ES2552461T3

ES2552461T3 - Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas

Info

Publication number: ES2552461T3
Application number: ES10713984.2T
Authority: ES
Inventors: Ju Kon Kim; Yang Do Choi; Jin Seo Jeong; Christophe Reuzeau
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH; Crop Functional Genomics Center
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH; Crop Functional Genomics Center
Priority date: 2009-04-29
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2015-11-30
Anticipated expiration: 2030-04-19
Also published as: KR20120034588A; CA2760429A1; EP2957637A3; AU2010243730B2; EP2957637A2; DE112010002842T5; US20120102599A1; EP2424994B1; MX2011011453A; AU2010243730A1; EP2424994A1; AR076483A1; KR20150046788A; KR101647732B1; WO2010124953A1; CN102459614A

Abstract

Un procedimiento para aumentar en las plantas el rendimiento de semilla con respecto a plantas de control, que comprende introducir y sobreexpresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a AIA2, en el que dicho polipéptido similar a AIA2 se representa por la SEC ID Nº: 2 o es un polipéptido que tiene una identidad de secuencia total de al menos 80 % con la secuencia representada por la SEC ID Nº: 2.

Description

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Construcción

Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. Los expertos en la técnica serán conscientes de que pueden ser adecuadas sustancias terminadoras y potenciadoras para su uso en la realización de la invención. También puede añadirse una secuencia intrónica en la región no traducida (UTR) 5’ o en la secuencia codificante para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadoras, intrónicas, regiones UTR3’ y/o UTR5’) pueden ser elementos estabilizadores de proteína y/o ARN. Un experto en la materia conocería dichas secuencias o podría obtenerlas fácilmente.

Las construcciones génicas de la invención pueden incluir adicionalmente un origen de secuencia de replicación que es necesario para la conservación y/o replicación en un tipo de célula específico. Un ejemplo es cuando en una célula bacteriana se requiere conservar una construcción genética como un elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de plásmido o de cósmido). Como orígenes de replicación preferidos se incluyen, pero sin limitación f1-ori y colE1.

Para la detección de la transferencia satisfactoria de las secuencias de ácidos nucleicos como se usa en los procedimientos de la invención y/o selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso usar genes marcadores (o genes indicadores). Por lo tanto, la construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador de selección. Los marcadores de selección se describen con más detalle en la sección “definiciones” del presente documento. Los genes marcadores pueden retirarse o escindirse de la célula transgénica una vez que ya no se necesitan. Las técnicas para retirar genes marcadores son conocidas en la materia, en la sección de definiciones anterior se describen técnicas útiles.

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor

Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se usan todas indistintamente en el presente documento y se toman en un contexto amplio para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos reguladora capaz de efectuar la expresión de las secuencias a las que se unen. El término “promotor” se refiere típicamente a una secuencia de control de ácido nucleico localizada cadena arriba del inicio transcripcional de un gen y que está implicado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo así la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. En los términos anteriormente mencionados se incluyen las secuencias reguladoras transcripcionales procedentes de un gen genómico eucariota clásico (incluyendo la caja TATA que es necesaria para el inicio de la transcripción adecuado, con o sin secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras cadena arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o de una manera específica de tejido. También se incluye en el término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladores transcripcionales de caja -10. La expresión “elemento regulador” también incluye una molécula de fusión sintética o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Un “promotor de planta” comprende elementos reguladores, que median la expresión de un segmento de secuencia codificante en células de plantas. Por consiguiente, un promotor de planta no tiene que ser de origen vegetal, sino que puede originarse de virus o microorganismos, por ejemplo de virus que atacan a las células de planta. El “promotor de planta” también puede originarse de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácidos nucleicos a expresar en el proceso de la invención y descrito en el presente documento. Esto también se aplica a las otras señales reguladoras de “planta”, tales como terminadores de “planta”. Los promotores cadena arriba de la secuencias de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótido sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, la fase de lectura abierta (ORF, Open Reading Frame) o la región reguladora 3’ tal como terminadores u otras regiones reguladoras 3’ que se localizan fuera de la ORF. Además es posible que la actividad de los promotores aumente por la modificación de su secuencia o que se reemplacen completamente mediante más promotores activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a, o comprender, un promotor adecuado que exprese el gen de manera adecuada, en tiempo y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen indicador y evaluando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o la beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden después compararse con la de un promotor de referencia (tal como el que se usa en los procedimientos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando niveles de ARNm o comparando niveles de ARNm del ácido nucleico usado en los procedimientos de la presente invención, con niveles de ARNm de genes constitutivos tal como ARNr 18S, usando

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procedimientos conocidos en la técnica, tales como transferencia de Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid y col., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente por “promotor débil” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se entiende niveles de aproximadamente 1/10.000 transcriptos a aproximadamente 5 1/100.000 transcriptos, a aproximadamente 1/5000000 transcriptos por célula. Por el contrario, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia codificante a alto nivel, o a aproximadamente 1/10 transcriptos a aproximadamente 1/100 transcriptos a aproximadamente 1/1000 transcriptos por célula. Generalmente, por “promotor de fuerza media” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que el de un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, inferior al obtenido

10 cuando está bajo el control de un promotor CaMV 35S.

