ES2553207T3 - Nuevo epítopo inmunogénico para inmunoterapia - Google Patents

Abstract

Péptido consistente en la secuencia ILAPVILYT conforme a la SEQ ID N. º 2 que induce la reacción cruzada de los linfocitos T con dicho péptido.

Description

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El factor nuclear (NF)-kappaB se activó predominantemente en células de adenoma y adenocarcinoma que expresaban NOX1 en abundancia, lo cual indica que la NOX1 podría estimular las vías antiapoptóticas que dependen del NF-kappaB en los tumores de colon (Fukuyama, M. et al. Overexpression of a novel superoxideproducing enzyme, NADPH oxidase 1, in adenoma and well differentiated adenocarcinoma of the human colon. Cancer Lett. 2005, 221, 97-104).

Se ha descrito que la señalización de Wnt3a/beta-catenina induce la expresión de NOX1 (Petropoulos, H. & Skerjanc, I. S. Beta-catenin is essential and sufficient for skeletal myogenesis in P19 cells. J Biol Chem. 2002, 277, 15393-15399).

Recientemente se ha planteado que las especies reactivas de oxígeno (ROS) inducen la apoptosis endotelial, fenómeno que a su vez induce la expresión de varias moléculas de adhesión para las células tumorales. Esto significaría que alterando la producción de ROS tal vez se podría impedir la recidiva del tumor en sitios distantes (Ten, KM, van der Wal, JB, Sluiter, W, Hofland, LJ, Jeekel, J, Sonneveld, P, and van Eijck, CH; The role of superoxide anions in the development of distant tumor recurrence, Br J Cancer, 2006, 95,1497-1503).

Antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA)

El PCNA se halla en el núcleo y es un cofactor de la ADN-polimerasa delta. La proteína codificada actúa como un homotrímero y ayuda a mejorar la procesividad de la síntesis de la hebra conductora durante la replicación del ADN. Así pues, se expresa en todas las células en proliferación, especialmente en las células tumorales, y se usa como marcador para detectar la proliferación.

ADN-topoisomerasa II

Los genes TOP2A y TOP2B codifican isoformas de una ADN-topoisomerasa, enzima que controla y altera los estados topológicos del ADN durante la transcripción. Esta enzima nuclear interviene en procesos como la condensación cromosómica, la separación de las cromátidas y el alivio de la tensión torsional que aparece durante la replicación y la transcripción del ADN. Las ADN-topoisomerasas catalizan la rotura transitoria y la religazón de las dos hebras de la doble hélice de ADN, lo que las permite girar libremente una respecto a la otra, alterando de ese modo la topología del ADN. Las dos isoformas de la enzima son probablemente el producto de un fenómeno de duplicación génica. El gen que codifica la forma alfa está localizado en el cromosoma 17 y el gen beta en el cromosoma 3.

El gen TOP2A es la diana de varios fármacos antitumorales y diversas mutaciones del mismo han sido vinculadas con el desarrollo de resistencia farmacológica.

TOP2A es adyacente a HER-2, el oncogén amplificado con más frecuencia en el cáncer de mama, en el sitio cromosómico 17ql2-q21 y aparece amplificado o eliminado, con igual frecuencia, en casi el 90% de los tumores primarios de mama HER-2 positivos (Jarvinen, TA and Liu, ET; Topoisomerase II alpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer-more common than anticipated, Cytopathology, 2003, 14, 309-313). También se han descrito amplificaciones de TOP2A en otros tipos de cáncer.

Sin TOP2A la replicación del ADN y la división celular son imposibles. Ello lo ha convertido en la diana principal de muchos regímenes de tratamiento antitumoral, aunque el mecanismo exacto con el que destruye las células aún escapa a nuestro conocimiento (Kellner, U,Sehested, M, Jensen, PB,Gieseler, F, and Rudolph, P; Culprit and victim -DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243). El éxito de esta estrategia se ve mermado por la aparición de resistencia espontánea, y los daños del ADN causados por los fármacos pueden potenciar la malignidad. Datos recientes apuntan a que la amplificación y la deleción de TOP2A podrían estar detrás tanto de la sensibilidad como de la resistencia vinculadas a la quimioterapia con inhibidores de TOP2A, dependiendo del defecto genético específico en el locus de TOP2A.

No está claro si la implicación de TOP2B en el cáncer es similar a la de TOP2A o si existe una diferencia importante entre ambas isoformas. TOP2B puede al menos complementar parte de la actividad de TOP2A (Sakaguchi, A and Kikuchi, A; Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase, J Cell Sci., 2004, 117, 1047-1054).

