JP2000514290A - 組換えアデノウイルスの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、パッケージング細胞培養物にウイルスＤＮＡを導入し、産生したウイルスを上清中に放出後に回収することを特徴とする、組換えアデノウイルスの製造方法に関する。本発明は製造したウイルスとその使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えアデノウイルスの製造方法 本発明は組換えアデノウイルスの新規製造方法に関する。本発明は前記方法に より製造した精製ウイルス調製物にも関する。 アデノウイルスは遺伝子治療で遺伝子導入用ベクターとして使用するのに特に 有利な所定の性質をもつ。特に、宿主範囲が非常に広く、休止細胞に感染させる ことができ、感染細胞のゲノムに取込まれず、今日までヒトで重要な疾病に関連 付けられていない。従って、アデノウイルスは目的遺伝子を筋（Ｒａｇｏｔら， Ｎａｔｕｒｅ ３６１（１９９３）６４７）、肝（Ｊａｆｆｅら，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １（１９９２）３７２）、神経系（Ａｋｌｉら，Ｎａｔｕ ｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３（１９９３）２２４）等に導入するために使用され ている。 アデノウイルスは約３６ｋｂ（キロベース）のサイズの直鎖状２本鎖ＤＮＡを もつウイルスである。そのゲノムは特に、各末端の逆方向反復配列（ＩＴＲ）と 、パッケージング配列（Ｐｓｉ）と、初期遺伝子と、後期遺伝子を含む。主要な 初期遺伝 子はＥ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４領域に含まれる。このうち、Ｅ１領域に含まれる 遺伝子は特にウイルス増殖に必要である。主要な後期遺伝子はＬ１〜Ｌ５領域に 含まれる。アデノウイルスＡｄ５のゲノムは完全に配列決定されており、データ ベースから入手できる（特にＧｅｎｅｂａｎｋ Ｍ７３２６０参照）。更に、他 のアデノウイルスゲノム（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２等）も部分的又は完全に配 列決定されている。 遺伝子治療で使用するために、種々の治療用遺伝子を組込んだ種々のアデノウ イルス由来ベクターが作製されている。これらの構築物の各々で、アデノウイル スは感染細胞で複製できないように改変されている。例えば、従来技術に記載さ れている構築物は、ウイルス複製に必須のＥ１領域を欠失し、このレベルに異種 ＤＮＡ配列を挿入したアデノウイルスである（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １ ０１（１９９１）１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｇｅｎｅ ５０（ １９８６） １６１）。また、ベクターの性質を改良するために、アデノウイル スのゲノム内に他の欠失又は変異を形成することも提案されている。例えば、７ ２ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を不活化できるように、突然変異株 ｔｓ１２５に感熱性点突然 変異が導入されている（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔら，１９７５）。この他、 ウイルス複製及び／又は増殖に必須の別の領域であるＥ４領域の欠失を含むベク ターもある。Ｅ４領域は実際に後期遺伝子の発現の調節、後期核ＲＮＡの安定性 、宿主細胞のタンパク質発現の減弱及びウイルスＤＮＡの複製効率に関与してい る。従って、Ｅ１及びＥ４領域を欠失するアデノウイルスベクターは転写バック グラウンドノイズとウイルス遺伝子発現が非常に低い。このようなベクターは例 えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＰＣＴ／ＦＲ９６ ／０００８８に記載されている。更に、ＩＶａ２遺伝子のレベルに変異をもつベ クターも記載されている（ＷＯ９６／１００８８）。 文献に記載されている組換えアデノウイルスは種々の血清型のアデノウイルス から製造されている。実際に、構造と性質は少しずつ異なるが、類似の遺伝子地 図をもつ種々の血清型のアデノウイルスが存在する。より詳細には、組換えアデ ノウイルスはヒト又は動物起源であり得る。ヒト起源のアデノウイルスについて は、Ｃ亜属に分類されるもの、特に２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、７（Ａｄ７） 又は１２（Ａｄ１２）型のアデノウ イルスを好適例として挙げることができる。動物起源の種々のアデノウイルスの うちでは、イヌ起源のアデノウイルス、特に全アデノウイルスＣＡＶ２株［例え ばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］を挙げること ができる。動物起源の他のアデノウイルスは、参考資料として本明細書の一部と する国際出願ＷＯ９４／２６９１４に特に記載されている。 本発明の１好適実施態様では、組換えアデノウイルスはＣ亜属のヒトアデノウ イルスである。アデノウイルスＡｄ２又はＡｄ５が特に好ましい。 組換えアデノウイルスは、パッケージング系即ち組換えアデノウイルスゲノム における欠損機能の１個以上をトランス相補することが可能な細胞系で作製され る。これらの細胞系の１例は例えば、アデノウイルスのゲノムの一部を組み込ん だ２９３系である。より詳細には、２９３系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５ ）のゲノムの左側末端（約１１〜１２％）を含むヒト胎児腎細胞であり、左側Ｉ ＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａとＥ１ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質 をコードする領域及びｐＩＶａ２タンパク質をコードする領域の一部を含む。こ の系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイ ルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを産生する ことができる。この系は、感熱性Ｅ２突然変異を更に含むウイルスストックを許 容温度（３２℃）で産生することもできる。Ｅ１領域を相補することが可能な他 の細胞系として、特にヒト肺癌細胞Ａ５４９（ＷＯ９４／２８１５２）やヒト網 膜芽細胞（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．（１９９６）２１５）に由来するものも 記載されている。また、アデノウイルスの複数の機能をトランス相補することが 可能な細胞系も記載されている。特に、Ｅ１及びＥ４領域を相補する系（Ｙｅｈ ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）５５９；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅ ｒ．２（１９９５）３２２；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ ．６（１９９５）１５７５）と、Ｅ１及びＥ２領域を相補する系（ＷＯ９４／２ ８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／２７０７１）を挙げることができ る。 組換えアデノウイルスは一般に、パッケージング系にウイルスＤＮＡを導入後 、約２又は３日後に細胞を溶解させることにより作製される（アデノウイルスサ イクルの周期は２４〜３６ 時間）。細胞溶解後、組換えウイルス粒子を塩化セシウム勾配遠心分離により単 離する。 この方法を実施するために導入するウイルスＤＮＡとしては完全組換えウイル スゲノムが挙げられ、場合により細菌（ＷＯ９６／２５５０６）又は酵母（ＷＯ ９５／０３４００）で構築し、細胞にトランスフェクトする。パッケージング系 に感染させるために使用する組換えウイルスでもよい。ウイルスＤＮＡは、パッ ケージング細胞に導入後に種々のフラグメント間の相同組換えにより組換えウイ ルスゲノムを再構成することが可能な相同ゾーンと組換えウイルスゲノムの一部 を各々もつフラグメントとして導入してもよい。従って、慣用アデノウイルス製 造方法の１例は次の段階を含む。細胞（例えば２９３細胞）にウイルスプレスト ックを細胞１個当たりウイルス粒子３〜５個の割合（感染多重度（ＭＯＩ）＝３ 〜５）で培養器内感染させるか、又はウイルスＤＮＡをトランスフェクトする。 その後、４０〜７２時間インキュベートする。次いで、一般には数回の連続融解 サイクルにより、ウイルスを細胞溶解により核から放出させる。その後、得られ た細胞溶解液を低速（２０００〜４０００ｒｐｍ）で遠心分離した後、 −ウイルスの密度（１．３４）を挟む１．２５及び１．４０の密度の２つの塩化 セシウム層で１．５時間急速遠心分離して培地のタンパク質からウイルスを分離 する第１段階と、 −ウイルスの真の固有の精製段階として、より長時間（使用するローターに応じ て１０〜４０時間）勾配遠心分離する第２段階 の２段階で上清（清澄化細胞溶解液）を塩化セシウムの存在下に遠心分離により 精製する。 一般に、第２段階の遠心分離後にウイルスのバンドは最大となる。他方、より 低密度の細い２つのバンドも観察され、電子顕微鏡試験によると、密度が大きい ほうのバンドは空の又は破壊したウイルス粒子であり、密度か小さいほうのバン ドはウイルスサブユニット（ペントン、ヘキソン）であることが判明した。この 段階後、遠心チューブに針を刺してウイルスを回収し、セシウムを透析又は脱塩 により除去する。 しかし、得られる純度レベルは十分であるとしても、この種の方法には所定の 欠点がある。特に、この方法はヒトの治療用途に不適確な試薬である塩化セシウ ムの使用に基づく。このため、精製後に塩化セシウムを除去することが不可欠で ある。こ の方法は更に、後述するように工業的規模での使用を制限する所定の他の欠点も ある。 これらの問題を解決するために、溶解後に得られるウイルスを塩化セシウム勾 配でなくクロマトグラフィーにより精製することが提案されている。例えば、Ｈ ｕｙｇｈｅらの論文（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６（１９９６）１４０３）は 、組換えアデノウイルスの精製に適用される種々の型のクロマトグラフィーを検 討している。この論文は特に、弱アニオン（ＤＥＡＥ）交換クロマトグラフィー を使用した組換えアデノウイルスの精製を検討している。この目的にこの種のク ロマトグラフィーを使用することは既に従来の文献に記載されている（Ｋｌｅｍ ｐｅｒｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９（１９５９）５３６；Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ Ｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０（１９６０）４５９；Ｈａｒｕｎａら，Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ １３（１９６１）２６４）。Ｈｕｙｇｈｅらの論文に記載されてい る結果によると、推奨されたイオン交換クロマトグラフィープロトコールの効率 はかなり低い。即ち、得られる分離は並であり、著者らは複数のクロマトグラフ ィーピークにウイルス粒子が存在することを示しており、収率は低く（ウイルス 粒子収率６７％； 感染性粒子収率４９％）、このクロマトグラフィー段階後に得られるウイルス調 製物は不純である。更に、種々の酵素／タンパク質によるウイルスの前処理が必 要である。この論文は更に、ケル浸透クロマトグラフィーの使用についても検討 しているが、分離が非常に不良で収率が非常に低い（１５〜２０％）としている 。 本発明は組換えアデノウイルスの新規製造方法に関する。本発明の方法は、産 生段階のレベル及び／又は精製段階のレベルで従来方法を改変したものである。 本発明の方法によると、非常に高品質の非常に多量のウイルスストックを非常に 迅速且つ工業的に得ることが今や可能である。 