ES2552095T3

ES2552095T3 - Un receptor de superficie de linfocitos que se une a CAML, ácidos nucleicos que lo codifican y métodos de uso del mismo

Info

Publication number: ES2552095T3
Application number: ES05020384.3T
Authority: ES
Inventors: Richard J. Bram; Gotz Von Bulow
Original assignee: St Jude Childrens Research Hospital
Current assignee: St Jude Childrens Research Hospital
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2018-03-03
Also published as: ATE373012T1; US6316222B1; EP1632500A2; EP2292654A3; US20030082173A1; ES2292201T3; WO1998039361A1; US6500428B1; US7355005B2; DE69838417D1; JP2001518080A; US20050183148A1; EP2292654A2; AU6685498A; EP0964874A1; DK0964874T3; AU732119B2; EP1632500B1; JP3594975B2; CA2284078A1

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende un fragmento soluble del dominio extracelular de la proteína TACI como se representa en SEQ ID NO: 6; en el que dicho fragmento soluble comprende restos de aminoácidos 33-66 y 70-104 de SEQ ID NO: 2; y en el que dicho polipéptido aislado antagoniza la actividad de TACI.

Description

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condiciones en las cuales, si es transcrita, es detectable. Un fármaco candidato es identificado como un fármaco inmunodepresivo cuando la segunda proteína marcadora es detectada, ya que el fármaco inmunodepresivo interfiere con la ruta (o su aspecto) que implica a la proteína TACI, pero no la ruta (o su aspecto) que implica al receptor de células T.

En una realización, los primeros y segundos linfocitos son células T Jurkat que han sido modificadas para expresar una proteína TACI. En una tal realización particular, el método comprende poner en contacto una primera célula T Jurkat con un fármaco potencial, en el que la primera célula T Jurkat ha sido manipulada genéticamente para expresar una proteína TACI y un primer gen indicador. El primer gen indicador es controlado por un promotor de NF-AT, y codifica una primera proteína marcadora. La proteína TACI es activada, y la cantidad de expresión de la primera proteína marcadora es cuantificada. Un fármaco potencial es seleccionado como un fármaco candidato cuando la cantidad de la primera proteína marcadora expresada en presencia del fármaco candidato es disminuida en relación con la cantidad expresada en ausencia del fármaco candidato. Entonces, se pone en contacto el fármaco candidato con un segunda célula T Jurkat que contiene un receptor de células T y un segundo gen indicador. El segundo gen indicador es controlado por un promotor de NF-AT, y codifica una segunda proteína marcadora. El receptor de células T es activado y la cantidad de expresión de la segunda proteína marcadora es cuantificada y luego comparada con la cantidad de la segunda proteína marcadora expresada en ausencia del fármaco candidato. Un fármaco candidato es identificado como un fármaco inmunodepresivo si no hay ninguna disminución en la cantidad de expresión de la segunda proteína marcadora en presencia del fármaco candidato, o la disminución en la expresión de la segunda proteína marcadora es sustancialmentemenor que la disminución correspondiente a la expresión de la primera proteína marcadora en presencia del fármaco candidato.

Cualquiera de las proteínas marcadoras descritas en este documento pueden ser usadas para este aspecto de la descripción incluyendo SEAP, LacZ o luciferasa. La primera y segunda proteína marcadora pueden ser la misma proteína o dos proteínas diferentes. La proteína TACI puede ser activada con un anticuerpo generado contra una proteína TACI, o sus fragmentos activos, o su proteína de fusión. En una realización preferida, la proteína TACI es TACI-1. Varios promotores pueden usarse para controlar el gen indicador incluyendo al promotor de NF-AT mencionado anteriormente y el promotor de AP-1. Pueden ser obtenidos fármacos potenciales a partir de cualquiera de las genotecas de fármaco actualmente disponibles, y a partir de sustancias químicas y genotecas de fagos descritas en este documento.