Molécula de adhesión celular 5 relacionada con el antígeno carcinoembrionario

El antígeno carcinoembrionario (CEA = CEACAM5) es una proteína de membrana de 180 kDa fuertemente glucosilada compuesta por tres unidades repetidas similares a la región C2 de Ig flanqueadas por una región Nterminal similar a la región V de Ig, y una región C-terminal que alberga una región de enlace con glucofosfatidilinositol (Hegde, P,Qi, R, Gaspard, R, Abernathy, K, Dharap, S, Earle-Hughes, J, Gay, C, Nwokekeh, NU, Chen, T, Saeed, Al, Sharov, V, Lee, NH, Yeatman, TJ, and Quackenbush, J; Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray, Cancer Res., 2001, 61, 7792-7797).

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En un metanálisis de estudios que investigaron la expresión génica en el carcinoma colorrectal, el TGFBI fue identificado como uno de los nueve únicos genes que aparecían regulados al alza reiteradamente (4 estudios de TGFBI) (Shih, W, Chetty, R, and Tsao, MS; Expression profiling by microarrays in colorectal cancer, Oncol. Rep., 2005, 13, 517-524).

En tejidos de páncreas humano se apreció un incremento de 32,4 veces en los niveles del ARNm del TGFBI en tumores pancreáticos en comparación con los tejidos de control normales. Los análisis de hibridación in situ revelaron que el ARNm del TGFBI se expresaba principalmente en células cancerosas del interior de la masa tumoral pancreática (Schneider, D, Kleeff, J, Berberat, PO, Zhu, Z, Korc, M, Friess, H, and Buchler, MW; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells, Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1588, 1-6).

El TGFBI ha sido identificado como un gen promotor de la angiogénesis en un modelo in vitro. Además, en varios tumores se ha detectado un aumento drástico de su expresión. Oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el TGFBI bloquearon tanto la expresión génica como la formación del tubo endotelial in vitro, lo cual parece indicar que el TGFBI puede desempeñar un papel esencial en las interacciones entre la matriz y la célula endotelial (Aitkenhead, M, Wang, SJ, Nakatsu, MN, Mestas, J, Heard, C, and Hughes, CC; Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM, Microvasc. Res., 2002, 63, 159171).

Proteína tirosina fosfatasa, de tipo receptor, Zeta 1 (PTPRZX)

El PTPRZ1 es miembro de la familia de las proteínas tirosina fosfatasa de tipo receptor que codifica una proteína de membrana de un solo paso de tipo 1 dotada de dos dominios citoplasmáticos de tirosina fosfatasa, un dominio alfaanhidrasa carbónica y un dominio de fibronectina de tipo III. La expresión de este gen es inducida en células de cáncer gástrico (Wu, CW, Li, AF, Chi, CW, and Lin, WC; Protein tyrosine-phosphatase expression profiling in gastric cancer tissues, Cancer Lett., 2006, 242, 95-103), en los oligodendrocitos remielinizantes de las lesiones de la esclerosis múltiple (Harroch, S, Furtado, GC, Brueck, W, Rosenbluth, J, Lafaille, J, Chao, M, Buxbaum, JD, and Schlessinger, J; A critical role for the protein tyrosine phosphatase receptor type Z in functional recovery from demyelinating lesions, Nat. Genet., 2002, 32,411-414), y en células de riñón embrionarias humanas en condiciones hipóxicas (Wang, V, Davis, DA, Haque, M, Huang, LE, and Yarchoan, R; Differential gene up-regulation by hypoxiainducible factor-1 alpha and hypoxia-inducible factor-2 alpha in HEK293T-cells, Cancer Res., 2005, 65, 3299-3306).

Tanto la proteína como el transcrito se sobreexpresan en las células de glioblastoma, promoviendo su migración haptotáctica (Lu, KV, Jong, KA, Kim, GY, Singh, J, Dia, EQ, Yoshimoto, K, Wang, MY, Cloughesy, TF, Nelson, SF, and Mischel, PS; Differential induction of glioblastoma migration and growth by two forms of pleiotrophin, J Biol Chem., 2005, 280,26953-26964).

Además, el PTRPZ1 aparece amplificado con frecuencia a nivel del ADN genómico en el glioblastoma (Mulholland, PJ, Fiegler, H, Mazzanti, C, Gorman, P, Sasieni, P, Adams, J, Jones, TA, Babbage, JW, Vatcheva, R, Ichimura, K, East, P, Poullikas, C, Collins, VP, Carter, NP, Tomlinson, IP, and Sheer, D; Genomic profiling identifies discrete deletions associated with translocations in glioblastoma multiforme, Cell Cycle, 2006, 5, 783-791).

Cinasa Janus y proteína interaccionante con los microtúbulos 2 (JAKMIP2)

La JAKMIP2 ha sido identificada como una de las muchas dianas ulteriores confirmadas y presuntas de PAX3-FKHR que aparecen muy sobreexpresadas en el rabdomiosarcoma pediátrico de subtipo alveolar o ARMS (Lae, M, Ahn, E, Mercado, G, Chuai, S, Edgar, M, Pawel, B, Olshen, A, Barr, F, and Ladanyi, M; Global gene expression profiling of PAX-FKHR fusion-positive alveolar and PAX-FKHR fusion-negative embryonal rhabdomyosarcomas, J Pathol., 2007, 212,143-151).