本発明の第１の側面の１つは、より詳細には、培養上清からウイルスを回収す ることを特徴とする組換えアデノウイルスの製造方法に関する。本発明の別の側 面は、限外濾過段階を含むアデノウイルスの製造方法に関する。別の側面による と、本発明はアニオン交換クロマトグラフィー段階を含む組換えアデノウイルス の精製方法にも関する。本発明は、場合によりアニオン交換クロマトグラフィー と共に、ゲル浸透クロマトグラフィーを使用する改良精製方法にも関する。本発 明の方法は、工業 的要件と治療用分子の製造に関する規制に完全に合致する製造条件下で、純度、 安定性、形態及び感染性の点で高品質なウイルスを非常に高収率で得ることがで きる。 特に、工業化の観点から、本発明の方法は例えば精密濾過又は深層濾過やタン ジェント限外濾過等の大規模で確実な培養上清処理方法を組換えタンパク質に利 用する。更に、３７℃でウイルスが安定であるため、この方法は細胞内方法のよ うに回収時期を半日単位で確定する必要がなく、良好な工業化が可能である。更 に、ウイルスを最大限に回収できるので、複数の領域を欠損するウイルスの場合 に特に重要である。他方、本発明の方法は前処理なしに上清の均質サンプルで産 生速度を直接容易且つ正確に追跡できるので、産生の良好な再現性が得られる。 本発明の方法は細胞溶解段階を省略することもできる。細胞溶解はいくつかの欠 点がある。例えば、工業的規模で凍結−融解サイクルにより細胞を破壊しようと するのは困難であると思われる。更に、溶解代用方法（Ｄｏｕｎｃｅ、Ｘプレス 、音波処理、機械的剪断等）にも欠点があり、Ｌ２又はＬ３ウイルスは空気感染 する傾向があるが、これらの方法はこれらのウイルスでは閉じ込めることが困難 なエアゾールを生成する可能性（ウ イルスの病原性又は伝播様式に依存する閉じ込めレベル）があり、また、制御し にくい剪断力及び／又は熱放出を生じ、調製物の活性を低下させる。細胞を溶解 するために洗剤を使用する方法は洗剤を評価する必要があり、更に洗剤の除去を 評価する必要もある。更に、細胞溶解は培地中に多数の細胞残滓を生じるので、 精製が一層困難になる。ウイルス品質の点では、本発明の方法は潜在的にウイル スの良好な成熟を可能にし、より均質な集団をもたらす。特に、ウイルスＤＮＡ のパッケージングはウイルスサイクルの最終段階であるので、細胞の早期溶解は 空の粒子を放出する恐れがあり、このような粒子は非複製性であるにも拘わらず アプリオリに感染性であり、ウイルスの固有毒性効果を高め、得られる調製物の 比活性比を増加させる。調製物の比感染性比は、生化学的方法（ＯＤ２６０ｎｍ 、ＨＰＬＣ、ＰＣＲ、酵素標識抗体法等）により測定した合計ウイルス粒子数と 、生物学的効果（固体培地培養細胞土の溶菌斑形成、細胞のトランスダクション ）を生じるウイルス粒子数の比として定義される。実際に、精製調製物では、こ の比は２６０ｎｍのＯＤにより測定した粒子の濃度と調製物のプラーク形成単位 の濃度の比を計算することにより決定される。この比は１００ 未満でなければならない。 得られた結果によると、本発明の方法は濃縮ウイルス上清から出発して前処理 を必要とすることなく、塩化セシウム勾配遠心分離により精製したウイルスに少 なくとも等しい純度のウイルスを１段階で得ることができる。 従って、本発明の第１の目的は、パッケージング細胞培養物にウイルスＤＮＡ を導入し、産生したウイルスを培養上清中に放出後に回収することを特徴とする 組換えアデノウイルスの製造方法に関する。機械的又は化学的な早期細胞溶解後 にウイルスを回収する従来方法とは異なり、本発明の方法では、外部因子により 細胞を溶解しない。培養をより長時間続け、パッケージング細胞による自然放出 後にウイルスを上清から直接回収する。従って、本発明ではウイルスを細胞上清 から回収するが、従来方法のウイルスは細胞内、より詳細には核内ウイルスであ る。 本願出願人は、培養期間の延長と多量の使用にも拘わらず、本発明の方法が良 好な品質のウイルス粒子を多量に生成できることを今般実証した。更に、上述の ように、本方法は工業規模では不経済で多くの不純物を生じる溶解段階を省略で きる。 従って、本発明の方法の原理は上清中に放出されるウイルスの回収にある。本 方法は、細胞溶解に基づく従来技術の方法よりも培養時間を改善できる。上述の ように、回収時期は半日単位で確定する必要がない。回収時期は培養上清へのウ イルス放出速度により主に決定される。 ウイルス放出速度は種々の方法で追跡することができる。特に、ＲＰ−ＨＰＬ Ｃ、ＩＥ−ＨＰＬＣ、半定量的ＰＣＲ（実施例４．３）、死細胞のトリパンブル ー染色、ＬＤＨ型細胞内酵素の放出の測定、Ｃｏｕｌｔｅｒ型装置又は光回折に よる上清中の粒子の測定、免疫（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等）又は比濁法、抗体の存 在下の凝集による滴定等の分析方法を使用することができる。 ウイルスの少なくとも５０％が上清中に放出された時点で回収を行うことが好 ましい。ウイルスの５０％が放出された時点は、上記方法により速度を確認する ことにより容易に決定することができる。ウイルスの少なくとも７０％が上清中 に放出された時点で回収を行うと一層好ましい。ウイルスの少なくとも９０％が 上清中に放出された時点、即ち速度が平坦域に達した時点で回収を行うと特に好 ましい。ウイルス放出速度は主にア デノウイルスの複製サイクルに依存し、所定の因子の影響を受ける。特に、使用 するウイルスの型、特に組換えウイルスゲノムの欠失の型によって変動し得る。 特に、Ｅ３領域の欠失はウイルスの放出を遅らせると思われる。従って、Ｅ３領 域の存在下では感染後２４〜４８時間にウイルスを回収すればよい。逆にＥ３領 域の不在下ではもっと長い培養時間が必要であると思われる。この点について、 本願出願人はＥ１及びＥ３領域を欠損するアデノウイルスの培養上清への放出速 度の実験を実施し、放出が感染後約４〜５日で開始し、約１４日まで続くことを 確認した。放出は一般に８日〜１４日で平坦域に達し、力価は感染後少なくとも ２０日間安定である。 本発明の方法では、細胞を２〜１４日間培養することが好ましい。他方、ウイ ルスの放出はウイルスの放出に関与する例えばウイルス性のタンパク質をパッケ ージング細胞中で発現させることにより誘導することができる。例えばアデノウ イルスの場合には、場合により誘導プロモーターの制御下に発現されるアデノウ イルスのＥ３領域（タンパク質Ｅ３−１１．６Ｋ）によりコードされるＤｅａｔ ｈタンパク質の発現により放出を調節することができる。従って、ウイルス放出 時間を短縮し、感 染後２４〜４８時間にウイルスの＞５０％を培養上清から回収することができる 。 ウイルス粒子を回収するためには、培養上清を予め濾過すると有利である。ア デノウイルスは約０．１μｍ（１２０ｎｍ）の寸法をもつので、ウイルスを通過 させるために十分大きく且つ汚染物質を保持するために十分小さい細孔径をもつ 膜を用いて濾過する。０．２μｍを上回る細孔径をもつ膜を用いて濾過すると好 ましい。特に有利な実施態様によると、漸減細孔径をもつ膜で連続濾過する。１ ０μｍ、１．０μｍ、０．８〜０．２μｍの漸減細孔径のディープフィルターで 濾過すると、特に良好な結果が得られた。別の好ましい態様によると、平膜又は 中空糸でタンジェント精密濾過により濾過する。より特定的には、０．２〜０． ６μｍの細孔径をもつＭｉｌｌｉｐｏｒｅ平膜又は中空糸を使用することができ る。実施例に示す結果から明らかなように、この濾過段階は収率１００％であっ た（最小細孔径のフィルターで保持することによるウイルスの損失は観察されな かった）。 本発明の別の側面によると、本願出願人は上清からウイルスを回収精製するこ とが可能な方法を今般開発した。このために は、こうして濾過（又は清澄化）した上清を限外濾過する。この限外濾過は（ｉ ）相当の容量の上清を濃縮し、（ｉｉ）第１段階のウイルス精製を実施し、（ｉ ｉｉ）調製物の緩衝液を後期調製段階に適合させることができる。好ましい実施 態様によると、上清をタンジェント限外濾過にかける。タンジェント限外濾過は 、装置の濾渣区画内に流れを形成すると共にこの区画と濾液区画の間に膜貫通圧 を加えることにより、所定のカットオフ閾値の膜により分離された濾渣と濾液の ２つの区画間で溶液を濃縮分画するものである。流れは一般に装置の濾渣区画内 でポンプにより形成され、膜貫通圧は濾渣回路の液体流路では弁により調節され 、濾液回路の液体流路では流量可調節ポンプにより調節される。流速と膜貫通圧 は、膜の目詰まりを避けながら僅かな剪断力を生じるように選択される（レイノ ルズ数５０００ｓｅｃ−１未満、好ましくは３０００ｓｅｃ−１未満、圧力１． ０ｂａｒ未満）。限外濾過を実施するためには、スパイラルメンブレン（Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ，Ａｍｉｃｏｎ）、平膜又は中空糸（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌ１ｉｐ ｏｒｅ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｐａｌｌ，ＧＦ，Ｓｅｐｒａｃｏｒ）等の種々の システムを使用することができる。アデノウイルスは約１０００ ｋＤａの分子量をもつので、本発明の範囲では１０００ｋＤａ未満、好ましくは １００ｋＤａ〜１０００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜を使用すると有利であ る。実際に、１０００ｋＤａ以上のカットオフ閾値をもつ膜を使用すると、この 段階で相当のウイルス損失を生じる。好ましくは２００〜６００ｋＤａ、より好 ましくは３００〜５００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜を使用する。実施例に 記載する実験から明らかなように、３００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜を使 用すると、培地から汚染物質（ＤＮＡ、培地のタンパク質、細胞タンパク質等） を除去しながらウイルス粒子の＞９０％を保持することができる。５００ｋＤａ のカットオフ閾値を使用しても同様の利点が得られる。 実施例に記載する結果から明らかなように、この段階はウイルスの損失なしに （収率９０％）相当容量の上清を濃縮することができ、良好な品質のウイルスを 生じる。特に、２０〜１００倍の濃縮倍率を容易に得ることができる。 従って、この限外濾過段階はカットオフ閾値（３００又は５００ｋＤａ）未満 の分子量の汚染物質を少なくとも部分的に除去するので、慣用方法の付加精製段 階を構成する。両方法の 最初の超速心段階後の分離様相を比較すると、ウイルス調製物の品質の改善は顕 著である。溶解を用いる慣用方法では、ウイルス調製物のチューブは凝塊（脂質 、タンパク質）が時折ウイルスバンドにぶつかって濁った様相を示すが、本発明 の方法では、放出及び限外濾過後の調製物は培地の汚染物質から既に十分に分離 されたバンドを示し、汚染物質は上層に保持される。細胞溶解により得られたウ イルスと、本発明で上記のように限外濾過により得られたウイルスのイオン交換 クロマトグラフィープロフィルを比較しても同様に品質の改善が実証される。ま た、限外濾過後に濃縮液のディアフィルトレーションを実施することにより、品 質を更に改善することができる。このディアフィルトレーションはタンジェント 限外濾過と同一原理で実施され、精製用緩衝液中の濃縮液の平衡を保ちながら、 膜のカットオフ閾値を上回る寸法の汚染物質をより完全に除去することができる 。 更に、本願出願人はこの限外濾過の結果、ウイルスをその後、イオン交換カラ ムクロマトグラフィー又はゲル浸透クロマトグラフィーにより直接精製すること ができ、クロマトグラフィーの前に調製物を処理する必要なしにウイルス粒子の ピークの優 れた分離が得られることも立証した。これは特に予想外であり、有利である。実 際に、Ｈｙｕｇｈｅらの上記論文に記載されているように、ウイルス調製物のク ロマトグラフィー精製では並の結果しか得られず、ベンゾナーゼやシクロデキス トリンによるウイルス懸濁液の前処理も必要である。 従って、より詳細には本発明の方法はウイルスを限外濾過により回収すること を特徴とする。 上述のように、得られる濃縮液はウイルスの精製に直接使用可能である。この 精製は、塩化セシウム勾配遠心分離や、サイズ、密度又は沈降係数に応じて粒子 を分離することが可能な他の超遠心法等の従来慣用技術により実施することがで きる。