ES2552018T3 - Construcción de una proteína asociada a la latencia que contenga un sitio de escisión sensible a la agrecanasa - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un péptido asociado a la latencia (LAP) que es el dominio precursor de TGFß-1, -2, -3, -4 o -5 y un principio farmacéuticamente activo en el que el LAP y el principio farmacéuticamente activo están unidos por una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa escindido por ADAMTS-4 (agrecanasa-1) o ADAMTS-5 (agrecanasa-2).

Description

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DESCRIPCIÓN

Construcción de una proteína asociada a la latencia que contenga un sitio de escisión sensible a la agrecanasa

5 [0001] La presente invención se refiere a proteínas de fusión y constructos de ácido nucleico que confieren latencia a principios farmacéuticamente activos donde el principio farmacéuticamente activo se libera por la acción de una agrecanasa. Dichos productos son útiles en el tratamiento de la artritis y el cáncer.

[0002] La mayoría de las citocinas y los factores de crecimiento se expresan bajo mecanismos de control estrictos.

10 Su expresión génica está regulada por estímulos ambientales como las infecciones, las interacciones célula-célula, el cambio en la composición de la matriz extracelular y las interacciones con las moléculas de adhesión o mediante la estimulación con otras citocinas.

[0003] Además del control a nivel transcripcional y postranscripcional, algunas citocinas no se liberan en el medio a

15 menos que una segunda señal active la célula. Un tercer nivel de regulación de la actividad de las citocinas se encuentra en moléculas que son secretadas en forma latente y son "activadas" mediante liberación de la porción de citocina en donde tienen lugar procesos de inflamación, cicatrización de heridas y reparación de tejidos (Khalil N, Microbes and Infection, 1, 1255-1263 (1999). Con respecto a esto último, el factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) ha recibido gran atención.

20 [0004] TGFβ se sintetiza como una citocina latente dimérica compuesta de una proteína amino terminal asociada a la latencia (LAP) y la citocina TGFβ activa en su extremo terminal COOH (Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, 419-472 (1996); Roth-Eicchorn et al., Hepatology, 28 1588-1596 (1998)). El péptido precursor contiene un péptido señal (residuos 1-29) necesario para la secreción de

25 la proteína y para guiar a la molécula a través del aparato de Golgi a fin de ser procesada por escisión proteolítica y glucosilación. El dominio de LAP se separa de TGFβ por escisión proteolítica en las argininas (277-278). TGFβ maduro comienza en la alanina 279. LAP, además de proteger a TGFβ, contiene residuos importantes necesarios para la interacción con otras moléculas. Las mutaciones en el dominio de LAP se han asociado recientemente a la enfermedad autosómica dominante de Camurati-Engelmann (Janssens et al., Nature Genetics, 26, 273-275 (2000).

30 Las cisteínas 224 y 226 son importantes en el enlace disulfuro intermolecular entre dos LAP. Su mutación a serina transforma la molécula en "activa" ( Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 92, 2572-2576 (1995); Brunner et al., Mol. Endocrinol. 6, 1691-1700 (1992); Brunner et al., J. Biol. Chem, 264, 13660-13664 (1989)). El motivo RGD (245-247) facilita la interacción con integrinas ( Munger et al., Mol, Biol. of the Cell, 9, 2627-2638 (1998; Derynck R, TIBS, 19, 548-553 (1994)). El ácido nucleico que codifica a TGFβ se describe en US 5801231.

35 [0005] En la mayoría de los tipos de células estudiados, que incluyen los de origen mesenquimático, epitelial y endotelial, TGFβ se secreta en una forma latente que consta de TGFβ y sus dímeros del propéptido del péptido asociado a la latencia (LAP), unidos covalentemente a proteínas de unión a TGFβ latente (LTBP). Las LTBP también son necesarias para la secreción y el plegamiento de TGFβ (Miyazano et al., EMBO J. 10, 1091-1101 (1991);

40 Miyazano et al., J. Biol. Chem. 267, 5668-5675 (1992); Eklov et al., Cancer Res. 53, 3193-3197 (1993)). La cisteína 33 es importante para el puente disulfuro con la tercera repetición rica en 8 cisteínas de la proteína de unión a TGFβ latente (LTBP) ( Saharinen et al., The EMBO Journal, 15, 245-253 (1996). La modificación de LTBP por enzimas como la trombospondina ( Schultz et al., The Journal of Biological Chemistry, 269, 26783-26788 (1994); Crawford et al., Cell, 93, 1159-1170 (1998)), la transglutaminasa ( Nunes et al., J. Cell, Biol. 136, 1151-1163 (1997); Kojima et

45 al., The Journal of Cell Biology, 121,439-448 (1993)) y MMP9, MMP2 ( Yu y Stamenkovic, Genes and Dev, 14, 163176 (2000)) podría liberar la porción activa de TGFβ del complejo latente.

[0006] Las citocinas son productos naturales que sirven como mediadores locales solubles de las interacciones célula-célula. Tienen una variedad de acciones pleiotrópicas, algunas de las cuales se pueden aprovechar con fines

50 terapéuticos. La administración dirigida de citocinas a tipos celulares específicos empleando scFv (Lode et al., Pharmacol. Ther, 80, 277-292 (1998)) y vWF (Gordon et al., Human Gene Therapy, 8, 1385-1394 (1997)) se ha centrado exclusivamente en la porción activa de la citocina del complejo de citocina.

[0007] Las proteínas farmacológicamente activas u otros medicamentos a base de dichos agentes, que deben ser

55 administrados sistémicamente en concentraciones muy altas para lograr concentraciones biológicamente eficaces en el tejido al que son dirigidos, tienden a producir efectos sistémicos indeseables, por ejemplo toxicidad, que limitan su uso y eficacia.

[0008] Los principios subyacentes a la construcción de un sistema de ese tipo para proporcionar latencia a principios

60 farmacéuticamente activos usando el LAP de TGF-β se describieron en WO 02/055098. Los inventores de la presente han desarrollado en la actualidad una mejor manera para proporcionar principios farmacéuticamente activos en forma latente basándose en este sistema.

[0009] Según un primer aspecto de la invención, se proporciona una proteína de fusión que comprende un péptido asociado a la latencia (LAP) que es el dominio precursor de TGFβ-1, -2, -3, -4 o -5 y un principio farmacéuticamente activo en la que el LAP y el principio farmacéuticamente activo están unidos por una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa escindido por ADAMTS-4 (agrecanasa-1) o ADAMTS-5 (agrecanasa-2).

