JPS6081130A - 抗ｈｌａ−ａ２抗体およびそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 近年、ヒト主要組織適合系（以下ＨＬ　Ａと略称）に関
する研究が急速に進展し、例えば臓器移植の分野では、
ＩＩ器の提供者と受容者の間での適合性を予測判定する
イ１力な手段として既に実施されている。

さらに、疾患関連性、免疫応答機構、人類学、ｊｄ伝学
、輸血学、法医学の領域においても逐次その研究成果が
導入されつつあり、その結果、ＨＬＡ分析の重弱性と需
要が増加し、それに伴って選ＩＲ性と活性の強い）ｔＬ
Ａ抗体を得るこ吉が爪型と々ってきている。

従来、ＨＬＡ分析には妊婦の血液から採収したＨ　Ｌ　
Ａ抗体が用いられているが、昂的にもＩＩＪ、！度があ
り、寸だ活性面でもさらに高いものが望−まれている。

最近、抗体製１ｉｊｉの分野にもリンパ球とミエローマ
細胞を融合させた／・イブリドーマを用いる方法が実用
化段階に入りつつあり、ＨＬＡ抗体についてもマウス・
ハイブリドーマを用いる方法が研究され、実用化されつ
つある。しかし、ヒ１−のアロ抗原であるＩＩ　Ｌ　Ａ
抗原を認識する抗体をマウスのリンパ球で作らせる場合
、特異性の高い抗体を得ることが難しい。

この発明の発明者は、かかる状況下において、ヒトのＨ
ＬＡ−Ａ−２抗原を有するヒトのＢリンパ芽球様細胞を
マウスに免疫させ、免疫させたマクスから３９２７球を
取り出し、マウス・ミエローマ細胞と細胞融合させ、ク
ローニングすることによって、妊婦の血液から採取した
ＨＬＡ抗体におきかえてＨＬＡ分析に用いることが可能
な七ツクローナル抗体ＦＬＡＯ２（以下　ＦＬＡＯ２抗
体と記す）をｆｑ・ることに成功した。

このＦＬＡＯ２抗体はＨＬＡ−Ａ２抗原に対し特異的に
反応し、従来の妊婦の血液からｔυ・られるものと比較
してはるかに高い抗体価を有する。

このＦＬＡＯ２抗体はハイブリドーマ５Ｈ−２−１１９
−６を適当な培地に培養し、その−ｉ１使用するとかあ
るいはその培養上清から分離するとか、マウスの腹腔に
移植し、その腹水から分離するなどの方法によって、大
計に得ることができる。

その具体例は実施例２および３に記しである。

−１入、この発明のＦ　ＬＡ　０２抗体を産生ずるハイ
ブリドーマ５Ｈ−２−１１９−６は実施例１の方法によ
って取ｆｑすることができた。

この発明のＦＬＡＯ２抗体の物理化学的および生物学的
性質は以下の通りである。

１）分子（；１ 実施例３で得られたこの発りＪのＦＬＡＯ２抗体はドデ
シル硫酸ナトリウムで処理した後、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で調べたところ、分子量５４．０００と２
７．０００のサブユニットから成り立っていることが判
りコした。これらのサブユニットはイムノグロブリンの
重鎮と軽鎖に相当し、Ｅ’ＬＡＯ２抗体がイムノグロブ
リンであるこトライ１（１′認できた。

１１）イムノグロブリンのクラスとインタイブＦ’ＬＡ
Ｏ２抗体のイムノグロブリンのクラスとインクイブをオ
フクロニー法によって調べた。

実施例２の方法で得られだ３００　）１１　の培養」１
清と３Ｃ）Ｏｇｌｌの飽和硫酸アンモニウム溶液を混ザ
ギ抗マクスイムノグロブリンＭ　＋　Ｇ、　＋　０２ａ
　、　Ｇ２ｂ。

Ｇ３＋Ａ＋　λおよびに鎖の血清（マイルズ社製）のそ
れぞれとの沈降線の形成を調べた。

その結果、ＦＬＡＯ２抗体はＧ２ｂの重鎖とにの軽鎖か
ら成る抗体であることが判明した。

ｉｆ）抗原の同定 リン酸Ｈ街生理食塩液で洗浄した１×１０８個のｓｈ細
胞の表面をラクトパーオキシダーゼ・過酸化水素の系で
ｌ　ｍ　ＣｉのＮ　ａ１２５Ｉで標識し、１％のノニデ
ットＰ４０（ベセスグ・リ　サーチ・ラボラトリーズ社
製）で水冷下１５分間処理して膜を可溶化した。マウス
のイムノグロブリンを結合させたセファローズ４Ｂ（フ
ァルマシア社製）で４℃で３０分間、２回処理して非特
異的吸着物を除去し、実施例３の方法で得られた精製Ｆ
ＬＡＯ２抗体ヲ結合させたセファロース４Ｂ（ファルマ
シア社製）に４°Ｃで一夜振とうし々から反応させた。