実施例４に記載する結果は実際に、こうして得られたウイルスが特筆すべ き特徴を示すことを実証している。特に、本発明によると、塩化セシウムの代わ りにヨージキサノール−５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイ ル）ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’−ビス−（２，３−ジヒドロキシ プロピル−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド）］溶液 を使用することができ、ウイルスはこの溶液中に平衡状態で相対密度１．１６〜 １．２４で沈降する。この 溶液は塩化セシウムとは異なり非毒性であるので、この溶液を使用すると有利で ある。更に、本願出願人は、得られた濃縮液からイオン交換メカニズム又はゲル 浸透によりウイルスを直接精製することができ、前処理の必要なしにウイルス粒 子のクロマトグラフィーピークの優れた分離が得られるという利点も立証した。 従って、好ましい実施態様によると、ウイルスはアニオン交換クロマトグラフ ィーにより回収精製される。 アニオン交換クロマトグラフィーには、セルロース、アガロース（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅゲル）、デキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル）、アクリルアミド（Ｓ ｅｐｈａｃｒｙｌゲル、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌゲル）、シリカ（ＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＷゲル）、ポリ［スチレン−ジビニルベンゼン］（Ｓｏｕｒｃｅゲル又はＰｏ ｒｏｓゲル）、エチレングリコール−メタクリレートコポリマー（Ｔｏｙｏｐｅ ａｒｌ ＨＷ及びＴＳＫ−ｇｅｌ ＰＷゲル）、又は混合物（アガロース−デキ ストラン：Ｓｕｐｅｒｄｅｘゲル）等の種々の型の支持体を使用することができ る。また、クロマトグラフィー分離を改善するために、本発明の範囲では以下の 特徴をもつビーズ形の支持体を使用することが好 ましい。 −できるだけ球状。 −直径が一定（完全に等しいか又はできるだけ均質なビーズ）で、欠陥や傷がな い。 −できるだけ小さい直径。１０μｍのビーズが記載されている（例えばＰｈａｒ ｍａｃｉａのＭｏｎｏＢｅａｄｓ又はＴｏｓｏＨａａｓのＴＳＫ−ｇｅｌ）。こ の値はビーズ直径の下限であり、クロマトグラフィー精製しようとする対象をビ ーズの内側に浸透させるためには細孔径をもっと大きくする必要があると思われ る（下記参照）。 −圧力に耐えるような強度に維持する。 また、非常に大きい寸法（直径＞１００ｎｍ）のアデノウイルスをクロマトグ ラフィー精製するためには、ウイルス粒子を相互作用させようとする官能基に接 触できるように、より高い細孔径上限あるいは最大限の上限をもつゲルを使用す ることが重要である。 支持体はアガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、ポリ［スチレ ン−ジビニルベンゼン］、エチレングリコール−メタクリレートコポリマーから 単独又は混合物として選択 すると有利である。 アニオン交換クロマトグラフィーに使用する支持体は、アニオン分子と相互作 用することが可能な基をグラフトすることにより官能化する必要がある。より一 般的には、このような基は第３級又は第４級アミンから構成される。例えばＤＥ ＡＥ等の第３級アミンを使用すると、弱アニオン交換体が得られる。第４級アミ ンを使用すると、強アニオン交換体が得られる。 本発明の範囲では、強アニオン交換体を使用すると特に有利である。従って、 本発明によると第４級アミンにより官能化した上記のようなクロマトグラフィー 支持体を使用することが好ましい。第４級アミンにより官能化した支持体として は、例えばＳｏｕｒｃｅ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｏｒ ｏｓ ＨＱ及びＰｏｒｏｓ ＱＥ樹脂、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ型樹脂並 びにＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ樹脂を挙げることができる。 本発明の範囲で使用可能な樹脂の好ましい例はＳｏｕｒｃｅ、特にＳｏｕｒｃ ｅ Ｑ(例えば１５Ｑ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ))、ＭｏｎｏＢｅａｄｓ（例えばＱ（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ及びＰｏｒｏｓ ＱＥ型樹脂である Ｍｏｎｏ Ｂｅａｄｓ支持体（ビーズ直径１０±０．５μｍ）は１０年以上前から市販され ており、Ｓｏｕｒｃｅ（１５μｍ）又はＰｏｒｏｓ（１０μｍ又は２０μｍ）型 の樹脂は約５年前から市販されている。後者２種の支持体は内部細孔分布が非常 に広い（２０ｎｍ〜１μｍ）ため、非常に大型の対象がビーズを通過できるとい う利点がある。更に、これらの支持体は液体のゲル循環耐性が非常に小さく（従 って圧力が非常に小さい）、非常に強靭である。従って、溶質は相互作用する官 能基に非常に迅速に輸送される。本願出願人は、アデノウイルスの場合には寸法 が大きいために拡散に時間がかかるので、これらのパラメーターが特に重要であ ることを立証した。 実施例に記載する結果から明らかなように、アデノウイルスはただ１回のアニ オン交換段階で濃縮液から精製することができ、精製収率が優れており（ｔｄｕ で表すと１４０％であるが、Ｈｕｙｇｈｅｓらにより報告されている値は４９％ ）、分離も優れている。更に、実施例に記載する結果から明らかなように、得ら れるアデノウイルスは感染性が高いため、治療用途に必要な特性をもつ。強アニ オン交換体即ち第４級アミンにより官能化した交換体、特にＳｏｕｒｃｅ Ｑ樹 脂を使用すると、特に 有利な結果が得られた。Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ１５樹脂が特に好ましい。 この点で、本発明の別の目的は強アニオン交換クロマトグラフィーによる精製 段階を含むことを特徴とする、生物培地からの組換えアデノウイルスの精製方法 に関する。 この態様によると、生物培地は前記ウイルスを産生するパッケージング細胞の 上清、前記ウイルスを産生するパッケージング細胞の溶解液又は前記ウイルスの 予備精製溶液であり得る。 クロマトグラフィーは第４級アミンで官能化した支持体で実施することが好ま しい。同様に好ましい態様によると、支持体はアガロース、デキストラン、アク リルアミド、シリカ、ポリ［スチレン−ジビニルベンゼン］、エチレングリコー ル−メタクリレートコポリマーから単独又は混合物として選択される。 特に有利な実施態様は、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ、好ましくはＳｏｕｒｃｅ Ｑ１５ 樹脂上でクロマトグラフィーを行うことを特徴とする。 更に、上記方法は産生細胞の上清から実施すると有利であり、予備限外濾過段 階を含む。この段階は、上記条件下で実施すると有利であり、特に、３００〜５ ００ｋＤａのカットオフ閾値 をもつ膜によるタンジェント限外濾過である。 本発明の方法の別の実施態様によると、ゲル浸透クロマトグラフィーによりウ イルスを回収精製する。 ゲル浸透は上清、濃縮液、又はアニオン交換クロマトグラフィーからのウイル スで直接実施することかできる。この段階ではアニオン交換クロマトグラフィー について上述した支持体を官能化せずに使用することができる。 この点で、好ましい支持体はアガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲル）、デキス トラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル）、アクリルアミド(Ｓｅｐｈａｃｒｙｌゲル、 Ｔｒｉｓａｃｒｙｌゲル)、シリカ（ＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＷゲル）、エチレング リコール−メタクリレートコポリマー（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ及びＴＳＫ− ｇｅｌ ＰＷゲル）、又は混合物（アガロース−デキストラン：Ｓｕｐｅｒｄｅ ｘゲル）である。特に好ましい支持体はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００ＨＲ、Ｓ−１０００ＨＲ又は Ｓ−２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＴＳＫ Ｇ６０００ＰＷ（ＴｏｓｏＨａ ａｓ）である。 従って、本発明による好ましい方法は限外濾過後にアニオン 交換クロマトグラフィーを実施する。 別の好ましい方法は、限外濾過後にアニオン交換クロマトグラフィーを実施し 、更にその後にゲル浸透クロマトグラフィーを実施する。 本発明の別の態様は、第１の超速心段階と、第２の希釈又は透析段階と、第３ のアニオン交換クロマトグラフィー段階を含む、生物培地からのアデノウイルス の精製方法に関する。この態様によると、第１段階は塩化セシウム勾配で急速超 遠心により実施することが好ましい。急速なる用語は約０．５〜４時間の超遠心 を意味する。第２段階ではウイルスをバッファで希釈又は透析し、クロマトグラ フィーゲルへの注入と超遠心溶媒の除去を容易にする。第３段階は上記のような アニオン、好ましくは強アニオン交換クロマトグラフィーを使用することにより 実施する。上清から回収した（又は場合により細胞内）ウイルスから出発する典 型的実験では、（実施例３に記載するように）塩化セシウムを使用して第１の急 速超遠心段階を実施する。次に、（例えば緩衝液１０容量で）サンプルを単に希 釈後又は緩衝液で単に透析後に、（実施例５．１に記載するように）サンプルを イオン交換クロマトグラフィーにかける。本発明の方法 のこの態様の利点は、２種の全く異なるウイルス分離方法（密度と表面電荷）を 使用する結果、場合によりこれらの２方法の性能を兼備する品質レベルにウイル スを導くことができるという点にある。更に、クロマトグラフィー段階は超遠心 に使用した溶媒（例えば塩化セシウム又は他の任意の上記等価溶媒）を同時に除 去することができる。 本発明の別の目的は、アデノウイルスの精製のためのヨージキサノール−５， ５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（アセチルアミノ） ］ビス［Ｎ，Ｎ’−ビス−（２，３−ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリ ヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド）］の使用に関する。 本発明の方法を実施するためには、アデノウイルスの種々のパッケージング細 胞を使用することができる。特に、パッケージング細胞は医薬的に使用可能な種 々の細胞、即ち工業的に許容可能な条件下で培養可能であり、病原性が認められ ていない細胞から作製することができる。このような細胞としては、樹立細胞系 又は初代培養物、特にヒト網膜芽細胞、ヒト肺癌細胞又は胎児腎細胞が挙げられ る。アデノウイルスにより感染可能なヒト起源の細胞が有利である。この点では 、ＫＢ、ＨｅＬａ、 ２９３、Ｖｅｒｏ、ｇｍＤＢＰ６、ＨＥＲ、Ａ５４９、ＨＥＲ等の細胞を挙げる ことができる。 ＫＢ系細胞はヒト表皮癌腫に由来する。この細胞とその培養条件はＡＴＣＣ（ ＣＣＬ１７参照）から入手できる。ヒトＨｅＬａ細胞系はヒト上皮癌腫に由来す る。この細胞とその培養条件もＡＴＣＣ（ＣＣＬ２参照）から入手できる。２９ ３系細胞はヒト胎児腎細胞である（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ３６（１９７７）５９）。この系は特にヒトアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左 側部分（１２％）をそのゲノムに組込んでいる。