ES2240740T3

ES2240740T3 - Metodo para proporcionar latencia a agentes farmaceuticamente activos.

Info

Publication number: ES2240740T3
Application number: ES02729440T
Authority: ES
Inventors: Yuti Bone and Joint Research Unit CHERNAJOVSKY; Hanna Stina Bone and Joint Research Unit DREJA; Gillian Bone and Joint Research Unit ADAMS
Original assignee: Queen Mary and Westfiled College University of London
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2002-01-09
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2022-01-09
Also published as: EP1349944A2; AU2002219345B2; WO2002055098A3; DE60203692D1; GB0100551D0; JP4201253B2; US6942853B2; ATE293169T1; JP2004520031A; DK1349944T3; US20020151478A1; DE60203692T2; EP1349944B1; WO2002055098A2

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un péptido asociado con la latencia (LAP) de TGF-1, 2, 3, 4 o 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasas de matriz (MMP), para uso para proporcionar latencia a una proteína farmacéuticamente activa.

Description

Método para proporcionar latencia a agentes farmacéuticamente activos.

La presente invención se refiere al uso de proteínas, derivados de proteínas y construcciones de ADN que confieren latencia a proteínas farmacéuticamente activas. La presente invención también se refiere a métodos para proporcionar latencia a proteínas farmacéuticamente activas y a métodos para proporcionar activación específica de sitio a proteínas latentes farmacéuticamente activas.

La mayoría de las citoquinas y factores de crecimiento se expresan por mecanismos estrechamente controlados. La expresión de sus genes está regulada por estímulos ambientales tales como infección, interacciones entre células, cambio en la composición de la matriz extracelular e interacciones con moléculas de adhesión o por medio de estimulación con otras citoquinas.

Además del control a los niveles transcripcional y postranscripcional, algunas citoquinas no se liberan al medio a menos que una segunda señal active a la célula. Se encuentra un tercer nivel de regulación de la actividad de citoquinas en moléculas que se secretan de forma latente y que se "activan" liberando el resto de citoquina donde tienen lugar procesos de inflamación, curación de heridas y reparación de tejidos (Khalil N, Microbes and Infection, 1, 1255-1263 (1999). En este último sentido, ha recibido la mayor atención el factor de transformación del crecimiento beta (TGF\beta) (véase, por ejemplo, el documento WO 0020449).

El TGF\beta se sintetiza como una citoquina latente dimérica compuesta por una proteína asociada a la latencia (LAP) amino terminal y la citoquina TGF\beta activa en su extremo COOH terminal (Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, 419-472 (1996); Roth-Eicchorn et al., Hepatology, 28, 1588-1596 (1998)). El péptido precursor contiene un péptido señal (restos 1-29) necesario para la secreción de la proteína y que guía a la molécula a través del aparato de Golgi para que se procese por escisión proteolítica y glicosilación. El dominio LAP se separa de TGF\beta por escisión proteolítica en las argininas (277-278). El TGF\beta maduro se inicia en la alanina 279. La LAP, además de proteger al TGF\beta, contiene restos importantes necesarios para la interacción con otras moléculas. Recientemente, se han asociado mutaciones en el dominio LAP con la enfermedad autosómica dominante de Camurati-Engelmman (Janssens et al., Nature Genetics, 26, 273-275 (2000). Las cisteínas 224 y 226 son importantes para el puente disulfuro intermolecular entre dos LAP.

Su mutación a serina hace que la molécula sea "activa" (Sanderson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 92, 2572-2576 (1995); Bruner et al., Mol. Endocrinol. 6, 1691-1700 (1992), Brunner et al., J. Biol. Chem., 264, 13660-13664 (1989)). El motivo RGD (245-247) facilita la interacción con integrinas (Munger et al., Mol. Biol. of the Cell, 9, 2627-2638 (1998; Derynck R, TIBS, 19, 548-553 (1994)). En el documento US 5801231 se describe un ácido nucleico que codifica TGF\beta.

En la mayoría de los tipos celulares estudiados, incluyendo los de origen mesenquimático, epitelial y endotelial, el TGF\beta se secreta en una forma latente que consta de TGF\beta y sus dímeros del propéptido del péptido asociado con la latencia (LAP), unidos covalentemente a proteínas de unión a TGF\beta latente (LTBP). Las LTBP también son necesarias para la secreción y plegamiento de TGF\beta (Miyazano et al., EMBO J. 10, 1091-1101 (1991); Miyazano et al., J. Biol. Chem. 267, 5668-5675 (1992); Eklov et al., Cancer Res. 53, 3193-3197 (1993)). La cisteína 33 es importante para el enlace disulfuro con la tercera repetición rica en 8 cisteínas de la proteína de unión a TGF\beta latente (LTBP) (Saharinen et al., The EMBO Journal, 15, 245-253 (1996)). La modificación de LTBP por enzimas tales como trombospondina (Schultz et al., The Journal of Biological Chemistry, 269, 26783-26788 (1994); Crawford et al., Cell, 93, 1159-1170 (1998)), transglutaminasa (Nunes et al., J. Cell, Biol. 136, 1151-1163 (1997); Kojima et al., The Journal of Cell Biology, 121, 439-448 (1993)) y MMP9, MMP2 (Yu y Stamenkovic, Genes and Dev. 14, 163-176 (2000)) podría liberar la porción activa de TGF\beta del complejo latente.

Las citoquinas son productos naturales que sirven como mediadores locales solubles de interacciones entre células. Tienen diversas acciones pleiotrópicas, de las que algunas pueden utilizarse con fines terapéuticos. La dirección de citoquinas a tipos celulares específicos usando scFv (Lode et al., Pharmacol. Ther, 80, 277-292 (1998)) y vWF (Gordon et al., Human Gene Therapy, 8, 1385-1394 (1997)) se ha centrado totalmente en el resto de citoquina activa del complejo de citoquina.

Las proteínas farmacológicamente activas u otras medicinas basadas en tales agentes, que tienen que administrarse a concentraciones muy altas sistémicamente para conseguir concentraciones biológicamente eficaces en el tejido al que se desean dirigir, tienden a proporcionar efectos sistémicos indeseables, por ejemplo, toxicidad, que limitan su uso y eficacia.

Los presentes inventores han creado un sistema para superar el efecto tóxico de la administración sistémica de agentes biológicos potentes.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una proteína de fusión que comprende un péptido asociado con la latencia (LAP) de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP) para uso para proporcionar latencia a una proteína farmacéuticamente activa.

El primer aspecto de la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende una LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP) para uso para proporcionar una activación con especificidad de sitio a una proteína farmacéuticamente activa latente. La expresión "activación con especificidad de sitio", como se usa en este documento, significa, en términos generales y sin limitación, la eliminación o reducción de latencia, conferida a una proteína farmacéuticamente activa, por escisión con especificidad de sitio en el sitio de escisión proteolítica.

Es de esperar que la escisión con especificidad de sitio en el sitio de escisión proteolítica tenga lugar concomitantemente con la activación restaurada de la proteína farmacéuticamente activa.

La expresión "proteína farmacéuticamente activa latente", como se usa en este documento, incluye proteínas farmacéuticamente activas que son latentes debido a su asociación con LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP). Específicamente, la proteína farmacéuticamente activa puede ser latente gracias a su fusión a un sitio de escisión proteolítica asociado con LAP para formar una proteína de fusión latente.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para proporcionar latencia a una proteína farmacéuticamente activa que comprende asociar una proteína de fusión que comprende un péptido asociado con la latencia (LAP) de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP) con dicho agente farmacéuticamente activo.

El término "proteína" en este texto significa, en términos generales, una pluralidad de restos aminoacídicos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Se usa indistintamente y significa lo mismo que péptido, oligopéptido, oligómero, polipéptido, e incluye glicoproteínas y derivados de los mismos. El término "proteína" también pretende incluir fragmentos, análogos y derivados de una proteína, donde el fragmento, análogo o derivado retiene esencialmente la misma actividad biológica o función que una proteína de referencia.

El fragmento, análogo o derivado de la proteína como se define en este texto, puede tener una longitud de al menos 6, preferiblemente 10 ó 20, o hasta 50 ó 100 aminoácidos.

El fragmento, derivado o análogo de la proteína puede ser (i) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos se han substituido con un resto aminoacídico conservado o no conservado (preferiblemente, un resto aminoacídico conservado) y tal resto aminoacídico substituido puede codificarse o no por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos incluyen un grupo substituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro esta fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora que se emplea para la purificación del polipéptido. Tales fragmentos, derivados y análogos se consideran dentro del alcance de los especialistas en la técnica por las enseñanzas de este documento.

Se prefieren particularmente variantes, análogos, derivados y fragmentos que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína en los que se han substituido, delecionado o añadido en cualquier combinación varios restos aminoacídicos, por ejemplo, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ninguno. Entre éstas variantes se prefieren especialmente substituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína de la presente invención. A este respecto, también se prefieren especialmente substituciones conservativas.

Un ejemplo de una variante de la presente invención es una proteína de fusión como se ha definido anteriormente, aparte de la substitución de uno o más aminoácidos con uno o más aminoácidos distintos. El especialista sabrá que diversos aminoácidos tienen propiedades similares. A menudo, uno o más de tales aminoácidos de una substancia pueden substituirse por uno o más aminoácidos distintos sin eliminar una actividad deseada de esa substan-
cia.

De esta manera, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina a menudo pueden substituirse entre sí (aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas). Entre estas substituciones posibles, se prefiere usar la glicina y la alanina para substituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y se prefiere que la valina, leucina e isoleucina se usen para substituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales alifáticas mayores que son hidrófobas). Otros aminoácidos que puede substituirse a menudo entre sí incluyen: fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas); asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).

Las substituciones de esta naturaleza a menudo se denominan substituciones de aminoácidos "conservativas" o "semiconservativas".

También pueden realizarse deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos para la proteína de fusión mencionada anteriormente. De esta manera, por ejemplo, pueden delecionarse aminoácidos que no tengan un efecto substancial sobre la actividad del polipéptido, o al menos que no eliminen tal actividad. Tales deleciones pueden ser ventajosas, ya que pueden reducirse la longitud total y el peso molecular de un polipéptido manteniendo al mismo tiempo la actividad. Esto puede permitir que se reduzca la cantidad de polipéptido requerida para un fin particular - por ejemplo, pueden reducirse los niveles de dosificación.

También pueden realizarse inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de la proteína de fusión anterior. Esto puede realizarse para alterar las propiedades de una substancia de la presente invención (por ejemplo, para ayudar en la identificación, purificación o expresión, como se ha explicado anteriormente en relación con las proteínas de fusión).

