ES2553900T3 - Derivados del ácido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)-betulínico - Google Patents
Derivados del ácido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)-betulínico Download PDFInfo
- Publication number
- ES2553900T3 ES2553900T3 ES11306138.6T ES11306138T ES2553900T3 ES 2553900 T3 ES2553900 T3 ES 2553900T3 ES 11306138 T ES11306138 T ES 11306138T ES 2553900 T3 ES2553900 T3 ES 2553900T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- group
- alk
- compound
- cells
- representing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- YJEJKUQEXFSVCJ-WRFMNRASSA-N bevirimat Chemical class C1C[C@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CC[C@@H](C(=C)C)[C@@H]5[C@H]4CC[C@@H]3[C@]21C YJEJKUQEXFSVCJ-WRFMNRASSA-N 0.000 title description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 63
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 101150009274 nhr-1 gene Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 18
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000004209 (C1-C8) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 101100097467 Arabidopsis thaliana SYD gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101100495925 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) chr3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- ACJPFLIEHGFXGP-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethyloxolane-2,5-dione Chemical compound CC1(C)CC(=O)OC1=O ACJPFLIEHGFXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101100490437 Mus musculus Acvrl1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 85
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 83
- TXIOIJSYWOLKNU-FLQODOFBSA-N (1r,3as,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13ar,13br)-9-(3-carboxy-3-methylbutanoyl)oxy-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-1-prop-1-en-2-yl-1,2,3,4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a,13b-hexadecahydrocyclopenta[a]chrysene-3a-carboxylic acid;(2r,3r,4r,5s)-6-(methylamino)hexane-1 Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.C1C[C@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CC[C@@H](C(=C)C)[C@@H]5[C@H]4CC[C@@H]3[C@]21C TXIOIJSYWOLKNU-FLQODOFBSA-N 0.000 description 51
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 44
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 32
- -1 acetic Chemical class 0.000 description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 26
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 25
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 18
- JUJWROOIHBZHMG-RALIUCGRSA-N pyridine-d5 Chemical compound [2H]C1=NC([2H])=C([2H])C([2H])=C1[2H] JUJWROOIHBZHMG-RALIUCGRSA-N 0.000 description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 16
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102100034347 Integrase Human genes 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 11
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 11
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 9
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 7
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 6
- 101710170658 Endogenous retrovirus group K member 10 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710186314 Endogenous retrovirus group K member 21 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710162093 Endogenous retrovirus group K member 24 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710094596 Endogenous retrovirus group K member 8 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710177443 Endogenous retrovirus group K member 9 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001551 total correlation spectroscopy Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 4
- 101150024249 vpr gene Proteins 0.000 description 4
- ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 1-[2-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)propan-1-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940126142 compound 16 Drugs 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 3
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- AOSZTAHDEDLTLQ-AZKQZHLXSA-N (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-6-[(3-chlorophenyl)methyl]-12,19-difluoro-11-hydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-9,13-dimethyl-6-azapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-one Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2[C@H]3[C@]([C@]4(C=CC(=O)C=C4[C@@H](F)C3)C)(F)[C@@H](O)C[C@@]2([C@@]1(C1)C(=O)CO)C)N1CC1=CC=CC(Cl)=C1 AOSZTAHDEDLTLQ-AZKQZHLXSA-N 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 2
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229940126657 Compound 17 Drugs 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000254058 Photinus Species 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 2
- WLLIXJBWWFGEHT-UHFFFAOYSA-N [tert-butyl(dimethyl)silyl] trifluoromethanesulfonate Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)OS(=O)(=O)C(F)(F)F WLLIXJBWWFGEHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001969 wideband alternating-phase low-power technique for zero residual splitting Methods 0.000 description 2
- SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N (1s,2s,3s,5r)-1-(carboxymethyl)-3,5-bis[(4-phenoxyphenyl)methyl-propylcarbamoyl]cyclopentane-1,2-dicarboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H]1[C@@H]([C@](CC(O)=O)([C@H](C(=O)N(CCC)CC=2C=CC(OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C1)C(O)=O)C(O)=O)N(CCC)CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N 0.000 description 1
- GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N (2S,3R)-N-[(2S)-3-(cyclopenten-1-yl)-1-[(2R)-2-methyloxiran-2-yl]-1-oxopropan-2-yl]-3-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)-2-[[(2S)-2-[(2-morpholin-4-ylacetyl)amino]propanoyl]amino]propanamide Chemical compound C1(=CCCC1)C[C@@H](C(=O)[C@@]1(OC1)C)NC([C@H]([C@@H](C1=CC=C(C=C1)OC)O)NC([C@H](C)NC(CN1CCOCC1)=O)=O)=O GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N 0.000 description 1