Fibronectina 1 (FN1)

La fibronectina es una glucoproteína de alto peso molecular que contiene alrededor de un 5% de glúcidos y que se une a proteínas receptoras que atraviesan la membrana celular, las integrinas. Además de a las integrinas, también se une a componentes de la matriz extracelular como el colágeno, la fibrina y la heparina. Existen varias isoformas de la fibronectina, todas producto del mismo gen. Las fibronectinas desempeñan un papel esencial en el mantenimiento de la morfología celular normal, la adhesión y la migración celular, la hemostasia, la trombosis, la cicatrización de heridas, la diferenciación y la proliferación (Hynes, RO; Fibronectins, Sci. Am., 1987, 254, 42-51).

La fibronectina polimérica, sFN, se forma in vitro tratando la fibronectina soluble con un péptido de 76 aa, el III1-C (llamado anastelina), que deriva de la primera repetición de tipo III de la fibronectina. Los estudios in vivoconratones portadores de tumores han demostrado que la aplicación sistémica de anastelina o de sFN suprimía el crecimiento, la angiogénesis y la metástasis tumorales (Yi, M and Ruoslahti, E; A fibronectin fragment inhibits tumor growth, angiogenesis, and metastasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2001, 98, 620-624). Anginex es un péptido sintético de 33 aminoácidos que se modeló originalmente para reproducir la estructura en lámina beta de proteínas antiangiogénicas. Se ha demostrado que anginex inicia la polimerización de la fibronectina y es inactivo en ratones que carecen de fibronectina plasmática (Akerman, ME, Pilch, J, Peters, D, and Ruoslahti, E; Angiostatic peptides use plasma fibronectin to home to angiogenic vasculature, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2005, 102, 2040-2045). Un

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crecimiento y la capacidad invasiva del tumor en el bazo y sus metástasis en el hígado. En conjunto, tales hallazgos sugieren la posible utilidad del CH50 en la terapia génica contra el cáncer hepático (Liu, Y, Huang, B, Yuan, Y, Gong, W, Xiao, H, Li, D, Yu, ZR, Wu, FH, Zhang, GM, and Feng, ZH; Inhibition of hepatocarcinoma and tumor metastasis to liver by gene therapy with recombinant CBD-HepII polypeptide of fibronectin, Int. J Cancer, 2007 121

(1) 184-92). La fibronectina posee un sitio funcional oculto (secuencia YTIYVIAL dentro de la decimocuarta repetición de tipo III) que se opone a la adhesión de la célula a la matrizextracelular. Un péptido 22-ámero de la fibronectina que contiene este sitio, llamado FNIII14, inhibe la adhesión mediada por la integrina beta-1 sin unirse a las integrinas. El estudio demuestra que el FNIII14 podría impedir la metástasis de las células de linfoma (Kato, R, Ishikawa, T, Kamiya, S, Oguma, F, Ueki, M, Goto, S, Nakamura, H, Katayama, T, and Fukai, F; A new type of antimetastatic peptide derived from fibronectin, Clin Cancer Res., 2002, 8, 2455-2462).

Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)

El EGFR desempeña un papel importante en la regulación de la proliferación, la diferenciación y la supervivencia de las células normales. Por esa razón el estado del EGFR suele aparecer alterado en un abanico de tipos de tumores humanos y en general acarrea un pronóstico malo. Contribuye al crecimiento y supervivencia de las células neoplásicas a través de diversas vías (Maehama, T and Dixon, JE; The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, J Biol Chem., 1998, 273, 13375-13378). Las anomalías del EGFR constituyen una de las aberraciones moleculares más habituales en el glioblastoma (Zawrocki, A and Biemat, W; Epidermal growth factor receptor in glioblastoma, Folia Neuropathol., 2005,43, 123-132).

La amplificación del EGFR y la sobreexpresión de su ARNm son frecuentes en los gliomas de alto grado de origen astrocítico, y siempre están estrechamente asociadas con un nivel elevado de la proteína EGFR (Wong, AJ, Bigner, SH, Bigner, DD, Kinzler, KW, Hamilton, SR, and Vogelstein, B; Increased expression of the epidermal growth factor receptor gene in malignant gliomas is invariably associated with gene amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1987, 84, 6899-6903; Chaffanet, M, Chauvin, C, Laine, M, Berger, F, Chedin, M, Rost, N, Nissou, MF, and Benabid, AL; EGF receptor amplification and expression in human brain tumors, 1992, Eur. J Cancer, 28, 11-17). La sobreexpresión de la proteína sin amplificación génica ha sido descrita hasta en el 27% de los glioblastomas, pero también se ha descrito que los astrocitomas y los oligodendrogliomas, menos malignos, también la presentan sin la amplificación del gen en cuestión (Reifenberger, J, Reifenberger, G, Ichimura, K, Schmidt, EE, Wechsler, W, and Collins, VP; Epidermal growth factor receptor expression in oligodendroglial tumors, Am. J Pathol., 1996,149, 29-35).