遠心分離後、沈澱物をドデシル硫酸ナトリウムで可溶化
した後、ポリアクリルアミド電気泳動で調べ、−ＦＬＡ
Ｏ２抗体と分子ｘｉ）、　４５．０００と１２；０００
からなるｓｈ細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまだはＨＬ
Ａ−Ｃの結合を（１（ｒ認した。

ｉｖ）各種培養細胞を用いた細胞毒性試験それぞれのリ
ンパ球のもつＨＬＡ、−Ａ抗原またはＨＬＡ−Ｂ抗原が
判明している培養細胞につき試験した。

テラサキマイクロテストプレート３０３４　（ファルコ
ン社製）のフェルに２ｐｌの実施例２でｆ！ｊ’られた
培養」１清と２ノｔｌの細胞懸深１液（ＩＸＩＯ６個／
ｍｅ）と５　）ｔｌの２倍希釈補体溶液（ベルフリーズ
社製）を入れ、５係炭酸ガス気流中で３７℃で１および
２時間、インキュベート後、倒立顕微鏡で観察して細胞
の生死を判定した。その結果を表１に示す。

表中、１−一」はそれぞれの細胞が、クイピングに用い
た範囲のＨＬＡ−Ａ抗体まだはＨＬＡ−Ｂ抗体とは反応
しなかつたことを示している。従つｄ゛いずれの抗原も
保持していない可能性が高いことを示している。

捷たｓｈ細胞の培養細胞に対する細胞毒性を実施例３の
方法でイ（、）られた精製抗体を用いて試験した結果は
、濃度に相関して細胞毒性の増加が認められ、５０％細
胞毒性を示す濃度は０．５４　ノ！！／／ｒｕｅであっ
た。

■）ヒト末梢血リンパ球に対する抗体の細胞ｉｆ性を 米国Ｎ　Ｎ　Ｈ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓ’１ｉｔｕ
ｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｂ１ｎり、Ｓ、Ａ、）のＨＬ　
Ａタイピング法に従い、実施例３で得られた精製’Ｉｌ
’ｉ：体または実施例２でＩＱられた培養上清を用いて
日本犬の供血者のリンパ球について調べた。

その結果、日本犬の末梢血リンパ球（Ｂ　ＩＪンパ球と
Ｔ　ＩＪンパ球の双方を含む）および末梢血Ｔ　ＩＪン
バ３３１りに対する実施例２の方法でヱ（Ｉられた培養
−１二盾の細胞毒性試験の結果は、表２の通りであり、
ＨＬＡ−Ａ２の保有の有無と高い相関性を示した。

表　２ ａ：ＨＬＡ−Ａ２抗Ｂ：”、保イ゛ｊの有無（１１本人
）′ｌ）：細胞７１ｊ性のイ１無二６０％以」二の死細
胞率を陽性とした。

また１」本人の末梢血リンノ（球に対する実施例３でｔ
ＩＪられた精’ＩＪ）−抗体の細１１（、毒性はＨＬＡ
−Ａ２　を竹子る９人のリンパ球にＱま１０／ｌ／／ｍ
ｅ以１：、テｌｏＯチのｉｉＪ性を示し、＋１１．　Ａ
　−Ａ　２を有しない８人のリンパ球には０．４〜ｌ　
（１０ｐり／ｍｅの濃度で全く毒性を示さなかった。

Ｖｉ）　Ｔ＝’ＡＣ８（自ｑＪＪ細胞解析分叩１装置；
、’ｉ、　）による抗原保イ］細胞の検出 培養したヒト末梢血リン・（球のＴ；ＩＰＭ工培地懸濁
液（２Ｘ　１０’個／ｍｅ　）　（７）　５０　ｐｌを
７　イ・７　シャー、デユープにとり、ハイプリドーマ
Ｓ　Ｈ−’　２−１１９−６の培養液を１００μｌ加え
、４゛Ｃで６０分間）Ｘ応させた。遠心分前して細＋ｌ
Ｖ＋、を除き、第２抗体として抗マクスイムノグログリ
ンＧ　ＦＩＴＣ標識ヤギイムノグロブリンのＦ　（ａｂ
’）２分画（カッペル社製）３０μｌを加え、４°Ｃで
３０分反応させた。