Los aspectos de la presente invención (que se definen en las reivindicaciones) serán mejor apreciados con relación a los dibujos siguientes y a la descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La distribución en tejidos, la secuencia de la proteína y otras propiedades carcaterísticas de TACI-1. La Figura 1 representa una transferencia Northern de los tejidos indicados sondados con el cADN de TACI-1. Otros tejidos sondados incluyen el corazón, el cerebro, la placenta, el pulmón, el hígado, el músculo esquelético, el riñón y el páncreas, ninguno de los cuales mostró ninguna expresión del mARN de TACI-1.

La Figura 2a representa la secuencia de aminoácidos de TACI-1. Se muestra el dominio transmembrana propuesto en el cuadrado y los motivos Prosite TNFR_NGFR están subrayados. La Figura 2b representa una gráfica de la hidrofobia de Kyte-Doolittle y el diagrama esquemático de TACI-1 mostrando las posiciones del supuesto dominio transmembrana (en negro) y losmotivos TNFR_NGFR (en puntos). La Figura 2c representa los restos de cisteína de la proteína TACI y otrosmiembros de lafamilia TNFR.

Figura 3. TACI-1 es una proteína de la superficie celular. La Figura 3a representa la citometría de flujo de células T Jurkat Tag transitoriamente transfectadas con un plásmido de expresión de TACI-1 y un marcador de transfección, pHook (Invitrogen), o el marcador de transfección pHook solo. La expresión de la superficie celular de TACI-1 y la proteína marcadora de la transfección, Ha-Hook, fueron detectadas por inmunofluorescencia indirecta usando el anticuerpo policlonal anti-TACI-1 purificado por inmunoafinidad y el anticuerpo monoclonal 12CA5. Los datos representados representan la tinción de TACI-1 de células activadas para el marcador de transfección. La Figura 3b representa una fotomicrografía que muestra la tinción de la superficie de células Cos-7 que expresan transitoriamente TACI-1 marcado con FLAG del extremo N-terminal, teñido con anticuerpos M2 (anti-FLAG) y anticuerpos de IgG antiratón fluorescentes [Bram y Crabtree, Nature, 371:355-358 (1994)]. La tinción de la superficie estaba presente tanto si las células estaban o no permeabilizadas con detergente.

Figura 4. TACI-1 es una proteína de señalización que funciona en la activación de la transcripción específica de NF-AT. La Figura 4a representa la activación de un indicador de fosfatasa alcalina secretado dirigido por NF-AT. Las células T Jurkat TAg, co-transfectadas con el indicador de SXNFAT [Bram et al., Mol. Cell. Biol, 13:4760-4769 (1993)] y el plásmido de expresión pBJ5 [Takebe, Y., et al., Mol. Cell. Biol., 8:466-472 (1988)] que contiene o bien el cADN que codifica TACI-1 (triángulos negros) o nada (círculos), fueron tratadas con 50 ng/ml de PMA y las cantidades indicadas de ionomicina en presencia (símbolos cerrados) y ausencia (símbolos abiertos) de perlas magnéticas revestidas de anticuerpos policlonales anti-TACI-1 purificados por inmunoafinidad. La Figura 4b representa la activación de NF-AT por TACI-1 reticulado con anticuerpo que es bloqueada con ciclosporina A (CsA) o FK506. La activación de NF-AT fue determinada en células T Jurkat TAg co-transfectadas con SXNFAT y pBJ5 (-TACI-1, izquierda) o

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dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteolisis y otras consideraciones.

Para el componente presente o los componentes, estos pueden ser dilucidados usando los ensayos proporcionados en este documento.

Proteínas TACI marcadas. La proteína TACI de la presente invención, y sus fragmentos, pueden marcarse. Los marcadores adecuados incluyen enzimas, fluoróforos (por ejemplo, el isotiocianato de fluorescencia (FITC), ficoeritrina (PE), rojo de Texas (TR), rodamina, sales de la serie de lantánido libres o queladas, especialmente Eu3+, por nombrar algunos fluoróforos), cromóforos, radioisótopos, agentes quelantes, tintes, oro coloidal, partículas de látex, ligandos (por ejemplo, la biotina), y agentes quimioluminiscentes. Cuando se emplea un marcador de control, pueden ser usados marcadores iguales o diferentes para la muestra de ensayo y el marcador de control.