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[0010] La proteína de fusión que contiene un LAP, un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa y un principio farmacéuticamente activo puede proporcionar la activación específica del sitio del principio farmacéuticamente activo latente. La expresión "activación específica del sitio" según se usa en este documento significa, en términos

10 generales y no exclusivamente, la eliminación o la reducción de la latencia, conferida a un principio farmacéuticamente activo, mediante escisión específica del sitio, en el sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa.

[0011] Se espera que la escisión específica del sitio en el sitio de escisión proteolítica tenga lugar 15 concomitantemente con la activación restaurada del principio farmacéuticamente activo.

[0012] La expresión "principio farmacéuticamente activo latente" según se usa en este documento puede incluir, pero no exclusivamente, principios farmacéuticamente activos que son latentes debido a su asociación con el LAP y un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa. Específicamente, el principio farmacéuticamente activo puede ser

20 latente en virtud de su fusión a un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa asociado a LAP para formar una proteína de fusión latente.

[0013] El término "proteína" en este texto, significa en términos generales, una pluralidad de residuos de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Se usa indistintamente y significa lo mismo que péptido,

25 oligopéptido, oligómero o polipéptido, e incluye glucoproteínas y sus derivados. El término "proteína" también pretende incluir fragmentos, análogos y derivados de una proteína en la que el fragmento, el análogo o el derivado mantiene esencialmente la misma actividad biológica o función que la proteína de referencia.

[0014] El fragmento, análogo o derivado de la proteína según se define en este texto, puede tener al menos 6, 30 preferentemente 10 o 20, o hasta 50 o 100 aminoácidos de longitud.

[0015] El fragmento, derivado o análogo de la proteína puede ser (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos son sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente, un residuo de aminoácido conservado) y dicho residuo de aminoácido sustituido puede o no ser codificado por el código 35 genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro está fusionado a otro compuesto, como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido maduro, como una secuencia líder o secretora que se emplea para la purificación del polipéptido. Se considera que dichos fragmentos, derivados y análogos se encuentran dentro del área de competencia de los expertos a partir de

40 las enseñanzas de este documento.

[0016] Se prefieren particularmente las variantes, los análogos, derivados y fragmentos que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína en la cual varios, por ejemplo, 5 a 10, o 1 a 5, o 1 a 3, 2, 1 residuos de aminoácidos o ningún residuo de aminoácido están sustituidos, eliminados o añadidos en ninguna combinación. Se prefieren

45 especialmente entre éstas las sustituciones, adiciones y eliminaciones silenciosas, que no alteran las propiedades ni las actividades de la proteína de la presente invención. A este respecto también se prefieren especialmente las sustituciones conservadoras.

[0017] Un ejemplo de una variante es una proteína de fusión como la definida antes, aparte de la sustitución de uno

50 o más aminoácidos con uno o más de otros aminoácidos. El experto es consciente de que varios aminoácidos tienen propiedades similares. Uno o más de dichos aminoácidos de una sustancia puede a menudo ser sustituido por uno o más de otros aminoácidos de ese tipo sin eliminar una actividad deseada de esa sustancia.

[0018] Por lo tanto, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina pueden a menudo ser sustituidos

55 unos por los otros (aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas). De estas posibles sustituciones se prefiere que glicina y alanina se usen para sustituirse entre sí (puesto que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que valina, leucina e isoleucina se usen para sustituirse entre sí (ya que tienen grandes cadenas laterales alifáticas que son hidrófobas). Otros aminoácidos que a menudo se pueden sustituir entre sí son: fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos con cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos con cadenas

60 laterales básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos con cadenas laterales ácidas); asparragina y glutamina (aminoácidos con cadenas laterales amida); y cisteína y metionina (aminoácidos con cadenas laterales que contienen azufre).

[0019] Las sustituciones de esta naturaleza se denominan a menudo sustituciones de aminoácidos "conservadoras" o "semiconservadoras".

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[0020] Las eliminaciones a inserciones de aminoácidos también se pueden hacer en relación con la secuencia de aminoácidos para la proteína de fusión mencionada. Así, por ejemplo, los aminoácidos que no tienen un efecto

5 sustancial sobre la actividad del polipéptido, o al menos que no eliminan dicha actividad, pueden ser eliminados. Dichas eliminaciones pueden ser ventajosas puesto que la longitud total y el peso molecular de un polipéptido se pueden reducir manteniendo simultáneamente la actividad. Esto puede permitir reducir la cantidad de polipéptido necesaria para un propósito particular, por ejemplo, se pueden reducir los niveles de dosificación.

10 [0021] También se pueden hacer inserciones de aminoácidos en relación con la secuencia de la proteína de fusión mencionada antes. Esto se puede hacer para alterar las propiedades de una sustancia de la presente invención (por ej. para ayudar a la identificación, purificación o expresión, como se explicó antes en relación con las proteínas de fusión).

15 [0022] Los cambios de aminoácidos en relación con la secuencia para la proteína de fusión de la invención se pueden hacer usando cualquier técnica adecuada, por ej., empleando mutagénesis sitio-dirigida.

[0023] Se debe entender que las sustituciones o inserciones de aminoácidos se pueden hacer empleando aminoácidos de origen natural o no natural. Ya sea que se empleen aminoácidos naturales o sintéticos, es preferible

20 que sólo estén presentes los L-aminoácidos.

[0024] Una proteína según la invención puede tener secuencias de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales adicionales. Tales secuencias se pueden proporcionar por varias razones, por ejemplo, glucosilación.

25 [0025] La expresión "proteína de fusión" en este texto, significa en términos generales, una o más proteínas unidas por medios químicos, que incluyen enlaces de hidrógeno o puentes salinos, o mediante enlaces peptídicos a través de síntesis de proteínas, o ambos.

[0026] El péptido asociado a la latencia (LAP) de la presente invención es el dominio precursor de TGFβ-1, -2, -3, -4 30 o -5 o una secuencia que sea sustancialmente idéntica a éste.