Pueden realizarse cambios de aminoácidos con respecto a la secuencia proporcionada en a) anterior usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, usando mutagénesis de localización dirigida.

Debe apreciarse que las substituciones o inserciones de aminoácidos dentro del alcance de la presente invención pueden realizarse usando aminoácidos naturales o no naturales. Tanto si se usan aminoácidos naturales como si se usan aminoácidos no naturales o sintéticos, se prefiere que sólo estén presentes L-aminoácidos.

Una proteína de acuerdo con la invención puede tener secuencias de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales adicionales. Tales secuencias pueden proporcionarse por diversas razones, por ejemplo, para la glicosilación.

La expresión "proteína de fusión" en este texto significa, en términos generales, una o más proteínas unidas entre sí por medios químicos, o por enlaces peptídicos formados durante la síntesis de proteínas o ambas cosas.

El péptido asociado con la latencia (LAP) de la presente invención incluye la secuencia codificante para el dominio precursor de TGF\beta o una secuencia que es substancialmente idéntica a la misma.

"Identidad", como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, determinada por el acoplamiento entre cadenas de tales secuencias. Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos polipéptidos o dos secuencias polinucleotídicas, los métodos empleados comúnmente para determinar la identidad están codificados en programas informáticos. Los programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).

La proteína LAP de la presente invención comprende el dominio precursor de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5, por ejemplo, el péptido precursor de TGF\beta-1, 2 ó 3 (de humano) (Derynck et al., Nature, 316, 701-705 (1985); De Martin et al., EMBO J. 6 3673-3677 (1987); Hanks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 79-82 (1988); Derynck et al., EMBO J. 7, 3737-3743 (1988); Ten Dyke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 85, 4715-4719 (1988)). TFG\beta-4 (de pollo) (Jakowlew et al., Mol. Endrocrinol. 2, 1186-1195 (1988)) o TGF\beta-5 (de xenopus) (Kondaiah et al., J. Biol. Chem. 265, 1089-1093 (1990)). La expresión "dominio precursor" se define como una secuencia que codifica un péptido precursor que no incluye la secuencia que codifica la proteína madura. En la figura 3 se muestran las secuencias de aminoácidos del dominio precursor de TGF\beta-1, 2, 3, 4 y 5 (Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, Capítulo 8, 422 (1996)).

Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la proteína LAP tiene una identidad de al menos un 50%, usando los parámetros por defecto del programa informático BLAST (Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990) proporcionado por HGMP (Human Genoma Mapping Project), a nivel de los aminoácidos, con el dominio precursor de TGF\beta 1, 2, 3, 4 ó 5 (Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, Capítulo 8, 422 (1996)) como se muestra en la figura 3. Más preferiblemente, la proteína LAP puede tener una identidad de al menos un 60%, 70%, 80%, 90% y aún más preferiblemente del 95% (aún más preferiblemente de al menos un 99%), a nivel del ácido nucleico o de los aminoácidos, con el dominio precursor de TGF\beta 1, 2, 3, 4 ó 5, como se muestra en la figura 3.

La proteína LAP comprende la proteína LAP de TGF\beta 1, 2, 3, 4 ó 5 (Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, Capítulo 8, 422 (1996)), como se muestra en la figura 3.

La proteína LAP puede contener al menos dos, por ejemplo, al menos 4, 6, 8, 10 ó 20 restos de cisteína para la formación de enlaces disulfuro.

La proteína LAP puede proporcionar una "cubierta" protectora alrededor del agente farmacéuticamente activo, protegiéndolo de esta manera e impidiendo o previniendo su interacción con otras moléculas en la superficie celular o moléculas importantes para su actividad.

La proteína LAP puede comprender la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1-832 de la figura 1 o los nucleótidos 598-1352 de la figura 2, o una secuencia que tenga una identidad de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, usando los parámetros por defecto del programa informático BLAST proporcionado por HGMP, con dicha secuencia.

El sitio de escisión proteolítica es un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz (MMP).

El sitio de escisión de MMP puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos que se pueda escindir por una MMP. La secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de MMP puede codificarse por los nucleótidos 844-861 de la figura 1 o los nucleótidos 565-585 de la figura 2, o una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, usando los parámetros por defecto del programa informático BLAST proporcionado por HGMP, con dichos nucleótidos. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sitio de escisión de MMP comprende el número mínimo de restos requerido para el reconocimiento y la escisión por MMP.

Un sitio de escisión de MMP puede comprender varios restos aminoacídicos reconocibles por MMP. Además, los aminoácidos del sitio MMP pueden unirse por uno o más enlaces peptídicos que se pueden escindir proteolíticamente por MMP. Las MMP que puede escindir el sitio de MMP incluyen, pero sin limitación, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 o MMP10 (Yu y Stamenkovic, Genes and Dev. 14, 163-176 (2000); Nagase y Fields, Biopolymers, 40, 399-416 (1996); Massova et al., J. Mol. Model. 3, 17-30 (1997); revisado por Vu y Werb, Genes and Dev. 14, 2123-2133 (2000)). En la figura 4 se muestran las secuencias de los sitios de escisión de proteína de MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 y MMP10.

Preferiblemente, el sitio de escisión proteolítica de la presente invención se escinde en sitios de inflamación y remodelación de tejidos. Más preferiblemente, el sitio de escisión proteolítica de la presente invención es un sitio de escisión de MMP, por ejemplo, uno cualquiera o más de MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 o MMP10, como se muestra en la figura 4.

La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión del primer y segundo aspectos de la invención. El ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede comprender los nucleótidos 1-861 de la figura 1 o los nucleótidos 585-1352 de la figura 2, o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, usando los parámetros por defecto del programa informático BLAST proporcionado por HGMP, con dichos nucleótidos.

La presente invención también puede proporcionar un péptido "enlazador". Preferiblemente, el péptido enlazador se une a la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica. El péptido enlazador puede proporcionarse en el extremo C-terminal o N-terminal de la secuencia de aminoácidos que codifica el sitio de escisión proteolítica. Preferiblemente, el péptido enlazador es continuo con la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica. El péptido enlazador puede comprender la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 831-843 y/o 862-873 de la figura 1 o los nucleótidos 553-564 y/o 586-597 de la figura 2 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, usando los parámetros por defecto del programa informático BLAST proporcionado por HGMP, con dicha secuencia.

La expresión "péptido enlazador" pretende definir cualquier secuencia de restos aminoacídicos que preferiblemente proporciona una región hidrófila cuando está contenida en una proteína expresada. Tal región hidrófila puede facilitar la escisión por un enzima en el sitio de escisión proteolítica.

El término "latencia", como se usa en este documento, puede relacionarse con un efecto de protección que puede obstaculizar la interacción entre la proteína de fusión y otras moléculas en la superficie celular. Como alternativa, el término latencia puede usarse para describir una reducción en la actividad (hasta e incluyendo la anulación de la actividad) de una molécula/agente asociado con la proteína de fusión. El término latencia también puede relacionarse con un efecto estabilizador de la proteína de fusión. El efecto puede ser total o parcial, siendo el efecto parcial suficiente para conseguir la latencia del agente activo.

La proteína farmacéuticamente activa puede incluir, pero sin limitación, un factor de crecimiento (por ejemplo, TGF\beta, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de nervios (NGF), factor estimulador de colonias (CSF), factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento semejante a insulina, factor de crecimiento de placenta); factor de diferenciación; citoquina, por ejemplo interleuquina, (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 o IL-21, \alpha o \beta), interferón (por ejemplo, IFN-\alpha, IFN-\beta e IFN-\gamma), factor de necrosis tumoral (TNF), factor inductor de IFN-\gamma (IGIF), proteína morfogenética de hueso (BMP); quimioquina (por ejemplo MIP (Proteínas Inflamatorias de Macrófagos), por ejemplo MIP1\alpha y MIP1\beta; MCP (Proteínas Quimiotácticas de Monocitos), por ejemplo MCP1, 2 ó 3; RANTES (regulado tras la activación de células T normales expresadas y secretadas)); factores tróficos; inhibidores de citoquinas; receptores de citoquinas; enzimas para eliminar radicales libres, por ejemplo superóxido dismutasa o catalasa; enzimas convertidores de profármacos (por ejemplo, enzima convertidor de angiotensina, desaminasas, deshidrogenasas, reductasas, quinasas y fosfatasas); miméticos de péptidos; inhibidores de proteasa; inhibidor tisular de metaloproteinasas e inhibidor de proteasas de serina. Preferiblemente, la proteína farmacéuticamente activa procederá de la especie a tratar, por ejemplo, será de origen humano para el tratamiento de seres humanos. Preferiblemente, la proteína farmacéuticamente activa es IFN\beta.

Como se usa en este documento, "miméticos de péptidos" incluye, pero sin limitación, agentes que tienen una conformación de esqueleto peptídico deseada incluida en un esqueleto no peptídico que mantiene el péptido en una conformación particular. Los miméticos de péptidos, que no tienen algunos de los inconvenientes de los péptidos, son de interés en los casos en los que los péptidos no son adecuados en medicina.

Los miméticos de péptidos pueden comprender un esqueleto peptídico que sea de la conformación L o D. Los ejemplos de miméticos de péptidos incluyen melanocortina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y otros agentes miméticos de péptidos que juegan un papel en el sistema nervioso central, en el sistema endocrino en la transducción de señales y en la infección e inmunidad.

La expresión "asociación con", en el contexto de la presente invención, pretende incluir todos los medios de asociación incluyendo, pero sin limitación, entrecruzamiento químico o unión de enlaces peptídicos.

En una realización alternativa, la invención proporciona adicionalmente la proteína de fusión de la presente invención opcionalmente en asociación con la proteína de unión a TGF\beta latente (LTBP). Típicamente, la proteína de fusión se une covalentemente a LTPB para formar un complejo. Preferiblemente, la asociación está mediada por enlaces disulfuro entre la Cys Nº 33 de LAP y el tercer resto 8 Cys de LTBP. La LTBP asociada con la proteína de fusión puede incluir, pero sin limitación, LTBP 1, 2, 3 ó 4 (Kanzaki et al., Cell, 61, 1051-1061 (1990); Tsuji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 87, 8835-8839 (1990); Moren et al., J. Biol. Chem. 269, 32469-32478 (1994); Yin et al., J. Biol. Chem. 270, 10147-10160 (1995); Gibson et al., Mol. Cell. Biol. 15, 6932-6942 (1995); Saharinen et al., J. Biol. Chem. 273, 18459-18469 (1998)), o fragmentos de LTBP que contengan la tercera repetición de 8 Cys, u homólogos que tengan una secuencia de aminoácidos o nucleótidos con una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, usando los parámetros por defecto del programa informático BLAST proporcionado por HGMP, con la secuencia de LTBP.

