ES2549775T3 - Variantes de glucósido hidrolasas - Google Patents

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Abstract

Polipéptido de variante aislada que tiene actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 de al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, incluso más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 95 % y de la forma más preferible al menos 97 %, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a la posición 373 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 373 y la variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa original, donde las propiedades mejoradas se seleccionan del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.

Description

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de 10. Los parámetros de alineación en pareja fueron Ktuple=1, penalización por espacio =3, ventanas =5 y diagonales=5.
[0044] Las glucósido hidrolasas originales sustancialmente homólogas pueden tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras como se ha descrito anteriormente y otras sustituciones que no afectan significativamente al pliegue tridimensional o a la actividad de la proteína o el polipéptido; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones del amino o carboxilo-terminal, tales como un residuo de metionina aminoterminal, un pequeño péptido de enlace de hasta 20-25 residuos aproximadamente o una pequeña extensión que facilita la purificación (una marca de afinidad), tal como un tracto de polihistidina o proteína A (Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198: 3. Véase, también, en general, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Ejemplos de modificaciones conservadoras están en el grupo de los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y pequeños aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las modificaciones de aminoácidos, que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que ocurren más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly al igual que a la inversa (Taylor, 1986, Journal of Theoretical Biology 119: 205-218.
[0045] Aunque los cambios anteriormente descritos son preferiblemente de una naturaleza menor, tales cambios también pueden ser de una naturaleza considerable tal y como fusión de polipéptidos mayores de hasta 300 aminoácidos o más tanto como extensiones amino-terminales como carboxilo-terminales.
[0046] Además de los 20 aminoácidos estándares, los aminoácidos no estándares (como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y alfa-metil serina) pueden sustituirse por residuos de aminoácidos de una glucósido hidrolasa de tipo salvaje. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético y los aminoácidos no naturales se pueden sustituir por residuos de aminoácidos. Los "aminoácidos no naturales" han sido modificados después de la síntesis de proteína y/o tienen una estructura química en su/s cadena/s lateral/es diferente de los aminoácidos estándares. Los aminoácidos no naturales pueden ser sintetizados químicamente y preferiblemente están disponibles comercialmente, e incluyen ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, dehidroprolina, 3-y 4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.
[0047] Preferiblemente, la glucósido hidrolasa original comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En una forma de realización preferida, el polipéptido original comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, el polipéptido original comprende los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, el polipéptido original comprende los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, el polipéptido original consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, el polipéptido original consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, el polipéptido original consiste en los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, el polipéptido original es codificado por la secuencia de nucleótidos contenida en el plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B-30683, caracterizado por el hecho de que la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, el polipéptido original es codificado por la región de codificación de polipéptido maduro contenida en el plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B-30683.
[0048] Un fragmento de SEC ID n.º: 2 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos borrados del amino y/o carboxilo terminal de esta secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, un fragmento contiene al menos 450 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 470 residuos de aminoácidos y de forma más preferible al menos 490 residuos de aminoácidos.
[0049] En un segundo aspecto, la glucósido hidrolasa original es codificada por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones de astringencia baja, preferiblemente condiciones de astringencia media, más preferiblemente, condiciones de astringencia media-alta, incluso más preferiblemente, condiciones de astringencia alta y de forma más preferible, condiciones de astringencia muy alta con una sonda de nucleótidos que se hibridiza bajo las mismas condiciones con (i) (i) los nucleótidos 52 a 1539 de SEC ID n.º: 1, (ii) la secuencia genómica de nucleótidos que comprende los nucleótidos 52 a 1539 de SEC ID n.º: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) o (iv) una cadena complementaria de (i); (ii) o (iii) (J. Sombroso, E.F. Fritsch y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, New York). La subsecuencia de la SEC ID n.º: 1 puede ser al menos 100 nucleótidos contiguos o preferiblemente al menos 200 nucleótidos contiguos. Por otra parte, la subsecuencia puede codificar un fragmento polipeptídico que tiene actividad de glucósido hidrolasa.