ｇｍＤＢＰ６細胞系（Ｂｒｏｕ ｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０（１９９２）６２４）はＭＭＴＶのＬＴＲの 制御下のアデノウイルスのＥ２遺伝子をもつＨｅＬａ細胞から構成される。 細胞は、イヌ起源の細胞（ＢＨＫＮＭＤＣＫ等）でもよい。 この点では、イヌＭＤＣＫ系の細胞が好ましい。ＭＤＣＫ細胞の培養条件は特に Ｍａｃａｔｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ４４（１９８８）９に記載されている。 種々のパッケージング細胞系が文献に記載されており、これらについては実施 例に記載する。アデノウイルスのＥ１機能を トランス相補する細胞が有利である。アデノウイルスのＥ１機能とＥ４機能又は Ｅ１機能とＥ２ａ機能トランス相補する細胞がより好ましい。これらの細胞はヒ ト胎児腎もしくは網膜又はヒト肺癌細胞に由来するものが好ましい。 従って、本発明は特に有利な組換えアデノウイルスの製造方法を提供する。こ の方法は１個以上の領域を欠損する組換えウイルス、特にＥ１領域又はＥ１領域 とＥ４領域を欠損するウイルスの製造に適している。また、上記のような種々の 血清型のアデノウイルスの製造にも適用可能である。 特に有利な態様によると、本発明の方法はアデノウイルスＡｄ５の配列上のヌ クレオチド４５４〜ヌクレオチド３３２８のＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメン トの欠失によりＥ１領域が不活化された組換えアデノウイルスの製造に使用され る。この配列は文献に記載されており、データベース（特にＧｅｎｅｂａｎｋ Ｎｏ．Ｍ７３２６０参照）からも入手できる。別の好適実施態様では、Ｅ１領域 はヌクレオチド３８２〜ヌクレオチド３４４６のＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラ グメントの欠失により不活化される。特定態様では、本方法はＥ４領域の全部を 欠失するベクターを製造することができる。これは、ヌクレオ チド３５８３５〜３２７２０に対応するＭａｅＩＩ−ＭｓｃＩフラグメントの除 去により実施できる。別の特定態様では、Ｅ４の機能部分のみが欠失している。 この部分は少なくとも読取り枠ＯＲＦ３及びＯＲＦ６を含む。例えば、これらの コーディング領域はヌクレオチド３４８０１〜３４３２９及び３４１１５〜３３ １２６に夫々対応するＰｖｕＩＩ−ＡｌｕＩ及びＢｇＩＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグ メントとしてゲノムから欠失させることができる。本発明の範囲では、ウイルス Ａｄ２ ｄｌ８０８又はウイルスＡｄ５ ｄｌ１００４、Ａｄ５ ｄｌ１００７ 、Ａｄ５ ｄｌ１０１１又はＡｄ５ ｄｌ１０１４のＥ４領域の欠失も使用する ことができる。この点では、本発明の細胞は不活性Ｅ１領域と、Ａｄ５ ｄｌ１ ０１４のゲノムに存在する型のＥ４領域の欠失を含むウイルス即ち読取り枠ＯＲ Ｆ４を保存するＥ４−ウイルスの製造に特に有利である。 上述のように、Ｅ１領域の欠失はＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域の全部又は一部に相当 すると有利である。この欠失はウイルスが細胞中で自律的に複製できなくなるた めに十分でなければならない。本発明によるアデノウイルスのＥ１領域の欠失部 分はヌクレオチド４５４〜３３２８又は３８２〜３４４６に相当すると 有利である。 上記位置は、データベースから入手可能な野生型アデノウイルスＡｄ５の公知 配列上の位置である。種々の血清型のアデノウイルス間には多少の相違が存在し 得るが、これらの位置は任意血清型、特にアデノウイルスＡｄ２及びＡｄ７から 本発明により組換えアデノウイルスを構築するのに一般に適用できる。 更に、製造されるアデノウイルスはそのゲノムのレベルに他の変異をもってい てもよい。特に、ウイルスの能力を増加し、ウイルス遺伝子の発現に結び付けら れるその副作用を減らすように他の領域を欠失していてもよい。例えば、特にＥ ３又はＩＶａ２領域の全部又は一部を欠失していてもよい。但し、Ｅ３領域につ いては、ｇｐ１９Ｋタンパタ質をコードする部分は保存しておくと特に有利であ る。このタンパク質は実際に、アデノウイルスベクターが（ｉ）その作用を制限 したり、（ｉｉ）望ましくない副作用を生じたりするような免疫反応を受けない ようにすることができる。特定態様によると、Ｅ３領域を欠失させ、ｇｐ１９ｋ タンパク質をコードする配列を異種プロモーターの制御下に再導入する。 上述のように、アデノウイルスは遺伝子及び細胞治療用とし て非常に有効な遺伝子導入用ベクターを構成する。このためには、細胞、臓器又 は生物への導入及び／又は発現が所望される異種核酸配列をそのゲノムに挿入す ればよい。この配列は、標的細胞で転写及び場合により翻訳されると治療効果を もつ物質を生成する遺伝子等の１種以上の治療用遺伝子を含み得る。治療物質と しては、特に酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（例えばインターロイ キン、インターフェロン、ＴＮＦ等）（ＦＲ９２０３１２０）、成長因子、神経 伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（例えばＢＤＮＦ、ＣＮ ＴＦ、ＮＧＦ、ＴＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等）、ア ポリポタンパク質（例えばＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等）（ＷＯ９４ ／２５０７３）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＷＯ９３／０６２２ ３）、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｆ 等）（ＷＯ９４／２４２９７）、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ等の凝血関連因子 をコードする遺伝子、自殺遺伝子（例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナ ーゼ等）、更には天然又は人工免疫グロブリン（Ｆａｂ）ＳｃＦｖ等、ＷＯ９４ ／２９４４６）の全部又は一部等を挙げることができる。治療用 遺伝子は標的細胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御す ることが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列はヨーロ ッパ特許第１４０３０８号に記載の方法に従い、例えば標的細胞で細胞ｍＲＮＡ の相補的ＲＮＡに転写すると、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。治 療用遺伝子はワクチン製造の目的では、ヒトで免疫応答を生じることが可能な抗 原性ペプチドをコードする遺伝子でもよい。このような遺伝子としては特に、エ プスタイン−バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５ ５７３）、疑狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド（ ＥＰ２５９２１２）が挙げられる。 一般に、異種核酸配列は感染細胞で機能的な転写プロモーター領域と、目的遺 伝子の３’側に配置され、転写終結シグナル及びポリアデニル化部位に相当する 領域も含む。これらの要素の集合が発現カセットを構成する。プロモーター領域 については、感染細胞で機能できるときに目的遺伝子の発現に天然に関与するプ ロモーター領域とすることができる。（合成タンパク質も含めた他のタンパク質 の発現に関与する）別の起源の領域でもよい。特に、ある遺伝子の転写を特異的 又は非特異的及び 誘導的又は非誘導的に刺激又は抑制する真核もしくはウイルス遺伝子のプロモー ター配列又は任意のプロモーター配列もしくは誘導配列を挙げることができる。 例えば、感染させたい細胞のゲノム、又はウイルスのゲノムに由来するプロモー ター配列、特にアデノウイルスのＥ１Ａ，ＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ 、ＬＴＲ−ＲＳＶプロモーター等を挙げることができる。真核プロモーターとし て、ユビキチンプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブ リン等）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、Ｇ ＦＡＰ等）のプロモーター、治療用遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、 ＶＩＩＩ因子型等）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、 脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞のαアクチンプロモーター 、肝特異的プロモーター、Ａｐｏ ＡＩ、Ａｐｏ ＡＩＩ、ヒトアルブミン等） 又は刺激応答プロモーター（ステロイドホルモンレセプター、レチノイン酸レセ プター等）も挙げることができる。更に、活性化配列、調節配列又は組織特異的 発現もしくは最大発現を可能にする配列を付加してこれらの発現配列を改変して もよい。また、挿入する核酸が発現配列を含まない場合には、このよう な配列の下流で欠損ウイルスのゲノムに挿入してもよい。 更に、異種核酸配列は標的細胞の分泌経路に合成治療物質を導くシグナル配列 を特に治療用遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は治療物質の 天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能的シグナル配列又は人工シグナル 配列でもよい。 治療用遺伝子の発現カセットは従来技術に記載の方法に従って組換えアデノウ イルスのゲノムの種々の部位に挿入することができる。まず第１に、Ｅ１欠失の レベルに挿入することができる。配列の付加又は置換によりＥ３領域のレベルに 挿入してもよい。また、欠失Ｅ４領域のレベルに挿入してもよい。 本発明は更に、本発明の方法により得られる精製ウイルス調製物と、この方法 により製造される１種以上の組換え欠損アデノウイルスを含む全医薬組成物にも 関する。本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、 皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。 医薬組成物は注射用製剤に医薬的に許容可能なキャリヤーを含むことが好まし い。キャリヤーとしては、特に滅菌等張塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸 二ナトリウム、塩化ナトリ ウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等、又はこのような塩 の混合物）、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えて注射可能な溶 質を構成し得る乾燥（特に凍結乾燥）組成物が挙げられる。例えばヒドロゲル等 の他のキャリヤーも利用できる。このヒドロゲルは生体適合性で非細胞毒性の任 意の（ホモ又はヘテロ）ポリマーから調製できる。このようなポリマーは例えば 国際出願ＷＯ９３／０８８４５に記載されている。特にエチレンオキシド及び／ 又はプロピレンオキシドから得られるようなポリマーは市販されている。注射に 使用するウイルス用量は種々のパラメーター、特に使用する投与経路、該当疾病 、発現させようとする遺伝子、又は所望の治療期間に応じて適応できる。一般に 、本発明による組換えアデノウイルスは１０４〜１０１４ｐｆｕ、好ましくは１ ０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕの用量形態で調剤及び投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成 単位」）なる用語はアデノウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞培養物の 感染により測定され、一般に１５日後の感染細胞のプラーク数を表す。