En el caso en el que se use un marcador radiactivo, tales como los isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co,59Fe, 90Y, 125I, 131I y 186Re, pueden ser utilizados conocidos procedimientos de recuento actualmente disponibles. En el caso en el que el marcador sea una enzima, la detección puede ser realizada por cualquiera de las técnicas calorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperometricas o gasométricas en este momento utilizadas conocidas en la técnica.

Los marcadores directos son un ejemplo de marcadores que pueden ser usados de acuerdo con la presente descripción. Un marcador directo se define como una entidad, que en su estado natural, es fácilmente visible, a primera vista, o con la ayuda de una estimulación óptica con filtro y/o aplicada, por ejemplo, luz U.V. para generar fluorescencia. Entre los ejemplos de marcadores coloreados, que pueden ser usados de acuerdo con la presente invención, se incluyen partículas sol metálicas, por ejemplo, partículas sol de oro como las descritas por Leuvering (Patente de EE.UU. Nº 4.313.734); partículas de tintes exclusivos como los descritos por Gribnau et al. (Patente de EE.UU. Nº 4.373.932) y May et al. (documento WO 88/08534); látex teñido como el descrito por May, supra, Snyder (documentos EP-A 0 280 559 y 0 281 327); o tintes encapsulados en liposomas como los descritos por Campbell et al. (Patente de EE.UU. Nº 4.703.017). Otros marcadores directos incluyen un radio-nucleótido, un resto fluorescente o un resto luminiscente. Además de estos dispositivos marcadores directos, también pueden ser usados marcadores indirectos que comprenden enzimas de acuerdo con la presente invención. Varios tipos de inmunoensayos unidos a enzimas son conocidos en la técnica, por ejemplo, la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante, lisozima, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, ureasa, éstos y otros han sido documentados detalladamente por Eva Engvall en “Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT” en Methods in Enzymology, 70:419-439 (1980) y en la Patente de EE.UU. Nº 4.857.453.

Las enzimas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante.

Otros marcadores para uso en la invención incluyen perlas magnéticas o marcadores de imagimática de resonancia magnética.

En otra realización, puede ser creado un sitio de fosforilación en un anticuerpo de la invención para marcar con 32P, por ejemplo, como se describe en la Patente Europea Nº 0372707 (Nº de solicitud 89311108.8) de Pestka, o la Patente de EE.UU. Nº 5.459.240, expedida el 17 de Octubre de 1995 a Foxwell et al.

Como se ejemplifica en este documento, se pueden marcar proteínas, incluyendo anticuerpos, mediante marcaje metabólico. El marcaje metabólico ocurre durante la incubación in vitro de las células que expresan la proteína en presencia de un medio de cultivo suplementado con un marcador metabólico, tal como [35S]-metionina o [32P]ortofosfato. Además del marcaje metabólico (o biosintético) con [35S]-metionina, la invención además contempla el marcaje con [14C]-aminoácidos y[3H]-aminoácidos (con tritiosustituido en posiciones no lábiles).

Proteínas TACI quiméricas

Una proteína TACI quimérica de la invención es como se define en las reivindicaciones. Una proteína TACI quimérica puede ser una proteína que sea generada uniendo un dominio funcional de una proteína TACI, tal como el dominio de unión de ligando o el dominio de unión de CAML, con el dominio complementario de otra proteína, por ejemplo, un receptor alternativo. Las construcciones quiméricas también pueden prepararse con un fragmento funcionalmente activo de una proteína TACI y otra molécula funcionalmente activa. Por ejemplo, el dominio extracelular de una proteína TACI puede ser unido al dominio Fc de una inmunoglobulina. De forma alternativa, el dominio citoplásmico de una proteína TACI podría ser unido a un ligando de receptor, tal como la transferrina o una hormona, para el reconocimiento intracelular. En aún otra realización, un dominio TACI podría ser unido a otra molécula de reconocimiento, tal como una cadena pesada de anti-inmunoglobulina o molécula de cadena ligera (por ejemplo, una parte del Fv de un anticuerpo) a células B de reconocimiento específicamente. En todavía otra realización, el fragmento funcionalmente activo de una proteína TACI, preferiblemente el dominio extracelular del extremo N-terminal, puede ser unido con un glicosilfosfolípido, tal como glicosilfosfoinositol, secuencia de señal ancla, preferiblemente localizada en el extremo C-terminal del fragmento de TACI, de modo que sea generada una proteína anclada glucolipídica [Cross, Annu. Rev. Cell Biol., 6:1-39 (1990); Low, Biochem. J., 244:1-13 (1987)].