Las implicaciones pronósticas de la amplificación/sobreexpresión del EGFR en los tumores cerebrales son controvertidas. Algunos autores no han hallado ninguna influencia de la amplificación/sobreexpresión del EGFR en la supervivencia de los pacientes (Olson, JJ, Barnett, D, Yang, J, Assietti, R, Cotsonis, G, and James, CD; Gene amplification as a prognostic factor in primary brain tumors, Clin Cancer Res., 1998, 4, 215-222; Newcomb, EW, Cohen, H, Lee, SR, Bhalla, SK, Bloom, J, Hayes, RL, and Miller, DC; Survival of patients with glioblastoma multiforme is not influenced by altered expression of p16, p53, EGFR, MDM2 or Bcl-2 genes, Brain Pathol, 1998, 8, 655-667; Waha, A, Baumann, A, Wolf, HK, Fimmers, R, Neumann, J, Kinderrnann, D, Astrahantseff, K, Blumcke, I, von, DA, and Schlegel, U; Lack of prognostic relevance of alterations in the epidermal growth factor receptortransforming growth factor-alpha pathway in human astrocytic gliomas, J Neurosurg, 1996, 85, 634-641) mientras que otros han llegado a la conclusión de que tales alteraciones influyeron negativamente en el pronóstico (Etienne, MC, Formento, JL, Lebrun-Frenay, C, Gioanni, J, Chatel, M, Paquis, P, Bernard, C, Courdi, A, Bensadoun, RJ, Pignol, JP, Francoual, M, Grellier, P, Frenay, M, and Milano, G; Epidermal growth factor receptor and labelling index are independent prognostic factors in glial tumor outcome, Clin Cancer Res., 1998, 4, 2383-2390; Jaros, E, Perry, RH, Adam, L, Kelly, PJ, Crawford, PJ, Kalbag, RM, Mendelow, AD, Sengupta, RP, and Pearson, AD; Prognostic implications of p53 protein, epidermal growth factor receptor, and Ki-67 labelling in brain tumors, Br. J Cancer, 1992, 66, 373-385; Schlegel, J, Merdes, A, Sturnm, G, Albert, FK, Forsting, M, Hynes, N, and Kiessling, M; Amplification of the epidermal-growth-factor-receptor gene correlates with different growth behaviour in human glioblastoma, Int. J Cancer, 1994, 56, 72-77; Zhu, A, Shaeffer, J, Leslie, S, Kolm, P, and El-Mahdi, AM; Epidermal growth factor receptor: an independent predictor of survival in astrocytic tumors given definitive irradiation, Int. J Radiat. Oncol. Biol Phys., 1996, 34, 809-815).

Existen algunas estrategias terapéuticas relacionadas con la molécula del EGFR en las células cancerosas. Las más ampliamente estudiadas son: El tratamiento con anticuerpos específicos por medio de anticuerpos desnudos o conjugados con toxinas, liposomas o radionúclidos, y el uso de inhibidores de la tirosina-cinasa de receptor. Existen varios tipos de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFRwt. Unos bloquean el acceso de los ligandos al receptor (cetuximab) y otros provocan la rápida internalización del receptor (ABX-EGF) (Sridhar, SS, Seymour, L, and Shepherd, FA; Inhibitors of epidermal-growth-factor receptors: a review of clinical research with a focus on nonsmall-cell lung cancer, Lancet Oncol., 2003, 4, 397-406). Pero como el EGFRwt también se halla presente en la superficie de las células normales, los efectos secundarios pueden limitar su uso.

El EGFR aparece sobreexpresado en el carcinoma escamoso de cabeza y cuello (HNSCC) dondesus niveles de expresión se correlacionan con la reducción de la supervivencia. Los tratamientos que bloquean el EGFR han demostrado poca eficacia en los ensayos clínicos y básicamente en combinación con el tratamiento estándar. El EGFRvIII se expresa en el HNSCC, donde contribuye a reforzar el crecimiento y la resistencia frente a los

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tratamientos dirigidos contra el EGFR natural. La eficacia antitumoral de las estrategias dirigidas contra el EGFR podría mejorar con la adición del bloqueo específico del EGFRvIII (Sok, JC, Coppelli, FM, Thomas, SM, Lango, MN, Xi, S, Hunt, JL, Freilino, ML, Graner, MW, Wikstrand, CJ, Bigner, DD, Gooding, WE, Furnari, FB, and Grandis, JR; Mutant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting, Clin Cancer Res., 2006, 12, 5064-5073).