La escisión de LTBP puede liberar la proteína de fusión del complejo de LTBP. Los enzimas que pueden escindir la LTBP de esta manera incluyen, pero sin limitación, trombospondina (Schultz et al., The Journal of Biological Chemistry, 269, 26783-26788 (1994), Crawford et al, Cell, 93, 1159-1170 (1998)), transglutaminasa (Nunes et al., J. Cell. Biol. 136, 1151-1163 (1997); Kojima et al., The Journal of Cell Biology, 121, 439-448 (1993)) MMP9 y MMP2 (Yu y Stamenkovic, Genes and Dev, 14, 163-176 (2000)).

Un tercer aspecto de la invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína farmacéuticamente activa, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5, donde se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP) entre la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico.

La expresión "construcción de ácido nucleico" generalmente se refiere a cualquier longitud de ácido nucleico que puede ser ADN, ADNc o ARN, tal como ARNm obtenido por clonación o producido por síntesis química. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario. El ADN monocatenario puede ser la cadena codificante con sentido, o puede ser la cadena no codificante o antisentido. Para uso terapéutico, la construcción de ácido nucleico preferiblemente está en una forma capaz de expresarse en el sujeto a tratar.

Preferiblemente, la primera secuencia de ácido nucleico codifica la proteína IFN\beta. La primera secuencia de ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos 874- 1376 de la figura 1 o los nucleótidos 598-1352 de la figura 2, o una secuencia que sea substancialmente homóloga a la misma. En una realización de la invención, la primera secuencia de ácido nucleico codifica IFN\beta de un ratón o un ser humano.

La construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención puede estar en forma de un vector, por ejemplo, un vector de expresión, y puede incluir, entre otras cosas, vectores cromosómicos, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, vaccinia virus, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. En general, para la expresión a este respecto, puede usarse cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar un ácido nucleico para expresar un polipéptido en un hospedador.

Preferiblemente, la construcción de ácido nucleico es LAP-huIFN\beta o huIFN\beta-LAP como se define en este documento en el ejemplo 4. Como alternativa, la construcción de ácido nucleico puede ser LAP-mIFN\beta como se muestra en la figura 1 y esquemáticamente en la figura 5 o mIFN\beta-LAP como se muestra en la figura 2 y esquemáticamente en la figura 5.

La invención también proporciona una proteína codificada por la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención, opcionalmente en asociación con la proteína de unión a TGF\beta latente (LTBP) descrita en este documento. Típicamente, la proteína codificada por la construcción de ácido nucleico se une covalentemente a LTBP para formar un complejo. Preferiblemente, la asociación está mediada por uno o más enlaces disulfuro entre la Cys Nº 33 de LAP y el tercer resto de 8 Cys de LTBP.

La construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención preferiblemente incluye un promotor u otra secuencia reguladora que controla la expresión del ácido nucleico. Se han identificado promotores y otras secuencias reguladoras que controlan la expresión de un ácido nucleico y se conocen en la técnica. El especialista en la técnica indicará que puede no ser necesario utilizar el promotor entero u otra secuencia reguladora. Puede requerirse sólo el elemento regulador esencial mínimo y, de hecho, tales elementos pueden usarse para construir secuencias quiméricas u otros promotores. Por supuesto, el requisito esencial es retener la especificidad de tejido y/o temporal. El promotor puede ser cualquier promotor conocido adecuado, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano inmediato de CMV, la timidina quinasa de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40 o los promotores de LTR retrovirales, tales como los del virus del Sarcoma de Rous (RSV) y promotores de metalotionina tales como el promotor de la metalotionina-I de ratón. El promotor puede comprender el mínimo necesario para la actividad promotora (tal como elementos TATA sin elementos potenciadores) por ejemplo, la secuencia mínima del promotor de CMV.

Preferiblemente, el promotor es contiguo a la primera y/o segunda secuencias de ácido nucleico.

Como se ha indicado en este documento, la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención puede estar en forma de un vector. Los vectores frecuentemente incluyen uno o más marcadores de expresión que permiten la selección de células transfectadas (o transformadas) con ellos, y preferiblemente, que permiten la selección de células que contienen vectores que incorporan un ADN heterólogo. Generalmente estará presente una señal de inicio y stop adecuada.

Una realización de la invención se refiere a una célula que comprende la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención. La célula puede denominarse célula "hospedadora", que es útil para la manipulación del ácido nucleico, incluyendo la clonación. Como alternativa, la célula puede ser una célula en la que se obtenga la expresión del ácido nucleico. Los ejemplos representativos de células hospedadoras apropiadas para la expresión de la construcción de ácido nucleico de la invención incluyen células de empaquetamiento de virus que permiten la encapsulación del ácido nucleico en un vector viral; células bacterianas, tales como Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células individuales tales como células de levadura, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, y células de Aspergillus; células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células animales tales como CHO, COS, C127, 3T3, PHK.293 y células de melanoma de Bowes y otras células humanas adecuadas; y células vegetales, por ejemplo, Arabidopsis thaliana.

La inducción de un vector de expresión en la célula hospedadora puede verse afectada por transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por raspado, introducción balística, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edición, Coldspring Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, N.Y. (1989).

Las proteínas maduras pueden expresarse en células hospedadoras, incluyendo células de mamífero tales como células CHO, células de levadura, bacterianas u otras células bajo el control de promotores apropiados. Para producir tales proteínas pueden emplearse sistemas de traducción sin células usando ARN procedentes de la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la presente invención. En Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edición, Coldspring Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, N.Y. (1989) se describen vectores de clonación y expresión apropiados para uso con hospedadores procariotas y eucariotas.

Las proteínas pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato amónico o con etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía líquida de alta resolución y cromatografía con lectina. Para la terapia, la construcción de ácido nucleico, por ejemplo, en forma de un vector recombinante, puede purificarse por técnicas conocidas en la técnica, tales como por medio de cromatografía en columna como se describe en Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edición, Coldspring, Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, N.Y. (1989).

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención para uso en medicina. La construcción puede usarse como parte de una construcción de expresión, por ejemplo, en forma de un vector de expresión tal como un plásmido o un virus. La construcción puede ser adecuada para administrarse por vía intravenosa, intradérmica, intramuscular, oral o por otras vías.

La construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención, y las proteínas derivadas de la misma, pueden emplearse solas o junto con otros compuestos tales como compuestos terapéuticos, por ejemplo, fármacos anti-inflamatorios, agentes citotóxicos, agentes citostáticos y antibióticos. Las construcciones de ácido nucleico y proteínas útiles en la presente invención preferiblemente se proporcionan en una forma aislada, y preferiblemente se purifican hasta la homogeneidad.

De acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, la construcción para uso en medicina incluye el uso en cualquier régimen que pueda proporcionar un beneficio a un ser humano o a un animal no humano. La expresión "animales no humanos" se extiende a animales domésticos, incluyendo caballos y animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros) y animales de granja/agrícolas, incluyendo miembros de las familias ovina, caprina, porcina, bovina y equina. El uso puede estar asociado con cualquier enfermedad o trastorno existente, o puede ser profiláctico (tratamiento preventivo). El uso puede ser de una enfermedad heredada o adquirida. El uso puede ser de una afección aguda o crónica. Preferiblemente, el uso es de una afección/trastorno asociado con la inflamación. La primera secuencia de ácido nucleico de la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención puede codificar una proteína para uso en el tratamiento del trastorno, incluyendo, pero sin limitación, osteoartritis, esclerodermia, enfermedad renal, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria de intestino, esclerosis múltiple, aterosclerosis o cualquier enfermedad inflamatoria; o cáncer.

La construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención puede usarse terapéuticamente en terapia génica. Como alternativa, la proteína codificada por la construcción de ácido nucleico puede ser adecuada para la administración directa como se describe en el este documento. La administración de la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto puede dirigirse al sitio diana por métodos físicos. Los ejemplos de estos métodos incluyen la administración tópica del ácido nucleico "desnudo" en forma de un vector en un vehículo apropiado, por ejemplo, en solución en un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, o la administración de un vector por un método físico tal como bombardeo de partículas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Otros métodos físicos para administrar la construcción de ácido nucleico o proteínas del tercer aspecto de la invención directamente en el receptor incluyen ultrasonidos, estimulación eléctrica, electroporación y microsiembra. Otros métodos de administración incluyen la administración oral o la administración por inhalación.

Se prefiere particularmente el modo de liberación por microsiembra, que es un sistema para suministrar material genético al interior de células in situ en un paciente. Este método se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5697901.

La construcción de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención también puede administrarse por medio de vectores de liberación. Éstos incluyen vectores de liberación viral, tales como vectores de liberación de adenovirus o retrovirus conocidos en la técnica. Otros vectores de liberación no virales incluyen vectores de liberación lipídicos, incluyendo vectores de liberación de liposomas conocidos en la técnica.

La administración también puede realizarse a través de células hospedadoras transformadas. Tales células incluyen células recogidas a partir del sujeto, al interior de las cuales se transfiere la construcción de ácido nucleico por métodos de transferencia génica conocidos en la técnica. A continuación se desarrollan las células transformadas en cultivo y se injertan en el sujeto.

Como se usa en este documento, la expresión "terapia génica" se refiere a la introducción de genes por ingeniería genética recombinante de células corporales (terapia génica somática) para el beneficio del paciente. Además, la terapia génica puede dividirse en técnicas ex vivo e in vivo. La terapia génica ex vivo se refiere a la extracción de células corporales de un paciente, tratamiento de las células extraídas con un vector, es decir, un vector recombinante, y la devolución posterior de las células tratadas al paciente. La terapia génica in vivo se refiere a la administración directa del vector con el gen recombinante, por ejemplo, por medios intravenosos o intravasculares.

Preferiblemente, para una construcción de ácido nucleico para uso en terapia génica, el vector de expresión de la presente invención se expresa en el sujeto a tratar. De esta manera, en el caso de los seres humanos, el promotor preferiblemente es un promotor humano de un gen humano, o de un que típicamente se expresa en humanos, tal como el promotor del CMV humano. La presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico como se ha definido anteriormente para uso en la manipulación de las células somáticas de mamíferos humanos y no humanos, o la manipulación de las células de la línea germinal de un mamífero no humano.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una proteína terapéutica preparada a partir de células humanas tratadas in vitro para insertar una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.

La manipulación de las células extraídas de un paciente se realiza con la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención en un vector apropiado. Como se usa en este documento, la expresión "células manipuladas" incluye células transfectadas con un vector recombinante.

También se contempla el uso de las células transfectadas en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

Un quinto aspecto de la invención proporciona una construcción de ácido nucleico, o proteína codificada por la misma, de acuerdo con el tercer aspecto de la invención para uso en medicina, preferiblemente para uso en terapia génica.