Unido operativamente

La expresión “unido operativamente” como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora puede iniciar la transcripción del gen de interés.

15 Promotor constitutivo

Un “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, aunque no necesariamente en todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayor parte de las condiciones ambientales, en al menos una célula, tejido u órgano. La siguiente Tabla 2a proporciona ejemplos de promotores constitutivos.

20 Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del gen: Referencia

Actina: McElroy y col, Plant Cell, 2: 163-171, 1990

HMGP: WO 2004/070039

CAMV 35S: Odell y col, Nature, 313: 810-812, 1985

CaMV 19S: Nilsson y col., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997

GOS2: de Pater y col, Plant J Nov; 2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596

Ubiquitina: Christensen y col, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992

Ciclofilina de arroz: Buchholz y col, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994

Histona H3 de maíz: Lepetit y col, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992

Histona H3 de alfalfa: Wu y col. Plant Mol. Biol. 11:641-649, 1988

Actina n 2: An y col, Plant J. 10(1); 107-121, 1996

34S FMV: Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443

Subunidad pequeña Rubisco: US 4,962,028

OCS: Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

nos: Shaw y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846

V-ATPasa: WO 01/14572

Súper promotor: WO 95/14098

Proteínas de la caja G: WO 94/12015

Promotor ubicuo Un promotor ubicuo es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo. Promotor regulado evolutivamente Un promotor regulado evolutivamente es activo durante determinadas etapas del desarrollo o en partes de la planta

25 que experimentan cambios evolutivos.

Promotor inducible

Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo químico

(para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108), ambiental o físico, o

puede ser “inducible por estrés”, es decir, activado cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o

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un “patógeno inducible,” es decir, activado cuando una planta está expuesta a la exposición a diversos patógenos.

Promotor especifico de órgano/específico de tejido

Un promotor específico de órgano o específico de tejido es uno que es capaz de iniciar preferentemente la transcripción en determinados órganos o tejidos, tales como hojas, raíces tejido de semillas, etc. Por ejemplo, un

5 “promotor específico de raíz” es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces las de plantas, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. En el presente documento a los promotores capaces de iniciar la transcripción solo en determinadas células se les denomina promotores “específicos de célula”.

En la siguiente Tabla 2b se indican ejemplos de promotores específicos de raíz:

10 Tabla 2b: ejemplos de promotores específicos de raíz

Fuente del gen: Referencia

RCc3: Plant Mol Biol. 1995 Jan;27(2):237-48

Arabidopsis PHT1: Kovama y col., 2005; Mudge y col. (2002, Plant J. 31: 341)

Transportador de fosfato en Medicago: Xiao y col., 2006

Arabidopsis Pyk10: Nitz y col. (2001) Plant Sci 161(2): 337-346

genes expresables en raíz: Tingey y col., EMBO J. 6: 1, 1987.

gen inducible por auxina en tabaco: Van der Zaal y col., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.

-tubulina: Oppenheimer, y col., Gene 63: 87, 1988.

genes específicos de la raíz del tabaco: Conkling, y col. Plant Physiol. 93: 1203, 1990.

gen G1-3b de B. napus: Patente de Estados Unidos No. 5.401.836

SbPRP1: Suzuki y col., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993.

LRX1: Baumberger y col. 2001, Genes & Dev. 15:1128

BTG-26 de Brassica napus: US 20050044585

LeAMT1 (tomate): Lauter y col. (1996, PNAS 3:8139)

The LeNRT1-1 (tomate): Lauter y col. (1996, PNAS 3:8139)

gen de la patatina de clase I (patata): Liu y col., Plant Mol. Biol. 153:386-395, 1991.