Otra estrategia consiste enprovocar la muerte selectiva de las células del glioblastoma y de otros tipos de cáncer que sobreexpresen el receptor del EGF. Con un vector no viral que reconoce específicamente el receptor del EGF se ha conseguido introducir de forma selectiva en células cancerosas un ARNdc sintético antiproliferativo (poliinosina-citosina [poli-IC]). La poli-IC dirigida contra el EGFR indujo con rapidez la apoptosis en las células diana tanto en condiciones in vitro como in vivo. La liberación en el tumor de la poli-IC dirigida contra el EGFR propició la regresión completa de tumores intracraneales preestablecidos en ratones atímicos, sin que se apreciaran efectos adversos tóxicos en el tejido cerebral normal. Un año después de la conclusión del tratamiento los ratones tratados seguían sanos y sin cáncer (Shir, A, Ogris, M, Wagner, E, and Levitzki, A; EGF receptor-targeted synthetic doublestranded RNA eliminates glioblastoma, breast cancer, and adenocarcinoma tumors in mice, PLoS. Med, 2006 Jan; 3(l):e6. Epub 2005 Dec 6).

La aplicación de ARN pequeños de interferencia (ARNsi) se ha convertido en una herramienta eficaz y altamente específica para modular la expresión génica, y con ella se hasilenciado una amplia gama de oncogenes. La regulación a la baja del EGFR mediante ARNsi ha sido demostrada en dos estirpes celulares de glioma que presentaban diferentes niveles de expresión del citado receptor (U373 MG, LN18). La expresión del ARNm y de la proteína del EGFR se redujo de un 70% a un 90%. Con todo, el tratamiento con ARNsi no inhibe la proliferación y la migración celular ni el estado de activación de las cascadas de señalización acopladas al EGFR. En concordancia con estos resultados, los análisis de la expresión génica con micromatrices solo revelaron pequeños cambios, aunque específicos, en los patrones de expresión. En suma, estos datos indican que la regulación a la baja del EGFR podría no bastar como monoterapia contra el glioma maligno (Vollmann, A, Vornlocher, HP, Stempfl, T, Brockhoff, G, Apfel, R, and Bogdahn, U; Effective silencing of EGFR with RNAi demonstrates non-EGFR dependent proliferation of glioma cells, Int. J Oncol., 2006, 28, 1531-1542).

Diversos estudios clínicos han ofrecido resultados prometedores. Por ejemplo: El h-R3 es un anticuerpo monoclonal humanizado que reconoce el dominio externo del EGFR con alta afinidad, inhibiendo así la activación de la tirosinacinasa. Con el fin de evaluar la seguridad, la inmunogenicidad y la eficacia preliminar del h-R3 en pacientes con glioma de alto grado recién diagnosticado se llevó a cabo un estudio de fase I/II (Ramos, TC, Figueredo, J, Catala, M, Gonzalez, S, Selva, JC, Cruz, TM, Toledo, C, Silva, S, Pestano, Y, Ramos, M, Leonard, I, Torres, O, Marinello, P, Perez, R, and Lage, A; Treatment of high-grade glioma patients with the humanized anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody h-R3: report from a phase I/II trial, Cancer Biol Ther., 2006, 5, 375-379).

El EKB-569 es un potente inhibidor de bajo peso molecular, selectivo e irreversible del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que está siendo desarrollado como antineoplásico. Se ha llevado a cabo un estudio de fase 1 de aumento de la dosis en pacientes japoneses. De acuerdo con los criterios RECIST, presentaron enfermedad estable pero regresión radiográfica del tumor (Yoshimura, N, Kudoh, S, Kimura, T, Mitsuoka, S, Matsuura, K, Hirata, K, Matsui, K, Negoro, S, Nakagawa, K, and Fukuoka, M; EKB-569, a new irreversible epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, with clinical activity in patients with non-small cell lung cancer with acquired resistance to gefitinib, Lung Cancer, 2006, 51, 363-368).

Gefitinib, un inhibidor específico de la tirosina-cinasa acoplada al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ha demostrado su eficacia en un subgrupo de pacientes con carcinoma de pulmón amicrocítico (NSCLC) que fracasan con la quimioterapia convencional. También se le ha atribuido un efecto antitumoral en metástasis cerebrales del NSCLC. Además, las mutaciones del EGFR han demostrado una estrecha asociación con la sensibilidad del NSCLC al gefitinib. Asimismo se ha evaluado su eficacia en metástasis cerebrales de NSCLC, así como el vínculo entre dicha eficacia y mutaciones del EGFR. Gefitinib parece ser eficaz como tratamiento contra las metástasis cerebrales en un subgrupo depacientes. Los datos apuntan a la posible relación entre la eficacia del gefitinib en el tratamiento de las metástasis cerebrales y las mutaciones del EGFR (Shimato, S, Mitsudomi, T, Kosaka, T, Yatabe, Y, Wakabayashi, T, Mizuno, M, Nakahara, N, Hatano, H, Natsume, A, Ishii, D, and Yoshida, J; 2006, EGFR mutations in patients with brain metastases from lung cancer: association with the efficacy of gefitinib, Neuro. Oncol., 8, 137-144).