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 1
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 1-[6-[2-[3-[3-[3-[2-[2-[3-[[2-[2-[[(2r)-1-[[2-[[(2r)-1-[3-[2-[2-[3-[[2-(2-amino-2-oxoethoxy)acetyl]amino]propoxy]ethoxy]ethoxy]propylamino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-[(2r)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanyl-1-oxopropan-2-yl Chemical compound O=C1C(SCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(=O)N[C@@H](CSC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(N)=O)CC(=O)N1CCNC(=O)CCCCCN\1C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2CC/1=C/C=C/C=C/C1=[N+](CC)C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C1 UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 0.000 description 1
- 125000000453 2,2,2-trichloroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(Cl)(Cl)Cl 0.000 description 1
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUHXLHLWASNVDB-UHFFFAOYSA-N 2-(oxan-2-yloxy)oxane Chemical class O1CCCCC1OC1OCCCC1 HUHXLHLWASNVDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003821 2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si](C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C(OC([H])([H])[*])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- LIWMQSWFLXEGMA-WDSKDSINSA-N Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N LIWMQSWFLXEGMA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 101710093674 Cyclic nucleotide-gated cation channel beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical class CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 1
- 229940126252 HIV maturation inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012565 NMR experiment Methods 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241001635529 Orius Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 description 1
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 1
- 102100025946 Transforming growth factor beta activator LRRC32 Human genes 0.000 description 1
- 101710169732 Transforming growth factor beta activator LRRC32 Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- WREOTYWODABZMH-DTZQCDIJSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-3,4-dihydroxy-5-[2-oxo-4-(2-phenylethoxyamino)pyrimidin-1-yl]oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N(C=C\1)C(=O)NC/1=N\OCCC1=CC=CC=C1 WREOTYWODABZMH-DTZQCDIJSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABIPMNCKZMKDKV-UHFFFAOYSA-N [tert-butyl(dimethyl)silyl] carbamate Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)OC(N)=O ABIPMNCKZMKDKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000001785 acacia senegal l. willd gum Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001420 alkaline earth metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002259 anti human immunodeficiency virus agent Substances 0.000 description 1
- 229940124411 anti-hiv antiviral agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000013321 baculovirus-insect cell expression system Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229950002892 bevirimat Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 1
- 229940125797 compound 12 Drugs 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000003674 cytoplasmic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000677 double quantum filter Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000019264 food flavour enhancer Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003881 globally optimized alternating phase rectangular pulse Methods 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 1
- 238000001052 heteronuclear multiple bond coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000001208 nuclear magnetic resonance pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 125000001209 o-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(C([H])=C1[H])[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-L suberate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCCCC([O-])=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- ILMRJRBKQSSXGY-UHFFFAOYSA-N tert-butyl(dimethyl)silicon Chemical group C[Si](C)C(C)(C)C ILMRJRBKQSSXGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012582 total correlation spectroscopy experiment Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J53/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by condensation with a carbocyclic rings or by formation of an additional ring by means of a direct link between two ring carbon atoms, including carboxyclic rings fused to the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton are included in this class
- C07J53/002—Carbocyclic rings fused
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
- C07J63/008—Expansion of ring D by one atom, e.g. D homo steroids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Compuesto de la fórmula (I) siguiente:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un estereoisómero o una mezcla de estereoisómero en cualquier proporción, en particular una mezcla de enantiómeros, y particularmente una mezcla de racemato, en el que R representa un grupo -(CHR2)-(CHR3)10 n-X, en el que: - n representa 1, - X representa un grupo COOH o NHR1, representando R1 un átomo de hidrógeno o un grupo -Alk, -C(O)- Alk o -C(O)O-Alk, representando Alk un grupo alquilo (C1-C6), y - R2 y R3 representan, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C8), preferentemente un grupo alquilo (C1-C4), opcionalmente sustituido con un grupo COOH o NHR1, representando preferentemente por lo menos R2 y R3 un átomo de hidrógeno.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
DESCRIPCION
Derivados del acido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)-betul[nico.