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[0050] Una subsecuencia de SEC ID n.º: 1, u homóloga de la misma, es una secuencia de nucleótidos en la cual uno o más nucleótidos han sido delecionados del extremo 5' y/o 3'. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos
1.350 nucleótidos, más preferiblemente al menos 1.410 nucleótidos y de forma más preferible al menos 1.470 nucleótidos.
[0051] El polipéptido original también puede ser una variante alélica de un polipéptido que tiene actividad de glucósido hidrolasa. Una variante alélica denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede suponer polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones de gen pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
[0052] La secuencia de nucleótidos de SEC ID n.º: 1 o una subsecuencia de la misma, al igual que la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2 o un fragmento de la misma, se puede utilizar para diseñar sondas de nucleótidos para identificar y clonar polipéptidos originales de codificación de ADN que tengan actividad de glucósido hidrolasa a partir de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o la especie de interés, siguiendo procedimientos estándares de hibridación de Southern, para identificar y aislar el gen correspondiente. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, preferiblemente al menos 25 y más preferiblemente al menos 35 nucleótidos de longitud. También pueden utilizarse sondas más largas. Pueden utilizarse tanto la sonda de ADN como la de ARN. Las sondas típicamente son marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina).
[0053] Una genoteca de ADN genómico o ADNc obtenido a partir de esos otros organismos se puede seleccionar para ADN que se hibrida con las sondas anteriormente descritas y que codifica un polipéptido original que tiene actividad de glucósido hidrolasa. El ADN genómico u otro ADN de esos otros organismos se pueden separar por agarosa o electrofóresis en gel de poliacrilamida u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado se puede transferir y ser inmovilizado en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo a SEC ID n.º: 1 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en una hibridación de Southern. Para fines de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de nucleótidos hibridiza a una sonda de nucleótidos marcada correspondiente a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n.º: 1 o su cadena complementaria o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de astringencia de baja a muy alta. Las moléculas a las cuales la sonda se hibrida pueden ser detectadas usando, por ejemplo, película radiográfica o cualquier medio de deleción conocido en la técnica.
[0054] En una forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID n.º: 2 o una subsecuencia de la misma. En otra forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos es SEC ID n.º: 1. En otra forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos son los nucleótidos 52 a 1539 de SEC ID n.º: 1. En otra forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos es la secuencia de ácidos nucleicos contenida en el plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B-30683, caracterizada por el hecho de que la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos es la región de codificación de polipéptido maduro contenida en el plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B-30683.
[0055] Para las sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia baja a muy alta son definidas como prehibridación e hibridación a 42º C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y bien formamida al 25 % para astringencias bajas, formamida al 35 % para astringencias medias y medias-altas o formamida al 50 % para astringencias altas y muy altas, siguiendo procedimientos estándares de hibridación de Southern durante 12 a 24 horas óptimamente.
[0056] Para las sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0,2 % preferiblemente al menos a 50º C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55º C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60º C (astringencia media-alta), de forma más preferible al menos a 65º C (astringencia alta), e incluso de forma más preferible al menos a 70º C (astringencia muy alta).
[0057] Para las sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia son definidas como prehibridación, hibridación y lavado post-hibridación a aproximadamente 5º C hasta aproximadamente 10º C por debajo de la Tm calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings de the National Academy de Sciences USA 48:1390) en 0,9 M de NaCl, 0,09 M de tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, NP-40 al 0,5 %, 1X Solución de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos estándares de hibridación de Southern durante 12 a 24 horas óptimamente.
