81), 144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82), 192FINF195 (SEC ID Nº 83) y 220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84) inclusive.

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5 y la HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 17.

Se prefiere que el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda una cadena ligera que tiene una región constante kappa y una cadena pesada que tiene una región constante de cadena pesada IgG4.

La cadena ligera está codificada preferiblemente por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 35, y la cadena pesada está codificada preferiblemente por la secuencia de polinucleótido de SEC ID Nº 47.

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención comprende dos cadenas ligeras codificadas por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 35 y dos cadenas pesadas codificadas por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 47.

Más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención tiene una cadena ligera que es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 35; y una cadena pesada que es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 47.

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, comprende dos cadenas ligeras, en las que el ácido amino de la cadena ligera es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 35; y dos cadenas pesadas en LAS que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº 47.

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y una cadena pesada que tiene una región constante de LA cadena pesada de IgG4.

Incluso más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención comprende dos cadenas ligeras que tienen la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y dos cadenas pesadas que tienen una región constante de cadena pesada de IgG4.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, la presente invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención para uso en terapia.

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención es para uso en el tratamiento del cáncer en un ser humano.

Más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención es para tratar cáncer gástrico, de riñón, de colon, colorrectal, de cabeza y cuello, de próstata, melanoma o de pulmón.

Por consiguiente, la presente invención proporciona:

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que:

a) se une a un epítopo dentro de la cadena α de c-Met humano y

b) induce la internalización del c-Met humano de la superficie celular.

Uno cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmento de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce la internalización independiente del factor de crecimiento de hepatocitos de c-Met humano de la superficie celular. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que induce la internalización de c-Met humano en las células que comprenden una variante de c-Met humano que contiene una ganancia mutación de función. La ganancia de la mutación de función puede ser una mutación del dominio quinasa de c-Met M149T o mutación en el dominio yuxtamembranal R988C.

Cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce al menos un 40 % de internalización en las células de c-Met humano de la superficie celular. Cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce al menos un 45 % de internalización en las células de c-Met humano de la superficie celular. Cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce al menos un 50 % de internalización en las células de c-Met humano de la superficie celular. Cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce al menos un 55 % de internalización en las células de c-Met humano de la superficie celular. Cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo

o fragmento de unión a antígeno del mismo induce al menos un 60 % de internalización en las células de c-Met humano de la superficie celular. Cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce al menos un 65 % de internalización en las células de c-Met humano. Cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce al menos un 70 % de internalización en las células de c-Met humano de la superficie celular.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que induce la reducción del c-Met total en las células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que induce reducción del c-Met total en células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización

preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que induce reducción del c-Met total en células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que induce la reducción del c-Met fosforilado en las células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se une a la cadena α del c-Met humano en sustancialmente al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 28 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 40, o que se une a la cadena α del c-Met humano en sustancialmente al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 29 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, con exclusión de los que comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 26 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 38, en el que el epítopo comprende uno o más residuos de aminoácidos dentro de 144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82) inclusive.

Uno cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno, en el que el epítopo comprende además uno o más residuos de aminoácidos dentro de 123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81) inclusive.

Uno cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno, en el que el epítopo comprende además uno o más residuos de aminoácidos dentro de 192FINF195 (SEC ID Nº 83) inclusive.

Uno cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno, en el que el epítopo comprende además uno o más residuos de aminoácidos dentro de 220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84) inclusive.

Uno cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) 121VVDTYYDDQL130 (SEC ID Nº 77),

b) 131ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 78),

c) 179ALGAKVLSSVKDRFINF195 (SEC ID Nº 79), y

d) 216VRRLKETKDGFM227 (SEC ID Nº 80), inclusive.

a) 123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81),

b) 144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82),

c) 192FINF195 (SEC ID Nº 83), y

d) 220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84), inclusive.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión al antígeno del mismo que se unen a una secuencia de aminoácidos dentro del epítopo caracterizado por 121VVDTYYDDQL140 (SEC ID Nº 77), 131ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 78), 179ALGAKVLSSVKDRFINF195 (SEC ID Nº 79), y 216VRRLKETKDGFM227 (SEC ID Nº 80), inclusive.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión al antígeno del mismo que se unen a una secuencia de aminoácidos dentro del epítopo caracterizado por 123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81), 144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82), 192FINF195 (SEC ID Nº 83), y 220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84) inclusive.

Uno cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une dentro de una secuencia de aminoácidos de 95CFPCQDCSSKA105 (SEC ID Nº 86) inclusive.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, con exclusión de los que comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 29 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 41, en el que el epítopo comprende uno o más residuos de aminoácidos dentro de 95CFPCQDCSSKA105 (SEC ID Nº 86) inclusive.

Una cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se une a c-Met humano, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR),

en el que dichas tres LCDR y dichas tres HCDR se seleccionan del grupo que consiste en:

a) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49);

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos GTSX1LX2S (SEC ID Nº 87), en el que X1 es Y o R, y X2 es

A o R; LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51); HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59); HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIYPVTGDTYYX7EX8FKG (SEC ID Nº 90), en la que X7

es N, 1, o R, y X8es K o P; y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GYGAFX9Y (SEC ID Nº 91), en la que X9 es Y o F; y b) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVX3SIYLH (SEC ID Nº 88), en la que X3 es S o

R; LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54); LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos X4X5YX6GYPLT (SEC ID Nº 89), en la que X4 es I o Q, X5

es Q o V, y X6es S o R; HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65); HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVNPX10RX11X12TTYNQKFEG (SEC ID Nº 92), en la que

X10 es N o Y, X11es G o R, y X12 es G o S; y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos X13NX14LDY (SEC ID Nº 93), en el que X13 es Y o R, y X14 es W o 1;

en el que dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo dentro de la

cadena α de dicho c-Met humano e induce la internalización de c-Met humano de la superficie celular. Una cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se une a c-Met humano, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR), en el que el anticuerpo comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (LCDR), en el que

LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49);

LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos GTSX1LX2S (SEC ID Nº 87), en el que X1 es Y o R, y X2 es A o

R;

LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51);

HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59);

HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos WIYPVTGDTYYX7EX8FKG (SEC ID Nº 90), en la que X7 es N,

1, o R, y X8es K o P; y

HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos GYGAFX9Y (SEC ID Nº 91), en la que X9 es Y o F. Una cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se une a c-Met humano, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera

(LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR), en el que

LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVX3SIYLH (SEC ID Nº 88); en la que X3 es S o R;

LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54);

LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos X4X5YX6GYPLT (SEC ID Nº 89), en la que X4 es I o Q, X5 es Q

o V, y X6 es S o R;

HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65);

HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos RVNPX10RX11X12TTYNQKFEG (SEC ID Nº 92), en la que X10

es N o Y, X11 es G o R, y X12 es G o S; y HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos X13NX14LDY (SEC ID Nº 93), en el que X13 es Y o R, y X14 es W o I; Una cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se une a c-Met humano, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR), y en el que dichas tres LCDR y dichas tres HCDR se seleccionan del grupo que consiste en:

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos GTSYLAS (SEC ID Nº 50);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51);

HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59);

HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIYPVTGDTYYNEKFKG (SEC ID Nº 60); y

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GYGAFYY (SEC ID Nº 61);

b) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49);

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos GTSYLAS (SEC ID Nº 50);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51);

HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59);

HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIYPVTGDTYYIEKFKG (SEC ID Nº 62); y

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GYGAFFY (SEC ID Nº 63);

c) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49);

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos GTSRLRS (SEC ID Nº 52);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51);

HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59);

HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIYPVTGDTYYREPFKG (SEC ID Nº 64); y

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GYGAFYY (SEC ID Nº 61);

d) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53);

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos IQYSGYPLT (SEC ID Nº 55);

HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65);

HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVNPNRGGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 66); y

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos TNWLDY (SEC ID Nº 67);

e) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53);

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QVYSGYPLT (SEC ID Nº 56);

HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65);

HCDR12 que comprende la secuencia de aminoácidos RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 68); y

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ANWLDY (SEC ID Nº 69); y f) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVRSIYLH (SEC ID Nº 57); LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54); LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QVYRGYPLT (SEC ID Nº 58); HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65); HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVNPYRGSTTYNQKFEG (SEC ID Nº 70); y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ANILDY (SEC ID Nº 71); y

cadena α de dicho c-Met humano e induce la internalización de c-Met humano de la superficie celular. Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en:

a) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49); LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos GTSYLAS (SEC ID Nº 50); LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51); HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59); HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIYPVTGDTYYNEKFKG (SEC ID Nº 60); y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GYGAFYY (SEC ID Nº 61); b) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49); LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos GTSYLAS (SEC ID Nº 50); LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51); HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59); HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIYPVTGDTYYIEKFKG (SEC ID Nº 62); y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GYGAFFY (SEC ID Nº 63); c) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49); LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos GTSRLRS (SEC ID Nº 52); LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51); HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59); HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WIYPVTGDTYYREPFKG (SEC ID Nº 64); y HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos GYGAFYY (SEC ID Nº 61);

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada en el que dichas tres HCDR se seleccionan del grupo que consiste en:

a) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53); LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54); LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos IQYSGYPLT (SEC ID Nº 55); HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65); HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVNPNRGGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 66); y

CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos TNWLDY (SEC ID Nº 67);

b) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53);

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QVYSGYPLT (SEC ID Nº 56);

HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65);

HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 68); y

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ANWLDY (SEC ID Nº 69); y

c) LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVRSIYLH (SEC ID Nº 57);

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QVYRGYPLT (SEC ID Nº 58);

HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65);

HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos RVNPYRGSTTYNQKFEG (SEC ID Nº 70); y

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ANILDY (SEC ID Nº 71). Una cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR), en el que:

LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53);

LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos IQYSGYPLT (SEC ID Nº 55);

HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65);

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos TNWLDY (SEC ID Nº 67); Una cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR), en el que:

LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53);

LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54);

LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QVYSGYPLT (SEC ID Nº 56);

HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65);

HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ANWLDY (SEC ID Nº 69); y Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno los mismos, que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en el que dicha LCVR y dicha HCVR, respectivamente, comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

a) SEC ID Nº 94 y SECID Nº 96; y

b) SEC ID Nº 95 y SEC ID Nº 97, en el que dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo dentro de la cadena α de dicho c-Met humano e induce la internalización de c-Met humano de la superficie celular. Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que

comprenden una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en 9

el que dicha LCVR comprende la SEC ID Nº 94 y dicha HCVR comprende la SEC ID Nº 96. Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en el que dicha LCVR comprende la SEC ID Nº 95 y dicha HCVR comprende la SEC ID Nº 97. 5 Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en el que dicha LCVR y dicha HCVR comprenden secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste

en: a) LCVR es SEC ID Nº 1 y HCVR es SEC ID Nº 13; b) LCVR es SEC ID Nº 2 y HCVR es SEC ID Nº 14;

10 c) LCVR es SEC ID Nº3 y HCVR es SEC ID Nº 15; d) LCVR es SEC ID Nº 4 y HCVR es SEC ID Nº 16; e) LCVR es SEC ID Nº 5 y HCVR es SEC ID Nº 17; y f) LCVR es SEC ID Nº 6 y LCVR es SEC ID Nº 18;

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en el 15 que dicha LCVR y dicha HCVR, respectivamente, comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a) LCVR es SEC ID Nº 1 y HCVR es SEC ID Nº 13; b) LCVR es SEC ID Nº 2 y HCVR es SEC ID Nº 14; y c) LCVR es SEC ID Nº 3 y HCVR es SEC ID Nº 15.

20 Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en el que dicha LCVR y dicha HCVR, respectivamente, comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

a) LCVR es SEC ID Nº 4 y HCVR es SEC ID Nº 16; b) LCVR es SEC ID Nº 5 y HCVR es SEC ID Nº 17; y 25 c) LCVR es SEC ID Nº6 y HCVR es SEC ID Nº 18. Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en el

que dicha LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 y dicha HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 16. Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en el

30 que dicha LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5 y dicha HCVR comprende la secuencia de

aminoácidos de SEC ID Nº 17. Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores en el que dicho anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera y la cadena pesada comprenden secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en:

35 a) la cadena ligera es la SEC ID Nº 25 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 37; b) la cadena ligera es la SEC ID Nº 26 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 38; c) la cadena ligera es la SEC ID Nº 27 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 39; d) la cadena ligera es la SEC ID Nº 28 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 40; e) la cadena ligera es la SEC ID Nº 29 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 41; y

40 f) la cadena ligera es la SEC ID Nº 30 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 42. Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores en el que dicho anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera y la cadena pesada comprenden secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en: a) la cadena ligera es la SEC ID Nº 25 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 37; 10

b) la cadena ligera es la SEC ID Nº 26 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 38; y

c) la cadena ligera es la SEC ID Nº 27 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 39.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores en el que dicho anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera y la cadena pesada comprenden secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en:

a) la cadena ligera es la SEC ID Nº 28 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 40;

b) la cadena ligera es la SEC ID Nº 29 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 41; y

c) la cadena ligera es la SEC ID Nº 30 y la cadena pesada es la SEC ID Nº 42.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, en el que dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, en el que dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, en el que dicho anticuerpo comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, en el que dicho anticuerpo comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite con cualquiera de los anticuerpos monoclonales frente a c-Met anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para la unión a c-Met. Tal anticuerpo monoclonal que compite o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir al mismo epítopo de c-Met que uno cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales frente a c-Met o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo compite on un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo compite con un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que induce la reducción del c-Met total humano y c-Met humano fosforilado en las células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos que sobreexpresan de forma constitutiva dicho c-Met humano. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que induce reducción del c-Met total humano y el c-MET humano fosforilado en células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos que sobreexpresan de forma constitutiva dicho c-Met humano, comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que induce reducción del c-Met total humano y c-Met humano fosforilado en células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos que sobreexpresan de forma constitutiva dicho c-Met humano comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que induce la reducción del c-Met total humano y c-Met humano fosforilado en las células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos que fosforilan de forma constitutiva dicho c-Met humano. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que induce reducción del c-Met total humano y el c-MET humano fosforilado en células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos que fosforilan de forma constitutiva dicho c-Met humano, comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que induce reducción del c-Met total humano y c-Met humano fosforilado en células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos que fosforilan de forma constitutiva dicho c-Met humano comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que

induce la reducción del c-Met total humano y c-Met humano fosforilado en las células tumorales independientes del factor de crecimiento de hepatocitos que son respondedores al factor de crecimiento de hepatocitos.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se une preferentemente al dominio extracelular de c-Met humano en comparación con el dominio extracelular de RON humano RON o el dominio extracelular de Plexina A2 humana.

Cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que no induce desprendimiento del dominio extracelular de c-Met humano. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que no induce desprendimiento del dominio extracelular de c-Met humano comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que no induce desprendimiento del dominio extracelular de c-Met humano comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que no protege a las células tumorales que expresan c-Met de la apoptosis inducida por estaurosporina. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que no que no protege a las células tumorales que expresan c-Met de la apoptosis inducida por estaurosporina comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que no que no protege a las células tumorales que expresan c-Met de la apoptosis inducida por estaurosporina comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que inhibe la proliferación independiente del factor de crecimiento de c-Met humano.

Uno cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que inhibe la unión del factor de crecimiento de hepatocitos humano al c-Met humano.

Uno cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que no induce actividades agonistas biológicas similares a HGF. Las actividades agonistas biológicas similares a HGF incluyen la proliferación de células tumorales, la motilidad de las células tumorales, la invasión de las células tumorales, la tubulogénesis, la angiogénesis, y los efectos anti-apoptóticos. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que no induce actividades agonistas biológicas similares a HGF, comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 41.

Una composición farmacéutica, que comprende uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Uno cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno del mismo para uso en terapia. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso en terapia comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso en terapia comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno del mismo para uso en el tratamiento de un cáncer en un ser humano. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso en el tratamiento de un cáncer en un ser humano comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso en el tratamiento de un cáncer en un ser humano comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uno cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno del mismo para uso en el tratamiento de un cáncer en un ser humano en combinación con otro agente terapéutico. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso en el tratamiento de un cáncer en un ser humano en combinación con otro agente terapéutico comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28 y la cadena pesada

comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 40. En otra realización preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso en el tratamiento de un cáncer en un ser humano en combinación con otro agente terapéutico comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 41.

Uso de uno cualquiera de los anteriores anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un ser humano.

Un procedimiento de tratamiento de un cáncer, que comprende administrar a un paciente humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Definiciones

Un anticuerpo de longitud completa tal como existe en la naturaleza, es una molécula de inmunoglobulina que comprende 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento del antígeno través de la regiones determinantes de la complementariedad (CDR) contenidas en el mismo. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Las CDR están intercaladas con regiones que están más conservadas denominadas regiones estructurales, marco ("FR"). Cada región variable de la de cadena ligera (LCVR) y región variable de la cadena pesada (HCVR) se compone de 3 CDR y 4 FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las 3 CDR de la cadena ligera se denominan "LCDR1, LCDR2 y LCDR3" y las 3 CDR de la cadena pesada se denominan "HCDR1, H CDR2, y HCDR3”. Las CDR contienen la mayor parte de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y el posicionamiento de los residuos de aminoácidos de las CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR están de acuerdo con la convención de numeración de Kabat bien conocida.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda, y se caracterizan por una región constante particular, como se conoce en la técnica. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isótopo del anticuerpo como IgG una, IgM, IgA, IgD, o IgE, respectivamente. Los anticuerpos IgG pueden dividirse además en subclases, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una región constante en particular con una secuencia bien conocida en la técnica.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" (Mab) como se aplica a los presentes compuestos de anticuerpo se refiere a un anticuerpo que se deriva de una sola copia o clon que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota, o fago, y no el procedimiento por el cual se produce. Los Mab de la presente invención existen preferiblemente en una población homogénea o sustancialmente homogénea. Los Mab completos contienen 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. Los "fragmentos de unión a antígeno" de tales anticuerpos monoclonales incluyen, por ejemplo, fragmento Fab, los fragmentos Fab', los fragmentos F(ab')2, los fragmentos Fv de cadena sencilla, y anticuerpos de un solo brazo que comprenden una cadena ligera y una cadena pesada. Los anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se pueden producir, por ejemplo, mediante tecnologías recombinantes, tecnologías de expresión en fagos, tecnologías sintéticas, por ejemplo, injerto de CDR, o combinaciones de tales tecnologías, u otras tecnologías conocidas en la técnica.