[0027] "Identidad" como se conoce en el área es la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada mediante comparación de las secuencias. En el área, identidad también significa el grado de relación de la secuencia (homología) entre secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, 35 según sea el caso, determinado por la correspondencia entre series de dichas secuencias. Si bien existen una serie de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polipéptidos o dos secuencias de polinucleótidos, los métodos empleados comúnmente para determinar la identidad son codificados en programas informáticos. Los programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no exclusivamente, el paquete de programas GCG ( Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP,

40 BLASTN y FASTA ( Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990).

[0028] El LAP de la presente invención consiste en el dominio precursor de TGFβ-1, -2, -3, -4 o -5, por ejemplo, el péptido precursor de TGFβ-1, 2 o 3 (de humano) (Derynck et al., Nature, 316, 701-705 (1985); De Martin et al., EMBO J. 6 3673-3677 (1987); Hanks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 79-82 (1988); Derynck et al., EMBO J. 7, 373745 3743 (1988); Ten Dyke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4715-4719 (1988)) TGFβ-4 (de pollo) (Jakowlew et al., Mol. Endocrinol. 2, 1186-1195 (1988)) o TGFβ-5 (de xenopus) (Kondaiah et al., J. Biol. Chem. 265, 1089-1093 (1990)). La expresión "dominio precursor" se define como una secuencia que codifica un péptido precursor que no incluye la secuencia que codifica la proteína madura. Las secuencias de aminoácidos del dominio precursor de TGFβ 1, 2, 3, 4 y 5 ( Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB,

50 Springer-Verlag, capítulo 8, 422 (1996)) se muestran en la figura 1.

[0029] Preferentemente, la secuencia de aminoácidos del LAP tiene al menos 50% de identidad, utilizando los parámetros predefinidos del programa informático BLAST ( Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990) provisto por HGMP (Human Genome Mapping Project), a nivel de aminoácido, con el dominio precursor de TGFβ 1, 2, 3, 4 o

55 5 (Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, capítulo 8, 422 (1996)) como se muestra en la figura 1. Más preferentemente, el LAP puede tener al menos 60%, 70%, 80%, 90% y aún más preferentemente 95% (todavía más preferentemente al menos 99%) de identidad, a nivel de ácido nucleico o aminoácido, con el dominio precursor de TGFβ 1, 2, 3, 4 o 5 como se muestra en la figura 1 que comprende los residuos 1 a 278.

60 [0030] El LAP comprende el LAP de TGFβ 1, 2, 3, 4 o 5 ( Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, capítulo 8, 422 (1996)) como se muestra la figura 1.

[0031] El LAP puede contener por lo menos dos, por ejemplo aAl menos 4, 6, 8, 10 o 20 residuos de cisteína para la formación de enlaces disulfuro.

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[0032] El LAP puede proporcionar una "cáscara protectora" alrededor del principio farmacéuticamente activo blindándolo de ese modo y obstaculizando, o impidiendo, su interacción con otras moléculas de la superficie celular

o moléculas importantes para su actividad.

5 [0033] El LAP también puede contener una secuencia que tenga al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad con la secuencia del LAP de la figura 1, usando los parámetros predefinidos del programa informático BLAST provisto por HGMP, a esos efectos.

10 [0034] El sitio de escisión proteolítica consiste en un sitio de escisión por una agrecanasa específico que es escindible por ADAMTS-4 (agrecanasa-1) o ADAMTS-5 (agrecanasa-2). Un sitio de escisión por una agrecanasa puede comprender una cantidad de residuos de aminoácidos reconocibles por una agrecanasa. Además, los aminoácidos del sitio de escisión sensible a una agrecanasa pueden estar unidos por uno o más enlaces peptídicos que son escindibles, proteolíticamente, por una agrecanasa.

15 [0035] Las agrecanasas que pueden escindir el sitio de escisión sensible a una agrecanasa comprenden ADAMTS-4 (agrecanasa-1) o ADAMTS-5 (agrecanasa-2) ( Tortorella, M.D., et al Osteoarthritis Cartilage, 2001. 9(6): p. 539-552); Abbaszade, I., et al J Biol Chem, 1999. 274(33): p. 23443-23450).

20 [0036] Las secuencias de los sitios de escisión de la proteína de ADAMTS-4 (agrecanasa-1) se muestran en la figura

2. Los sitios para ADAMTS-4 adecuados incluyen:

HNEFRQRETYMVF

25 DVQEFRGVTAVIR

[0037] El motivo de escisión de ADAMTS-4 de consenso puede ser representado según Hills et al (J. Biol. Chem. 282 11101-11109 (2007)) como:

30 E-[AFVLMY]-X(0,1)-[RK]-X(2,3)-[ST]-[VYIFWMLA]

[0038] Preferentemente, el sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa de la presente invención se escinde en los sitios de una enfermedad diagnosticada como artritis o cáncer que se caracterizan por inflamación y/o remodelación del tejido. El sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa de la presente invención es escindido

35 por ADAMTS-4 (agrecanasa-1) o ADAMTS-5 (agrecanasa-2).

[0039] La secuencia de aminoácidos del sitio de escisión por una agrecanasa incluye una secuencia que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad, empleando los parámetros predefinidos del programa informático BLAST provisto por HGMP, a esos efectos. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica

40 el sitio de escisión por una agrecanasa contiene el número mínimo de residuos necesarios para el reconocimiento y la escisión por una agrecanasa.

[0040] La presente invención puede proporcionar además un péptido "conector". Preferentemente el péptido conector está unido a una secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica. El péptido conector se puede

45 proporcionar en el extremo C-terminal o N-terminal de la secuencia de aminoácidos que codifica el sitio de escisión proteolítica. Preferentemente, el péptido conector es continuo con la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica. El péptido conector puede contener la secuencia de aminoácidos GGGGS o un multímero de ésta (por ejemplo un dímero, un trímero o un tetrámero), un conector adecuado puede ser (GGGGS)3, o una secuencia de nucleótidos que tenga al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad, empleando los parámetros

50 predefinidos del programa informático BLAST provisto por HGMP, a esos efectos.

[0041] La expresión "péptido conector" pretende definir cualquier secuencia de residuos de aminoácidos que proporcione preferentemente una región hidrófila cuando está contenida en una proteína expresada. Dicha región hidrófila puede facilitar la escisión por una enzima en el sitio de escisión proteolítica.

55 [0042] El término "latencia" según se usa en este documento, puede referirse a un efecto de blindaje que puede obstaculizar la interacción entre la proteína de fusión y otras moléculas de la superficie celular. Alternativamente, el término latencia se puede usar para describir una reducción en la actividad (hasta e incluida la ablación de la actividad) de una molécula/un agente asociado a la proteína de fusión. El término latencia también se puede referir a

60 un efecto estabilizador de la proteína de fusión. El efecto puede ser total o parcial, donde el efecto parcial es suficiente para lograr la latencia del principio activo.