La presente invencion se refiere a derivados del acido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)-betulfnico, a un procedimiento para su preparacion, y a su utilizacion en el tratamiento de una infeccion con un retrovirus tal como VIH.
La mayorfa de los inhibidores farmaceuticos anti-VIH-1 se centran en las actividades enzimaticas catalizadas por la transcriptasa inversa (RT), la integrasa (IN) o la proteasa (PR), y han provocado la aparicion de cepas del VIH-1 multirresistentes. De este modo, la comunidad cientffica se ha visto implicada en el descubrimiento de nuevas dianas para combatir el SIDA, y en el desarrollo de nuevas moleculas dirigidas contra estas dianas. El ensamblaje del precursor Gag de VIH-1 (Pr55Gag) y las etapas de maduracion de la replicacion del virus representan dianas atractivas para el diseno de nuevas moleculas que puedan inhibir la replicacion retrovfrica.
La poliprotefna Gag es necesaria y suficiente para el ensamblaje de pseudopartfculas similares a virus (VLP). Durante o subsiguientemente al ensamblaje de toda la partfcula del VIH-1, Gag se escinde mediante la PR en cuatro protefnas maduras: matriz (MA), capside (CA), nucleocapside (NC) y p6. Se liberan dos peptidos espaciadores extra, SP1 y SP2, que separan CA/NC y NC/p6 respectivamente. Este proceso de maduracion esta regulado en el tiempo: la primera escision se produce entre SP1 y NCp7, que conduce al producto intermedio MA-CA-SP1, que entonces se escinde en MA y CA-SP1 precursora (p25). La escision de p25 se produce tarde en el ciclo de vida del virus, y genera la CA madura (p24) y el peptido SP1. Esta es una etapa crucial para la formacion apropiada de partfculas vfricas maduras e infecciosas.
Recientemente, se ha demostrado que la inhibicion en el sitio de escision de CA-SP1 provoca la produccion de partfculas vfricas defectuosas y no infecciosas. Ademas, la region que rodea al dominio de CA-SP1 desempena un papel importante en la morfogenesis del virion. Se han llevado a cabo en diferentes aislados del VIH-1 y otros lentivirus de primates mutaciones de restos en la union de CA-SP1 o en el peptido SP1, que muestran un grado elevado de conservacion en sus cuatro restos N-terminales. Se ha sugerido que estas mutaciones bloquean la etapa de procesamiento y dan como resultado la produccion de viriones con nucleos aberrantes. El peptido SP1 desempena un papel crucial en el ensamblaje y en las etapas de maduracion de la replicacion del VIH-1, puesto que se ha mostrado que la incorporacion del dominio SP1 en el termino C de CA permite a Gag multimerizarse.
La acumulacion de partfculas vfricas inmaduras y no infecciosas debido a precursores poliprotefnicos no procesados o parcialmente procesados se puede provocar mediante una nueva clase de antivirales derivados del acido betulfnico. Un miembro importante de esta familia de farmacos antivirales es el acido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)- betulfnico, abreviado DSB, conocido como YK-FH312 o PA-457, y usado en la clfnica como Bevirimat™. Se sintetiza a partir de acido betulfnico (BA), que se extrae de las hojas de Syzigium claviforum. En el intervalo nanomolar, DSB interfiere con la escision proteolftica mediada por PR del sustrato poliproteico Pr55Gag en la union de los dominios de capside (CA) y nucleocapside (NC), dando como resultado partfculas con un mayor contenido de CAp25 (CAp25 = CAp24 + SP1) y menor infecciosidad. En el intervalo micromolar y en un sistema heterologo, DSB tiene un efecto negativo sobre el ensamblaje y salida de partfculas semejantes a virus (VLP) formadas de Pr55Gag.
5
10
15
20
25
30
35
40
acido betulfnico acido 3-0-(3',3'-dimetilsuccinil)-betul[nico (DSB)
El DSB, el inhibidor de la maduracion del VIH primero de la clase, muestra sin embargo una baja eficacia debido al polimorfismo natural de su diana, la union de CA-SP1 en la poliprotefna Gag, y debido a la baja biodisponibilidad. El documento US 2004/0204389 describe una serie de compuestos derivados de DSB. En particular, se describen compuestos derivados de DSB con diversas cadenas en la posicion C28.
