ES2552535T3 - Sistemas de CRISPR-Cas y métodos para alterar la expresión de productos génicos - Google Patents

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Abstract

Un sistema vector asociado a CRISPR - Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR) (Cas) (CRISPR-Cas) que no se encuentran en la naturaleza, de ingeniería, que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más ARN guía del sistema CRISPR-Cas que se hibridan con secuencias objetivo en los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota, donde el ARN guía comprende una secuencia guía, una secuencia tracr y una secuencia de emparejamiento tracr, b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, comprendiendo dicha proteína una secuencia de localización nuclear (NLS); en el que los componentes (a) y (b) están situados en los mismos vectores o diferentes vectores del sistema, en el que la secuencia tracr tiene una longitud de 30 o más nucleótidos, y según lo cual uno o más ARN guía fijan como objetivo los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota y la proteína Cas9 escinde los sitios de los polinucleótidos, según lo cual se modifica la secuencia de los sitios de los polinucleótidos; y en el que la proteína Cas9 y uno o más ARN guía no se encuentran juntos en la naturaleza.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Sistemas de CRISPR-Cas y métodos para alterar la expresión de productos génicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a sistemas, métodos y composiciones usados para el control de la
5 expresión de genes que implica fijar como objetivo una secuencia, tal como perturbación del genoma o edición de genes, que pueden usar sistemas vector relacionados con Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR, por sus siglas en inglés) y componentes de los mismos.
Informe en cuanto a investigación patrocinada federalmente
Esta invención se realizó con soporte del gobierno otorgado por el Pioneer Award del NIH, Institutos Nacionales de 10 Salud, DP1MH100706. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Antecedentes de la invención
Los recientes avances en las técnicas de secuenciación del genoma y métodos de análisis han acelerado significativamente la capacidad para catalogar y cartografiar factores genéticos asociados a un diverso intervalo de funciones biológicas y enfermedades. Se requieren tecnologías precisas para fijar como objetivo genoma para 15 permitir la ingeniería inversa sistemática de variaciones genéticas causales permitiendo la perturbación selectiva de elementos genéticos individuales, así como avanzar las aplicaciones de la biología sintética, biotecnológicas y médicas. Aunque están disponibles técnicas de edición de genoma tales como dedos de cinc diseñadores, efectores del tipo activador de la transcripción (los TALE, por sus siglas en inglés) o meganucleasas de migración para producir perturbaciones del genoma fijado como objetivo, sigue existiendo la necesidad de nuevas tecnologías de
20 ingeniería del genoma que tengan un precio asequible, fáciles de montar, escalables y susceptibles de fijar como objetivo múltiples posiciones dentro del genoma eucariota.
Sumario de la invención
Existe una necesidad apremiante de sistemas y técnicas alternativos y robustos para fijar como objetivo secuencias con una amplia serie de aplicaciones. Esta invención estudia esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas. El 25 CRISPR/Cas o el sistema CRISPR-Cas (ambos términos se usan de manera intercambiable por toda esta solicitud) no requiere la generación de proteínas personalizadas para secuencias específicas fijadas como objetivo sino más bien se puede programar una enzima Cas única mediante una molécula de ARN corta para reconocer un objetivo de ADN específico, en otras palabras la enzima Cas se puede reclutar para un objetivo de ADN específico usando dicha molécula de ARN corta. Añadir el sistema CRISPR-Cas al repertorio de técnicas de secuenciación del genoma
30 y métodos de análisis puede simplificar de manera significativa la metodología y acelerar la capacidad para catalogar y cartografiar factores genéticos asociados a un diverso intervalo de funciones biológicas y enfermedades. Para utilizar el sistema CRISPR-Cas de manera eficaz para editar genoma sin efectos perjudiciales, es crítico comprender aspectos de ingeniería y optimización de estas herramientas de ingeniería del genoma, que son aspectos de la presente descripción.
35 De acuerdo con la presente invención, se proporciona un sistema vector de CRISPR-Cas de ingeniería que no se encuentra en la naturaleza de acuerdo con la reivindicación 1. En la invención se describen aspectos adicionales en las reivindicaciones dependientes. La invención también proporciona los usos del sistema de acuerdo con las reivindicaciones 13 a 15.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para alterar o modificar la expresión de uno o más productos
40 génicos que puede comprender introducir en una célula que contiene y expresa moléculas de ADN que codifican uno o más de los productos génicos, un sistema CRISPR-Cas de ingeniería que no se encuentra en la naturaleza, que puede comprender una proteína Cas y uno o más ARN guía que tienen como objetivo moléculas de ADN, donde uno o más ARN guía tienen como objetivo los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos y la proteína Cas escinde los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más
45 productos génicos, de esta manera la expresión de uno o más productos génicos se altera o modifica; y donde la proteína Cas y el ARN guía no se encuentran juntos en la naturaleza. La descripción abarca que la expresión de dos
o más productos génicos se puede alterar o modificar. La descripción además abarca que el ARN guía comprende una secuencia guía fusionada a una secuencia tracr. En una realización preferida, la célula es una célula eucariota, en una realización más preferida, la célula es una célula de mamífero y en una realización aún más preferida, la 50 célula de mamífero es una célula humana. La descripción también abarca que la proteína Cas puede comprender una o más señales de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, la proteína Cas es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. El algunas realizaciones, la proteína Cas es una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas es una Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutadas derivadas de estos organismos. La proteína puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En
55 algunas realizaciones, la proteína Cas es codón-optimizada para su expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la proteína Cas dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo. En un aspecto adicional de la descripción, la expresión del producto génico disminuye y el producto génico es una proteína. La descripción abarca que la introducción en la célula se realiza mediante un sistema de suministro que puede comprender partículas víricas, liposomas, electroporación, microinyección o conjugación.
imagen2
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para alterar o modificar la expresión de uno o más productos génicos que comprende introducir en una célula que contiene y expresa moléculas de ADN que codifican uno o más 5 productos génicos un sistema vector de ingeniería que no está presente en la naturaleza que puede comprender uno
o más vectores que comprenden: a) un primer elemento regulador unido de manera operable a uno o más ARN guía del sistema CRISPR-Cas que se hibridan con secuencias objetivo en los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos, b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una proteína Cas, donde los componentes (a) y (b) se localizan en los mismos vectores del sistema o diferentes, en el 10 que los ARN guía tienen como objetivo los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos y la proteína Cas escinde los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos, y de esta manera se altera o modifica la expresión de uno o más productos génicos; y, donde la proteína Cas y los ARN guía no se encuentran juntos en la naturaleza. La descripción abarca que la expresión de dos o más productos génicos se puede alterar o modificar. La descripción además abarca que el ARN guía 15 comprende una secuencia guía fusionada a una secuencia tracr. En una realización preferida, la célula es una célula eucariota, en una realización más preferida, la célula es una célula de mamífero y en una realización aún más preferida, la célula de mamífero es una célula humana. La descripción también abarca que los vectores del sistema pueden comprender además una o más NLS. En algunas realizaciones, la proteína Cas es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la proteína Cas es una proteína Cas9. En algunas realizaciones la 20 proteína Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutadas derivadas de esos organismos. La proteína puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas es codón-optimizada para la expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones la proteína Cas dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia diana. En un aspecto adicional de la descripción, la expresión del producto génico disminuye y el producto génico es una proteína. La descripción abarca que la
25 introducción en la célula se realiza mediante un sistema de suministro que puede comprender partículas víricas, liposomas, electroporación, microinyección o conjugación.
La invención proporciona un sistema vector de ingeniería que no está presente la naturaleza de acuerdo con la reivindicación 1 que puede comprender uno o más vectores que comprenden: a) un primer elemento regulador unido de manera operable a uno o más ARN guía del sistema CRISPR-Cas que se hibridan con secuencias objetivo en los 30 sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos, b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una proteína Cas, donde los componentes (a) y (b) se localizan en los mismos vectores del sistema o diferentes, en el que los ARN guía tienen como objetivo los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos en una célula y la proteína Cas escinde los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos, y de esta manera se altera o 35 modifica la expresión de uno o más productos génicos; y, donde la proteína Cas y los ARN guía no se encuentran juntos en la naturaleza. La invención abarca que la expresión de dos o más productos génicos se puede alterar o modificar. La invención además abarca que el ARN guía comprende una secuencia guía fusionada a una secuencia tracr. En una realización preferida, la célula es una célula eucariota, en una realización más preferida, la célula es una célula de mamífero y en una realización aún más preferida, la célula de mamífero es una célula humana. La 40 invención también abarca que los vectores del sistema pueden comprender además una o más NLS. La proteína Cas es una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutadas derivadas de esos organismos. La proteína puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas es codón-optimizada para la expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones la proteína Cas dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la
45 secuencia diana. En un aspecto adicional de la descripción, la expresión del producto génico disminuye y el producto génico es una proteína. La invención abarca que la introducción en la célula se realiza mediante un sistema de suministro que puede comprender partículas víricas, liposomas, electroporación, microinyección o conjugación.
En otro aspecto más, la descripción proporciona un sistema de CRISPR-Cas de ingeniería, programable que no está presente en la naturaleza que puede comprender una proteína Cas y uno o más ARN guía que tienen como objetivo 50 los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos en una célula y la proteína Cas escinde los sitios genómicos de las moléculas de ADN que codifican uno o más productos génicos, de manera que se altera o modifica la expresión de uno o más productos génicos; y donde la proteína Cas y los ARN guía no se encuentran juntos en la naturaleza. La descripción abarca que la expresión de dos o más productos génicos se puede alterar o modificar. La descripción además abarca que el ARN guía comprende una secuencia 55 guía fusionada a una secuencia tracr. En una realización preferida, la célula es una célula eucariota, en una realización más preferida, la célula es una célula de mamífero y en una realización aún más preferida, la célula de
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mamífero es una célula humana. La invención también abarca que el sistema CRISPR-Cas puede comprender además una o más NLS. En algunas realizaciones, la proteína Cas es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la proteína Cas es una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 es Cas9 de
S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutadas derivadas de esos organismos. La
5 proteína puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas es codón-optimizada para la expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la proteína Cas dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia diana. En un aspecto adicional de la descripción, la expresión del producto génico disminuye y el producto génico es una proteína. La invención abarca que la introducción en la célula se realiza mediante un sistema de suministro que puede comprender partículas víricas, liposomas, electroporación, microinyección o conjugación.
En un aspecto, la descripción proporciona un sistema vector que comprende uno o más vectores. En algunas realizaciones, el sistema comprende: (a) un primer elemento regulador ligado de manera operable a una secuencia de emparejado tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una o más secuencias guía aguas arriba de la secuencia de emparejado tracr, en la que cuando se expresa, la secuencia guía se dirige a unión específica de 15 secuencias de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia fijada como objetivo y (2) la secuencia de emparejado tracr que se hibrida a la secuencia tracr y (b) un segundo elemento regulador ligado de manera operable a una secuencia codificadora de enzimas que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear; en el que los componentes (a) y (b) están situados en los mismos vectores o diferentes del sistema. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además dos o más secuencias guía ligadas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos o más secuencias guía dirige unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente 25 en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el sistema comprende la secuencia tracr bajo el control de un tercer elemento regulador, tal como un activador de polimerasa III. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejado tracr cuando se alinean de manera óptima. La determinación de la alineación óptima está comprendida en las competencias del experto en la técnica. Por ejemplo, existen algoritmos de alineación y programas comercializados y públicos tales como, sin carácter limitante, Clustal W, Smith-Waterman en matlab, Bowtie, Geneious, Biopython y SeqMan. En algunas realizaciones, el complejo CRISPR comprende una
o más secuencias de localización nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulación de dicho complejo CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. Sin desear estar ligados por la teoría, se cree que una secuencia de localización nuclear no es necesariamente para actividad del complejo CRISPR en 35 eucariotas, sino que incluyendo tales secuencias se mejora la actividad del sistema, especialmente en cuanto a moléculas de ácido nucleico fijadas como objetivo en el núcleo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada derivada de estos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia guía tiene al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleótidos de longitud. En 45 general y por toda esta memoria descriptiva, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, ningún extremo libre (por ejemplo, circular); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN o ambos y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, tal como por técnicas de clonación molecular clásicas. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que están presentes secuencias de ADN o ARN derivadas víricamente en el vector para empaquetamiento en un virus (por ejemplo, retrovirus, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, adenovirus de replicación defectuosa y virus adenoasociados). Los vectores víricos también incluyen polinucleótidos soportados
55 por un virus para transinfección a una célula huésped. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos con un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped y se replican de ese modo junto con el genoma huésped. Por otra parte, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos de manera operativa. Dichos vectores se refieren en la presente memoria como "vectores de expresión". Los vectores de expresión comunes de utilidad en técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en la forma de plásmidos.
Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la descripción en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores, que se pueden seleccionar sobre la base de las células huésped que se tienen que usar para expresión, que están unidos de manera operativa a la secuencia de ácidos nucleicos que se tiene que expresar. En un vector de expresión recombinante, "unido de manera operable" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida al elemento o a los elementos reguladores de una manera que
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5 permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped).
Se pretende que el término "elemento regulador" incluya activadores, potenciadores, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES, por sus siglas en inglés) y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de terminación de la transcripción, tales como señales de poliadenilación y secuencias poli-U). Tales elementos 10 reguladores se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1.990). Los elementos reguladores incluyen aquellos que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula huésped y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del tejido). Un activador específico del tejido puede dirigir la expresión principalmente en un 15 tejido deseado de interés, tal como músculo, neurona, hueso, piel, sangre, órganos específicos (por ejemplo, hígado, páncreas) o tipos de células particulares (por ej., linfocitos). Los elementos reguladores también pueden dirigir la expresión de una manera dependiente temporal, tal como de una manera dependiente del ciclo celular o dependiente de la fase de desarrollo, que puede ser o no también específica del tejido o del tipo de célula. En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más activadores de pol III (por ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más activadores 20 de pol III), uno o más activadores de pol II (por ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más activadores de pol II), uno o más activadores de pol I (por ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más activadores de pol I) o combinaciones de los mismos. Ejemplos de activadores de pol III incluyen, pero no se limitan a, activadores U6 y H1. Ejemplos de activadores de pol II incluyen, pero no se limitan a, el activador LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés) retrovírico (opcionalmente con el potenciador de RSV), el activador de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el estimulador de CMV) 25 [véase, por ej., Boshart et al, Cell, 41: 521-530 (1.985)], el activador de SV40, el activador de dihidrofolato reductasa, el activador de β-actina, el activador de fosfoglicerol kinasa (PGK, por sus siglas en inglés) y el activador de EF1α. También están incluidos en el término "elemento regulador" los elementos estimuladores, tales como WPRE; estimuladores de CMV; el segmento R-U5' en LTR de HTLV-1 (Mol. Cell. Biol., Vol. 8 (1), pág. 466-472, 1.988); estimulador de SV40 y la secuencia del intrón entre los exones 2 y 3 de β-globina de conejo (Proc. Natl. Acad. Sci. 30 USA., Vol. 78 (3), pág. 1.527-31, 1.981). Se apreciará por los expertos en la materia que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se tiene que transformar, el nivel de expresión deseado, etc. Se puede introducir un vector en células huésped para producir de ese modo transcritos, proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente memoria (por ejemplo, transcritos de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y
35 regularmente interespaciadas (CRISPR), proteínas, enzimas, formas mutantes de los mismos, proteínas de fusión de los mismos, etc.).
Vectores ventajosos incluyen lentivirus y virus adenoasociados y también se pueden seleccionar tipos de tales vectores para fijar como objetivo tipos particulares de células.
En un aspecto, la descripción proporciona una célula eucariota huésped que comprende: (a) un primer elemento
40 regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una o más secuencias guía aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en la que cuando se expresa, la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo en una célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a
45 la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica a dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende los componentes (a) y (b). En algunas realizaciones, el componente (a), el componente (b) o los componentes (a) y (b) están integrados de manera estable en un genoma de la célula eucariota huésped. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además la secuencia tracr aguas abajo
50 de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además dos o más secuencias guía unidas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos o más secuencias guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula huésped eucariota comprende además un tercer elemento regulador, tal como un activador
55 de la polimerasa III, unido de manera operable a una dicha secuencia tracr. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinean de manera óptima. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la
60 posición de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escisión de la hebra de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia guía es al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleótidos de longitud. En un aspecto, la descripción proporciona un organismo eucariota no humano; preferiblemente un organismo eucariota multicelular, que comprende una célula eucariota huésped según cualquiera de las realizaciones descritas. En otros aspectos, la descripción proporciona un organismo eucariota; preferiblemente un organismo eucariota multicelular, que comprende una célula eucariota huésped según cualquiera
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5 de las realizaciones descritas. El organismo en algunas realizaciones de estos aspectos puede ser un animal; por ejemplo un mamífero. También, el organismo puede ser un artrópodo tal como un insecto. El organismo puede también ser una planta. Además, el organismo puede ser un hongo.
En un aspecto, la descripción proporciona un estuche que comprende uno o más de los componentes descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el estuche comprende un sistema vector e instrucciones para usar el 10 estuche. En algunas realizaciones, el sistema vector comprende: (a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una o más secuencias guía aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en el que cuando se expresan, la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia 15 guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear. En algunas realizaciones, el estuche comprende los componentes (a) y (b) situados en los mismos vectores del sistema o diferentes. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de 20 emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además dos o más secuencias guía unidas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos o más secuencias guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el sistema comprende además un tercer elemento regulador, tal como un activador de la polimerasa III, unido de manera 25 operable a dicha secuencia tracr. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinea de manera óptima. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende una o más secuencias de localización nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulación de dicha enzima CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima 30 CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo. En
35 algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escisión de la hebra de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia guía es al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleótidos de longitud.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para modificar un polinucleótido objetivo en una célula
40 eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que se una un complejo CRISPR al polinucleótido objetivo para efectuar la escisión de dicho polinucleótido objetivo modificando de ese modo el polinucleótido objetivo, en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía se transcribe a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido objetivo, en el que dicha secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez se transcribe a una
45 secuencia tracr. En algunas realizaciones, dicha escisión comprende escindir una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo mediante dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escisión da como resultado la transcripción disminuida de un gen objetivo. En algunas realizaciones, el método comprende además reparar dicho polinucleótido objetivo escindido por recombinación homóloga con un polinucleótido exógeno de plantilla, en el que dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o
50 más nucleótidos de dicho polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácido en una proteína expresada de un gen que comprende la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, el método comprende además suministrar uno o más vectores a dicha célula eucariota, en el que uno o más vectores conducen la expresión de uno o más de: la enzima CRISPR, la secuencia guía ligada a la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr. En algunas realizaciones, dichos vectores se suministran a
55 la célula eucariota en un individuo. En algunas realizaciones, dicha modificación tiene lugar en dicha célula eucariota en un cultivo celular. En algunas realizaciones, el método comprende además aislar dicha célula eucariota de un individuo antes de dicha modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además devolver dicha célula y/o células eucariotas procedentes de ahí a dicho individuo.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula
60 eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido de manera que dicha unión dé como resultado la expresión aumentada o disminuida de dicho polinucleótido; en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía se transcribe a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido, en el que dicha secuencia guía
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está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez se transcribe a una secuencia tracr. En algunas realizaciones, el método comprende además suministrar uno o más vectores a dichas células eucariotas, en el que uno o más vectores conducen la expresión de una o más de: la enzima CRISPR, la secuencia guía ligada a la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para generar una célula eucariota modelo que comprende un gen mutado de la enfermedad. En algunas realizaciones, un gen de la enfermedad es cualquier gen asociado a un aumento del riesgo de tener o desarrollar una enfermedad. En algunas realizaciones, el método comprende (a) introducir uno o más vectores en una célula eucariota, en la que uno o más vectores conducen la expresión de uno o más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía ligada a una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr y (b) permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleótido objetivo para efectuar la escisión del polinucleótido objetivo dentro de dicho gen de la enfermedad, en el que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo dentro del polinucleótido objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr, generando de ese modo una célula eucariota modelo que comprende un gen mutado de la enfermedad. En algunas realizaciones, dicha escisión comprende escindir una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo mediante dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escisión da como resultado la transcripción disminuida de un gen objetivo. En algunas realizaciones, el método comprende además reparar dicho polinucleótido objetivo escindido por recombinación homóloga con un polinucleótido exógeno de plantilla, en el que dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácido en una expresión de proteína de un gen que comprende la secuencia objetivo.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para desarrollar un agente biológicamente activo que module un caso de señalización celular asociado a un gen de la enfermedad. En algunas realizaciones, un gen de la enfermedad es cualquier gen asociado a un aumento del riesgo de tener o desarrollar una enfermedad. En algunas realizaciones, el método comprende (a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula modelo de una cualquiera de las realizaciones descritas y (b) detectar un cambio en una lectura que sea indicativo de una reducción
o un aumento del caso de señalización celular asociado a dicha mutación en dicho gen de la enfermedad, desarrollando de ese modo dicho agente biológicamente activo que module dicho caso de señalización celular asociado a dicho gen de la enfermedad.
En un aspecto, la descripción proporciona un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia guía aguas arriba de una secuencia de emparejamiento tracr, en el que la secuencia guía cuando se expresa dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una correspondiente secuencia objetivo presente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es una secuencia vírica presente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es un proto-oncogén o un oncogén.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para seleccionar una o más células por introducción de una o más mutaciones en un gen en una o más células, comprendiendo el método: introducir uno o más vectores en la célula o las células, en las que uno o más vectores conducen la expresión de uno o más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía ligada a una secuencia de emparejamiento tracr, una secuencia tracr y una plantilla de edición; en la que la plantilla de edición comprende una o más mutaciones que anula la escisión de la enzima CRISPR; permitir la recombinación homóloga de la plantilla de edición con el polinucleótido objetivo en la célula o las células que se tienen que seleccionar; permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleótido objetivo para efectuar la escisión del polinucleótido objetivo dentro de dicho gen, en el que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo dentro del polinucleótido objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr, en la que la unión del complejo CRISPR al polinucleótido objetivo induce la muerte celular, permitiendo de ese modo que se seleccione una o más células en que se han introducido una o más mutaciones. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 derivadas de esos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima es codón-optimizada para la expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia diana. En una realización preferida, la enzima CRISPR es Cas9. En otra realización preferida de la descripción, la célula que se tiene que seleccionar puede ser una célula eucariota. Los aspectos de la descripción permiten la selección de células específicas sin que se requiera un marcador de selección o un procedimiento de dos etapas que pueda incluir un sistema de contraselección.
Los aspectos de la invención abarcan la inactivación génica específica del sitio en el genoma endógeno: la presente invención presenta ventajas respecto a la utilización de las tecnologías de nucleasas específicas del sitio basadas en dedos de zinc y los efectores TAL ya que no requiere un diseño elaborado y se puede utilizar para inactivar simultáneamente múltiples genes dentro del mismo genoma. En un aspecto adicional, la invención abarca la edición genómica específica del sitio. La presente invención presenta ventajas respecto a la utilización de nucleasas o recombinasas específicas del sitio naturales o artificiales ya que puede ser capaz de introducir dobles roturas de cadena específicas del sitio para facilitar la recombinación homóloga en los sitios genómicos objetivo. En otro 7 5
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aspecto, la invención abarca la interferencia de ADN específica de la secuencia. La invención se puede utilizar para inactivar el genoma de organismos dañinos basados en ADN, tales como microbios, virus o incluso células cancerosas, introduciendo directamente roturas en sitios específicos en el genoma de estos organismos. La invención proporciona métodos y composiciones para la ingeniería genómica multiplexada ya que el sistema CRISPR-Cas de la invención se puede dirigir fácilmente a múltiples sitios en el genoma mediante la utilización de múltiples secuencias guía o elementos espaciadores CRISPR específicos de la secuencia.