“Compuestos de anticuerpo" se refiere a los Mab y Fab divulgados en el presente documento. Los compuestos de anticuerpos adicionales que presentan propiedades funcionales similares de acuerdo con la presente invención se pueden generar por procedimientos convencionales. Por ejemplo, los ratones pueden inmunizarse con c-Met humano o fragmentos de los mismos, los anticuerpos resultantes pueden recuperarse y purificarse, y la determinación de si poseen propiedades de unión y funcionales similares a o las mismas que los compuestos de anticuerpos divulgados en el presente documento pueden evaluarse por Los procedimientos divulgados en los Ejemplos 2-19, a continuación. Los fragmentos de unión a antígeno también se pueden preparar por procedimientos convencionales. Los procedimientos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, capítulos 5 – 8 y 15, ISBN 0–87969– 314–2.

La expresión "anticuerpos manipulados humanos" se refiere a anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno, además de los compuestos de anticuerpos divulgados en el presente documento que tienen propiedades de unión y funcionales de acuerdo con la invención similares a las divulgados en el presente documento, y que tienen regiones marco que son sustancialmente humanas o completamente humanas que rodean a las CDR

derivadas de un anticuerpo no humano. "Región marco” o "secuencia marco" se refiere a una cualquiera de las regiones marco 1 a 4. Los anticuerpos humanos manipulados y fragmentos de unión a antígeno abarcados por la presente invención incluyen moléculas en las que una cualquiera o más de las regiones marco 1 a 4 es sustancialmente o completamente humana, es decir, en la que cualquiera de las posibles combinaciones de las regiones marco individuales sustancialmente o completamente humanas 1 a 4, está presente. . Por ejemplo, esto incluye moléculas en las que la región marco 1 y la región marco 2, la región marco I y la región marco 3, la región marco 1, 2, y 3, etc. son sustancialmente o totalmente humanas. Los marcos sustancialmente humanos son aquellos que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con una secuencia marco de la línea germinal humana conocida. Preferiblemente, los marcos sustancialmente humanos tienen al menos aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de marco de la línea germinal humana conocida.

Los marcos completamente humanos son aquellos que son idénticos a una secuencia marco de la línea germinal humana conocida. Las secuencias de la línea germinal marco humanas pueden obtenerse de ImMunoGeneTics (IMGT) mediante su sitio web http://imgt.cines.fr, o de The Immunoglobulin FactsBook de Marie–Paule Lefranc y Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, los marcos de la cadena ligera de la línea germinal se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2, y 08, y las regiones marco de la cadena pesada de la línea germinal se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en: VH2–5, VH2–26, VH2–70, VH3–20, VH3–72, VHI–46, VH3–9, VH3– 66, VH3–74, VH4–31, VHI–18, VHI–69, V1–13–7, VH3–11, VH3–15, VH3–21, VH3–23, VH3–30, VH3–48, VH4–39, VH4–59, y VH5–5I.

Los anticuerpos manipulados humanos, además de los divulgados en el presente documento exhiben propiedades funcionales similares de acuerdo con la presente invención pueden generarse usando varios procedimientos diferentes. En un enfoque, las CDR del compuesto del anticuerpo parental se injertan en un marco humano que tiene una alta identidad de secuencia con el marco del compuesto del anticuerpo parental. La identidad de secuencia del nuevo marco será generalmente de al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia del marco correspondiente en el compuesto anticuerpo parental. En el caso de los marcos que tienen menos de 100 residuos de aminoácidos, uno, dos, o tres residuos de aminoácidos se pueden cambiar. Este injerto puede resultar en una reducción en la afinidad de unión en comparación con la del anticuerpo parental. Si este es el caso, el marco puede retromutarse al marco de parental en ciertas posiciones sobre la base de criterios específicos divulgados por Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Referencias adicionales que describen procedimientos útiles en la humanización de anticuerpos de ratón incluyen las patentes de EE.UU. Nº 4.816.397; 5.225.539, y 5.693.761; programas de ordenador ABMOD y ENCAD como se describe en Levitt (1983) J. Mol. Biol.

168:595 – 620; y el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522 – 525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323 – 327; y Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534 – 1536.

La identificación de los residuos a considerar para la retromutación se puede llevar a cabo como sigue.

Cuando un aminoácido cae bajo la siguiente categoría, el aminoácido marco de la secuencia de la línea germinal humana que se está utilizando (el "marco aceptor") se sustituye por un aminoácido marco de un marco del compuesto anticuerpo parental (el " marco donante”).

(a): el aminoácido en la región marco humana del marco aceptor es inusual para marcos humana en esa posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es típico para los marcos humana en esa posición;

(b): la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a uno de loas CDR; o

(c): cualquier átomo de la cadena lateral de un aminoácido marco está a unos 5-6 ángstrom (de centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional.

Cuando cada uno de los aminoácidos en la región marco humana del marco aceptor y un aminoácido correspondiente en el marco donante es generalmente inusual para marcos humana en esa posición, tal aminoácido puede reemplazarse por un aminoácido típico para marcos humanos en ese posición. Este criterio de retromutación permite recuperar la actividad del compuesto anticuerpo parental.

Otro enfoque para la generación de anticuerpos humanos manipulados que presentan propiedades funcionales similares a las de los compuestos de anticuerpos divulgados en el presente documento implica la mutación al azar de aminoácidos dentro de las CDR injertadas sin cambiar el marco, y cribar las moléculas resultantes para la afinidad y otras propiedades funcionales de unión que son tan buenos o mejores que las de los compuestos anticuerpo parental. Las mutaciones individuales también pueden introducirse en cada posición de aminoácido dentro de cada CDR, seguido de la evaluación de los efectos de dichas mutaciones en la afinidad de unión y otras propiedades funcionales. Las mutaciones individuales que producen propiedades mejoradas se pueden combinar para evaluar sus efectos en combinación entre sí.

Además, una combinación de ambos de los enfoques anteriores es posible. Después del injerto de CDR, se pueden

retromutar regiones marco específicas además de introducir cambios de aminoácidos en las CDR. Esta metodología se describe en Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151 – 162.

Aplicando las enseñanzas de la presente invención, una persona experta en la técnica puede utilizar las técnicas comunes, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, para sustituir los aminoácidos dentro de las secuencias marco actualmente divulgadas y de ese modo generar secuencias de aminoácidos de la región variable adicionales derivada de la secuencias presentes. Hasta todos los aminoácidos de origen natural se puede introducir en un sitio de la sustitución específica. Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden usarse para detectar estas secuencias de aminoácidos de la región variables adicionales para identificar secuencias que tienen las funciones in vivo indicadas. De esta manera, pueden identificarse otras secuencias adecuadas para la preparación de anticuerpos humanos de ingeniería y las porciones de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, la sustitución de aminoácidos dentro de los marcos está restringida a una, dos,

o tres posiciones dentro de uno cualquiera o más de las 4 regiones marco de la cadena ligera y/o la cadena pesada divulgadas en el presente documento. Preferiblemente, la sustitución de aminoácidos dentro de las CDR está restringida a una, dos, o tres posiciones dentro de uno cualquiera o más de las 3 CDR de la cadena ligera y/o la cadena pesada. Las combinaciones de los diversos cambios dentro de estas regiones estructurales y CDR descritas anteriormente también son posibles.

Que las propiedades funcionales de los compuestos de anticuerpos generados mediante la introducción de las modificaciones de aminoácidos descritas anteriormente se ajustan a las exhibidas por las moléculas específicas divulgadas en el presente documento puede confirmarse por los procedimientos descritos a continuación en los Ejemplos 2-19.

]El término "epítopo" se refiere a una disposición específica de los aminoácidos situados en un péptido o proteína a la que un anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une. Los epítopos a menudo consisten en grupos de superficie químicamente de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. Los epítopos pueden ser lineales, es decir, implican la unión a una única secuencia de aminoácidos, o conformacional, es decir, que implica la unión a dos o más secuencias de aminoácidos en varias regiones del antígeno que puede no ser necesariamente contiguos. Los epítopos divulgados en el presente documento puede consistir en, consisten esencialmente en, o comprenden las secuencias de aminoácidos divulgadas en el Ejemplo 3.

Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que "compiten" con las moléculas divulgadas en este documento son aquellos que se unen a c-Met humano en el o los sitio (s) que son idénticas a, o se solapan con, el sitio (s) a la que las presentes moléculas se unen. Los anticuerpos monoclonales de competición

o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden identificar mediante un ensayo de competición de anticuerpos. Por ejemplo, una muestra de c-Me humano purificado o parcialmente purificado puede estar unido a un soporte sólido. Luego, se añaden un compuesto de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente invención y un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo sospechoso de ser capaz de competir con tal compuesto anticuerpo de la invención. Una de las dos moléculas está marcada. Si el compuesto marcado y el compuesto no marcado se unen a sitios discretos y separados en c-Met, el compuesto marcado se unirá al mismo nivel haya o no presente el compuesto que de competición sospechoso. Sin embargo, si los sitios de interacción son idénticos o solapantes el compuesto no marcado competirá, y la cantidad de compuesto marcado unido al antígeno se reducirá. Si el compuesto no marcado está presente en exceso, muy poco, si algo, del compuesto marcado se unirá. Para los propósitos de la presente invención, los anticuerpos monoclonales que compiten o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son los que disminuyen la unión de los presentes compuestos anticuerpos frente a c-Met en aproximadamente un 50 %, aproximadamente 60%, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 %. Los detalles de los procedimientos para llevar a cabo tales ensayos de competición son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, capítulos 567 – 569 y 15, ISBN 0–87969–314–2. Tales ensayos pueden hacerse cuantitativos mediante el uso de anticuerpos purificados. Una curva estándar se establece por valoración de un anticuerpo contra sí mismo, es decir, el mismo anticuerpo se utiliza tanto como marcador como competidor. Se valora la capacidad de un anticuerpo monoclonal no marcado que compite o fragmento de unión a antígeno del mismo para inhibir la unión de la molécula marcada a la placa. Se comparan los resultados se representan, y las concentraciones necesarias para alcanzar el grado deseado de inhibición de la unión. Si los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que compiten con los compuestos de anticuerpo de la presente invención en tales ensayos de competición poseen las mismas o similares propiedades funcionales de los presentes compuestos de anticuerpos se puede determinar a través de los procedimientos divulgados en los Ejemplos 2-19 del presente documento.

Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen sustancialmente al mismo epítopo (s) de c-Met que los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno divulgados en el presente documento dson aquellos que se unen a c-Met humano en el sitio (s) que se superponen con el o los sitios en el que los presentes moléculas se unen. Los procedimientos que facilitan la identificación de anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen sustancialmente al mismo epítopo de c-Met que los anticuerpos monoclonales c-Met o fragmentos de unión a antígeno divulgados en el presente

documento son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación internacional PCT WO 00/64946. Si tales anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen sustancialmente al mismo epítopo(s) de c-Met que los divulgados en el presente documento poseen las mismas o similares propiedades funcionales de los presentes compuestos de anticuerpos se puede determinar a través de los procedimientos divulgados en los Ejemplos 2-19 en el presente documento.

"c–Met" o " c–Met humano" se refiere a cualquier c-Met humano, así como formas mutadas funcionalmente activas de los mismos. La estructura del c-Met se representa esquemáticamente como:

Dominio extracelular (DEC) Dominio intracelular

SEMA: dominio Sema

PSI: dominios de plexina, semaforinas e integrinas

IPT: 4 Inmunoglobulinas, Plexinas, y los dominios del factor de transcripción

TM: región transmembrana

JM: dominio yuxtamembranal

KD: dominio cinasa

En el DEC de c-Met humano (SEC ID Nº 75), los aminoácidos 1-24 comprenden la secuencia señal. La proteína madura comienza en el aminoácido 25 (E). dominio Sema consta de aproximadamente 500 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal de c-Met, y contiene la cadena α (residuos de aminoácidos 25 a 307) y parte de la cadena β (residuos de aminoácidos 308 a 519).

El término "inhibir" significa la capacidad para antagonizar sustancialmente, prohibir, prevenir, frenar, ralentizar, interrumpir, eliminar, detener, reducir o invertir los efectos biológicos de c-Met.

El término "que trata" (o "tratar" o "tratamiento") significa ralentizar, interrumpir, detener, controlar, parar, reducir o invertir la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad, pero no implica necesariamente una eliminación total de todos los síntomas, afecciones o trastornos relacionados con la enfermedad.

Los acontecimientos agudos y las enfermedades crónicas se pueden tratar. En un acontecimiento agudo, se administra un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al inicio de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad, y se interrumpe cuando termina el acontecimiento agudo. En contraste, un síntoma crónico, trastorno, afección o enfermedad es tratada durante un período de tiempo más prolongado.

El término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o dosis de un compuesto de anticuerpo de la presente invención que, tras la administración de una sola dosis o de múltiples dosis a un paciente, proporciona el tratamiento o la prevención deseadas. Las cantidades terapéuticamente efectivas de los presentes compuestos de anticuerpos pueden comprender una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg / kg a aproximadamente 20 mg / kg por dosis única. Una cantidad terapéuticamente eficaz para cualquier paciente individual puede determinarla el proveedor de la atención sanitaria mediante la supervisión del efecto de los compuestos anticuerpos sobre un biomarcador, tal como c-Met de la superficie celular en los tejidos tumorales o no tumorales, regresión del tumor, etc. El análisis de los datos obtenidos por estos procedimientos permite la modificación del régimen de tratamiento durante la terapia de modo que se administren cantidades óptimas de los compuestos de anticuerpos, se usen solos

o en combinación con otro agente terapéutico, y de modo tal que la duración del tratamiento se pueda determinar como bien. De esta manera, el régimen de dosificación / tratamiento puede modificarse en el transcurso de la terapia de manera que se administran las cantidades más bajas de compuestos anticuerpos utilizados solos o en combinación que presentan una eficacia reductora del tumor satisfactoria, por lo que la administración de tales compuestos solo continúa el tiempo que sea necesario para tratar con éxito al paciente.

Los compuestos de anticuerpo de la presente invención pueden utilizarse como medicamentos en la medicina humana, administrados por diversas vías. Lo más preferentemente, dichas composiciones son para administración parenteral. Tales composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practise of Pharmacy, 19ª ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co., y comprenden uno o más compuestos de anticuerpos divulgados en el presente documento, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El término "tumor" se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso" y "tumor" no son mutuamente excluyentes, como se usan en el presente documento.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento/proliferación celular aberrante. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinomas, linfomas, blastomas, sarcomas, y leucemias.

c-Met y Cáncer

Las cías de c-Met con regulación alterada pueden inducirse por regulación por aumento de la transcripción, amplificación del gen c-Met, alteraciones genéticas específicas, o mecanismos autocrinos o paracrinos dependientes de ligando. La causa más frecuente de la activación constitutiva de c-Met en tumores humanos es la expresión de proteínas incrementada como consecuencia de la regulación positiva de la transcripción en ausencia de amplificación del gen. Además, la amplificación de del gen MET, con la consiguiente sobreexpresión proteica y la activación constitutiva de la cinasa, se ha notificado en una serie de tumores primarios humanos, incluidos los carcinomas gástricos y esofágicos, de pulmón de células no pequeñas (NSCL), carcinomas y meduloblastomas. Los tumores de origen mesenquimal, tales como osteosarcomas y rabdomiosarcomas, a menudo utilizan mecanismos autocrinos mediante la producción de HGF. Los niveles elevados de HGF y la sobreexpresión de c-Met se asocian a menudo con pobres resultados clínicos que incluyen enfermedad más agresiva, el aumento de la metástasis tumoral y la supervivencia del paciente más corta. Además, los altos niveles de HGF y / o proteínas c-Met en los tumores confieren resistencia a la quimioterapia y la radioterapia. Además del HGF anormal y la expresión de c-Met, la vía de c-Met se puede activar a través de alteraciones genéticas, tales como mutaciones c-Met, amplificación de genes, y reordenamiento génico. Se encuentran mutaciones de sentido erróneo de c–MET en todos los individuos con carcinomas de células renales papilares hereditarios (PRCC) bien caracterizados y en un pequeño subgrupo (13 %) de muestras de PRCC esporádico. Algunas de las mutaciones poseen potencial oncogénico debido al aumento de la actividad quinasa. La trisomía del cromosoma 7, en la que residen los genes HGF y c–MET, se produce con frecuencia en PRCC, y da como resultado la duplicación no aleatoria del alelo de c-MET mutante. Además, han identificado mutaciones somáticas de c–MET en otros cánceres humanos, incluyendo cánceres gástrico, de cabeza y cuello, de hígado, de ovarios, de pulmón no microcítico y de tiroides, así como en las metástasis de algunos de estos tipos de cáncer. A diferencia del PRCC, en el que las mutaciones normalmente están limitadas al dominio quinasa, estas mutaciones se encuentran a menudo en otras regiones del receptor, por ejemplo, el dominio yuxtamembranal. Además de la mutación, el gen c–MET a menudo está amplificado en los cánceres de mama, hígado, cerebro, colorrectal, gástrico, de pulmón y de estómago, que se correlaciona con la progresión de la enfermedad en algunos pacientes.