KDC1 (Daucus carota): Downey y col. (2000, J. Biol. Chem. 275:39420)

gen de TobRB7: W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA

OsRAB5a (raíz): Wang y col. 2002, Plant Sci. 163:273

ALF5 (Arabidopsis): Diener y col. (2001, Plant Cell 13:1625)

NRT2;1Np (N. plumbaginifolia): Quesada y col. (1997, Plant Mol. Biol. 34:265)

Un promotor específico de semilla es transcripcionalmente activo predominantemente en tejidos de semilla, pero no necesariamente exclusivamente en tejidos de semilla (en casos de expresión parcial). El promotor específico de semilla puede ser activo durante el desarrollo y/o durante la germinación de la semilla. El promotor específico de semilla puede ser específico de endospermo/aleurona/embrión. A continuación en las Tablas 2c a 2f2f se muestran

15 ejemplos de promotores específicos de semilla (específicos de endospermo/aleurona/embrión). Otros ejemplos de promotores específicos de semilla se proporcionan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004).

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Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de semilla

Fuente del gen: Referencia

genes específicos de semilla: Simon y col., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;

Scofield y col., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;

Baszczynski y col., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

albúmina de Nuez del Brasil: Pearson y col., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

Legumina: Ellis y col., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

Glutelina (arroz): Takaiwa y col., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986;

Takaiwa y col., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.

Zeína: Matzke y col Plant Mol Biol, 14(3):323-32 1990

napA: Stalberg y col, Planta 199: 515-519, 1996.

Gluteína-1 de BPM y APM de trigo: Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989

SPA de trigo: Albani y col, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

,  y  gliadinas de trigo: EMBO J. 3:1409-15, 1984

Promotor Itr1 de cebada: Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8

Hordeína B1, C, D de cebada: Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996

DOF de cebada: Mena y col, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998

blz2: EP99106056.7

promotor sintético: Vicente-Carbajosa y col., Plant J. 13: 629-640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz: Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

 globulina Glb-1 de arroz: Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

OSH1 de arroz: Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

 globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase y col. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz: Trans Res 6:157-68, 1997

familia del gen ESR de maíz: Plant J 12:235-46, 1997

-kafirina de sorgo: DeRose y col., Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996

KNOX: Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999

Oleosina de arroz: Wu y col, J. Biochem. 123:386, 1998

Oleosina de girasol: Cummins y col., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992

PRO0117, supuesta proteína ribosomal 40S de arroz: WO 2004/070039

PRO0136, alanina aminotransferasa de arroz: No publicado

PRO0147, inhibidor de tripsina ITR1 (cebada): No publicado

PRO0151, WSI18 de arroz: WO 2004/070039

PRO0175, RAB21 de arroz: WO 2004/070039

PRO005: WO 2004/070039

PRO0095: WO 2004/070039

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(continuación)

Fuente del gen: Referencia

-amilasa (Amy32b): Lanahan y col, Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991

gen similar a la  catepsina: Cejudo y col, Plant Mol Biol 20: 849-856, 1992

Ltp2 de cebada: Kalla y col., Plant J. 6: 849-60, 1994

Chi26: Leah y col., Plant J. 4: 579-89, 1994

B-Perú de maíz: Selinger y col., Genetics 149; 1125-38, 1998

Tabla 2d: ejemplos de promotores específicos de endospermo

Fuente del gen: Referencia

glutelina (arroz): Takaiwa y col. (1986) Mol Gen Genet 208:15-22; Takaiwa y col. (1987) FEBS Letts. 221:43-47

zeína: Matzke y col., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323-32

gluteína-1 de BPM y APM de trigo: Colot y col. (1989) Mol Gen Genet 216:81-90, Anderson y col. (1989) NAR 17:461-2

SPA de trigo: Albani y col. (1997) Plant Cell 9:171-184

gliadinas de trigo: Rafalski y col. (1984) EMBO 3:1409-15

promotor Itr1 de cebada: Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8

hordeína B1, C, D de cebada: Cho y col. (1999) Theor Appl Genet 98:1253-62; Muller y col. (1993) Plant J 4:343-55; Sorenson y col. (1996) Mol Gen Genet 250:750-60

DOF de cebada: Mena y col, (1998) Plant J 116(1): 53-62

blz2: Onate y col. (1999) J Biol Chem 274(14):9175-82

promotor sintético: Vicente-Carbajosa y col. (1998) Plant J 13:629-640

prolamina NRP33 de arroz: Wu y col, (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889

globulina Glb-1 de arroz: Wu y col. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889

globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase y col. (1997) Plant Molec Biol 33: 513-522

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz: Russell y col. (1997) Trans Res 6:157-68

familia del gen ESR de maíz: Opsahl-Ferstad y col. (1997) Plant J 12: 235-46

Kafirina de sorgo: DeRose y col. (1996) Plant Mol Biol 32: 1029-35

Tabla 2e: ejemplos de promotores específicos de embrión:

Fuente del gen: Referencia

OSH1 de arroz: Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

KNOX: Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999

PRO0151: WO 2004/070039

PRO0175: WO 2004/070039

PRO005: WO 2004/070039

PRO0095: WO 2004/070039

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Tabla 2f: ejemplos de promotores específicos de aleurona:

Fuente del gen: Referencia

-amilasa (Amy32b): Lanahan y col, Plant Cell 4:203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991

gen similar a  catepsina: Cejudo y col, Plant Mol Biol 20:849-856, 1992

Ltp2 de cebada: Kalla y col., Plant J. 6:849-60, 1994

Chi26: Leah y col., Plant J. 4:579-89, 1994

B-Perú de maíz: Selinger y col., Genetics 149;1125-38,1998

Un promotor específico de tejido verde como se define en el presente documento es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido verde, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta.