Breve descripción de los dibujos
Se tendrá un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente invención por referencia a la siguiente descripción detallada que explica realizaciones ilustrativas, en que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los que:
La Figura 1 muestra un modelo esquemático del sistema CRISPR. La nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarillo) se fija como objetivo para ADN genómico por un ARN guía sintético (ARNsg) que consiste en una secuencia guía de 20-nt (azul) y un andamio (rojo). Los pares de bases de la secuencia guía con el ADN objetivo (azul), directamente aguas arriba de una unidad adyacente protoespaciadora (PAM, por sus siglas en inglés; magenta) 5'-NGG requisito y Cas9 media una doble rotura de cadena (DSB, por sus siglas en inglés) ~3 pb aguas arriba de la PAM (triángulo rojo).
La Figura 2A-F muestra un sistema CRISPR ejemplar, un posible mecanismo de acción, una adaptación de ejemplo para la expresión en células eucariotas y los resultados de los ensayos que evalúan la localización nuclear y la actividad de CRISPR. La Figura 2C describe las SEQ ID NOS 23-24, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 2E describe las SEQ ID NOS 25-27, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 2F describe las SEQ ID NOS 28-32, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 3A-D muestra los resultados de una evaluación de la especificidad de SpCas9 por un objetivo de ejemplo. La Figura 3A describe las SEQ ID NOS 33, 26 y 34-44, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 3C describe la SEQ ID NO: 33.
La Figura 4A-G muestra un sistema vector ejemplar y los resultados de su uso para dirigir la recombinación homóloga en células eucariotas. La Figura 4E describe la SEQ ID NO: 45. La Figura 4F describe las SEQ ID NOS 46-47, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 4G describe las SEQ ID NOS 48-52, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 5 proporciona una tabla de secuencias protoespaciadoras (SEQ ID NOS 16, 15, 14, 53-58,18, 17 y 59-63, respectivamente, en orden de aparición) y resume los resultados de la eficacia de la modificación para protoespaciadores objetivo diseñados basándose en sistemas CRISPR ejemplares de S. pyogenes y S. thermophilus con las PAM correspondientes frente a sitios en genomas humanos y de ratón. Se transfectaron unas células con Cas9 y pre-ARNcr/ARNtracr o ARN quimérico y se analizaron 72 horas después de la transfección. Se calcularon los porcentajes de inserciones o supresiones basándose en los resultados de un ensayo Surveyor a partir de las líneas celulares indicadas (n=3 para todos los protoespaciadores objetivos, los errores son E.E.M., N.D. indica no detectable utilizando el ensayo Surveyor y N.T. indica no estudiado en este estudio).
La Figura 6A-C muestra una comparación de diferentes transcritos de ARNtracr para fijar como objetivo genes mediados por Cas9. La Figura 6A describe las SEQ ID NOS 64-65, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 7 muestra un ensayo de nucleasa surveyor de manera esquemática para la detección de microinserciones y supresiones inducidas por dobles roturas de cadena.
La Figura 8A-B muestra vectores de expresión bicistrónicos ejemplares para la expresión de elementos del sistema CRISPR en células eucariotas. La Figura 8A describe las SEQ ID NOS 66-68, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 8B describe las SEQ ID NOS 69-71, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 9A-C muestra histogramas de distancias entre la PAM del sitio 1 de S. pyogenes SF370 (NGG) (Figura 9A) y la PAM del sitio 2 de LMD9 de S. thermophilus (NNAGAAW) (Figura 9B) adyacentes en el genoma humano; y las distancias para cada PAM según el cromosoma (Chr) (Figura 9C).
La Figura 10A-D muestra un sistema CRISPR ejemplar, una adaptación ejemplar para la expresión de células eucariotas y los resultados de las pruebas que evalúan la actividad CRISPR. La Figura 10B describe las SEQ ID NOS 72-73, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 10C describe la SEQ ID NO:74.
La Figura 11A-C muestra manipulaciones ejemplares de un sistema CRISPR para fijar como objetivo los sitios 8
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genómicos en células de mamífero. La Figura 11A describe la SEQ ID NO:75. La Figura 11B describe las SEQ ID NOS 76-78, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 12A-B muestra los resultados de un análisis por el método de Northern del tratamiento de ARNcr en células de mamífero. La Figura 12A describe la SEQ ID NO:79.
La Figura 13A-B muestra una selección ejemplar de protoespaciadores en los sitios de PVALB humano y Th de ratón. La Figura 13A describe la SEQ ID NO:80. La Figura 13B describe la SEQ ID NO: 81.
La Figura 14 muestra un protoespaciador ejemplar y las secuencias objetivo PAM correspondientes del sistema CRISPR de S. thermophilus en el sitio de EMX1 humano. La Figura 14 describe la SEQ ID NO:74.
La Figura 15 proporciona una tabla de secuencias (SEQ ID NOS 82-93, respectivamente, en orden de aparición, para cebadores y sondas utilizados para los ensayos Surveyor, RFLP, de secuenciación genómica y de análisis de Northern.
La Figura 16A-C muestra la manipulación ejemplar de un sistema CRISPR con ARN quiméricos y los resultados de los ensayos SURVEYOR para determinar la actividad del sistema en células eucariotas. La Figura 16A describe la SEQ ID NO:94.
La Figura 17A-B muestra una representación gráfica de los resultados de los ensayos SURVEYOR para determinar la actividad del sistema CRISPR en células eucariotas.
La Figura 18 muestra una visualización ejemplar de algunos sitios objetivo de Cas9 de S. pyogenes en el genoma humano utilizando el explorador genómico de UCSC. La Figura 18 describe las SEQ ID NOS 95-173, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 19A-D muestra una representación circular del análisis filogenético que revela cinco familias de Cas9, incluidos tres grupos de Cas9 grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9 pequeños (~1100 aminoácidos).
La Figura 20A-F muestra la representación lineal del análisis filogenético que revela cinco familias de Cas9, incluidos tres grupos de Cas9 grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9 pequeños (~1100 aminoácidos).
La Figura 21A-D muestra la edición genómica mediante la recombinación homóloga. (a) Esquema de la nickasa de SpCas9, con la mutación D10A en el dominio catalítico RuvC I. (b) Esquema que representa la recombinación homóloga (RH) en el sitio de EMX1 humano utilizando oligonucleótidos monocatenarios sentido o antisentido como plantillas de reparación. La flecha roja superior indica el sitio de escisión del ARNsg; los cebadores de la PCR para el genotipado (Tablas J y K) se indican como flechas en el panel de la derecha. La Figura 21C describe las SEQ ID NOS 174-176, 174,177 y 176, respectivamente, en orden de aparición. (c) Secuencia de la región modificada por RH. d, ensayo SURVEYOR para determinar las inserciones o supresiones mediadas por SpCas9 natural (wt, por sus siglas en inglés) y nickasa (D10A) en el sitio 1 del objetivo EMX1 (n=3). Las flechas indican las posiciones de los tamaños de los fragmentos esperados.
La Figura 22A-B muestra diseños de vectores únicos para SpCas9. La Figura 22A describe las SEQ ID NOS 178180, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 22B describe la SEQ ID NO: 181.
Las figuras en la presente memoria son solo para fines ilustrativos y no están necesariamente dibujadas a escala.
Descripción detallada de la invención
Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan de forma intercambiable. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes no son ejemplos limitantes de los polinucleótidos: regiones codificadoras o no codificadoras de un gen o fragmento de gen, sitios (sitio) definidos a partir de análisis de unión, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN de interferencia corta (ARNsi), ARN de horquilla corta (ARNsh), micro-ARN (ARNmi), ribozimas, y ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si hay, se pueden impartir modificaciones a la estructura del nucleótido antes o después del ensamblado del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede ser modificado además después de polimerización, tal como por conjugación con un componente etiquetado.
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En aspectos de la invención, los términos "ARN quimérico", "ARN guía quimérico", "ARN guía", "ARN guía único" y "ARN guía sintético" se usan de forma intercambiable y se refieren a la secuencia de polinucleótidos que comprende
5 la secuencia guía, la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr. El término "secuencia guía" se refiere a la secuencia de aproximadamente 20 pb dentro del ARN guía que especifica el sitio objetivo y se puede usar de manera intercambiable con los términos "guía" o "espaciador". El término "secuencia de emparejamiento tracr" también se puede usar de forma intercambiable con el término "repetición o repeticiones directas". Un sistema ejemplar CRISPR-Cas se muestra en la Figura 1.
10 Como se usa en la presente memoria el término "de tipo natural" es un término de la técnica entendido por los expertos y significa la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica como se encuentra en la naturaleza como se distingue de formas mutantes o variantes.
Como se usa en la presente memoria el término "variante" se debería considerar que significa la exhibición de cualidades que presentan un patrón que se desvía de lo que ocurre en la naturaleza.
15 Los términos "que no se encuentra en la naturaleza " o "de ingeniería " se usan de forma intercambiable e indican la implicación de la mano del hombre. Los términos, cuando se refieren a moléculas de ácido nucleico o polipéptidos significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido está al menos sustancialmente exento de al menos otro componente con el que se asocian de manera natural en la naturaleza y como se encuentran en la naturaleza.
"Complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar el enlace o enlaces de hidrógeno
20 con otra secuencia de ácidos nucleicos por emparejamiento de Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de restos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ej., emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácidos nucleicos (por ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de un total de 10 siendo la complementariedad del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100%). "Perfectamente complementario" significa que todos los restos contiguos de una
25 secuencia de ácidos nucleicos formarán un enlace de hidrógeno con el mismo número de restos contiguos en una segunda secuencia de ácidos nucleicos. " Sustancialmente complementario" como se usa en la presente memoria se refiere a un grado de complementariedad que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% por una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas.
30 Como se usa en la presente memoria, "condiciones rigurosas" para hibridación se refiere a las condiciones en las cuales un ácido nucleico que tiene complementariedad a una secuencia objetivo se hibrida predominantemente con la secuencia objetivo y sustancialmente no se hibrida a las secuencias no objetivo. Las condiciones rigurosas son en general dependientes de la secuencia, y varían dependiendo de una serie de factores. En general, cuanto más larga la secuencia, mayor la temperatura a la que se hibrida de manera específica la secuencia a su secuencia objetivo.
35 Se describen con detalle ejemplos no limitantes de condiciones rigurosas en Tijssen (1.993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Segundo Capítulo "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.
"Hibridación" se refiere a una reacción en que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza vía enlace de hidrógeno entre las bases de los restos de nucleótido. El enlace de hidrógeno puede tener 40 lugar por apareamiento de bases de Watson Crick, unión de Hoogstein o de cualquier otra manera específica de la secuencia. El complejo puede comprender dos hebras que forman una estructura dúplex, tres o más hebras que forman un complejo multicatenario, una sola hebra que se autohibrida o cualquier combinación de éstas. Una reacción de hibridación puede constituir una etapa en un procedimiento más extenso, tal como la iniciación de PCR
o la escisión de un polinucleótido mediante una enzima. Una secuencia capaz de hibridación con una secuencia 45 determinada se refiere como el “complemento” de la secuencia determinada.
Como se usa en la presente memoria, "expresión" se refiere al procedimiento por el que un polinucleótido se transcribe de una plantilla de ADN (tal como en ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el procedimiento por el que se traduce con posterioridad un ARNm transcrito en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y polipéptidos codificados se pueden referir de manera colectiva como “producto génico”. Si el polinucleótido procede de ADN
50 genómico, la expresión puede incluir proceso de corte y empalme del ARNm en una célula eucariota.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado y puede comprender aminoácidos modificados y puede ser interrumpido por no aminoácidos. Los términos también incluyen un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glucosilación,
55 lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, tal como conjugación con un componente etiquetado. Como se usa en la presente memoria el término “aminoácido” incluye aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y los dos isómeros ópticos D o L y análogos de aminoácido y peptidomiméticos.
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Los términos " individuo," "individual" y "paciente" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, murinos, simios, seres humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas. Los tejidos, las células y su progenie de una entidad biológica obtenida in vivo o cultivada in vitro también se incluyen.
Los términos "agente terapéutico", "agente terapéutico capaz" o "agente de tratamiento" se usan de forma intercambiable y se refieren a una molécula o compuesto que confiere algún efecto beneficioso en la administración a un individuo. El efecto beneficioso incluye permitir determinaciones de diagnóstico; alivio de una enfermedad, síntoma, trastorno o afección patológica; reducir o prevenir el comienzo de una enfermedad, síntoma, trastorno o afección y en general contrarrestar una enfermedad, síntoma, trastorno o afección patológica.
Como se usa en la presente memoria, "tratamiento" o " tratar," o "paliar" o "aliviar" se usan de forma intercambiable. Estos términos se refieren a una propuesta para obtener resultados beneficiosos o deseados incluyendo pero no limitándose a un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se quiere decir cualquier mejora terapéuticamente relevante en, o efecto sobre, una o más enfermedades, afecciones o síntomas bajo tratamiento. Para beneficio profiláctico, las composiciones se pueden administrar a un individuo con riesgo de desarrollar una enfermedad particular, afección o síntoma o a un individuo que indica uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, incluso aunque la enfermedad, afección o síntoma pueda no haberse manifestado aún.
El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo de uno o más de: el individuo y la enfermedad que se está tratando, el peso y la edad del individuo, la gravedad de la enfermedad, la manera de administración y similares, que se puede determinar fácilmente por un experto en la materia. El término también se aplica a una dosis que proporcionará una imagen para detección por uno cualquiera de los métodos de formación de imagen descritos en la presente memoria. La dosis específica puede variar dependiendo de uno o más de: el agente particular elegido, el régimen de dosificación que se tenga que seguir, si se administra en asociación con otros compuestos, la sincronización de la administración, el tejido que se tiene que someter a formación de imagen y el sistema de suministro físico en el cual esté soportado.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, ADN genómico y recombinante, que están dentro de la destreza de la técnica. Véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición (1.989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.
M. Ausubel, et al. eds., (1.987)); las series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1.995)), Harlow and Lane, eds.
(1.988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL AND ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1.987)).
Varios aspectos de la descripción se refieren a sistemas vector que comprenden uno o más vectores o vectores como tales. Se pueden diseñar vectores para expresión de transcritos CRISPR (por ejemplo, transcritos de ácidos nucleicos, proteínas o enzimas) en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, se pueden expresar transcritos de CRISPR en células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levaduras o células de mamíferos. Las células huésped adecuadas se discuten además en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego; Calif. (1.990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras de activador T7 y polimerasa T7.
Se pueden introducir vectores y propagar en una procariota. En algunas realizaciones, se usó una procariota para multiplicar copias de un vector que se tiene que introducir en una célula eucariota o como un vector intermedio en la producción de un vector que se tiene que introducir en una célula eucariota (por ej., multiplicando un plásmido como parte de un sistema de empaquetamiento de vector vírico). En algunas realizaciones, se usa una procariota para multiplicar copias de un vector y expresar uno o más ácidos nucleicos, tal como para proporcionar una fuente de una
o más proteínas para suministro a una célula huésped u organismo huésped. La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo lo más frecuentemente en Escherichia coli con vectores que contienen activadores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada allí, tal como al término amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión pueden servir para uno o más fines, tales como: (i) para aumentar la expresión de proteína recombinante; (ii) para aumentar la solubilidad de la proteína recombinante y (iii) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando de purificación de afinidad. Con frecuencia, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento o de origen similar, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Vectores de expresión de fusión de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1.988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.) que condensan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante objetivo.
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Ejemplos de vectores de expresión E. coli no de fusión, inducibles, adecuados, incluyen pTrc (Amrann et al., (1.988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1.990) 60-89).
En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en levadura Saccharomyces cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., 1.987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1.982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1.987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
En algunas realizaciones, un vector conduce la expresión de proteínas en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ej., células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1.983. Mol. Cell. Biol. 3: 2.156-2.165) y la serie pVL (Lucklow and Summers, 1.989. Virology 170: 31-39).
En algunas realizaciones, un vector es capaz de conducir la expresión de una o más secuencias en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, 1.987. Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1.987. EMBO J. 6: 187-195). Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión se proporcionan típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los activadores usados comúnmente proceden de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus 40 de simio y otros descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para ambas células procariotas y eucariotas véanse, por ejemplo, los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1.989.
En algunas realizaciones, el vector de expresión de mamíferos recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos del tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos del tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de activadores específicos del tejido adecuados incluyen el activador de albúmina (específico del hígado; Pinkert, et al., 1.987. Genes Dev. 1: 268-277), activadores específicos linfoides (Calame and Eaton, 1.988. Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular activadores de receptores de las células T (Winoto and Baltimore, 1.989. EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji, et al., 1.983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1.983. Cell 33: 741-748), activadores específicos de las neuronas (por ej., el activador de neurofilamentos; Byrne and Ruddle, 1.989. Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 5.473-5.477), activadores específicos del páncreas (Edlund, et al., 1.985. Science 230: 912-916) y activadores específicos de las glándulas mamarias (por ej., activador de suero de leche; Patente de EE.UU. Nº 4. 873. 316 y Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 264.166). También se incluyen activadores regulados por el desarrollo, por ej., los activadores de hox de murina (Kessel and Gruss, 1.990. Science 249: 374-379) y el activador de α-fetoproteína (Campes and Tilghman, 1.989. Genes Dev. 3: 537-546).
En algunas realizaciones, un elemento regulador se une de manera operable a uno o más elementos de un sistema CRISPR a fin de conducir la expresión de uno o más elementos del sistema CRISPR. En general, las CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), también conocidas como las SPIDR (Repeticiones Directas Intercaladas Separadas, por sus siglas en inglés), constituyen una familia de sitios de ADN que son normalmente específicos para una especie bacteriana particular. El sitio de CRISPR comprende una clase distinta de repeticiones de secuencias cortas intercaladas (las SSR) que se reconocieron en E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169: 5.429-5.433 [1.987] y Nakata et al., J. Bacteriol., 171: 3.553-3.556 [1.989]) y genes asociados. Las SSR intercaladas similares han sido identificadas en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Véase, Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: 1.057-1.065 [1.993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263 [1.999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1.307: 26-30 [1.996] y Mojica et al., Mol. Microbiol., 17: 85-93 [1.995]). El sitio de CRISPR difiere típicamente de las otras SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones espaciadas regularmente cortas (las SRSR) (Janssen et al. OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33 [2.002] y Mojica et al., Mol. Microbiol., 36: 244-246 [2.000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que tienen lugar en agrupaciones que están regularmente espaciadas por secuencias de intervención únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2.000], supra). Aunque las secuencias de repeticiones se conservan mucho entre cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones espaciadoras difiere típicamente de cepa a cepa (van Embden et al., J. Bacteriol., 182: 2.393-2.401 [2.000]). Se ha identificado el sitio de CRISPR en más de 40 procariotas (Véase por ej., Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: 1.565-1.575 [2.002] y Mojica et al., [2.005]) incluyendo, pero no limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus. Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella. Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pastaurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.
En general, "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresión de o dirigidos a la actividad de genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluyendo secuencias que codifican un gen
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Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activante) (por ej., ARNtracr o un ARNtracr parcial activo), una secuencia de emparejamiento tracr (incluyendo una "repetición dirigida" y una repetición directa parcial tratada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también referida como un "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno) u otras secuencias y transcritos de un sitio CRISPR. En algunas 5 realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR procede de un sistema CRISPR tipo I, tipo II o tipo III. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR procede de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que activan la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia objetivo (también referido como un protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la que se diseña que una secuencia guía presente complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía active la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para producir hibridación y activar la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótido de ADN o
15 ARN. En algunas realizaciones, se sitúa una secuencia objetivo en el núcleo o citoplasma de una célula. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo puede estar dentro de un organelo de una célula eucariota, por ejemplo, mitocondria o cloroplasto. Una secuencia o plantilla que se puede usar para recombinación en el sitio fijado como objetivo que comprende las secuencias objetivo se refiere como “ plantilla de edición” o “polinucleótido de edición” o “secuencia de edición”. En aspectos de la invención, un polinucleótido de plantilla exógeno se puede referir como una plantilla de edición. En un aspecto de la invención la recombinación es recombinación homóloga.
Típicamente, en el contexto de un sistema CRISPR endógeno, la formación de un complejo CRISPR (que comprende una secuencia guía hibridada a una secuencia objetivo y complejada con una o más proteínas Cas) da como resultado la escisión de una o más hebras en o cerca de (por ej., dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases de) la secuencia objetivo. Sin desear estar limitados por la teoría, la secuencia tracr, que puede 25 comprender o constar de toda o una porción de una secuencia tracr de tipo natural (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 o más nucleótidos de una secuencia tracr de tipo natural), también puede formar parte de un complejo CRISPR, tal como por hibridación a lo largo de al menos una porción de la secuencia tracr a toda o una porción de una secuencia de emparejamiento tracr que esté ligada de manera operable a la secuencia guía. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta suficiente complementariedad a una secuencia de emparejamiento tracr para hibridar y participar en la formación de un complejo CRISPR. Como con la secuencia objetivo, se cree que no es necesaria la complementariedad completa, siempre que haya suficiente para que sea funcional. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinea de manera óptima. En algunas realizaciones, uno o más vectores que conducen la expresión de 35 uno o más elementos de un sistema CRISPR se introducen en una célula huésped de manera que la expresión de los elementos del sistema CRISPR dirija la formación de un complejo CRISPR en uno o más sitios objetivo. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía ligada a una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr podían estar unidas cada una de manera operable a elementos reguladores separados en vectores separados. Como alternativa, dos o más de los elementos expresados de los mismos o diferentes elementos reguladores, se pueden combinar en un vector único, proporcionando uno o más vectores adicionales cualquier componente del sistema CRISPR no incluido en el primer vector. Los elementos del sistema CRISPR que se combinan en un único vector se pueden disponer en cualquier orientación adecuada, tal como un elemento situado en 5' con respecto a ("aguas arriba" de) o 3' con respecto a ("aguas abajo" de) un segundo elemento. La secuencia codificadora de un elemento puede estar situada en la misma hebra u opuesta de la secuencia codificadora de un segundo elemento y
45 orientada en la misma dirección u opuesta. En algunas realizaciones, un activador único conduce la expresión de una transcripción que codifica una enzima CRISPR y una o más de la secuencia guía, la secuencia de emparejamiento tracr (opcionalmente unida de manera operable a la secuencia guía) y una secuencia tracr embebida dentro de una o más secuencias intrón (por ej., cada una en un intrón diferente, dos o más en al menos un intrón o todas en un solo intrón). En algunas realizaciones, la enzima CRISPR, secuencia guía, secuencia de emparejamiento tracr y secuencia tracr se unen de manera operable a y se expresan a partir del mismo activador. En la Figura 22 se ilustran constructos de vectores únicos para SpCas9.