Indicaciones terapéuticas

La señalización aberrante de HGF / c-MET se ha documentado en una amplia gama de neoplasias malignas humanas, incluyendo los cánceres de vejiga, de mama, cervical, colorrectal, de endometrio, esófago, gástrico, de cabeza y cuello, de riñón, de hígado, de pulmón, nasofaríngeo, de ovarios, de páncreas, de próstata y de tiroides, así como colangiocarcinoma, osteosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcomas, y MFH / fibrosarcoma. Además, la expresión anormal de HGF anormal y / o c-Met también se ha descrito en neoplasias malignas hematológicas tales como leucemia mielógena aguda, leucemia de células T del adulto, leucemia mieloide crónica, linfomas y mieloma múltiple, así como otros tumores tales como melanoma, mesotelioma , tumor de Wilms, glioblastomata y astrocitomas (resumidos en Liu et al. (2008) Expert Opin. Investig. Drugs 17(7):997 – 1011). Los anticuerpos de c-Met de la presente invención pueden inhibir los tumores dependientes de HGF y e independientes de HGF.

Los ejemplos siguientes no limitantes ilustran varios aspectos de la presente invención.

En los siguientes ejemplos, los anticuerpos control IgG2 e IgG4 humanizados e IgG murino (también denominado a veces mIgG1) son anticuerpos de control de isotipo no relacionados con los presentes anticuerpos de c-Met. Los anticuerpos C8, D 11 y optD11 son anticuerpos murinos. En todos los casos, el HGF humano se obtiene de R&D Systems (#294).

Ejemplo 1

Anticuerpos frente a c-Met

Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las cadenas ligera y pesada completas y las respectivas secuencias de nucleótidos codificantes de los anteriores, de los presentes anticuerpos humanos manipulados se enumeran a continuación en la sección titulada “Secuencias de aminoácidos y nucleótidos”. Las secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera y la cadena pesada se muestran en las Tablas 1 y 2, respectivamente.

Tabla 1. CDR de la cadena ligera

Anticuerpo: CDR 1 CDR 2 CDR 3

D11–S17Y: SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49) GTSYLAS (SEC ID Nº 50) QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51)

D11–8B8: SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49) GTSYLAS (SEC ID Nº 50) QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51)

D11–C27G3: SVSSSISSTNLH (SEC ID Nº 49) GTSRLRS (SEC ID Nº 52) QQWSSYPYS (SEC ID Nº 51)

Secuencia consenso de D11: –– GTSX1LX2S (SEC ID Nº 87) ––

C8–6: SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53) STSNLAS (SEC ID Nº 54) IQYSGYPLT (SEC ID Nº 55)

C8–H241: SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53) STSNLAS (SEC ID Nº 54) QVYSGYPLT (SEC ID Nº 56)

C8–co–16: SVSSSVRSIYLH (SEC ID Nº 57) STSNLAS (SEC ID Nº 54) QVYRGYPLT (SEC ID Nº 58)

Secuencia consenso de C8: SVSSSVX3SIYLH (SEC ID Nº 88) –– X4X5YX6GYPLT (SEC ID Nº 89)

X1 es Y o R, y X2 es A o R; X3 es S o R; X4 es I o Q, X5 es Q o V, y X6 es S o R;

Tabla 2. CDR de la cadena pesada

Anticuerpo: CDR 1 CDR 2 CDR 3

D11–S17Y: GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59) WIYPVTGDTYYNEKFKG (SEC ID Nº 60) GYGAFYY (SEC ID Nº 61)

D11–8B8: GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59) WIYPVTGDTYYIEKFKG (SEC ID Nº 62) GYGAFFY (SEC ID Nº 63)

D11–C27G3: GYTFTSRYIH (SEC ID Nº 59) WIYPVTGDTYYREPFKG (SEC ID Nº 64) GYGAFYY (SEC ID Nº 61)

Secuencia consenso de D11: –– WIYPVTGDTYYX7EX8FKG (SEC ID Nº 90) GYGAFX9Y (SEC ID Nº 91)

C8–6: GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65) RVNPNRGGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 66) TNWLDY (SEC ID Nº 67)

Anticuerpo: CDR 1 CDR 2 CDR 3

C8–H241: GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65) RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 68) ANWLDY (SEC ID Nº 69)

C8–co–16: GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65) RVNPYRGSTTYNQKFEG (SEC ID Nº 70) ANILDY (SEC ID Nº 71)

Secuencia consenso de C8: –– RVNPX10RX11X12TTYNQKFEG (SEC ID Nº 92) X13NX14LDY (SEC ID Nº 93)

X7 es N, I, o R, y X8 es K o P; X9 es Y o F; X10 es N o Y, X11 es G o R, y X12 es G o S; X13 es T o A, y X14 es W o I;

Las secuencias consenso para las regiones variables de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo D11-y C8 son:

D11– Secuencia consenso de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo (SEC ID Nº 94)

en la que X1 es Y o R, y X2es A o R;

C8– Secuencia consenso de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo (SEC ID Nº 95)

en la que X3 es S o R, X4es I o Q, X5es Q, o V, y X6es S o R;

D11– Secuencia consenso de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (SEC ID Nº 96)

en la que X7 es N, I, o R, X8 es K o P, y X9 es Y o F;

C8– Secuencia consenso de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (SEC ID Nº 97)

en la que X10 es Y o N, X11 es G o R, X12 es S o G, X13 es A o T, y X14es I o W.

15 Los anticuerpos se expresan transitoriamente en las células HEK293 EBNA (Edge BioSystems, # 90500130) utilizando procedimientos de transfección estándar. Las células transfectadas se cultivan en medio libre de suero estándar que contiene geneticina (G418) y tobramicina durante de 48 a 120 horas a 37 °C después de la transfección. Los anticuerpos se purificaron en una columna de 60 ml de rProteína A Sepharose (Amersham Biosciences, # 17-1279-04) siguiendo las instrucciones del fabricante, y se concentraron y se purificaron

20 adicionalmente por cromatografía de exclusión por tamaño (XK50 / 60 Superdex200, Pharmacia) con solución salina

tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, como la fase móvil. Los anticuerpos de filtran después utilizando membranas de PVDF Millev-GV, de 0,22 m, 33 mm, (Millipore, # SLGV033RS), y se almacenaron a de 4 a 8 °C.

El anticuerpo IgG1 c–Met murino 5D5 (patente de EE.UU. Nº 5.686.292) tratado en muchos de los ejemplos siguientes, se aísla y purifica a partir del hibridoma HB-11895 obtenido de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 5 Manassas, VA, como se describió anteriormente.

Ejemplo 2

Cinética de unión de los anticuerpos de c-Met a varios dominios extracelulares de c-Met

Los dominios extracelulares (DEC) de las secuencias de c-Met de origen humano, de mono cynomolgus y de rata se expresan como proteínas de fusión Fc con un marcador flan e His (marcador Flis) en el C-terminal de la Fc (SEC ID

10 Nº de 72-74). Estas proteínas de fusión de DEC de c-Met – Fc se expresaron por separado transitoriamente en células HEK293 EBNA y se purificaron como se describe en el Ejemplo 1.

Se usa un instrumento Biacore® 2000 se utiliza para medir la cinética de unión de los anticuerpos de c-Met frente a los DEC de c-met de origen humano, de mono cynomolgus y de rata. Las mediciones se realizaron a 25 °C. Las muestras se disuelven en tampón HBS-EP (cloruro de sodio 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005 % (p / v) tensioactivo P-20,

15 y N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES) 10 mM a pH 7,4; # BR-1001 -1088).El fragmento F(ab')2 de anticuerpo de cabra anti humana de tipo IgG, fragmento F(ab')2 específico (Jackson Immunoresearch Inc, nº 109006-097) se inmoviliza en celdas de flujo 1 a 4 de un chip sensor CM5 a un nivel de 4.000 unidades de respuesta (UR) usando química de acoplamiento de aminas para capturar los anticuerpos anti-c-Met.

La unión se evalúa usando múltiples ciclos. Cada ciclo se realiza a un caudal de 50 l / min y consta de las

20 siguientes etapas: inyección de aproximadamente 10 l de un anticuerpo de c-Met a 10 lg / ml dirigido a una captura de de 40-100 UR, inyección de 250 l del DEC de c-Met--Flis-Fc humano, de mono cynomolgus, o de rata (a partir de 100 nM y utilizando diluciones en serie por dos para cada ciclo), seguido de 20 minutos, para la disociación y la regeneración usando aproximadamente 30 l de clorhidrato de glicina 10 mM, pH 1,5. Las velocidades de asociación y disociación para cada ciclo se evalúan utilizando un modelo "de unión 1: 1 (Langmuir)" en el software

25 BIAevaluation versión 4.1. Para la unión del anticuerpo D11-S17Y al DEC de c-Met-Flis-Fc se usa un modelo de ligando heterogéneo para ajustar los datos de manera adecuada; por lo tanto, se obtienen dos afinidades de unión.

Los resultados se muestran en las Tablas 3 -5 que se exponen a continuación.

Tabla 3

Cinética de unión y afinidad de los anticuerpos de c-Met al DEC de c-Met humano-Flis-Fc

Anticuerpo: kon (1/Ms) koff(1/s) KD (nM)

D11–8B8: 1,0 ± 0,1 x 105 0,5 ± 0,2 x 10–4 0,5 ± 0,2

D11–C27G3: 6,4 ± 0,2 x 104 0,9 ± 0,2 x 10–4 1,4 ± 0,3

D11–S17Y: 0,7 ± 0,1 x 105 2,8 ± 0,1 x 104 4,2 ± 0,9

C8–H241: 1,1 ± 0,3 x 105 < 10–5 <0,1

C8–6: 1,6 ± 0,4 x 103 3 ± 2 x 10–4 4 ± 1

C8–co16: 1,1 ± 0,2 x 105 0,3 ± 0,2 x 10–4 0,3 ± 0,1

30 Tabla 4

Cinética de unión y afinidad de los anticuerpos de c-Met al DEC de c-Met de monos cynomolguss-Flis-Fc

Anticuerpo: kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)

D11–8B8: 0,78 ± 0,02 x 105 2,23 ± 0,07 x 10–4 2,9 ± 0,2

D11–C27G3: 0,5 ± 0,1 x 105 3,2 ± 0,4 x 10–4 6,5 ± 0,7

D11–517Y: 0,70 ± 0,08 x 105 3,6 ± 0,5 x 10–4 5,1 ± 0,2

Anticuerpo: kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)

C8–H241: 0,80 ± 0,06 x 105 <10–5 <0,2

C8–6: 1,4 ± 0,5 x 105 4,5 ± 0,2 x 10–4 3,6 ± 1,1

C8–co16: 1,03 ± 0,02 x 105 <10–5 <0,1

Tabla 5

Cinética de unión y afinidad de los anticuerpos de c-Met al DEC de c-Met de rata-Flis-Fc

Anticuerpo: kon (1/Ms) koff (1/s) KD (pM) kon (1/Ms) koff(1/s) KD (nM)

D11–8B8: 2,1 ± 0,2 x 105 1,9 ± 0,3 x 10–4 0,89 ± 0,04

D11–C27G3: 1,3 ± 0,1 x 105 3,4 ± 0,5 x 10–4 2,7 ± 0,2

D11– S17Y: 0,66 x 105 189 x 10–4 286 2,5 x 105 3,0 x 10–4 1,2

Estos datos demuestran que los anticuerpos C8-H241, C8-6, y C8-CO16 se unen a los DEC de c-Met humanos y de monos cynomolgus con afinidad similar, pero no a los DEC de c-Met de rata. Datos adicionales (no mostrados) indican que estos anticuerpos no se unen a los DEC de c-Met de ratón hasta 100 nM de anticuerpo con 1 µg/ml el DEC revestido sobre placas de ELISA. Los anticuerpos D11-8B8, D11-C27G3 y D11-S17Y, sin embargo, se unen a los DEC de ser humano, de mono cynomolgus y de rata.

Ejemplo 3

Mapeo de epítopos

Los epítopos de los presentes anticuerpos de c-Met se mapean mediante una combinación de espectrometría de masas con intercambio de hidrógeno-deuterio (HDXMS) (Yamada et al. (2002) Rapid Commun. Mass Spectrom. 16(4):293 – 299) y marcaje con policarbonato de dietilo (DEPC) (Mendoza et al. (2008) Analy. Chem. 80(8):2895 – 2904). La reacción de intercambio de hidrógeno-deuterio del dominio Sema de c-Met humano se lleva a cabo en presencia o ausencia de anticuerpos de c-Met. Las regiones del dominio Sema que ganan menos de deuterio en presencia de un anticuerpo que, en su ausencia, se identifican como el o los epítopo(s) para el anticuerpo. DEPC puede reaccionar con grupos amino de los restos de lisina o histidina expuestos en la superficie en el dominio Sema, formando lisina o histidina-carbamato de etilo. Si estos aminoácidos se encuentran en la región del epítopo, estarán protegidos y no reaccionarán con DEPC tras la unión del anticuerpo. Esto ayuda a localizar más y / o confirmar las regiones del epítopo determinadas mediante HDXMS.

Expresión y purificación del dominio Sema de c-Met. El dominio Sema de c-Met humano se expresa con un marcador Flis en el extremo C-terminal (SEC ID Nº 76) en células HEK293 EBNA y se purifica como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después, la proteína purificada se almacena a 4 °C en PBS a pH 7,4. Este dominio se une a los anticuerpos de c-Met de la presente invención con una afinidad similar a la del DEC de c-Met humano de longitud completa, lo que indica que los epítopos para estos anticuerpos están localizados en esta región de c-Met humano.

Desglicosilación y desialización del dominio Sema de c-Met. 100 µl de 1,2 mg/ml del dominio Sema de c–Met Sema humano se tratan con 1 µl de solución PNGase F (Prozyme, GKE–5006B) a 37 °C durante la noche para la N–glicosilación. El análisis CL/EM demuestra que la mayor parte de la proteína está desglicosilada después de este tratamiento. Por separado, 100 µl de 1,2 mg/ml de solución de dominio Sema de c-Met humano se tratan con 2 µl de 10 U/ml de solución de neuraminidasa (Roche, nº Cat. 10 269 611 001) a 37 °C durante 1 hora para desialilar el dominio Sema.

Formación de complejos de dominio Sema de c-Met Sema Dominio / Anticuerpo. 10 µl de solución de dominio Sema de c-Met desglicosilado (1,2 mg/ml) se mezclan con una parte alícuota que contenía 29 µg de proteína de la solución de anticuerpo (2,07 µl de C8–H241, 2,01 µl de D11–8B8, o 3,87 µl de un Mab control no relacionado), y después se diluyen con una solución 1X PBS hasta un volumen final de 40 µl. Por separado, 5 µl de la solución de dominio Sema de c-Met desialilado (1,2 mg/ml) se mezclan con una parte alícuota que contenía 14 µg de proteína de la solución de anticuerpo (1,04 µl de C8–H241, 1,01 µl de D11–8B8, o 1,94 µl de un Mab control no relacionado), y después se diluyen con una solución 1X PBS hasta un volumen final de 15 µl. Cada una de las soluciones mixtas de cada anticuerpo se somete después a análisis HDXMS.

Ensayos HDXMS. 4 µl de la mezcla del dominio Sema de c-Met /anticuerpo desglicosilada o desialilada se mezclan con 16 µl de 100 % de D2O (Acros, Código 166 310 500; 80 % de D durante el intercambio) y se incuba a temperatura ambiente durante 90 segundos. Después, el intercambio se inactiva con 50 µl de 0,5 % (v / v) de ácido fórmico en agua a 0 °C. La solución inactivada se trata inmediatamente con 2 µl de 5 mg / ml (v / v) de solución de pepsina (Sigma, Cat. Nº # P6887) a 0 °C durante 3,5 o 4 minutos. La solución digerida se inyecta inmediatamente manualmente en una columna de RP-HPLC (Polymer Laboratories, Part nº 1912–1802; 2,1 x 50 mm, tamaño de poro de 1000 A, tamaño de particular 8 µM). La corriente de tampón para de la bomba de HPLC (Waters, 2795 HPLC) pasa a través de un tubo de metal (aproximadamente 1 ml) a un inyector manual. El eluido de la columna se pasa después a un espectrómetro de masas Micromass LCT Premier o SYNAPT. El tubo de metal, el circuito de inyección y la columna se sumergen en un baño de agua helada.

La columna se equilibra con 99 % de A (0,05 % (v / v) de TFA (ácido trifluoroacético) acuoso y 1 % de B (0,04 % (v / v) de TFA en acetonitrilo) a un caudal de 0,2 ml / min. Se realiza una elución por gradiente isocrático durante 1 minuto, de 1 al 10 % de B durante 1 minuto, a 40 % de B durante 12 minutos, a 90 % de B durante 4 minutos. con una retención de 3 minutos, y después se devolvió rápidamente a las condiciones iniciales. La espectrometría de masas se lleva a cabo en un espectrómetro de masas Micromass LCT Premier con pulverización positiva, modo W, y los ajustes siguientes: un voltaje capilar de 1,5 kV, un voltaje de cono de 100 V, abertura 1 de 25 V, un intervalo de masa de 200 a 2.000, una temperatura de desolvatación de 150 °C, y un flujo de gas de desolvatación de 500 l / h. El espectro de masas de cada péptido péptico de c-Met se obtiene después del intercambio de D / H con o sin anticuerpo de c-Met. La masa promedia de cada péptido se calcula de acuerdo a la distribución isotópica del pico del ion más intenso.