Un receptor de TACI quimérico puede prepararse uniendo el dominio extracelular de otra molécula receptor con un dominio transmembrana y el dominio intracelular de una proteína TACI. En otra realización, el dominio extracelular

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moléculas de ADN bicatenarias particulares, pueden ser descritas secuencias en este documento de acuerdo con la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga al mARN). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha sufrido unamanipulación biológicamolecular.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un cADN, ADN genómico

o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede templar a la otra molécula de ácido nucleico en condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica en solución (véase Sambrook et al., supra). Las condiciones de temperaturas y fuerza iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Para el rastreo preliminar de ácidos nucleicos homólogos, pueden ser usadas condiciones de hibridación de severidad baja, correspondientes a una Tm de 55°C, por ejemplo, 5 x SSC, 0,1% de SDS, 0,25% de leche, y ninguna formamida; o 30% de formamida, 5 x SSC, 0,5% SDS. Las condiciones de hibridación de severidad moderada corresponden a una Tm más alta, por ejemplo, formamida del 40%, con 5 x o 6 x SCC. Las condiciones de hibridación de severidad alta corresponden a una Tm más alta, por ejemplo, formamida del 50%, 5 x o 6 x SCC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan las secuencias complementarias aunque, dependiendo de la severidad de la hibridación, sean posibles desajustes entre bases. La severidad apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementariedad, variables conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de semejanza u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de la Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen aquellas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a la Tm más alta) de hibridaciones de ácidos nucleicas disminuye en el orden siguiente: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos demás de 100 nucleótidos de longitud, han sido derivadas ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al., supra, 9.50-0.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleotidos, la posición de desajustes se vuelve más importante y la longitud del oligonucleotido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de al menos 10 nucleótidos; preferiblemente al menos 18 nucleótidos; más preferiblemente la longitud es de al menos 24 nucleótidos y lo más preferiblemente al menos de 30 nucleótidos de longitud. En una realización específica, un ácido nucleico hibridable tiene una secuencia correspondiente a al menos 12 nucleótidos, preferiblemente al menos 18 nucleótidos, más preferiblemente al menos 24 nucleótidos, y lo más preferiblemente al menos 30 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO: 1, omás específicamente la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1.

En una realización específica, la expresión "condiciones de hibridación estándar" se refiere a una Tm de 55°C, y se utilizan las condiciones que se exponen anteriormente. En una realización preferida, la Tm es 60°C; en una realizaciónmás preferida, la Tm es 65°C.

Como se usa en este documento, el término "oligonucleotido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de al menos 18 nucleótidos, que es hibridable a una molécula de ADN genómica, una molécula cADN, o una molécula de mARN que codifica una proteína TACI. Se pueden marcar los oligonucleotidos, por ejemplo, con 32P-nucleótidos o nucleótidos a los que un marcador, tal como la biotina, ha sido covalentemente conjugado (véase la discusión, supra, en lo que concierne al marcaje de polipéptidos TACI). En una realización, puede ser usado un oligonucleotido marcado como una sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico que codifica una proteína TACI. En otra realización, pueden ser usados oligonucleotidos (uno o ambos de los cuales pueden ser marcados) como cebadores de la PCR, para clonar la longitud completa o un fragmento de una proteína TACI, o detectar la presencia de ácidos nucleicos que codifican una proteína TACI. En una realización más, un oligonucleotido puede formar una triple hélice con una molécula de ADN de TACI. Generalmente, los oligonucleotidos se preparan sintéticamente, preferiblemente con un sintetizador de ácidos nucleicos. En consecuencia, pueden prepararse oligonucleotidos con enlaces de análogos de fosfoester artificiales, tales como enlaces tioester, etc.