En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más sitios de inserción, tal como una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción (también referido como un “sitio de clonación”). En algunas realizaciones, uno o más sitios de inserción (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 55 8, 9, 10 o más sitios de inserción) están situados aguas arriba y/o aguas abajo de uno o más elementos de secuencia de uno o más vectores. En algunas realizaciones, un vector comprende un sitio de inserción aguas arriba de una secuencia de emparejamiento tracr y opcionalmente aguas abajo de un elemento regulador unido de manera operable a la secuencia de emparejamiento tracr, de manera que después de la inserción de una secuencia guía en el sitio de inserción y en la expresión de la secuencia guía dirija la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo en una célula eucariota. En algunas realizaciones, un vector comprende dos o más sitios de inserción, estando situado cada sitio de inserción entre dos secuencias de emparejamiento tracr de manera que se permita la inserción de una secuencia guía en cada sitio. En dicha disposición, dos o más secuencias guía pueden comprender dos o más copias de una secuencia guía única, dos o más secuencias guía diferentes o combinaciones de éstas. Cuando se usan múltiples secuencias guía diferentes, se puede usar una
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construcción de expresión única para fijar como objetivo la actividad de CRISPR a múltiples secuencias objetivo correspondientes, diferentes, dentro de una célula. Por ejemplo, un solo vector puede comprender aproximadamente
o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más secuencias guía. En algunas realizaciones, se pueden proporcionar aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de tales vectores que contienen secuencia guía y se suministran opcionalmente a una célula.
En algunas realizaciones, un vector comprende un elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR, tal como una proteína Cas. Ejemplos no limitantes de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocidas como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de las mismas o versiones modificadas de las mismas. Estas enzimas son conocidas; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de proteína Cas9 de S. pyogenes se puede encontrar en la base de datos SwissProt con el número de acceso Q99ZW2. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR no modificada presenta actividad de escisión de ADN, tal como Cas9. En algunas realizaciones la enzima CRISPR es Cas9 y puede ser Cas9 de S. pyogenes o S. pneumoniae. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas hebras en la posición de una secuencia objetivo, tal como dentro de la secuencia objetivo y/o dentro del complemento de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas hebras dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 o más pares de bases del primer o el último nucleótido de una secuencia objetivo. En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que muta con respecto a una enzima de tipo natural correspondiente de manera que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad para escindir una o ambas hebras de un polinucleótido objetivo que contiene una secuencia objetivo. Por ejemplo, una sustitución de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes convierte Cas9 de una nucleasa que escinde ambas hebras a una nickasa (escinde una única hebra). Otros ejemplos de mutaciones que hacen Cas9 una nickasa incluyen, sin limitación, H840A, N854A y N863A. En los aspectos de la invención, se puede utilizar nickasas para la edición genómica mediante la recombinación homóloga. Por ejemplo, la Figura 21 muestra la edición genómica mediante la recombinación homóloga. La figura 21 (a) muestra un esquema de la nickasa de SpCas9 con una mutación D10A en el dominio catalítico RuvC I. (b) Esquema que representa la recombinación homóloga (RH) en el sitio de EMX1 humano utilizando oligonucleótidos monocatenarios sentido o antisentido como plantillas de reparación. (c) Secuencia de la región modificada por RH. d, Ensayo SURVEYOR para determinar las inserciones o supresiones mediadas por SpCas9 natural (wt) y nickasa (D10A) en el sitio 1 del objetivo EMX1 (n=3). Las flechas indican las posiciones de los tamaños de los fragmentos esperados.
En algunas realizaciones, se puede usar una nickasa de Cas9 junto con secuencia o secuencias guía, por ejemplo, dos secuencias guía, que fijan como objetivo hebras transcrita y complementaria respectivamente del objetivo de ADN. Esta combinación permite que ambas hebras sean nickeadas y usadas para inducir NHEJ. Los solicitantes han demostrado (datos no mostrados) la eficacia de dos objetivos de nickasa (es decir, los ARNsg fijados como objetivo en la misma posición pero para diferentes hebras de ADN) en la inducción de NHEJ mutagénico. Una única nickasa (Cas9-D10A con un único ARNsg) es incapaz de inducir NHEJ y crear inserciones o supresiones pero los Solicitantes han demostrado en la nickasa doble (Cas9-D10A y dos ARNsg fijados como objetivo a diferentes hebras en la misma posición) lo puede hacer en células madre embrionarias humanas (las hESC). La eficacia es aproximadamente 50% de nucleasa (es decir, Cas9 regular sin mutación D10) en las hESC.
Como un ejemplo más, dos o más dominios catalíticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II y RuvC III) pueden mutar para producir un Cas9 mutado que carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, una mutación de D10A se combina con una o más de las mutaciones H840A, N854A o N863A para producir una enzima Cas9 que carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, se considera que una enzima CRISPR carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN cuando la actividad de escisión de ADN de la enzima mutada es menor que aproximadamente 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% o menor con respecto a su forma no mutada. Pueden ser útiles otras mutaciones; en el caso de que la Cas9 u otra enzima CRISPR sea de una especie distinta de S. pyogenes, se pueden realizar mutaciones en los correspondientes aminoácidos para conseguir efectos similares.
En algunas realizaciones, una secuencia codificadora de enzimas que codifica una enzima CRISPR es codón optimizada para expresión en células particulares, tales como células eucariotas. Las células eucariotas pueden ser aquéllas de, o procedentes de, un organismo particular, tal como un mamífero, incluyendo pero no limitado a, ser humano, ratón, rata, conejo, perro o primate no ser humano. En general, optimización de codón se refiere a un procedimiento para modificar una secuencia de ácidos nucleicos para mejorar la expresión en las células huésped de interés reemplazando al menos un codón (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más codones) de la secuencia natural con codones que se usan más frecuentemente o lo más frecuentemente en los genes de esa célula huésped al tiempo que se mantiene la secuencia de aminoácidos natural. Diversas especies presentan sesgo particular para ciertos codones de un aminoácido particular. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre organismos) con frecuencia se correlaciona con la eficacia de traducción de ARN mensajero (ARNm), que se cree a su vez que depende de, entre otras cosas, las propiedades de los codones que se están traduciendo y la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares.
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La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula es en general una reflexión de los codones usados lo más frecuentemente en síntesis de péptidos. De acuerdo con esto, se pueden adaptar los genes para expresión óptima de los genes en un organismo determinado basándose en optimización de codones. Las tablas de utilización de codones están fácilmente disponibles, por ejemplo, en la “Base de Datos de Uso de Codones”, y estas tablas se
5 pueden adaptar de una serie de maneras. Véase Nakamura Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28: 292 (2.000). También están disponibles algoritmos de ordenador para codones optimizando una secuencia particular para expresión en una célula huésped particular, tales como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). En algunas realizaciones, uno o más codones (por ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más o todos los codones) en una secuencia codificando una enzima CRISPR corresponden al codón usado lo más frecuentemente para un aminoácido particular.
En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleótidos objetivo para hibridación con la secuencia objetivo y dirigir la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su correspondiente secuencia objetivo, cuando se alinean de 15 manera óptima usando un algoritmo de alineación adecuado, es aproximadamente o más de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o más. La alineación óptima se puede determinar con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, ejemplo no limitante de lo cual incluye el algoritmo Smith-Waterman, el algoritmo Needleman-Wunsch, los algoritmos basados en la transformación de Burrows-Wheeler (por ej., el Alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, una secuencia guía es aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia guía es menor que aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos de longitud. La capacidad de una secuencia guía para dirigir la unión específica de la secuencia 25 de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo se puede evaluar por cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes de un sistema CRISPR suficientes para formar un complejo CRISPR, incluyendo la secuencia guía que se tiene que ensayar, se puede proporcionar a una célula huésped que tenga la correspondiente secuencia objetivo, tal como por transinfección con vectores que codifiquen los componentes de la secuencia CRISPR, seguido por una evaluación de la escisión preferente dentro de la secuencia objetivo, tal como mediante ensayo Surveyor como se describe en la presente memoria. De manera similar, la escisión de una secuencia de polinucleótido objetivo se puede evaluar en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia objetivo, los componentes de un complejo CRISPR, incluyendo la secuencia guía que se tiene que ensayar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de ensayo y comparando la unión o velocidad de escisión en la secuencia objetivo entre las reacciones de la secuencia guía de ensayo y de control. Son posibles otros ensayos, y tendrán lugar para los
35 expertos en la materia.
Se puede seleccionar una secuencia guía para fijar como objetivo cualquier secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es una secuencia dentro de un genoma de una célula. Las secuencias objetivo ejemplares incluyen aquéllas que son únicas en el genoma objetivo. Por ejemplo, para la Cas9 de S. pyogenes, una secuencia objetivo única en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG donde NNNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma. Una única secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de S. pyogenes de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG donde NNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma. Para la Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, una única secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma 45 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 1) donde NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 2) (N es A, G, T o C; X puede ser cualquiera y W es A o T) presenta un solo caso en el genoma. Una única secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 3) donde NNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 4) (N es A, G, T o C; X puede ser cualquiera y W es A o T) presenta un solo caso en el genoma. Para la Cas9 de S. pyogenes, una sola secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG donde NNNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma. Una única secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de S. pyogenes de la forma MMMMMMMMNMNNNNNNNNNNXGGXG donde NNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un único caso en el genoma. En
55 cada una de estas secuencias "M" puede ser A, G, T o C y requiere que no se considere en la identificación de una secuencia como única.
En algunas realizaciones, una secuencia guía se selecciona para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia guía. La estructura secundaria se puede determinar por cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleótidos adecuado. Algunos programas se basan en calcular la energía libre mínima de Gibbs. Un ejemplo de uno de tales algoritmos es mFold, como se describe por Zuker y Stiegler (Nucleic Acid Res. 9 (1.981), 133-148). Otro algoritmo de plegamiento de ejemplo es el RNAfold webserver online, desarrollado en el Instituto para Química Teórica de la Universidad de Viena, usando el algoritmo de predicción de estructura centroide (véase por ej., A. R. Gruber et al., 2.008, Cell 106 (1): 23-24 y PA Carr y GM Church, 2.009, Nature Biotechnology 27 (12): 1.151-62).
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En general, una secuencia de emparejamiento tracr incluye cualquier secuencia que presente suficiente complementariedad con una secuencia tracr para activar uno o más de: (1) escisión de una secuencia guía flanqueada por secuencias de emparejamiento tracr en una célula que contiene la correspondiente secuencia tracr y
(2) formación de un complejo CRISPR en una secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende la
5 secuencia de emparejamiento tracr hibridada a la secuencia tracr. En general, el grado de complementariedad es con referencia al alineamiento óptimo de la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr, junto con la longitud del acortador de las dos secuencias. El alineamiento óptimo se puede determinar por cualquier algoritmo de alineamiento adecuado y puede justificar además estructuras secundarias, tal como autocomplementareidad dentro de cualquiera la secuencia tracr o la secuencia de emparejamiento tracr. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr junto con la longitud del acortador de las dos cuando se alinean de manera óptima es aproximadamente o más de aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o mayor. Las ilustraciones de ejemplo de alineación óptima entre una secuencia tracr y una secuencia de emparejamiento tracr se proporcionan en las Figuras 10B y 11B. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es aproximadamente o más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10,
15 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia tracr y secuencia de emparejamiento tracr están contenidas dentro de una transcripción única, de manera que la hibridación entre las dos produce un transcripto con una estructura secundaria, tal como una horquilla. Las secuencias formadoras de lazo preferidas para uso en estructuras de horquilla tienen cuatro nucleótidos de longitud y lo más preferiblemente tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, se pueden usar secuencias de lazo más largas o más cortas, como se pueden usar secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferiblemente un triplete nucleótido (por ejemplo, AAA) y un nucleótido adicional (por ejemplo C o G). Ejemplos de secuencias formadoras de lazo incluyen CAAA y AAAG. En una realización de la descripción, el transcripto o secuencia de polinucleótidos transcrita presenta al menos dos o más horquillas. En realizaciones preferidas, el transcripto presenta dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En una realización más de la descripción, el transcripto presenta a lo sumo cinco
25 horquillas. En algunas realizaciones, el transcripto único incluye además una secuencia de terminación de la transcripción; preferiblemente esta es una secuencia poliT, por ejemplo seis nucleótidos T. Una ilustración de ejemplo de dicha estructura de horquilla se proporciona en la porción inferior de la Figura 11B, donde la porción de la secuencia 5' del "N" final y aguas arriba del lazo corresponde a la secuencia de emparejamiento tracr y la porción de la secuencia 3' del lazo corresponde a la secuencia tracr. Ejemplos no limitantes adicionales de polinucleótidos únicos que comprenden una secuencia guía, una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr son como sigue (enumerados 5' a 3'), donde "N" representa una base de una secuencia guía, el primer bloque de letras minúsculas representan la secuencia de emparejamiento tracr y el segundo bloque de letras minúsculas secuencia representa la secuencia tracr y la secuencia poli-T final representa el terminador de la transcripción: (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt
35 catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (SEQ ID NO: 5); (2) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (SEQ ID NO: 6); (3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT (SEQ ID NO: 7); (4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa agtggcaccgagtcggtgcTTTTTT (SEQ ID NO: 8); (5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtgTTTTTTT (SEQ ID NO: 9); y (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTT TTT (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, las secuencias (1) a (3) se usan junto con Cas9 de CRISPR1 S.
45 thermophilus. En algunas realizaciones, las secuencias (4) a (6) se usan junto con Cas9 de S. pyogenes. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es un transcrito separado de una transcripción que comprende la secuencia de emparejamiento tracr (tal como se ilustra en la porción superior de la Figura 11B).
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de proteína heteróloga (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios además de la enzima CRISPR). Una proteína de fusión de enzima CRISPR puede comprender cualquier secuencia de proteínas adicional y opcionalmente una secuencia ligadora entre dos dominios cualesquiera. Ejemplos de dominios de proteínas que se pueden condensar a una enzima CRISPR incluyen, sin limitación, etiquetas de epítopos, secuencias de genes informadores y dominios de proteínas con una o más de las siguientes actividades: actividad de metilasa, actividad de desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, 55 actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histona, actividad de escisión de ARN y actividad de unión de ácidos nucleicos. Ejemplos no limitantes de etiquetas de epítopos incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de la influenza (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tioredoxina (Trx). Los ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa (GST), peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés), cloramfenicol acetiltransferasa (CAT, por sus siglas en inglés) beta-galactosidasa, betaglucuronidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (PFV), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (PFC) proteína fluorescente amarilla (PFAm) y proteínas autofluorescentes incluyendo proteína fluorescente azul (PFA). Una enzima CRISPR se puede condensar a una secuencia de genes que codifique una proteína o un fragmento de una proteína que una moléculas de ADN u otras moléculas celulares, incluyendo pero no limitándose a (por sus 65 siglas en inglés), proteína de unión de maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de dominios de unión de ADN Lex A
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(DBD), fusiones de dominios de unión de ADN GAL4 y fusiones de proteínas BP16 de virus del herpes simple (HSV). Los dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que comprende una enzima CRISPR se describen en la patente de EE.UU. 20110059502. En algunas realizaciones, se usa una enzima CRISPR etiquetada para identificar la posición de una secuencia objetivo.
En un aspecto de la descripción, un gen informador que incluye, sin limitación, glutatión-S-transferasa (GST), peroxidasa de rábano (HRP), cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (PFV), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (PFC), proteína fluorescente amarilla (PFAm) y proteínas autofluorescentes que incluyen la proteína fluorescente azul (PFA), se puede introducir en una célula para codificar un producto génico que actúe como un marcador mediante el cual medir la alteración o modificación de la expresión del producto génico. En una realización adicional de la descripción, la molécula de ADN que codifica el producto génico se puede introducir en la célula mediante un vector. En una realización preferida de la descripción, el producto génico es luciferasa. En una realización adicional de la descripción, la expresión del producto génico disminuye.
En algunos aspectos, la descripción proporciona métodos que comprenden suministrar uno o más polinucleótidos, tales como o uno o más vectores como se describe en la presente memoria, uno o más transcritos de los mismos y/o una o proteínas transcritas de allí, a una célula huésped. La descripción sirve como una plataforma básica que hace posible modificaciones objetivo de genomas basados en ADN. Puede actuar de interfaz con muchos sistemas de suministro que incluyen, sin limitación, el vírico, con liposomas, electroporación, microinyección y conjugación. En algunos aspectos, la descripción proporciona además células producidas por tales métodos y organismos (tales como animales, plantas u hongos) que comprenden o son producidos de tales células. En algunas realizaciones, se suministra una enzima CRISPR junto con (y opcionalmente complejada con) una secuencia guía a una célula. Se pueden usar métodos de transferencia de genes con base vírica y no vírica convencionales para introducir ácidos nucleicos en células de mamífero o tejidos objetivo. Se pueden usar dichos métodos para administrar componentes que codifican ácidos nucleicos de un sistema CRISPR a células en cultivo o en un organismo huésped. Los sistemas de suministro de vectores no víricos incluyen plásmidos de ADN, ARN (por ej., un transcrito de un vector descrito en la presente memoria), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro, tal como un liposoma. Los sistemas de suministro de vectores víricos incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después de suministro a la célula. Para una revisión de procedimientos de tratamiento de genes, véase Anderson, Science 256: 808-813 (1.992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1.993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1.993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1.993); Miller, Nature 357: 455-460 (1.992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1.149-1.154 (1.988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1.995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1): 31-44 (1.995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds) (1.995) y Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1.994).
Los métodos de suministro no vírico de ácidos nucleicos incluyen lipofección, nucleofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y absorción de ADN aumentada por agente. La lipofeción se describe en por ej., Las Patentes de EE.UU. Nº 5.049.386, 4.946.787 y 4.897.355) y se venden comercialmente los reactivos de lipofeción (por ej., Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para lipofeción de reconocimiento de receptores eficaz de polinucleótidos incluyen aquéllos de Felgner, Patente Internacional WO 91/17424; Patente Internacional WO 91/16024. El suministro puede ser a células (por ej., administración in vitro o ex vivo) o tejidos objetivo (por ej., administración in vivo).
La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, incluyendo liposomas fijados como objetivo tales como complejos de inmunolípidos, es conocida para un experto en la materia (véase, por ej., Crystal, Science 270: 404410 (1.995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1.995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1.994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1.994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1.995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4.817-4.820 (1.992); Patentes de EE.UU. Nº 4.186.183; 4.217.344; 4.235.871; 4.261.975; 4.485.054; 4.501.728; 4.774.085; 4.837.028 y 4.946.787).
El uso de sistemas de base vírica de ARN o ADN para el suministro de ácidos nucleicos toma ventaja de los procedimientos altamente desarrollados para fijar como objetivo un virus a células específicas en el cuerpo y traficar la carga útil vírica al núcleo. Se pueden administrar vectores víricos directamente a pacientes (in vivo) o se pueden usar para tratar células in vitro y las células modificadas se pueden administrar opcionalmente a los pacientes (ex vivo). Los sistemas con base vírica convencionales podían incluir vectores retrovirales, de lentivirus, adenovirales, adenoasociados y del virus del herpes simple para transferencia de genes. La integración en el genoma huésped es posible con los métodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, dando como resultado con frecuencia expresión a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, se han observado altas eficacias de transducción en muchos tipos celulares diferentes y tejidos fijados como objetivo.
El tropismo de un retrovirus se puede modificar por incorporación de proteínas de sobre extrañas, expandiendo la población objetivo potencial de células objetivo. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar células no de división y típicamente producen títulos víricos altos. La selección de un sistema de transferencia de genes retrovirales dependería por lo tanto del tejido objetivo. Los vectores retrovirales están constituidos por repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento para hasta 6
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10 kb de secuencia extraña. Las mínimas LTR que actúan en cis son suficientes para la replicación y empaquetamiento de los vectores, que se usan después para integrar el gen terapéutico en la célula objetivo para proporcionar expresión de transgenes permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen los basados en virus de la leucemia murina (MuLV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de la 5 inmunodeficiencia simia (VIS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (véase, por ej., Buchscher et al., J. Virol. 66: 2.731-2.739 (1.992); Johann et al., J. Virol. 66: 1.635-1.640 (1.992); Sommnerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1.990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2.374-2.378 (1.989); Miller et al., J. Virol. 65: 2.220-2.224 (1991); Patente de EE.UU. PCT/US94/05700). En aplicaciones donde se prefiere la expresión transitoria, se pueden usar sistemas a base de adenovirus. Los vectores a base de adenovirus son capaces de una eficacia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores, se han obtenido altos títulos y niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. También se pueden usar vectores de virus adenoasociados (“AAV”, por sus siglas en inglés) para transducir células con ácidos nucleicos objetivo, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos y para procedimientos de tratamiento con genes in vivo y ex vivo (véase, por ej., West et al.,
15 Virology 160: 38-47 (1.987); la Patente de EE.UU. Nº 4.797.368; la patente internacional WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1.994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1.351 (1.994). Se describe la construcción de vectores AAV recombinantes en una serie de publicaciones, incluyendo la Patente de EE.UU. Nº 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3.251-3.260 (1.985); Tratschin, et al., Mol. Cell Biol. 4: 2.072-2.081 (1.984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6.466-6.470 (1.984) y Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1.989).
Típicamente se usan células de empaquetamiento para formar partículas de virus que sean capaces de infectar una célula huésped. Tales células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células ψ2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores víricos usados en terapia génica se generan habitualmente produciendo una estirpe celular que empaqueta un vector de ácidos nucleicos en una partícula vírica. Los vectores contienen típicamente las mínimas secuencias víricas requeridas para empaquetamiento y posterior integración en un 25 huésped, siendo reemplazadas otras secuencias víricas por una casete de expresión para el polinucleótido o los polinucleótidos que se tienen que expresar. Las funciones víricas que faltan se suministran típicamente en trans por la estirpe celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores AAV usados en terapia génica típicamente poseen sólo secuencias ITR del genoma AAV que se requieren para empaquetamiento e integración en el genoma huésped. El ADN vírico se empaqueta en una estirpe celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, es decir rep y cap, pero carecen de secuencias ITR. La estirpe celular también puede infectarse con adenovirus como auxiliar. El virus auxiliar activa la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no se empaqueta en cantidades significativas debido a ausencia de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir por, por ejemplo, tratamiento térmico al cual es más sensible el adenovirus que AAV. Los métodos adicionales para el suministro de ácidos nucleicos a células son
35 conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 20030087817.
En algunas realizaciones, una célula huésped se transfecta de manera transitoria o de manera no transitoria con uno
o más vectores descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, una célula se transfecta como tiene lugar de manera natural en un individuo. En algunas realizaciones, una célula que se transfecta es tomada de un individuo. En algunas realizaciones, la célula procede de células tomadas de un individuo, tales como una estirpe celular. Una amplia variedad de estirpes celulares de cultivos de tejido se conocen en la técnica. Ejemplos de estirpes celulares incluyen, pero no se limitan a, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, 45 HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, epitelial de riñón de mono BS-C-1, fibroblasto de embrión de ratón BALB/ 3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetales humanos 132-d5; fibroblastos de ratón 10.1, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, células BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145 estirpes celulares OPCN / OPCT, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf
55 9, SkBr3, T2, T-47D, T84, estirpe celular THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63 YAC-1, YAR y variedades transgénicas de los mismos. Las estirpes celulares están disponibles de una variedad de fuentes conocidas por los expertos en la materia (véase, por ej., La Colección de Cultivos de Tipo Americano (ATCC, por sus siglas en inglés) (Manassus, Va.)). En algunas realizaciones, una célula transfectada con uno o más vectores descritos en la presente memoria se usa para establecer una nueva estirpe celular que comprende una o más secuencias procedentes de vector. En algunas realizaciones, una célula transfectada de manera transitoria con los componentes de un sistema CRISPR como se describe en la presente memoria (tal como por transinfección transitoria de uno o más vectores o transinfección con ARN) y modificada por la actividad de un complejo CRISPR, se usa para establecer una nueva estirpe celular que comprende células que contienen la modificación pero carecen de otra secuencia exógena. En algunas realizaciones, las células transfectadas de manera transitoria o de manera
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no transitoria con uno o más vectores descritos en la presente memoria o estirpes celulares procedentes de dichas células se usan en la valoración de uno o más compuestos de ensayo.
