ES2552687T3

ES2552687T3 - Partículas alfavíricas y métodos de preparación

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Publication number: ES2552687T3
Application number: ES03813433.4T
Authority: ES
Inventors: Jonathan F. Smith; Kurt Kamrud; Sergey Dryga; Harold Alterson; Jon Rayner; Kim Alterson; Maureen F. Maughan
Original assignee: Alphavax Inc
Current assignee: Alphavax Inc
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2015-12-01
Anticipated expiration: 2023-12-12
Also published as: JP5727420B2; EP2290054B1; BR122019005271B1; US20040166573A1; BRPI0317276B1; JP5079981B2; US7078218B2; CA2509979C; DK2290054T3; AU2003297041B2; EP1590451A4; IL169076A; HK1082524A1; ES2890023T3; BR0317276A; ES2630222T3; CA2807515C; DK1590451T3; ZA200505517B; EP3246399A1

Abstract

Un método para preparar partículas de replicón alfavírico (ARP) portadoras de mutaciones que confieren la capacidad de unión a glicosaminoglicano en células de mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) introducir un ácido nucleico de replicón alfavírico en una célula hospedadora permisiva de alfavirus, comprendiendo dicho ácido nucleico de replicón al menos una señal de empaquetamiento vírico y al menos una secuencia de codificación heteróloga expresable en dicho ácido nucleico de replicón alfavírico, en el que dicha célula hospedadora comprende al menos una función colaboradora, produciendo una célula hospedadora modificada; (b) cultivar dicha célula hospedadora modificada en condiciones que permitan la expresión de la al menos una función colaboradora, que permite la replicación de dicho ácido nucleico de replicón alfavírico y el empaquetamiento de dicho ácido nucleico de replicón alfavírico, formando ARP; (c) poner en contacto las células hospedadoras modificadas después de la etapa (b) con una disolución acuosa de lavado salino que tiene una fuerza iónica de 0,5 a 5 M para liberar las ARP con capacidad de unión a glicosaminoglicano en la disolución acuosa, produciendo una disolución que contiene ARP; (d) recoger las ARP de la disolución que contiene ARP de la etapa (c), seguido de cromatografía de afinidad con heparina.

Description

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tienen un amplio intervalo de hospedadores. Los ejemplos de células de empaquetamiento adecuadas incluyen, pero sin limitación, células Vero, células de riñón de hámster recién nacido (BHK), fibroblastos de embrión de pollo, DF-1, 293, 293T, células de ovario de hámster chino (CHO) y células de insecto.

Las frases “proteína estructural” o “proteína estructural alfavírica” como se usan en la presente memoria hacen referencia a una o más de las proteínas codificadas por alfavirus que son necesarias para empaquetar el replicón de ARN, e incluyen típicamente la proteína de cápsida, glicoproteína E1 y glicoproteína E2 en los alfavirus maduros (ciertos alfavirus, tales como virus del bosque Semliki, contienen una proteína adicional, E3, en la cubierta madura). El término “proteína o proteínas estructurales alfavíricas” hace referencia a una o una combinación de proteínas estructurales codificadas por alfavirus. Estas se sintetizan (a partir del genoma vírico) en forma de una poliproteína y se representan generalmente en la bibliografía como C-E3-E2-6k-E1. E3 y 6k sirven como señales de translocación/transporte de membrana para las dos glicoproteínas E2 y E1. Por tanto, el uso del término E1 en la presente memoria puede hacer referencia a E1, E3-E1, 6k-E1 o E3-6k-E1, y el uso del término E2 en la presente memoria puede hacer referencia a E2, E3-E2, 6k-E2 o E3-6k-E2.