Los ejemplos de promotores específicos de tejido verde que pueden usarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran a continuación en la Tabla 2g.

Tabla 2g: ejemplo de promotores específicos de tejido verde

Gen: Expresión Referencia

Ortofosfato diquinasa de maíz: Específica de hoja Fukavama y col., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz: Específica de hoja Kausch y col., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa de arroz: Específica de hoja Liu y col., 2003

Pequeña subunidad de Rubisco de arroz: Específica de hoja Nomura y col., 2000

beta expansina EXBP9 de arroz: Específica de brote WO 2004/070039

pequeña subunidad de Rubisco de frijol de palo: Específica de hoja Panguluri y col., 2005

RBCS3A de guisante: Específica de hoja

Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristemo, que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido meristemático, sustancialmente con la exclusión de

10 cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. Los ejemplos de promotores específicos de meristemo verde que pueden usarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran en la siguiente Tabla 2h.

Tabla 2h: ejemplos de promotores específicos de meristemo

Fuente del gen: Patrón de expresión Referencia

OSH1 de arroz: Meristemo apical de brote, desde la fase globular embrionaria a la fase de plántula Sato y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122

Metalotioneína de arroz: Específico de meristemo BAD87835.1

WAK1 y WAK 2: Meristemos apicales de brote y raíz y en hojas y sépalos en expansión Wagner y Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303-318

Terminador

15 El término “terminador” incluye una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señaliza el procesamiento y la poliadenilación en dirección 3’ de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede proceder del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de ADN T. El terminador a añadir puede proceder, por ejemplo, de genes de nopalina sintasa u octopina

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sintasa, o como alternativa, de otro gen de planta, o menos preferentemente, de cualquier otro gen eucariota.

Marcador de selección (gen)/Gen indicador

Un “marcador de selección”, “gen marcador de selección” o “gen indicador” incluye cualquier gen que confiere un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o transforman con una construcción de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse de marcadores que confieren resistencia a antibióticos

o a herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten selección visual. Los ejemplos de genes marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporciona resistencia contra glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas usar manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo -glucuronidasa, GUS o -galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X Gal), luminiscencia (tal como el sistema luciferina/luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP y derivados de los mismos). Esta lista solo representa una pequeña cantidad de marcadores posibles. El experto está familiarizado con dichos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores dependiendo del organismo y del procedimiento de selección.

Se sabe que, después de la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en células de plantas, solo una minoría de las células capta el ADN exógeno y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y de la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, normalmente se introduce un gen que codifica un marcador de selección (tal como los descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por procedimientos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador de selección pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usarse en los procedimientos de la invención, o incluso en un vector distinto. Las células que se han transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, por selección (por ejemplo, células que tienen integrado el marcador de selección sobreviven mientras que las otras mueren).

Dado que los genes marcadores, particularmente genes para resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no se requieren o no se desean en la célula huésped transgénica una vez que se han introducido satisfactoriamente los ácidos nucleicos, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permiten la retirada o escisión de estos genes marcadores. Un procedimiento de este tipo es lo que se conoce como co-transformación. El procedimiento de co-transformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que lleva el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que lleva el gen (o genes) marcador. Una proporción grande de transformantes recibe o, en el caso de plantas, comprende (hasta el 40 % o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de transformación con Agrobacteria, los transformantes normalmente solo reciben una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, que normalmente representa el casete de expresión. Posteriormente los genes marcadores pueden retirarse de la planta transformada realizando cruzamientos. En otro procedimiento, se usan genes marcadores integrados en un transposón para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, de manera transitoria o estable. En algunos casos (aprox. 10 %), el transposón salta del genoma de la célula huésped una vez que se ha producido la transformación satisfactoriamente y se pierde. En una serie de casos adicionales, el trasposón salta a una localización diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruzamientos. En microbiología, se desarrollan técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de dichos acontecimientos. Un procedimiento ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que la eliminación puede dispensarse por cruzamiento. El sistema mejor conocido de este tipo es lo que se conoce como sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que retira las secuencias localizadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, éste se elimina una vez se haya producido la transformación satisfactoriamente, por expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble y col., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan y col., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). De acuerdo con la invención, es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de la secuencia de ácidos nucleicos. Naturalmente, estos procedimientos también pueden aplicarse a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