La presente invención también puede encontrar aplicación en medicina veterinaria para el tratamiento/profilaxis de animales domésticos incluyendo caballos y animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros) y animales de granja que pueden incluir miembros de la familia ovina, porcina, caprina, bovina y equina.

Un sexto aspecto de la invención proporciona el uso de la construcción de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio. En este contexto, el trastorno inflamatorio puede incluir una cualquiera o más de las afecciones asociadas con la inflamación descritas anteriormente.

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden la construcción de ácido nucleico o proteínas del tercer aspecto de la invención. Por lo tanto, la construcción de ácido nucleico de la presente invención puede emplearse en combinación con el vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier manera eficaz y conveniente para tratar la enfermedad de un paciente, incluyendo, por ejemplo, la administración por vía oral, tópica, intravenosa, intramuscular, intranasal o intradérmica, entre otras. En terapia o como un profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

Para la administración a mamíferos y particularmente a seres humanos, es de esperar que la dosificación diaria del agente activo sea desde 0,01 mg/kg de peso corporal, típicamente aproximadamente 1 mg/kg. En cualquier caso, el médico determinara la dosificación real más adecuada para un individuo, que será dependiente de factores que incluyen la edad, el peso, el sexo y la respuesta del individuo. Las dosificaciones anteriores son ilustrativas del caso medio. Por supuesto, puede haber casos en los que se requieran dosificaciones superiores o inferiores, y están dentro del alcance de esta invención.

Un séptimo aspecto de la invención proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP), donde la proteína de fusión está asociada con una proteína farmacéuticamente activa.

La invención también proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión del séptimo aspecto de la invención. La construcción de ácido nucleico preferiblemente comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 adyacente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP). Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica una LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 convenientemente está unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP). La construcción de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede comprender los nucleótidos 1-861 de la figura 1 o los nucleótidos 585-1352 de la figura 2, o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, usando los parámetros por defecto del programa informático BLAST proporcionado por HGMP, con dichos nucleótidos.

La invención también proporciona la proteína de fusión del séptimo aspecto de la invención, opcionalmente en asociación con la proteína de unión a TGF\beta latente (LTBP) descrita en este documento.

La proteína de fusión del séptimo aspecto de la invención puede asociarse con la proteína farmacéuticamente activa por medio de un enlace de unión de péptidos. Como alternativa, la proteína de fusión puede asociarse con la proteína farmacéuticamente activa por medio de un enlace químico, por ejemplo, por entrecruzamiento de la proteína de fusión con un compuesto químico tal como un agente quimioterapéutico, fármaco sintético o PNA.

Preferiblemente, en la proteína de fusión del séptimo aspecto de la invención, a proteína farmacéuticamente activa está unida al extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP). Más preferiblemente, la proteína farmacéuticamente activa es continua con el resto C-terminal de la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP).

Un octavo aspecto de la invención proporciona un proceso para preparar la proteína de fusión, y una proteína farmacéuticamente activa asociada, del séptimo aspecto de la invención, que comprende la producción de la proteína de fusión de forma recombinante por expresión en una célula hospedadora, la purificación de la proteína de fusión expresada y la asociación de la proteína farmacéuticamente activa con la proteína de fusión purificada por medio de un enlace de unión de péptidos o un entrecruzamiento químico.

Un noveno aspecto de la invención proporciona una proteína de fusión y una proteína farmacéuticamente activa asociada de acuerdo con el séptimo aspecto de la invención para uso en medicina.

La proteína de fusión, y la proteína farmacéuticamente activa asociada del séptimo aspecto de la invención, pueden emplearse solas o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos, por ejemplo, fármacos anti-inflamatorios, agentes citotóxicos, agentes citostáticos o antibióticos.

Preferiblemente, la proteína de fusión y la proteína farmacéuticamente activa asociada del séptimo aspecto de la invención son adecuadas para la administración directa a un paciente como se describe en este documento.

Un décimo aspecto de la invención proporciona el uso de la proteína de fusión y la proteína farmacéuticamente activa asociada de acuerdo con el séptimo aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio. En este contexto, el trastorno inflamatorio puede incluir una cualquiera o más de las afecciones asociadas con la inflamación descritas en este documento.

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden la proteína de fusión y la proteína farmacéuticamente activa asociada del séptimo aspecto de la invención. Por lo tanto, la proteína de fusión y la proteína farmacéuticamente activa asociada pueden emplearse en combinación con el vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, polietilenglicol, etanol y combinaciones de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier manera eficaz y conveniente para tratar una enfermedad de un paciente incluyendo, por ejemplo, la administración por vía oral, tópica, intravenosa, intramuscular, intranasal o intradérmica, entre otras. En terapia o como un agente profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

La invención también proporciona un kit de partes que comprende una construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención, o una proteína de fusión y una proteína farmacéuticamente activa asociada de acuerdo con el séptimo aspecto de la invención, y un vehículo de administración que incluye, pero sin limitación, comprimidos para administración oral, inhaladores para administración pulmonar y soluciones inyectables para administración intravenosa.

Una realización preferida de la presente invención proporciona un uso para proporcionar latencia a una proteína farmacéuticamente activa que es una citoquina, preferiblemente interferón, comprendiendo el método la construcción de una proteína de fusión que tiene un péptido asociado con la latencia (LAP) de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5, asociado con un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP), y la proteína farmacéuticamente activa. Preferiblemente, la proteína farmacéuticamente activa va seguida del sitio de escisión proteolítica de MMP y el péptido LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 como se indica a continuación: agente activo - sitio de escisión - LAP.

Todas las características preferidas del segundo y de los aspectos posteriores de la invención son como en relación con el primer aspecto mutatis mutandis.

La presente invención se describirá a continuación a modo de ejemplo sólo haciendo referencia a las figuras adjuntas en las que:

Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (A) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (B) de la construcción LAP-mIFN\beta. La secuencia recuadrada corresponde a la secuencia del sitio de escisión de MMP incluyendo la secuencia enlazadora;

Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos (A) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (B) de la construcción mIFN\beta-LAP. La secuencia recuadrada corresponde a la secuencia del sitio de escisión de MMP incluyendo la secuencia enlazadora;

Figura 3 muestra secuencias de aminoácidos del dominio precursor de TGF\beta 1, 2 y 3 (humano, Hu), TGF\beta 4 (pollo, Ck), TGF\beta (rana, Fg). Las flechas indican la posición del procesamiento proteolítico que da como resultado la escisión del péptido señal de TGF\beta1 y de los TGF\beta maduros. Los sitios de glicosilación unidos a N están subrayados, como también lo está la secuencia de reconocimiento celular de la integrina (Roberts y Sporn, Peptide Growth Factors AND their Receptors: Sporn, MB y Roberts, AB, Springer-Verlag, Capítulo 8, 422 (1996));

Figura 4 muestra las secuencias de los sitios de escisión de proteína de metaloproteinasas de matriz (MMP) (Nagase y Fields, Biopolymers, 40, 399-416 (1996));

Figura 5 muestra la representación esquemática de las proteínas de fusión usadas en este estudio y su supuesto plegamiento. (A) Estructura primaria de proteínas latentes recombinantes. Se muestra la disposición de la secuencia lineal de los constituyentes LAP, MMP y mIFN\beta en las dos configuraciones usadas en este estudio, LAP-mIFN\beta y mIFN\beta-LAP. El recuadro en el extremo amino terminal de LAP-mIFN\beta y mIFN\beta-LAP representa el péptido de la secuencia señal nativo para la secreción de TGF\beta o mIFN\beta, respectivamente. (B) Supuesto plegamiento e interacciones con LTBP de citoquina latente. En LTBP, las repeticiones de tipo EGF se muestran como cuadrados pequeños, las repeticiones ricas en cisteína y el dominio híbrido como círculos, y la "región de bisagra", que es sensible a la escisión proteolítica, se muestra como una línea llena negra. Los enlaces disulfuro se muestran como líneas llenas grises;

Figura 6 muestra la detección de proteínas de fusión recombinantes en sobrenadantes de células CHO. SDS-PAGE no desnaturalizante de sobrenadantes de células CHO (calle 1), transfectadas con LAP-mIFN\beta (calle 2) y mIFN\beta-LAP (calle 3). La posición de las dobles bandas de las proteínas de fusión recién expresadas está marcada por una doble flecha. Se muestra la posición de los marcadores de peso molecular (P.M.) en kDa;

Figura 7 muestra la inmunoprecipitación de sobrenadantes de células CHO con anticuerpo anti-LAP y escisión con MMP1 y MMP3. LAP-mIFN\beta (calles 1, 3 y 5) y mIFN\beta-LAP (calles 2, 4 y 6). Controles no tratados (calles 1 y 2), tratados con MMP3 (calles 3 y 4), tratados con MMP1 (calles 5 y 6). La SDS PAGE se realizó en condiciones desnaturalizantes. Las posiciones de LTBP y de las proteínas de fusión están indicadas por flechas. Las flechas marcadas con un asterisco (*) indican la presencia de productos de escisión de MMP. Se muestra la posición de los marcadores de peso molecular (P.M.) en kDa;

Figura 8 muestra la inmunoprecipitación de sobrenadantes de células CHO seleccionados con MTX con anticuerpos anti-LAP y anti-IFN\beta y escisión con MMP1, MMP3 y líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide. (A). LAP-mIFN\beta y (B) mIFN\beta-LAP. Sobrenadantes no tratados (calles 1 y 5), tratados con MMP1 (calles 2 y 6), tratados con MMP3 (calles 3 y 7) y tratados con líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (calles 4 y 8). Inmunoprecipitados con anticuerpo monoclonal anti-LAP (calles 1-4) y anti-IFN\beta (calles 5-8). Las posiciones de LTBP y de las proteínas de fusión están indicadas por flechas. Las flechas marcadas con un asterisco (*) indican la presencia de productos de escisión de MMP;

Figura 9 muestra la cinética de la actividad de IFN después de la incubación en medio solo o con líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide. A. LAP-mIFN\beta; Panel B. mIFN\beta-LAP.

Figura 10 muestra la inhibición de la artritis inducida por colágeno por inyección de ADN con LAP-IFN\beta. El panel A muestra el hinchamiento de las patas traseras y el panel B muestra el desarrollo de la puntuación clínica desde el momento del refuerzo con colágeno de tipo II.

Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos (A) prevista y la secuencia de aminoácidos correspondiente (B) de la construcción huIFN\beta-LAP.

Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos (A) prevista y la secuencia de aminoácidos correspondiente (B) de la construcción LAP-huIFN\beta.