遠心分め（１して３回洗浄後、ＦＡｃｓｌｌ’Ｋかけレ
ーザー光による励起によって蛍光陽性細胞を測定した。

その結果、５０％抗体結合細胞数は０．０８　）Ｉ！Ａ
ｌｅで認められた。

■１）ラジオイムノアッセイによる抗体結合能測定ＲＰ
　Ｍ　Ｉ　培地に懸’／＆’＋　サセタ８　ｘ　１０６
細胞／ＴＩＩｅノ培養細胞の１００　ｐ７？を０．５％
牛血清アルブミン溶液でコートしたプラスチック製小試
］倹管（栄研１−リ）に収り、遠心分前上て細胞を集め
、ノ・イブリドーマＳＨ２１１９Ｇの培養液１００／Ｚ
ｊ！を加え、４℃で９０分間反応させた。２回洗浄後、
抗マクスイムノグロブリンＧＩ２５Ｉ標識ウサギイムノ
グロブリンのＦ（ａｂ’）２　分画（マイルズ製）を１
００　）１１！加え、４゛Ｃで一夜静置後遠心分前して
３回洗浄し、ガンマシンチレーションカクンクーで細胞
に結合した放射能を測定した。

その結果、５０％抗体結合能は０．１３　ｐＶ　／ｍｅ
で認められた。

実施例１ （ハイブリドーマ５Ｈ−２−１１９−６の収イＩ））（
ｉ）　ＨＬＡ　−Ａ　２免疫肝細胞のシ、′１製ＨＬＡ
−Ａ２抗原吉ＩＩ　ＪＬ　Ａ　−Ａ　９抗原をヘテロに
イ；Ｊするヒ）Ｂリンパ球細胞であるＳｈ細胞にＥＢウ
ィルスを感染させてリンパ芽球様細胞（以１−′、Ｅ　
Ｂ　Ｖ　−Ｓ　ｈ細胞と訳す）としたものを増殖させて
免疫原としだ。すなわち、ＥＢＶ−８ｈを１０％牛脂児
血清１ＡＦ加ｆｉｌ）ＭＩ−１６４０培地（日永製薬製
）を用いて３７’Ｃの５％炭酸ガス気流中で培養し、生
育した細胞を１．５００　ｒｐｍで５分間遠心分ｌｉ３
！トシ、次いでリン酸緩衝生理食塩液でｆ’ｋ　ｉｒｔ
後、量減に懸濁させた後、３匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス（
♀）の腹腔にそれぞれ４Ｘ１０’個ずつ投Ｍ’した。２
５［１後に、同様に培養し洗浄したＥＢＶ−８ｈ細胞を
それぞハのマウスの腹１控内と静脈内にそれぞれ１、（
３５Ｘ１０’個ずつ画免疫した。