[0043] El principio farmacéuticamente activo puede ser una proteína farmacéuticamente activa que puede incluir, pero no exclusivamente, un factor de crecimiento (por ejemplo, TGFβ, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor

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de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor estimulante de las colonias (CSF), factor de crecimiento de los hepatocitos, factor de crecimiento semejante a la insulina, factor de crecimiento de la placenta); un factor de diferenciación; una citocina por ejemplo una interleucina, (por ej. IL1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL5 22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 o IL-33 o un interferón (por ej. IFN-α, IFN-β y IFNγ)), factor de necrosis tumoral (TNF), factor inductor de IFN-γ (IGIF), una proteína morfogenética ósea (BMP por ej. BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP10, BMP-11, BMP-12, BMP13); un antagonista del receptor de interleucina (por ej. IL-1ra, IL-1RII); una quimiocina (por ej. las MIP (proteínas inflamatorias de macrófagos) por ejemplo MIP1α y MIP1β; las MCP (proteínas quimiotácticas de monocitos) por ej. 10 MCP1, 2 o 3; RANTES (linfocito T normal expresado y secretado regulado por activación)); un factor trófico; un inhibidor de citocinas; un receptor de citocinas; una enzima secuestradora de radicales libres por ejemplo superóxido dismutasa o catalasa; una enzima convertidora de profármacos (por ejemplo, enzima convertidora de la angiotensina, desaminasas, deshidrogenasas, reductasas, cinasas y fosfatasas); un péptido mimético; un inhibidor de proteasas; un inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP por ej. TIMP1, TIMP2, TIMP3 o TIMP4) o una serpina

15 (inhibidores de serina proteasas). Preferentemente, el principio farmacéuticamente activo se puede derivar de la especie que se va a tratar por ej. de origen humano para el tratamiento de seres humanos. Preferentemente, el principio farmacéuticamente activo es IFNβ, IL-4 o IL-1ra.

[0044] Las interleucinas y citocinas pueden ser tanto antiinflamatorias como proinflamatorias. Las citocinas

20 antiinflamatorias y ciertas interleucinas, como IL-4 o IL-10, son adecuadas para el tratamiento de la artritis, en tanto que las citosinas proinflamatorias y otras interleucinas, como IL-1 e Il-2, son adecuadas para el tratamiento del cáncer.

[0045] Según se usa en este documento "peptidomiméticos" incluye, pero no exclusivamente, agentes que tienen

25 una conformación de esqueleto peptídico deseada incorporada en un esqueleto no peptídico que mantiene al péptido en una conformación particular. Los peptidomiméticos, que no tienen algunos de los inconvenientes de los péptidos, son de interés en aquellos casos en los que los péptidos no son adecuados en medicina.

[0046] Los peptidomiméticos pueden contener un esqueleto peptídico que sea de conformación L o D. Los ejemplos

30 de peptidomiméticos son melanocortina, la hormona adrenocorticotrofina (ACTH) y otros agentes de peptidomiméticos que desempeñan un papel en el sistema nervioso central, el sistema endocrino en la transducción de señales y en infección e inmunidad.

[0047] El principio farmacéuticamente activo puede consistir en un compuesto químico como un antineoplásico y

35 otros fármacos sintéticos. Alternativamente, el principio farmacéuticamente activo puede consistir en un ARNip o una secuencia de un ácido péptido nucleico (PNA) por ejemplo, una secuencia de polilisina que se une a los ácidos nucleicos y permeabiliza las bicapas lipídicas (Wyman et al., Biological Chemistry, 379, 1045-1052 (1998)) o un péptido KALA que facilita la transferencia a través de las bicapa lipídicas (Wyman et al., Biochemistry, 36, 3008-3017 (1997)) o un dominio de transducción de proteínas (DPT) que permite a los polipéptidos entrar en las células a

40 través de la membrana plasmática (Pi et al Molecular Therapy 2, 339-347 (2000)).

[0048] La expresión "en asociación con" en el contexto de la presente invención pretende incluir todos los medios de asociación, entre otros, pero no exclusivamente, reticulación química o unión por enlace peptídico.

45 [0049] En una realización alternativa, la invención proporciona además la proteína de fusión de la presente invención opcionalmente en asociación con la proteína de unión a TGFβ latente (LTBP). Generalmente, la proteína de fusión se une covalentemente a LTBP para formar un complejo. Preferentemente, la asociación es mediada por enlace(s) disulfuro entre Cys Nº 33 de LAP y los tercer 8 residuos de Cys de LTBP. La LTBP asociada con la proteína de fusión puede incluir, pero no exclusivamente, LTBP 1, 2, 3 o 4 ( Kanzaki et al., Cell, 61, 1051-1061 (1990); Tsuji et

50 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8835-8839 (1990); Moren et al., J. Biol. Chem. 269, 32469-32478 (1994); Yin et al., J. Biol. Chem. 270, 10147-10160 (1995); Gibson et al., Mol. Cell. Biol. 15, 6932-6942 (1995); Saharinen et al., J. Biol. Chem. 273, 18459-18469 (1998)), o fragmentos de LTBP como los que contienen la tercera repetición de 8 Cys, u homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de identidad, empleando los parámetros predefinidos del programa informático BLAST

55 provisto por HGMP, con la de LTBP.

[0050] La escisión de LTBP puede liberar a la proteína de fusión del complejo de LTBP. Las enzimas que pueden escindir a LTBP de esta manera son, pero no exclusivamente, trombospondina ( Schultz et al., The Journal of Biological Chemistry, 269, 26783-26788 (1994); Crawford et al., Cell, 93, 1159-1170 (1998)), transglutaminasa (

60 Nunes et al., J. Cell, Biol. 136, 1151-1163 (1997); Kojima et al., The Journal of Cell Biology, 121, 439-448 (1993)) MMP9 y MMP2 ( Yu y Stamenkovic, Genes and Dev, 14, 163-176 (2000)).

[0051] La invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión del primer aspecto de la invención según se definió antes. Un segundo aspecto de la invención proporciona un constructo de ácido

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nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un principio farmacéuticamente activo, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un LAP, donde la secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa se proporciona entre la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico.

[0052] La expresión "constructo de ácido nucleico" se refiere en general a cualquier longitud de ácido nucleico que puede ser ADN, ADNc o ARN como ARNm obtenido por clonación o producido por síntesis química. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario. El ADN monocatenario puede ser la hebra codificante sentido, o puede ser la hebra no codificante o antisentido. Para el uso terapéutico, el constructo de ácido nucleico está preferentemente en una forma capaz de ser expresada en el sujeto que se va a tratar.