Quitinasa 3-Like 2 (CHI3L2)

La CHI3L2 se descubrió inicialmente en condrocitos. Ha sido descrita frecuentemente como un antígeno diana en la artritis reumatoide. No se ha descubierto ninguna relación relevante de la CHI3L2 con el cáncer. Las proteínas quitinasa 3-like han sido implicadas en la estimulación de la proliferación de las células del tejido conectivo humano, entre ellas los fibroblastos, a través de la activación de la vía de señalización mediada por la PKB y la vía de la cinasa regulada por señales extracelulares (Recklies AD, White C, Ling H; The chitinase 3-like protein human cartilage glycoprotein 39 (HC-gp39) stimulates proliferation of human connective-tissue cells and activates both extracellular signal-regulated kinase-and protein kinase B-mediated signalling pathways; Biochem J. 2002; 365:119126). En ratón las proteínas quitinasa 3-like se han hallado muy reguladas al alza en modelos de cáncer gástrico

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edematoso cerebral y el KCNJ10 amortigua el K+ extracelular elevado (Saadoun, S, Papadopoulos, MC, and Krishna, S; Water transport becomes uncoupled from K+ siphoning in brain contusion, bacterial meningitis, and brain tumors: immunohistochemical case review, J Clin Pathol., 2003, 56, 972-975).

Es sabido que los péptidos que son presentados por MHC de clase II están compuestos por una «secuencia central» dotada de un secuencia de aminoácidos que se ajusta a cierto motivo específico del alelo de HLA y, opcionalmente, de extensiones N y/o C-terminales que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir, que se consideran irrelevantes para la interacción del péptido y todos o una parte de los clones de linfocitos T que reconocen la contrapartida natural). Las extensiones N y/o C-terminales pueden, por ejemplo, tener entre 1 y 10 aminoácidos de longitud, respectivamente. Estos péptidos se pueden utilizar directamente para cargar las moléculas MHC de clase II o bien la secuencia se puede clonar en vectores de acuerdo con la descripción ofrecida abajo en la presente memoria. Dado que estos péptidos constituyen el producto final del procesamiento de péptidos más grandes en el interior de la célula, también pueden utilizarse péptidos más largos. Los péptidos descritos pueden tener cualquier tamaño, pero normalmente suelen tener un peso molecular inferior a 100. 000, preferiblemente inferior a 50. 000, más preferiblemente inferior a 10. 000 y normalmente unos 5. 000. En cuanto al número de residuos de aminoácidos, los péptidos descritos pueden tener menos de 1. 000 residuos, preferiblemente menos de 500 residuos y más preferiblemente menos de 100.

En consecuencia, las variantes naturales o artificiales que estimulan la reacción cruzada de los linfocitos T con un péptido como el descrito son a menudo variantes de longitud. La Tabla 1 ofrece ejemplos de tales variantes de longitud naturales en las SEQ ID N. º 11 y 12, y 21 y 24, respectivamente.

Si un péptido más largo de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos se utiliza directamente para unirse a una molécula MHC de clase II, es preferible que los residuos que flanquean la región de unión a HLA central sean residuos que no afecten sustancialmente a la capacidad del péptido para unirse específicamente a la hendidura de unión de la molécula MHC de clase II o presentar el péptido al CTL. No obstante, como se ha indicado arriba, se apreciará que es posible usar péptidos más grandes, p. ej. los codificados por un polipéptido, ya que estos péptidos más grandes pueden ser fragmentados por células presentadoras de antígeno adecuadas.

También es posible que los epítopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 10 aminoácidos de longitud, sean generados por el procesamiento de péptidos más largos o proteínas que incluyen el epítopo real. A semejanza de los epítopos de MHC de clase II, es preferible que los residuos que flanquean la región de unión no alteren sustancialmente la capacidad del péptido para unirse específicamente a la hendidura de unión de la molécula MHC de clase I o para presentar el péptido al CTL ni enmascarar los sitios de escisión proteolítica necesarios para exponer el auténtico epítopo durante el procesamiento.

Por supuesto, el péptido conforme a la presente invención tendrá la capacidad para unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I. La unión de un péptido a un complejo MHC puede ser analizada con métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos en el ejemplo 4 de la presente invención o los descritos en la bibliografía para diferentes alelos de MHC de clase II (p. ej. Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0T01 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4): 1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association; J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993; 163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Haider T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flaveli RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776).

No obstante, dichos segmentos pueden ser importantes para facilitar la introducción eficaz del péptido conforme a la presente invención en las células. En una forma de realización de la presente invención, el péptido es una proteína de fusión que comprende los 80 aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo “Ii”) como la derivada del NCBI, número de acceso de GenBank X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E. O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 1984 3 (4), 869-872).