４０後に、それぞれのマウスを開腹し肝臓をピンセント
でほぐして細胞をダルベツコ氏改変イーグル最小栄養培
地に懸濁させＩＩ’（Ｌ細胞懸濁液を調製した。

ＩＩ）ハイブリドーマの収ｔυ・とクローニング得られ
た肝細胞懸濁液とマウス・ミエローマＰ３／ｘ６３Ａｇ
８Ｕ１（以下、Ｐ３Ｕ１と記す）細胞懸濁液（ＢＡＬＢ
／Ｃマクス山米のミエローマ）が５：１の細胞比で混合
し遠心分離後４５％ポリエチレングリコール（シグマ社
、分子Ｔｊｓ：４．０００　）を徐々に滴下し７分間室
温で放置させて細ｔｊ：ｘを融合させた。この融合細胞
を１５％牛脂児血Ｗｔ添加グルベツコ氏改変イーグル最
小栄養培地（２ｍＭＬ−グルタミン、２Ｘ１０　Ｍ２−
メルカプトエタノール、８０μｙ／ｍｅゲンタミシン硫
酸塩、１００単位／ｍｅペニシリンＧ　、　１００　／
ｌｆｊ／ｍｅストレプトマイシン硫酸塩０．２５　ｐＶ
　／ｍｅファンギゾンを含む）（以下、ＣＭ培地と記す
）に懸濁して２４ウエルプレート（ヌンク社製）に植え
込み、翌日名りエルにＨＡ　Ｔ培地（上記培地にさらに
ｌＸｌ０Ｍヒボキサンチン、４Ｘ１０　Ｍア三）プテリ
ンおよび１．６　Ｘ　１０””５Ｍチミジンを添加した
培地）をそれぞわｌ　ｍｅずつ加え、翌々口、さらにそ
の後２゜３０毎に名ウェルの培地の半量を新しいト■Δ
Ｔ培地で交換１−々から培養を続け、融合細胞のみを増
殖させ、次いで、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除い
たＨＴ培地でさらに各ウェルの培地の半１１（を交換し
、その培養１−伯の一部を採ｊ１又してＳｈ細胞に対す
る細１１；訂１７性試験を行ないＳ　ｈ　＃ａｌ　１ｉ
ｔｕに対する抗１１辺産生の有無を調べ、さらに８］コ
細胞に対する抗体を産生しているウェルの培養」−６１
４の一部を採取して、ＨＬＡ−Ａ２４抗原を有するＨＯ
細胞、ＩＬＡ　−ｆｉ、　１１、ＨＬＡ−Ａ２６抗原を
有するＫｙ細胞およびＨＴ、Ａ−Ａ３３抗原をイ］”す
るＨＯＲ細胞に対する細胞毒性試験を行々いこれらの細
胞に対する抗体を産生じてい々いウェルを選ひ出し、こ
のウェルに生育するハイブリドーマを５Ｈ−２−１１９
と命名し、このノ・イブリドーマを常法ｊｌ′Ｉｉリク
ローニングした。クローニングはＣＭ培地を用いＢＡ、
ＬＢ／ＣマウスのＴ細胞をフィーダーレイヤー（ｆ’ｅ
ｅｄｅｒ　］、ａｙｅｒ　）として１（μ界希釈法で行
った。

１個の細胞由来でＳｈ細胞に対する細胞毒性が最も強い
かイブリドーマを選び５Ｈ−２−１１９−６と命名した
。

実施例２ ＦＬＡＯ２抗体の製ｊｉｌｉ ハイブリドーマＳ　Ｈ２］　１９−６をＣＭ培地で３７
°Ｃの５％炭酸ガス気Ｍ１１中で４　ｔＴＩ聞培養し、
］、　０　（１０ｒＴ）ｍで４℃で１０分間遠心分前し
てＦ　Ｌ　Ａ０２抗体を含む培養土Ｙｔをｆｉノだ。

実施例３ １ｒ　ＬＡ　Ｏ２抗体の製造 １週間前にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルベンタテカン）を腹腔に投与した５匹ノＢ　Ａ　Ｌ
　Ｂ／Ｃ（＃１ｔ　）マクスの１復腔にマクス当り１ｘ
１０７個のハイグリドーマＳＨ−’２−１１９−６の細
胞を移植した。移植後１〜２週間後に腹水計１８　ｍｅ
を採収した。

腹水を１０．０００　ｒｐｍで１０分間遠心分前、シて
その上清を収り、等１１の５０％硫酸アシモニクム飽１
和溶液を加えて氷１−３で３０分間撹拌し、さらに３０
分聞静ｉｉ；（してイムノグロブリン分画を沈澱させ、
１５．００　（ｌ　ｒｐｍ　、１０分間遠心分離してそ
の沈澱を収り、少量のリン酸緩衝生理食塩水に溶解させ
、５ｍＭ）リス塩酸緩衝液ｐＨ７，５に対し一夜透析し
、５　ｍＭ　）　’）ス塩酸緩衝液で平衡化したＤＥ５
２セルロース（ソットマシ社製）を用いたＤ　１ａ　Ａ
　ＥセルＩＪ−ヌカラムクロマトクラフィーにかけ、５
ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液を連続的に１００ｍＭ食塩添加
５　ｍ　Ｍ　）　’）ス塩酸緩衝液で置換しながら溶出
する連続０度勾配法で〆出しだ。Ｓ　ｍｅずつの７ラク
シヨンに分収し、２８０ｍμに吸収を示すフラクション
を集め、５２．４ｍｙの精製したＦＬＡＯ２をイυ−た
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１マクス・ハイブリドーマ５Ｈ−２−１１９−６によ
   って産生され、補体依存性細胞ＩＪＬ性を有し、ＨＬＡ
   −Ａ２抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体Ｆ　
   Ｌ　Ａ　０２　。 （２）補体依存性細胞重性を有し、ＨＬＡ−Ａ２抗原に
   特異的に反応するモノクローナル抗体ＦＬＡ０２を産生
   するハイブリドーマ５Ｈ−２−１１９−６゜