En el contexto de la presente invencion se ha descubierto que es posible obtener agentes anti-VIH con mayor solubilidad y eficacia en la inhibicion de la maduracion, asf como en la inhibicion del ensamblaje, mediante la sustitucion de la posicion C-28 de DSB con cadenas particulares.
Estos derivados triterpenicos se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir la replicacion del VIH-1 bloqueando la escision mediada por proteasa (PR) en la union de CA-SP1.
Tambien se evaluo la produccion de virus a partir de celulas 293T transfectadas con el tipo salvaje del VIH-1 en presencia de estos compuestos, y se revelo su funcion como inhibidor de la modulacion.
Paralelamente, se aplico una cuantificacion a base de luciferasa de la produccion de VLP mediante celulas de insecto a estos nuevos derivados, y mostraron su inhibicion del ensamblaje vfrico.
Los resultados muestran que en el intervalo nanomolar los nuevos compuestos, y en particular el compuesto 16, son inhibidores de la maduracion, y que a mayores dosis (micromolar), inhiben el ensamblaje de las partfculas. Esta propiedad dual es nueva y esencial, en estrecha relacion con la naturaleza de los sustituyentes en la posicion C28.
La presente invencion se refiere asf a compuestos de la siguiente formula (I):
o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos, un estereoisomero o una mezcla de estereoisomeros en cualquier proporcion, en particular una mezcla de enantiomeros, y particularmente una mezcla racemica,
en los que R es como se cita en la reivindicacion 1.
En el contexto de la presente invencion, la expresion “farmaceuticamente aceptable” pretende significar lo que es util para la preparacion de una composicion farmaceutica, y lo que es generalmente seguro y no toxico para un uso farmaceutico.
La expresion “sal farmaceuticamente aceptable” pretende significar, en el contexto de la presente invencion, una sal
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
de un compuesto que es farmaceuticamente aceptable, como se define anteriormente, y que posee la actividad farmacologica del compuesto correspondiente. Tales sales comprenden:
(1) hidratos y solvatos,
(2) sales de adicion de acidos formadas con acidos inorganicos tales como acido clorhfdrico, bromhfdrico, sulfurico, nftrico y fosforico, y similares; o formadas con acidos organicos tales como acido acetico, bencenosulfonico, fumarico, glucoheptonico, gluconico, glutamico, glicolico, hidroxinaftoico, 2- hidroxietanosulfonico, lactico, maleico, malico, mandelico, metanosulfonico, muconico, 2-naftalenosulfonico, propionico, succfnico, dibenzoil-L-tartarico, tartarico, p-toluenosulfonico, trimetilacetico y trifluoroacetico, y similares, y
(3) sales formadas cuando un proton acido presente en el compuesto se sustituye por un ion metalico, tal como un ion de metal alcalino, un ion de metal alcalino-terreo, o un ion de aluminio; o se coordina con una base organica o inorganica. Las bases organicas aceptables comprenden dietanolamina, etanolamina, N- metilglucamina, trietanolamina, trometamina, y similares. Bases inorganicas aceptables comprenden hidroxido de aluminio, hidroxido de calcio, hidroxido de potasio, carbonato de sodio de hidroxido de sodio.
En el contexto de la presente invencion, “estereoisomeros” pretende designar diastereoisomeros y enantiomeros. Por lo tanto, son isomeros opticos. Los estereoisomeros que no son imagenes especulares entre si se denominan asf “diastereoisomeros”, y los estereoisomeros que son imagenes especulares no superponibles se denominan “enantiomeros”.
Un atomo de carbono enlazado a cuatro sustituyentes no identicos se denomina un “centro quiral”.
Una mezcla equimolar de dos enantiomeros se denomina mezcla racemica.
El termino “alquilo (C1-C10)”, como se usa en la presente invencion, se refiere a una cadena hidrocarbonada saturada lineal o ramificada que contiene de 1 a 10 atomos de carbono.
El termino “alquilo (C1-C6)”, como se usa en la presente invencion, se refiere a una cadena hidrocarbonada saturada lineal o ramificada que contiene de 1 a 6 atomos de carbono, incluyendo, pero sin limitarse a, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, n-hexilo, y similar.