La "recombinación homóloga" se refiere a la inserción de una secuencia de ADN ajena de un vector en un cromosoma. Preferiblemente, el vector reconoce un sitio cromosómico específico para la recombinación homóloga. Para la recombinación homóloga específica, el vector contendrá regiones suficientemente largas de homología respecto a las secuencias del cromosoma para permitir la unión complementaria y la incorporación del vector en el cromosoma. Las regiones de homología más largas, y los mayores grados de semejanza de la secuencia, pueden aumentar la eficacia de la recombinación homóloga.

Una "secuencia que codifica" el ADN es una secuencia de ADN bicatenaria que es transcrita y traducida en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación son determinados por un codon de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codon de terminación de translacion en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada con, secuencias procariotas, cADN de mARN eucariota, secuencias de ADN genómicas de ADN eucariota (por ejemplo, mamífero), y hasta secuencias de ADN sintéticas. Si la secuencia de codificación es requerida para la expresión en una célula eucariota, una secuencia señal de poliadenilación y de terminación de la transcripción por lo general será localizada en 3' respecto a la secuencia de codificación. En una realización específica, una secuencia que codifica para TACI de la invención tiene la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 1.

Las secuencias control transcripcional y translacional son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores, y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una

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Los derivados de la proteína TACI pueden preparse cambiando la secuencias de ácidos nucleicos codificantes por sustituciones, adiciones o deleciones que porporcionen moléculas funcionalmente equivalentes. Preferiblemente, los derivados son hechos para que tengan una actividad funcional realzada o aumentada en relación con la proteína TACI natural. De forma alternativa, tales derivados pueden codificar fragmentos solubles del dominio extracelular de la proteína TACI que tienen la misma o mayor afinidad para el ligando natural de la proteína TACI de la descripción. Tales derivados solubles pueden ser potentes inhibidores dela unión del ligando a la proteína TACI.

Debido a la degeneración de las secuencias que codifican nucleótidos, pueden ser usadas otras secuencias de ADN que codifiquen sustancialmente lamisma secuencia de aminoácidos que el gen de la proteína TACI en la práctica dela presente descripción. Éstas incluyen, pero no están limitadas a, alelos, genes homólogos de otra especie, y secuencia de nucleótidos que comprendan todo o partes de genes de la proteína TACI que son cambiados por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo resto de aminoácido dentro de la secuencia, produciéndose así un cambio silente. De la misma manera, los derivados de la proteína TACI de la descripción incluyen, pero no están limitados a, aquellos que contienen, como una secuencia de aminoácidos primaria, todo o parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína TACI incluyendo las secuencias cambiadas en las cuales restos de aminoácidos funcionalmente equivalentes son sustituidos por restos dentro de la secuencia causando una sustitución de aminoácidos conservadora. Y así, tal sustitución es definida como una sustitución conservadora.

Por ejemplo, uno o varios restos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden ser sustituidos por otro aminoácido de una polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, causando una alteración silente. Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia pueden ser seleccionados a partir de otros miembros de la clase a la cual el aminoácido pertenece. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras aromáticas de anillo son fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No se espera que tales alteraciones afecten al peso molecular aparente como se determina por la electroforesis en gel de poliacrilamida o por su puntoisoeléctrico.

Las sustituciones particularmente preferidas son:

-Lys por Arg y viceversa tal que pueda ser mantenida una carga positiva;

-Glu por Asp y viceversa tal que pueda ser mantenida una carga negativa;

-Ser por Thr tal que pueda ser mantenido un OH-libre; y

-Gln por Asn tal que pueda ser mantenido un NH2 libre.