La invención se describe a continuación haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes;

Ejemplo 1 Construcción de proteínas de fusión hLAP-mIFN\beta, mIFN\beta-hLAP y pLAP-mIFN\beta Métodos Clonación de enlazador GS-MMP-GS en sitios EcoR1-Not1 de pcDNA3

Se construyó un vector insertando el enlazador GS-MMP-GS en pcDNA3 escindido con EcoR1-Not1. pcDNA3 es un vector de expresión (de Invitrogen) que comprende el promotor temprano inmediato y el potenciador de citomegalovirus humano, junto con señales de procesamiento de ARN que permiten la transcripción.

Se diseñó un desoxioligonucleótido bicatenario que codificaba la secuencia GLY GLY GLY GLY SER PRO LEU GLY LEU TRP ALA GLY GLY GLY SER como se indica a continuación:

Oligo con sentido:

5'AATTCGGGGGAGGCGGATCCCCGCTCGGGCTTTGGGCGGGAGGGGGCTCAGC 3'

Oligo antisentido:

5'GGCCGCTGAGCCCCCTCCCGCCCAAAGCCCGAGCGGGGATCCGCCTCCCCCG 3'

Los desoxioligonucleótidos sintéticos se adquirieron en Life Technologies Ltd. (Paisley, Reino Unido). Los desoxioligonucleótidos hibridados se clonaron en pcDNA3 escindido con EcoR1-Not1 (Invitrogen, Groningen, Países Bajos). El clon recombinante perdió su sitio EcoRV y consiguió un sitio BamH1 adicional. Los clones plasmídicos se evaluaron por hibridación de transferencia de Southern con oligos de extremos marcados. El clon se denominó gen GS-MMP-GS. Los enzimas de restricción y los enzimas para modificar el ADN se obtuvieron en New England Biolabs, Hitchin, Reino Unido.

Construcción de LAP (TGF\beta) en el extremo NH_{2} seguido de GS-MMP-GS e IFN\beta maduro

Se construyó un vector que comprendía LAP (TGF\beta) seguido de GS-MMP-GS e IFN\beta maduro como se indica a continuación:

Se clonó LAP de TGF\beta como una unidad 5' (con péptido señal) con extremos HindIII y EcoR1 por PCR a partir del plásmido TGF\beta-Babe neo (Chernajovsky et al., Gene Ther. 4, 553-559 (1997)). Se usaron los siguientes cebadores:

Cebador con sentido: 5' CCAAGCTTATGCCGCCCTCCGGGCTGCGG 3'

Cebador antisentido: 5' CCGAATTCGCTTTGCAGATGCTGGGCCCT 3'

Después de la PCR, el producto se sometió a una extracción con fenol, los extremos se rellenaron con Klenow y se digirieron con HindIII y EcoR1. El producto de 820 pb se clonó en el plásmido GS-MMP-GS cortado con los mismos enzimas. El clon se denomino enlazador TGF\beta-GS-MMP-GS. Se sintetizó mIFN\beta maduro (de ratón) con sitios 5' Not1 y 3' Xba1 por PCR a partir del clon Aphrodite (Triantaphyllopoulos et al., Gene Ther. 5, 253-263 (1998)) usando los siguientes cebadores:

Cebador con sentido: 5' CGCGGCCGCAATCAACTATAAGCAGCTCCAG 3'

Cebador antisentido: 5' GGTCTAGATCAGTTTTGGAAGTTTCTGGTAAG 3'

Después de la PCR, el fragmento se sometió a extracción con fenol, los extremos se rellenaron con Klenow y se digirieron con Not1 y Xba1. El clon LAP-mIFN\beta se obtuvo clonando el fragmento en los sitios Not1 y Xba1 del plásmido enlazador TGF\beta-GS-MMP-GS.

La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del inserto LAP-mIFN\beta se muestra en la figura 1.

Construcción de mIFN\beta en el extremo NH_{2} seguido de GS-MMP-GS y LAP madura (TGF\beta)

Se construyó un vector que comprendía mIFN\beta maduro seguido de GS-MMP-GS y LAP (TGF\beta) como se indica a continuación:

Se sintetizó Pre-IFN\beta con péptido señal y sin codón stop por PCR como se ha indicado anteriormente usando los siguientes cebadores:

Cebador con sentido: 5' CCAAGCTTATGAACAACAGGTGGATCCTC 3'

Cebador antisentido: 5' CCGAATTCGTTTTGGAAGTTTCTGGTAAG 3'

Después de la síntesis por PCR, extracción con fenol, relleno con fragmento de Klenow de la ADN polimerasa, el producto de ADN se digirió con HindIII y EcoR1 y se clonó en el plásmido pCDNA3 GS-MMP-GS en los mismos sitios. El clon se denomino enlazador IFN\beta-GS-MMP-GS. Se sintetizó LAP madura (TGF\beta) con codón stop por PCR como se ha indicado anteriormente usando los siguientes cebadores:

Cebador con sentido: 5' CGCGGCCGCACTATCCACCTGCAAGACTATC 3'

Cebador antisentido: 5'-GGTCTAGATCAGCTTTGCAGATGCTGGGCCCT 3'

Después de la PCR y extracción con fenol, los extremos se rellenaron con Klenow y se digirieron con Not1 y Xba1. El clon mIFN\beta-LAP se obtuvo clonando el fragmento de PCR en los mismos sitios del plásmido IFN\beta-GS-MMP-GS. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del inserto mIFN\beta-LAP se muestra en la figura 2.

Clonación del LAP porcina delante de mIFN\beta

El ADNc porcino mutado, mutado en Cys a Ser (223/225), como el plásmido pPK14 (Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 92 2572-2576 (1995), se proporcionó amablemente por P.J. Wirth, NIH, Bethesda, Maryland. La clonación de la proteína LAP porcina se realizó por PCR usando la siguiente serie de cebado-
res:

El cebador con sentido que empezaba en el péptido señal era 5' CGCCCATGGCGCCTTCGGGGCCT 3'. Este cebador tiene una secuencia modificada alrededor del iniciador ATG para crear un sitio Nco1.

Cebador antisentido 5' CCGAATTCGCTGTGCAGGTGCTGGGCCCT 3'

Después de la síntesis por PCR, el producto de PCR se sometió a un relleno de extremos con ADN polimerasa de Klenow, se cortó con EcoR1, se clonó en el plásmido LAP-mIFN\beta cortado con HindIII (relleno) y después se cortó con EcoR1 (intercambiando la LAP humana). La construcción se denomino PorcLap-mIFN\beta.

Resultados Consideraciones estructurales

Para crear una citoquina latente usando el dominio LAP de proteínas de fusión de TGF\beta en dos conformaciones, se construyeron una que contenía LAP en el extremo amino terminal de IFN\beta de ratón (véase la figura 1) y otra en su extremo COOH (véase la figura 2).

Para evitar el procesamiento de la proteína LAP-mIFN\beta en Arg 278 de LAP, se clonó LAP que incluía los aminoácidos Met 1-Ser 273. Esta secuencia se continuó por un enlazador flexible (GGGGS), un supuesto sitio de escisión de MMP9 (Peng et al., Human Gene Therapy 8, 729-738 (1997); Ye et al., Biochemistry, 34, 4702-4708 (1995)) o un supuesto sitio de escisión de MMP1 (Nagase y Fields, Biopolymers, 40, 399-416 (1996)) (PLGLWA) y otra porción flexible (GGGGSAAA) seguido de mIFN\beta maduro (empezando en el aminoácido Ile-22). La inclusión del sitio de escisión de MMP en un área hidrófila facilitaría el acceso al ataque enzimático. Se ha demostrado que el núcleo del sitio de escisión (PLGL) se escinde como un péptido por MMP2 y en una versión diferente (PLGI) también por MMP3, MMP7 y MMP8 (Nagase y Fields, Biopolymers, 40, 399-416 (1996)).

La molécula de IFN\beta-LAP constaba de la secuencia precursora de mIFN\beta, donde su codón stop se mutó para permitir la lectura a través del enlazador flexible y el sitio MMP seguido de la secuencia madura de LAP (de Leu-29 a Ser-273).

Las proteínas de fusión LAP-mIFN\beta y mIFN\beta-LAP no procesadas tienen un peso molecular esperado de 52.375 y 51.768 Daltons respectivamente. La secuencia primaria de estas proteínas de fusión contiene cuatro sitios de N-glicosilación posibles. En la fig. 5 se muestra una representación esquemática de la estructura primaria y el supuesto plegamiento de estas proteínas y su posible interacción con LTBP. En el panel de la derecha de la figura 5B se muestra el plegamiento de LAP-mIFN\beta que se parece al plegamiento del TGF\beta nativo. Cerca del extremo amino terminal (N) de LAP-mIFN\beta, la Cys 33 interacciona con la tercera repetición rica en 8-cisteínas de LTBP, mientras que es de esperar que las Cys 224 y 226 dimericen la proteína por enlaces disulfuro intermoleculares (Saharinen et al., Cytokine and Growth Factors, 10, 99-117 (1999)). En el panel de la izquierda de la figura 5B, se muestra la estructura de mIFN\beta-LAP. La Cys 33 ahora está localizada detrás del sitio de escisión de MMP y la Cys 224 y 226 están próximas al extremo carboxi (C) de la proteína.

Ejemplo 2 Estudios de transfección de células Métodos Transfección en células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en DHFR

Se mantuvieron células CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) en medio HAM-F12 (Life Technologies Ltd., Paisley, Reino Unido) con un 10% de suero bovino fetal (FBS) (Life Technologies Ltd.), penicilina/estreptomicina y glutamina.

Se linealizaron plásmidos de pcDNA3 (20 \mug) que expresaban LAP-mIFN\beta o mIFN\beta-LAP con PvuI y se unieron por separado con pSV_{2}DHFR (1 \mug) cortado con PvuI (Chernajovsky et al., DNA, 3, 297-308 (1984)). Después de la extracción con fenol, los plásmidos se unieron en 300 \mul con ADN ligasa de T4 a 16ºC durante 3 días. El ADN se precipitó en acetato de NH_{4} 0,4 M y se resuspendió en agua para añadirse como 1 ml de coprecipitado de fosfato cálcico a 0,5 x 10^{6} células CHO en placas de 9 cm sembradas 24 horas antes. Cuatro horas después, las células se trataron con glicerol al 10% en HAM-F12 sin FBS, se lavaron en medio sin FBS y se dejaron recuperar durante 48 horas. Las células transfectadas se tripsinizaron y se dividieron en seis placas de 9 cm. La selección se realizó en medio Alpha-DMEM sin nucleósidos (PAA Laboratories, Linz, Austria), FBS dializado al 10% (PAA Laboratories) y 1 mg/ml de G418 (Geneticin, de Life Technologies Ltd.). El medio de selección se cambió dos veces por semana. Los clones celulares aparecieron 2-3 semanas después y se mantuvieron como una población (Chernajovsky et al., DNA, 3, 297-308 (1984)).