R representa un grupo -(CHR2)-(CHR3)n-X, en el que:
- n representa 1,
X representa un grupo COOH o NHR1, representando R1 un atomo de hidrogeno o un grupo -Alk, -C(O)-Alk o -C(O)O-Alk, representando Alk un grupo alquilo (C1-C6), y
- R2 y R3 representan, independientemente entre si, un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo (C1-C8), preferiblemente un grupo alquilo (C1-C4), opcionalmente sustituido con un grupo COOH o NHR1.
Preferentemente, al menos R2 o R3 representa un atomo de hidrogeno.
En la definicion de R anterior, R1 puede representar ventajosamente un atomo de hidrogeno o un grupo -C(O)O-Alk, en particular R1 puede representar H o un grupo Boc (ferc-butiloxicarbonilo).
En particular, R se selecciona de los siguientes grupos:
- C .OH )
El compuesto de formula (I) se selecciona preferentemente del siguiente compuesto
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La presente invencion se refiere tambien a los compuestos mencionados anteriormente de formula (I) como un medicamento.
Estos compuestos pueden ser utiles para el tratamiento de una infeccion con un retrovirus tal como VIH, y en particular VIH-1.
La invencion tambien se refiere a la utilizacion de un compuesto de formula (I) para la preparacion de un medicamento destinado a ser usado en el tratamiento de una infeccion con un retrovirus tal como VIH, y en particular VIH-1.
La invencion tambien se refiere a un procedimiento para tratar una infeccion con un retrovirus tal como VIH, y en particular VIH-1, que comprende administrar a una persona que lo necesite una cantidad eficiente de al menos un compuesto de formula (I).
La presente invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende al menos un compuesto de formula (I) y al menos un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden estar destinadas a la administracion oral, sublingual, subcutanea, intramuscular, intravenosa, transdermica, local o rectal. El principio activo se puede administrar en formas unitarias para administracion, mezclado con vehfculos farmaceuticos convencionales, a animales o a seres humanos. Las formas unitarias adecuadas para administracion comprenden las formas para administracion oral, tales como comprimidos, capsulas de gelatina, polvos, granulos y disoluciones o suspensiones orales, las formas para administracion sublingual y bucal, las formas para administracion subcutanea, intramuscular, intravenosa, intranasal o intraocular, y en las formas para administracion rectal.
Cuando una composicion solida se prepara en forma de comprimidos, el principio activo principal se mezcla con un vehfculo farmaceutico tal como gelatina, almidon, lactosa, estearato de magnesio, talco, goma arabiga y similar. Los comprimidos se pueden revestir con sacarosa o con otros materiales adecuados, o se pueden tratar de tal manera que pueden tener una actividad prolongada o retrasada y liberan continuamente una cantidad predeterminada de principio activo.
Una preparacion en capsulas de gelatina se obtiene mezclando el principio activo con un diluyente y vertiendo la mezcla obtenida en capsulas de gelatina blandas o duras.
Una preparacion en forma de un jarabe o un elixir puede contener el principio activo junto con un edulcorante, un antiseptico, o tambien un potenciador del sabor o un agente colorante adecuado.
Los polvos o granulos dispersables en agua pueden contener el principio activo mezclado con agentes dispersantes o agentes humectantes, o agentes de suspension, y con correctores del sabor o edulcorantes.
Para administracion rectal, se usan supositorios que se preparan con aglutinantes que funden a la temperatura rectal, por ejemplo manteca de cacao o polietilenglicoles.
Para administracion parenteral, intranasal o intraocular, se usan suspensiones acuosas, disoluciones salinas isotonicas o disoluciones esteriles e inyectables que contienen agentes dispersantes y/o agentes humectantes farmacologicamente compatibles.
El principio activo tambien se puede formular en forma de microcapsulas, opcionalmente con uno o mas aditivos portadores.
Los compuestos de la invencion se pueden usar en una composicion farmaceutica a una dosis que oscila de 0,01 mg a 1000 mg por dfa, administrada en una sola dosis una vez al dfa o en varias dosis a lo largo del dfa, por ejemplo dos veces al dfa. La dosis administrada diariamente comprende ventajosamente entre 5 mg y 500 mg, y mas ventajosamente entre 10 mg y 200 mg. Sin embargo, puede ser necesario usar dosis fuera de estos intervalos, que
5
10
15
20
25
30
35
resultan evidentes para el experto en la materia.