Marcaje con DEPC de los complejos c-Met / Anticuerpo. 8,3 µl de la solución del dominio Sema de c-Met humano de 1,2 mg/ml mezclan con una solución de anticuerpos (24 (24 µg de proteína: 1,71 µl de C8–H241, 1,67 µl de D11–8B8, o 3,2 µl de Mab control sin tratar), y 1 X solución de PBS hasta un volumen final de 76 µl. Cada mezcla de c–Met/anticuerpo se trata con 4 µl de 10 mg/ml (p/v) de DEPC en isopropanol a temperatura ambiente durante 5 minutos y después se inactiva con 10 µl de 20 mg/ml de histidina en tampón Tris–HCl 0,1 M, a pH 8, y 10 µl de 0,2 mg/ml de lisina en tampón Tris–HCl 0,1 M a pH 8. Cada solución se mezcla con 5 µl de 0,2 mg / ml (p / v) solución de tripsina porcina (Promega, nº Cat. # V528A), y la mitad de la mezcla se mezcla con 0,5 µl de 50 mg / ml (p / v) de solución de ditiotreitol. Cada solución de muestra se incuba a 37 °C durante 5 horas y después se trata con 0,5 µl de solución de PNGasa F durante una hora adicional. Cada solución digerida se acidifica con 2 µl de 10 % de solución de ácido acético (v / v). 2 µl de 100 mg/ml de solución TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina clorhidrato (Sigma, nº de Cat. # C4702–2G) se añaden al digesto no reducido compendio sin ditiotreitol añadido. Cada una de las soluciones se somete a análisis CL / EM utilizando un espectrómetro de masas Waters Acquity UPLC y Waters SYNAPT. La HPLC utiliza una columna Waters Acquity UPLC BEH C8 (2,1×50 mm, 1,7 µm, Waters, parte nº 186002877) a 60 °C, y los péptidos se eluyen con un gradiente de acetonitrilo en un sistema de fase móvil de HPLC agua / acetonitrilo/TFA. Para los digestos se usa un tiempo de carrera de 45 minutos. La columna se equilibra con 99 % de A (0,05 % (v / v) solución acuosa de TFA) y 1 % de B (0,04 % (v / v) de TFA en acetonitrilo) a un caudal de 0,2 ml / min. Se realiza una elución por gradiente en estado isocrático durante 2 minutos, de 1 al 25 % de B durante 25 minutos, a 45 % de B durante 10 minutos, a 90 % de B durante 1 minuto, con una retención de 1,5 minutos (al mismo periodo de tiempo, caudal de 0,3 ml/min) y después se devolvió rápidamente a 1 % de B.

Resultados. El Mab C8-H241 parece unirse un epítopo conformacional que comprende cuatro regiones del dominio Sema de c-Met, situado en el cadena α del dominio extracelular de c-Met humano (residuos de aminoácidos 25-307 de la SEC ID Nº 75):

121VVDTYYDDQL130 (SEC ID Nº 77),

131ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 78),

179ALGAKVLSSVKDRFINFF196 (SEC ID Nº 79), y

216VRRLKETKDGFM227 (SEC ID Nº 80).

Más particularmente, el Mab C8-H241 une c-Met interaccionando con uno o más residuos de aminoácidos dentro de:

123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81) inclusive,

144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82) inclusive,

192FINF195 (SEC ID Nº 83) inclusive, and

220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84) inclusive.

La unión del Mab C8-H241 a la región 144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82) lo convierte e capaz de unirse al dominio extracelular de c-Met humano (SEC ID Nº 75) y de mono cynomolgus (aminoácidos 25 a 932 de SEC ID Nº 73) con una afinidad comparable, pero no a c-Met de rata o de ratón, hasta 100 nM de anticuerpo en los ensayos de unión.

La unión del Mab D11–8B8 a la cadena dα-el dominio Sema de c-Met parece estar localizada en una región, es decir, los residuos de aminoácidos dentro de un epítopo lineal dentro de la secuencia de aminoácidos 84YKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANL107 (SEC ID Nº 85) inclusive, más particularmente la región 95CFPCQDCSSKA105 (SEC ID Nº 86) inclusive. El epítopo para Mab D11-8B8 se ve confirmado por experimentos de extracción de epítopo (Dhungana et al. (2009) Methods Mol. Biol. 524:87 – 101). El dominio Sema de c-Met se digiere con tripsina porcina (Promega) y el producto de digestión se mezcla entonces con el Mab D11–8B8 biotinilado, usando el kit EZ–Link™ Sulfo–NHS–LC–Biotin (Pierce, Prod. #1754210), para unir los péptidos c-Met. El D11-8B8 biotinilado con o sin péptidos de c-Met unidos es capturado por la resina de estreptavidina agarosa de alta capacidad (Thermo Scientific, Prod. # 20359). Los péptidos unidos se liberan por ácido fórmico al 0,15 % (v / v) en H2O, y a continuación, se identifican mediante CL/EM.

Ejemplo 4

Unión preferencial de anticuerpos contra c-Met frente a los DEC de RON y Plexina A2

Las proteínas humanas con la mayor identidad de secuencia con c-Met son RON y Plexina A2. Este experimento compara la especificidad del anticuerpo c-Met que se une a los DEC de c-Met, RON, y Plexina A2.

Los pocillos de placas de unión alta de 96 –pocillos de EIA/RIA (Costar, #2592) se recubren con 100 µl de 1 µg/ml del dominio extracelular (DEC) de la fusión c-Met humano–Fc–Flis (SEC ID Nº 72), DEC de RON–Fc (R&D Systems, #1947–MS), o DEC de Plexina A2–Fc (Abnova, Taipei, Taiwán #H00005362–P01) en tampón de recubrimiento (BioFX Labs, # COAT–1000–01) durante la noche a 4 °C. Los pocillos se aspiran y los sitios de unión no específica se bloquean mediante la adición de 200 µl de tampón de bloqueo (solución salina tamponada con Tris, a pH 8,0, con 0,05 % (v/v) de polisorbato 20 (Tween–20) (TBS–T) (BioFX Labs, # WSHW–1000–01) más 1 % (p/v) de seroalbúmina de suero (BSA) (Jackson Immuno, #001–000–162) incubando durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las placas tres veces con tampón de lavado (TBS-T), se añaden de 100 µl/pocillo de diluciones en serie a 1:6 de anticuerpos c-Met en tampón de bloqueo (a partir de 100 µg/ml) y se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavan y se incuban con 100 µl / pocillo de F(ab)2 de IgG anti-humana de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Labs de # 109-036-097) en tampón de bloqueo durante 90 minutos. Después de lavar las placas, se añaden 100 µl/pocillo de solución de sustrato / pocillo (BioFX, # TMBW-1000-01) y las placas se incuban durante 10 minuto a temperatura ambiente. Para detener la reacción se añaden 100 µl/pocillo (BioFx, # LSTP–1000–01). Las señales colorimétricas se desarrollan y se leen a 450 nm usando un lector de placas SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El anticuerpo de c-Met de unión a los DEC DE c-Met, RON y Plexina A2 es proporcional a la producción de la señal de color.

Como se muestra en la Tabla 6, ambos anticuerpos de c-Met C8 y D11 de la presente invención se unen preferentemente al DEC de c-Met humano en comparación con el DEC de RON o los DEC de Plexina A2.

Tabla 6

Unión preferente de los anticuerpos de c-Met a los DEC de c-Met humano frente a los DEC de RON y Plexina A2

A450 nm promedio

Dosis del anticuerpo: C8–H241 C8–6 C8–co16

(ng/ml): DEC de c-Met DEC de RON Plexina A2 DEC de c-Met DEC de RON Plexina A2 DEC de c-Met DEC de RON Plexina A2

0,000: 0,300 0,098 0,092 0,322 0,110 0,109 0,335 0,106 0,104

0,002: 0,317 0,088 0,082 0,326 0,106 0,099 0,369 0,100 0,094

0,010: 0,317 0,081 0,090 0,335 0,097 0,095 0,374 0,096 0,078

0,060: 0,484 0,104 0,099 0,551 0,087 0,096 0,446 0,089 0,082

0,357: 0,902 0,091 0,097 0,813 0,080 0,107 0,907 0,083 0,095

2,143: 2,861 0,101 0,103 2,415 0,098 0,106 2,888 0,114 0,092

12,860: 4,000 0,079 0,083 4,000 0,087 0,085 4,000 0,102 0,069

77,160: 4,000 0,085 0,079 4,000 0,090 0,078 4,000 0,084 0,096

462,963: 4,000 0,090 0,104 4,000 0,088 0,086 4,000 0,103 0,092

2777,778: 4,000 0,085 0,092 4,000 0,088 0,094 4,000 0,095 0,114

16666,667: 4,000 0,117 0,125 4,000 0,124 0,118 4,000 0,198 0,284

100000,000: 4,000 0,267 0,310 4,000 0,170 0,171 4,000 0,421 0,983

Error estándar

0,000: 0,006 0,015 0,007 0,011 0,000 0,004 0,003 0,005 0,011

0,002: 0,003 0,006 0,002 0,012 0,005 0,006 0,023 0,000 0,006

0,010: 0,002 0,000 0,005 0,001 0,004 0,009 0,015 0,012 0,002

0,060: 0,055 0,001 0,002 0,144 0,004 0,005 0,029 0,003 0,002

0,357: 0,004 0,004 0,002 0,022 0,005 0,003 0,005 0,007 0,000

2,143: 0,032 0,004 0,005 0,041 0,004 0,003 0,128 0,002 0,007

12,860: 0,000 0,001 0,012 0,000 0,000 0,007 0,000 0,004 0,004

77,160: 0,000 0,002 0,014 0,000 0,008 0,007 0,000 0,003 0,001

462,963: 0,000 0,004 0,003 0,000 0,006 0,001 0,000 0,013 0,001

2777,778: 0,000 0,004 0,002 0,000 0,004 0,001 0,000 0,007 0,000

16666,667: 0,000 0,005 0,004 0,000 0,004 0,003 0,000 0,003 0,002

100000,000: 0,000 0,008 0,012 0,000 0,002 0,003 0,000 0,011 0,093

D11–8B8: D11–C27G3 D11–S17Y

DEC de c-Met: DEC de RON Plexina A2 DEC de c-Met DEC de RON Plexina A2 DEC de c-Met DEC de RON Plexina A2

0,297: 0,097 0,081 0,2844 0,0791 0,0771 0,31475 0,1129 0,10795

0,299: 0,082 0,078 0,2708 0,07065 0,07965 0,3091 0,09705 0,09345

0,304: 0,074 0,078 0,2904 0,0715 0,0763 0,31405 0,0868 0,0986

0,445: 0,094 0,073 0,45965 0,0695 0,06605 0,37355 0,0857 0,09455

1,314: 0,073 0,074 1,43965 0,07085 0,0792 0,78915 0,08475 0,0924

2,416: 0,069 0,073 2,5266 0,0655 0,0742 2,1432 0,1085 0,08235

3,931: 0,079 0,075 4 0,07835 0,0641 4 0,0825 0,0768

4,000: 0,079 0,066 4 0,06725 0,076 4 0,08195 0,07575

4,000: 0,071 0,077 4 0,0981 0,1045 4 0,08185 0,0783

4,000: 0,088 0,093 4 0,20445 0,30325 4 0,09255 0,0955

4,000: 0,165 0,181 4 0,67565 1,33475 4 0,1274 0,1491

4,000: 0,544 0,498 3,9211 2,30295 3,37085 4 0,23775 0,3146

Error estándar

0,006: 0,003 0,003 0,0087 0,0017 0,0106 0,00515 0,0012 0,00035

D11–8B8: D11–C27G3 D11–S17Y

0,011: 0,002 0,002 0,0194 0,00595 0,00185 0,0228 0,00065 0,01725

0,012: 0,002 0,001 0,0051 0,0018 0,0017 0,01195 0,0058 0,0079

0,007: 0,017 0,003 0,01495 0,0006 0,00335 0,00375 0,0013 0,00035

0,092: 0,007 0,004 0,02935 0,00695 0,0017 0,04195 0,00075 0,0039

0,044: 0,002 0,001 0,2742 0,0002 0,0015 0,0841 0,0054 0,00015

0,069: 0,005 0,002 0 0,01505 0,0043 0 0,0029 0,0061

0,000: 0,007 0,000 0 0,00275 0,0066 0 0,00445 0,00455

0,000: 0,005 0,004 0 0,0063 0,0032 0 0,00485 0,0089

0,000: 0,003 0,005 0 0,00975 0,00535 0 0,00705 0,0055

0,000: 0,007 0,004 0 0,03125 0,03495 0 0,0007 0,0035

0,000: 0,016 0,006 0,0789 0,07335 0,14345 0 0,00865 0,004

Ejemplo 5

Los anticuerpos de c-Met bloquean la unión de HGF/c–Met

Los ensayos de unión in vitro se utilizan para determinar la inhibición de la unión de HGF a c-Met por los presentes 5 anticuerpos de c-Met.

Los pocillos de placas de unión alta de 96 pocillos de EIA/RIA (Costar, #2592) se revisten con 100 µl del DEC de c– Met humano-Fc–Flis (SEC ID Nº 72) (2 µg/ml) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 's (DPBS) durante la noche a temperatura ambiente; se lavan cuatro veces con tampón de lavado (solución salina tamponada –Tris, pH 8,0, con 0,05 % (v/v) de polisorbato 20 (TWEEN®–20) (TBS–T) (BioFX Labs, # WSHW–1000–01) en un 10 lavador de placas; se bloquean mediante la adición de 300 µl de tampón de bloqueo (TBS–T más 1 % (p/v) de seroalbúmina bovina (BSA) (Jackson Immuno, #001–000–162); y se incuban durante 60 minutos a 37 °C. A continuación se elimina el tampón de bloqueo de los pocillos y se añaden 50 µ de anticuerpos en tampón de bloqueo a concentraciones finales tal como se indican en la Tabla 7 a cada pocillo, respectivamente. Se añade tampón de bloqueo a los pocillos de control con solo HGF. Las placas con anticuerpos de c-Met se incuban durante 90 minutos 15 a 37 °C. Se añaden 50 µl de factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HGF) (R & D Systems, # 294) en tampón de bloqueo a una concentración final de 10 ng / ml a cada pocillo, excepto los pocillos con solo el anticuerpo control. Las placas que contienen la mezcla anticuerpo de c-Met/ HGF se incuban en un agitador de placas durante dos horas a temperatura ambiente. Después, los pocillos se lavan cuatro veces con TBS-T en un lavador de placas. A continuación a cada pocillo se añaden 100 µl de anticuerpo anti-HGF biotinilado (R&D Systems, # BAF294) en 20 tampón de bloqueo a una concentración final de 100 ng / ml. Las placas se incuban durante 90 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan de nuevo cuatro veces con TBS-T en un lavador de placas. A cada pocillo se añaden 100 µl de una dilución a 1:200 de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) (R & D Systems, DY998) en tampón de bloqueo. Las placas se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan cuatro veces con TBS-T en un lavador de placas. A continuación se añaden 100 µl/pocillo de la 25 solución de sustrato (BioFx, #TMBW–1000–01) y las placas se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para detener la reacción se añaden 100 µl/pocillo de solución de parada (BioFx, # LSTP–1000–01). Las muestras se leyeron a una longitud de onda de 450 -570 nm en un lector de microplacas (Spectra, MAX 190) y no se resta fondo.

Como se muestra en la Tabla 7, los anticuerpos de c-Met C8 y D11 de la presente invención bloquean la unión HGF humano/ c-Met.

Tabla 7

inhibición de a unión de HGF humano a c-Met humano mediante los anticuerpos C8 y D11

A450 nm PROM.

Dosis del anticuerpo hIgG2 D11– D11–27G3 D11–S17Y hIgG4 C8–6 C8–H241 C8–co16 (ng/ml) 8B8

0,00 2,43 2,43 2,43 2,43 2,61 2,61 2,61 2,61 0,48 2,46 2,51 2,37 2,15 2,41 2,56 2,45 2,05 1,91 2,87 2,48 2,31 1,98 2,49 2,59 2,46 2,18 7,63 2,70 2,41 2,27 2,08 2,88 2,64 2,53 2,20 30,52 2,41 2,32 2,38 2,07 2,63 2,42 2,42 2,08 122,07 2,52 1,92 1,60 1,69 2,44 2,00 1,77 1,30 488,28 2,53 1,30 0,94 1,29 2,44 1,33 0,73 0,70 1953,13 2,43 1,43 0,97 1,23 2,27 1,08 0,68 0,60 7812,50 2,50 1,24 0,91 1,12 2,49 0,95 0,70 0,57 31250,00 2,50 1,31 0,94 1,17 2,67 0,98 0,77 0,56 125000,00 2,43 1,38 0,89 1,35 3,00 1,32 0,69 0,38

Error est. 0,00 0,06 0,06 0,06 0,06 0,10 0,10 0,10 0,10 0,48 0,02 0,13 0,01 0,09 0,24 0,02 0,14 0,15 1,91 0,27 0,08 0,08 0,03 0,00 0,03 0,16 0,12 7,63 0,14 0,01 0,21 0,08 0,14 0,03 0,06 0,09

30,52 0,09 0,02 0,31 0,09 0,16 0,01 0,03 0,01 122,07 0,09 0,07 0,03 0,02 0,08 0,10 0,02 0,03 488,28 0,00 0,04 0,04 0,02 0,01 0,02 0,00 0,01 1953,13 0,13 0,16 0,02 0,05 0,00 0,01 0,01 0,01 7812,50 0,04 0,01 0,01 0,02 0,25 0,07 0,01 0,02 31250,00 0,06 0,02 0,02 0,04 0,03 0,03 0,03 0,03 125000,00 0,07 0,03 0,01 0,08 0,13 0,47 0,01 0,00

Abreviaturas: PROM= promedio; Err. est.= error estándar

Ejemplo 6

Los anticuerpos de c-Met inducen una débil fosforilación de c-Met en comparación con el factor de 5 crecimiento de hepatocitos y el Mab 5D5 agonista

Tras la estimulación con HGF, la línea celular de carcinoma de pulmón A549 exhibe incremento de la fosforilación de c-Met en el residuo de tirosina 1349. Se usa un ensayo ELISA de c-Met fosforilado (p-Met) para medir la actividad agonista de diversos anticuerpos DE c-Met en ausencia de HGF, así como de Mab 5D5 y el propio HGF.