Como se describe en la presente memoria, las proteínas estructurales del alfavirus se distribuyen entre una o más moléculas de ácido nucleico colaborador (p.ej., un primer ARN (o ADN) colaborador y un segundo ARN (o ADN) colaborador)). Además, una o más proteínas estructurales pueden estar localizadas en la misma molécula que el ácido nucleico de replicón, a condición de que se elimine al menos una proteína estructural del ARN de replicón de tal modo que el replicón y la partícula alfavírica resultante sean defectivos de replicación. Como se usa en la presente memoria, los términos “eliminado” o “deleción” significan la deleción total del segmento especificado o la deleción de una porción suficiente del segmento especificado para volver el segmento inoperativo o no funcional, de acuerdo con la utilización estándar. Véase, p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.650.764 de Ternin et al. El término “defectivo de replicación” como se usa en la presente memoria es sinónimo de “defectivo de propagación” y significa que las partículas producidas en una célula hospedadora dada no pueden producir partículas de progenie en la célula hospedadora debido a la ausencia de la función colaboradora, concretamente las proteínas estructurales alfavíricas necesarias para empaquetar el ácido nucleico de replicón. Sin embargo, el ácido nucleico de replicón es capaz de replicarse a sí mismo y expresarse en la célula hospedadora en que se ha introducido.

La célula colaboradora, a la que se hace referencia también como célula de empaquetamiento, usada para producir las partículas alfavíricas infecciosas defectivas de replicación debe expresar o ser capaz de expresar proteínas estructurales alfavíricas suficientes para empaquetar el ácido nucleico de replicón. Las proteínas estructurales pueden producirse a partir de un conjunto de ARN, típicamente dos, que se introducen en la célula colaboradora simultáneamente a o antes de la introducción del vector de replicón. El primer ARN colaborador incluye ARN que codifica al menos una proteína estructural alfavírica pero que no codifica todas las proteínas estructurales alfavíricas. El primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la glicoproteína E1 alfavírica pero que no codifica la proteína de cápsida alfavírica y la glicoproteína E2 alfavírica. Como alternativa, el primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la glicoproteína E2 alfavírica pero que no codifica la proteína de cápsida alfavírica y la glicoproteína E1 alfavírica. En una realización adicional, el primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la glicoproteína E1 alfavírica y la glicoproteína E2 alfavírica pero no la proteína de cápsida alfavírica. En una cuarta realización, el primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la cápsida alfavírica pero ninguna de las glicoproteínas alfavíricas. En una quinta realización, el primer ARN colaborador puede comprender ARN que codifica la cápsida y una de las glicoproteínas, concretamente E1 o E2, pero no ambas.

En combinación con uno cualquiera de estos primeros ARN colaboradores, el segundo ARN colaborador codifica al menos una proteína estructural alfavírica no codificada por el primer ARN colaborador. Por ejemplo, cuando el primer ARN colaborador codifica solo la glicoproteína E1 alfavírica, el segundo ARN colaborador puede codificar una

o ambas de la proteína de cápsida alfavírica y la glicoproteína E2 alfavírica. Cuando el primer ARN colaborador codifica solo la proteína de cápsida alfavírica, el segundo ARN colaborador puede incluir ARN que codifica una o ambas de las glicoproteínas alfavíricas. Cuando el primer ARN colaborador codifica solo la glicoproteína E2 alfavírica, el segundo ARN colaborador puede codificar una o ambas de la proteína de cápsida alfavírica y la glicoproteína E1 alfavírica. Cuando el primer ARN colaborador codifica tanto la cápsida como la glicoproteína E1 alfavírica, el segundo ARN colaborador puede incluir ARN que codifica una o ambas de la proteína de cápsida alfavírica y la glicoproteína E2 alfavírica.

En todos los ácidos nucleicos colaboradores, se entiende que estas moléculas comprenden adicionalmente las secuencias necesarias para la expresión (que engloban señales de traducción y, cuando sea apropiado, transcripción o replicación) de las secuencias de proteína estructural codificadas en las células colaboradoras. Dichas secuencias pueden incluir, por ejemplo, promotores (víricos, procarióticos o eucarióticos, inducibles o constitutivos) y secuencias de reconocimiento de replicasa vírica 5’ y 3’. En el caso de que los ácidos nucleicos colaboradores expresen una o más glicoproteínas, se entiende en la materia que estas secuencias se expresan ventajosamente con una secuencia líder o señal en el extremo N de la región de codificación de la proteína estructural en los constructos de ácido nucleico. La secuencia líder o señal puede derivar del alfavirus, por ejemplo E3 o 6k, o puede ser una secuencia heteróloga tal como un péptido señal de activador de plasminógeno de tejido o una secuencia sintética. Por tanto, como ejemplo, el primer ácido nucleico colaborador puede ser una molécula de ARN que codifica cápsida-E3-E1, y el segundo ácido nucleico colaborador puede ser una molécula de ARN que codifica cápsida-E3-E2. Como alternativa, el primer ARN colaborador puede codificar la cápsida sola, y el segundo