Algunos aspectos de la descripción se refieren a la generación de líneas isogénicas de células de mamífero para el estudio de variaciones genéticas en una enfermedad. Un aspecto adicional de la descripción se refiere a la generación de modelos de animales modificados genéticamente, ya sea con un suministro mediado por virus o transgénico. La descripción también abarca modificaciones del genoma de microbios, células, plantas, animales u organismos sintéticos para la generación de productos útiles desde un punto de vista biomédico, agrícola e industrial. En otro aspecto más, la descripción abarca la terapia génica. La descripción se puede utilizar como una herramienta de investigación biológica, para entender el genoma, por ejemplo, estudios de inactivación génica. La descripción se refiere a muchos otros métodos y composiciones que dependen de la habilidad básica de editar y reescribir el contenido de ADN de los genomas, así como también a una inactivación objetivo de organismos basados en ADN. La descripción también puede utilizarse como herramienta terapeútica para fijar como objetivo cepas específicas de infecciones bacterianas, infecciones víricas, etc.
En algunas realizaciones, uno o más vectores descritos en la presente memoria se usan para producir un animal transgénico no humano o planta transgénica. En algunas realizaciones, el animal transgénico es un mamífero, tal como un ratón, rata o conejo. En algunas realizaciones, el organismo o individuo es una planta. En algunas realizaciones, el organismo o individuo o planta es un alga. Los métodos para producir plantas y animales transgénicos son conocidos en la técnica y generalmente empiezan con un método de transinfección de células, tal como se describe en la presente memoria. También se proporcionan animales transgénicos como son plantas transgénicas, especialmente cultivos y algas. El animal o la planta transgénicos pueden ser útiles en aplicaciones fuera de proporcionar un modelo de enfermedad. Éstas pueden incluir producción de alimentos o de alimentación por expresión de, por ejemplo, mayores niveles de proteína, carbohidrato, nutriente o vitaminas que lo que se observaría normalmente en el tipo natural. Con respecto a esto, se prefieren las plantas transgénicas, especialmente legumbres y tubérculos y animales, especialmente los mamíferos tales como ganado (vacas, ovejas, cabras y cerdos), pero también aves de corral e insectos comestibles.
Las algas transgénicas u otras plantas tales como colza pueden ser útiles en particular en la producción de aceites vegetales o biocombustibles tales como alcoholes (especialmente metanol y etanol), por ejemplo. Estos se pueden conseguir por ingeniería para expresar o sobreexpresar altos niveles de aceite o alcoholes para uso en las industrias de aceites o biocombustibles.
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para modificar un polinucleótido objetivo en una célula eucariota, que podrá ser in vivo, ex vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el método comprende obtener muestras de una célula o población de células procedentes de un animal humano o no humano o una planta (incluidas las microalgas) y modificar la célula o las células. El cultivo puede tener lugar en cualquier etapa ex vivo. La célula o las células podrán incluso reintroducirse en el animal no humano o planta (incluidas las micro algas).
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para modificar un polinucleótido objetivo en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido objetivo para efectuar la escisión de dicho polinucleótido objetivo modificando de ese modo el polinucleótido objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido objetivo, en el que dicha secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez híbrida a una secuencia tracr.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido de manera que dicha unión dé como resultado expresión aumentada o disminuida de dicho polinucleótido; en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido, en el que dicha secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez hibrida a una secuencia tracr.
Con los recientes avances en la genómica de cultivos, la capacidad para usar sistemas CRISPR-Cas para realizar edición de genes y manipulación eficaz y de coste eficaz permitirá la rápida selección y la comparación de manipulaciones genéticas únicas y multiplexadas para transformar dichos genomas para producción mejorada y cebos mejorados. Con respecto a esto se hace referencia a las Patentes y publicaciones de EE.UU.: Patente de EE.UU. Nº 6.603.061 -Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; la Patente de EE.UU. Nº 7.868.149 -Plant Genome Sequences and Uses Thereof y la Patente de EE.UU. 2009/0100536 -Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits. En la práctica de la descripción, también se hace referencia a los contenidos y descripción de Morrell et al "Crop genomics: advances and applications" Nat Rev Genet. 29 de diciembre de 2.011; 13 (2): 85-96.
En las plantas, los patógenos son con frecuencia específicos del huésped. Por ejemplo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici produce marchitamiento del tomate pero ataca sólo al tomate y F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f sp. tritici ataca sólo al trigo. Las plantas tienen defensas existentes e inducidas para resistir a la mayoría de los patógenos. Las mutaciones y casos de recombinación a lo largo de las generaciones de plantas conducen a
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variabilidad genética que da lugar a susceptibilidad, especialmente cuando se reproducen los patógenos con más frecuencia que las plantas. En las plantas puede haber resistencia al no huésped, por ejemplo, el huésped y el patógeno son incompatibles. También puede ser Resistencia Horizontal, por ejemplo, resistencia parcial contra todas las razas de un patógeno, controlado típicamente por muchos genes y Resistencia Vertical, por ejemplo, resistencia completa a algunas razas de un patógeno pero no a las demás razas, típicamente controlado por algunos genes. En un nivel gen por gen, las plantas y los patógenos evolucionan juntos y los cambios genéticos en uno equilibran los cambios en otro. De acuerdo con esto, usando Variabilidad Natural, los criadores combinan la mayoría de los genes útiles para Rendimiento, Calidad, Uniformidad, Dureza, Resistencia. Las fuentes de genes de la resistencia incluyen Variedades naturales o extrañas, Variedades Heirloom, Mutaciones Relativas a las Plantas Silvestres e Inducidas, por ej., tratando material vegetal con agentes mutagénicos. Usando la presente descripción, se proporciona a los criadores de plantas una nueva herramienta para inducir mutaciones. De acuerdo con esto, un experto en la materia puede analizar el genoma de fuentes de genes de resistencia y en Variedades con características o rasgos deseados emplea la presente invención para inducir el aumento de genes de resistencia, con más precisión que los agentes mutagénicos previos y por lo tanto acelera y mejora los programas de cultivo.
En un aspecto, la descripción proporciona estuches que contienen uno o más cualesquiera de los elementos descritos en los métodos y composiciones anteriores. En algunas realizaciones, el estuche comprende un sistema vector e instrucciones para usar el estuche. En algunas realizaciones, el sistema vector comprende (a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una secuencia guía aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en el que cuando se expresa, la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear. Los elementos se pueden proporcionar de manera individual o en combinaciones y se pueden proporcionar en cualquier envase adecuado, tal como un vial, un frasco o un tubo. En algunas realizaciones, el estuche incluye instrucciones en uno o más idiomas, por ejemplo en más de un idioma.
En algunas realizaciones, un estuche comprende uno o más reactivos para uso en un procedimiento utilizando uno o más de los elementos descritos en la presente memoria. Los reactivos se pueden proporcionar en cualquier envase adecuado. Por ejemplo, un estuche puede proporcionar uno o más tampones de reacción o de almacenamiento. Los reactivos se pueden proporcionar en una forma que sea utilizable en un ensayo particular o en una forma que requiera la adición de otro u otros componentes más antes de uso (por ejemplo, en forma concentrada o liofilizada). Un tampón puede ser cualquier tampón, incluyendo pero no limitándose a tampón de carbonato de sodio, un tampón de bicarbonato de sodio, un tampón de borato, un tampón de Tris, un tampón de MOPS, un tampón de HEPES y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tampón es alcalino. En algunas realizaciones, el tampón presenta un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el estuche comprende uno
o más oligonucleótidos correspondientes a una secuencia guía para inserción en un vector de manera que se una de manera operable a la secuencia guía y un elemento regulador. En algunas realizaciones, el estuche comprende un polinucleótido de plantilla de recombinación homólogo.
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para usar uno o más elementos de un sistema CRISPR. El complejo CRISPR de la descripción proporciona un medio eficaz para modificar un polinucleótido objetivo. El complejo CRISPR de la descripción presenta una amplia variedad de utilidad incluyendo modificación (por ej., supresión, inserción, traslocación, inactivación, activación) de un polinucleótido objetivo en una multiplicidad de tipos de células. Como tal el complejo CRISPR de la descripción presenta un amplio espectro de aplicaciones en, por ej., tratamiento génico, investigación de fármacos, diagnóstico de enfermedades y prognosis. Un complejo CRISPR ejemplar comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro del polinucleótido objetivo. La secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr, que a su vez híbrida a una secuencia tracr.
El polinucleótido objetivo de un complejo CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno a la célula eucariota. Por ejemplo, el polinucleótido objetivo puede ser un polinucleótido que resida en el núcleo de la célula eucariota. El polinucleótido objetivo puede ser una secuencia que codifique un producto génico (por ej., una proteína) o una secuencia no codificadora (por ej., un polinucleótido regulador o un ADN basura). Sin desear estar limitados por la teoría, se cree que la secuencia objetivo debería estar asociada a un PAM (unidad adyacente protoespaciadora); esto es, una secuencia corta reconocida por el complejo CRISPR. Los requerimientos de secuencia y longitud precisos para el PAM difieren dependiendo de la enzima CRISPR usada, pero los PAM son típicamente secuencias de 2-5 pares de bases adyacentes al protoespaciador (esto es, la secuencia objetivo) Ejemplos de secuencias PAM se proporcionan en la sección de ejemplos a continuación y el experto podrá identificar secuencias PAM adicionales para uso con una enzima CRISPR determinada.
El polinucleótido objetivo de un complejo CRISPR puede incluir una serie de genes y polinucleótidos asociados a enfermedades así como genes y polinucleótidos asociados a ruta bioquímica de señalización.
Ejemplos de polinucleótidos objetivo incluyen una secuencia asociada a una ruta bioquímica de señalización, por ej.,
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un gen o polinucleótido asociado a una ruta bioquímica de señalización. Ejemplos de polinucleótidos objetivo incluyen un gen o polinucleótido asociado a una enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociado a una enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleótido que esté proporcionando productos de transcripción o traducción en un nivel anormal o en una forma anormal en las células procedentes de tejidos afectados por una enfermedad 5 comparado con tejidos o células de un control no de enfermedad. Puede ser un gen que llegue a expresarse a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que llegue a expresarse a un nivel anormalmente bajo, donde la expresión modificada se correlaciona con la aparición y/o progresión de la enfermedad. Un gen asociado a la enfermedad también se refiere a un gen que posee mutación o mutaciones o variación genética que es directamente responsable o está ligada a desequilibrio con un gen, o genes, que es responsable de la etiología de una
10 enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos y puede ser a un nivel normal o anormal.
Ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a una enfermedad están disponibles en Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genética, Universidad de Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y Centro Nacional para Información de Biotecnología, Biblioteca Nacional de Medicina (Betesda, Md.), disponible en la Red Informática Mundial.
15 Ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a una enfermedad se enumeran en las Tablas A y B. La información específica de la enfermedad está disponible en el Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genética, Universidad de Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y Centro Nacional para Información de Biotecnología, Biblioteca Nacional de Medicina (Betesda, Md.), disponible en la Red Informática Mundial. Ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a una ruta bioquímica de señalización se enumeran en la Tabla C.
20 Las mutaciones en estos genes y rutas pueden dar como resultado la producción de proteínas inapropiadas o proteínas en cantidades inapropiadas que afecten a la función. Tales genes, proteínas y rutas pueden ser el polinucleótido objetivo de un complejo CRISPR.
Tabla A
ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GEN (ES)
Neoplasia
PTEN; ATM; ATR; EGFR; ERBB2; ERBB3; ERBB4;
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Notch1; Notch2; Notch3; Notch4; AKT; AKT2; AKT3; HIF;
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HIF1a; HIF3a; Met; HRG; Bcl2; PPAR alfa; PPAR
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gamma; WT1 (Tumor Wilms ); Familia Receptor FGF
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miembros (5 miembros: 1, 2, 3, 4, 5); CDKN2a; APC; RB
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(retinoblastoma); MEN1; VHL; BRCA1; BRCA2; AR
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(Receptor Andrógenos ); TSG101; IGF; Receptor IGF; Igf1 (4
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variantes); Igf2 (3 variantes); Receptor Igf 1; Receptor Igf 2;
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Bax; Bcl2; familia caspases (9 miembros:
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1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; Apc
Degeneración
Abcr; Cc12; Cc2; cp (ceruloplasmina); Timp3; catepsina D;
Macular relacionada con la edad
Vldlr; Ccr2
Esquizofrenia
Neuregulina1 (Nrg1); Erb4 (receptor para Neuregulina);
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Complexina1 (Cplx1); Tph1 Triptófano hidroxilasa; Tph2
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Triptófano hidroxilasa 2; Neurexina 1; GSK3; GSK3a;
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GSK3b
Trastornos
5-HTT (Slc6a4); COMT; DRD (Drd1a); SLC6A3; DAOA;
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DTNBP1; Dao (Dao1)
Repetición del trinucleótido
HTT (Huntington's Dx); SBMA/SMAX1/AR (Kennedy's
Trastornos
Dx); FXN/X25 (Friedrich's Ataxia); ATX3 (Machado
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Joseph's Dx); ATXN1 y ATXN2 (ataxia
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espinocerebelar); DMPK (distrofia miotónica); Atrophin-1 y Atn1
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(DRPLA Dx); CBP (Creb-BP -inestabilidad global); VLDLR
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Tabla B
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y trastornos
linfoproliferativo autoinmunitario (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A);
inmunorelacionados
immunodeficiencia combinada, (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4); HIV-1 (CCL5, SCYA5, D17S136E, TCP228), susceptibilidad o infección por VIH (IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2, CMKBR5, CCCKR5 (CCR5)); Inmunodeficiencias (CD3E, CD3G, AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG, HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI); Inflamación (IL10, IL-1 (IL-1a, IL-1b), IL-13, IL-17 (IL-17a (CTLA8), IL-17b, IL-17c, IL-17d, IL-17f), II23, Cx3cr1, ptpn22, TNFa, NOD2/CARD15 for IBD, IL-6, IL-12 (IL-12a, IL-12b), CTLA4, Cx3cl1); inmunodeficiencias combinadas severas (SCIDs)(JAK3, JAKL, DCLRE1C, ARTEMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4).
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Enfermedades y trastornos
Neuropatía amiloide (TTR, PALB); Amiloidosis (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1,
metabólicos, hepáticos,
GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrosis (KRT18, KRT8, C1RH1A, NAIC, TEX292,
renales y proteínicos
K1AA1988); fibrosis quística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); enfermedades de almacenamiento de glucógeno (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); adenoma hepático, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), fallo hepático, comienzo temprano y trastorno neurológico (SCOD1, SCO1), deficiencia de lipasa hepática(LIPC), Hepatoblastoma, cáncer y carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5; enfermedad del riñón quístico medular (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); Fenilcetonuria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); enfermedad renal y hepática poliquística (FCYT, PKHD1, ARPKD, PKD 1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63).
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enfermedades y trastornos
Distrofia muscular de Becker (DMD, BMD, MYF6), Distrofia muscular de Duchenne
musculares / del esqueleto
(DMD, BMD); Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A, HGPS, LGMD1B, LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A); Distrofia muscular de Facioscapulohumeral (FSHMD1A, FSHD1A); Distrofia muscular (FKRP, MDC1C, LGMD2I, LAMA2, LAMM, LARGE, KIAA0609, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, LGMD2B, SGCG, LGMD2C, DMDA1, SCG3, SGCA, ADL, DAG2, LGMD2D, DMDA2, SGCB, LGMD2E, SGCD, SGD, LGMD2F, CMD1L, TCAP, LGMD2G, CMD1N, TRIM32, HT2A, LGMD2H, FKRP, MDC1C, LGMD21, TTN, CMD1G, TMD, LGMD2J, POMT1, CAV3, LGMD1C, SEPN1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1); Osteopetrosis (LRP5, BMND1, LRP7, LR3, OPPG, VBCH2, CLCN7, CLC7, OPTA2, OSTM1, GL, TCIRG1, TIRC7, OC116, OPTB1); Atrofia muscular (VAPB, VAPC, ALS8, SMN1, SMA1, SMA2, SMA3, SMA4, BSCL2, SPG17, GARS, SMAD1, CMT2D, HEXB, IGHMBP2, SMUBP2, CATF1, SMARD1).
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enfermedades y trastornos
ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF (VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c);
neurológicos y neuronales
enfermedad de Alzheimer (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP1, ACE1, MPO, PACIP1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3); Autismo (Mecp2, BZRAP1, MDGA2, Sema5A, Neurexina 1, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2); Síndrome frágil X (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR5); enfermedad de Huntington y trastornos tipo enfermedad (HD, IT15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17); enfermedad de Parkinson (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, PARK7, LRRK2, PARK8, PINK1, PARK6, UCHL1, PARK5, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, PRKN, PARK2, PDJ, DBH, NDUFV2); síndrome de Rett (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, x-Synuclein, DJ-1); Esquizofrenia (Neuregulin1 (Nrg1), Erb4 (receptor de Neuregulin), Complexin1 (Cplx1), Tph1 Triptófano hidroxilasa, Tph2, Triptófano hidroxilasa 2, Neurexina 1, GSK3, GSK3a, GSK3b, 5-HTT (Slc6a4), COMT, DRD (Drd1a), SLC6A3, DAOA, DTNBP1, Dao (Dao1)); Trastornos Relacionados con la secretasa (APH-1 (alfa y beta), Presenilin (Psen1), nicastrin, (Ncstn), PEN-2, Nos1, Parp1, Nat1, Nat2); Trastornos Repetición del trinucleótido (HTT (Huntington's Dx), SBMA/SMAX1/AR (Kennedy's Dx), FXN/X25 (Ataxia de Friedrich), ATX3 (Machado-Joseph's Dx), ATXN1 y ATXN2 (ataxias espinocerebelares), DMPK (distrofia miotónica), Atrofina-1 y Atn1 (DRPLA Dx), CBP (Creb-BP -inestabilidad global), VLDLR (Alzheimer's), Atxn7, Atxn10).
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enfermedades y trastornos oculares
degeneración macular relacionada con la edad (Abcr, Ccl2, Cc2, cp (ceruloplasmina), Timp3, catepsinaD, Vldlr, Ccr2); Catarata (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2,
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PITX3, BFSP2, CP49, CP47, CRYAA, CRYA1, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BFSP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYBB2, CRYB2, CRYGC, CRYG3, CCL, CRYAA, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1); distrofia y turbidez de la córnea (APOA1, TGFBI, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TACSTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD); Cornea plana congénita (KERA, CNA2); Glaucoma (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A); amaurosis congénita de Leber (CRB1, RP12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3); distrofia macular (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2).