La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento como se cita en la reivindicacion 7 para preparar un compuesto de formula (I) segun la presente invencion, que comprende las siguientes etapas sucesivas:
(i) hacer reaccionar un compuesto de la siguiente formula (II):
con anhidrido 2,2-dimetilsuccinico de la siguiente formula:
y
(ii) opcionalmente, cuando R comprende un grupo NHR1, desproteger este grupo NHR1 para producir un grupo NH2.
Etapa (i):
R representa un grupo -(CHR2)-(CHR3)n-X, en el que:
- n representa 1,
X representa un grupo COOH o NHR1, representando R1 un grupo -Alk, -C(O)-Alk o -C(O)O-Alk, representando Alk un grupo alquilo (C1-Ca), y
- R2 y R3 representan, independientemente entre si, un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo (C1-C8), preferiblemente un grupo alquilo (C1-C4), opcionalmente sustituido con un grupo COOH o NHR1.
Preferentemente, al menos R2 o R3 representa un atomo de hidrogeno.
En la definicion de R anterior, R1 puede representar ventajosamente un grupo -C(O)O-Alk, tal como un grupo Boc (ferc-butiloxicarbonilo).
En particular, R se selecciona de los siguientes grupos:
La reaccion de la etapa (i) se puede llevar a cabo en presencia de DMAP (N,N-dimetilaminopiridina) en piridina,
a
5
10
15
20
25
30
35
40
principalmente a reflujo.
La reaccion conduce a una mezcla de derivados de acido 3-O-(2',2'-dimetilsuccinil)- y 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)- betulfnico. Los productos de esta mezcla se pueden separar mediante cromatograffa ultrarrapida para producir el compuesto deseado de formula (I) (un derivado de acido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)-betulmico.
Etapa (ii):
Esta etapa de desproteccion, si es necesaria, es bien conocida por un experto en la materia.
Preferentemente, el grupo R1 sera en este caso un grupo -C(O)O-Alk, tal como un grupo Boc. La etapa de desproteccion del grupo Boc se puede llevar a cabo haciendo reaccionar en primer lugar el compuesto con trifluorometanosulfonato de ferc-butildimetilsililo en presencia de 2,6-lutidina para dar un carbamato de terc- butildimetilsililo, es decir, el grupo -NHBoc se sustituye por el grupo -NH-C(O)-SiMe2fBu. Despues, la eliminacion del grupo W-ferc-butildimetilsililoxicarbonilo se puede lograr mediante tratamiento con iones fluoruro, que se pueden proporcionar mediante n-Bu4NF, en un disolvente tal como THF. Otra posibilidad es escindir el enlace de N-Boc en presencia de HCl en un disolvente tal como THF.
El compuesto de formula (II) se puede preparar como se cita en la reivindicacion 8 mediante las siguientes etapas sucesivas:
(a) acoplar un compuesto de formula (III)
en la que GP representa un grupo O-protector, tal como un grupo acetilo, con una amina de la siguiente formula (IV):
R4-NH2 (IV)
para producir un compuesto de la siguiente formula (IV):
en la que R4 y GP son como se definen anteriormente, y
(b) desproteger el grupo hidroxilo y, cuando sea apropiado, el grupo -COO-Alk1 y/o NHR1 del compuesto de formula (IV) obtenido en la etapa (a) previa para producir un compuesto de formula (II).
Etapa (a):
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
R4 representa un grupo -(CHR2)-(CHR3)n-X, en el que:
- n representa 1,
-C(O)-Alk o -C(O)O-Alk, un grupo alquilo (C1-C8),
preferentemente un grupo alquilo (C1-C4), opcionalmente sustituido con un grupo COO-Alk1 o NHR1. Preferentemente, al menos R2 o R3 representa un atomo de hidrogeno.
En la definicion de R4 anterior, R1 puede representar ventajosamente un grupo -C(O)O-Alk1, tal como un grupo Boc (ferc-butiloxicarbonilo). Alk1 puede representar ventajosamente un grupo ferc-butilo.