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disolución acuosa de lavado salino que tiene una fuerza iónica de 0,5 a 5 M (en la presente memoria el “medio de liberación”) para liberar las ARP y producir una disolución que contiene ARP y (d) recolectar las ARP de la disolución que contiene ARP de la etapa (c) seguido de cromatografía de afinidad con heparina.

La etapa (c) se efectúa con una disolución acuosa de lavado salino medio de liberación, y el rendimiento de “lavado salino” de ARP (concretamente las ARP recolectadas en el medio del liberación) será en parte función de la duración del tiempo que las células estén expuestas a medio de liberación. Este periodo de tiempo puede ser de 1 minuto a varias horas; de 5 a 20 minutos es típico. En una realización preferida, se usa una disolución de sal 0,5 M y se incuban las células en esta disolución durante aproximadamente 5 minutos. La combinación óptima de concentración salina en el medio de liberación y tiempo de incubación puede determinarse directamente por un especialista en la materia, y será adicionalmente función del tipo celular y del dispositivo de soporte celular.

La sorprendente observación de que muchas de las ARP se retienen por las células proporciona la oportunidad de lavar las células concienzudamente antes de la liberación de las ARP de las células a una disolución que contiene sal, reduciendo así significativamente la necesidad de purificación posterior de las ARP. Se usan eficazmente por tanto monocapas celulares como matriz de afinidad para las ARP.

Por tanto, en una realización preferida, se cultivan las células como se describe en la etapa (b) anterior, en un contenedor tal como un matraz de cultivo celular, botella rotatoria, dispositivo de Cell-cube, recipiente de cultivo (incluyendo biorreactor y matraz de agitación) con perlas para crecimiento celular adherido, o un dispositivo de fibra hueca, en que las células se dejan incubar de aproximadamente 12 a 48 horas, preferiblemente 16-24 horas, generando ARP. En caso de que se utilicen células de mamífero, las células se adhieren típicamente a las superficies internas del contenedor u otro soporte sólido incluyendo, pero sin limitación, perlas, partículas de poliestireno, fibras huecas y similares, y después del periodo de incubación necesario, se retira deseablemente el medio de cultivo (se decanta, aspira o similar) de las células y se reserva o desecha, separando así las células hospedadoras modificadas del medio de cultivo celular. Como alternativa, pueden centrifugarse las células que crecen en cultivo en suspensión para retirar las células del medio de crecimiento. Pueden lavarse entonces las células extensamente en una disolución de “lavado celular”, que es un medio bajo en sal o que no contiene sal que contiene opcionalmente componentes adicionales para ayudar a retirar materiales externos, p.ej. una preparación de ADNasa u otros productos químicos que retiran el ADN celular o proteinasas residuales. Es una ADNasa comercialmente disponible la benzonasa, una desoxirribonucleasa de Serratia marcescens disponible en Novagen/EMD Biosciences, Madison, WI (véase también la patente de EE.UU. nº 5.173.418). Puede incorporarse al medio después de la electroporación a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 1.000 unidades/ml. Cuando la ADNasa, p.ej. benzonasa, se incorpora a la preparación de ARP, se usa a una concentración de 100 a 5.000 unidades por ml, deseablemente a aproximadamente 500 unidades por ml, con incubación a 30 a 37 ºC durante 10 a 90 minutos, deseablemente aproximadamente 30 minutos. Se presentan en la Figura 4 ejemplos de medios de liberación útiles (disoluciones de lavado celular para la liberación de ARP unidas). Estos resultados indican que la disolución de lavado celular puede optimizarse para cada combinación de cepa alfavírica y célula para maximizar la retención de las ARP (o partículas alfavíricas) por el sustrato celular y minimizar su liberación en el medio antes de la adición del medio de liberación. Al maximizar la retención de ARP por las células, puede no ser eficaz ni económico recolectar los números mucho menores de partículas presentes en el medio de cultivo celular.