Células A549 (ATCC, # CCL-185) se cultivan en medio de Ham F12K + glutamina 2 mM (Invitrogen, # 21127–022) + 10 10 % de FBS (Invitrogen, #10082). Las células se siembran a 6 x 104 células / pocillo en el medio completo de suero

como anteriormente en placas de 96 pocillos y se incuban durante la noche a 37 °C en 5 % (v / v) de CO2. Se retira el medio de los pocillos y las células se dejan sin alimentos en 100 µl de medio de Ham F12K + glutamina 2 mM + 0,5 % de FBS durante seis horas a 37 °C en 5 % (v / v) CO2. Los anticuerpos o HGF are se diluyen en el medio de cultivo sin nutrientes, añadido a concentraciones finales tal como se indica en la Tabla 8, y se incuban durante 15 minutos a 37 ºC. El medio se aspira y las células se lisan en 50 µl de tampón de lisis (Tris 10 mM (Invitrogen, #15567–027), NaCl, 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético 2 mM (EDTA) (Invitrogen, #15575–038), NaF 50 mM (Sigma, #S1504), 1 % (v/v) de octilfenoxi polietoxi etanol (TRITON®–X 100; Sigma, #T8787), ortovanadato de sodio 2 mM (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, #567540), inhibidor de la proteasa (Sigma, St. Louis, MO; #P8340), cóctel de inhibidores de fosfatasa 1 (Sigma #P2850), y cóctel 2 de inhibidor de fosfatasa (Sigma #P5726)) por pocillo y se incuban en hielo durante 15-20 minutos. Los lisados celulares se utilizan en el ensayo ELISA descrito a continuación para determinar la fosforilación de c-Met en el residuo Y1349.

El anticuerpo de captura de c-Met se diluye en tampón de revestimiento Bup H (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, # 28382) a 2 µg / ml, añadido a placas de ELISA (Greiner Bio-One, Monroe, NC, # 655081) y se incuban durante la noche a 4 °C. Los pocillos se aspiran, se lavan tres veces con TBS-T (BioFX, Owings Mills, MD, WSH1000/01), y luego se bloquean con 200 µl de tampón de bloqueo (TBS-T más 2 % (p / v) de BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan tres veces con TBS-T. A continuación, se añaden 25 µl de lisados celulares más 75 µl de tampón de bloqueo, y las placas se incuban durante la noche a 4 °C. Las placas se lavan a continuación tres veces con TBS-T. Se añaden 100 µl de 0,5 mg / ml del anticuerpo policlonal de pY1349 c-Met (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, # 3133) en tampón de bloqueo a cada pocillo, y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavan tres veces con TBS-T. Después se añaden a cada pocillo 100 µl del anticuerpo policlonal IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa diluida a 1/10.000 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, # 111–035–144) en tampón de bloqueo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan a continuación tres veces con TBS-T. Se añaden 100 µl de solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (BioFX, # TMBW-1000/01) a cada pocillo, seguido por la adición de 100 µl de solución de parada (BioFX, # LSTP-1000/01). Las placas se leen a 450 nm usando un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y los valores de la muestra se determinan usando el software SOFTmax Pro 3.

1. 2 (Molecular Devices).

Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8

Efecto de los anticuerpos de c-Met, HGF y el Mab agonista 5D5 sobre la fosforilación de c-Met en células A549

Conc. del Señal de p-Met C8– Señal de p-Met C8– Señal de p-Met hlgG4 anticuerpo (µg /ml) H241 6

30 0,333 0,272 0,061

10 0,418 0,334 0,077 3,333 0,450 0,328 0,068 1,113 0,465 0,365 0,087 0,370 0,340 0,211 0,082 0,123 0,304 0,127 0,067 0,041 0,130 0,125 0,268 0,014 0,078 0,105 0,074 0,005 0,074 0,070 0,074 0,002 0,070 0,081 0,117

Conc. de HGF Señal de p-Met: Conc. del Señal de p-Met Mab 5D5

(ng/ml): anticuerpo (ng /ml)

300: 10,615 5 3,290

100: 6,129

33,33333: 2,267

11,11111: 1,0667

3,703704: 0,461

1,234568: 0,211

0,411523: 0,142

0,137174: 0,128

0,045725: 0,100

0,015242: 0,148

Los datos demuestran que el HGF y el Mab 5D5 agonista de c-Met estimulan fuertemente la fosforilación de c-Met, mientras que los Mab de c-Met actuales, C8-H241 y C8-6, estimulan débilmente la fosforilación de c-Met. Se obtienen resultados similares en las líneas celulares HCT116, H460, y MDA–MB–231.

El Mab D11–8B8 produce resultados similares.

Ejemplo 7

Los anticuerpos de c-Met inhiben la fosforilación de c-Met inducida por HGF

La unión de HGF a C-Met tiene como resultado la fosforilación en tirosina de moléculas de c-Met y la activación de la vía de señalización de c-Met. En este ejemplo, la línea celular de cáncer de colon humano HCT116, que es sensible a HGF, se utiliza para evaluar la inhibición de la fosforilación inducida por HGF en los residuos de tirosina 1230, 1234 y 1235 de c-Met por los presentes anticuerpos de c-Met.

Células HCT116 (ATCC, Manassas, VA, # CCL-247) se resuspenden hasta 150.000 células / ml en medio de McCoy 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA, # 16600-082) más penicilina / estreptomicina (Invitrogen, # 15140-122) con 10 % (v / v) de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen, # 10082-147). 0,2 ml de las células HCT116 resuspendidas se añaden a placas de microtitulación de 96 pocillos (Corning, Lowell, MA, #3596) a 30.000 células / pocillo, y las células se incuban a continuación durante 48 horas a 37 °C en 5 % (v/v) de CO2. Después, se aspira el medio de cultivo es y no se alimenta a las células en 100 µl de medio de McCoy 5A además de penicilina / estreptomicina con 0,1% (p / v) de BSA durante 24 horas a 37 ° C en 5 % (v / v) de CO2. Se añaden 25 µl de azida sódica (concentración final de 0,01 % (p / v)) (Sigma, # S2002), seguido inmediatamente de la adición de 25 µl de diluciones x8 de anticuerpos de c-Met a medio de McCoy 5A, más penicilina / estreptomicina con 0,1 % (p / v) de BSA, y las células se incuban durante 30 minutos a 37 °C en 5 % (v / v) de CO2. A cada pocillo se añaden 50 µl de HGF a una concentración final de of 200 ng/ml y las células se incuban durante 15 minutos adicionales a 37 ° C en 5 % (v / v) de CO2. DESPUÉS SE ASPIRA EL MEDIO y se añaden 50 µl de tampón de lisis celular of (Tris 10 mM (Invitrogen, #15567–027), NaCl 150 mM, ácido 2 mM etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM (Invitrogen, #15575–038), NaF 50 mM (Sigma, #S1504), 1 % (v/v) de octilfenoxi polietoxi etanol (TRITON®–X100; Sigma, #T8787), ortovanadato de sodio 2 mM (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, #567540), e inhibidor completo de la proteasa, EDTA libre (Roche, Basel, Switzerland, #11836170001). Las células se incuban en el tampón de lisis a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Los lisados celulares se analizan para detectar la fosforilación en tirosina de c-Met mediante ELISA del siguiente modo.

El anticuerpo de captura de c-Met se diluye en tampón de recubrimiento (BioFX, Glendora, CA, CAPA-1000/01) a 2 µg/ml. Se añaden 110 µl de anticuerpo diluido por pocillo a placas de ELISA Greiner Bio–One, Monroe, NC, #655081), y las placas se incuban durante la noche a 4 °C. Los pocillos se aspiran, se lavan dos veces con TBS-T, y después se bloquean con 200 µl de tampón de bloqueo (TBS-T más 2 % (p / v) de BSA) durante 1 hora. Las placas se lavan dos veces con TBS-T. A continuación, se añaden 25 µl de lisados celulares más 75 µl de tampón de bloqueo o 100 µl de diluciones de lisados de células MKN45 (diluidas con tampón de bloqueo, como patrón), y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan a continuación cuatro veces con TBS-T. Después, a cada pocillo se añaden 100 µl de 0,5 µg/ml de anticuerpo policlonal pYpYpY1230/1234/1235 c–

Met (Invitrogen, #44–888G) en tampón de bloqueo y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavan cuatro veces con TBS-T. Después se añaden 100 µl de anticuerpo policlonal IgG de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, #111– 035–144) en tampón de bloqueo y la mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan

5 a continuación seis veces con TBS-T. Se añaden 100 µl de solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (BioFX, # TMBW-1000/01) a cada pocillo, seguido por la adición de 100 µl de solución de parada (BioFX, # LSTP-1000/01). Las placas se leen a 450 nm con una corrección 570 nm usando un lector de placas SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La curva estándar se establece mediante el análisis de 4 parámetros y los valores de la muestra se determinan utilizando el software 3. 1. 2 Pro SOFTmax (Molecular Devices).

10 El porcentaje de inhibición de fosforilación de la tirosina de c-Met se establece a un promedio de tratamiento con HGF sin adición de anticuerpos de c-Met (inhibición del 0 %), y la inhibición del 100 % se establece en el promedio de tratamiento con azida sódica (sin tratamiento con HGF o con anticuerpos de c-Met).

La Tabla 9 muestra el promedio de los tratamientos por triplicado por experimento para tres experimentos con errores estándar. Los datos demuestran que cinco de seis anticuerpos de c-Met de la presente invención inhiben

15 significativamente la fosforilación de la tirosina de c-Met inducida por HGF en comparación con la de los controles de isotipo IgG2 e IgG4 humanos.

.

Ejemplo 8

Inducción de internalización de c-Met por los anticuerpos de c-Met

Los experimentos descritos en este ejemplo usan análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

5 para demostrar que los presentes anticuerpos de c-Met se unen a las moléculas de c-Met de la superficie celular e inducen internalización de c-Met. Las células MKN45 empleadas constitutivamente expresan niveles altos de c-Met total y exhiben fosforilación de de c-Met independiente de HGF como resultado de la amplificación del gen MET. La internalización de c-Met parece inducir la degradación de c-Met (véanse los Ejemplos 10 y 19), lo que tiene como resultado la inhibición de la vía de señalización de c-Met.

10 Los pocillos de placas de cultivo tisular de 6 pocillos (Costar, # 3598) se siembran con 1,5 x 105 células tumor gástrica humanas MKN45 (Japan Health Sciences Foundation, Health Science Research Resource Bank, #JCRB0254) en 2 ml de medio de cultivo (RPMI-1640 (Invitrogen, # 11835), el 10 % (v / v) de FBS (Invitrogen, # 10082 ); L-glutamina 2 mM (Invitrogen, # 25030); 100 U / 500 ml de penicilina G, y 100 µg / 500 ml de estreptomicina (Invitrogen, # 15140)). Las placas se incuban durante 24 horas a 37 °C con 95% de humedad relativa y 5 % (v / v) de

15 CO2. Después, los anticuerpos se añaden a los pocillos a una concentración final de 5 µg / ml. Después del tratamiento durante la noche, se retira el medio de cultivo de los pocillos y se reemplaza con 1 ml de solución de disociación celular libre de enzimas (Chemicon, # S-014-B). Las células se recogen en tubos de centrífuga después de haber sido incubadas durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se lavan una vez en medio de cultivo seguido de un lavado más en tampón de unión (DPBS con 1 % (p / v) de BSA y 0,01 % (p / v) de azida sódica). Antes de

20 células de la tinción, un anticuerpo de c-Met, que reconoce un epítopo diferente de los presentes anticuerpos de c-Met se marca mediante el uso de un kit de marcaje Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, # A-20181) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. A las células se añaden 100 µl de tampón de unión que contiene 2 µg / ml del anticuerpo marcado con Alexa Fluor 488, y después se incuban durante 60 minutos en hielo. Después, las células se lavan una vez con tampón de unión y se resuspenden en DPBS que

25 contenía 2 µg / ml de yoduro de propidio (para teñir las células muertas). La cantidad de moléculas de c-Met restantes en la superficie celular se analiza mediante análisis FACS, y se adquieren 10. 000 acontecimientos para cada muestra.

La intensidad media de la fluorescencia sobre la superficie celular refleja la cantidad de moléculas de c-Met que permanecen en la superficie de las células después del tratamiento con los anticuerpos de c-Met.

30 Los datos de un experimento representativo se muestran en la Tabla 10.

Los datos demuestran que la intensidad media de fluorescencia sobre la superficie de las células tratadas con los presentes anticuerpos de c-Met es menor que en las células tratadas con un correspondiente anticuerpo control de isotipo IgG o anticuerpo mIgG, lo que indica que los presentes anticuerpos inducen internalización de c-Met. Además, la intensidad media de fluorescencia sobre la superficie de las células tratadas con los presentes anticuerpos de c-Met es más baja que en células tratadas con el anticuerpo control agonista de c-Met 5D5. El % de Internalización puede calcularse del siguiente modo

% Internalización = [1 – (fluorescencia media del anticuerpo de ensayo dividida por

fluorescencia media del anticuerpo isótopo control)]multiplicado por 100

Los datos de internalización sugieren que los presentes anticuerpos inducen dimerización de c-Met humano. Los datos de los Ejemplos 9 y 19 demuestran que los anticuerpos C8 y D11 también inducen degradación, y reducen la fosforilación de c-Met.

Los resultados de internalización complementarios se obtienen mediante microscopia confocal usando el anticuerpo C8 murino marcado con fluorescencia en células MKN45 y Caki-1.

Utilizando los anticuerpos C8-H241, C8-6, C8-co-16 y D11 murino se obtienen resultados de internalización similares en las células NIH3T3 de mono cynomolgus transfectadas con ácido nucleico que codifica el c-Met de mono cynomolgus.

Los anticuerpos C8-H241, C8-6, C8-co-16, y optD11 también inducen la internalización de c-Met en células NIH3T3 transfectadas con ácido nucleico que codifica la mutación M1149T en el dominio cinasa de c-Met humano. Los anticuerpos C8-H241, C8-6, C8-co-16 y D11 murino también inducen internalización de c-Met en células de cáncer de pulmón no microcítico H 1437 que contienen c-la mutación R988C en el dominio yuxtamembranal de c-Met. . Ambas mutaciones causan ganancia de activación constitutiva de la función de c-Met.

Ejemplo 9

Inhibición por el anticuerpo de la proliferación de células tumorales independiente de ligando in vitro

En este ensayo se analiza la inhibición del crecimiento de las células tumorales in vitro por los anticuerpos de c-Met en células MKN45 independiente de HGF en ausencia del ligando de HGF.

Los anticuerpos de c-Met y de control del isotipo se diluyen con medio de cultivo (RPMI-1640 (Invitrogen, # 11835), 10 % (v / v) de FBS, L-glutamina 2 mM (Invitrogen, # 25030), 100 U / 500 ml de penicilina G y 100 µg / 500 ml de estreptomicina (Invitrogen, # 15140)) para lograr 2X las concentraciones finales indicadas en la Tabla 11, y se añaden 50 µl de las soluciones de anticuerpos 2X a cada pocillo de placas de cultivo tisular de 96 pocillos (PerkinElmer # 1. 450 -517). Las células MKN45 (Japan Health Sciences Foundation, Health Science Research Resource Bank, #JCRB0254) se mantienen en el medio indicado anteriormente, y se vuelven a suspender a 1 x 105 células / ml en el mismo medio. 50 µl de esta resuspensión de MKN45 se añaden a cada pocillo para lograr 5 x 103 células / pocillo. Las placas se incuban durante 48 horas a 37 °C con 95 % de humedad relativa y 5 % (v / v) de CO2. Durante las últimas seis horas del cultivo, las células se pulsan con 3H-timidina (MP Biomedicals, Solon, OH # 24066) a 1 µci/ / pocillo a 37 °C, humedad relativa del 95 %, 5 % (v / v) de CO2. Después se retira el medio y las células se lavan una vez con DPBS. Después de esto, a cada pocillo se añaden 200 µl de Optiphase Supermix (PerkinElmer, # 1200-439). Las placas se sellan y se incuban durante al menos una hora a temperatura ambiente. La 3H-timidina incorporada en las células se cuenta durante un minuto usando un contador de centelleo.

Los datos de un experimento representativo se muestran en la Tabla 11.

Estos datos demuestran que diversos anticuerpos de c-Met C8 y D11, de la presente invención inhiben la proliferación de células MKN45 independiente de HGF como se pone de manifiesto mediante una reducción en la incorporación de 3H-timidina. Se obtienen resultados similares en las células tumorales SNU5 y NUGC-4, cada una de las cuales exhibe sobreexpresión constitutiva y fosforilación de c-Met.