Epilepsia, mioclónica, tipo Lafora, 254780
EPM2A, MELF, EPM2
Epilepsia, mioclónica, tipo Lafora, 254780
NHLRC1, EPM2A, EPM2B
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Distrofia muscular de Duchenne, 310200 (3)
DMD, BMD
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SIDA, progresión retrasada/rápida a (3)
KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11,
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KIR3DS1
SIDA, progresión rápida a, 609423 (3)
IFNG
SIDA, resistencia a (3)
CXCL12, SDF1
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Deficiencia de alfa 1antitripsina
SERPINA 1 [inhibidor de la serpín peptidasa, clado A (alfa-1 antiproteinasa, antitripsina), miembro 1]; SERPINA2 [inhibidor de la serpín peptidasa, clado A (alfa-1 antiproteinasa, antitripsina), miembro 2]; SERPINA3 [inhibidor de la serpín peptidasa, clado A (alfa-1 antiproteinasa, antitripsina), miembro 3]; SERPINA5 [inhibidor de la serpín peptidasa, clado A (alfa-1 antiproteinasa, antitripsina), miembro 5]; SERPINA6 [inhibidor de la serpín peptidasa, clado A (alfa-1 antiproteinasa, antitripsina), miembro 6]; SERPINA7 [inhibidor de la serpín peptidasa, clado A (alfa-1 antiproteinasa, antitripsina), miembro 7]; y SERPINA6 (inhibidor de la serpín peptidasa, clado A (alfa1 antiproteinasa, antitripsina), miembro 6)
Tabla C
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización PI3K/AKT
PRKCE; ITGAM; ITGA5; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2;
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PTEN; EIF4E; PRKCZ; GRK6; MAPK1; TSC1; PLK1;
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AKT2; IKBKB; PIK3CA; CDK8; CDKN1B; NFKB2; BCL2;
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PIK3CB; PPP2R1A; MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC2;
imagen51
ITGA1; KRAS; EIF4EBP1; RELA; PRKCD; NOS3;
imagen52
PRKAA1; MAPK9; CDK2; PPP2CA; PIM1; ITGB7;
imagen53
YWHAZ; ILK; TP53; RAF1; IKBKG; RELB; DYRK1A;
imagen54
CDKN1A; ITGB1; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen55
CHUK; PDPK1; PPP2R5C; CTNNB1; MAP2K1; NFKB1;
imagen56
PAK3; ITGB3; CCND1; GSK3A; FRAP1; SFN; ITGA2;
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TTK; CSNK1A1; BRAF; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
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FUNCIÓN CELULAR
GENES
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HSP90AA1; RPS6KB1
Señalización ERK/MAPK
PRKCE; ITGAM; ITGA5; HSPB1; IRAK1; PRKAA2;
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EIF2AK2; RAC1; RAP1A; TLN1; EIF4E; ELK1; GRK6;
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MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; CREB1;
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PRKCI; PTK2; FOS; RPS6KA4; PIK3CB; PPP2R1A;
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PIK3C3; MAPK8; MAPK3; ITGA1; ETS1; KRAS; MYCN;
imagen64
EIF4EBP1; PPARG; PRKCD; PRKCA1; MAPK9; SRC;
imagen65
CDK2; PPP2CA; PIM1; PIK3C2A; ITGB7; YWHAZ;
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PPP1CC; KSR1; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
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MAP2K2; PAK4; PIK3R1; STAT3; PPP2R5C; MAP2K1;
imagen68
PAK3; ITGB3; ESR1; ITGA2; MYC; TTK; CSNK1A1;
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CRKL; BRAF; ATF4; PRKCA; SRF; STAT1; SGK
Señalización
RAC1; TAF4B; EP300; SMAD2; TRAF6; PCAF; ELK1;
Receptor Glucocorticoide
MAPK1; SMAD3; AKT2; IKBKB; NCOR2; UBE2I;
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PIK3CA; CREB1; FOS; HSPA5; NFKB2; BCL2;
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MAP3K14; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPKB; BCL2L1;
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MAPK3; TSC22D3; MAPK10; NRIP1; KRAS; MAPK13;
imagen73
RELA; STAT5A; MAPK9; NOS2A; PBX1; NR3C1;
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PIK3C2A; CDKN1C; TRAF2; SERPINE1; NCOA3;
imagen75
MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; MAP3K7; CREBBP;
imagen76
CDKN1A; MAP2K2; JAK1; IL8; NCOA2; AKT1; JAK2;
imagen77
PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1;
imagen78
ESR1; SMAD4; CEBPB; JUN; AR; AKT3; CCL2; MMP1; STAT1; IL6; HSP90AA1
Señalización Guía Axonal
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; ADAM12;
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IGF1; RAC1; RAP1A; EIF4E; PRKCZ; NRP1; NTRK2;
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ARHGEF7; SMO; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2;
imagen81
PTPN11; GNAS; AKT2; PIK3CA; ERBB2; PRKCI; PTK2;
imagen82
CFL1; GNAQ; PIK3CB; CXCL 12; PIK3C3; WNT11;
imagen83
PRKD1; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
imagen84
PRKCD; PIK3C2A; ITGB7; GLI2; PXN; VASP; RAF1;
imagen85
FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; ADAM17; AKT1; PIK3R1;
imagen86
GLI1; WNT5A; ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3;
imagen87
CDC42; VEGFA; ITGA2; EPHA8; CRKL; RND1; GSK3B;
imagen88
AKT3; PRKCA
Señalización Receptor Ephrin
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; IRAK1;
imagen89
PRKAA2; EIF2AK2; RAC I; RAP1A; GRK6; ROCK2;
imagen90
MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; PLK1; AKT2;
imagen91
DOK1; CDK8; CREB1; PTK2; CFL1; GNAQ; MAP3K14;
imagen92
CXCL12; MAPK8; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1;
imagen93
KRAS; RHOA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2;
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FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen95
PIM1; ITGB7; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
imagen96
MAP2K2; PAK4; AKT1; JAK2; STAT3; ADAM10;
imagen97
MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA; ITGA2;
imagen98
EPHA8; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; PTPN13; ATF4;
imagen99
AKT3; SGK
Señalización
ACTN4; PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; IRAK1;
cictoesqueleto de actina
PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; INS; ARHGEF7; GRK6;
imagen100
ROCK2; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8;
imagen101
PTK2; CFL1; PIK3CB; MYH9; DIAPH1; PIK3C3; MAPK8;
imagen102
F2R; MAPK3; SLC9A1; ITGA1; KRAS; RHOA; PRKCD;
imagen103
PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; ITGB7;
imagen104
PPP1CC; PXN; VIL2; RAF1; GSN; DYRK1A; ITGB1;
imagen105
MAP2K2; PAK4; PIP5K1A; PIK3R1; MAP2K1; PAK3;
imagen106
ITGB3; CDC42; APC; ITGA2; TTK; CSNK1A1; CRKL;
imagen107
BRAF; VAV3; SGK
Señalización
PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; TGM2;
enfermedad de Huntington
MAPK1; CAPNS1; AKT2; EGFR; NCOR2; SP1; CAPN2;
imagen108
PIK3CA; HDAC5; CREB1; PRKCI; HSPA5; REST;
imagen109
GNAQ; PIK3CB; PIK3C3; MAPKB; IGF1R; PRKD1;
imagen110
GNB2L1; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; HDAC2;
imagen111
HDAC7A; PRKCD; HDAC11; MAPK9; HDAC9; PIK3C2A;
imagen112
HDAC3; TP53; CASP9; CREBBP; AKT1; PIK3R1;
imagen113
PDPK1; CASP1; APAF1; FRAP1; CASP2; JUN; BAX;
imagen114
ATF4; AKT3; PRKCA; CLTC; SGK; HDAC6; CASP3
Señalización de muerte celular programada
PRKCE; ROCK1; BID; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; BAK1;
imagen115
BIRC4; GRK6; MAPK1; CAPNS1; PLK1; AKT2; IKBKB;
imagen116
CAPN2; CDK8; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8;
imagen117
BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; KRAS; RELA;
imagen118
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; TP53; TNF;
imagen119
RAF1; IKBKG; RELB; CASP9; DYRK1A; MAP2K2;
imagen120
CHUK; APAF1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; LMNA; CASP2;
imagen121
BIRC2; TTK; CSNK1A1; BRAF; BAX; PRKCA; SGK;
imagen122
CASP3; BIRC3; PARP1
Señalización de Receptor de células B
RAC1; PTEN; LYN; ELK1; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen123
AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; SYK; NFKB2; CAMK2A;
imagen124
MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; ABL1;
imagen125
MAPK3; ETS1; KRAS; MAPK13; RELA; PTPN6; MAPK9;
imagen126
EGRI; PIK3C2A; BTK; MAPK14; RAF1; IKBKG; RELB;
imagen127
MAP3K7; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; MAP2K1;
imagen128
NFKB1; CDC42; GSK3A; FRAP1; BCL6; BCL10; JUN;
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FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen130
GSK3B; ATF4; AKT3; VAV3; RPS6KB1
Señalización de diapédesis
ACTN4; CD44; PRKCE; ITGAM; ROCK1; CXCR4; CYBA;
imagen131
RAC1; RAP1A; PRKCZ; ROCK2; RAC2; PTPN11;
imagen132
MMP14; PIK3CA; PRKCI; PTK2; PIK3CB; CXCL12;
imagen133
PIK3C3; MAPK8; PRKD1; ABL1; MAPK10; CYBB;
imagen134
MAPK13; RHOA; PRKCD; MAPK9; SRC; PIK3C2A; BTK;
imagen135
MAPK14; NOX1; PXN; VIL2; VASP; TTGB1; MAP2K2;
imagen136
CTNND1; PIK3R1; CTNNB1; CLDN1; CDC42; F11R; ITK;
imagen137
CRKL; VAV3; CTTN; PRKCA; MMP1; MMP9
Señalización de Integrina
ACTN4; ITGAM; ROCK1; ITGA5; RAC1; PTEN; RAP1A;
imagen138
TLN1; ARHGEF7; MAPK1; RAC2; CAPNS1; AKT2;
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CAPN2; PIK3CA; PTK2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen140
CAV1; CAPN1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
imagen141
SRC; PIK3C2A; ITGB7; PPP1CC; ILK; PXN; VASP;
imagen142
RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1;
imagen143
TNK2; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; RND3; ITGA2;
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CRKL; BRAF; GSK3B; AKT3
Señalización
IRAK1; SOD2; MYD88; TRAF6; ELK1; MAPK1; PTPN11;
de Respuesta de fase aguda
AKT2; IKBKB; PIK3CA; FOS; NFKB2; MAP3K14;
imagen145
PIK3CB; MAPK8; RIPK1; MAPK3; IL6ST; KRAS;
imagen146
MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; FTL; NR3C1;
imagen147
TRAF2; SERPINE1; MAPK14; TNF; RAF1; PDK1;
imagen148
IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1;
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CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; FRAP1; CEBPB; JUN;
imagen150
AKT3; IL1R1; IL6
Señalización de PTEN
ITGAM; ITGA5; RAC1; PTEN; PRKCZ; BCL2L 11;
imagen151
MAPK1; RAC2; AKT2; EGFR; IKBKB; CBL; PIK3CA;
imagen152
CDKN1B; PTK2; NFKB2; BCL2; PIK3CB; BCL2L1;
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MAPK3; ITGA1; KRAS; ITGB7; ILK; PDGFRB; INSR;
imagen154
RAF1; IKBKG; CASP9; CDKN1A; ITGB1; MAP2K2;
imagen155
AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; PDPK1; MAP2K1;
imagen156
NFKB1; ITGB3; CDC42; CCND1; GSK3A; ITGA2;
imagen157
GSK3B; AKT3; FOXO1; CASP3; RPS6KB1
Señalización de p53
PTEN; EP300; BBC3; PCAF; FASN; BRCA1; GADD45A;
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BIRC5; AKT2; PIK3CA; CHEK1; TP53INP1; BCL2;
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PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; THBS1; ATR; BCL2L1; E2F1;
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PMAIP1; CHEK2; TNFRSF10B; TP73; RB1; HDAC9;
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CDK2; PIK3C2A; MAPK14; TP53; LRDD; CDKN1A;
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HIPK2; AKT1; PIK3R1; RRM2B; APAF1; CTNNB1;
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SIRT1; CCND1; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A; JUN;
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FUNCIÓN CELULAR
GENES
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SNAI2; GSK3B; BAX; AKT3
Señalización
HSPB1; EP300; FASN; TGM2; RXRA; MAPK1; NQO1;
de Receptor Arilhidrocarbonado
NCOR2; SP1; ARNT; CDKN1B; FOS; CHEK1;
imagen166
SMARCA4; NFKB2; MAPK8; ALDH1A1; ATR; E2F1;
imagen167
MAPK3; NRIP1; CHEK2; RELA; TP73; GSTP1; RB1;
imagen168
SRC; CDK2; AHR; NFE2L2; NCOA3; TP53; TNF;
imagen169
CDKN I A; NCOA2; APAF1; NFKB1; CCND1; ATM; ESR1;
imagen170
CDKN2A; MYC; JUN; ESR2; BAX; IL6; CYP1B1;
imagen171
HSP90AA1
Señalización de
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; MAPK1; NQO1;
Metabolismo Xenobiótico
NCOR2; PIK3CA; ARNT; PRKCI; NFKB2; CAMK2A;
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PIK3CB; PPP2R1A; PIK3C3; MAPK8; PRKD1;
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ALDH1A1; MAPK3; NRIP1; KRAS; MAPK13; PRKCD;
imagen174
GSTP1; MAPK9; NOS2A; ABCB1; AHR; PPP2CA; FTL;
imagen175
NFE2L2; PIK3C2A; PPARGC1A; MAPK14; TNF; RAF1;
imagen176
CREBBP; MAP2K2; PIK3R1; PPP2R5C; MAP2K1;
imagen177
NFKB1; KEAP1; PRKCA; EIF2AK3; IL6; CYP1B1;
imagen178
HSP90AA1
Señalización de SAPK/JNK
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC I ; ELK1;
imagen179
GRK6; MAPK1; GADD45A; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA;
imagen180
FADD; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; R1PK1;
imagen181
GNB2L1; IRS1; MAPK3; MAPK10; DAXX; KRAS;
imagen182
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A;
imagen183
TRAF2; TP53; LCK; MAP3K7; DYRK1A; MAP2K2;
imagen184
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; CDC42; JUN; TTK; CSNK1A1;
imagen185
CRKL; BRAF; SGK
Señalización de PPAr/RXR
PRKAA2; EP300; INS; SMAD2; TRAF6; PPARA; FASN;
imagen186
RXRA; MAPK1; SMAD3; GNAS; IKBKB; NCOR2;
imagen187
ABCA1; GNAQ; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK8;
imagen188
IRS1; MAPK3; KRAS; RELA; PRKAA1; PPARGC1A;
imagen189
NCOA3; MAPK14; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7;
imagen190
CREBBP; MAP2K2; JAK2; CHUK; MAP2K1; NFKB 1;
imagen191
TGFBR1; SMAD4; JUN; IL1R1; PRKCA; IL6; HSP90AA1; ADIPOQ
Señalización de NF-KB
IRAK1; EIF2AK2; EP300; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6;
imagen192
TBK1; AKT2; EGFR; IKBKB; PIK3CA; BTRC; NFKB2;
imagen193
MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; HDAC2;
imagen194
KRAS; RELA; PIK3C2A; TRAF2; TLR4; PDGFRB; TNF;
imagen195
INSR; LCK; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; AKT1;
imagen196
PIK3R1; CHUK; PDGFRA; NFKB1; TLR2; BCL10;
imagen197
GSK3B; AKT3; TNFAIP3; IL1R1
imagen198
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización de Neuregulina
ERBB4; PRKCE; ITGAM; ITGA5; PTEN; PRKCZ; ELK1;
imagen199
MAPK1; PTPN11; AKT2; EGFR; ERBB2; PRKCI;
imagen200
CDKN1B; STAT5B; PRKD1; MAPK3; ITGA1; KRAS;
imagen201
PRKCD; STAT5A; SRC; ITGB7; RAF1; ITGB1; MAP2K2;
imagen202
ADAM17; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; ITGB3;
imagen203
EREG; FRAP1; PSEN1; ITGA2; MYC; NRG1; CRKL;
imagen204
AKT3; PRKCA; HSP90AA1; RPS6KB1
Señalización de
CD44; EP300; LRP6; DVL3; CSNK1E; GJA1; SMO;
catenina Wnt y Beta
AKT2; PIN1; CDH1; BTRC; GNAQ; MARK2; PPP2R1A;
imagen205
WNT11; SRC; DKK1; PPP2CA; SOX6; SFRP2; ILK;
imagen206
LEF1; SOX9; TP53; MAP3K7; CREBBP; TCF7L2; AKT1;
imagen207
PPP2R5C; WNT5A; LRP5; CTNNB1; TGFBR1; CCND1;
imagen208
GSK3A; DVL1; APC; CDKN2A; MYC; CSNK1A1; GSK3B;
imagen209
AKT3; SOX2
Señalización de Receptor de Insulina
PTEN; INS; EIF4E; PTPN1; PRKCZ; MAPK1; TSC1;
imagen210
PTPN11; AKT2; CBL; PIK3CA; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3;
imagen211
MAPK8; IRS1; MAPK3; TSC2; KRAS; EIF4EBP1;
imagen212
SLC2A4; PIK3C2A; PPP1CC; INSR; RAF1; FYN;
imagen213
MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
imagen214
GSK3A; FRAP1; CRKL; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
imagen215
RPS6KB1
Señalización de IL-6
HSPB1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; MAPK1; PTPN11;
imagen216
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK3;
imagen217
MAPK10; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1;
imagen218
MAPK9; ABCB1; TRAF2; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG;
imagen219
RELB; MAP3K7; MAP2K2; IL8; JAK2; CHUK; STAT3;
imagen220
MAP2K1; NFKB1; CEBPB; JUN; IL1R1; SRF; IL6
Colestasis Hepática
PRKCE; IRAK1; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; PPARA;
imagen221
RXRA; IKBKB; PRKCI; NFKB2; MAP3K14; MAPK8;
imagen222
PRKD1; MAPK10; RELA; PRKCD; MAPK9; ABCB1;
imagen223
TRAF2; TLR4; TNF; INSR; IKBKG; RELB; MAP3K7; IL8;
imagen224
CHUK; NR1H2; TJP2; NFKB1; ESR1; SREBF1; FGFR4;
imagen225
JUN; IL1R1; PRKCA; IL6
Señalización de IGF-1
IGF 1; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; NEDD4; AKT2;
imagen226
PIK3CA; PRKCI; PTK2; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen227
IGF1R; IRS1; MAPK3; IGFBP7; KRAS; PIK3C2A;
imagen228
YWHAZ; PXN; RAF1; CASP9; MAP2K2; AKT1; PIK3R1;
imagen229
PDPK1; MAP2K1; IGFBP2; SFN; JUN; CYR61; AKT3;
imagen230
FOXO1; SRF; CTGF; RPS6KB1
Respuesta de Estrés
PRKCE; EP300; SOD2; PRKCZ; MAPK1; SQSTM1;
imagen231
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Oxidativo mediado por NRF2
NQO1; PIK3CA; PRKCI; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen232
PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; GSTP1; MAPK9; FTL;
imagen233
NFE2L2; PIK3C2A; MAPK14; RAF1; MAP3K7; CREBBP;
imagen234
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PPIB; JUN; KEAP1;
imagen235
GSK3B; ATF4; PRKCA; EIF2AK3; HSP90AA1
Fibrosis Hepática /
EDN1; 1GF1; KDR; FLT1; SMAD2; FGFR1; MET; PGF;
Activación de células estelares hepáticas
SMAD3; EGFR; FAS; CSF1; NFKB2; BCL2; MYH9;
imagen236
IGF1R; IL6R; RELA; TLR4; PDGFRB; TNF; RELB; IL8;
imagen237
PDGFRA; NFKB1; TGFBR1; SMAD4; VEGFA; BAX;
imagen238
IL1R1; CCL2; HGF; MMP1; STAT1; IL6; CTGF; MMP9
Señalización de PPAR
EP300; INS; TRAF6; PPARA; RXRA; MAPK1; IKBKB;
imagen239
NCOR2; FOS; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK3;
imagen240
NRIP1; KRAS; PPARG; RELA; STAT5A; TRAF2;
imagen241
PPARGC1A; PDGFRB; TNF; INSR; RAF1; IKBKG;
imagen242
RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; CHUK; PDGFRA;
imagen243
MAP2K1; NFKB1; JUN; IL1R1; HSP90AA1
Señalización de Fc Epsilon RI
PRKCE; RAC1; PRKCZ; LYN; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen244
AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen245
PRKD1; MAPK3; MAPK10; KRAS; MAPK13; PRKCD;
imagen246
MAPK9; PIK3C2A; BTK; MAPK14; TNF; RAF1; FYN;
imagen247
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; AKT3;
imagen248
VAV3; PRKCA
Señalización de Receptor
PRKCE; RAP1A; RGS16; MAPK1; GNAS; AKT2; IKBKB;
Acoplado a proteína G
PIK3CA; CREB1; GNAQ; NFKB2; CAMK2A; PIK3CB;
imagen249
PIK3C3; MAPK3; KRAS; RELA; SRC; PIK3C2A; RAF1;
imagen250
IKBKG; RELB; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK;
imagen251
PDPK1; STAT3; MAP2K1; NFKB1; BRAF; ATF4; AKT3;
imagen252
PRKCA
Metabolismo de
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; GRK6;
Inositol fosfato
MAPK1; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; PIK3CB; PIK3C3;
imagen253
MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2;
imagen254
PIM1; PIK3C2A; DYRK1A; MAP2K2; PIP5K1A; PIK3R1;
imagen255
MAP2K1; PAK3; ATM; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Señalización de PDGF
EIF2AK2; ELK1; ABL2; MAPK1; PIK3CA; FOS; PIK3CB;
imagen256
PIK3C3; MAPK8; CAV1; ABL1; MAPK3; KRAS; SRC;
imagen257
PIK3C2A; PDGFRB; RAF1; MAP2K2; JAK1; JAK2;
imagen258
PIK3R1; PDGFRA; STAT3; SPHK1; MAP2K1; MYC;
imagen259
JUN; CRKL; PRKCA; SRF; STAT1; SPHK2
Señalización de VEGF
ACTN4; ROCK1; KDR; FLT1; ROCK2; MAPK1; PGF;
imagen260
AKT2; PIK3CA; ARNT; PTK2; BCL2; PIK3CB; PIK3C3;
imagen261
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen262
BCL2L1; MAPK3; KRAS; HIF1A; NOS3; PIK3C2A; PXN;
imagen263
RAF1; MAP2K2; ELAVL1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; SFN;
imagen264
VEGFA; AKT3; FOXO1; PRKCA
Señalización de células
PRKCE; RAC1; PRKCZ; MAPK1; RAC2; PTPN11;
aniquilantes naturales
KIR2DL3; AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB;
imagen265
PIK3C3; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PTPN6;
imagen266
PIK3C2A; LCK; RAF1; FYN; MAP2K2; PAK4; AKT1;
imagen267
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; AKT3; VAV3; PRKCA
Ciclo celular: G1/S
HDAC4; SMAD3; SUV39H1; HDAC5; CDKN1B; BTRC;
Regulación de control
ATR; ABL1; E2F1; HDAC2; HDAC7A; RB1; HDAC11;
imagen268
HDAC9; CDK2; E2F2; HDAC3; TP53; CDKN1A; CCND1;
imagen269
E2F4; ATM; RBL2; SMAD4; CDKN2A; MYC; NRG1;
imagen270
GSK3B; RBL1; HDAC6
Señalización de Receptor de células T
RAC1; ELK1; MAPK1; IKBKB; CBL; PIK3CA; FOS;
imagen271
NFKB2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
imagen272
RELA; PIK3C2A; BTK; LCK; RAF1; IKBKG; RELB; FYN;
imagen273
MAP2K2; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; ITK; BCL10;
imagen274
JUN; VAV3
Señalización de Receptor de la muerte
CRADD; HSPB1; BID; BIRC4; TBK1; IKBKB; FADD;
imagen275
FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; RIPK1; CASP8;
imagen276
DAXX; TNFRSF10B; RELA; TRAF2; TNF; IKBKG; RELB;
imagen277
CASP9; CHUK; APAF1; NFKB1; CASP2; BIRC2; CASP3;
imagen278
BIRC3
Señalización de FGF
RAC1; FGFR1; MET; MAPKAPK2; MAPK1; PTPN11;
imagen279
AKT2; PIK3CA; CREB1; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen280
MAPK3; MAPK13; PTPN6; PIK3C2A; MAPK14; RAF1;
imagen281
AKT1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FGFR4; CRKL; ATF4;
imagen282
AKT3; PRKCA; HGF
Señalización de GM-CSF
LYN; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; CAMK2A;
imagen283
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; GNB2L1; BCL2L1; MAPK3;
imagen284
ETS1; KRAS; RUNX1; PIM1; PIK3C2A; RAF1; MAP2K2;
imagen285
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; CCND1; AKT3;
imagen286
STAT1
Señalización de esclerosis
BID; IGF1; RAC1; BIRC4; PGF; CAPNS1; CAPN2;
lateral amiotrófica
PIK3CA; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; CAPN1;
imagen287
PIK3C2A; TP53; CASP9; PIK3R1; RAB5A; CASP1;
imagen288
APAF1; VEGFA; BIRC2; BAX; AKT3; CASP3; BIRC3
Señalización de JAK/Stat
PTPN1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; STAT5B;
imagen289
PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A;
imagen290
PTPN6; PIK3C2A; RAF1; CDKN1A; MAP2K2; JAK1;
imagen291
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen292
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FRAP1; AKT3;
imagen293
STAT1
Metabolismo de
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; GRK6; MAPK1;
Nicotinato y
imagen294
Nicotinamida
PLK1; AKT2; CDK8; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1;
imagen295
PBEF1; MAPK9; CDK2; PIM1; DYRK1A; MAP2K2;
imagen296
MAP2K1; PAK3; NT5E; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Señalización de quimiocinas
CXCR4; ROCK2; MAPK1; PTK2; FOS; CFL1; GNAQ;
imagen297
CAMK2A; CXCL12; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK13;
imagen298
RHOA; CCR3; SRC; PPP1CC; MAPK14; NOX1; RAF1;
imagen299
MAP2K2; MAP2K1; FLAN; CCL2; PRKCA
Señalización de IL-2
ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; SYK; FOS;
imagen300
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
imagen301