Después de este extenso lavado, se exponen entonces las células al medio de liberación y se liberan las ARP en el medio a partir de las células hospedadoras. El medio de liberación es una disolución acuosa de lavado salino que contiene sal de 0,50 M a 5 M, y es típicamente un volumen mucho menor que el volumen de medio en que se hicieron crecer las células, p.ej. una reducción de volumen de 10 a 50 veces. Puede contener componentes adicionales tales como ADNasa (particularmente si no se usó en la disolución de lavado celular) y estabilizantes, p.ej. HSA y sacarosa. La temperatura de la etapa de liberación no es crítica, se han obtenido resultados similares a 4 ºC, temperatura ambiente y 37 ºC. Se obtienen resultados similares con lavados salinos (en medio de liberación) de 10 a 30 min.

El medio de liberación puede elaborarse a la fuerza iónica deseada con sales que incluyen, pero sin limitación, NaCl, KCI, MgCl2, CaCl2, NH4Cl, sulfato de NH4, acetato de NH4 y bicarbonato de NH4. Deseablemente, el pH del medio de liberación es compatible con el mantenimiento de la integridad celular, p.ej. de aproximadamente 6 a aproximadamente 9,0, o de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5. En realizaciones específicas, el uso de sales volátiles en el medio de liberación tales como sales de amonio volátiles, especialmente acetato o bicarbonato de amonio, permite liofilizar la disolución que contiene ARP resultante, con el resultado de que se retira la sal de la preparación de ARP concentrada.

Se ensayaron en varias sales sus capacidades de facilitar la recolección y recuperación de ARP de células Vero a las 16 h y 24 horas después de la electroporación. NaCl 1 M a pH 7,2, acetato de amonio 1 M a pH 7,35, bicarbonato de amonio 1 M a pH 7,4, cloruro de magnesio 1 M a pH 7,2, acetato de sodio 1 M a pH 7,35 y sulfato de amonio 1 M a pH 7,35 dieron todos resultados equivalentes y buenos. Aumentar la concentración salina en el medio de liberación de 0,5 a 5 M no afectaba al rendimiento de ARP. Usar una concentración hacia la menor cantidad eficaz evitaba la necesidad de cargar grandes volúmenes diluidos en los medios cromatográficos. Fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, fosfato de sodio 20 mM a pH 6,5, fosfato de sodio 50 mM a pH 7,2 y fosfato de sodio 20 mM a pH

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Se usaron ARN colaboradores sin caperuza para generar ARP en células Vero, CHO, DF-1 y 293T. Las ARP generadas con colaboradores de ARN sin caperuza eran equivalentes en título a las ARP generadas con colaboradores de ARN con caperuza en todos los tipos celulares ensayados (Figura 1). La capacidad de usar moléculas de ARN colaboradores sin caperuza permite significativos ahorros de costes en términos de reactivos y rendimiento de ARN. En contraposición, los rendimientos eran mayores para ARN de replicón con caperuza que para ARN de replicón sin caperuza. Las caperuzas pueden incluir la caperuza G, caperuza C, caperuza A, G metilada (m7G(5’ppp(5’)pppG(5)A); G no metilada (G(5’ppp(5’)A); ARCA (análogo de caperuza antiinverso, 3-O-Me-m7G(5’)pppG(5); los reactivos de caperuza son bien conocidos en la materia y están comercialmente disponibles, por ejemplo, en Promega, Madison, WI y Ambion; Austin, TX. El coste de la producción de ARN disminuye significativamente debido a que el reactivo análogo de caperuza es un componente caro del proceso y porque cada reacción de transcripción procura más ARN.