[0053] Preferentemente, la primera secuencia de ácido nucleico codifica la proteína IFNβ, IL-4 o IL-1ra. En una realización de la invención, la primera secuencia de ácido nucleico codifica a IFNβ, IL-4 o IL-1ra de un ratón o un ser humano.

[0054] El constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención puede estar en forma de un vector, por ejemplo, un vector de expresión y puede incluir, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus como el baculovirus, papova virus, como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de sus combinaciones, como los derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Generalmente, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar ácido nucleico a fin de expresar un polipéptido en un huésped, se puede usar para la expresión en este sentido.

[0055] La invención proporciona además una proteína codificada por el constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención opcionalmente en asociación con la proteína de unión a TGFβ latente (LTBP) descrita antes. Habitualmente, la proteína codificada por el constructo de ácido nucleico se une covalentemente a LTBP para formar un complejo. Preferentemente, la asociación es mediada por enlace(s) disulfuro entre Cys Nº 33 de LAP y los tercer 8 residuos de Cys de LTBP.

[0056] El constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención incluye preferentemente un promotor u otra secuencia reguladora que controla la expresión del ácido nucleico. Se han identificado y son conocidos en el área promotores y otras secuencias reguladoras que controlan la expresión de un ácido nucleico. Los expertos notarán que puede no ser necesario utilizar todo el promotor u otra secuencia reguladora. Sólo el elemento regulador esencial mínimo puede ser necesario y, de hecho, dichos elementos se pueden usar para construir secuencias quiméricas u otros promotores. El requisito esencial es, por supuesto, retener la especificidad tisular y/o temporal. El promotor puede ser cualquier promotor conocido adecuado, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus (CMV) humano, el promotor inmediato temprano del CMV, la timidina cinasa de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40 o los promotores de las LTR retrovirales, como las del virus del sarcoma de Rous (RSV) y los promotores de metalotionina como el promotor de la metalotionina-I de ratón. El promotor puede contener el mínimo implícito para la actividad del promotor (como elementos TATA sin elementos potenciadores) por ejemplo, la secuencia mínima del promotor del CMV.

[0057] Preferentemente, el promotor es contiguo a la primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico.

[0058] Como se indica en este documento, el constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención puede estar en forma de un vector. Los vectores incluyen frecuentemente uno o más marcadores de expresión que permiten la selección de células transinfectadas (o transformadas) con ellos, y preferentemente para permitir una selección de células que contengan vectores que incorporan ADN heterólogo. Generalmente estarán presentes una señal de inicio y de parada adecuadas.

[0059] Una realización de la invención se refiere a una célula que contiene el constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención. La célula se puede denominar una célula "huésped", que es útil para la manipulación del ácido nucleico, incluida la clonación. Alternativamente, la célula puede ser una célula en la cual obtener la expresión del ácido nucleico. Los ejemplos representativos de células huésped adecuadas para la expresión del constructo de ácido nucleico de la invención incluyen células empaquetadoras de virus que permiten la encapsulación del ácido nucleico en un vector viral; células bacterianas, como Streptococci, Staphylococci, E.coli, Streptomyces y Bacillus Subtilis; células individuales, como células de levadura, por ejemplo, células de Saccharomyces Cerevisiae y Aspergillus; células de insectos como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células de animales como células CHO, COS, C127, 3T3, PHK.293 y de melanoma de Bowes y otras células humanas adecuadas; y células de vegetales, por ej. Arabidopsis thaliana.

[0060] La inducción de un vector de expresión en la célula huésped se puede ver afectada por transinfección con

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fosfato de calcio, transinfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, transinfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por raspado, introducción balística, infección u otros métodos. Dichos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, como Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, segunda edición Coldspring Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, N.Y. (1989).

[0061] Las proteínas maduras se pueden expresar en células huésped, que incluyen células de mamíferos como las células CHO, de levadura, de bacterias u otras células bajo el control de los promotores apropiados. Se pueden emplear sistemas de traducción acelulares para producir tales proteínas con ARN derivados del constructo de ácido nucleico del tercer aspecto de la presente invención. Vectores de clonación y de expresión adecuados para usar con células huésped procariotas y eucariotas son descritos por Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, segunda edición, Coldspring Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, N.Y. (1989).

[0062] Las proteínas se pueden recuperar y purificar de cultivos celulares recombinantes por métodos bien conocidos, como precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía con lectina y/o heparina. Para la terapia, el constructo de ácido nucleico, por ejemplo en forma de un vector recombinante, se puede purificar por técnicas conocidas en el área, como por medio de cromatografía en columna según describen Sambrook et al, en Molecular Cloning, a Laboratory Manual,, segunda edición, Coldspring Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, N.Y. (1989).

[0063] Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición de conformidad con el primer aspecto de la invención para utilizar en el tratamiento de la artritis o el cáncer. Este aspecto de la invención se extiende por lo tanto al uso, y lo incluye, de una proteína de fusión que comprende un péptido asociado a la latencia (LAP) unido por un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa a un principio farmacéuticamente activo como el definido en el primer aspecto de la invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis o el cáncer.

[0064] La presente invención proporciona una composición como la que se describe antes para su uso en el tratamiento de la artritis o el cáncer. Artritis define un grupo de enfermedades (o artropatías) en las que el daño es causado a las articulaciones del cuerpo e incluye artrosis (también conocida como enfermedad degenerativa de las articulaciones) que puede aparecer después de un traumatismo en la articulación, después de una infección en la articulación o a consecuencia del envejecimiento. Otras formas de artritis incluyen la artritis reumatoide y la artritis psoriásica, que son enfermedades autoinmunitarias, y la artritis séptica causada por infección en las articulaciones. El cáncer define un grupo de enfermedades caracterizadas por una proliferación anormal de células en el cuerpo, que pueden ser definidas como tumores, por ejemplo glioblastoma. El glioblastoma también se conoce a veces como astrocitoma de grado 4.

[0065] En un cuarto aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico de conformidad con el segundo aspecto de la invención para su uso en el tratamiento de la artritis o el cáncer. Este aspecto se extiende por lo tanto al uso, y lo incluye, de un constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la artritis o el cáncer. Cuando se utiliza el constructo de ácido nucleico en el tratamiento terapéutico, el constructo se puede utilizar como parte de un constructo de expresión, por ejemplo, en forma de un vector de expresión como un plásmido o un virus. El constructo se puede administrar por vía intravenosa, intradérmica, intramuscular, oral o por otras vías.

[0066] El constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención y las proteínas derivadas de éste, se pueden emplear solos o en combinación con otros compuestos, como compuestos terapéuticos, por ejemplo antiinflamatorios, citotóxicos, citostáticos o antibióticos. Los constructos de ácido nucleico y las proteínas útiles en la presente invención se proporcionan preferentemente en forma aislada, y preferentemente se purifican hasta la homogeneidad.