Para la amplificación de genes, las células se seleccionaron adicionalmente con metotrexato (MTX) (Sigma, Poole, Reino Unido) a 50 nM (LAP-mIFN\beta) o 12,5 nM (mIFN\beta-LAP) respectivamente. Los clones celulares se aislaron por clonación de anillo y se expandieron en medio de selección.

Ensayo biológico de IFN\beta

La actividad biológica de IFN\beta de ratón se evaluó por inhibición del efecto citopático de la infección por el virus EMC (proporcionado amablemente por I. Kerr, Imperial Cancer Research Fund, Londres) en células LTK^{-} de ratón usando diluciones a la mitad de sobrenadantes celulares como se describe (Triantaphyllopoulos et al., Gene Ther. 5, 253-263 (1998)). Cuando se indica, los sobrenadantes de CHO sin suero se concentraron por centrifugación usando filtros Vivaspin (Sartorious, Goettingen, Alemania) con un límite de 30.000 kDa.

Marcaje metabólico de células CHO

Se lavaron placas confluentes de células transfectadas permanentemente o células CHO no transfectadas con medio sin cisteína-metionina (Life Technologies, Ltd.) que contenía FBS dializado al 10% y suplementado con timidina, glutamina, penicilina/estreptomicina y 150 \mug/ml de L-prolina. El marcaje se realizó durante una noche o durante 48 horas en presencia de una mezcla de ^{35}S-metionina-cisteína (Amersham-Pharmacia Biotech, Bucks, Reino Unido) a 1 Ci/mmol usando 250 mCi/placa en 5 ml de medio.

Al final del periodo de marcaje, se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron los desechos celulares y los sobrenadantes transparentes se suplementaron cuando se indica con inhibidores de proteasa de serina (SPI) (pepstatina-A a 10 \mug/ml, aprotinina a 1 \mug/ml, quimostatina a 10 \mug/ml, leupeptina a 10 \mug/ml y AEBSF (fluoruro de 4-(2-aminoetil)benceno sulfonilo, HCl) a 200 \muM (todos de Calbiochem, Beeston, Reino Unido). Estos sobrenadantes se congelaron a -70ºC hasta que se usaron para los estudios de inmunoprecipitación.

Inmunoprecipitación

Se preaclararon sobrenadantes de células marcadas metabólicamente con Protein-G-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) (400 \mul) equilibrada en PBS con NP40 al 0,1% (50% perlas/vol) (BDH, Poole, Reino Unido). Se usaron sobrenadantes que contenían 25 x 10^{6} cpm de proteína total precipitada con ácido tricloroacético (TCA) (Sigma) (aproximadamente 5-7 ml de sobrenadantes celulares). Después de mezclar en un mezclador de tambor vertical durante 4 horas a 4ºC, se retiró la proteína G Sepharose por centrifugación (200 RPM, 5 min). El sobrenadante aclarado se incubó con anticuerpo de cabra anti-LAP humana (R&D Systems, Oxon, Reino Unido a 0,9 \mug/ml) o anticuerpo monoclonal de rata anti-mIFN\beta (7F-D3, AMS, Abingdon, Reino Unido; a una dilución de 1/250) durante 3-4 horas a 4ºC.

Después, los complejos antígeno-anticuerpo se unieron a Protein-G-Sepharose (700 \mul de solución al 50%) mezclando durante una noche a 4ºC en un mezclador de tambor vertical. Las perlas de Protein-G-Sepharose se lavaron tres veces con 5 ml de NP40 al 0,1% en PBS. Las proteínas unidas a las perlas se dividieron en fracciones de 50 \mul de perlas en pequeños tubos y se resuspendieron directamente en tampón de carga de Laemmli o se usaron en reacciones de MMP antes de SDS-PAGE en gel de acrilamida al 10%. Como alternativa, los sobrenadantes se trataron con MMP y después se inmunoprecipitaron. Los geles se fijaron durante 30 minutos en ácido acético al 7% y metanol al 10% y se trataron con salicilato sódico 1 M antes de secarse y exponerse a autorradiografía con una película de rayos X. Los marcadores de peso molecular de proteínas coloreados se obtuvieron en Amersham-Pharmacia Biotech.

Los sobrenadantes de las células seleccionadas con MTX se trataron con MMP o líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (RA/SF:1/5) durante una noche, las reacciones se detuvieron con EDTA 10 mM y después se inmunoprecipitaron.

Digestión con MMP

Se incubaron recombinantes pro-MMP9 (proporcionados amablemente por R. Fridman, Wayne University, Detroit) o MMP1 y MMP3 activas (proporcionadas amablemente por H. Nagase, Kennedy Institute of Rheumatology, Londres) durante una noche a 37ºC con sobrenadantes inmunoprecipitados de células CHO en TrisHCl 20 mM pH 7,4, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 140 mM y Brij 35 al 0,1% (todos de Sigma) en 50 \mul a un 1 \mug/ml o se añadieron directamente a sobrenadantes celulares (a 4 \mug/ml). En ciertos experimentos se usó acetato aminofenilmercúrico (APMA) (Sigma) a 10 \muM para activar la pro-MMP9 durante una noche a 37ºC (Ogata et al., J. Biol. Chem. 270, 18506-18511
(1995)).

Resultados TABLA 1 Ensayo biológico de mIFN\beta

Muestra	Actividad antiviral (U/ml)
No transfectada	0
mIFN\beta-LAP	210
LAP-mIFN\beta	0

Valor medio de ensayos triplicados

Se expresaron proteínas recombinantes LAP-mIFN\beta y mIFN\beta-LAP en células de ovario de hámster chino deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR^{-}CHO) (clon CHO-K1) después de la cotransfección permanente de plásmidos linealizados con el plásmido DHFR (pSV_{2}DHFR) (Chernajovsky et al., DNA, 3, 297-308 (1984)) y selección tanto G418 como en suero dializado.

Como se muestra en la tabla 1, se secretó mIFN\beta-LAP que tenía una baja actividad biológica residual, mientras que LAP-mIFN\beta era completamente "latente" o "inactiva". El nivel de expresión de proteínas fue similar, según se confirmó por transferencia de western con un anticuerpo anti-LAP (no mostrado).

Caracterización bioquímica de proteínas recombinantes

Se marcaron metabólicamente proteínas secretadas de células transfectadas permanentemente con ^{35}S-metionina y cisteína. Tanto las proteínas marcadas LAP-mIFN\beta como las proteínas marcadas mIFN\beta-LAP mostraron dos bandas principales por encima de 97 kDa en condiciones no reductoras que no se veían en sobrenadantes de células CHO no transfectadas (fig. 6).

Tras la inmunoprecipitación con anticuerpo anti-LAP, los sobrenadantes de LAP- mIFN\beta y mIFN\beta-LAP mostraron tres bandas: una a 57 kDa, otra 135 kDa y otro componente minoritario a aproximadamente 75 kDa en condiciones reductoras. Fig. 7. La proteína de 135 kDa probablemente es la procedente de CHO (LTBP) que está unida por medio de enlaces disulfuro a LAP (Saharinen et al., Cytokine and Growth Factors, 10, 99-117 (1999)).

El componente minoritario de 75 kDa (fig. 7, calles 1, 3 y 5) se convierte en el componente principal reconocido por el anticuerpo anti-LAP tras la amplificación génica con MTX (fig. 8A, calles 1-4). De manera interesante, el anticuerpo monoclonal anti-mIFN\beta no parece reconocer el producto glicosilado de 75 kDa (fig. 8A y 7, calles 5-8) y el anti-LAP apenas lo reconoce en la configuración mIFN\beta-LAP (fig. 8A, calles 5-8) de la proteína, indicando que las proteínas de fusión tienen diferentes conformaciones. Se obtuvieron resultados similares cuando el material inmunoprecipitado se trató enzimáticamente (con MMP1 o MMP3) y después se separó en SDS-PAGE. La diferencia en conformación puede explicar la diferente sensibilidad de estas proteínas a diferentes MMP (véase más adelante) y su grado de latencia.

El peso molecular previsto de las proteínas recombinantes secretadas es 49.376 Da para LAP-mIFN\beta y mIFN\beta-LAP. El mayor peso molecular determinado puede deberse a la glicosilación de estas proteínas. La incubación de proteínas inmunoprecipitadas con N-glicosidasa F produce dos proteínas principales con pesos moleculares de 70 kDa y 51 kDa que corresponden a LTBP y a la proteína de fusión respectivamente (no mostrado).

Escisión con MMP de proteínas recombinantes

Se trataron complejos inmunoprecipitados durante una noche con MMP individuales o su combinación. Como se muestra en la fig. 7, pro-MMP9 o MMP1 no escindieron de forma muy eficaz el producto recombinante de 57 kDa. MMP1 pudo escindir la forma glicosilada de la proteína de fusión (fig. 7, calles 3 y 4; fig. 8A, calle 2), mientras que MMP3, por sí misma, pudo digerirlo proporcionando varias bandas discretas. Fig. 7, calles 5 y 6; fig. 8A y 8B, calles 3 y 7).

La banda de LTBP también se escindió por MMP3 (fig. 7, calles 3 y 4 y fig. 8B, calles 3 y 7) dando lugar a un producto de 78 kDa. Dos de los productos digeridos (con pesos moleculares de 36 kDa y 20 kDa) corresponden a los fragmentos polipeptídicos de LAP e IFN\beta esperados, respectivamente.

La especificidad mostrada en estos experimentos in vitro puede no reflejar completamente la actividad antiviral medida en sobrenadantes celulares después del tratamiento con MMP. Los sobrenadantes celulares ya estaban activados en una cierta medida, indicando que otros enzimas proteolíticos presentes en el sobrenadante pueden activar el resto de citoquina latente. No fue evidente un aumento de proteolisis de los polipéptidos de fusión después de la inmunoprecipitación usando una combinación de pro-MMP9 con MMP1 o MMP3, o con la propia pro-MMP9 activada con APMA in vitro (no mostrado).