En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino que el enlace peptídico está invertido. Estos peptidomiméticos retro-inversos pueden sintetizarse con métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos por Meziere et al. J. Immunol. 1997, 159, 3230-3237. Esta estrategia implica la síntesis de seudopéptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al. (1997) demuestran que estos seudopéptidos resultan útiles para las respuestas de MHC y de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH

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proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP) están siendo investigadas en este momento como tratamiento para el cáncer de próstata (Sipuleucel-T) (Small EJ, Schellhammer PF, Higano CS, Redfern CH, Nemunaitis JJ, Valone FH, Verjee SS, Jones LA, Hershberg RM.; Placebo-controlled phase 3 trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer; J Clin Oncol. 2006; 24(19):3089-3094; Rini BI, Weinberg V, Fong L, Conry S, Hershberg RM, Small EJ; Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells (Provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy; Cancer. 2006; 107(l):67-74).

Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir un péptido. El método comprende el cultivo de la célula hospedadora y el aislamiento del péptido a partir de dicha célula o de su medio de cultivo.

En otra forma de realización el péptido, el ácido nucleico o el vector de expresión de la invención se emplean en medicina. Por ejemplo, el péptido puede ser preparado para la inyección por vía intravenosa (i. v.), subcutánea (s. c.), intradérmica (i. d.), intraperitoneal (i. p.) o intramuscular (i. m.). Las vías preferidas para la inyección del péptido son s. c, i. d., i. p., i. m. e i. v. Los métodos preferidos para la inyección del ADN son i. d., i. m., s. c., i. p. e i. v. Según el péptido o ADN de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 µg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 µg a 500 µg de péptido o ADN. Dosis de este rango se han utilizado con éxito en varios ensayos (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Møller M, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, Reunión de ASCO 2007; Resumen N. º 3017).

Un aspecto importante de la presente invención es un método in vitro para producir CTL activados. El método comprende la puesta en contacto en condiciones in vitro de CTL con moléculas MHC de clase I o II humanas cargadas con antígeno y expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada por tiempo suficiente para activar dichos CTL de una manera específica de antígeno. El antígeno es un péptido conforme a la invención. Preferentemente se emplea una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.

Cuando se utilice como antígeno un epítopo de MHC de clase II, los CTL serán linfocitos cooperadores CD4positivos, preferiblemente del tipo TH1. Las moléculas MHC de clase II pueden expresarse en la superficie de cualquier célula adecuada pero es preferible que la célula no exprese de forma natural moléculas MHC de clase II (en cuyo caso la célula será transfectada para expresar dicha molécula). Si, en cambio, la célula expresa de forma natural moléculas MHC de clase II es preferible que sea defectuosa en los mecanismos de procesamiento o de presentación de los antígenos. De ese modo será posible que la célula que expresa la molécula MHC de clase II quede completamente sensibilizada con el antígeno peptídico escogido antes de activar al CTL.

La célula presentadora de antígeno (o célula estimuladora) normalmente posee moléculas MHC de clase II en su superficie y es preferible que sea básicamente incapaz de cargar dicha molécula de MHC de clase II con el antígeno seleccionado. La molécula MHC de clase II puede cargarse fácilmente in vitro con el antígeno seleccionado.

Preferiblemente, la célula de mamífero carecerá del transportador de péptidos TAP o bien este estará presente en un nivel reducido o escasamente funcional. Las células adecuadas que carecen del transportador de péptidos TAP incluyen las células T2, RMA-S y de Drosophila. TAP es el transportador relacionado con el procesamiento de los antígenos.

La estirpe celular humana deficiente en carga de péptidos T2 está disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE. UU. con el N. º de catálogo CRL 1992; la estirpe de células de Drosophila Schneider line 2 está disponible en la ATCC con el N. º de catálogo CRL 19863; la estirpe de células de ratón RMA-S está descrita en Karre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162,1745.

Es preferible que la célula hospedadora no exprese las moléculas MHC de clase I antes de la transfección. Preferiblemente la célula estimuladora expresará una molécula importante para la coestimulación de los linfocitos T, como cualquiera de las siguientes: B7. 1, B7. 2, ICAM-1 o LFA3.

Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase II y de las moléculas co-estimuladoras están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.

De forma similar, en el caso del epítopo de MHC de clase I usado como antígeno, las CTL son linfocitos cooperadores CD8-positivos. Las moléculas MHC de clase I pueden expresarse en la superficie de cualquier célula adecuada y es preferible que la célula no exprese de forma natural moléculas MHC de clase I (en cuyo caso la célula será transfectada para expresar dicha molécula). Si, en cambio, la célula expresa de forma natural moléculas MHC de clase I ha de ser defectuosa en los mecanismos de procesamiento o de presentación de los antígenos.