Las sustituciones de aminoácidos también pueden ser introducidas para sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, puede ser introducida una Cys en un sitio potencial para puentes disulfuro con otra Cys. Una His puede ser introducida como un sitio particularmente "catalítico" (es decir, His puede actuar como un ácido o una base y es el aminoácido más común en la catálisis bioquímica). Pro puede ser introducido debido a su estructura particularmente plana, queinduce a β-giros en la estructura de la proteína.

Los genes que codifican los derivados de la proteína TACI y los análogos de la descripción pueden ser producidos por varios métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que causan su producción pueden ocurrir a nivel de la proteína o del gen. Por ejemplo, la secuencia del gen de la proteína TACI clonada puede ser modificada según cualquiera de las numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989, supra). La secuencia puede ser dividida en sitios apropiados con endonucleasa(s) de restricción, seguido por una modificación enzimática posterior de ser deseada, aislada, y ligada in vitro. En la producción del gen que codifica a un derivado o análogo de la proteína TACI, debe ser puesto cuidado para asegurarse de que el gen modificado permanece dentro del mismo marco de lectura translacional que el gen de la proteína TACI, ininterrumpido por las señales de terminación translacionales, en la región génica donde la actividad deseada es codificada.

Además, la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína TACI puede ser mutada in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de translacion, iniciación y/o terminación, o crear variaciones en las regiones de codificación y/o formar nuevos sitios de la endonucleasa de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar además la modificación in vitro. Preferiblemente, tales mutaciones realzan la actividad funcional del producto génico de la proteína TACI mutado. Cualquier técnica para la mutagénesis conocida en la técnica puede ser usada, incluyendo, pero no limitado a, mutagénesis dirigida in vitro [Hutchinson, C., et al., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)]; [Zoller y Smith, DNA, 3:479-488 (1984)]; [Oliphant et al., Gene, 44:177 (1986)]; [Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:710 (1986)], el uso de enlazadores TAB® (Pharmacia), etc. y las técnicas de PCR son preferidas para la mutagénesis dirigida (véase Higuchi, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capítulo 6, págs. 61-70 (1989)).

El gen identificado y aislado puede ser insertado entonces en un vector de clonación apropiado. Un gran número de sistemas huésped-vectorial conocidos en la técnica puede ser usado. Los posibles vectores incluyen, pero no están

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rasa, timidina quinasa del herpes simple y toxina de difteria.

La actividad funcional de la proteína transmembrana activadora e interactuante con CAML puede ser evaluada transgénicamente. En relación a esto, puede ser usado un modelo de ratón genosuprimido. El gen de la proteína transmembrana activadora e interactuante con CAML puede ser usado en estudios de complementación empleando un ratón genosuprimido. Los vectores transgénicos, incluyendo vectores virales, o clones de cósmido (o clones de fago) correspondientes al locus tipo silvestre de un gen candidato pueden ser construidos usando el gen de la proteína TACI aislado. Pueden ser introducidos cósmidos en ratones transgénicos usando procedimientos publicados [Jaenisch, Science, 240:1468-1474 (1988)]. En un sentido genético, el transgen actúa como una mutación supresora.

De forma alternativa, un modelo de animal transgénico puede prepararse en el cual sea interrumpida la expresión del gen de la proteína TACI. La expresión génica es interrumpida, de acuerdo con la invención, cuando ninguna proteína funcional es expresada. Un método estándar para evaluar el efecto fenotípico de un producto génico es emplear la tecnología transgénica para suprimir el gen. De forma alternativa, pueden ser usadas técnicas recombinantes para introducir mutaciones, tales como mutaciones sin sentido y ámbar, o mutaciones que conduzcan a la expresión de una proteína inactiva. En otra realización, los genes de la proteína TACI pueden ser analizados examinando sus efectos fenotípicos cuando se expresan en la orientación antisentido en animales tipo silvestre. En este enfoque, la expresión del alelo tipo silvestre es suprimida, lo que conduce a un fenotipo mutante. La formación de la doble hélice de ARN · ARN (antisentido-sentido) previene la manipulación normal del mARN, causando la eliminación parcial o completa del efecto del gen tipo silvestre. Esta técnica ha sido usada para inhibir la síntesis de TK en un cultivo de tejido y para producir los fenotipos de la mutación Kruppel en drosófila, y la mutación Shiverer en ratones [Izant et al., Cell, 36:1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki et al., Science, 241:593-595 (1988)]. Una ventaja importante de este enfoque es que sólo se necesita que se exprese una pequeña parte del gen para la inhibición eficaz de la expresión del mARN cognado entero. El transgen antisentido será colocado bajo el control de su propio promotor u otro promotor expresado en el tipo de célula correcta, y colocado corriente arriba del sitio polyA de SV40. Este transgen será usado para generar ratones transgénicos o usando la tecnologíatransgénica génica.