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preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 371 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Cys como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 371 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución Y371C de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0141] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Phe como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0142] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ala como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T462A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0143] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 227 y 259 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 227 y 259 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Gly (o Ala o Leu) como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 227 y 259, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones P227G (o P227A o P227L) + D259N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0144] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 227 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 227 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Ala (o Leu o Gly) y Trp como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 227 y 486, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º:
2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones P227A (o P227L o P227G) + C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0145] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 301 y 337 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 301 y 337 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Ser y Val como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 301 y 337, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones N301S + E337V de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0146] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 196 y 350 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 196 y 350 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Pro (o Thr o Phe) como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 196 y 350, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones S196P (o S196T o S196F) + T350S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0147] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 22 y 467 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 22 y 467 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Asp o Ser como sustituciones en posiciones
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Variante de Cel7A
Sustituciones de aminoácidos* Relación de mejora
Tipo salvaje
ninguna 1
G205R
G205R
2,60
776-M1
T226A 6,20
776-M3
P227A, C486W 7,80
776-M4
S113N, S196T, T462A 6,00
776-M21
N301S, E337V 4,00
776-M22
S196P,T350S 1,60
776-M23
G22D, G467S 1,40
776-M26
S21P, S57N 3,80
776-M27
S411F 7,60
776-M30
T41I 2,60
776-M32
K157R, G205R, T255P 5,20
776-M35
G205R, S411F 8,40
776-M40
G205R, P227A 10,20
776-M41
G205R, H206Y 3,40
776-M42
S8P, G205R 4,60
776-M52
G94S, G205R 4,00
776-M53
S196P, G205R 4,80
776-M57
S113N, S196T, P227A, T462A 14,60
776-M65
S57N 5,00
776-M71
T383A, T455A 2,60
776-M73
N373H 4,80
776-M101
S113N, S411F 12,40
776-M108
T41I, E193K, S411F 15,60
776-M109
N49S, S113N, P227A, P438L 15,00
776-M124
Y247C y 371C, S411F 17,40
776-M125
S21P, S57N, T246I, R251K, S411F 18,00
776-M192
K157R, G205R, T255P, S411F 15,00
776-M216
S113N, S196T, P227A, S411F 17,80
776-M252
S113N, S196T, P227A, T356I, T462A 19,20
*La numeración utiliza el primer residuo de la enzima Cel7A madura como posición 1.

Ejemplo 11: Secuenciación de ADN de las variantes
[0595] Para determinar la secuencia de las variantes de celobiohidrolasa I Cel7A derivadas de las bibliotecas de los
5 Ejemplos 7 y 9, se aisló ADN plásmido. Cada variante fue estriada sobre medio de selección de levadura de agar e incubada durante 3-5 días a 30° C. Ocho colonias fueron aisladas e inoculadas en 1 ml de medio de selección de levadura y cultivadas durante 5-8 días a 30° C. Las placas de agar fueron recultivadas a 30° C durante 3-5 días. El caldo de cultivo de las colonias individuales de cada variante fue evaluada con relación a la actividad térmica mejorada de la variante de celobiohidrolasa I Cel7A como se describe en el Ejemplo 10 para determinar cuáles tuvieron índices de
10 actividad térmica mejorada con relación a la celobiohidrolasa I Cel7A de tipo salvaje (ts). El plásmido fue rescatado de las colonias que produjeron variantes de celobiohidrolasa I Cel7A con actividad térmica mejorada como describen Kaiser y Auer, 1993, BioTechniques 14: 552, usando la cepa de E. coli XL-10 (Stratagene Inc., La Jolla, CA).
[0596] La secuenciación del ADN fue realizada usando un secuenciador ABI 3700 (Applied Biosystems, Foster City, CA)
15 usando química de terminador de tinte (Giesecke et al., 1992, Journal de Virol. Methods 38: 47-60). El ADN plásmido para secuenciación fue preparado usando un Biorobot 9604, (QIAGEN Valencia, CA). La región de codificación entera para variante de celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei fue ordenada usando 0,5 µl de ADN plásmido y 3,2 pmol de los siguientes cebadores:
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generación de biblioteca Los primeros 5 ciclos de la reacción de amplificación fueron compuestos por tampón 1X PCR, 0,2 mM de dNTPs, 100 ng de megacebador de sentido (5'), 100 ng de megacebador antisentido (3') y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333 programadas durante 1 ciclo a 95° C durante 3 minutos seguidos de 5 ciclos cada uno a 95° C durante 30 segundos, 55° C durante 60 segundos y 72° C durante 90 segundos. A esta reacción, se agregaron 50 pmol de cebador aGal776.1 y aGal776.1A para amplificar el fragmento aleatorizado de sitio recién generado en la reacción de 5 ciclos precedente. Las reacciones después de la adición de los nuevos cebadores fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333 programado durante 30 ciclos cada uno a 95° C durante 30 segundos, 55° C durante 60 segundos y 72° C durante 90 segundos (extensión final de 5 minutos). Los fragmentos de la PCR resultantes luego fueron purificados usando un equipo de PCR QIAquick según las instrucciones del fabricante. El fragmento de PCR final luego fue transformado directamente en la levadura junto con el plásmido pJC106 escindido con BamH I y Xho I (Ejemplo 6).