[0067] Según se usa en este documento, el término "tratamiento" incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un ser humano o a un animal no humano. El tratamiento de "animales no humanos" se extiende al tratamiento de animales domésticos, incluidos caballos y animales de compañía (por ej. perros y gatos) y animales de granja o establecimientos agrícolas como los miembros de las familias ovina, caprina, porcina, bovina y equina. El tratamiento puede ser en este sentido de cualquier afección o trastorno existente o puede ser profiláctico (tratamiento preventivo). El tratamiento puede ser de una enfermedad heredada o adquirida. El tratamiento puede ser de una afección aguda o crónica. Preferentemente, el tratamiento es de una afección/trastorno asociado a inflamación. La primera secuencia de ácido nucleico del constructo de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención puede codificar una proteína para usar en el tratamiento del trastorno, incluidos pero no exclusivamente, artrosis, esclerodermia, enfermedad renal, artritis reumatoide, enfermedad del intestino irritable, esclerosis múltiple, aterosclerosis, cáncer o cualquier enfermedad inflamatoria.

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[0068] El constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención se puede usar terapéuticamente a manera de genoterapia. Alternativamente, la proteína codificada por el constructo de ácido nucleico se puede administrar directamente como se describe en este documento.

[0069] La administración del constructo de ácido nucleico del segundo aspecto se puede dirigir al sitio de destino por métodos físicos. Los ejemplos de esto incluyen la administración tópica del ácido nucleico "desnudo" en forma de un vector en un vehículo apropiado, por ejemplo, en solución en un excipiente farmacéuticamente aceptable, como solución salina tamponada con fosfato, o la administración de un vector por métodos físicos tales como el bombardeo de partículas según métodos conocidos en el área.

[0070] Otros métodos físicos para la administración del constructo de ácido nucleico o las proteínas del tercer aspecto de la invención directamente al destinatario incluyen ultrasonido, electroestimulación, electroporación y microsiembra. Otros métodos de administración incluyen la administración oral o la administración por inhalación.

[0071] Se prefiere particularmente el modo de administración de microsiembra que es un sistema para administrar material genético a las células in situ en un paciente. Este método se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5697901.

[0072] El constructo de ácido nucleico de conformidad con el segundo aspecto de la invención también se puede administrar mediante vectores de administración. Estos incluyen vectores de administración virales, como vectores de administración de adenovirus, retrovirus o lentivirus conocidos en el área.

[0073] Otros vectores de administración no virales incluyen vectores de administración lipídicos, como los vectores de administración liposómicos conocidos en el área.

[0074] La administración también puede tener lugar a través de células huésped transformadas. Dichas células incluyen células extraidas del sujeto, a las cuales se transfiere un constructo de ácido nucleico por métodos de transferencia génica conocidos en el área. Seguido de la multiplicación de las células transformadas en cultivo y su injerto en el sujeto.

[0075] Según se usa en este documento, el término "genoterapia" se refiere a la introducción de genes mediante ingeniería genética de recombinación de las células del cuerpo (genoterapia somática) para el beneficio del paciente. Además, la genoterapia se puede dividir en técnicas ex vivo e in vivo. La genoterapia ex vivo se refiere a la extracción de células del cuerpo de un paciente, al tratamiento de las células extraídas con un vector es decir un vector recombinante, y el posterior retorno de las células tratadas al paciente. La genoterapia in vivo se refiere a la administración directa del vector génico recombinante mediante, por ejemplo, medios intravenosos o intravasculares.

[0076] Preferentemente la genoterapia se lleva a cabo ex vivo.

[0077] Preferentemente, para un constructo de ácido nucleico que se va a usar en genoterapia, el vector de expresión de la presente invención se expresa en el sujeto que se va a tratar. Por lo tanto, para la genoterapia humana, el promotor es preferentemente un promotor humano de un gen humano o de un gen que se expresa normalmente en los seres humanos, como el promotor del CMV humano.

[0078] Para la genoterapia, la presente invención proporciona un constructo de ácido nucleico como el definido antes para el uso en la manipulación de las células somáticas de los mamíferos humanos y no humanos, o la manipulación de las células de la línea germinal de un mamífero no humano.

[0079] La presente invención proporciona, por lo tanto, una proteína terapéutica preparada a partir de células humanas que han sido tratadas in vitro para insertar en ellas un constructo de ácido nucleico de conformidad con el segundo aspecto de la invención.

[0080] La manipulación de las células extraídas de un paciente es con el constructo de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención en un vector apropiado. Según se usa en este documento, la expresión "células manipuladas" abarca células transinfectadas con un vector recombinante.

[0081] También se contempla el uso de células transinfectadas en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis o el cáncer.

[0082] La presente invención también puede encontrar aplicación en medicina veterinaria para el tratamiento/la profilaxis de animales domésticos como caballos y animales de compañía (por ej. perros y gatos) y animales de granja que pueden incluir mamíferos de las familias ovina, porcina, caprina, bovina y equina.

[0083] La presente invención también se refiere a composiciones que contienen el constructo de ácido nucleico o las proteínas del primer o segundo aspecto de la invención. Por consiguiente, la proteína de fusión o los constructos de ácido nucleico de la presente invención se pueden emplear en combinación con un portador o portadores farmacéuticamente aceptables. Dichos portadores pueden ser, entre otros, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones.

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5 [0084] Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera eficaz y conveniente, que sea eficaz para tratar una enfermedad en un paciente como, por ejemplo, mediante administración por vías oral, tópica, intravenosa, intramuscular, intranasal o intradérmica, entre otras. En terapia o como profilaxis, el principio activo se puede administrar a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril,

10 preferentemente isotónica.

[0085] Para la administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que la dosis diaria del principio activo sea de 0.01 mg/kg de peso corporal, habitualmente de alrededor de 1 mg/kg. En cualquier caso el médico determinará la dosis real que será más conveniente para un individuo que dependerá de factores como la

15 edad, el peso, el género y la respuesta del individuo. Las dosis anteriores son ejemplos del caso promedio. Por supuesto, puede haber casos que ameriten una dosis mayor o menor, y éstas están comprendidas por el alcance de esta invención

[0086] Un sexto aspecto de la invención proporciona una proteína de fusión que contiene un LAP y un sitio de

20 escisión proteolítica por una agrecanasa donde la proteína de fusión se asocia con un principio farmacéuticamente activo. El principio farmacéuticamente activo puede ser según se describió antes. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, el principio farmacéuticamente activo puede ser un ARNip o una molécula de PNA.