SOCS1; STAT5A; PIK3C2A; LCK; RAF1; MAP2K2;
imagen302
JAK1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; JUN; AKT3
Depresión sináptica
PRKCE; IGF1; PRKCZ; PRDX6; LYN; MAPK1; GNAS;
a largo lazo
PRKCI; GNAQ; PPP2R1A; IGF1R; PRKD1; MAPK3;
imagen303
KRAS; GRN; PRKCD; NOS3; NOS2A; PPP2CA;
imagen304
YWHAZ; RAF1; MAP2K2; PPP2R5C; MAP2K1; PRKCA
Señalización de
TAF4B; EP300; CARM1; PCAF; MAPK1; NCOR2;
Receptor de Estrógenos
SMARCA4; MAPK3; NRIP1; KRAS; SRC; NR3C1;
imagen305
HDAC3; PPARGC1A; RBM9; NCOA3; RAF1; CREBBP;
imagen306
MAP2K2; NCOA2; MAP2K1; PRKDC; ESR1; ESR2
Ruta de
TRAF6; SMURF1; BIRC4; BRCA1; UCHL1; NEDD4;
Ubiquitinación de proteínas
CBL; UBE2I; BTRC; HSPA5; USP7; USP10; FBXW7;
imagen307
USP9X; STUB1; USP22; B2M; BIRC2; PARK2; USP8;
imagen308
USP1; VHL; HSP90AA1; BIRC3
Señalización de IL-10
TRAF6; CCR1; ELK1; IKBKB; SP1; FOS; NFKB2;
imagen309
MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA; MAPK14; TNF;
imagen310
IKBKG; RELB; MAP3K7; JAK1; CHUK; STAT3; NFKB1;
imagen311
JUN; IL1R1; IL6
Activación de VDR/RXR
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; GADD45A; HES1;
imagen312
NCOR2; SP1; PRKCI; CDKN1B; PRKD1; PRKCD;
imagen313
RUNX2; KLF4; YY1; NCOA3; CDKN1A; NCOA2; SPP1;
imagen314
LRP5; CEBPB; FOXO1; PRKCA
Señalización de TGF-beta
EP300; SMAD2; SMURF1; MAPK1; SMAD3; SMAD1;
imagen315
FOS; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK9; RUNX2;
imagen316
SERPINE1; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2;
imagen317
MAP2K1; TGFBR1; SMAD4; JUN; SMAD5
Señalización de Receptor tipo Toll
IRAK1; EIF2AK2; MYD88; TRAF6; PPARA; ELK1;
imagen318
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen319
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13;
imagen320
RELA; TLR4; MAPK14; IKBKG; RELB; MAP3K7; CHUK;
imagen321
NFKB1; TLR2; JUN
Señalización de p38 MAPK
HSPB1; IRAK1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; FADD; FAS;
imagen322
CREB1; DDIT3; RPS6KA4; DAXX; MAPK13; TRAF2;
imagen323
MAPK14; TNF; MAP3K7; TGFBR1; MYC; ATF4; IL1R1;
imagen324
SRF; STAT1
Señalización de Neurotrofina/TRK
NTRK2; MAPK1; PTPN11; PIK3CA; CREB1; FOS;
imagen325
PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; PIK3C2A;
imagen326
RAF1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
imagen327
CDC42; JUN; ATF4
Activación de FXR/RXR
INS; PPARA; FASN; RXRA; AKT2; SDC1; MAPK8;
imagen328
APOB; MAPK10; PPARG; MTTP; MAPK9; PPARGC1A;
imagen329
TNF; CREBBP; AKT1; SREBF1; FGFR4; AKT3; FOXO1
Potenciación sináptica
PRKCE; RAP1A; EP300; PRKCZ; MAPK1; CREB1;
a largo plazo
PRKCI; GNAQ; CAMK2A; PRKD1; MAPK3; KRAS;
imagen330
PRKCD; PPP1CC; RAF1; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1;
imagen331
ATF4; PRKCA
Señalización de calcio
RAP1A; EP300; HDAC4; MAPK1; HDAC5; CREB1;
imagen332
CAMK2A; MYH9; MAPK3; HDAC2; HDAC7A; HDAC11;
imagen333
HDAC9; HDAC3; CREBBP; CALR; CAMKK2; ATF4;
imagen334
HDAC6
Señalización de EGF
ELK1; MAPK1; EGFR; PIK3CA; FOS; PIK3CB; PIK3C3;
imagen335
MAPK8; MAPK3; PIK3C2A; RAF1; JAK1; PIK3R1;
imagen336
STAT3; MAP2K1; JUN; PRKCA; SRF; STAT1
Señalización de Hipoxia en el
EDN1; PTEN; EP300; NQO1; UBE2I; CREB1; ARNT;
Sistema Cardiovascular
HIF1A; SLC2A4; NOS3; TP53; LDHA; AKT1; ATM;
imagen337
VEGFA; JUN; ATF4; VHL; HSP90AA1
Inhibición mediada por LPS/IL-1
IRAK1; MYD88; TRAF6; PPARA; RXRA; ABCA1;
de función RXR
MAPK8; ALDH1A1; GSTP1; MAPK9; ABCB1; TRAF2;
imagen338
TLR4; TNF; MAP3K7; NR1H2; SREBF1; JUN; IL1R1
Activación de LXR/RXR
FASN; RXRA; NCOR2; ABCA1; NFKB2; IRF3; RELA;
imagen339
NOS2A; TLR4; TNF; RELB; LDLR; NR1H2; NFKB1;
imagen340
SREBF1; IL1R1; CCL2; IL6; MMP9
Proceso amiloide
PRKCE; CSNK1E; MAPK1; CAPNS 1; AKT2; CAPN2;
imagen341
CAPN1; MAPK3; MAPK13; MAPT; MAPK14; AKT1;
imagen342
PSEN1; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; APP
Señalización de IL-4
AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; IRS1; KRAS; SOCKS1;
imagen343
PTPN6; NR3C1; PIK3C2A; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen344
FRAP1; AKT3; RPS6KB1
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Regulación
EP300; PCAF; BRCA1; GADD45A; PLK1; BTRC;
Control de daño
CHEK1; ATR; CHEK2; YWHAZ; TP53; CDKN1A;
Ciclo celular: ADN G2/M
PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A
Señalización de óxido nítrico en el
KDR; FLT1; PGF; AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3;
Sistema Cardiovascular
CAV1; PRKCD; NOS3; PIK3C2A; AKT1; PIK3R1;
imagen345
VEGFA; AKT3; HSP90AA1
Metabolismo de Purina
NME2; SMARCA4; MYH9; RRM2; ADAR; EIF2AK4;
imagen346
PKM2; ENTPD1; RAD51; RRM2B; TJP2; RAD51C;
imagen347
NT5E; POLD1; NME1
Señalización mediada por cAMP
RAP1A; MAPK1; GNAS; CREB1; CAMK2A; MAPK3 ;
imagen348
SRC; RAF1; MAP2K2; STAT3; MAP2K1; BRAF; ATF4
Disfunción mitocondrial
SOD2; MAPK8; CASP8; MAPK10; MAPK9; CASP9;
imagen349
PARK7; PSEN1; PARK2; APP; CASP3
Señalización de Notch
HES1; JAG1; NUMB; NOTCH4; ADAM 17; NOTCH2;
imagen350
PSEN1; NOTCH3; NOTCH1; DLL4
Ruta del estrés del
HSPA5; MAPK8; XBP1; TRAF2; ATF6; CASP9; ATF4;
Retículo endoplasmático
EIF2AK3; CASP3
Metabolismo de pirimidina
NME2; AICDA; RRM2; EIF2AK4; ENTPD1; RRM2B;
imagen351
NT5E; POLD1; NME1
Señalización de Parkinson
UCHL1; MAPK8; MAPK13; MAPK14; CASP9; PARK7;
imagen352
PARK2; CASP3
Señalización
GNAS; GNAQ; PPP2R1A; GNB2L1; PPP2CA; PPP1CC;
Cardíaca y beta adrenérgica
PPP2R5C
Glucolisis/Gluconeogénesis
HK2; GCK; GPI; ALDH1A1; PKM2; LDHA; HK1
Señalización de interferón
IRF1; SOCS1; JAK1; JAK2; IFITM1; STAT1; IFIT3
Señalización Sonic Hedgehog
ARRB2; SMO; GLI2; DYRK1A; GLI1; GSK3B; DYRK1B
Metabolismo
PLD1; GRN; GPAM; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
Glicerofosfolípidos
imagen353
Degradación de fosfolípidos
PRDX6; PLD1; GRN; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
Metabolismo de triptofano
SIAH2; PRMT5; NEDD4; ALDH1A1; CYP1B1; SIAH1
Degradación de lisina
SUV39H1; EHMT2; NSD1; SETD7; PPP2R5C
Ruta
ERCC5; ERCC4; XPA; XPC; ERCC1
Reparación escisión de nucleótidos
imagen354
Metabolismo de
UCHL1; HK2; GCK; GPI; HK1
Almidón y sacarosa
imagen355
Metabolismo de aminoazúcares
NQO1; HK2; GCK; HK1
Metabolismo de
PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
Ácido araquidónico
imagen356
Señalización de ritmo circadiano
CSNK1E; CREB1; ATF4; NR1D1
Sistema de coagulación
BDKRB1; F2R; SERPINE1; F3
imagen357
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Receptor de Dopamina
PPP2R1A; PPP2CA; PPP1CC; PPP2R5C
Señalización
imagen358
Metabolismo de glutatión
IDH2; GSTP1; ANPEP; IDH1
Metabolismo de glicerolípidos
ALDH1A1; GPAM; SPHK1; SPHK2
Metabolismo de ácido linoleico
PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
Metabolismo de Metionina
DNMT1; DNMT3B; AHCY; DNMT3A
Metabolismo de piruvato
GLO1; ALDH1A1; PKM2; LDHA
Metabolismo de
ALDH1A1; NOS3; NOS2A
Arginina y Prolina
imagen359
Señalización Eicosanoide
PRDX6; GRN; YWHAZ
metabolismo de
HK2; GCK; HK I
Fructosa y Manosa
imagen360
Metabolismo de Galactosa
HK2; GCK; HK1
Biosíntesis de estilbeno,
PRDX6; PRDX1; TYR
cumarina y lignina
imagen361
Ruta de
CALR; B2M
Presentación de antígenos
imagen362
Biosíntesis de esteroides
NQO1; DHCR7
Metabolismo de Butanoato
ALDH1A1; NLGN1
Ciclo del Citrato
IDH2; IDH1
Metabolismo de ácidos grasos
ALDH1A1; CYP1B1
Metabolismo de
PRDX6; CHKA
Glicerofosfolípidos
imagen363
Metabolismo de Histidina
PRMT5; ALDH1A1
Metabolismo de Inositol
ERO1L; APEX1
Metabolismo de xenobióticos
GSTP1; CYP1B1
por citocromo p450
imagen364
Metabolismo de metano
PRDX6; PRDX1
Metabolismo de fenilalanina
PRDX6; PRDX1
Metabolismo de Propanoato
ALDH1A1; LDHA
Metabolismo de
PRMT5; AHCY
Selenoaminoácido
imagen365
Metabolismo de esfingolípidos
SPHK1; SPHK2
Aminofosfonato
PRMT5
Metabolismo
imagen366
Andrógenos y estrógenos
PRMT5
Metabolismo de
imagen367
Ascorbato y Aldarato
ALDH1A1
Metabolismo de
imagen368
Biosínteis de ácidos biliares
ALDH1A1
imagen369
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Metabolismo de cisteína
LDHA
Biosínteis de ácidos grasos
FASN
Receptor de Glutamato
GNB2L1
Señalización de
imagen370
Respuesta de estrés
PRDX1
Oxidativa mediada por NRF2
imagen371
Ruta de
GPI
Pentosa fosfato
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Interconversiones de
UCHL1
Pentosa y Glucuronato
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Metabolismo de Retinol
ALDH1A1
Metabolismo de Riboflavina
TYR
Metabolismo de tirosina
PRMT5, TYR
Biosíntesis de Ubiquinona
PRMT5
Degradación de Valina, Leucina e
ALDH1A1
Isoleucina
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Metabolismo de Glicina, Serina y
CHKA
Treonina
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Degradación de lisina
ALDH1A1
dolor/sabor
TRPM5; TRPA1
dolor
TRPM7; TRPC5; TRPC6; TRPC1; Cnr1; cnr2; Grk2;
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Trpa1; Pomc; Cgrp; Crf; Pka; Era; Nr2b; TRPM5; Prkaca;
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Prkacb; Prkar1a; Prkar2a
Función mitocondrial
AIF; CytC; SMAC (Diablo); Aifm-1; Aifm-2
Neurología de desarrollo
BMP-4; Chordin (Chrd); Noggin (Nog); WNT (Wnt2;
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Wnt2b; Wnt3a; Wnt4; Wnt5a; Wnt6; Wnt7b; Wnt8b;
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Wnt9a; Wnt9b; Wnt10a; Wnt10b; Wnt16); beta-catenin;
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Dkk-1; proteínas relacionadas con Frizzled; Otx-2; Gbx2; FGF-8;
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Reelin; Dab1; unc-86 (Pou4f1 or Brn3a); Numb; Reln
Las realizaciones de la descripción también se refieren a métodos y composiciones relacionadas con eliminación de genes, la multiplicación de genes y reparación de mutaciones particulares asociadas a la inestabilidad de repeticiones de ADN y trastornos neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and
5 Neurological Diseases, Segunda Edición, Academic Press 13 de octubre de 2.011-Medical). Aspectos específicos de secuencias de repetición en tándem se han encontrado responsable de más de veinte enfermedades humanas (Nuevos conocimientos en la inestabilidad de la repetición: función de híbridos de ARN·ADN. McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. Sep-Oct 2.010; 7 (5): 551-8). El sistema CRISPR-Cas puede ser aprovechado para corregir estos defectos de inestabilidad genómica.
10 Un aspecto más de la descripción se refiere a la utilización del sistema CRISPR-Cas para corregir defectos en los genes EMP2A y EMP2B que se ha identificado que están asociados a la enfermedad Lafora. La enfermedad de Lafora es un trastorno autosómico recesivo que se caracteriza por epilepsia mioclónica progresiva que puede empezar como ataques epilépticos en la adolescencia. Algunos casos de la enfermedad pueden estar causados por mutaciones en genes que se tienen que identificar sin embargo. La enfermedad produce ataques, espasmos
15 musculares, dificultad para caminar, demencia y eventualmente la muerte. En la actualidad no hay tratamiento que se haya demostrado eficaz contra el progreso de la enfermedad. Otras anormalidades genéticas asociadas a la epilepsia también pueden ser fijadas como objetivo mediante el sistema CRISPR-Cas y la genética subyacente se describe además en Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology: 20; 2.009).
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En otro aspecto más de la descripción, el sistema CRISPR-Cas puede ser usado para corregir defectos oculares que surgen de mutaciones genéticas diversas descritas además en Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edición, 5 editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2.012.
Diversos aspectos adicionales de la descripción se refieren a corregir defectos asociados a un amplio intervalo de enfermedades genéticas que se describen además en la página web del Instituto Nacional para la Salud bajo la subsección tópica Trastornos Genéticos (sitio web: health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). Las enfermedades cerebrales genéticas pueden incluir pero no se limitan a, Adrenoleucodistrofia, Angenesia del Cuerpo Calloso, 10 Síndrome de Aicardi, Enfermedad de Alper, Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Barth, Enfermedad de Batten, CADASIL, Degeneración Cerebelar, Enfermedad de Fabry, Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Enfermedad de Huntington y otros Trastornos de Triple Repetición, Enfermedad de Leigh, Síndrome de Lesch-Nyhan, Enfermedad de Menkes, Miopatías Mitocondriales y Colpocefalia de NINDS (por sus siglas en inglés). Estas enfermedades se describen además en la página web del Instituto Nacional de la Salud bajo la subsección
15 Trastornos Cerebrales Genéticos.
En algunas realizaciones, la afección puede ser neoplasia. En algunas realizaciones, donde la afección es neoplasia, los genes que se tienen que fijar como objetivo son cualquiera de los enumerados en la Tabla A (en este caso PTEN etc). En algunas realizaciones, la afección puede ser Degeneración Macular Relacionada con la Edad. En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno Esquizofrénico. En algunas realizaciones, la afección 20 puede ser un trastorno de Repetición del Trinucleótido. En algunas realizaciones, la afección puede ser Síndrome de Frágil X. En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno Relacionado con la Secretasa. En algunas realizaciones, la afección puede ser un trastorno relacionado con el Prión. En algunas realizaciones, la afección puede ser ALS (por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, la afección puede ser una drogadicción. En algunas realizaciones, la afección puede ser Autismo. En algunas realizaciones, la afección puede ser Enfermedad
25 de Alzheimer. En algunas realizaciones, la afección puede ser inflamación. En algunas realizaciones, la afección puede ser Enfermedad de Parkinson.
Ejemplos de proteínas asociadas a la enfermedad de Parkinson incluyen pero no se limitan a α-sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, Synphilin-1 y NURR1.
Ejemplos de proteínas relacionadas con la adicción pueden incluir ABAT por ejemplo.
30 Ejemplos de proteínas relacionadas con la inflamación pueden incluir la proteína quimioatrayente de monocitos -1 (MCP1) codificada por el gen Ccr2, el receptor de quimiocina C-C tipo 5 (CCR5) codificada por el gen Ccr5, el receptor IIB de IgG (FCGR2b, también denominado CD32) codificada por el gen Fcgr2b o la proteína de R1g Fc épsilon (FCER1g) codificada por el gen Fcer1g, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a enfermedades cardiovasculares pueden incluir IL1B (interleucina 1, beta), XDH
35 (xantina deshidrogenasa), TP53 (proteína tumoral p53), PTGIS (prostaglandina I2 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de unión a ATP, sub-familia G (WHITE), miembro 8) o CTSK (catepsina K), por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a la enfermedad de Alzheimer pueden incluir la proteína receptora de lipoproteína de densidad muy baja (VLDLR, por sus siglas en inglés) codificada por el gen VLDLR, la enzima activadora de
40 modificador de tipo ubiquitina 1 (UBA1) codificada por el gen UBA1 o la proteína de subunidad catalítica de enzima E1 activadora de NEDD8 (UBE1C) codificada por el gen UBA3, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a Trastorno por Espectro Autista pueden incluir la proteína 1 asociada a receptor de benzodiazapina (periférica) (BZRAP1) codificada por el gen BZRAP1, la proteína del miembro 2 de la familia AF4/FMR2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (también denominado MFR2), la proteína de homólogo 1 autosómico
45 de retraso mental frágil X (FXR1) codificada por el gen FXR1 o la proteína de homólogo 2 autosómico del retraso mental frágil X (FXR2) codificada por el gen FXR2, por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas a Degeneración Macular pueden incluir la casete de unión de ATP, proteína del miembro 4 (ABCA4) de la sub-familia A (ABC 1) codificada por el gen ABCR, la proteína apolipoproteína E (APOE) codificada por el gen APOE o la proteína de Ligando 2 (CCL2) de quimiocina (unidad C-C) codificada por el
50 gen CCL2, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a Esquizofrenia pueden incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B y combinaciones de las mismas.
Ejemplos de proteínas implicadas en la supresión de tumores pueden incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), EGFR (receptor de factor de crecimiento epidérmico), ERBB2 55 (homólogo 2 de oncogén vírico de leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB3 (homólogo 3 de oncogén vírico de leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB4 (homólogo 4 de oncogén vírico de leucemia eritroblástica v-erb-b2), Notch
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1, Notch2, Notch 3 o Notch 4, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a trastorno de la secretas pueden incluir PSENEN (homólogo de estimulador 2 de presenilina (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora de amiloide beta (A4)), APH1B (homólogo B defectuoso 1 anterior de la faringe (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (enfermedad de
5 Alzheimer 4)) o BACE1 (enzima 1 de escisión de APP de sitio beta), por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas a Esclerosis Lateral Amiotrófica pueden incluir SOD1 (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (proteína de unión de ADN TAR), VAGFA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquier combinación de los mismos.
10 Ejemplos de proteínas asociadas a enfermedades por priones pueden incluir SOD1 (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (proteína de unión de ADN TAR), VAGFA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquier combinación de los mismos.
Los ejemplos de proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas en trastornos por priones pueden
15 incluir A2M (Alfa-2-Macroglobulina), AATF (Factor de transcripción de antagonización de muerte celular programada), ACPP (fosfatasa ácida prostática), ACTA2 (Actina alfa 2 de músculo liso aorta), ADAM22 (dominio de la metalopeptidasa ADAM), ADORA3 (Receptor de adenosina A3) o ADRA1D (Receptor adrenérgico Alfa-1D para adrenoreceptor Alfa-1D), por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas a Inmunodeficiencia pueden incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT
20 [arilalquilamina N-acetiltransferasa]; ABCA1 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 1]; ABCA2 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 2] o ABCA3 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 3]; por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a Trastornos de Repetición del Trinucleótido incluyen AR (receptor de andrógeno), FMR1 (retraso mental 1 frágil X), HTT (huntingtina) o DMPK (distrofia miotónica-proteína cinasa), FXN (frataxina),
25 ATXN2 (ataxina 2), por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a Trastornos de Neurotransmisión incluyen SST (somatostatina), NOS1 (óxido nítrico sintasa 1 (neuronal)), ADRA2A (receptor alfa-2A-adrenérgico), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), TACR1 (receptor de taquicinina 1) o HTR2c (receptor 2C de 5-hidroxitriptamina (serotonina)), por ejemplo.
Ejemplos de secuencias asociadas al neurodesarrollo incluyen A2BP1 [proteína 1 de unión de ataxina 2], AADAT
30 [aminoadipato aminotransferasa], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa], ABAT [4-aminobutirato aminotransferasa], ABCA1 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 1] o ABCA13 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 13], por ejemplo.
Más ejemplos de trastornos preferidos tratables con el presente sistema se pueden seleccionar de: Síndrome de Aicardi-Goutières; Enfermedad de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos Relacionados con 35 POLG; Alfa-Manosidosis (Tipo II y III); Síndrome de Alström; Angelman; Síndrome; Ataxia-Telangiectasia; Lipofuscinosis Ceroide Neuronal; Beta-Talasemia; Atrofia Óptica Bilateral y Atrofia Óptica (Infantil) Tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Síndrome 1 Cerebroculofacioesquelético [COFS1]; Xantomatosis Cerebrotendinosa; Síndrome de Cornelia de Lange; Trastornos Relacionados con MAPT; Enfermedades Genéticas por Priones; Síndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer Familiar de Comienzo 40 Temprano; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia Muscular Congénita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias Orgánicas; Linfohistiocitosis Hemofagocítica; Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico Libre Infantil; Neurodegeneración Asociada a PLA2G6; Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermolisis Bullosa sobre las Articulaciones; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); Síndrome de Leigh Asociado 45 al ADN Mitocondrial y NARP; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Asociada a LIS1; Síndrome de Lowe; Enfermedad Urinaria de Jarabe de Maple; Síndrome de Duplicación de MECP2; Trastornos de Transporte de Cobre Relacionado con ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada con LAMA2; Deficiencia de Arilsulfatasa A; Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de la Biogénesis del Peroxisoma, Espectro del Síndrome de Zellweger; Neurodegeneración con Trastornos de Acumulación de Hierro en el Cerebro; Deficiencia de 50 Esfingomielinasa Ácida; Enfermedad de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatía por Glicina; Trastornos Relacionados con ARX; Trastornos del Ciclo de la Urea; Osteogénesis Imperfecta Relacionada con COL1A1/2; Síndrome de Supresión de ADN Mitocondrial; Trastornos Relacionados con PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Enfermedad de Almacenamiento de Glucógeno Tipo II (Enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos Relacionados con MAPT; Trastornos Relacionados con MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomélica Tipo 1; 55 Síndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler -Tipo 1; Deficiencia de Adenosina Deaminasa; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinal; Ataxia Espinocerebelar de Comienzo Infantil; Deficiencia de Hexosaminidasa A; Displasia Tanatofórica de Tipo 1; Trastornos Relacionados con el Colágeno Tipo VI; Síndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia de Lipasa
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Ácida Lisosomal y Xerodermia Pigmentosa.