Ejemplo 10

Reducción de c-Met fosforilado y total y falta de desprendimiento del dominio extracelular de c-Met, en respuesta a los anticuerpos de c-Met

En este ejemplo se investiga si el tratamiento de las células MKN45 con anticuerpos de c-Met de la presente invención tiene como resultado la reducción de c-Met fosforilado (p-Met) y de c-Met total. Además, este ensayo se usa para determinar si el tratamiento con los anticuerpos c-Met induce el desprendimiento del DEC de c-Met en un medio acondicionado para MKN45.

Los anticuerpos de c-Met y de control del isotipo se diluyen con medio de cultivo (RPMI-1640 (Invitrogen, # 11835), 10 % (v / v) de FBS (Invitrogen, #10082), L-glutamina 2 mM (Invitrogen, # 25030), 100 U / 500 ml de penicilina G y 100 µg / 500 ml de estreptomicina (Invitrogen, # 15140)) para lograr 2X las concentraciones finales indicadas en la Tabla 12, y se añaden 50 µl de las soluciones de anticuerpos 2X a cada pocillo de placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Costar, #3596). Las células MKN45 (Japan Health Sciences Foundation, Health Science Research Resource Bank, #JCRB0254) se mantienen en el medio indicado anteriormente, y se vuelven a suspender a 1 x 105 células / ml en el mismo medio. 50 µl de esta resuspensión de MKN45 se añaden a cada pocillo para lograr 5 x 103 células / pocillo. Las placas se incuban a continuación durante 24 horas a 37 °C con 95 % de humedad relativa y 5 % (v / v) de CO2, y los lisados celulares se preparan como se describe en el Ejemplo 7. Además, se recoge el medio acondicionado de cada tratamiento para la cuantificación del DEC de c-Met. Los niveles de c-Met total y de p-Met en los lisados celulares de determinan mediante ELISA, y se normalizan a la concentración de proteína del lisado (determinada por BCA, Pierce # 23225).

c-Met fosforilado

La fosforilación de c-Met en los residuos de tirosina 1230, 1234 y 1235 se determina como se describe en el Ejemplo

7.

Desprendimiento de c-Met total y del DEC de c-Met

Para los ELISA de c-Met total y del DEC de c-Met, un anticuerpo de captura de c-Met se diluye en tampón de recubrimiento (BioFX, Glendora, CA, CAPA-1000/01) hasta 2 µg/ml. Se añaden 110 µl de anticuerpo diluido por pocillo a placas de ELISA Greiner Bio–One, Monroe, NC, #655081), y las placas se incuban durante la noche a 4 °C. Los pocillos se aspiran, se lavan dos veces con TBS-T, y después se bloquean con 200 µl de tampón de bloqueo (TBS-T más 2 % (p / v) de BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan dos veces con TBS-T. A continuación se añaden lisados de células MKN45, medio condicionado para MKN45 o dominio extracelular (DEC) de c-Met (SEC ID Nº 75) (como patrón) y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan a continuación cuatro veces con TBS-T. Después, a cada pocillo se añaden 100 µl de 0,5 µg/ml de anticuerpo secundario de c-Met biotinilado (Mab 5D5) que se une a un epítopo de c-Met diferente del anticuerpo de captura diluido en tampón de bloqueo y después se añaden a cada pocillo y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavan cuatro veces con TBS-T. Después se añaden 100 µl de estreptavidina conjugada con peroxidasa (diluida a 1/12.000 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PAPA, #016–030–084) en tampón de bloqueo y la mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan a continuación seis veces con TBS-T. Se añaden 100 µl de solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (BioFX, # TMBW-1000/01) a cada pocillo, seguido por la adición de 100 µl de solución de parada (BioFX, # LSTP1000/01). Las placas se leen a 450 nm con una corrección 570 nm usando un lector de placas SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La curva estándar se establece mediante el análisis de 4 parámetros y los valores de la muestra se determinan utilizando el software 3. 1. 2 Pro SOFTmax (Molecular Devices).

Como se muestra en la Tabla 12, los datos de ELISA de p-Met y c-Met total revelan que el tratamiento con el Mab C8-H241 reduce al máximo el p-Met en un 77 % y el c-Met total en aproximadamente un 67 %. El tratamiento con D11-8B8 reduce al máximo el p-Met en aproximadamente un 75 % y el c-Met total en un 63 %.

Como se ha indicado en el Ejemplo 8, estos datos demuestran que los anticuerpos C8– y D11 inducen la degradación de c-Met y reducen la fosforilación de c-Met.

Los datos de la Tabla 12 también indican que el tratamiento con los anticuerpos de c-Met C8–H241 y D11–8B8 no inducen escisión y desprendimiento del DE de c-Met.

Tabla 12

Efecto de los anticuerpos C8 y D11 en c-Met fosforilado, c-Met total, y desprendimiento del dominio extracelular de c-Met en lisados de células MKN45 y medio acondicionado Porcentaje de inhibición de c-Met fosforilado en MKN45

C8–H241: hIgG4 D11–8B8 hIgG2

Dosis del anticuerpo (ng/ml): Prom. desv. est. Prom. Desv. est. Prom. Desv. est. Prom. Desv. est.

10000: 77,0 2,4 –2,1 10,9 74,8 3,4 14,0 7,1

1000: 74,1 1,3 11,1 9,7 72,8 2,0 –4,6 10,9

100: 71,7 2,5 13,4 13,3 69,1 3,7 –7,6 24,4

10: 42,3 3,0 5,8 11,3 37,6 5,5 6,1 11,0

Prom.: Desv. est.

Sin tratar: 0,0 8,0

Porcentaje de inhibición de c-Met total en MKN45

C8–H241: hlgG4 D11–8B8 hgG2

10000: 63,1 1,6 –23,7 4,1 63,0 7,0 14,1 9,1

1000: 66,7 4,3 10,4 16,0 62,7 0,6 –2,4 22,4

100: 61,5 3,4 –3,7 14,4 62,9 2,5 7,3 9,1

10: 32,3 4,9 –3,4 13,5 34,5 8,4 15,1 7,0

Prom.: desv. est.

Sin tratar: 0,0 25,9

Nivel de DEC de c-Met en MKN45 –Medio acondicionado (ng / ml)

C8–H241: hlgG4 D11–8B8 hlgG2

10000: 5,1 0,5 7,4 0,7 6,2 0,2 7,0 0,1

1000: 6,1 0,8 7,6 0,4 7,2 0,5 7,2 0,5

100: 5,4 0,4 7,6 0,8 6,9 1,6 7,2 0,6

10: 6,6 0,2 8,4 1,1 6,2 0,4 7,2 0,1

Prom.: desv. est.

Sin tratar: 8,3 1,0

Ejemplo 11

Actividad agonista de los anticuerpos en células tumorales Caki-1 en ausencia de HGF

Las células de carcinoma renal Caki-1 proliferan en respuesta a HGF. La activación de c-Met en las células Caki-1 por los anticuerpos de c-Met en ausencia de HGF se examina en este ejemplo para evaluar la actividad agonista de 5 los anticuerpos c-Met de la presente invención.

Los pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos se siembran con 5.000 células de carcinoma de células renales humano Caki-1 (ATCC, # HTB-46) en medio de cultivo de McCoy 5A (Invitrogen, # 16600) suplementado con 10 % (v / v) DE FBS , L-glutamina 2 mM (Invitrogen, # 25030), 100 U / 500 ml de penicilina G y 100 µg / 500 ml de estreptomicina (Invitrogen, # 15140). Después de cultivar durante 24 horas, las células se dejan sin alimentar en 10 medio bajo en suero (0,5 % (v / v) de FBS) durante otras 24 horas. Después, las células se cultivan en presencia de anticuerpos de control anti–c–Met en medio bajo en suero a concentraciones finales como se indica en la Tabla 13 durante 24 horas a 37 °C, humedad relativa del 95 %, 5 % (v / v) de CO2. Durante las últimas seis horas del cultivo, las células se pulsan con 3H-timidina (MP Biomedicals, Solon, OH # 24066) a 1 µci/ / pocillo a 37 °C, humedad relativa del 95 %, 5 % (v / v) de CO2. Después se retira el medio y las células se lavan una vez con DPBS. Después

15 de esto, a cada pocillo se añaden 200 µl de Optiphase Supermix (PerkinElmer, # 1200-439). A continuación, las placas se sellan y se incuban durante al menos una hora a temperatura ambiente. La 3H-timidina incorporada en las células se cuenta durante un minuto usando un contador de centelleo.

Los datos de un experimento representativo se muestran en la Tabla 13.

Estos datos demuestran que los anticuerpos de c-Met C8-H241, C8-6, C8-co-16, y D11-8B8 no aumentan significativamente la captación de timidina-[metil-3H] en las células Caki-1 en comparación con la de los controles de isotipo IgG. D11–C27G3 y D11–S17Y exhiben una baja, variable, aunque estadísticamente significativa,

5 estimulación de la captación de timidina-[metil-3H] en las células Caki-1 en comparación con la del control de isotipo IgG. El anticuerpo agonista de control de c-Met 5D5 induce una captación de timidina [metil-3H] más fuerte que la de los presentes anticuerpos de c-Met en células Caki-1 en las mismas condiciones experimentales.

Ejemplo 12

Actividad agonista de los anticuerpos en hepatocitos humanos primarios en ausencia de HGF

10 La actividad agonista de los presentes anticuerpos de c-Met se evalúa adicionalmente en hepatocitos humanos primarios (PHH), que responden a HGF en ausencia de HGF.

Células PHH criopreservadas que se pueden sembrar en placas (KQG Celsis, Chicago, IL, RD # 00002) se descongelan a 37 °C y se resuspenden a 175.000 células / ml en medio InVitroGRO CP (Celsis, # Z99029) con la mezcla de antibióticos torpedo (Celsis, # Z99000). Se añaden 0,2 ml de células PHH resuspendidas por pocillo en 15 placas de microtitulación de 96 pocillos revestidos con colágeno I (BD, Franklin Lakes, NJ, # 354407) en 35.000 células / pocillo, y las células se incuban durante 24 horas a 37 °C, 5 % (v / v) de CO2. Después se aspira el medio de cultivo es y se añaden 150 µl por pocillo de medio InVitroGRO HI (Celsis, # Z99009) con la mezcla de antibiótico torpedo más 0,1 % (p / v) de BSA más 50 µl de anticuerpos de c-Met y de control en un intervalo de concentración final de 10 µg/ml a 0,0032 µg / ml o HGF a una concentración final de 200 ng / mL, en medio InVitroGRO HI con la 20 mezcla de antibiótico torpedo más 0,1 % (p / v) de BSA. Las células se incuban durante 48 horas a 37 °C, 5 % (v / v) de CO2 y se añaden 10 µl de 0,1 mCi de timidina-[metil-3H] / ml (MP Biomedicals, Solon, OH, # 24066) por pocillo durante las últimas 6 horas de incubación. Las placas de ensayo se congelan a -70 °C, se descongelan a 37 °C y se cosechan en placas UniFilter-96 GF / C (Perkin Elmer, Waltham, MA, # 6005174) utilizando una cosechadora Filtermate Harvester (Perkin Elmer). Las placas Unifilter se secan, se añaden 20 µl de líquido de centelleo Microscint

25 0 (Perkin Elmer, # 6013611) por pocillo, y las placas se cuentan en un contador de centelleo líquido 1450 Microbeta (Perkin Elmer).

La Tabla 14 muestra el promedio de los tratamientos por triplicado con desviaciones estándar, y es representativo de tres experimentos repetidos.

Los datos demuestran que en comparación con los controles dl isotipo IgG, los presentes anticuerpos de c-Met C8-H241 no aumentan significativamente la captación de timidina-[metil-3] en células PHH; C8-6, C8-co-16, D11-8B8, D11-C27G3 y D11-S17Y exhiben una estimulación baja, variable, pero estadísticamente significativa de la captación de timidina-[metil-3H]. Sin embargo, la actividad agonista de los presentes anticuerpos de c-Met es significativamente menor que la del anticuerpo de c-Met control 5D5. El anticuerpo agonista 5D5 estimula la proliferación de PHH de una manera dependiente de la dosis, con un aumento de 5 veces a una concentración de 3 μ / ml. A 200 µg / ml, HGF estimula un aumento de 5 veces la captación de 3H-timidina. El Mab C8-H241 no induce la proliferación ni cuando se utiliza a 10 µg / ml.

Se obtienen resultados similares en células epiteliales renales humanas HK2, que también proliferan en respuesta a la estimulación con HGF.

Ejemplo 13

Efecto de los anticuerpos sobre la morfogénesis tubular en las células HepG2 en ausencia de HGF

HGF induce cambios morfologénicos tubulares en las células HepG2 cultivadas en Matrigel™(Becton-Dickinson, # 354 234), un material de matriz extracelular que contiene componentes de la membrana basal. En este experimento, se evalúa la actividad agonista de tupo HGF de los anticuerpos de la presente invención en la inducción de cambios morfologénicos tubulares en las células HepG2.

Las células HepG2 (ATCC, # HB-8065) se cultivan en medio DMEM suplementado con 10 % de FBS. 100 µl de una solución Matrigel™ (Matrigel™, Becton–Dickinson) diluido en Opi-MEMI (Invitrogen, # 31985) suplementado con 10 % (v / v) de FBS, L-glutamina 2 mM (Invitrogen, # 25030), 100 U / 500 ml de penicilina G y 100 µg / 500 ml de estreptomicina (Invitrogen, # 15140) se siembran en pocillos de placas de 96 pocillos de cultivo tisular (Costar, # 3596). Una vez que la solución Matigel™ solidifica se añaden 2000 células HepG2 en 50µ l de medio de cultivo suplementado con 10 % de suero. A continuación, a las células se añaden los anticuerpos c-Met y de control a una concentración final de 50 µg / ml o HGF a una concentración final de 50 ng / ml. Las células se cultivan durante 4 días a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5 % (v / v) de CO2. Después de 4 días, se retira el medio de la parte superior y se reemplaza con 50 µl de de 1 mg / ml de p-yodonitro-tetrazolio violeta (Sigma, # 18377) en PBS, y las células se incuban durante otras 48 horas en las mismas condiciones. Se toman fotografías del área teñida de 32 mm y se analizan utilizando Image–Pro Plus 6 (Media Cybernetics, Inc., MD).

Los datos de un experimento representativo, para anticuerpos a 50 mµg / ml, se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15

Efecto de los anticuerpos C8 en la morfogénesis tubular en células HepG2

Anticuerpo (50 µg/ml): hlgG4 C8–H241 C8–co16 C8– 6 mlgG 5D5 NGF (50 ng/ml)

Morfogénesis tubular: Sin estimulación Sin estimulación Sin estimulación 1,2 1,2 4,9 5,4

Actividad agonista

(estimulación)

Estos datos demuestran que el HGF y el anticuerpo agonista de control 5D5 inducen cambios morfologénicos tubulares POR aproximadamente 5 veces en las células HepG2 en comparación con el control de isotipo. En contraste, los presentes anticuerpos de c-Met C8–H241 y C8–co16 no inducen cambios morfologénicos tubulares significativos en las células HepG2 en las mismas condiciones, mientras que el anticuerpo de c-Met C8-6 induce sólo un bajo nivel de estimulación.

Se obtienen resultados similares con el Mab D11-8-B8.

Ejemplo 14

Efecto de los anticuerpos en la motilidad celular: Ensayo de dispersión con DU145 y ensayo de raspado celular H441

Tras la estimulación con HGF, las células de cáncer de próstata DU145 se disocian unas de otras y células H441

llenan un raspado hecho en una capa de células confluentes. Las células H441 exhiben un alto nivel de expresión de c-Met y fosforilación constitutiva de este receptor, pero todavía responden a HGF. Los siguientes experimentos evalúan el efecto agonista de los anticuerpos de la presente invención sobre la motilidad celular en un ensayo de dispersión y un ensayo de raspado.

Ensayo de dispersión de células DU145

Las células DU 145 (ATCC, # HTB-81) cultivadas en medio MEM (Invitrogen, # 11095) + 10 % de FBS (Invitrogen, # 10082) a 37 C en 5 % (v / v) de CO2 se siembran a 2 x 103 células / pocillo en 70 µl de volumen en placas negras de de 96 pocillos ViewPlate (Perkin Elmer, Waltham, MA, # 6005182) y se incuban durante la noche a 37 C en 5 % (v / v) de CO2. Los anticuerpos de c-Met y control se diluyen en el medio de cultivo celular y se añaden a una concentración final de 20 µg / ml, y se añade HGF a una concentración final de 20 ng / ml, cada uno en 30 µl de volumen con doce repeticiones, y se incuban durante 48 horas a 37 °C en 5 % (v / v) de CO2. Después se aspira el medio y las células se fijan en 2 % de formaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS, y se añaden 50 µl de 5 U / ml de Alexa Fluor 488 faloidina (Invitrogen, # A12379) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan tres veces con PBS y se añaden 50 µl de yoduro de propidio 15 µM (Invitrogen, # P3566). La placa se lee posteriormente en un citómetro de microplacas de fluorescencia de barrido láser Acumen Explorer™ (TTP Labtech Ltd, Cambridge, MA) usando el software Jockyss con el fin de determinar el porcentaje de células DU145 en colonias.

Los resultados se muestran en la Tabla 16.