En particular, R4 se selecciona de los siguientes grupos:
X representa un grupo COO-Alk1 o NHR1, representando R1 un grupo -Alk, representando Alk y Alk1, independientemente entre si, un grupo alquilo (C1-C6), y
- R2 y R3 representan, independientemente entre si, un atomo de hidrogeno o
La expresion “grupo O-protector”, como se usa en la presente invencion, se refiere a un sustituyente que protege a los grupos hidroxilo frente a reacciones indeseables durante procedimientos de sfntesis, tales como aquellos grupos O-protectores descritos en Greene, “Protective Groups In Organic Synthesis”, (John Wiley & Sons, Nueva York (1981)). Los grupos O-protectores comprenden grupos alquilo (C1-C6), tales como metilo, etilo, ferc-butilo; esteres de metilo sustituidos, por ejemplo metoximetilo (MOM), benciloximetilo, 2-metoxietoximetilo, 2-(trimetilsili l)etoxi metilo, bencilo y trifenilmetilo; eteres tetrahidropiranilo; eteres de etilo sustituidos, por ejemplo, 2,2,2-tricloroetilo; eteres de sililo, por ejemplo, trimetilsililo, t-butildimetilsililo (TBS) y t-butildifenilsililo; y esteres preparados haciendo reaccionar el grupo hidroxilo con un acido carboxflico, por ejemplo acetilo, propionilo, benzoflo y similar. En particular sera un grupo acetilo.
El acoplamiento se puede llevar a cabo mediante acoplamiento peptfdico bien conocido por el experto en la materia.
El acoplamiento peptfdico se llevara a cabo ventajosamente en presencia de un agente de acoplamiento, tal como diisopropilcarbodiimida (DIC), diciclohexilcarbodiimida (DCC), hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida (EDC), carbonildiimidazol (CDI), hexafluorofosfato de 2-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU), tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU), hexafluorofosfato de O-(7- azobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU) o hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolodinofosfonio (PiBOP); opcionalmente asociado con un acoplamiento auxiliar, tal como N-hidroxi-succinimida (NHS), N-hidroxi- benzotriazol (HOBt), 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazol (HOOBt), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HAt) o N- hidroxisulfosuccinimida (sulfo NHS).
Ventajosamente, el acoplamiento peptfdico se llevara a cabo en presencia de PyBOP y una base tal como diisopropiletilamina (DIEA).
El compuesto de formula (III) se puede preparar ademas a partir de acido betulfnico mediante una etapa de proteccion del grupo hidroxilo.
Preferiblemente, el grupo O-protector sera un grupo acetilo. Este grupo se puede introducir en el acido betulfnico mediante reaccion con anhfdrido acetico en piridina.
Etapa (b):
La etapa de desproteccion del grupo O-protector se puede llevar a cabo mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia.
En el caso en el que GP represente un grupo acetilo, la etapa de desproteccion se puede llevar a cabo mediante saponificacion, principalmente en presencia de hidroxido sodico, principalmente en un disolvente tal como una mezcla de tetrahidrofurano y metanol.
En estas condiciones de reaccion, el grupo -COO-Alk1 tambien se desprotege para conducir al grupo -COOH
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
deseado.
La invencion se pondra mas claramente de manifiesto a partir de los siguientes ejemplos y figuras, proporcionandose dichos ejemplos unicamente a tftulo ilustrativo de la invencion.
Figuras
Figura 1: Efecto del compuesto sobre la produccion de partfculas vfricas y procesamiento de Gag en lisado virionico. Se observa acumulacion de p25 en presencia de 1, 2, 12, 16 y 15.
Figura 2: Analisis mediante EM de seccion delgada de viriones producidos a partir de celulas tratadas con BA (1), DSB (2), 12, 16, 15. Se transfectaron celulas 293T con pNL4-3 y no se trataron (A) o se trataron (B, C, D, E, F) con BA (1), DSB (2), 12, 16 y 15. Dos dfas despues de la transfeccion, las celulas se fijaron y se analizaron mediante EM de seccion delgada. La flecha discontinua en A indica nucleos conicos maduros; las flechas en B, C, D, E y F indican la capa densa en electrones, con forma de media luna, dentro de la membrana viral que resulta de la inhibicion del procesamiento de p25. (Barra: »100 nm).