Al comparar los resultados con ARN purificados y no purificados en electroporación, se determinó que era necesaria una purificación de ARN al menos parcial (usando kits comercialmente disponibles y métodos que incluyen, pero sin limitación, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía en columna de sílice o LiCl) para unos buenos rendimientos de ARP. La purificación retira moléculas tales como EDTA, HEPES y TRIS (constituyentes comunes en la manipulación de ácido nucleico), que son conocidos por causar efectos perjudiciales sobre las eficacias de transfección obtenidas por electroporación (véase, p.ej., el manual de instrucciones de Brinkmann Instruments), así como los componentes del tampón de transcripción usado para generar los ARN (véase el Ejemplo 2). Las preparaciones de ácido nucleico usadas en la electroporación están preferiblemente a una relación de A260/A280 de aproximadamente 1,7 a 1,9 y se suspenden en agua destilada antes de la electroporación. La purificación de ARN tiene la ventaja añadida de lograr una concentración de las disoluciones de ARN. Con un menor volumen para la disolución de ARN que se va a añadir a las células en el medio de electroporación, pueden usarse más células en la electroporación. Sin desear ligarse a teoría particular alguna, se cree que la retirada del catión de Mg divalente o la reducción del catión divalente de Mg a una concentración menor de 5 mM antes de la electroporación mejora el rendimiento de ARP definitivo.

Puede usarse un único colaborador de ADN para producir ARP cuando se electropora junto con el ARN de replicón alfavírico portador de la secuencia de interés. Aunque las electroporaciones de onda cuadrada y onda exponencial daban resultados similares, cuanto mayor es la pureza del colaborador de ADN mejor es el rendimiento de ARP. Se encontró que era preferible un menor voltaje (con una mayor capacitancia) para introducir eficazmente las moléculas de ADN en las células, en comparación con introducir solo moléculas de ARN.

Después de haber recogido las ARP de las células por lavado salino, y recogido opcionalmente del sobrenadante exento de células, pueden purificarse las ARP mediante una o más etapas que incluyen, pero sin limitación, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad con heparina. La cromatografía de heparina parece funcionar con varias de las proteínas estructurales alfavíricas mutantes atenuadas incorporadas a las ARP, pero no para las proteínas estructurales del virus VEE 3000.

Es un alfavirus preferido para uso en la presente invención el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). Preferiblemente, la cepa de VEE usada para producir las ARP contiene al menos una mutación atenuante. Como clase representativa de dichas mutaciones atenuantes, se diseñaron primero como mutantes “de penetración rápida” (Johnston y Smith, Virology 162: 437-443, 1988), muchos de los cuales se mostró después que portaban mutaciones en la glicoproteína E2 que daban como resultado una carga positiva neta (Davis et al., Virology 183: 20-31, 1991) y conferían también una capacidad potenciada de unirse a glicosaminoglicanos, p.ej. sulfato de heparano (véanse también Klimstra, WB et al. 1998 72: 7357-7366; Bernard et al., Virology 276: 93-103, 2000). Son conocidas mutaciones similares en otros alfavirus, p.ej. Sindbis (Olmsted et al., Virology 148: 245, 1986; Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6771, 1986); es un mutante de VEE atenuado de unión a heparina específicamente ejemplificado la cepa 3014. Los virus o las ARP derivadas de los mismos portan mutaciones que confieren la capacidad de unión a glicosaminoglicanos y son particularmente bien adecuados para purificación usando la etapa de lavado salino, y pueden purificarse adicionalmente también usando cromatografía de afinidad con heparina.

Las células colaboradoras, en el contexto de esta invención, son células que, cuando están presentes ácidos nucleicos colaboradores y de replicón en las mismas, producen partículas de replicón alfavírico. Pueden usarse también para empaquetar ARP células en que las funciones colaboradoras están codificadas en una o más secuencias integradas establemente. Puede introducirse el ADN o ARN mediante cualquier medio conocido en la materia que sea apropiado para el tipo particular de célula, incluyendo sin limitación, transformación, lipofección o electroporación. Como alternativa, pueden usarse también las células transformadas establemente en que los genes estructurales necesarios para el empaquetamiento del ácido nucleico de replicón en partículas víricas están integrados en el genoma para preparar ARP usando los métodos dados a conocer en la presente memoria.