[0087] La invención proporciona además un constructo de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión del sexto

25 aspecto de la invención. El constructo de ácido nucleico contiene preferentemente una secuencia de ácido nucleico que codifica un LAP adyacente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un LAP está unida operablemente de manera adecuada a una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa.

30 [0088] La invención proporciona además la proteína de fusión del sexto aspecto de la invención opcionalmente en asociación con la proteína de unión a TGFβ latente (LTBP) descrita aquí.

[0089] La proteína de fusión del sexto aspecto de la invención puede estar asociada con el principio

35 farmacéuticamente activo por medio de una unión por enlace peptídico. Alternativamente, la proteína de fusión se puede asociar con el principio farmacéuticamente activo por medio de unión química por ejemplo por reticulación de la proteína de fusión con un compuesto químico como un antineoplásico, un fármaco sintético o PNA.

[0090] Preferentemente, el principio farmacéuticamente activo está unido al extremo C-terminal de la secuencia de

40 aminoácidos del sitio de escisión proteolítica en la proteína de fusión del séptimo aspecto de la invención. Más preferentemente, el principio farmacéuticamente activo es continuo con el residuo C-terminal de la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa.

[0091] La proteína de fusión y el principio farmacéuticamente activo asociado del sexto aspecto de la invención, se

45 pueden emplear solos o en combinación con otros compuestos, como compuestos terapéuticos, por ejemplo antiinflamatorios, citotóxicos, citostáticos o antibióticos. Dicha administración puede ser simultánea, por separado o secuencial. Los componentes se pueden preparar en forma de un kit que puede contener instrucciones según sea adecuado.

50 [0092] Preferentemente, la proteína de fusión y el principio farmacéuticamente activo asociado del sexto aspecto de la invención se administran directamente a un paciente como se describe en este documento.

[0093] La presente invención también se refiere a composiciones que contienen la proteína de fusión y el principio farmacéuticamente activo asociado del sexto aspecto de la invención. Por consiguiente, la proteína de fusión y el 55 principio farmacéuticamente activo asociado se pueden emplear en combinación con el portador o los portadores farmacéuticamente aceptables. Dichos portadores pueden ser, entre otros, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, polietilenglicol, etanol y sus combinaciones. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera eficaz y conveniente, que sea eficaz para tratar una enfermedad en un paciente como, por ejemplo, mediante administración por vías oral, tópica, intravenosa,

60 intramuscular, intranasal o intradérmica entre otras. En terapia o como profilaxis, el principio activo se puede administrar a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferentemente isotónica.

[0094] Un séptimo aspecto de la invención proporciona un kit de piezas que consiste en una proteína de fusión del primer aspecto de la invención, un constructo de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención, o una proteína de fusión y un principio farmacéuticamente activo asociado, de conformidad con el sexto aspecto de la invención, y un vehículo de administración que incluye, sin limitación, comprimidos para administración oral, inhaladores para administración pulmonar y soluciones inyectables para administración intravenosa.

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5 [0095] Un octavo aspecto de la invención proporciona un proceso para preparar la proteína de fusión del primer aspecto de la invención, que comprende la producción de la proteína de fusión por vía recombinante por expresión en una célula huésped, la purificación de la proteína de fusión expresada y la asociación del principio farmacéuticamente activo a la proteína de fusión purificada por medio de la unión por enlace peptídico, enlace de

10 hidrógeno o salino o reticulación química. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, en las que el principio farmacéuticamente activo es un péptido, la proteína de fusión se podría preparar usando enlaces de hidrógeno o salinos en los que el péptido es capaz de multimerización, por ejemplo dimerización o trimerización.

[0096] Un noveno aspecto de la invención proporciona un proceso para preparar un constructo de ácido nucleico del

15 segundo aspecto de la invención que comprende ligar secuencias de ácidos nucleicos que codifican un péptido asociado a la latencia, una secuencia de escisión por una agrecanasa y un principio farmacéuticamente activo, incluida opcionalmente una secuencia conectora a ambos lados del sitio de escisión por una agrecanasa.

[0097] Una realización preferida de la presente invención estipula un método para proporcionar latencia a un

20 principio farmacéuticamente activo que es una citocina, preferentemente interferón o una interleucina, donde el método comprende construir una proteína de fusión que tenga un péptido asociado a la latencia (LAP), a partir de TGFβ-1, -2, -3, -4 o -5, asociada con un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa elegido entre los sitios de escisión por ADAMTS-4 o ADAMTS-5, y el principio farmacéuticamente activo. Preferentemente, el principio farmacéuticamente activo es seguido de un sitio de escisión proteolítica y el LAP de la manera siguiente: LAP-sitio

25 de escisión-principio activo.

[0098] Todas las características preferidas del segundo aspecto y aspectos subsiguientes de la invención son en cuanto al primer aspecto mutatis mutandis.

30 [0099] La presente invención se describirá ahora sólo a modo de ejemplo con referencia a las figuras acompañantes en las cuales:

La figura 1 muestra secuencias de aminoácidos del dominio precursor de TGFβ 1, 2 y 3 (humano, Hu), TGFβ 4 (pollo, Ck), TGFβ (rana, Fg). Las flechas indican la posición del procesamiento proteolítico resultante en la escisión

35 del péptido señal de TGFβ1 y de los TGFβ maduros. Los sitios de glucosilación unidos por N están subrayados, como lo está la secuencia de reconocimiento celular de la integrina (Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, capítulo 8, 422 (1996));

La figura 2 muestra una alineación de secuencias múltiples de las secuencias del epítopo de ADAMTS-4 con el

40 correspondiente porcentaje promedio de escisión de fagémidos y el motivo de escisión de ADAMTS-4 derivado. Los aminoácidos predominantes encontrados con una frecuencia superior a 40% en una posición particular se ilustran con un fondo negro, en contraste con los aminoácidos relacionados que se muestran con un fondo gris (reproducido de Hills et al J. Biol. Chem. 282 11101-11109 (2007)).