ウイルス 溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。 治療用遺伝子に応じて、こうして製造したウイルスを遺伝病 （ジストロフィー、嚢胞性線維症等）、神経変性病（アルツハイマー病、パーキ ンソン病、ＡＬＳ等）、癌、凝血障害又はリポタンパク異常血症に結び付けられ る疾病、ウイルス感染に結び付けられる疾病（肝炎、ＡＩＤＳ等）等を含む多数 の疾病の治療又は予防に使用することができる。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単なる 例示であり、発明を制限するものではない。 図面の説明 図１：実施例４により精製したアデノウイルスの安定性試験。 図２：実施例４により精製したアデノウイルスの（逆相）ＨＰＬＣ分析。実施 例３のアデノウイルスとの比較。 図３：半定量的ＰＣＲ及びプラークアッセイにより測定した２９３細胞上清へ のアデノウイルスＡｄ−βＧａｌの放出速度。 図４：限外濾過したアデノウイルス上清（実施例５．１）のＳｏｕｒｃｅ Ｑ １５による溶離プロフィル。 図５：限外濾過したアデノウイルス上清（実施例５．１）からＳｏｕｒｃｅ Ｑ１５樹脂クロマトグラフィーにより回収したウイルスピークのＲｅｓｓｏｕｒ ｃｅ ＱによるＨＰＬＣ分析。図６：（Ａ）限外濾過したアデノウイルスＡｄ−ＡＰＯＡ１上清（実施例５． ３）のＳｏｕｒｃｅ Ｑ１５樹脂による溶離プロフィル。（Ｂ）回収したウイル スピークのＨＰＬＣ（Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅ Ｑ）分析。 図７：（Ａ）限外濾過したアデノウイルスＡｄ−ＴＫ上清（実施例５．３）の Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ１５による溶離プロフィル。 回収した種々のウイルスフラクション（ピークの始点から終点）即ちピークの中 間のフラクションＦ２（Ｂ）、ピークの後部のフラクションＦ３（Ｃ）、ピーク の終点のフラクションＦ４（Ｄ）のＨＰＬＣ（Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅ Ｑ）分析。 図８：アデノウイルス産生細胞培養物の濃縮上清（実施例５．４）のＭｏｎｏ Ｑ樹脂による溶離プロフィル。ＢＧ２５Ｆ１：セシウムで精製したウイルス濃 縮土清。ＢＧ２５Ｃ：濃縮感染上清。 図９：アデノウイルス産生細胞培養物の濃縮上清（実施例５．４）のＰＯＲＯ Ｓ ＨＱゲルによる溶離プロフィル。ＢＧ２５Ｆ１：セシウムで精製したウイル ス濃縮上清。ＢＧ２５Ｃ：濃縮感染上清。 図１０：限外濾過したアデノウイルス上清のＳｅｐｈａｃｒ ｙｌ Ｓ１０００ＨＲ／Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲによるケル浸透精製プロ フィル。 図１１：本発明により精製したアデノウイルスストックの電子顕微鏡分析。 図１２：密度１．２７のウイルスバンドの電子顕微鏡分析。 一般分子生物学技術 プラスミドＤＮＡの分取抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心分離 、アガロース又はアクリルアミドケル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶離 精製、タンパク質のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、塩類溶媒中 のＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈降、大腸菌での形質転換等の分子 生物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に詳細に記載 されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ.ら（編）,“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２型のプラスミド、ｐＵＣ及びＭ１３系ファージは市販品とする（ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。連結に際 しては、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動によ りそのサイズに応じて分離し、フェノール又はフェノール／クロロホルム混合物 で抽出し、エタノール沈降させた後、製造業者の指示に従ってＴ４ファージのＤ ＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートすればよい。付着５ ’末端の充填は製造業者の指示に従って大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏ ｌａｂｓ）のＫｌｅｎｏｗフラグメントにより実施することができる。付着３’ 末端の破壊は、Ｔ４ファージのポリメラーゼＤＮＡ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業 者の指示に従って使用することにより実施される。付着５’末端の破壊はヌクレ アーゼＳ１で処理することにより実施される。 合成オリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓ ｈａｍから市販されているキットを使用することにより、Ｔａｙｌｏｒら[Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４]によ り開発され た方法に従って実施することができる。所謂ＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ− ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ ．Ｂ．とＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７ ）３３５−３５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、「ＤＮＡサーマル サイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示に従 って使用することにより実施することができる。ヌクレオチド配列の確認は、Ａ ｍｅｒｓｈａｍにより市販されているキットを使用することにより、Ｓａｎｇｅ ｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４ ６３−５４６７］により開発された方法により実施することができる。実施例 実施例１：パッケージング細胞系 本発明の範囲で使用されるパッケージング細胞は、アデノウイルスにより感染 可能であり且つ治療用途に適合可能な任意細胞系から得られる。以下の細胞系か ら選択した細胞が特に好ましい。 −２９３系細胞 ２９３系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１〜 １２％）を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ １ａ，Ｅ１ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域及びｐＩＶａ ２タンパク質をコードする領域の一部を含む（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ ｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全 部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高 力価をもつウイルスストックを産生することかできる。 −Ａ５４９系細胞 アデノウイルスのＥ１領域を相補する細胞をＡ５４９細胞から構築した（Ｉｍ ｌｅｒら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９６）７５）。これらの細胞は、誘導プ ロモーターの制御下におかれたＥ１領域から左側ＩＴＲを除去したフラグメント を含む。 −ＨＥＲ系細胞 ヒト胎児網膜細胞（ＨＥＲ）はアデノウイルスにより感染可能である（Ｂｙｒ ｄら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２（１９８８）４７７）。これらの細胞から作製した アデノウイルスパッケージ ング細胞は例えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２又はＦａｌｌａｕｘらの論文（ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９６）２１５）に記載されている。具体的 には、ＨＥＲ細胞のゲノムに組み込まれたヌクレオチド７９〜ヌクレオチド５７ ８９のアデノウイルスＡｄ５のゲノムのＥ１領域を含む９１１系を挙げることが できる。この細胞系はＥ１領域を欠損するウイルスを産生することができる。 −ＩＧＲＰ２細胞 ＩＧＲＰ２細胞は誘導プロモーターの制御下のＥ４領域の機能ユニットを組み 込むことにより２９３細胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ ４領域を欠損するウイルスを産生することができる（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ （１９９６）７０）。 −ＶＫ細胞 ＶＫ（ＶＫ２−２０及びＶＫ１０−９）細胞は誘導プロモーターの制御下のＥ ４領域全体とｐＩＸタンパク質をコードする領域を組み込むことにより２９３細 胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイル スを産生することができる（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１５７５）。 −２９３Ｅ４細胞 ２９３Ｅ４細胞はＥ４領域全体を組み込むことにより２９３細胞から得られる 細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを産生するこ とができる（ＷＯ９５／０２６９７；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１ ９９５）３２２）。実施例２：使用したウイルス 下記実施例の範囲で作製したウイルスは大圃菌のＬａｃＺマーカー遺伝子を含 むアデノウイルス（Ａｄ−βＧａｌ）、Ｉ型ヘルペスウイルスのチミジンキナー ゼをコードする遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ）、ヒト腫瘍抑制タン パク質をコードする遺伝子ｐ５３を含むアデノウイルス、及びアポリポタンパク 質Ａ１をコードするウイルス（Ａｄ−ａｐｏＡＩ）である。これらのウイルスは 血清型Ａｄ５から誘導され、以下の構造をもつ。 −例えばヌクレオチド３８２（ＨｉｎｆＩ部位）〜３４４６（Ｓａｕ３ａ部位 ）におけるＥ１領域の欠失。 −ＲＳＶ又はＣＭＶプロモーターの制御下に前記欠失のレベ ルに挿入された遺伝子発現カセット。 −Ｅ３領域の欠失。 これらのウイルスの構築は文献に記載されている（ＷＯ９４／２５０７３、Ｗ Ｏ９５／１４１０２、ＦＲ９５．０１６３２、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉ ｃａｕｄｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ（１９９２）ｐ６２６）。当然の ことながら、本発明の方法により他の任意構築物も作製でき、特に他の異種遺伝 子及び／又は他の欠失（例えばＥ１／Ｅ４又はＥ１／Ｅ２）をもつウイルスを作 製することができる。実施例３：細胞溶解によるウイルスの作製 本実施例は、産生されたウイルスを回収するためにパッケージング細胞を溶解 する従来技術のウイルス作製を再現する。 ２９３細胞にＡｄ−βＧａｌ又はＡｄ−ＴＫウイルス（実施例２）のプレスト ックを細胞１個当たりウイルス３〜５個の割合（感染多重度ＭＯＩ＝３〜５）で ８０〜９０％集密まで培養器内感染させる。インキュベーションを４０〜７２時 間続け、細胞の増殖、屈折性増加、培養基接着の減弱を顕微鏡で観察することに より回収時期を判断する。