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Yang, JC, Seipp, CA, et al.; Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report, N. Engl. J Med, 1988, 319, 1676-1680; Dudley, ME, Wunderlich, JR, Robbins, PF, Yang, JC, Hwu, P, Schwartzentruber, DJ, Topalian, SL, Sherry, R, Restifo, NP, Hubicki, AM, Robinson, MR, Raffeld, M, Duray, P, Seipp, CA, Rogers-Freezer, L, Morton, KE, Mavroukakis, SA, White, DE, and Rosenberg, SA; Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes, Science, 2002, 298, 850-854; Yee, C, Thompson, JA, Byrd, D, Riddell, SR, Roche, P, Celis, E, and Greenberg, PD; Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2002, 99, 16168-16173; Dudley, ME, Wunderlich, JR, Yang, JC, Sherry, RM, Topalian, SL, Restifo, NP, Royal, RE, Kammula, U, White, DE, Mavroukakis, SA, Rogers, LJ, Gracia, GJ, Jones, SA, Mangiameli, DP, Pelletier, MM, Gea-Banacloche, J, Robinson, MR, Berman, DM, Filie, AC, Abati, A, and Rosenberg, SA; Adoptive cell transfer therapy following nonmyeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma,

J. Clin. Oncol., 2005, 23, 2346-2357); y aparecen revisados en (Gattinoni, L, Powell, DJ, Jr., Rosenberg, SA, and Restifo, NP; Adoptive immunotherapy for cancer: building on success, Nat. Rev. Immunol., 2006, 6, 383-393) y (Morgan, RA, Dudley, ME, Wunderlich, JR, Hughes, MS, Yang, JC, Sherry, RM, Royal, RE, Topalian, SL, Kammula, US, Restifo, NP, Zheng, Z, Nahvi, A, de Vries, CR, Rogers-Freezer, LJ, Mavroukakis; SA, and Rosenberg, SA; Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes, Science, 2006, 314 (5796): 126-129).

Cualquier molécula de la invención, ya sea péptido, ácido nucleico, vector de expresión, célula o CTL activado es útil para el tratamiento de trastornos caracterizados por células que eluden la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, cualquier molécula de la presente invención puede ser utilizada como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La molécula puede ser utilizada sola o combinada con otra molécula o moléculas de la invención o con cualquier o cualesquier moléculas conocidas.

Preferiblemente, el medicamento es una vacuna. La vacuna puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o por vía sistémica, o aplicarse ex vivo a células derivadas del paciente o a una estirpe celular humana que después se administra al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias derivadas del paciente que después se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico se administra a células in vitro, puede ser útil que estas células sean transfectadas para que expresen simultáneamente citocinas inmunoestimuladoras, como la interleucina-2. El péptido puede ser sustancialmente puro, o combinarse con un adyuvante inmunoestimulador (véase abajo) o utilizarse en combinación con citocinas inmunoestimuladoras, o bien administrarse mediante otro sistema de liberación adecuado, como por ejemplo liposomas. El péptido también se puede conjugar con un transportador adecuado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (véase WO 95/18145 y Longenecker et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291). El péptido también puede estar marcado, o ser una proteína de fusión, o ser una molécula híbrida. Se espera que los péptidos de la presente invención estimulen a los CTL CD4 o CD8. No obstante, la estimulación es más eficiente si se cuenta con la ayuda de los linfocitos T positivos para el CD opuesto. Así pues, en el caso de los epítopos de MHC de clase II que estimulan a los CTL CD4, el compañero de fusión o las secciones de una molécula híbrida adecuada proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD8-positivos. Y viceversa, en los epítopos de MHC de clase I que estimulan a los CTL CD8, la pareja de fusión o las secciones de una molécula híbrida proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4-positivos. Los epítopos estimuladores de los CD4 y los CD8 son bien conocidos en la técnica e incluyen los identificados en la presente invención.

En un aspecto de la invención, la vacuna comprende al menos un péptido, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 15 y más preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o trece péptidos como los dados a conocer o péptidos adicionales. Los péptidos pueden derivar de uno o más TAA específicos y se pueden unir a moléculas MHC de clase I y/o II.

Preferiblemente, cuando el péptido de la invención se usa en una vacuna o medicamento de la invención, está presente en forma de sal, como por ejemplo, una sal de acetato o una sal de cloruro. El ejemplo 7 presenta estudios con la vacuna IMA-910, que contiene algunos de los péptidos de la presente invención y describe la preparación de la misma con péptidos en forma de sal y su tamaño de partícula.

El polinucleótido puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, ARN o una combinación de los mismos. Los métodos para diseñar e introducir ese ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede obtener una visión general por ejemplo en S. Pascolo: Vaccination with messenger RNA Methods Mol Med 2006, 127; 23-40; R. Stan, JD Wolchok and AD Cohen DNA vaccines against cancer Hematol Oncol Clin North Am 2006, 3; 613-636 or A Mahdavi and BJ Monk Recent advances in human papillomavirus vaccines Curr Oncol Rep 2006, 6, 465-472. Las vacunas polinucleotídicas son fáciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberación adecuados incluyen los de ADN y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunal, retrovirus, herpesvirus, virus adeno-asociados o híbridos que contienen elementos de varios virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos que son bien conocidos como técnicas para la introducción de ADN. Los métodos de introducción físicos, como la «pistola génica», también pueden utilizarse. El péptido o péptidos codificados por el ácido núcleico pueden ser una proteína de fusión, por ejemplo con un epítopo que estimule los linfocitos T para el

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