Se reconoce por los especialistas en la materia que las secuencias de codificación pueden variar debido a la degeneración del código genético y la utilización de codones. Están incluidas dentro del alcance de esta invención todas las secuencias sinónimas que codifican el antígeno u otro polipéptido o proteína de interés.

Adicionalmente, se reconoce por los especialistas en la materia que pueden aparecer variaciones alélicas en las secuencias de codificación que no cambien significativamente la actividad de las secuencias aminoacídicas de los

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Concentración celular en células/ml; unidad relativa: Volumen de medios o lavado salino Rendimiento de ARP Rendimiento de ARP total (lavado salino + medios)

30 ml de lavado salino nº 1: 1,1 x 109

30 ml de lavado salino nº 2: 4,5 x 108 2,2 x 109

1,2 x 108 8x: 225 ml de medios 3,2 x 108

30 ml de lavado salino nº 1: 2,4 x 109

30 ml de lavado salino nº 2: 1,2 x 109 3,9 x 109

1,5 x 108 10x: 300 ml de medios 4,8 x 108

60 ml de lavado salino nº 1: 3,8 x 109

60 ml del lavado salino nº 2: 1,4 x 109 5,7 x 109

Por tanto, un aumento de 5 veces de la concentración celular, sin ningún aumento de la cantidad de ARN usada en la electroporación, da como resultado un aumento de casi 10 veces del rendimiento de ARP.

B. Empaquetamiento de ARP con un único colaborador de ADN

Se resuspendieron células Vero en medio exento de suero InVitrus a las densidades celulares indicadas. Se electroporaron las células usando 30 µg de un ARN de replicón de gag de VIH de VEE y 100-150 µg de colaborador de ADN de VEE que expresa todas las proteínas estructurales de VEE bajo un promotor CMV. Se purificó el colaborador de ADN y se concentró a al menos 5 mg/ml antes de usar en electroporación.

Después de la electroporación, se incubaron las células durante 10 minutos a temperatura ambiente y se transfirieron entonces a 4 ml de OptiPro, que se dividió entonces equitativamente en dos matraces T300 que contenían cada uno 100 ml de OptiPro. Se incubaron las células durante una noche a 37 ºC y 5 % de CO2. Se recolectaron las ARP aspirando en primer lugar los medios de las células y pasándolos a través de un filtro de 0,2 µm a un envase estéril. Se lavaron las células en el matraz durante 5 minutos a temperatura ambiente con 10 ml de una disolución de NaCl 1 M en NaPi 20 mM, pH 7,2-7,4. Se transfirió el lavado salino al filtro usado y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se pasó este lavado salino a través del filtro a un envase limpio y separado de los medios. Se mantuvieron y titularon separadamente medios y lavado salino. Las UI totales, reseñadas en la Tabla 4, representan la suma de lavado salino y medios; generalmente, los medios contenían un numero insignificante de ARP en comparación con el lavado salino. Se obtuvieron resultados similares usando una disolución de lavado salino de NaCl 0,5 M.

C. Experimento 3

Se usó un Cell Cube de Corning (Corning, Inc., Acton, MA) para hacer crecer una gran cantidad de células. Se efectuó una única electroporación usando 5 x 108 células Vero en una cubeta de electroporación de 1 cm de paso. Se electroporaron 150 µg de cada uno de replicón de VEE (que codifica gag de VIH), colaborador de cápsida de VEE y colaborador de glicoproteína de VEE en las células usando 4 pulsos a 1150 V, 25 µF en un electroporador Bio-Rad (Gene Pulser II, BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA; nº de catálogo 165-2105). Después de la electroporación, se sembraron las células en 5 matraces T-300 que contenían 100 ml de OptiPro SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA; nº de catálogo 12309019). 24 horas después de la electroporación, se recogieron los medios de cada matraz y se combinaron para titulación. Se efectuó entonces un lavado salino en cada matraz usando 20 ml de NaCl 1,0 M en cada matraz, y se combinaron los lavados salinos para titulación. El rendimiento total de ARP en los medios era de 1 x 108 u.i.; el rendimiento total de ARP en el lavado salino era de 2,2 x 1011 u.i.