Activación de IFN\beta latente por MMP

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TABLA 2 Actividad biológica de mIFN\beta (U/ml) procedente de sobrenadantes concentrados tratados con MMP

	pro-MMP9	MMP1	MMP3	pro-MMP9+	pro-MMP9+
				MMP1	MMP3
mIFN\beta-LAP	Exp. 1	1.305	1.740	870	3.481	7.740
LAP-mIFN\beta	Exp.1	163	217	109	435	217
	Exp. 2	109	N.D.	N.D.	435	217
Se trataron sobrenadantes sin suero concentrados con MMP como se muestra.
N.D. = no realizado

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TABLA 3

Actividad biológica de mIFN\beta (U/ml) de sobrenadantes no concentrados de células transfectadas con CHO amplificadas con MTX

Tratamiento

	ninguno	MMP1	MMP3	pro-	pro-	pro-	RA-	sin
				MMP9	MMP9 +	MMP9 +	S.F.	SPI.
					MMP1	MMP3
LAP-mIFN	288	6144	9126	288	1536	768	1152	768
(50 nM MTX)
mIFN\beta-LAP	1536	6144	3072	1536	1536	4608	6144	3072
(12,5 nM MTX)

Los sobrenadantes se suplementaron con o sin (última fila) inhibidores de proteasa de serina (SPI) y MMP como se indica. El RA.SF es el mismo que se usó en la figura 6.

El sobrenadante no concentrado tenía aproximadamente 210 U/ml de actividad antiviral que correspondía a aproximadamente 0,3 ng de proteína (Iwakura et al., J. Biol. Chem. 253, 5074-5079) (1978)). Los sobrenadantes celulares se concentraron 100 veces por centrifugación a través de membranas porosas para permitir la actividad MMP a una mayor concentración de substrato.

Después de la concentración, incluso el sobrenadante de LAP-IFN\beta demostró actividad antiviral sin ningún tratamiento adicional (tabla 3). Este resultado puede explicarse por el hecho de que se ha indicado que las células CHO secretan una diversidad de proteinasas (Goldman et al., Cytotechnology, 23, 103-111 (1997); Satoh et al., Cytotechnology, 13, 79-88 (1993)) incluyendo MMP (Masure et al., Eur. J. Biochem. 244, 21-30 (1997)). Posiblemente, algunos inhibidores naturales de MMP (TIMP) pueden retirarse de las proteinasas por este método de concentración, facilitando su actividad.

Los sobrenadantes de las células CHO no transfectadas no tuvieron actividad biológica incluso después del tratamiento con MMP o líquido sinovial de artritis reumatoide (RA-S.F.) a 1/5 del volumen final (datos no mostrados).

La adición de MMP1 a sobrenadantes concentrados aumentó ligeramente la actividad biológica, y la adición de MMP1 y pro-MMP9 o MMP3 y pro-MMP9 hizo lo mismo (véase la tabla 2). De forma interesante, el tratamiento de IFN\beta-LAP con MMP1 y pro-MMP9 condujo a un aumento de 3-6 veces en la actividad antiviral, indicando que puede conseguirse una activación adicional de esta molécula.

Usando sobrenadantes no concentrados de células amplificadas con MTX, se demostró que tanto MMP1 como MMP3 pueden activar LAP-IFN\beta 21 y 32 veces respectivamente (tabla 3), y que el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide puede activar esta proteína hasta cuatro veces (tabla 3). También puede activarse mIFN\beta-LAP, pero como se ha demostrado previamente (tabla 1), su nivel de actividad basal es elevado. Las figs. 8A y 8B (calles 4 y 8) demuestran que el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide también puede escindir las proteínas de fusión para dar productos discretos de 36 kDa y 20 kDa correspondientes a LAP e IFN\beta respectivamente.

Como se ha mencionado anteriormente, la incubación de los sobrenadantes sin inhibidores de proteasa produce una mayor actividad biológica, indicando que los enzimas secretados a partir de las células CHO pueden escindir la proteína. La sensibilidad de las dos proteínas de fusión a la presencia de MMP9 es diferente, demostrando que mIFN\beta-LAP puede activarse mientras que en el caso de LAP-IFN\beta, MMP9 parece ser inhibidora, induciendo quizás su degradación adicional por otros enzimas presentes en los sobrenadantes de células CHO.

Activación de IFN\beta latente con muestras de sitios inflamados

La fig. 8 y la tabla 3 demostraron que el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide puede activar la citoquina latente.

Para evaluar si la incubación a largo plazo de la citoquina latente con estas muestras puede conducir a su degradación o acumulación en compuesto activo, se incubaron tanto LAP-mIFN\beta como mIFN\beta-LAP durante un periodo de hasta cinco días a 37ºC en presencia o ausencia de líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y después se aplicaron al ensayo biológico de IFN. Los símbolos blancos son muestras incubadas en medio con FBS al 10%, mientras que los símbolos rellenos son muestras incubadas con 1/5 vol/vol de líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (RA.SF).

Se tomaron muestras e intervalos de 24 horas. La fig. 9 demuestra que la incubación durante este periodo prolongado produjo una mayor actividad, es decir, la activación del LAP-mIFN\beta hasta 10 veces durante las primeras 24-48 horas con una reducción estacionaria posterior. La proteína mIFN\beta-LAP no pudo activarse y sólo se observó una reducción en su actividad. Este resultado indica claramente que la conformación de LAP-IFN\beta puede tener usos terapéuticos potenciales.

No se observó activación usando mIFN\beta-LAP. En general, en ambos casos la actividad de la proteína se redujo a lo largo del tiempo, ya que las proteasas encontradas en el medio de las células pueden degradar las proteínas obtenidas por ingeniería genética.

Para determinar si la activación de la citoquina latente podría corroborarse usando muestras de otros estados inflamatorios patológicos, se ensayó líquido cefalorraquídeo de monos con encefalomielitis alérgica experimental. Después de la incubación durante una noche, dos de las tres muestras ensayadas aumentaron la actividad biológica de las proteínas de fusión hasta cuatro veces más que sus muestras de suero paralelas (datos no mostrados), indicando que puede obtenerse una activación con especificidad de sitio.

Ejemplo 3

Para evaluar si la latencia detectada con LAP-mIFN\beta requería la formación de una supuesta estructura de envuelta cerrada limitada por la proteína LAP dimérica con enlaces disulfuro, se construyó una proteína de fusión usando LAP porcina que se mutó en las Cys 223 y 225 a Ser.

Métodos Preparación de la construcción

Se clonó proteína LAP porcina por PCR como se indica en el ejemplo 1. Los cebadores usados fueron los indicados en el ejemplo (clonación de LAP porcina). La LAP porcina clonada se mutó en Cys 223 y 225 a Ser (Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Science, 92, 2572-2576 (1995)).

Transfección transitoria en células COS-7 de mono

Se transfectaron 20 \mug de ADN plasmídico, PorcLAP-mIFN\beta y controles de mIFN\beta-LAP y LAP-mIFN\beta, por el método de coprecipitación con fosfato cálcico en duplicado en 0,5x10^{6} células COS-7 sembradas en placas de 9 cm como se ha descrito anteriormente. El coprecipitado de ADN se dejó sobre las células durante una noche en lugar de 4 horas. Las células COS-7 se cultivaron en DMEM con antibióticos y FBS al 10%. 48 horas después del choque con glicerol, se recogieron los sobrenadantes para los ensayos antivirales de IFN.

Resultados

La construcción mutada PorcLAP-mIFN\beta se comparó con otras construcciones con respecto a su actividad biológica in vitro después de la transfección transitoria en células COS-7. La tabla 4 demuestra que PorcLAP-mIFN\beta era tan activa como mIFN\beta-LAP en este ensayo, demostrando esto.

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TABLA 4

Plásmido	Actividad antiviral (U/ml)
LAP-mIFN\beta	0
PorcLAP-mIFN\beta	256
mIFN\beta-LAP	256

Los resultados mostrados son representativos de uno de dos experimentos.

Conclusión

Los resultados demuestran que se requieren enlaces disulfuro en las posiciones 223 y 225 para la latencia de LAP-mIFN\beta.

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Ejemplo 4 Clonación y expresión de proteínas de fusión IFN\beta humano-LAP, IL-2-LAP e IL-10-LAP

La construcción de IFN\beta humano-MMP-LAP y LAP-MMP-IFN\beta humano facilitará el ensayo de la expresión de estas construcciones en líneas de células CHO y el posterior ensayo de la actividad del producto expresado con algunas líneas celulares humanas in vitro e in vivo.

Las construcciones que comprenden IL-10 e IL-2 humana se expresarán y ensayarán como se ha indicado anteriormente. La purificación de las proteínas de fusión expresadas utilizará una cola de poli-His como anclaje para los esquemas de purificación. Tales esquemas de purificación son bien conocidos en la técnica.

Construcción de proteínas de fusión IFN humano-LAP y LAP-IFN humano Métodos

Como se hizo con el gen de IFN \beta de ratón (véase el ejemplo 1), el gen de IFN humano se clonó en el extremo COOH del sitio MMP (después de LAP) en los sitios Not1/Xba1 produciendo la molécula OM52 (LAP-hu IFN\beta) usando los siguientes cebadores:

Cebador con sentido

5' cgc/g gcc gca ATG AGC TAC AAC TTG CTT GG

Cebador anti-sentido

5' ggt/ctaga TCA GTT TCG GAG GTA ACC

El producto de PCR se obtuvo por PCR del plásmido PSVEIF (Chernajovsky et al. DNA 3, 297-308, (1984)), el producto de PCR se digirió con Not1 y Xba1 y se clonó en el plásmido que expresaba LAP-mIFN beta digerido con los mismos enzimas y a partir del cual se extrajo el gen de ratón.

Se clonó pre IFN\beta humano antes que LAP humana produciendo la molécula OM53 (huIFN\beta-LAP), usando los siguientes cebadores de PCR:

Cebador con sentido

5' cca/agc tt ATG ACC AAC AAG TGT C

Cebador anti-sentido

5' ccg/aat tc GTT TCG GAG GTA ACC TG

Se usó el plásmido PSVEIF como plantilla para la reacción por PCR como se ha indicado anteriormente y el producto de PCR se digirió con HindIII y EcoR1 y se clonó en los mismos sitios de mIFN\beta-LAP de los que se extrajo el ADNc de ratón.

La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de la construcción huIFN\beta-LAP y de las construcciones LAP-huIFN\beta se muestra en las figuras 11 y 12 respectivamente.

Para evaluar la latencia o actividad de estas moléculas, se cotransfectaron permanentemente células CHO con 20 microgramos de ADN plasmídico de OM52 y OM53 linealizado y con 1 microgramo de pSV2DHFR (como se ha indicado anteriormente). La selección se realizó en G418 (Genetician de Life Technologies Ltd), suero bovino fetal (FBS) dializado al 10% y medio Alpha DMEM. Los sobrenadantes de cultivos confluentes de 24 horas se ensayaron en un ensayo antiviral usando fibroblastos humanos (línea MRC5) y virus EMC como se describe en el ejemplo 2. Los resultados se muestran en la tabla 5.