Como será evidente, se prevé que el presente sistema se pueda usar para fijar como objetivo cualquier secuencia de polinucleótidos de interés. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que se podían tratar positivamente usando el presente sistema se incluyen en las Tablas anteriores y también se proporcionan allí ejemplos de genes asociados en la actualidad a esas enfermedades. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos de diversas realizaciones de la invención y no están destinados a limitar la presente invención de ningún modo. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en la presente memoria son representativos en el momento presente de realizaciones preferidas, son ejemplares, y no se destinan a limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Actividad del complejo CRISPR en el núcleo de una célula eucariota.
Un sistema CRISPR de ejemplo de tipo II es el sitio CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, que contiene una agrupación de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, así como dos elementos de ARN no codificante, ARNtracr y una serie característica de secuencias repetitivas (repeticiones directas) inter espaciadas por tramos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, aproximadamente 30 pb cada uno). En este sistema, se genera rotura de doble cadena (RDC) de ADN fijado como objetivo en cuatro etapas secuenciales (Figura 2A). Primero, dos ARN no codificantes, la serie pre-ARNcr y ARNtracr, se transcriben del sitio CRISPR. Segundo, ARNtracr se hibrida a las repeticiones directas de pre-ARNcr, que se tratan después en ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. Tercero, el complejo ARNcr:ARNtracr maduro dirige Cas9 al ADN objetivo que consiste en el protoespaciador y la correspondiente PAM vía la formación de heterodúplex entre la región espaciadora del ARNcr y el ADN protoespaciador. Finalmente, Cas9 media la escisión de ADN objetivo aguas arriba de PAM para crear una RDC dentro del protoespaciador (Figura 2A). Este ejemplo describe un procedimiento de ejemplo para adaptar este sistema de nucleasa programable de ARN para dirigir la actividad del complejo CRISPR en el núcleo de las células eucariotas.
Cultivo celular y transfección
Se mantuvo la estirpe celular HEK 293FT de riñón embrionario humano (HEK, por sus siglas en inglés) (Life Technologies) en Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero fetal bovino al 10% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C con incubación en CO2 al 5%. Se mantuvo la línea celular neuro2A de ratón (N2A) (ATCC) con DMEM enriquecido con suero bovino fetal al 5% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37 ºC con incubación en CO2 al 5%.
Se sembraron células HEK 293FT o N2A en placas de 24 pozos (Corning) un día antes de la transfección con una densidad de 200.000 células por pozo. Se transfectaron las células usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada pozo de una placa de 24 pozos, se usó un total de 800 ng de plásmido.
Ensayo Surveyor y análisis de la secuenciación para modificación de genomas
Se transfectaron células 293FT o N2A con ADN de plásmido como se describió anteriormente. Después de la transfección, se incubaron las células a 37°C durante 72 horas antes de la extracción de ADN genómico. Se extrajo ADN genómico usando el kit de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se volvieron a suspender las células en solución QuickExtract y se incubaron a 65 °C durante 15 minutos y 98 °C durante 10 minutos. El ADN genómico extraído se proceso inmediatamente o se almacenó a -20 °C.
La región genómica que flanquea el sitio objetivo de CRISPR para cada gen se amplificó por PCR y se purificaron los productos usando una columna de QiaQuick Spin (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se mezclaron 400 ng totales de los productos de PCR purificados con 2 µl de tampón de PCR 10X ADN Taq Polimerasa (Enzymatics) y agua ultra pura hasta un volumen final de 20 µl y se sometieron a un procedimiento de rehibridación para permitir la formación de heteroduplex: 95°C durante 10 min, de 95°C a 85°C descendiendo a -2°C/s, de 85°C a 25°C a – 0,25°C/s y 25°C mantenidos durante 1 minuto. Después de la rehibridación, se trataron los productos con nucleasa Surveyor y estimulador S Surveyor (Transgenomics) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y se analizaron sobre geles de poliacrilamida Novex TBE al 4-20% (Life Technologies). Se tiñeron los geles con tinción de ADN SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos y se formaron imágenes con un sistema de formación de imágenes de gel Gel Doc (Bio-rad). La cuantificación estuvo basada en intensidades de banda relativas, como una medida de la fracción de ADN escindido. La Figura 7 proporciona una ilustración esquemática de este ensayo Surveyor.
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Ensayo de polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción para la detección de la recombinación homóloga.
Se transfectaron las células HEK293FT y N2A con ADN de plásmido y se incubaron a 37 °C durante 72 horas antes de la extracción de ADN genómico como se ha descrito anteriormente. La región genómica objetivo se amplificó por
5 PCR utilizando cebadores fuera de los brazos de homología de la plantilla de recombinación homóloga (HR). Se separaron los productos de la PCR sobre un gel de agarosa al 1% y se extrajeron con el kit MinElute GelExtraction (Qiagen). Los productos purificados se digirieron con HindIII (Fermentas) y se analizaron sobre un gel de poliacrilamida Novex TBE al 6% (Life Technologies).
Predicción y análisis de la estructura secundaria del ARN
10 Se realizó una predicción de la estructura secundaria del ARN utilizando el RNAfold webserver online, desarrollado en el Instituto para Química Teórica de la Universidad de Viena, usando el algoritmo de predicción de estructura centroide (véase, por ejemplo, A. R. Gruber et al., 2.008, Cell 106 (1): 23-24 y PA Carr y GM Church, 2.009, Nature Biotechnology 27 (12): 1.151-62).
Purificación de ARN
15 Se mantuvieron las células HEK 293FT y se transfectaron tal como se ha indicado anteriormente. Se recolectaron las células por tripsinización seguida por lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se extrajo el ARN celular total con el reactivo TRI (Sigma) siguiendo el protocolo del fabricante. Se cuantificó el ARN total extraído utilizando Naonodrop (Thermo Scientific) y se normalizó respecto a la misma concentración.
Análisis de Northern de la expresión de ARNcr y ARNtracr en células de mamífero
20 Se mezclaron los ARN con volúmenes idénticos de tampón de carga 2X (Ambion), se calentaron hasta 95 °C durante 5 min, se enfriaron en hielo durante 1min y después se añadieron a un gel de poliacrilamida desnaturalizado al 8% (SequaGel, National Diagnostics) después de haber pretratado el gel durante al menos 30 minutos. Las muestras se sometieron a electroforesis durante 1.5 horas con un límite de 40 W. Posteriormente, se transfirió el ARN a la membrana Hybond N+ (GE Healthcare) a 300 mA en un aparato de transferencia semiseco (Bio-rad) a
25 temperatura ambiente durante 1.5 horas. Se retículo el ARN a la membrana utilizando el botón de autorreticulación en Stratagene UV Crosslinker Stratalinker (Stratagene). La membrana se sometió a una hibridación previa en el tampón de hibridación ULTRAhyb-Oligo (Ambion) durante 30 min con rotación a 42 °C y a continuación se añadieron las sondas y se hibridó durante toda la noche. Se encargaron las sondas a IDT y se marcaron con [gamma-32P] ATP (Perkin Elmer) con la polinucleótido cinasa T4 (New England Biolabs). Se lavó la membrana una vez con 2xSSC
30 precalentado (42 °C), SDS al 0.5% durante 1 min seguido por dos lavados de 30 minutos a 42 °C. La membrana se expuso a una pantalla de luminiscencia durante una hora o toda la noche a temperatura ambiente y a continuación se realizó un barrido con un lector de luminiscencia fotoestimulada (Typhoon).
Construcción y evaluación del sistema CRISPR bacteriano
Se amplificaron mediante PCR los elementos del sitio de CRISPR incluidos el ARNtracr, Cas9 y el líder a partir del
35 ADN genómico de Streptococcus pyogenes SF370 con brazos de homología flanqueantes para el ensamblaje de Gibson. Se introdujeron dos sitios BsaI de tipo IIS entre dos repeticiones directas para facilitar la inserción sencilla de espaciadores (Figura 8). Se clonaron los productos de la PCR en pACYC184 digerido con EcoRV aguas abajo del promotor tet utilizando la Mezcla Maestra (Master Mix) para el ensamblaje de Gibson (NEB). Se omitieron otros elementos endógenos del sistema CRISPR, con la excepción de los últimos 50 pb de Csn2. Se clonaron los oligos
40 (Integrated DNA Technology) que codificaban espaciadores con regiones protuberantes complementarias en el vector pDC000 digerido con BsaI (NEB) y se ligaron a continuación con la ligasa T7 (Enzymatics) para generar los plásmidos pCRISPR. Los plásmidos de exposición que contienen espaciadores con expresión de PAM en células de mamífero (construcciones de expresión ilustradas en la Figura 6A, con funcionalidad cuando se determina por los resultados del ensayo de Surveyor mostrado en la Figura 6B). Los sitios de comienzo de la transcripción se señalan
45 como +1 y el terminador de la transcripción y la secuencia probada por el ensayo de northern se indican también. La expresión de ARNtracr tratado también se confirmó por ensayo de Northern. La Figura 6C muestra los resultados de un ensayo de Northern de ARN total extraído de células 293FT transfectadas con construcciones de expresión U6 que soportan ARNtracr largo o corto, así como SpCas9 y DR-EMX1(1)-DR. Los paneles izquierdo y derecho son de células 293FT transfectadas sin o con SpRNasa III, respectivamente. U6 indica control de carga representado
50 gráficamente con una sonda que fija como objetivo ARNsn U6 humano. La transinfección de la construcción de expresión de ARNtracr corto conduce a niveles abundantes de la forma tratada de ARNtracr (~75 pb). Se detectan
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cantidades muy bajas de ARNtracr largo en el análisis de Northern.
Para activar la iniciación precisa transcripcional, se seleccionó el activador de U6 basado en ARN polimerasa III para conducir la expresión de ARNtracr (Figura 2C). De manera similar, se desarrolló una construcción a base de activador U6 para expresar una serie pre-ARNcr que consiste en un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (las RD, también incluida por el término "secuencias de emparejamiento tracr"; Figura 2C). Se diseñó el espaciador inicial para fijar como objetivo un sitio objetivo de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb más una secuencia de unidad (PAM) CRISPR de 3 pb que satisface la unidad de reconocimiento NGG de Cas9) en el sitio EMX1 humano (Figura 2C), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.
Para ensayar si la expresión heteróloga del sistema CRISPR (SpCas9, SpRNasa III, ARNtracr y pre-ARNcr) en células de mamífero puede conseguir la escisión fijada como objetivo de cromosomas de mamífero, se transfectaron células HEK 293FT con combinaciones de componentes CRISPR. Puesto que las RDC en núcleos de mamífero se reparan parcialmente por la ruta de unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés), que conduce a la formación de inserciones o supresiones, se usó el ensayo Surveyor para detectar potencial actividad de escisión en el sitio EMX1 objetivo (Figura 7) (véase por ej., Guschin et al., 2.010, Methods Mol Biol 649: 247). La transinfección conjunta de los cuatro componentes CRISPR pudo inducir una escisión hasta del 5,0% en el protoespaciador (véase la Figura 2D). La transinfección conjunta de todos los componentes CRISPR menos SpRNasa III también indujo hasta 4,7% de inserción o supresión en el protoespaciador, que sugiere que puede haber Rnasas de mamífero endógenas que son capaces de ayudar a la maduración de ARNcr, tal como por ejemplo las enzimas Dicer y Drosha relacionadas. Retirar cualquiera de los tres componentes restantes anula la actividad de escisión del genoma del sistema CRISPR (Figura 2D). La secuenciación Sanger de amplicones que contiene el sitio fijado como objetivo verificó la actividad de escisión: en 43 clones secuenciados, se encontraron 5 alelos mutados (11,6%). Experimentos similares usando una variedad de secuencias guía produjeron porcentajes de inserción o supresión tan altos como 29% (véanse las Figuras 3-6, 10 y 11). Estos resultados definen un sistema de tres componentes para modificación de genomas mediada por CRISPR eficaz en células de mamífero. Para optimizar la eficacia de escisión, los solicitantes también ensayaron si diferentes isoformas de ARNtracr afectaban a la eficacia de la escisión y encontraron que, en este sistema de ejemplo, sólo la forma transcrita corta (89 pb) era capaz de mediar la escisión del sitio genómico EMX1 humano (Figura 6B).
La Figura 12 proporciona un análisis de Northern adicional de tratamiento de ARNcr en células de mamífero. La Figura 12A ilustra un esquema que muestra el vector de expresión para un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (RD-EMX1(1)-RD). El espaciador de 30 pb que fija como objetivo el protoespaciador 1 del sitio EMX1 humano (veáse la Figura 6) y las secuencias de repetición directa se muestran en la secuencia debajo de la Figura 12A. La línea indica la región cuya secuencia de complemento inverso se usó para generar sondas de Northern para detección de ARNcr de EMX1(1). La Figura 12B muestra un análisis Northern de ARN total extraído de células 293FT transfectadas con construcciones de expresión U6 que soportan RD-EMX1(1)-RD. Los paneles izquierdo y derecho son de células 293FT transfectadas sin o con SpRNasa III respectivamente. Se trató RDEMX1(1)-RD en ARNcr maduros sólo en presencia de SpCas9 y ARNtracr corto y no fue dependiente de la presencia de SpRNasa III. El ARNcr maduro detectado de ARN total de 293FT transfectado es ~33 pb y es más corto que el ARNcr maduro de 39-42 pb de S. pyogenes. Estos resultados demuestran que un sistema CRISPR se puede trasplantar en células eucariotas y reprogramar para facilitar la escisión de polinucleótidos objetivo de mamíferos endógenos.
La Figura 2 ilustra el sistema CRISPR bacteriano descrito en este ejemplo. La Figura 2A ilustra un esquema que muestra el sitio 1 de CRISPR de Streptococcus pyogenes SF370 y un mecanismo propuesto de escisión de ADN mediada por CRISPR por este sistema. El ARNcr maduro tratado de la serie repetición directa – espaciador dirige Cas9 a objetivos genómicos que constan de protoespaciadores complementario y una unidad adyacente al protoespaciador (PAM). En el emparejamiento de base objetivo-espaciador, Cas9 media una rotura de doble cadena en el ADN objetivo. La Figura 2B ilustra el logro de Cas9 de S. pyogenes (SpCas9) y RNasa III (SpRNasa III) con señales de localización nuclear (las NLS) para permitir la importación al núcleo del mamífero. La Figura 2C ilustra la expresión de mamífero de SpCas9 y SpRNasa III conducida por el activador EF1a constitutivo y ARNtracr y la serie pre-ARNcr (RD-Espaciador-RD) conducidos por el activador U6 de ARN Pol3 para activar iniciación y terminación de transcripción precisa. Un protoespaciador del sitio EMX1 humano con una secuencia PAM satisfactoria se usa como el espaciador en la serie pre-ARNcr. La Figura 2D ilustra ensayo de la nucleasa surveyor para inserciones y supresiones minoritarias mediadas por SpCas9. SpCas9 se expresó con y sin SpRNasa III, ARNtracr y una serie pre-ARNcr que soporta el espaciador objetivo EMX1. La Figura 2E ilustra una representación esquemática de emparejamiento de bases entre el sitio objetivo y ARNcr que fija como objetivo EMX1, así como un cromatograma de ejemplo que muestra una microsupresión adyacente al sitio de escisión de SpCas9. La Figura 2F ilustra alelos mutados identificados de análisis de secuenciación de 43 amplicones clonales que muestran una variedad de microinserciones y supresiones. Las líneas discontinuas indican bases suprimidas y bases no alineadas o emparejadas erróneamente indican inserciones o mutaciones. Barra de escala = 10 µm.
Para simplificar además el sistema de tres componentes, se adaptó un diseño híbrido de ARNcr-ARNtracr quimérico, donde un ARNcr maduro (que comprende una secuencia guía) se puede fusionar a un ARNtracr parcial vía un tallolazo para imitar el dúplex ARNcr:ARNtracr natural. Para incrementar la eficacia de cosuministro, se creó un vector de expresión bicistrónico para impulsar la coexpresión de un ARN quimérico y SpCas9 en células transfectadas. En
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paralelo, se utilizaron vectores bicistrónicos para expresar un pre-ARNcr (RD-secuencia guía-RD) con SpCas9 para inducir el procesamiento en ARNcr con un ARNtracr expresado por separado (compare la parte superior e inferior de la Figura 11B). La Figura 8 proporciona ilustraciones esquemáticas de vectores de expresión bicistrónicos para una serie de pre-ARNcr (Figura 8A) o ARNcr quimérico (representado por la línea corta aguas abajo del sitio de inserción 5 de la secuencia guía y aguas arriba del promotor EF1α en la Figura 8B) con hSpCas9, que muestra la ubicación de varios elementos y el punto de inserción de la secuencia guía. La secuencia expandida alrededor de la ubicación del sitio de inserción de la secuencia guía en la Figura 8B también muestra una secuencia RD parcial (GTTTTAGAGCTA) (SEQ ID NO: 11) y una secuencia de ARNtracr parcial (TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTT) (SEQ ID NO: 12). Las secuencias guía se pueden insertar entre los sitios BbsI utilizando oligonucleótidos hibridados. El diseño de la secuencia para los oligonucleótidos se muestra debajo de las ilustraciones esquemáticas de la Figura 8, indicándose los adaptadores de ligación apropiados. WPRE representa el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck. La eficacia de la escisión mediada por el ARN quimérico se estudió fijando como objetivo el mismo sitio de EMX1 descrito anteriormente. Utilizando tanto el ensayo Surveyor como la secuenciación de Sanger de los amplicones, los
15 solicitantes confirmaron que el diseño de ARN quimérico facilita la escisión del sitio de EMX1 humano con aproximadamente un 4.7% de tasa de modificación (Figura 3).
La posibilidad de generalizar la escisión mediada por CRISPR en células eucariotas se estudió fijando como objetivo sitios genómicos adicionales tanto en células de ratón como humanas diseñando ARN quimérico que tenía como objetivo múltiples sitios en  y PVALB humano, así como en los sitios Th de ratón. La Figura 13 ilustra la selección de algunos protoespaciadores fijados como objetivo en el PVLAB humano (Figura 13A) y sitios Th de ratón (Figura 13B). Se proporcionan los esquemas de los sitios génicos y la ubicación de tres protoespaciadores comprendidos en el último exón. Las secuencias subrayadas incluyen 30 pb de la secuenica protoespaciadora y 3 pb del extremo 3’ correspondientes a las secuencias PAM. Los protoespaciadores en las hebras transcrita y complementaria se indican por encima y por debajo de las secuencias de ADN, respectivamente. Se consiguió una
25 tasa de modificación de 6,3% y 0,75% para los sitios PVALB humano y Th de ratón, respectivamente, que demuestra la amplia aplicabilidad del sistema CRISPR en la modificación de diferentes sitios a través de múltiples organismos (Figura 5). Aunque la escisión sólo se detectó con uno de tres espaciadores para cada sitio usando las construcciones quiméricas, todas las secuencias objetivo se escindieron con eficacia de producción de inserción o supresión que alcanzó el 27% cuando se usó la disposición de pre-ARNcr expresada conjuntamente (Figuras 6 y 13).
La Figura 11 proporciona una ilustración más de que SpCas9 puede ser reprogramado para fijar como objetivo múltiples sitios genómicos en células de mamífero. La Figura 11A proporciona un esquema del sitio EMX1 humano que muestra la posición de cinco protoespaciadores, indicado por las secuencias subrayadas. La Figura 11B proporciona un esquema del complejo pre-ARNcr/ARNtrcr que muestra la hibridación entre la región de repetición
35 directa del pre-ARNcr y ARNtracr (parte superior) y un esquema de un diseño de ARN quimérico que comprende una secuencia guía de 20 pb y secuencias de emparejamiento tracr y tracr que consisten en secuencias de repetición directa parcial y ARNtracr hibridadas según la estructura de horquilla (fondo). Los resultados de un ensayo Surveyor comparando la eficacia de escisión mediada por Cas9 en cinco protoespaciadores en el sitio EMX1 humano se ilustra en la Figura 11C. Cada protoespaciador se fija como objetivo usando complejo preARNcr/ARNtracr tratado (ARNcr) o ARN quimérico (ARNqui).
Puesto que la estructura secundaria de ARN puede ser crucial para interacciones intermoleculares, se usó un conjunto de algoritmo de predicción de estructuras basado en energía libre mínima y estructura pesada de Boltzmann para comparar la estructura secundaria putativa de todas las secuencias guía usadas en el experimento de fijación como objetivo de genoma (véase por ej., Gruber et al., 2.008, Nucleic Acids Research, 36: W70). El
45 análisis reveló que en la mayoría de los casos, las secuencias guía eficaces en el contexto de ARNcr quimérico estaban sustancialmente exentas de unidades de estructura secundaria, mientras las secuencias guía ineficaces era más probable que formaran estructuras secundarias internas que podían evitar el emparejamiento de bases con el ADN de protoespaciador objetivo. Así es posible que la variabilidad en la estructura secundaria del espaciador puede impactar en la eficacia de la interferencia mediada por CRISPR cuando se usa un ARNcr quimérico.
Más diseños de vectores para SpCas9 se presentan en la Figura 22, que ilustra vectores únicos de expresión que incorporan un activador U6 ligado a un sitio de inserción para un oligo guía y un activador Cbh ligado a secuencia de codificación SpCas9. El vector que se muestra en la Figura 22b incluye una secuencia codificante ARNtracr unida a un promotor H1.
En el ensayo de bacterias, todos los espaciadores facilitaron interferencia de CRISPR eficaz (Figura 3C). Estos
55 resultados sugieren que puede haber factores adicionales que afecten a la eficacia de la actividad de CRISPR en células de mamífero.
Para investigar la especificidad de la escisión mediada por CRISPR, se analizó el efecto de mutaciones de único nucleótido en la secuencia guía sobre la escisión del protoespaciador en el genoma de mamífero usando una serie de ARNcr quiméricos que fijan como objetivo EMX1 con mutación de puntos únicos (Figura 3A). La Figura 3B ilustra los resultados de un ensayo de nucleasa Surveyor comparando la eficacia de la escisión de Cas9 cuando se empareja con diferentes ARN quiméricos mutantes. El emparejamiento erróneo de bases únicas hasta 12 pb 5' de la PAM sustancialmente anuló la escisión genómica por SpCas9, mientras los espaciadores con mutaciones en posiciones aguas arriba más lejos retuvieron la actividad frente al objetivo del protoespaciador original (Figura 3B). Además de la PAM, SpCas9 presenta especificidad de base única dentro de los últimos 12 pb del espaciador. Además, CRISPR es capaz de mediar la escisión genómica tan eficazmente como un par de nucleasas TALE
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5 (TALEN) fijando como objetivo el mismo protoespaciador EMX1. La Figura 3C proporciona un esquema que muestra el diseño de las TALEN que fijan como objetivo EMX1 y la Figura 3D muestra un gel Surveyor comparando la eficacia de TALEN y Cas9 (n=3).