Ejemplo 4. Parámetros de cultivo después de electroporación

A. Medio de crecimiento después de electroporación

En los informes anteriores de producción de ARP, se siembran las células en medio que contiene FBS al 10 % después de la electroporación. Para examinar los efectos del suero sobre el rendimiento de ARP, se sembraron células en diferentes medios con concentraciones variables de suero. Un medio después de electroporación óptimo

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Medios: Lavado salino

30 µg de ARN de cápsida truncado/Optipro: 1,50 x 109 9,00 x 1010

90 µg de ARN de cápsida truncado/Optipro: 2,36 x 109 8,30 x 1010

Ejemplo 6. Colaborador de ADN y condiciones de electroporación

Típicamente, se necesitan cantidades mayores de ADN y condiciones de electroporación algo diferentes para obtener la electroporación eficaz de colaboradores de ADN en células Vero, en comparación con las cantidades y

5 condiciones usadas para colaboradores de ARN. Por ejemplo, se electroporan los colaboradores de ADN usando 250 V, 950 µF o 2-3 pulsos (30 ms) a 250 V, 800 µF, mientras que se electroporan los colaboradores de ARN usando 580 V, 25 µF (cuatro pulsos).

Como con el ARN, el colaborador de ADN (o colaboradores) se purifican deseablemente antes de la electroporación. Se llevó a cabo la electroporación en una cubeta de electroporación de 0,4 cm de paso con 1 x 108 células Vero y un 10 único colaborador de ADN que codifica todas las proteínas estructurales de VEE usando dos dispositivos de electroporación diferentes. La primera máquina proporciona un pulso de voltaje inicial que decae exponencialmente. Usando 100 o 150 µg de ADN (de una disolución purificada a una concentración de al menos 5 mg/ml), es un conjunto útil de condiciones un único pulso a 250 V, 950 µF, que suministra un pulso de aproximadamente 20 a 30 ms. La capacitancia puede reducirse, p.ej. a 800 µF, y 2-3 pulsos a 250 V proporcionan aproximadamente el mismo 15 rendimiento de ARP. En una segunda máquina que suministra el voltaje en forma de una onda cuadrada, un pulso de entre 20 y 50 ms a 300 V proporcionó resultados similares a la primera máquina. Este procedimiento puede optimizarse para todos los tipos celulares variando longitud de pulso, forma, voltaje, capacitancia y número. Las células Vero típicamente no sobreviven a un pulso de 25 ms superior a 400 V. Puesto que estas condiciones son más duras que las necesarias para suministrar el ARN de replicón de vector, se electroporan las partículas

20 preparadas usando un colaborador de ADN en las condiciones optimizadas para ADN, y el ARN de replicón de vector entra en las células eficazmente en estas condiciones.

Se electroporaron 108 células en 0,8 ml usando 30 µg de un ARN de replicón de gag de VIH de VEE y 150 µg de colaborador de ADN de VEE que expresa todas las proteínas estructurales de VEE bajo el control regulador de un promotor CMV. Después de la electroporación, se manipularon las células, se recogieron las ARP, se titularon como

25 se describe anteriormente y se muestran los resultados en la tabla siguiente.

Tabla 6. Condiciones de electroporación y rendimiento de ARP

Voltaje (V): Capacitancia (mF) Nº de pulsos UI totales

250: 950 1 5,2 x 106

300: “ 1 3,9 x 106

350: “ 1 2,9 x 106

400: “ 1 0

450: “ 1 0

“
“: 1 0

250: 800 2 5,2 x 106

“
“: 3 4,3 x 106

350: 650 2 0

“
“: 3 1,4 x 106

250: 950 2 4,7 x 106

Se observa que, en el experimento para el que se presentan los datos anteriores, se cree que la pureza insuficiente de la preparación de colaborador de ADN es responsable de los rendimientos globales relativamente bajos, pero 30 estos datos documentan los efectos relativos de los parámetros de electroporación.

Ejemplo 7. Sincronización de células para la producción de ARP

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