Tabla 16

Efecto de los anticuerpos en C8– y D11 en la dispersión celular DU145

Porcentaje de células DU145 en colonias

C8–H241: C8–6 C8–co–16 hIgG4 D11–8B8 hIgG2 5D5 HGF Sin tratar

Promedio: 24,13 23,29 23,69 24,41 25,57 25,67 14,45 8,15 26,53

Desv. Típica: 3,35 1,37 2,30 2,02 1,98 3,13 0,34 1,23 2,44

Los datos demuestran que el Mab agonista de c-Met 5D5 y HGF, pero no los Mab de c-Met C8-H241, C8-co-16, C86, o D11-8B8, estimulan significativamente la dispersión/motilidad de las células DU145.

Ensayo de raspado celular H441

Para el ensayo de raspado H441, las células H441 (ATCC, # HTB-174) se cultivan en medio RPM1-1640 (Invitrogen, # 11835); 10% (v / v) de FBS (Invitrogen, # 10082); L-glutamina 2 mM (Invitrogen, # 25030); 100 U / 500 ml de penicilina G, y 100 µg / 500 ml de estreptomicina (Invitrogen, # 15140)), y se siembran a 1 x 106 células / 2 ml / pocillo en placas de cultivo tisular de 6 pocillos (Costar, # 3598) en el medio de cultivo. Las placas se incuban durante 3 días con 95 % de humedad relativa y 5 % (v / v) de CO2. Después se aspira el medio y las células se dejan sin alimentos en medio bajo en suero (0,5 % (v / v) de FBS en medio RPMI) durante 16 horas. Las capas de células confluentes en el fondo de los pocillos se raspan con las puntas de las pipetas de 5 ml en medio de cada pocillo y se aspiran las células que flotan. Las células restantes se lavan 1 vez con medio bajo en suero. Se añade medio bajo en suero y se obtienen imágenes de las zonas raspadas usando un microscopio de campo claro con un objetivo 4X. Estos huevos se definen como Huecos a 0 horas.

Los anticuerpos de ensayo se añaden a las células a una concentración final de 10 µg / ml, seguido de incubación a 37 °C en 5% de CO2 (v/v) durante 16 horas. El HGF se ensaya a una concentración final de 200 ng / ml. Cada grupo de tratamiento se analiza al menos en pocillos duplicados. De nuevo se obtienen imágenes de las áreas raspadas usando un microscopio de campo claro a las 16 horas. Estos huevos se definen como Huecos a 16 horas.

El efecto de los anticuerpos de c-Met o de HGF sobre el movimiento de las células H441 para llenar los huevos se calcula como sigue:

Porcentaje de cambio promedio=

Grupo de tratamiento (hueco a 0 horas – Hueco a 15 horas) x 100

Grupo de medio promedio (hueco a 0 horas – Hueco a 16 horas)

Los resultados se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17

Efecto de los anticuerpos C8 en el Ensayo de raspado H441

Anticuerpo (10 Promedio % Desv. Est. µg/ml)

Medio 100 7 hIgG4 98 9 C8–H241 98 9 C8–6 102 4

mIgG1 98 18 Mab 5D5 244 4 HGF (200 ng/ml) 364 9

Los datos demuestran que el agonista de c-Met Mab 5D5 y HGF estimulan el movimiento de las células H441 / para 5 rellenar las zonas raspadas. En las mismas condiciones, los Mab de c-Met C8-H241 y C8-6 no estimulan la motilidad de las células H441.

Ejemplo 15

Efecto de los anticuerpos de c-Met sobre la invasividad de las células HepG2

Los anticuerpos agonistas de c-Met y HGF estimulan invasión de las células portadoras de c-Met. En este ejemplo 10 se examina la actividad agonista de los presentes anticuerpos de c-Met en un ensayo de invasión celular empleando células HepG2, que responden a HGF en un ensayo de invasión.

Las células HepG2 (ATCC, # H-8065) se dejan sin alimentar durante la noche en medio MEM libre de suero (Invitrogen, # 11095) y después se añaden 5 x 104 células en un volumen total de 500 µl a cada pocillo de la cámara superior de una cámara de invasión de Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ, # 354483), en la que la cámara inferior 15 contiene anticuerpos en un volumen total de 750µ l de medio libre de suero a una concentración de 10 µg / ml, o HGF a 50 ng / ml en medio libre de suero, seguido de incubación durante cuarenta y ocho horas a 37 °C en 5 % (v / v) de CO2. Las células no invasoras se retiran de la cámara superior con un hisopo, seguido de fijación de la membrana con etanol al 95 % y tinción con 0,2 % (p / v) de violeta cristal. Después del lavado y secado, el número de células invasoras se cuenta utilizando el software Image–Pro Plus 6 Manual Tag (Media Cybernetics, Inc. , MD)

20 de análisis de fotografías tomadas de las células teñidas con un objetivo 2,5X.

Los resultados se resumen en la Tabla 18.

Tabla 18

Efecto de los anticuerpos C8, C8, y D11 en la invasividad de las células HepG2

Concentración del anticuerpo HIgG4 (µg/ml): Número de células promedio por 2,5 x campo

C8–H241: C8 mIgG1 optD11 5D5 HGF (50 ng/ml) Medio

10,00: 5,5 3,5 4,3 5,5 19,8 85,0 509,5 3,5

Err. est.

0,5: 0,9 1,3 0,5 4,1 20,4 4,5
0,5

estimulan la invasión de HepG2. El Mab de c-Met murino optD11 induce débilmente la invasión de células HepG2.

Ejemplo 16

Los anticuerpos C8– and D11no protegen a las células Caki–1 de la apoptosis inducida por estaurosporina

Los anticuerpos de c-Met agonista y HGF protegen a las células de la muerte celular inducida por estaurosporina. 5 Este ejemplo examina la actividad agonista de los anticuerpos DE c-Met de la presente invención en un ensayo de la apoptosis inducida por estaurosporina usando células Caki-1 que responden a HGF.

Las células Caki-1 (ATCC, # HTB-46) se cultivan como se describe en el Ejemplo 11, se siembran a 1 x 104células / pocillo en placas de 96 pocillos (Costar, # 3596) en medio de cultivo, y se pretratan con anticuerpos (diluidos desde

30.000 ng / ml a 3 ng / ml en el medio de cultivo celular), o HGF (diluido desde 225 ng / ml a 0,02 ng / ml), durante

10 una hora, seguido de tratamiento con estaurosporina 0,1 µM (concentración final) durante cuarenta y ocho horas a 37 °C. El medio se aspira y las células se lisan durante 30 minutos con 0,2 ml del componente de tampón de lisis del kit ELISA de detección de muerte celular (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, #11774425001). Este kit utiliza 20 µl de cada lisado para medir la muerte celular mediante la detección de fragmentos de ADN asociados a histonas citoplásmicas según lo determinado por la absorción a 450 nm. Una densidad óptica a 450 nm más alta indica una

15 mayor apoptosis.

Los resultados mostrados en la Tabla 19 demuestran que el HGF, pero no los Mab de c-Met C8-H241, C8-6, y D118B8, protege a las células Caki-1 de la apoptosis inducida por estaurosporina.

Tabla 19

Efecto de los anticuerpos de c-Met sobre la apoptosis inducida por estaurosporina en células Caki-1

Dosis del anticuerpo (ng/ml): A450 nm promedio

hIgG4: C8–H241 C8–6 HGF hIgG2 D11–8B8 Medio ESTS*

3: 0,95 0,83 1,09 0,97 (0,02 ng/ml) 0,95 1,02 0,24 0,87

30: 0,98 0,84 1,02 0,93 (0,23 ng/ml) 0,91 0,91

300: 0,87 0,86 0,97 0,73 (2,25 ng/ml) 0,95 0,81

3000: 0,98 0,85 0,92 0,58 (22,5 ng/ml) 0,95 0,91

30000: 0,91 0,90 0,96 0,45 (225 ng/ml) 0,94 0,87

Err. est.

3: 0,03 0,02 0,19 0,02 0,07 0,01 0,01 0,03

30: 0,03 0,01 0,14 0,06 0,00 0,11

300: 0,10 0,03 0,06 0,03 0,02 0,02

3000: 0,04 0,01 0,12 0,01 0,06 0,02

30000: 0,00 0,01 0,13 0,06 0,04 0,03

*ESTS: Estaurosporina

20 Ejemplo 17 Efecto de los anticuerpos C8 sobre la angiogénesis Los anticuerpos agonistas de c-Met y HGF estimulan la angiogénesis. Los anticuerpos de c-Met de la presente invención se evalúan para esta propiedad agonista funcional en el ensayo de formación de tubos de cocultivo de CMTA / CFCE. Las células madre derivadas de tejido adiposo (CMTA) expresan HGF; las células formadoras de

25 colonias endoteliales (CFCE) tubos de formulario en respuesta a la estimulación por HGF.

Las ADCS (Lonza, Allendale, NJ, # PCT–5006) de disocian, se resuspenden en medio basal (medio MCDB–131 (Sigma, St. Louis, MO #M8537)) + 30 µg/ml de ácido L–ascórbico-2–fosfato (Sigma #A8960), dexametasona 1 µM (Sigma #D4902), 50 µg/ml de tobramicina (Sigma #T4014), 10 µg/ml de cebador celular–transferrina AF (Millipore #9701) + 10 µg/ml de nucelina (insulina recombinante humana de Lilly)), se siembran a 4 x 104 células / pocillo en placas de 96 pocillos y se incuban durante la noche a 37 °C en 5 % (v/v) de CO2. El medio se aspira y se añaden 500 µg/ml de heparina sódica (Sigma, # H3393) en medio basal a 100 µl / pocillo; las células se incuban después durante 1 hora a 37 °C. Los pocillos se aspiran, lavan una vez con 100 µl medio basal, y se agregan CFCE como sigue: CFCE

(EndGenitor Technologies, Inc., Indianápolis, IN #EGT–CFCE100506) se disocian, se lavan en medio basal, se resuspenden en medio basal, y se añaden a 4 x 103 células / pocillo en la parte superior de CMTA placas de 96 pocillos. Después de 4 horas de incubación a 37 °C, HGF y los anticuerpos se diluyen en el medio de cultivo celular y se añaden a pocillos separados en las siguientes concentraciones finales: HGF:100 ng/ml; anticuerpos: 10 µg/ml. El anticuerpo GHF (R&D Systems #AB–294–NA) también se añade a una concentración final de 10 µg/ml. Las células se incuban durante 4 días adicionales a 37 °C. Los pocillos se aspiran y se añaden 100 µl / pocillo de 1 % de paraformaldehído, seguido de incubación durante 20-30 minutos. Las células se lavan tres veces con PBS-BSA (0,1 % de BSA, Invitrogen # 15260-037) y se tratan con 50 µl de 1 µg / ml de anticuerpo CD31 anti-humano (R & D Systems, # AF806) durante 1 hora a 37 °C o durante la noche a 4 °C. Las células se lavan dos veces con PBS-BSA y se tratan con 50 µl de 4 µg / ml de IgG anti-oveja conjugado con AlexaFluor488 (Invitrogen, # A11015) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavan dos veces con PBS-BSA y se tiñen con 100 µl de colorante Hoechst3342 y se leen en un Cellomics ArrayScan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se usa el software VHCS View Versión 1, 4.6 para determinar las áreas tubulares totales, que se utilizan para evaluar el efecto de los diversos anticuerpos y el HGF sobre la estimulación de la angiogénesis.

Los resultados se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20

Efecto de los anticuerpos C8 sobre la formación de tubos en células CFC

Área total del tubo

Medio basal: hIgG4 C8–H241 C8–6 mIgG1 5D5 HGF Ab HGF

Promedio: 67753,3 90134,3 22979,7 65224,0 125538,3 147237,3 22824,3 212104,7

Desv. Est.: 24221,6 17741,1 604,9 18275,9 34702,4 18748,1 6586,0 16588,5

Los resultados demuestran que C8-H241 y C8-6 no estimulan la formación de tubos en comparación con el medio o sus anticuerpos de control de isotipo correspondientes, mientras que HGF y el Mab agonista 5D5 estimulan significativamente la formación de tubos.

Ejemplo 18

inhibición del crecimiento de células tumorales dependiente de HGF e independiente de HGF en modelos de xenoinjerto

La inhibición del crecimiento de células tumorales dependiente de HGF e independiente de HGF por los anticuerpos c-Met de la presente invención se examina en ensayos in vivo que emplean modelos de xenoinjerto de ratón de células MKN45 y U87MG (glioblastoma humano), respectivamente. Las células MKN45 expresan constitutivamente niveles altos de c-Met y fosforilación de c-Met en ausencia de HGF. Las células U87MG secretan HGF de una manera autocrina y responden a HGF.

Las células MKN45 (Japan Health Sciences Foundation, Health Science Research Resource, #JCRB0254) se expanden en cultivo como se describe en el Ejemplo 8, se digieren con tripsina en células individuales, se cosechan, y se resuspenden en PBS. Dos millones de células MKN45 en PBS se inyectan subcutáneamente en el flanco trasero de ratones desnudos atímicos (Harlan, Indianápolis, IN). Los anticuerpos de c-Met y los anticuerpos IgG2 y IgG4 correspondientes se diluyen en PBS, pH 7,2, y se administran una vez a la semana por inyección intravenosa a partir de 3 o 7 días después de la implantación de las células tumorales en 1, 5, o 20 mg / ml. La inhibición del crecimiento de las células tumorales se determina por medición mediante compás tridimensional de los volúmenes tumorales dos veces a la semana durante el curso del tratamiento. El peso corporal se mide como una medición general de la toxicidad.

Las células U87MG (ATCC # HTB-, 14) se cultivan en MEM (Invitrogen, # 11095) a 37 °C, se expanden en cultivo, se digieren con tripsina, se cosechan y se resuspenden en PBS (Invitrogen, # 14190). Cinco millones de células se

inyectan por vía subcutánea en el flanco trasero de ratones desnudos atímicos (Harlan, Indianápolis, IN). Los anticuerpos de c-Met se diluyen en PBS, y se administran una vez a la semana por inyección intravenosa a las dosis indicadas en la Tabla 22 a partir de 7 días después de la implantación de células tumorales. El anticuerpo control IgG4 se administra a 10 mg/kg. La inhibición del crecimiento de las células tumorales se determina por medición

5 mediante compás tridimensional de los volúmenes tumorales dos veces a la semana durante el curso del tratamiento. El peso corporal se mide como una medición general de la toxicidad.

La eficacia antitumoral de cuatro anticuerpos, D11-8B8, C8-H241, C8-6, y C8-Co-16 en el modelo de xenoinjerto de células MKN45 se resume en la Tabla 21. "% de inhibición máxima" representa el porcentaje de inhibición del crecimiento del tumor en comparación con el tratamiento con el anticuerpo de control correspondiente (inhibición 0

10 %).

Cuando se administran dosis de 5 mg / kg o 20 mg / kg, los cuatro anticuerpos de c-Met producen una inhibición significativa del crecimiento de las células tumorales MKN45 en comparación con sus correspondientes controles de isotipo IgG.

Tabla 21

Efecto de los anticuerpos C8– y D11 sobre el crecimiento tumoral independiente de HGF de MKN45 in vivo

Anticuerpo: Nivel de dosis (mg/kg) % inhibición máxima Valor p

D11–8B8: 5 53 p<0,05

20: 56 p<0,01

C8–H241: 1 39 NS

5: 63 p<0,01

20: 51 p<0,05

C8–6: 1 60 p<0,001

5: 59 p<0,01

20: 73 p<0,001

C8–Co–16: 1 36 NS

5: 60 p<0,001

20: 85 p<0,001

Una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento de células tumorales por C8-H241 también se observa en el modelo de xenoinjerto de células U87MG dependiente de HGF, tal como se resume en la Tabla 22. "% de inhibición máxima" representa el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento con el anticuerpo de control correspondiente IgG4 (inhibición del 0 %).

20 Tabla 22

Efecto del anticuerpo C8–H:241 sobre el crecimiento tumoral U87MG independiente de HGF in vivo

Anticuerpo: Nivel de dosis (mg/kg) % inhibición máxima Valor p

C8–H241: 0,1 45,2 NS

C8–H241: 0,3 86,8 p<0,001

C8–H241: 1 91,9 p<0,001

C8–H241: 3 91 p<0,001

C8–H241: 10 94,8 p<0,001

A 5 y 20 mg / kg, el anticuerpo C8-H241 también inhibe el crecimiento del tumor de xenoinjerto de cáncer de pulmón no microcítico H441 un 58% y 60%, respectivamente. Las células H441 exhiben un alto nivel de expresión de c-Met y fosforilación constitutiva de c-Met, pero todavía son sensibles a HGF.

Ejemplo 19

Reducción de anticuerpos de c-Met Total y fosforilado en tumores de xenoinjerto MKN45

La actividad in vivo del anticuerpo de c-Met C8-H241 sobre el c-Met total y c-Met fosforilado en ratones portadores de tumores de xenoinjerto MKN45 (independiente de HGF) se investiga en este ejemplo. Se observa una reducción dependiente de la dosis de c-Met total y c-Met fosforilado (en la tirosina 1349) 24 horas después de la administración del anticuerpo.