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Un procedimiento de este tipo para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión génica (regulación negativa). En este caso, el silenciamiento se activa en una planta mediante una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este ARNbc se procesa adicionalmente por la planta de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos denominado ARN de interferencia pequeño (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcripto de ARNm del gen endógeno diana, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que se traducen en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación en sentido en una planta. “Orientación en sentido” se refiere a una secuencia de ADN que es homóloga a un transcripto de ARNm de la misma. Por lo tanto, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reducirá la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como co-supresión. La reducción de la expresión del gen sería más pronunciada si en una planta se introdujesen varias copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos, cuando hay una correlación positiva entre altos niveles de transcripto y la activación de co-supresión.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica el uso de secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de “ácidos nucleicos “antisentido” comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos “en sentido” que codifica una proteína, es decir complementaria a la cadena que codifica una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de transcripto de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es preferentemente complementaria a gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede localizarse en la “región codificante” y/o en la “región no codificante” de un gen. La expresión “región codificante” se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de aminoácidos. La expresión “región no codificante” se refiere a las secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones no traducidas 5’ y 3’).

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos completa (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que sea antisentido para solo una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluyendo la UTR 5’ y 3’ del ARNm). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de un transcripto de ARNm que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada se conoce en la técnica y puede comenzar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o varios nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. En la técnica se conocen bien ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Las modificaciones de nucleótido conocidas incluyen metilación, ciclación y ‘protecciones’ y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. En la técnica se conocen bien otras modificaciones de nucleótidos.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). Preferentemente, la producción de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido en plantas se produce mediante una construcción de ácido nucleico establemente integrada que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico usadas para el silenciamiento en los procedimientos (tanto si se introducen en una planta como si se generan in situ) se hibridan con, o se unen a, los transcriptos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la hélice doble. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden introducirse en una planta por transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse para dirigir las células seleccionadas y después administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de tal manera que se unan específicamente a

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Los microARN artificiales (amiARN), que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN de planta. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento diana y pueden usarse para ayudar a diseñar los amiARN específicos, (Schwab y col., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Herramientas convenientes para el diseño y generación de los amiARN y sus precursores también están disponibles para el público (Schwab y col., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta determinada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácidos nucleicos que se introduce se origine de la misma especie de planta como la planta en la que se introducirá. Basta con que haya una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico a introducir.

Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la técnica podrá adaptar fácilmente los procedimientos anteriormente mencionados para el silenciamiento para conseguir la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma usando un promotor apropiado, por ejemplo.

Transformación

El término “introducción” o “transformación” como se denomina en el presente documento, incluye la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento usado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética de la presente invención y a partir del mismo regenerarse una planta completa. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clonales disponibles para, y mejor adaptados a, la especie particular que se va a transformar. Las dianas tisulares ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes axilares y meristemos radiculares) e inducen tejido meristemático (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotiledón). El polinucleótido puede introducirse de manera estable o transitoria en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Como alternativa, éste puede integrarse en el genoma huésped. La célula de la planta transformada resultante puede después usarse para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.

La transferencia de genes externos dentro del genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies plantas es actualmente una técnica muy habitual. Ventajosamente, cualquiera de los diversos procedimientos de trasformación puede usarse para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas de tejidos de plantas o células de plantas pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Los procedimientos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, pistola de bombardeo de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Pueden seleccionarse procedimientos entre, el procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastos (ica, F. A. y col., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I y col. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R. D. y col. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en el material de planta (Crossway A y col., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas revestido con ADN o ARN (Klein TM y col., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrantes) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Para esta finalidad, es posible, por ejemplo, permitir que la agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular las agrobacterias en el meristemo de la planta. Se ha demostrado de un modo particularmente conveniente, de acuerdo con la invención, permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios florales. Posteriormente la planta crece hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación de arroz mediada por Agrobacterium incluyen procedimientos bien conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes referencias bibliográficas: solicitud de patente Europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan y col. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei y col. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994). En el caso de la transformación de maíz, el procedimiento preferido es como se describe en Ishida y col. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o en Frame y col. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento como si se indicaran completamente. Dichos procedimientos se describen adicionalmente, a modo de ejemplo, en B. Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o la construcción a expresar se clona preferentemente en un vector, que es

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Claims

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