TABLA 5

Plásmido	Actividad antiviral U/ml
OM52 (LAP-huIFN)	256
OM53 (huIFN-LAP)	0

Resultados

Estos datos indican que la latencia de la proteína de fusión no puede predecirse, porque el IFN\beta humano fusionado a LAP-MMP se comporta de manera diferente a la proteína de ratón cuando se fusiona al péptido LAP-MMP. Aunque con la secuencia de ratón la conformación LAP-MMP-IFN\beta era latente, en el caso del ser humano (OM52), esta construcción era activa y viceversa, es decir, la conformación IFN-LAP de ratón era activa mientras que la humana (OM53) era inactiva.

Ejemplo 5 Artritis inducida por colágeno (CIA) e inyección de ADN

Se inmunizaron ratones DBA/1 con colágeno de tipo II (CII) como se describe en Dreja et al. Arthritis and Rheumatism, 43, 1698-1708 (2000) y 3 semanas después se reforzaron con CII en adyuvante incompleto de Freund. Se inyectaron por vía intramuscular 100 microgramos de ADN plasmídico en PBS en tres sitios en los cuadriceps en el día del inicio de la artritis, los ratones se evaluaron un día sí y otro no con respecto a la artritis clínica y el hinchamiento de las patas traseras se midió con calibres como se ha descrito (Dreja, et al. Arthritis and Rheumatism, 43, 1698-1708, (2000)).

En un modelo de artritis (CIA), se midió la eficacia relativa de la citoquina latente (LAP-mIFN\beta) frente a las versiones activas (PorcLAP-mIFN\beta y mIFN\beta-LAP). La proteína LAP-mIFNb latente muestra una mayor eficacia que cualquiera de los restos activos, mIFNb-LAP o PorcLAP-IFNb, en comparación con el control tratado con el vector plasmídico vacío pCDNA3.

Se descubrió que cuando se suministraba por terapia génica por medio de inyección intramuscular, la citoquina latente era más eficaz en el tratamiento de la enfermedad establecida.

Conclusiones

En este documento se ha demostrado que la molécula de citoquina activa podría diseñarse para convertirse en "latente" por medio de la adición del dominio de latencia de TGF\beta en su extremo NH_{2} o COOH. En los modelos experimentales se usó la citoquina IFN\beta.

El dominio LAP de TGF\beta confería "latencia" a IFN\beta, que podía anularse por incubación de la proteína de fusión con MMP. Posiblemente, la latencia se debe al impedimento estérico por LAP sobre la interacción entre el resto de IFN\beta con sus receptores celulares. A pesar del hecho de que tanto el extremo NH_{2} como el extremo COOH de la molécula están muy cerca en la estructura cristalina de IFN\beta, parecía conferirse una mejor "envuelta" fusionando el dominio LAP por su extremo NH_{2} terminal como se encuentra en el propio TGF\beta. Es posible que con otras citoquinas esto pueda ser diferente, dependiendo de su estructura terciaria y la superficie de interacción con sus receptores.

El sitio MMP localizado entre LAP e IFN\beta podría escindirse in vitro por MMP-3 y MMP-1. MMP-3 y MMP-1 tienen regiones homólogas en su sitio activo (Massova et al., J. Mol. Model. 3, 17-30 (1997)). Es bastante plausible que otras MMP también escindan este sitio, como se muestra por la activación que se produce en sobrenadantes sin suero concentrados de células CHO (tabla 2). La expresión de MMP está regulada muy estrictamente (Han et al. Autoimmunity, 28, 197-208 (1998)). Las MMP son activas durante la remodelación de tejidos, curación de heridas e inflamación (Kubota et al., J. Oral & Maxillofacial Surgery, 55, 20-27 (1997); Van Meurs et al., Arthritis & Rheumatism, 42, 2074-2084 (1999); Leppert et al., Brain, 121, 2327-2334 (1998); Uhm et al., Annals of Neurology, 46, 319-324 (1999); Louis et al., Clin. Exp. Immunol. 120, 241-246 (2000); Baugh et al., Gastroenterology, 117, 814-822 (1999)). Las MMP también son necesarias para que las células tumorales invadan el tejido circundante. De hecho, la expresión de inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMP) puede inhibir la invasión tumoral y la metástasis (DeClerck et al., Cancer Res. 52, 701-708 (1992)).

La MMP9 no pudo escindir las proteínas de fusión. Usando substratos peptídicos fluorogénicos con la secuencia PLGLWA-d-R, el valor de la velocidad de hidrólisis (kcat/km) de metaloproteinasas de matriz parece seguir el orden MMP9>MMP2>MMP7>MMP3>MMP1 (Nagase y Fields, Biopolymers, 40, 399-416 (1996)). Esta discrepancia en sensibilidad a la hidrólisis entre el substrato peptídico y las proteínas obtenidas por ingeniería genética usadas en este estudio puede relacionarse con su estructura terciaria.

El diseño de la citoquina "latente" parece tener varias ventajas. En primer lugar, tras la administración de la citoquina, no parece absorberse rápidamente por las células que llevan sus receptores, lo cual puede afectar a su toxicidad y puede proporcionar una vida media mayor. Se ha demostrado que el TGF\beta que contiene LAP tiene una mayor vida media in vivo Wakefield et al., J. Clin. Invest. 86, 1976-1984 (1990)). De esta manera, como consecuencia, la administración sistémica terapéutica podría dosificarse a menores concentraciones.

En segundo lugar, tanto LAP como LTBP pueden facilitar la interacción de la citoquina latente con la matriz extracelular.

En tercer lugar, la citoquina puede no liberarse típicamente para interaccionar con receptores celulares a menos que estén teniendo lugar procesos inflamatorios o de remodelación de tejidos que implican actividad MMP. Tal actividad se encuentra en la osteoartritis, artritis reumatoide (Kubota et al., J. Oral & Maxillofacial Surgery, 55, 20-27 (1997); Van Meurs et al., Arthritis & Rheumatism, 42, 2074-2084 (1999); Singer et al., Osteoarthritis & Cartilage, 5, 407-418 (1997)) y otros tipos de enfermedades crónicas tales como enfermedad inflamatoria del intestino (Loius et al., Clin. Exp. Immunol, 120, 241-246 (2000); Baugh et al., Gastroenterology, 117, 814-822 (1999)), esclerosis múltiple (Leppert et al., Brain, 121, 2327-2334)), aterosclerosis (Libby, Vascular Medicine, 3, 225-229 (1998)) y durante la invasión de un cáncer (DeClerck et al., Cancer Res. 52, 701-708 (1992)).

Podría afirmarse que tras la escisión, la liberación de LAP podría tener efectos antagonistas para TFG\beta, ya que se ha demostrado que, in vitro, LAP puede inhibir la acción del TGF\beta activo (Wakefield et al., Growth Factors, 1, 203-218 (1989)). Sin embargo, es de esperar que nuestra proteína de fusión de LAP pueda ejercer su acción en sitios de inflamación en los que abundan los radicales libres. Se ha demostrado que la nitrosilación de LAP impide su capacidad de unión a TGF\beta (Vodovotz et al., Cancer Res. 59, 2142-2149 (1999)). De esta manera, es poco probable que en sitios de inflamación la proteína LAP liberada antagonice la función de TGF\beta.

Otras modificaciones del sitio de escisión de MMP pueden proporcionar una especificidad tisular adicional.

Claims

1. Una proteína de fusión que comprende un péptido asociado con la latencia (LAP) de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasas de matriz (MMP), para uso para proporcionar latencia a una proteína farmacéuticamente activa.

2. Una proteína de fusión que comprende un péptido asociado con la latencia (LAP) de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasas de matriz (MMP), para uso para proporcionar activación con especificidad de sitio de una proteína farmacéuticamente activa latente.

3. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el sitio de escisión de MMP se escinde por una metaloproteinasa de matriz seleccionada entre MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 o MMP10.

4. Una proteína de fusión para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la proteína farmacéuticamente activa es un factor de crecimiento, factor de diferenciación, citoquina, quimioquina, factor trófico, inhibidor de citoquina, receptor de citoquina, enzima de eliminación de radicales libres, enzima convertidor de profármacos, mimético de péptidos, inhibidor de proteasa, inhibidor tisular de metaloproteinasa o inhibidor de proteasas de serina.

5. Una proteína de fusión para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la citoquina es una interleuquina o un interferón.

6. Una proteína de fusión para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la proteína de fusión está en asociación con la proteína de unión a TGF\beta latente.

7. Una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína farmacéuticamente activa, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5, donde se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP) entre la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico.

8. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, donde el sitio de escisión de MMP se escinde por una metaloproteinasa de matriz seleccionada entre MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 o MMP10.

9. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, donde la proteína farmacéuticamente activa es un factor de crecimiento, factor de diferenciación, citoquina, quimioquina, factor trófico, inhibidor de citoquina, receptor de citoquina, enzima de eliminación de radicales libres, enzima convertidor de profármacos, mimético de péptidos, inhibidor de proteasa, inhibidor tisular de metaloproteinasa o inhibidor de proteasas de serina.

10. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, donde la citoquina es una interleuquina o un interferón.

11. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, donde la primera secuencia de ácido nucleico codifica la proteína IFN\beta.

12. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, que está en forma de un vector.

13. Una célula que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

14. Una citoquina que es el producto de expresión de una construcción de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 12.

15. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 para uso en medicina.

16. El uso de una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7a 12 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis, esclerodermia, enfermedad renal, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria o cáncer.

17. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

18. Una proteína de fusión que comprende una proteína LAP de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP), donde la proteína de fusión está asociada con una proteína farmacéuticamente activa.

19. Un proceso para preparar una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende la producción de la proteína de fusión de manera recombinante por expresión en una célula hospedadora, la purificación de la proteína de fusión expresada y la asociación de la proteína farmacéuticamente activa con la proteína de fusión purificada por medio de entrecruzamiento químico.

20. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 18 para uso en medicina.

21. El uso de una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis, esclerodermia, enfermedad renal, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria o cáncer.

22. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 18.

23. Un método in vitro para proporcionar latencia a una proteína farmacéuticamente activa que comprende asociar una proteína de fusión que comprende un péptido asociado con la latencia (LAP) de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP) con dicha proteína farmacéuticamente activa.

24. Un kit de partes que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 18, y un vehículo de administración.

25. El uso de una proteína de fusión que comprende un péptido asociado con la latencia (LAP) de TGF\beta-1, 2, 3, 4 ó 5 y un sitio de escisión proteolítica de metaloproteinasa de matriz (MMP), donde la proteína de fusión está asociada con una proteína farmacéuticamente activa, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis, esclerodermia, enfermedad renal, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria o cáncer.