Las células MKN45 se expanden en cultivo como se describe en el Ejemplo 8, se digieren con tripsina y se cosechan. Dos millones de células MKN45 en PBS se inyectan subcutáneamente en el flanco trasero de ratones desnudos atímicos (Harlan, Indianápolis, IN). El anticuerpo frente a c-Met C8-H241 se diluye en PBS, a pH 7,2, y se administra por inyección intravenosa ocho días después de la implantación de células tumorales en 2,5, 5, 10, 20, y 40 mg / kg. El anticuerpo control hIgG4 se administra a 40 mg / kg. Después de 24 horas de tratamiento, se eliminan los tumores, se someten a congelación ultrarrápida, se almacenan temporalmente en -80 °C, y se lisan en tampón de lisis (ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM, etilenglicol-bis (b-aminoetil) -N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) 5 mM, HEPES 50 mM, 20 mM de pirofosfato de sodio (ThermoFisherScientific, # S390-500), NaCl 150 mM, NaF 20 mM, 1% (v / v) octilfenoxi polietoxi etanol (TRITON®-X 100), inhibidor de proteasa completo, sin EDTA (Roche, Basilea, Suiza, # 1836153) cóctel de inhibidores de fosfatasa I (Sigma # P2850), y el inhibidor de la fosfatasa cóctel II)).

ELISA de c-Met total

Para el ELISA de c-Met total, un anticuerpo de captura de c-Met se diluye en tampón de revestimiento Bup H (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, # 28382) a 2 µg/ml. Se añaden 100 µl de anticuerpo diluido por pocillo a placas de ELISA (ThermoFisherScientific, Waltham, MA # 439454), y las placas se incuban durante la noche a 4 °C. Los pocillos se aspiran, se lavan dos veces con TBS-T, y después se bloquean con 200 µl de tampón de bloqueo (TBS-T más 2 % (p / v) de BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan dos veces con TBS-T. A continuación, las diluciones de los lisados tumorales o el dominio extracelular de c-met (aminoácidos 25-932 de SEC ID Nº 75) se añaden, y las placas se incuban durante la noche a 4 °C. Las placas se lavan a continuación tres veces con TBS-T. A continuación, a cada pocillo se añaden 100 µl de 0,5 mg / ml de Mab 5D5 biotinilado (como segundo anticuerpo frente a c-Met que se une a un epítopo de c-Met diferente del anticuerpo de captura) diluido en tampón de bloqueo y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavan tres veces con TBS-T. Después se añaden 100 µl de estreptavidina conjugada con peroxidasa (diluida a 1/10.000 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, # 016-030-484) en tampón de bloqueo y la mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan a continuación tres veces con TBS-T. Se añaden 100 µl de solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (BioFX, # TMBW-1000/01) a cada pocillo, seguido por la adición de 100 µl de solución de parada (BioFX, # LSTP-1000/01). Las placas se leen a 450 nm usando un lector de placas SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) con el software SOFTmax Pro 3. 1. 2 (Molecular Devices).

ELISA de c-Met fosforilado

Para el ELISA de fosfo-c-Met total, un anticuerpo de captura de c-Met se diluye en tampón de revestimiento Bup H (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, # 28382) a 2 µg/ml. Se añaden 100 µl de anticuerpo diluido por pocillo a placas de ELISA (ThermoFisherScientific, Waltham, MA # 439454), y las placas se incuban durante la noche a 4 °C. Los pocillos se aspiran, se lavan dos veces con TBS-T, y después se bloquean con 200 µl de tampón de bloqueo (TBS-T más 2 % (p / v) de BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan dos veces con TBS-T. A continuación, se añaden los lisados de células MKN45 y las placas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Las placas se lavan a continuación tres veces con TBS-T. Después, a cada pocillo se añaden 100 µl de 0,5 µg/ml de anticuerpo anti-pY1349 c-Met (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, # 3121) diluido en tampón de bloqueo y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavan tres veces con TBS-T. Después se añaden 100 µl de IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa (diluida a 1/10.000 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, # 111–035–144) en tampón de bloqueo y la mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan a continuación tres veces con TBS-T. Se añaden 100 µl de solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (BioFX, # TMBW-1000/01) a cada pocillo, seguido por la adición de 100 µl de solución de parada (BioFX, # LSTP-1000/01). Las placas se leen a 450 nm usando un lector de placas SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) con el software SOFTmax Pro 3. 1. 2 (Molecular Devices).

Los resultados se muestran en la Tabla 23.

Los datos demuestran que el tratamiento in vivo de tumores de xenoinjerto MKN45 con el Mab C8-H241 durante 24 horas reduce al máximo el c-Met total en aproximadamente un 43 %, el c-Met fosforilado en aproximadamente un 73

%, en estas condiciones.

Tabla 23

Reducción de c-Met total y fosforilado en tumores de xenoinjerto MKN45 después del tratamiento 24 horas con el anticuerpo de c-Met C8-H241 in vivo

Reducción de c-Met total

% de inhibición: C8–H241 hIgG4

PBS: 2,5 mpk 5 mpk 10 mpk 20 mpk 40 mpk 40 mpk

% inhibición promedio: –88,51 –8,43 4,26 25,07 42,85 30,62 0,00

% inhibición desv. est.: 62,63 –8,43 36,84 26,88 17,67 35,95 41,23

Reducción de c-Met fosforilado

% de inhibición: C8–H241 hIgG4

PBS: 2,5 mpk 5 mpk 10 mpk 20 mpk 40 mpk 40 mpk

% inhibición promedio: 12,16 22,89 17,56 53,21 67,04 73,42 0,00

% inhibición desv. est.: 23,89 22,89 37,05 9,90 6,58 7,04 48,81

mpk: mg/kg

Secuencias de aminoácidos y nucleótidos

Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera D11–S17Y (SEC ID Nº 1)

D11–8B8 (SEC ID Nº 2)

D11–C27G3 (SEC ID Nº 3)

C8–6 (SEC ID Nº 4)

C8–co–16 (SEC ID Nº 6)

Secuencias de ácidos nucleicos de la región variable de la cadena ligera D11–S17Y (SEC ID Nº 7)

D11–8B8 (SEC ID Nº 8)

D11–C27G3 (SEC ID Nº 9)

C8–6 (SEC ID Nº 10)

C8–H241 (SEC ID Nº 11)

C8–co–16 (SEC ID Nº 12)

Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada D11–S17Y (SEC ID Nº 13)

D11–8B8 (SEC ID Nº 14)

D11–C27G3 (SEC ID Nº 15)

C8–6 (SEC ID Nº 16)

20

C8–H241 (SEC ID Nº 17)

50

C8–co–16 (SEC ID Nº 18)

Secuencias de ácidos nucleicos de la región variable de la cadena pesada D11–S17T (SEC ID Nº 19)

D11–8B8 (SEC ID Nº 20)

D11–C27G3 (SEC ID Nº 21)

C8–6 (SEC ID Nº 22)

C8–H241 (SEC ID Nº 23)

C8–co–16 (SEC ID Nº 24)

Secuencias de aminoácidos de la cadena ligera completa D11–S17 kappa (SEC ID Nº 25)

D11–8B8 kappa (SEC ID Nº 26)

D11–C27G3 kappa (SEC ID Nº 27)

C8–6 kappa (SEC ID Nº 28)

C8–h241 kappa (SEC ID Nº 29)

C8–co–16 kappa (SEC ID Nº 30)

Secuencias de ácidos nucleicos de la cadena ligera completa D11–S17Y LC (SEC ID Nº 31)

D11–8B8 LC (SEC ID Nº 32)

D11–C27G3 LC (SEC ID Nº 33)

C8–6 LC (SEC ID Nº 34)

C8–H241 LC (SEC ID Nº 35)

C8–co16 LC (SEC ID Nº 36)

Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada completa D11–S17Y IgG2 (SEC ID Nº 37)

D11–8B8 IgG2 (SEC ID Nº 38)

D11–C27G3 IgG2 (SEC ID Nº 39)

C8–6 IgG2 (SEC ID Nº 40)

C8–H241 IgG2 (SEC ID Nº 41)

C8–co–16 IgG2 (SEC ID Nº 42)

Secuencias de ácidos nucleicos de la cadena pesada completa D11–S17Y IgG2 HC (SEC ID Nº 43)

D11–8B8 IgG2 HC (SEC ID Nº 44)

D11–C27G3 IgG2 HC (SEC ID Nº 45)

C8–6 IgG4 HC (SEC ID Nº 46)

C8–H241 IgG4 HC (SEC ID Nº 47)

C8–co16 IgG4 HC (SEC ID Nº 48)

DEC de c-Met humano–Fc–Flis (SEC ID Nº 72)

Los aminoácidos en negrita y cursiva representan la secuencia señal; los aminoácidos subrayados en negrita representan el marcador Flis.

DEC de c-Met de mono cynomolgus–Fc–Flis (SEC ID Nº 73)

DEC de c-Met de rata–Fc–Flis (SEC ID Nº 74)

DEC de c-Met humano (SEC ID Nº 75)

Los aminoácidos en negrita y cursiva representan la secuencia señal.

Dominio Sema de c-Met humano con marcador Flis (SEC ID Nº 76)

Epítopos del anticuerpo C8 en el dominio extracelular de c-Met humano

10 121VVDTYYDDQL130 (SEC ID Nº 77) 131ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 78) 179ALGAKVLSSVKDRFTNF195 (SEC ID Nº 79) 216VRRLKETKDGFM227 (SEC ID Nº 80) 123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81)

15 144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82) 192FINF195 (SEC ID Nº 83) 220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84)

Epítopos del anticuerpo D11 en el dominio extracelular de c-Met humano

84YKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANL95 (SEC ID Nº 85)

95CFPCQDCSSKA105 (SEC ID Nº 86)

Secuencias consenso de CDR CDR2 de la cadena ligera del anticuerpo D11 GTSX1LX2S (SEC ID Nº 87), en el que X1es Y o R; y X2es A o R; CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo C8 SVSSSVX3SIYLH (SEC ID Nº 88), en el que X3 es S o R; CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo C8 X4X5YX6GYPLT (SEC ID Nº 89), en el que X4es I o Q, X5 es Q o V, y X6es S o R; CDR2 de la cadena pesada del anticuerpo D11 WIYPVTGDTYYX7EX8FKG (SEC ID Nº 90), en la que X7 es N, 1, o R, y X8 es K o P; CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo D11 GYGAFX9Y (SEC ID Nº 91), en la que X9 es Y o F; CDR2 de la cadena pesada del anticuerpo C8 RVNPX10RX11X12TTYNQKFEG (SEC ID Nº 92), en la que X10 es N o Y, X11 es G o R, y X12 es G o S; CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo C8 X13NX14LDY (SEC ID Nº 93), en la que X13 es T o A, y X14 es W o I;

Secuencias consenso de la región variable de la cadena ligera D11– Secuencia consenso de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo (SEC ID Nº 94)

en la que X1 es Y o R, y X2es A o R;

en la que X3 es S o R, X4es I o Q, X5es Q, o V, y X6es S o R;

Secuencias consenso de la región variable de la cadena pesada D11– Secuencia consenso de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (SEC ID Nº 96)

en la que X7 es N, I, o R, X8 es K o P, y X9 es Y o F;

Listado de secuencias

<110> Eli Lilly and Company

<120> Anticuerpos de c–Met

<130> X–18217

<150>: 61/116825 <151> 2008–11–21

<150>: 61/219903 <151> 2009–06–24

<160> 97

<170> PatentIn versión 3,5

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 1

5 <210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 2

<210> 3

<211> 108 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 3 <210> 4

<211> 108 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 4

<210> 5

<211> 108

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

10 <400> 5

15 <210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 6

<210> 7

<211> 324 5 <212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 7

15

<210> 8

<211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 8

<210> 9

<211> 324 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 15

<400> 9

20 <210> 10

<211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 10

5

<210> 11

<211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 11

15

<210> 12

<211> 324 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 25

<400> 12 <210> 13

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 13

<210> 14

<211> 115

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 14

<210> 15 10 <211> 115

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Construcción sintética

<400> 15 <210> 16

<211> 114 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 16 <210> 17

<211> 114 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 17 <210> 19

<210> 18

<211> 114

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 18

10

<211> 345 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 20

<400> 19 <210> 20

<211> 345 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 20

15 <210> 21

<211> 345

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 21

<210> 22

<211> 342 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 22 <210> 24

15

<210> 23

<211> 342

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 23

25

<211> 342 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 24

15 <210> 25

<211> 215

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 25

<210> 26 5 <211> 215

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Construcción sintética

<400> 26 5 <210> 27

<211> 215

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 27

<210> 28 5 <211> 215

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Construcción sintética

<400> 28

<210> 29 5 <211> 215

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Construcción sintética

<400> 29

5: <210> 30 <211> 215 <212> PRT <213> Secuencia artificial

10: <220> 85

<223> Construcción sintética

<400> 30

<210> 31

<211> 645

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Construcción sintética

<400> 31

<210> 32

<211> 645 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 15

<400> 32 <210> 33

<211> 645 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 33

<210> 34

<211> 645

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 34

10

<210> 35

<211> 645

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 35

20

<210> 36

<211> 645 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 36

15 <210> 37

<211> 441

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 37

<210> 38

<211> 441 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 38

<210> 39

<211> 441 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 39

<210> 40

<211> 440 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 40

<210> 41

<211> 440 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 41

<210> 42

<211> 440

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 42

<210> 43

<211> 1323

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 43

<210> 44

<211> 1323 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 15

<400> 44 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>: 10 <223> Construcción sintética

<400> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>: 10 <223> Construcción sintética

<400> 46

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>: 10 <223> Construcción sintética

<400> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>: 10 <223> Construcción sintética

<400> 48

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>: 10 <223> Construcción sintética

<400> 49

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 50

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 51

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 52 <210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 53

<210> 54

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 54

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 55 <210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 56

<210> 57

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 57

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 58

<210> 59

<211> 10 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 59

15 <210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 60

<210> 61

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 61

5 <210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 62

<210> 63

<211> 7

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

25 <400> 63

<210> 64 30 <211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 64

<210> 65

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 15

<400> 65 <210> 67

20

<210> 66

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 66

30

<211> 6 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 67

15 <210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción sintética

<400> 68

<210> 69

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 69

<210> 70

<211> 17

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

15 <400> 70

<210> 71 20 <211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Construcción sintética

<400> 71

<210> 72

<211> 1192

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

<210> 73

<211> 1192

<212> PRT

<213> Macao mulatta

<400> 73

<210> 74

<211> 1194

<212> PRT

<213> Rattus rattus

<400> 74

<210> 75

<211> 932

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

<210> 76

<211> 578

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

<210> 77

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

5 <210> 78

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 78

<210> 79 15 <211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79 20

<210> 80

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

<210> 81

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

<210> 82

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83 Phe Ile Asn Phe

<210> 84

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84

<210> 85

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 85

10

<210> 86

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 86

20 <210> 87

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature 30 <222> (4)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220> <221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 87

<210> 88

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 88

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 89

<210> 90

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 90

<210> 91 <211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 91

<210> 92

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(8)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 92 <210> 93

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 93

<210> 94

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature <222> (54)..(54)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220> 5 <221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 94 10

<210> 95 15 <211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Construcción sintética

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>: misc_feature 5 <222> (90)..(91)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>: misc_feature 10 <222> (93)..(93)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 95

<210> 96

<211> 115 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética 25

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

5 <220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(63)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

10 <220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(104)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

15 <400> 96

<210> 97

<211> 114

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<220>

<221>: misc_feature 5 <222> (54)..(54)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>: misc_feature 10 <222> (56)..(57)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>: misc_feature 15 <222> (99)..(99)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>: misc_feature 20 <222> (101)..(101)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 97

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo monoclonal de c-Met, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR), en el que LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SVSSSVSSIYLH (SEC ID Nº 53) , LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEC ID Nº 54), LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos QVYSGYPLT (SEC ID Nº 56), HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTDYYMH (SEC ID Nº 65), HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEC ID Nº 68), y HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos ANWLDY (SEC ID Nº 69).
2.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 que se une a un epítopo dentro de la cadena α de c-Met humano e induce la internalización de c-Met humano de la superficie celular.
3.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que induce internalización independiente del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) del c-Met de la superficie celular.
4.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) 121VVDTYYDDQL130 (SEC ID Nº 77),

b) 131ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 78),

c) 179ALGAKVLSSVKDRFINF195 (SEC ID Nº 79), y

d) 216VRRLKETKDGFM227(SEC ID Nº 80).
5. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a.

123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81),

b.

144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82),

c.

192FINF195 (SEC ID Nº 83), and

d.

220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84).
6.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une una secuencia de aminoácidos dentro del epítopo conformacional caracterizado por 123DTYYDD128 (SEC ID Nº 81), 144HVFPHNHTADIQS156 (SEC ID Nº 82), 192FINF195 (SEC ID Nº 83), and 220KETKDGFM227 (SEC ID Nº 84) inclusive.
7.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5 y la HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 17.
8.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprenda una cadena ligera que tiene una región constante kappa y una cadena pesada que tiene una región constante de cadena pesada de IgG4.
9.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una cadena ligera codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 35, y una cadena pesada codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 47.
10.

Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende dos cadenas ligeras codificadas por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 35 y dos cadenas pesadas codificadas por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 47.
11.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la secuencia de aminoácidos de dicha cadena ligera es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 35; y la secuencia de aminoácidos de dicha cadena pesada es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de polinucleótidos de

SEC ID Nº 47.
12.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 10, que comprende dos cadenas ligeras, en el que la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID

5 Nº 35; y dos cadenas pesadas, en el que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº 47.
13. Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y una cadena pesada que tiene una región constante de LA cadena pesada de IgG4.

10 14. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 13 que comprende dos cadenas ligeras que tienen la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 29 y dos cadenas pesadas que tienen una región constante de cadena pesada de IgG4.
15. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del

mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y un vehículo, diluyente o excipiente 15 farmacéuticamente aceptable.
16.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en terapia.
17.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en el tratamiento de cáncer en un ser humano.

20 18. Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho cáncer es cáncer gástrico, de riñón, de colon, colorrectal, de cabeza y cuello, de próstata, melanoma o de pulmón.