Teniendo establecida una serie de componentes para conseguir edición de genes mediada por CRISPR en células de mamífero a través del mecanismo NHEJ con predisposición a errores, se ensayó la capacidad de CRISPR para 10 estimular la recombinación homóloga (RH), una ruta de reparación de genes de alta fidelidad para preparar mediciones precisas en el genoma. SpCas9 de tipo natural es capaz de mediar las RDC específicas del sitio, que se pueden reparar a través de tanto NHEJ como RH. Además, se logró una sustitución de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de SpCas9 para convertir la nucleasa en una nickasa (SpCas9n; ilustrado en la Figura 4A) (véase por ej., Sapranausaks et al., 2.011, Nucleic Acids Research, 39: 9.275; Gasiunas et al., 2.012, 15 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: E2579), de manera que el ADN genómico nickeado experimenta la reparación dirigida por homología de alta fidelidad (HDR, por sus siglas en inglés). El ensayo Surveyor confirmó que SpCas9n no generaba inserciones o supresiones en el objetivo del protoespaciador EMX1. Como se ilustra en la Figura 4B, la expresión conjunta de ARNcr quimérico que fija como objetivo EMX1 con SpCas9 produjo inserciones o supresiones en el sitio fijado como objetivo, mientras la expresión conjunta con SpCas9n no lo hizo (n=3). Por otra parte, la 20 secuenciación de 327 amplicones no detectó ninguna inserción o supresión inducida por SpCas9n. Se seleccionó el mismo sitio para ensayar RH mediada por CRISPR por transinfección conjunta de células HEK 293FT con el ARN quimérico que fija como objetivo EMX1, hSpCas9 o hSpCas9n, así como una plantilla de RH para introducir un par de sitios de restricción (HindIII y NheI) cerca del protoespaciador. La Figura 4C proporciona una ilustración en esquema de la estrategia de la RH, con posiciones relativas de puntos de recombinación y secuencias de 25 hibridación de cebadores (flechas). SpCas9 y SpCas9n por supuesto catalizaron la integración de la plantilla de RH en el sitio EMX1. La multiplicación por PCR de la región fijada como objetivo seguida por digestión de restricción con HindIII reveló productos de escisión correspondiendo a tamaños de fragmentos esperados (flechas en análisis de gel de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción mostrado en la Figura 4D), mediando SpCas9 y SpCas9n niveles similares de eficacias de la RH. Los solicitantes verificaron además RH usando secuenciación de Sanger de
30 amplicones genómicos (La Figura 4E). Estos resultados demuestran la utilidad de CRISPR para facilitar la inserción de genes fijados como objetivo en el genoma del mamífero. Dada la especificidad objetivo de 14 pb (12 pb del espaciador y 2 pb de la PAM) de SpCas9 de tipo natural, la disponibilidad de una nickasa puede reducir significativamente la probabilidad de modificaciones fuera de lo proyectado, puesto que las roturas de hebra única no son sustratos para la ruta NHEJ con predisposición a errores.
35 Las construcciones de expresión que imitan la arquitectura natural de sitios CRISPR con espaciadores formados (Figura 2A) se construyeron para ensayar la posibilidad de fijar como objetivo secuencias multiplexadas. Usando una única serie CRISPR codificando un par de espaciadores que fijan como objetivo EMX1 y PVALB, se detectó la escisión eficaz en ambos sitios (Figura 4F, que muestra tanto un diseño esquemático de la serie ARNcr como un análisis Surveyor mostrando la mediación eficaz de la escisión). La supresión fijada como objetivo de regiones
40 genómicas mayores a través de las RDC usando espaciadores frente a dos objetivos dentro de EMX1 espaciado por 119 pb también se ensayó y se detectó una eficacia de la supresión del 1,6% (3 de un total de 182 amplicones; Figura 4G). Esto demuestra que el sistema CRISPR puede mediar la edición multiplexada dentro de un único genoma.
Ejemplo 2: Modificaciones y alternativas del sistema CRISPR.
45 La capacidad para usar ARN para programar escisión de ADN específica de la secuencia define una nueva clase de herramientas de ingeniería del genoma para una variedad de aplicaciones de investigación e industriales. Diversos aspectos del sistema CRISPR se pueden mejorar además para aumentar la eficacia y la versatilidad de la fijación como objetivo de CRISPR. La actividad óptima de Cas9 puede depender de la disponibilidad de Mg2+ libre en niveles mayores que los presentes en el núcleo de los mamíferos (véase por ej., Jinek et al., 2.012, Science, 337: 816) y la
50 preferencia para una unidad de NGG inmediatamente aguas abajo del protoespaciador restringe la capacidad para fijar como objetivo de promedio cada 12 pb en el genoma humano (Figura 9, que evalúa tanto la hebra positiva como la negativa de las secuencias cromosómicas humanas). Algunas de estas restricciones se pueden superar explorando la diversidad de los sitios CRISPR a través del metagenoma microbiano (véase por ej., Makarova et al., 2.011, Nat Rev Microbiol, 9: 467). Otros sitios CRISPR pueden ser trasplantados en el medio celular de los
55 mamíferos mediante un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1. Por ejemplo, la Figura 10 ilustra la adaptación del sistema CRISPR de tipo II de CRISPR 1 de LMD-9 de Streptococcus thermophilus para la expresión heteróloga en células de mamífero para lograr la edición genómica mediada por CRISPR. La Figura 10A proporciona una ilustración esquemática de CRISPR1 de LMD-9 de S. thermophilus. La Figura 10B ilustra el diseño de un sistema de expresión para el sistema CRISPR de S. thermophilus. La hStCas9 codón-optimizada humana se
60 expresa utilizando un promotor EF1α constitutivo. Las versiones maduras de ARNtracr y ARNcr se expresan utilizando el promotor U6 para impulsar una iniciación de la transcripción precisa. Se ilustran las secuencias procedentes de ARNcr y ARNtracr maduros. Se utiliza una única base indicada por la “a” minúscula en la secuencia
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de ARNcr para eliminar la secuencia de poliU que actúa como un terminador transcripcional de la ARN pol III. La Figura 10C proporciona un esquema que muestra secuencias guía que tienen como objetivo el sitio de EMX1 humano. La Figura 10D muestra los resultados de la escisión mediada por hStCas9 en el sitio objetivo utilizando el ensayo Surveyor. Los espaciadores 1 y 2 del ARN guía indujeron un 14% y 6.4% respectivamente. El análisis 5 estadístico de la actividad de escisión a lo largo de réplicas biológicas en estos dos sitios protoespaciadores también se proporciona en la Figura 5. La Figura 14 proporciona un esquema de un protoespaciador adicional y la secuencia PAM correspondiente que son objetivos del sistema CRISPR de S. thermophilus en el sitio de EMX1 humano. Se resaltan dos secuencias protoespaciadoras y se indican sus secuencias PAM correspondientes que satisfacen el motivo NNAGAAW mediante el subrayado en 3’ respecto a la secuencia resaltada correspondiente. Ambos
10 protoespaciadores tienen como objetivo la secuencia antisentido.
Ejemplo 3: Algoritmo de selección de secuencias objetivo de muestra.
Se diseña un programa informático para identificar secuencias objetivo de CRISPR candidato en ambas cadenas de una secuencia de ADN de entrada basada en longitud deseada de secuencias guía y una secuencia de unidad CRISPR (PAM) para una enzima CRISPR especificada. Por ejemplo, los sitios objetivo para Cas9 de S. pyogenes, 15 con secuencias NGG de PAM, se pueden identificar por investigación para 5'-Nx-NGG-3' ambas en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. Asimismo los sitios objetivo para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, con secuencia NNAGAAW de PAM, se pueden identificar por investigación para 5'-Nx-NNAGAAW-3' ambos en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. Asimismo, los sitios objetivo para Cas9 de CRISPR3 de S. thermophilus, con secuencia NGGNG de PAM, se pueden identificar por investigación para
20 5'-Nx-NGGNG-3' ambos en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. El valor "x" en Nx puede ser fijado por el programa o especificado por el usuario, tal como 20.
Puesto que múltiples apariciones en el genoma del sitio objetivo de ADN pueden conducir a edición de genoma no especifica, después de identificar todos los sitios potenciales, el programa filtra secuencias basadas en el número de veces que aparecen en el genoma de referencia relevante. Para esas enzimas CRISPR para las cuales se 25 determina la especificidad de secuencia mediante una secuencia "simiente", tal como la 5’ de 11-12 pb de la secuencia PAM, incluyendo la propia secuencia PAM, la etapa de filtración puede estar basada en la secuencia simiente. Así, para evitar la edición en sitios genómicos adicionales, los resultados se filtran basándose en el número de apariciones de la secuencia simiente:PAM en el genoma relevante. Se puede permitir que el usuario elija la longitud de la secuencia simiente. También se puede permitir que el usuario especifique el número de apariciones 30 de la secuencia simiente:PAM en un genoma para fines de pase del filtro. El defecto es investigar secuencias únicas. El nivel de filtración se modifica cambiando tanto la longitud de la secuencia simiente como el número de apariciones de la secuencia en el genoma. El programa puede proporcionar además o como alternativa la secuencia de una secuencia guía complementaria a la secuencia o secuencias objetivo indicadas proporcionando el complemento inverso de la secuencia o secuencias objetivo identificadas. En la Figura 18 se proporciona una
35 visualización de ejemplo de algunos sitios objetivo en el genoma humano.
Ejemplo 4: Evaluación de híbridos ARNcr-ARNtracr quiméricos múltiples.
Este ejemplo describe los resultados obtenidos para los ARN quiméricos (los ARNqui; que comprenden una secuencia guía, una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr en un transcrito único) que tienen secuencias tracr que incorporan diferentes longitudes de secuencia ARNtracr de tipo natural. La Figura 16a ilustra 40 un esquema de un vector bicistrónico de expresión para ARN quimérico y Cas9. Cas9 es conducido por el activador CBh y el ARN quimérico es conducido por un activador U6. El ARN guía quimérico consta de una secuencia guía de 20 pb (Ns) unida a la secuencia tracr (barriendo desde la primera "U" de la hebra menor al extremo del transcrito), que se trunca en diversas posiciones como se indica. Las secuencias guía y tracr se separan mediante la secuencia de emparejamiento tracr GUUUUAGAGCUA (SEQ ID NO: 13) seguido por la secuencia lazo GAAA. Los resultados 45 de los ensayos SURVEYOR para inserciones o supresiones mediadas por Cas9 en los sitios EMX1 y PVALB humanos se ilustran en la Figura 16b y 16c, respectivamente. Las flechas indican los fragmentos SURVEYOR esperados. Los ARNqui se indican por su designación "+n" y ARNcr se refiere a un ARN híbrido donde las secuencias guía y tracr se expresan como transcritos separados. La cuantificación de estos resultados, realizados por triplicado, se ilustran por histograma en las Figuras 17a y 17b, que corresponden a las Figuras 16b y 16c,
50 respectivamente ("N. D." indica no inserciones o supresiones detectadas). Los ID del protoespaciador y su correspondiente objetivo genómico, secuencia del protoespaciador, secuencia PAM y posición de la cadena se proporcionan en la Tabla D. Las secuencias guía se diseñan para que sean complementarias a la secuencia completa del protoespaciador en el caso de transcritos separados en el sistema híbrido o sólo a la porción subrayada en el caso de ARN quiméricos.
55 Tabla D:
ID del protoespaciador
objetivo genómico secuencia del protoespaciador (5' a 3') PAM SEQ ID NO: Hebra
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Inicialmente, se fijaron como objetivo tres sitios dentro del sitio de EMX1 en células HEK 293FT humanas. Se evaluó la eficacia de la modificación del genoma de cada ARNqui usando el ensayo de la nucleasa SURVEYOR, que detecta mutaciones que resultan de las roturas de la doble cadena de ADN (las RDC) y su posterior reparación por 5 la ruta de reparación de daños de ADN de unión del extremo no homólogo (NHEJ). Las construcciones designadas ARNqui(+n) indican que hasta el nucleótido +n de ARNtracr de tipo natural se incluye en la construcción de ARN quimérico, con valores de 48, 54, 67 y 85 usados para n. Los ARN quiméricos que contienen fragmentos mayores de ARNtracr de tipo natural (ARNqui (+67) y ARNqui (+85)) mediaron la escisión de ADN en los tres sitios objetivo de EMX1, demostrando ARNqui (+85) en particular niveles significativamente mayores de escisión de ADN que los
10 correspondientes híbridos ARNcr/ARNtracr que expresaron secuencias guía y tracr en transcritos separados (Figuras 16b y 17a). También se fijaron como objetivo dos sitios en el sitio PVALB que no proporcionaron escisión detectable usando el sistema híbrido (secuencia guía y secuencia tracr expresadas como transcritos separados) usando ARNquis. ARNqui(+67) y ARNqui(+85) fueron capaces de mediar escisión significativa en los dos protoespaciadores PVALB (Figuras 16c y 17b).
15 Para los cinco objetivos en los EMX1 y PVALB, se observó un incremento consistente en la eficacia de modificación del genoma con longitud creciente de la secuencia tracr. Sin desear estar limitados por ninguna teoría, la estructura secundaria formada por el extremo 3' de la ARNtracr puede desempeñar una función en la activación de la tasa de formación de complejo CRISPR.
Ejemplo 5: Diversidad de Cas9
20 El sistema CRISPR-Cas es un mecanismo inmunitario adaptativo contra ADN exógeno invasor empleado por varias especies de bacterias y arqueas. El sistema CRISPR-Cas9 de tipo II está constituido por un conjunto de genes que codifican proteínas causantes de la "adquisición" de ADN foráneo en el sitio de CRISPR, así como también por un conjunto de genes que codifican la "ejecución" del mecanismo de escisión del ADN; estos incluyen la ADN nucleasa (Cas9), un ARNcr transactivante no codificante (ARNtracr) y una serie de espaciadores derivados del ADN foráneo
25 flanqueados por repeticiones directas (ARNcr). Tras la maduración mediante Cas9, la estructura dúplex ARNtracr y ARNcr guía a la nucleasa Cas9 a una secuencia de ADN objetivo especificada por las secuencias guía espaciadoras y media en la doble rotura de cadena en el ADN cerca de un motivo con una secuencia corta en el ADN diana que se requiere para la escisión y que es específica de cada sistema CRISPR-Cas. Los sistemas de CRISPR-Cas de tipo II se hallan repartidos por todo el reino bacteriano y son sumamente diversos en la secuencia y tamaño de la
30 proteína Cas9, secuencia de repeticiones directas de ARNcr y ARNtracr, organización genómica de estos elementos y requisitos del motivo de la escisión diana. Otras especies podrán tener múltiples sistemas CRISPR-Cas diferentes.
Los solicitantes evaluaron 207 Cas9s putativas procedentes de especies bacterianas identificadas en función de la homología secuencial con Cas9s conocidas y estructuras ortólogas a subdominios conocidos, incluidos el dominio de la endonucleasa HNH y los dominios de la endonucleasa RuvC [información procedente de Eugene Koonin y Kira
35 Makarova]. Los análisis filogenéticos en función de la conservación de la secuencia proteica de este conjunto reveló cinco familias de Cas9s, incluidos tres grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeñas (~1100 aminoácidos) (remítase a las Figuras 19 y 20A-F).
Ejemplo 6: Ortólogos de Cas9
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[00630] Los solicitantes analizaron ortólogos de Cas9 para identificar las secuencias PAM relevantes y el ARN guía quimérico correspondiente. Tener un conjunto expandido de PAM proporciona la posibilidad de tener más objetivos a lo largo del genoma y también incrementa significativamente el número de sitios objetivo únicos y proporciona la posibilidad de identificar Cas9s novedosas con mayores niveles de especificidad en el genoma.
La especificidad de los ortólogos de Cas9 se puede evaluar estudiando la capacidad de cada Cas9 de tolerar emparejamientos erróneos entre el ARN guía y su ADN objetivo. Por ejemplo, se ha caracterizado la especificidad de SpCas9 estudiando el efecto de mutaciones del ARN guía en la eficacia de escisión. Se obtuvieron colecciones de ARN guía con emparejamientos erróneos únicos o múltiples entre la secuencia guía y el ADN objetivo. En función de estas observaciones, se pueden seleccionar los sitios objetivo de SpCas9 en función de las siguientes directrices:
Para maximizar la especificidad de SpCas9 para editar un gen particular, se debería escoger un sitio objetivo dentro del sitio de interés de modo que las secuencias genómicas "fuera del objetivo" potenciales cumplieran los siguientes cuatro requisitos: En primer lugar, y sobre todo, no deben estar seguidas por una PAM con secuencias 5’-NGG o NAG. En segundo lugar, su similaridad secuencial global respecto a la secuencia diana deberá minimizarse. En tercer lugar, un número máximo de emparejamientos erróneos debería situarse dentro de la región próxima a PAM del sitio fuera del objetivo. Finalmente, un número máximo de emparejamientos erróneos deberán ser consecutivos
o estar separados por menos de cuatro bases.
Se pueden utilizar métodos similares para evaluar la especificidad de otros ortólogos de Cas9 y para establecer el criterio para la selección de sitios diana específicos dentro de los genomas de especies objetivo. Como se ha mencionado anteriormente, los análisis filogenéticos en función de la conservación de la secuencia proteica de este conjunto reveló cinco familias de Cas9s, incluidos tres grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeñas (~1100 aminoácidos) (remítase a las Figs. 19 y 20A-F).
Ejemplo 7: Ingeniería de plantas (microalgas) utilizando Cas9 para tener como objetivo genes de plantas y manipularlos
Métodos de suministro de Cas9
Método 1: Los solicitantes suministran Cas9 y un ARN guía utilizando un vector que exprese Cas9 controlado por un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o Beta2-tubulina.
Método 2: Los solicitantes suministran Cas9 y una polimerasa T7 utilizando vectores que expresen Cas9 y la polimerasa T7 controlados por un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o Beta2-tubulina. Los ARN guía se suministrarán utilizando un vector que contenga el promotor T7 que impulsa el ARN guía.
Método 3: Los solicitantes suministran ARNm de Cas9 y ARN guía transcrito in vitro a células de algas. El ARN se puede transcribir in vitro. El ARNm de Cas9 estará constituido por la región codificante de Cas9 así como también la UTR 3' de Cop1 para garantizar la estabilización del ARNm de Cas9.
Para la recombinación homóloga, los solicitantes proporcionan una plantilla de reparación dirigida por homología adicional.
Secuencia para un casete que impulse la expresión de Cas9 controlada por el promotor de la beta-2 tubulina, seguido por la UTR 3' de Cop1.
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Secuencia para un casete que impulse la expresión de la polimerasa T7 controlada por el promotor de la beta-2 tubulina, seguido por la UTR 3' de Cop1:
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Secuencia de ARN guía impulsada por el promotor T7 (promotor T7, Ns que representa la secuencia de direccionamiento):
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Suministro de genes:
Se utilizarán para la electroporación las cepas CC-124 y CC-125 de Chlamydomonas reinhardtii del Centro de Recursos de Chlamydomonas. El protocolo de electroporación sigue el protocolo estándar recomendado por el kit 5 de ingeniería de Chlamydomonas de GeneArt.
Asimismo, los solicitantes generan una línea de Chlamydomonas reinhardtii que expresa Cas9 constitutivamente. Esto se puede realizar utilizando pChlamy1 (linealizada utilizando PvuI) y seleccionando las colonias resistentes a higromicina. A continuación se muestra la secuencia de pChlamy1 que contiene Cas9. De esta manera, para lograr genes inactivados únicamente se necesita suministrar el ARN para el ARNguía. Para la recombinación homóloga los
10 solicitantes suministran ARNguía así como también una plantilla de recombinación homóloga linealizada.
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Para todas las células de Chlamydomonas reinhardtii modificadas, los solicitantes utilizan PCR, el ensayo con nucleasa SURVEYOR y la secuenciación de ADN para verificar el éxito en la modificación.
Aunque se han presentado realizaciones preferidas de la presente invención y se han descrito en la presente
5 memoria, será evidente para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan como ejemplo solamente. Ahora tendrán lugar numerosas variaciones, cambios y sustituciones para los expertos en la materia sin apartarse de la invención. Se debería entender que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria en la práctica de la invención.
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Claims (11)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un sistema vector asociado a CRISPR -Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR) (Cas) (CRISPR-Cas) que no se encuentran en la naturaleza, de ingeniería, que comprende uno o más vectores que comprenden:
    5 a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más ARN guía del sistema CRISPR-Cas que se hibridan con secuencias objetivo en los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota, donde el ARN guía comprende una secuencia guía, una secuencia tracr y una secuencia de emparejamiento tracr,
    b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de nucleótidos que codifica una 10 proteína Cas9 de Tipo II, comprendiendo dicha proteína una secuencia de localización nuclear (NLS);
    en el que los componentes (a) y (b) están situados en los mismos vectores o diferentes vectores del sistema,
    en el que la secuencia tracr tiene una longitud de 30 o más nucleótidos, y
    según lo cual uno o más ARN guía fijan como objetivo los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota y la proteína Cas9 escinde los sitios de los polinucleótidos, según lo cual se modifica la secuencia de los sitios de los 15 polinucleótidos; y en el que la proteína Cas9 y uno o más ARN guía no se encuentran juntos en la naturaleza.
  2. 2. Un sistema vector CRISPR-Cas de Tipo II, que no se encuentra en la naturaleza, de ingeniería, según la reivindicación 1,
    en el que la proteína Cas9 comprende una o más mutaciones en un dominio catalítico, de modo que la proteína Cas9 mutada carece de la capacidad para escindir una hebra de los sitios del polinucleótido y es una nickasa.
    20 3. El sistema de la reivindicación 1 o 2, en el que los vectores son vectores víricos.
  3. 4.
    El sistema de la reivindicación 3, en el que los vectores víricos son vectores víricos retrovíricos, lentivíricos, adenovíricos, adenoasociados o de herpes simple.
  4. 5.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que la proteína Cas9 comprende una o más mutaciones en los dominios catalíticos RuvC I, RuvC II o RuvC III.
    25 6. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que la proteína Cas9 comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en D10A, H840A, N854A y N863A con referencia a la numeración de la posición de una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9).
  5. 7. El sistema de cualquier reivindicación precedente, en el que el ARN guía es un ARN quimérico que comprende la secuencia guía, la secuencia tracr y una secuencia de emparejamiento tracr.
    30 8. El sistema de la reivindicación 7, en el que la hibridación entre la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr produce un transcrito que tiene una estructura secundaria.
  6. 9.
    El sistema de la reivindicación 8, en el que la estructura secundaria es una horquilla.
  7. 10.
    El sistema de cualquier reivindicación precedente, en el que la célula eucariota es una célula de mamífero o una célula humana.
    35 11. El sistema de cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína Cas9 es codón-optimizada para la expresión en una célula eucariota.
  8. 12. El sistema de cualquier reivindicación precedente, en el que se inserta una plantilla de reparación en los sitios del polinucleótido escindidos.
  9. 13. El uso del sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-12: 40 a) para una inactivación génica específica del sitio;
    60
    imagen2
    b) para una edición genómica específica del sitio;
    c) para una interferencia específica de la secuencia de ADN; o
    d) para una ingeniería del genoma multiplexada;
    siempre que el uso no comprenda un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres 5 humanos; y
    en el que el uso i) es in vitro o ex vivo; o ii) no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
  10. 14. El uso de la reivindicación 13 en el que el uso comprende además reparar dicho polinucleótido fijado como objetivo escindido mediante recombinación homóloga con un polinucleótido de plantilla exógeno, en el que dicha
    10 reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido objetivo.
  11. 15. El uso del sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en la producción de un animal no humano transgénico o una planta transgénica, siempre que el uso no sea un método para el tratamiento del cuerpo animal mediante terapia.
    15
    61
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