Así, la presente descripción se extiende a la preparación de nucleótidos antisentido y ribozimas que pueden ser usados para interferir con la expresión de la proteína TACI a nivel translacional. Este enfoque utiliza el ácido nucleico antisentido y ribozimas para bloquear la translacion del mARN específico, enmascarando este mARN con un ácido nucleico antisentido o dividiéndolo con una ribozima. Pueden ser introduidos genes que codifican ácidos nucleicos antisentido específicos del mARN de TACI o ribozimas, por ejemplo, usando técnicas como las descritas anteriormente para la "Terapia Génica". De forma alternativa, pueden prepararse oligonucleotidos antisentido sintéticos o ribozimas.

Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias a al menos una parte de una molécula demARN específica [véase Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172:298 (1988)]. En la célula, se hibridan a este mARN, formando una molécula bicatenaria. La célula no traduce un mARN en esta forma bicatenaria. Por lo tanto, los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la expresión de mARN en la proteína. Oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos y moléculas que se hibriden al codon de iniciación AUG serán particularmente eficientes, ya que éstas son fáciles de sintetizar y probablemente plantean menos problemas que las moléculas más grandes cuando se introducen en células de órganos. Los métodos de antisentido han sido usados para inhibir la expresión demuchos genes in vitro [Marcus-Sekura, 1988, supra; Hambor et al., J. Exp. Med., 168:1237 (1988)]. Los nucleótidos antisentido sintéticos preferiblemente contienen análogos de fosfoester, tales como fosforotiolatos, o tioesteres, más bien que enlaces fofoester naturales. Tales análogos con enlace fosfoester son más resistentes a la degradación, aumentandola estabilidad y, por lo tanto, la eficacia de los ácidos nucleicos antisentido.

Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la capacidad de dividir específicamente otras moléculas de ARN monocatenarias de una manera algo análoga a las endonucleasas de restricción del ADN. Los investigadores han identificado dos tipos de ribozimas, tipo Tetrahymena y tipo "cabeza de martillo". Las ribozimas tipo cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas tipo Tetrahymena para inactivar a una especie de mARN específica, y las secuencias de reconocimiento de dieciocho bases son preferibles alas secuencias de reconocimiento más cortas.

Las secuencias de ADN que codifican la proteína TACI descrita y proporcionada en este documento pueden así ser usadas para preparar moléculas antisentido contra los mARN y ribozimas que los dividen para la proteína TACI, inhibiéndose así la expresión del gen que codifica la proteína TACI, lo que puede reducir el nivel de estimulación inmune por las células dendríticas, o el nivel de detección clonal mediado por las células epiteliales del timo.

El reconocimiento génico en células madres embrionarias es una técnica relativamente nueva que permite la manipulación exacta de los genes in vivo. Esta técnica permite la creación de ratones con mutaciones definidas en la estructura de cualquier gen dado. Esta capacidad de generar mutaciones predeterminadas da a los investigadores la capacidad de aplicar el poder de la genética al complejo sistema inmunológico humano, tal como ha sido aplicado satisfactoriamente en sistemas neuronales para organismos tales como la drosófila y C. elegans.

Una clave para encontrar tratamientos para muchos trastornos ha sido el desarrollo de modelos apropiados de ani

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