文献によると、ウイルスサイクルの周期は２４〜３６ 時間である。 実験室作製レベルでは、細胞を損失せずに回収時点で感染培地を除去するよう に、細胞が分離する前に回収し、その後、最小容量にとることが重要である（濃 度倍率は培養寸法に応じて約１０〜１００倍である）。 その後、３〜６回の連続融解サイクル（ドライアイスで−７０℃に冷却したエ タノール、３７℃水浴）により核からウイルスを放出させる。 その後、得られた細胞溶解液を低速（２０００〜４０００ｒｐｍ）で遠心分離 した後、上清（清澄化細胞溶解液）を２段階の塩化セシウム勾配超遠心により精 製する。 −第１段階はウイルスの密度（１．３４）を挟む１．２５及び１．４０の２つ のセシウム層で３５０００ｒｐｍローターｓｗ４１で１．５時問急速に超遠心し 、培地のタンパク質からウイルスを分離する。ローターは処理しようとする容量 に応じて「スイング」ローター（Ｓｗ２８、Ｓｗ４１ Ｂｅｃｋｍａｎ）でもよ いし、アングルローター（Ｔｉ４５、Ｔｉ７０、Ｔｉ７０．１ Ｂｅｃｋｍａｎ ）でもよい。 −第２段階は、より長時間（使用するローターに応じて１０〜４０時間）、例 えばローターｓｗ４１で３５０００ｒｐｍで １８時間の勾配超遠心であり、ウイルスの真の固有の精製段階を構成する。ウイ ルスは直線勾配中に平衡状態で密度１．３４で存在する。 一般に、この段階でウイルスのバンドは最大である。他方、より低密度の細い ２つのバンドも観察され、電子顕微鏡試験によると、密度が大きいほうのバンド は空の又は破壊したウイルス粒子であり、密度が小さいほうのバンドはウイルス サブユニット（ペントン、ヘキソン）であることが判明した。この段階後にチュ ーブに針を刺してウイルスを回収し、Ｇ２５で透析又は脱塩によりセシウムを除 去する。実施例４：上清中のウイルス作製 本実施例は自然放出後の回収によるウイルス作製実験に関する。放出後にウイ ルスを限外濾過により回収後、塩化セシウムにより精製する。 ４．１．プロトコール 本方法では実施例３と異なり、細胞を感染後４０〜７２時間で回収せず、凍結 −融解サイクルを実施する必要なしに細胞の完全溶解を得るように、インキュベ ーションを８〜１２日間続ける。 その後、漸減細孔径（１０μｍ／１．０μｍ／０．８〜０．２μｍ）のディー プフィルターで濾過して上清を清澄化する。 ウイルスは０．１μｍの寸法であり、この段階で最小細孔径（０．２２μｍ） のフィルターで保持することによるウイルスの損失は全く観察されなかった。 一旦清澄化した上清をその後、カットオフ閾値３００ｋＤａのＭｉｌｌｉｐｏ ｒｅスパイラルメンブランでタンジェント限外濾過により濃縮する。 本発明で報告する実験では、濃縮倍率は１００ｍｌのシステムの死容積に基づ く。このシステムで容量４〜２０リットルの上清を濃縮すると、容量１００ｍｌ 〜２００ｍｌの濃縮液を難なく得ることができた（濃縮倍率２０〜１００倍に対 応）。 その後、濃縮液を０．２２μｍで濾過した後、実施例３に記載したように塩化 セシウム遠心分離により精製し、次いで透析段階を実施した。 ４．２．結果 純度 細胞内ウイルス（実施例３）のチューブは凝塊（脂質、タンパク質）が時折ウ イルスバンドにぶつかって濁った様相を示す が、本発明の方法により第１の塩化セシウム遠心分離段階後に得られたウイルス 調製物は培地の汚染物質から既に十分に分離したウイルスバンドを示し、汚染物 質は上層に保持される。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムによる高性能液体クロマト グラフィー分析（実施例５）も感染上清の限外濾過により得られた出発材料のこ の純度利得を立証し、核酸（ＯＤ２６０／２８０比１．８以上）及びタンパク質 （ＯＤ２６０／２８０比１未満）汚染物質は減少する。 ３７℃における上清中のウイルスの安定性 感染性培養土清のアリコートを感染後３７℃で種々の時間インキュベーション 後に分取し、プラークアッセイ法によりウイルスの安定性を滴定により測定した 。結果は以下の通りである。 ウイルスＡｄ−ＴＫ： ・感染後１０日力価＝３．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ ・感染後２０日力価＝３．３×１０８ｐｆｕ／ｍｌ ウイルスＡｄ−βＧａｌ： ・感染後８日力価＝５．８×１０８ｐｆｕ／ｍｌ ・感染後９日力価＝３．６×１０８ｐｆｕ／ｍｌ ・感染後１０日力価＝３．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ ・感染後１３日力価＝４．１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ ・感染後１６日力価＝５．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ 得られた結果から明らかなように、感染後少なくとも２０日まで上清の力価は 用量精度範囲内で安定である。更に、図１に示すように溶離用緩衝液中でウイル スは−２０℃と同様に−８０℃でも少なくとも８カ月安定である。 調製物の比感染性 このパラメーターはＨＰＬＣにより測定したウイルス粒子数とｐｆｕ値の比に 対応し、ウイルス調製物の感染能を表す。ＦＤＡ勧告によると、このパラメータ ーは１００未満でなければならない。このパラメーターは次のように測定した。 ２９３細胞を入れた２系列の培養びんに同時に同時点で同一条件下で同一ウイル スプレストックを感染させた。この実験は組換えアデノウイルスＡｄ−βｇａｌ で実施した後、アデノウイルスＡｄ−ＴＫでも実施した。各アデノウイルスで一 方の系列のびんは感染後４８時間に回収し、凍結−融解後にセシウム勾配で精製 した細胞内ウイルス生産サンプルとする。他方の系列は感染後１０日間インキュ ベートし、上清からウイルスを回収する。得られた精製調製物をプラークアッセ イにより滴定し、６．４Ｍ グアニジンでサンプルを変性後にＣ４ Ｖｙｄａｃ ４．６×５０ｍｍカラムで 逆相ＨＰＬＣによりＰＶＩＩタンパク質濃度を測定することにより、合計ウイル ス粒子数を定量する。ウイルス１個当たり７２０ＰＶＩＩコピーとしてＰＶＩＩ タンパク質の量をウイルス粒子数に相関させる（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，第２版（１９９０））。１．０吸光度単位＝粒子１．１×１０¹²個／ｍｌ を比吸光係数として２６０ｎｍでデンシトメトリー法により測定した精製調製物 のウイルス粒子数に前記方法を相関させる。 得られた結果によると、ウイルスＡｄ−βＧａｌではこの比は上清ウイルスで １６、細胞内ウイルスで４５である。ウイルスＡｄ−ＴＫでは、この比は上清法 でウイルスを回収した場合には７８、細胞内法により回収したウイルスでは８０ である。 電子顕微鏡分析 この方法は空の粒子又は同時に精製された遊離ウイルスサブユニットの存在を 検出すると共に、精製ウイルス調製物のタンパク質汚染又はウイルス粒子の解離 不能な凝集物の存在を評価することができる。 プロトコール：サンプル２０μｌを炭素格子に堆積し、ネガ ティブ着色観察のために１．５％酢酸ウラシルで処理する。観察には５０ｋＶ〜 １００ｋＶのＪｅｏｌ １０１０電子顕微鏡を使用する。 結果：上清から回収したウイルスを分析すると、汚染物質も凝集物も空のウイ ルス粒子もない適正な調製物を示す。更に、ウイルスの繊維とその規則的な幾何 構造を認めることができる。これらの結果は、本発明により得られるウイルス粒 子の高品質を裏付けている。 ＨＰＬＣ及びＳＤＳ ＰＡＧＥによるタンパク質プロフィルの分析 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析： サンプル２０μｌをＬａｅｍｍｌｉバッファー（Ｎａｔｕｒｅ２２７（１９９ ０）６８０−６８５）で希釈し、５分問９５℃で還元した後、１ｍｍ×１０ウェ ル、４→２０％勾配のＮｏｖｅｘゲルに加える。泳動後、ゲルをクーマシーブル ー染色し、Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ Ｐｈａｒｍａｃｉａで分析する 。分析によると、上清から回収したウェルの電気泳動プロフィルは文献のデータ に一致する（Ｌｅｎｎａｒｔ Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ，１９８４ Ｈ．Ｓ Ｇｉｎ ｓｂｅｒｇ編， Ｐｌｅｎｕｍ ｐｒｅｓｓ，３１０−３３８）。 逆相ＨＰＬＣ分析： 図２は、細胞内から回収した２つのウイルスサンプルと上清法により精製した １つのウイルスサンプルから得られた３種のクロマトグラムを重ねたものである 。実験条件は、カラムＶｙｄａｃ ｒｅｆ ２５４ Ｔｐ５４０５，ＲＰＣ４ ４．６×５０ｍｍ、溶媒Ａ：Ｈ₂０＋０．０７％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ＋０ ．０７％ＴＦＡ、直線勾配：Ｔ＝０分 ％Ｂ＝２５；Ｔ＝５０分 ％Ｂ＝５０％ ；流速＝１ｍｌ／分、デテクター＝２１５ｎｍである。クロマトグラムはサンプ ル間の完全な一致を示し、各ピークの相対強度に差はない。各ピークの種をシー ケンシングにより決定すると、存在するタンパク質はすべてウイルスに由来する ことが判明した（下表参照）。 トランスダクション効率及び細胞毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析 ２４穴プレートで培養したＨＣＴ１１６細胞にＭＯＩを漸増させながら感染さ せ、感染後２及び５日に非感染対照に対する生存細胞の百分率をクリスタルバイ オレット染色法により測定することにより、細胞毒性分析を実施する。 結果を下表に示す。 トランスダクション効率の分析 ２４穴プレートで培養した複製に許容不能なＷ１６２細胞にウイルス粒子濃度 を漸増させながら感染させることにより、アデノウイルスＡｄ−βＧａｌの調製 物のトランスダクション効率を測定する。同一量のウイルス粒子を堆積し、基質 としてＸ−ｇａｌと共にインキュベーション後にβ−ガラクトシダーゼ活性を発 現する細胞を感染後４８時間に計数する。各青色細胞を１トランスダクション単 位（ＴＤＵ）として計数し、結果にサンプルの希釈度を乗じ、サンプルのトラン スダクション単位で表した濃度を得る。次に、ＴＤＵで表した濃度に対するウイ ルス粒子濃度の比を計算することによりトランスダクション効率を表す。得られ た結果は、精製ウイルスが良好なｉｎ ｖｉｔｒｏトランスダクション効率を示 すことを立証する。 ｉｎ ｖｉｖｏ脳内発現の分析 本発明によるアデノウイルスのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入及び発現効率を評価 する目的で、アデノウイルスを免疫適格マウスＯＦ１の線条体に定位経路で注入 した。このために、１０⁷ｐｆｕのウイルス１μｌ容量を（門歯バーを０ｍｍと して）前後方＋０．５、中外側２、深さ−３．５の定位点に注入した。 注入後７日に脳を分析した。得られた結果によると、トランスダクション効率 が高く、数千の細胞が導入され、非常に強い核内発現と、高頻度で強い細胞質内 拡散を示す。 ４．３．ウイルスの放出速度 本実施例はパッケージング細胞の培養上清へのアデノウイルスの放出速度試験 に関する。 本試験はアデノウイルスのゲノムの領域の相補的オリゴヌクレオチドを用いる 半定量的ＰＣＲにより実施した。このために、直鎖化したウイルスＤＮＡ（１〜 １０ｎｇ）を１０ＸＰＣＲバッファー中ｄＸＴＰ（２μｌ，１０ｍＭ）、特異的 オリゴヌクレオチド対及びＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｅｔｕｓ）の存在 下でインキュベートし、２分間９１℃、３０サイクル（１分間９１℃、２分間ア ニーリング温度、３分間７２℃）、５分間７２℃、次いで４℃の条件下で３０増 幅サイクルにかけた。ＰＣＲ実験は下記配列のオリゴヌクレオチド対を用いて実 施した。 Ａｄ−βＧａｌを感染させた２９３細胞の上清で種々の感染後時点で上清中に 放出されたアデノウイルスの量を測定した。得られた結果を図３に示す。この結 果から明らかなように、細胞放出は感染後５又は６日目から開始する。 当然のことながら、同じ目的で他の任意のウイルス測定方法を他の任意のパッ ケージング系で任意種のアデノウイルスに使用することができる。実施例５：限外濾過及びイオン交換によるウイルス精製 本実施例は、濃縮液に含まれるアデノウイルスを如何にして非常に高い収率で 単一イオン交換クロマトグラフィー段階で直接精製できるかを示す。 ５．１．プロトコール 従って、本実験では、出発材料は実施例４に記載した濃縮液（又は限外濾渣） から構成する。この濾渣はＰＢＳバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する １０ｍＭリン酸、ｐＨ７．２）中５〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜３ ０ｍｇ／ｍｌの全タンパタ質濃度をもつ。 ２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１０％グリセロールを含 有するＴｒｉｓ／５０ｍＭ ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．０)(バッフアーＡ)で平 衡化したＳｏｕｒｃｅ Ｑ１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を入れたカラムにウイル ス調製物から得られた限外濾過上清を注入する。バッファーＡ１０カラム容量で リンスした後、直線流速６０〜３００ｃｍ／時、より好ましくは１２ｃｍ／時で ２５カラム容量でＮａＣｌの直線勾配（２５０ｍＭ→１Ｍ）を用いて吸着種を溶 離する。２６０ｎｍで得られた典型的溶離プロフィルを図４に示す。ウイルス粒 子を含むフラクションを集める。このフラクションは対称な細いピークに対応し 、その保持時間は限外濾過により精製したウイルス粒子調製物で得られる保持時 間に一致する。上記条件下では、ウイルス粒子ピークの優れた分離を維持しなが ら、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ１５樹脂１ｍｌ当たり最低３０ｍｇの全タンパク質を注入 することが可能である。 アデノウイルスβ−ｇａｌ（実施例２）の調製物から実施した典型的実験では 、全タンパク質１２．６ｍｇ、即ち５×１０¹⁰ＰＦＵ及び１．６×１０１０ＴＤ ＵをＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラム（１ｍｌ）に注入した。クロマトグラフィー後 に集めたウイルス粒子ピーク（３．２ｍｌ、図５）はタンパク質１７３μｇ、３ ．２×１０１０ＰＦＵ及び２．３×１０１０ＴＤＵを含んでいた。従って、ウイ ルス粒子は７０倍（タンパク質の量で表す）に精製され、精製収率はＰＦＵで６ ４％、ＴＤＵで１４２％である（下表参照）。 ５．２．純度 この精製段階後に集めたフラクションを下記クロマトグラフィーシステムでＲ ｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラム（１ｍｌ）で高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）により分析すると、ウイルス粒子として純度≧９８％（２６０ｎｍでＵＶ検 出）を示す。クロマトグラフィーシステムは、実施例５．１に記載したようにク ロマトグラフィー精製したフラクション１０μｌをＴｒｉｓ／５０ｍＭ ＨＣｌ バッファー（ｐＨ８．０）（バッファーＢ）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ １５カラム（ゲル１ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注人する。バッファーＢ５ｍ ｌでリンスした後、流速１ｍｌ／分でバッファーＢ中ＮａＣｌ３０ｍｌの直線勾 配（０→１Ｍ）を用いて吸着種を溶離する。吸着種を２６０ｎｍで検出する。こ のＨＰＬＣ分析（図５）は更に、限外濾渣中に存在する残留ウシ血清アルブミン が分取クロマトグラフィーの間に完全に除去されることを示す。精製フラクショ ン中のその濃度は＜０．１％であると推定される。抗ＢＳＡポリクローナル抗体 を用いたウェスタンブロット分析（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍで検出）によると 、クロマトグラフィー調製物中のＢＳＡ濃度はウイルス１ｍｇ当たり１００ｎ ｇ未満である。 クロマトグラフィー精製したアデノウイルスフラクションを変性条件下（ＳＤ Ｓ）にポリアクリルアミドゲル（４→２０％）電気泳動分析する。その後、タン パク質バンドを硝酸銀で検出する。この分析によると、クロマトグラフィーによ り得られたアデノウイルス調製物は、非アデノウイルスタンパク質による調製物 の汚染に相当するような付加的タンパク質バンドを示さないので、常法で超遠心 により得られた調製物に少なくとも等しい純度レベルをもつ。 クロマトグラフィーにより得られたアデノウイルス調製物は１．３０±０．０ ５の吸光度Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比を示す。この値は超遠心により得られ る最良の調製物で得られる値に等しく、調製物が汚染性タンパク質や汚染性核酸 を含んでいないことを示す。 クロマトグラフィー精製したウイルスＡｄ−βｇａｌを実施例４．２に記載し た条件下で電子顕微鏡分析すると、汚染物質も凝集物も空のウイルス粒子も含ま ない適正な調製物であることが明らかである（図１１）。更に、この調製物の塩 化セシウム勾配超遠心によると密度１．３０のただ１つのバンドが検出 され、クロマトグラフィー調製物が空の粒子やキャプシドフラグメントで汚染さ れていないことを裏付ける。精製時にはウイルスのクロマトグラフィーピークに 続いてその後部にショルダー（又は二次ピーク）か検出されるが、これは主ピー クに合わせない。このフラクションを塩化セシウム勾配で超遠心すると、密度１ ．２７のバンドが検出され、このフラクションを組成分析すると核酸を含んでな い。電子顕微鏡分析によると、このフラクションは表面に穴のあいた不規則形状 の粒子を含んでいる（図１２）。従って、（ＤＮＡを含まない）空の不完全粒子 である。従って、アデノウイルスのクロマトグラフィー精製は精製前に調製物中 に少量存在する空の粒子を除去することが明らかである。 ５．３．タンパク質ＡｐｏＡ１又はチミジンキナーゼをコードする遺伝子等の 治療用遺伝子を含むアデノウイルスの精製 本実施例は、治療用タンパタ質をコードする異種核酸配列をそのゲノム中に含 むアデノウイルスを如何にして単一イオン交換クロマトグラフィー段階で直接精 製できるかを示す。更に、アデノウイルスのクロマトグラフィー挙動がこのアデ ノウイルスに含まれる異種核酸配列から独立しているため、種々の異種 核酸配列をもつ種々のアデノウイルスに同一精製方法を実施できることも示す。 典型的精製実験では、感染後１０日に回収した細胞培養物の濃縮上清１８ｍｌ （タンパク質７２ｍｇ、粒子１．０８×１０¹³個）を実施例５．１に記載したシ ステムでクロマトグラフィー精製することにより、タンパク質ＡｐｏＡ１（実施 例２、ＷＯ９４／２５０７３）をコードする異種核酸配列をそのゲノム中に含む アデノウイルスを精製する（図６Ａ）。クロマトグラフィー後に集めたウイルス 粒子ピーク（１４ｍｌ、タンパク質１．４ｍｇ）は粒子９．９８×１０¹²個を含 んでおり、９２％の粒子収率と５１の精製倍率を示す。この精製段階後に集めた フラクション（図６Ｂ）を５．２に記載した条件下でクロマトグラフィー分析す ると、９８％を上回るウイルス粒子純度を示す。クロマトグラフィー精製したア デノウイルスフラクションを実施例５．２に記載した条件下で電気泳動分析した 処、この調製物は超遠心により常法で得られた調製物に少なくとも等しい純度レ ベルをもち、汚染性タンパク質や汚染性核酸を含んでいないことが判明した。 別の典型的精製実験では、細胞培養物の濃縮上清３６ｍｌ （タンパク質１８０ｍｇ、粒子４．６９×１０¹³個）を実施例５．１に記載した システムでクロマトグラフィー精製することにより、１型単純ヘルペスのチミジ ンキナーゼタンパク質（実施例２、ＷＯ９５／１４１０２）をコードする異種核 酸配列をそのゲノムに含むアデノウイルスを精製する（図７Ａ）。クロマトグラ フィー後に集めたウイルス粒子ピーク（２０ｍｌ、タンパク質５．６ｍｇ）は粒 子４．２８×１０¹³個を含んでおり、粒子収率９１％と精製倍率３２を示す。こ の精製段階後に集めたフラクション（図７Ｂ〜Ｄ）を実施例５．２に記載した条 件下でクロマトグラフィー分析すると、９９％を上回るウイルス粒子純度を示し 、吸光度比は１．２９であった。クロマトグラフィー精製したアデノウイルスフ ラクションを実施例５．２に記載した条件下で電気泳動分析した処、この調製物 は超遠心により常法で得られた調製物に少なくとも等しい純度レベルをもち、汚 染性タンパク質や汚染性核酸を含んでいないことが判明した。 ５．４．細胞内アデノウイルスの強アニオン交換による精製 本実施例は、異種核酸配列をそのゲノム中に含むアデノウイルスを、該ウイル スを産生するパッケージング細胞の溶解液か ら如何にして単一イオン交換クロマトグラフィー段階で直接精製できるかを示す 。 典型的精製実験では、感染後３日に化学的溶解（１％Ｔｗｅｅｎ−２０）によ り回収した細胞培養物の濃縮溶解液４５０ｍｌ（即ち粒子２．５×１０¹⁴個）を 実施例５．１に記載したシステム（ＦｉｎｅＬｉｎｅ Ｐｉｌｏｔ ３５カラム ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ樹脂１００ｍｌ）でクロマトグラ フィー精製することにより、タンパク質β−ｇａｌをコードする異種核酸配列を そのゲノム中に含むアデノウイルスを精製する。クロマトグラフィー後に集めた ウイルス粒子ピーク（１１０ｍｌ）は粒子２．１５×１０¹⁴個を含んでおり、８ ６％の粒子収率を示す。この精製段階後に集めたフラクションを５．２に記載し た条件下でクロマトグラフィー分析すると、９８％を上回るウイルス粒子純度を 示す。クロマトグラフィー精製したアデノウイルスフラクションを実施例５．２ に記載した条件下で電気泳動分析した処、この調製物は超遠心により常法で得ら れた調製物に少なくとも等しい純度レベルをもち、汚染性タンパク質又は汚染性 核酸を含まないことが判明した。５．５．限外濾過と種々のカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによるウ イルスの精製 本実施例は、マトリックスの第４級アミン基との相互作用によるアニオン交換 を同一分離原理で利用しながら、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ支持体と異なるゲルを使 用することにより、濃縮液に含まれるアデノウイルスを如何にして単一イオン交 換クロマトグラフィー段階で直接精製できるかを示す。 アデノウイルスの典型的精製実験では、実施例５．１に記載したプロトコール に従い、（β−ｇａｌ、アポリポタンパク質ＡＩ及びＴＫをコードする）種々の 組換えアデノウイルスをＳｏｕｒｃｅ Ｑ３０ゲルカラムでクロマトグラフィー 精製した。得られた結果によると、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ３０ゲルは７０〜１００％ の収率で純度約８５％のウイルス調製物を得ることができる。更に、得られた結 果によると、Ｑ３０はアデノウイルス精製効率１０００（理論プレート数により 表す）と精製能０．５〜１×１０１２ｐｖ／ｍｌ（ピークが変化せずにクロマト グラフィー精製可能な最大ウイルス量）をもつ。従って、これらの結果から明ら かなように、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ３０ゲルはＳｏｕｒｃｅ Ｑ１５（純度約９９％ 、精製効率約８０００及 び精製能約２．５〜５×１０１２ｐｖ／ｍｌ）よりも性質が劣るが、組換えアデ ノウイルスの精製に利用することができる。 別の典型的なアデノウイルス精製実験では、実施例５．１に記載したプロトコ ールに従い、アデノウイルスβ−ｇａｌをＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラムでク ロマトグラフィー精製する。こうして得られた限外濾渣と精製ウイルス調製物に 対応するクロマトグラフィー像を図８に示す。 別の典型的なアデノウイルス精製実験では、実施例５．１に記載したプロトコ ールに従い、アデノウイルスβ−ｇａｌをＰｏｒｏｓ ＨＱ／Ｍカラムでクロマ トグラフィー精製する。こうして得られた限外濾渣と精製ウイルス調製物に対応 するクロマトグラフィー像を図９に示す。実施例６：限外濾過及びゲル浸透によるウイルスの精製 本実施例は、濃縮液（限外濾渣）に含まれるアデノウイルスを如何にして非常 に高い収率でゲル浸透クロマトグラフィーにより直接精製できるかを示す。 ６．１．プロトコール 実施例４で得られた限外濾渣２００μｌ（即ちタンパク質１．３ｍｇ）を、例 えば１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するＰＢ Ｓバッフアー（ｐＨ７．２）（バッファーＣ）で平衡したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００ＳＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を満たしたＨＲ １０／３０カラム（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入する。種を分画し、流速０．５ｍｌ／分でバッファ ーＣで溶離し、カラムの出口で２６０ｎｍでＵＶ検出する。あるいは、１００ｎ ｍ〜１０００ｎｍの粒子の場合にＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００ＨＲカラム よりも良好な分離を可能にするＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２０００を満たしたカ ラムを同一実施条件下で使用してもよい。 直列に連結した２つのＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（Ｓｅ ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００ＨＲ又はＳ−２０００カラムに続いてＳｕｐｅｒ ｄｅｘ ２００ ＨＲカラムを配置）をバッファーＣで平衡したシステムで限外 濾過上清（２００μｌ）をクロマトグラフィー精製することにより、上記２種の ゲル浸透タロマトグラフィーシステムの分離を改善することができる。流速０． ５ｍｌ／分でバッファーＣにより種を溶離し、２６０ｎｍでＵＶ検出する。この システムでは、ウイルス粒子ピークはＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００ＨＲ又 はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２０００カラムを単独で用いたシ ステムよりも著しく良好に低分子量種から分離される。 典型的実験では、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００ＨＲ−Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０の２つのカラムからなるシステムで限外濾渣（２０ ０μｌ、タンパク質１．３ｍｇ）をクロマトグラフィー精製した（図１０）。ウ イルス粒子を含むクロマトグラフィーピークを集めた。その保持時間は、超遠心 により精製したウイルス粒子調製物で得られた保持時間に一致する。クロマトグ ラフィー後に集めたウイルス粒子ピーク（７ｍｌ）はタンパク質２８μｇ及び３ ．５×１０９ＰＦＵを含んでいた。５．２に記載した条件下で分析用イオン交換 クロマトグラフィーにより分析すると、分析カラムに強く保持された汚染物質ピ ークの存在が判明し、その表面積はウイルスピークの表面積の約２５％に相当す る。その２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸光度比は１．８６であり、この汚染物質ピー クが核酸に対応することを示す。従って、ウイルス粒子は約５０倍(タンパク質 の量として表す)に精製され、精製収率はＰＦＵで８５％である。 あるいは、バッファーＣで平衡したＴＳＫ Ｇ６０００ ＰＷカラム（７．５ ×３００ｍｍ；ＴｏｓｏＨａａｓ）でウイ ルス粒子調製物（限外濾液又はアニオン交換クロマトグラフィーの出口のフラク ション）をクロマトグラフィー精製してもよい。流速０．５ｍｌ／分でバッファ ーＣで種を溶離し、２６０ｎｍでＵＶ検出する。更に、直列に連結した２つのカ ラム［ＴＳＫ Ｇ６０００ ＰＷ（７．５×３００ｍｍ）カラムに続いてＳｕｐ ｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲカラムを配置］をバッファーＣで平衡したシステムで 限外濾過上清（５０〜２００μｌ）をクロマトグラフィー精製することにより、 クロマトグラフィーシステムの分離、特に低分子量種からのウイルス粒子ピーク の分離を増加すると有利である。実施例７：限外濾過、イオン交換及びゲル浸透によるウイルスの精製 例えばウイルス粒子の純度レベルを更に改善する目的だけでなく、主にウイル ス調製物の後期使用（注入等）に適合可能又は適当な培地でウイルス粒子を条件 付けする目的で、アニオン交換クロマトグラフィー（実施例５）からのウイルス 粒子フラクションを上記ゲル浸透クロマトグラフィーシステムの１つでクロマト グラフィー精製すると有利である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ， ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．パッケージング細胞培養物にウイルスＤＮＡを導入し、産生したウイルスを 上清中に放出後に回収することを特徴とする組換えアデノウイルスの製造方法。 ２．ウイルスの少なくとも５０％が上清中に放出された時点で回収を行うことを 特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．ウイルスの少なくとも７０％が上清中に放出された時点で回収を行うことを 特徴とする請求項１に記載の方法。 ４．ウイルスの少なくとも９０％が上清中に放出された時点で回収を行うことを 特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．限外濾過によりウイルスを回収することを特徴とする請求項１に記載の方法 。 ６．限外濾過がタンジェント限外濾過であることを特徴とする請求項５に記載の 方法。 ７．１０００ｋＤａ未満のカットオフ閾値をもつ膜で限外濾過を行うことを特徴 とする請求項５又は６に記載の方法。 ８．アニオン交換クロマトグラフィーによりウイルスを回収することを特徴とす る請求項１に記載の方法。 ９．アニオン交換クロマトグラフィーが強アニオン交換クロマトグラフィーであ ることを特徴とする請求項８に記載の方法。 １０．強アニオン交換クロマトグラフィーがＳｏｕｒｃｅ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ、 Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ及びＰｏｒｏｓ ＱＥ樹脂、Ｆｒａ ｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ型樹脂及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑから選 択される支持体上で実施されることを特徴とする請求項９に記載の方法。 １１．ゲル浸透クロマトグラフィーによりウイルスを回収することを特徴とする 請求項１に記載の方法。 １２．ゲル浸透クロマトグラフィーがＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００ ＨＲ、 Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００ ＳＦ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００ ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２０００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ、 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ、４Ｂ又は６Ｂ及びＴＳＫ Ｇ６０００ ＰＷゲルか ら選択される支持体上で実施されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。 １３．限外濾過後にアニオン交換クロマトグラフィーを実施することによりウイ ルスを回収することを特徴とする請求項１に記載の方法。 １４．限外濾過後にアニオン交換クロマトグラフィーを実施し、更にその後、ゲ ル浸透クロマトグラフィーを実施することによりウイルスを回収することを特徴 とする請求項１３に記載の方法。 １５．パッケージング細胞がアデノウイルスのＥ１機能をトランス相補する細胞 であることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。 １６．パッケージング細胞がアデノウイルスのＥ１及びＥ４機能をトランス相補 する細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 １７．パッケージング細胞がアデノウイルスのＥ１及びＥ２ａ機能をトランス相 補する細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 １８．細胞がヒト胎児腎細胞、ヒト網膜芽細胞又はヒト肺癌細胞であることを特 徴とする請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。 １９．強アニオン交換クロマトグラフィーによる精製段階を含むことを特徴とす る生物培地からの組換えアデノウイルスの精製方法。 ２０．生物培地が前記ウイルスを産生するパッケージング細胞の上清であること を特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２１．生物培地が前記ウイルスを産生するパッケージング細胞の溶解液であるこ とを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２２．生物培地が前記ウイルスから予備精製された溶液であることを特徴とする 請求項１９に記載の方法。 ２３．第４級アミンで官能化した支持体上でクロマトグラフィーを行うことを特 徴とする請求項１９に記載の方法。 ２４．支持体がアガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、ポリ［ス チレン−ジビニルベンゼン］、エチレングリコール−メタクリレートコポリマー から単独又は混合物として選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法 。 ２５．クロマトグラフィーがＳｏｕｒｃｅ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ ＱＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡ Ｅ又はＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ樹脂上で実施されることを特徴とす る請求項２４に記載の方法。 ２６．クロマトグラフィーがＳｏｕｒｃｅ Ｑ、好ましくはＳｏｕｒｃｅ Ｑ１ ５樹脂上で実施されることを特徴とする請求 項２５に記載の方法。 ２７．予備限外濾過段階を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２８．限外濾過が３００〜５００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜によるタンジ ェント限外濾過であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。 ２９．請求項１又は１９に記載の方法により得られる精製ウイルス調製物。 ３０．請求項２９に記載のウイルス調製物と、医薬的に許容可能なベクターを含 む医薬組成物。 ３１．アデノウイルスの精製のためのヨージキサノール−５，５’−［（２−ヒ ドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’ −ビス−（２，３−ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリヨード−１，３− ベンゼンカルボキサミド）］の使用。 ３２．第１の超遠心段階と、第２の希釈又は透析段階と、第３のアニオン交換ク ロマトグラフィー段階を含む、生物培地からのアデノウイルスの精製方法。