45 La figura 3 muestra el desarrollo de LAP-IL-4 sensible a ADAMTS-4. Inmunotransferencia tipo Western de los sobrenadantes de células 293T transinfectadas transitoriamente sondadas con el anticuerpo anti-IL-4. Los sobrenadantes exentos de suero se recolectaron 48 h después de la transinfección y se incubaron toda la noche a 37 °C sin (-) o con (+) MMP-1 recombinante o agrecanasa (ambos proporcionados amablemente por H. Nagase, Kennedy Institute). Tenga en cuenta la especificidad de la escisión LAP-MMP IL-4 es sólo escindida por MMP-1,

50 mientras que los constructos Agg1 y Agg2 son escindidos por ADAMTS-4 pero no por MMP-1. Agg1 y Agg2 corresponden a las secuencias B05 y B06 de Hills et al. (J. Biol. Chem 282(15):11101-11109; (2007)).

Las figuras 4 y 5 muestran el marco de lectura abierto completo y la secuencia de ADN de ambos constructos de la agrecanasa. Las secuencias GGGS antes y después del sitio del agrecanasa están en itálicas, los sitios de

55 clonación EcoR1 y Not1 están ambos en negrita y subrayados. Los sitios sensibles a la agrecanasa están en negrita. El mIL-4 tiene una cola poli histidina y un epítopo etiquetado en el extremo COOH. La figura 4 muestra el constructo con el sitio de escisión B06 y la figura 5 muestra el constructo con el sitio de escisión B05.

[0100] La invención se describirá ahora con referencia a los ejemplos no limitantes siguientes;

60 Experimento 1 Desarrollo de LAP-IL-4 sensible a ADAMTS-4

[0101] Los sitios de escisión por una agrecanasa B05 y B06 reportados por Hills et al (J. Biol. Chem. 282: 1110111109 (2007)) fueron flanqueados en ambos lados por el conector (GGGGS)3 usando oligodesoxinucleótidos

Claims (17)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una proteína de fusión que comprende un péptido asociado a la latencia (LAP) que es el dominio precursor de TGFβ-1, -2, -3, -4 o -5 y un principio farmacéuticamente activo en el que el LAP y el principio farmacéuticamente

   5 activo están unidos por una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa escindido por ADAMTS-4 (agrecanasa-1) o ADAMTS-5 (agrecanasa-2).
2. 2. Una proteína de fusión como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que el sitio de escisión por una

   agrecanasa es escindido por ADAMTS-4 (agrecanasa-1) y es definido por la secuencia de consenso E-[AFVLMY]10 X(0,1)-[RK]-X(2,3)-[ST]-[VYIFWMLA].
3. 3. Una proteína de fusión como la reivindicada en la reivindicación 2, en la que el sitio de escisión por una agrecanasa es:

   15 HNEFRQRETYMVF, o DVQEFRGVTAVIR
4. 4. Una proteína de fusión como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia

   peptídica conectora está presente adyacente al sitio de escisión por una agrecanasa. 20
5. 5. Una proteína de fusión como la reivindicada en la reivindicación 4, en la que la secuencia conectora peptídica es GGGGS, o un multímero de ésta.
6. 6. Una proteína de fusión como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el principio 25 farmacéuticamente activo es una proteína.
7. 7. Una proteína de fusión como la reivindicada la reivindicación 6, en la que la proteína farmacéuticamente activa es un factor de crecimiento, un factor de diferenciación, una citocina, una quimiocina, un factor trófico, un inhibidor de las citocinas, un receptor de citocinas, una enzima secuestradora de radicales libres, una enzima convertidora de

   30 profármacos, un peptidomimético, un inhibidor de las proteasas, un inhibidor tisular de las metaloproteinasas o un inhibidor de la serina proteasa.
8. 8. Una proteína de fusión como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la

   proteína de fusión está en asociación con una proteína de unión a TGFβ latente. 35
9. 9. Una proteína de fusión que consiste en un LAP que es el dominio precursor de TGFβ-1, -2, -3, -4 o -5 y un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa donde la proteína de fusión está asociada con un principio farmacéuticamente activo, en la cual el sitio de escisión por una agrecanasa es escindido por ADAMTS-4 (agrecanasa-1), ADAMTS-5 (agrecanasa-2).

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10. 10. Un constructo de ácido nucleico que contiene una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un principio farmacéuticamente activo, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un LAP que es el dominio precursor de TGFβ-1, -2, -3, -4 o -5, donde la secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión proteolítica por una agrecanasa se provee entre la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico, donde el sitio

    45 de escisión por una agrecanasa es escindido por ADAMTS-4 (agrecanasa-1), ADAMTS-5 (agrecanasa-2).
11. 11. Un constructo de ácido nucleico como el reivindicado en la reivindicación 10, en el que el principio farmacéuticamente activo es un factor de crecimiento, un factor de diferenciación, una citocina, una quimiocina, un factor trófico, un inhibidor de las citocinas, un receptor de citocinas, una enzima secuestradora de radicales libres,

    50 una enzima convertidora de profármacos, un peptidomimético, un inhibidor de las proteasas, un inhibidor tisular de las metaloproteinasas o un inhibidor de la serina proteasa.
12. 12. Un vector que contiene un constructo de ácido nucleico de la reivindicación 10 o la reivindicación 11.

    55 13. Una proteína de fusión codificada por el constructo de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 10 a
13. 12.
14. 14. Una célula que contiene un vector de la reivindicación 12 o el constructo de ácido nucleico de cualquiera de las

    reivindicaciones 10 a 11. 60

15. 15.

    Una proteína de fusión como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, una secuencia de ácido nucleico como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, o una célula como la reivindicada en la reivindicación 14 para usar en el tratamiento de artritis o cáncer.

16. 16.

    Una composición farmacéutica que contiene una proteína de fusión como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un constructo de ácido nucleico como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, o una célula como la reivindicada en la reivindicación 14.

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    5 17. El uso de una proteína de fusión como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, una secuencia de ácido nucleico como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 o una célula como la definida en la reivindicación 14 en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de artritis o cáncer.

    10 18. Un kit de piezas que contiene una proteína de fusión como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un constructo de ácido nucleico como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, o una célula como la reivindicada en la reivindicación 14 y un vehículo de administración.
17. 19. Un proceso para preparar la proteína de fusión como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,

    15 que comprende la producción de la proteína de fusión por vía de recombinación mediante expresión en una célula huésped, la purificación de la proteína de fusión expresada y la asociación del principio farmacéuticamente activo con la proteína de fusión purificada por medio de una unión por enlace peptídico, enlace de hidrógeno o salino, o reticulación química.

    20 20. Un proceso para preparar un constructo de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 que comprende ligar entre sí secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido asociado a la latencia, una secuencia de escisión por una agrecanasa y un principio farmacéuticamente activo, que incluye opcionalmente una secuencia conectora a cada lado del sitio de escisión por una agrecanasa.

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