[0607] Ya que la Taq ADN polimerasa usada tiene baja actividad de corrección, el proceso de mutagénesis de saturación puede haber introducido mutaciones nuevas en la secuencia codificante además de los cambios diseñados en las posiciones 94, 196 y 227. Las bibliotecas que contienen aminoácidos aleatorizados específicos de sitio fueron seleccionadas como se describe en el ejemplo 10. Como se muestra en la tabla 2, varias sustituciones que mejoraron el índice de actividad térmica a 63° C/50° C en relación con el tipo salvaje fueron descubiertos además de las sustituciones identificadas mediante selección de bibliotecas mutagenizadas aleatoriamente. Por ejemplo, la variante 776-M3 se obtuvo de la selección de una biblioteca primaria, donde una prolina en la posición 227 fue convertida a una alanina. En la selección de la biblioteca aleatorizada específica de sitio en esta posición, se identificaron sustituciones a leucina y a glicina al igual que alanina.
[00608] Además de descubrir las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 227, 94 y 196, que confieren termoestabilidad y actividad mejoradas, se identificó una segunda mutación de sitio que podría mejorar la actividad térmica. Específicamente, la sustitución D259N fue identificada en la variante 776-M273 como se muestra en tabla 2.
Tabla 2, variantes de Cel7A con termoestabilidad mejorada que contiene sustituciones en las posiciones 227, 94 y 196. "Relación de mejora" indica la mejora relativa en el índice de actividad térmica, medida a 63° C/50° C.
Variante de Cel7A tipo salvaje
Sustitución de aminoácidos* ninguna Relación de mejora 1 Tipo de librería ninguna
776-M3
P227A, C486W 2,67 primaria
776-M259
P227L 1,50 Aleatorización específica de sitio en 227
776-M273
P227G, D259N 3,00 Aleatorización específica de sitio en 227
776-M274
P227A 2.67 Aleatorización específica de sitio en 227
776-M275
P227L 2,00 Aleatorización específica de sitio en 227
776-M52
G94S, G205R 2,00 primaria
776-M268
G94A, T226A 2,67 Aleatorización específica de sitio 94
776-M264
G94R 2,07 Aleatorización específica de sitio en 94
776-M266
G94Q 2,17 Aleatorización específica de sitio en 94
776-M269
G94A 2,03 Aleatorización específica de sitio en 94
776-M53
S196P, G205R 1,50 primaria
776-M4
S113N, S196T, T462A n.a. primaria
776-M261
S196P 1,33 Aleatorización específica de sitio en 196
776-M263
T41I, S196F 1,67 Aleatorización específica de sitio en 196
*La numeración utiliza el primer residuo de la enzima Cel7A madura como posición 1.

Ejemplo 15: Construcción de los vectores de expresión pMJ04, pMJ06 y pMJ09
[0609] El vector de expresión pMJ04 fue construido por PCR amplificando el terminador del gen de celobiohidrolasa 1 (cbh1) de Trichoderma reesei de ADN genómico de Trichoderma reesei RutC30 usando cebadores 993429 (antisentido) y 993428 (sentido) mostrados más abajo. El cebador de antisentido fue creado genéticamente para que tuviera un sitio Pac I en el extremo 5' y un sitio Spe I en el extremo 3' del cebador de sentido.
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