Figura 3: Dependencia del empaquetamiento de LucVpr respecto del dominio p6 de Gag. Analisis mediante ultracentrifugacion isopfcnica en gradiente de densidad de sacarosa-D2O de VLP extracelulares aisladas de medio de cultivo de celulas Sf9. (a), Transferencia Western de las fracciones de gradientes analizadas mediante SDS- PAGE. La transferencia se hizo reaccionar con anticuerpo policlonal anti-Gag y con anticuerpo IgG anticonejo marcado con fosfatasa. Lfnea m, marcadores de masa molecular previamente tenidos (PageRuler™; Fermentas Inc.). La posicion de VLP (fracciones 10-13; 1,12-1,15 en densidad) se indica en la parte superior del panel. (b), La actividad de luciferasa se ensayo en cada fraccion de gradiente, y se expreso como unidades de luz relativas (RLU). Sfmbolo en blanco, celulas Sf9 que expresan LucVpr sola; sfmbolos en negro, celulas Sf9 que coexpresan LucVpr y Pr55Gag de longitud completa o Gag sin p6 (GagDp6). Cada fraccion de gradiente se evaluo para determinar la actividad de luciferasa. Los valores de la densidad se indican en la escala de la derecha.
Figura 4: Cuantificacion del ensamblaje y salida de VLP usando ensayo de luciferasa. Celulas que coexpresan Pr55Gag y LucVpr no se trataron (control 0) o se trataron con DSB en DMSO durante 24 h a 24 h pi, a concentraciones crecientes como se indica. VLP se aislaron del medio de cultivo a 48 h pi mediante ultracentrifugacion isopfcnica en gradiente de densidad de sacarosa-D2O, y se evaluaron para determinar la actividad de luciferasa, expresada como unidades de luz relativas (RLU).
Figura 5: Evaluacion de la actividad inhibidora de BA, PA-457, 12, 15 y 16 sobre el ensamblaje de VLP, usando un ensayo a base de empaquetamiento de Vpr con luciferasa.
Alfcuotas de celulas Sf9 coinfectadas con AcMNPV-Pr55Gag y AcMNPV-LucVpr a MOI iguales se trataron a 24 h pi con dosis crecientes de cada inhibidor durante 24 h. Las celulas y el medio de cultivo se cosecharon a 48 h pi, y las VLP se aislaron del medio de cultivo. Los sedimentos celulares y las VLP se procesaron entonces para el ensayo de luciferasa, y los valores de la relacion de la actividad de luciferasa asociada a VLP incorporadas a las celulas, en porcentaje del control (inhibidor 0), se representaron graficamente frente a las concentraciones de DSB. En las muestras de control, la fraccion de luciferasa incorporada por las VLP fue habitualmente 5 a 7% de la actividad total recuperada. Por ejemplo, en el experimento ilustrado aquf, la actividad recuperada fue 35,5 x 106 RLU en sedimentos celulares, frente a 2,5 x 106 en VLP extracelulares. Observese que la curva de inhibicion de 17, que se asemejo a la de 12, no se represento por razones de claridad.
Ejemplos
I. Sfntesis de los compuestos
Los productos se caracterizaron mediante espectroscopfa de masas de alta resolucion (HRMS) y mediante RMN (resonancia magnetica nuclear). Se uso la convencion de IUPAC para numerar los atomos de carbono. La asignacion completa de las resonancias de RMN de 1H y 13C se logro mediante experimentos de RMN 1D y 2D, correlacion heteronuclear de un solo cuanto (1H,13C-HSQC), correlacion heteronuclear a multiples enlaces (1H,13C-HMBC), espectroscopfa de correlacion 1H-1H (COSY) y espectroscopfa de correlacion total (TOCSY).
Los espectros de RMN 1H, RMN 13C, DEPT135, DQF-COSY, TOCSY, HSQC y HMBC se registraron con un espectrometro de RMN Bruker AVANCE 400 a 400,13 MHz (SF) para 1H y 100,623 MHz (SF) para 13C con sonda inversa de 5 mm a temperatura ambiente. Los diferentes compuestos estaban en disoluciones 10 mM en 0,5 ml de C5D5N en tubos de RMN de 5 mm. Todos los desplazamientos qufmicos estaban en ppm (8). Los espectros de RMN 1H se realizaron con una anchura espectral (SW) de 4084,97 Hz, y los espectros de RMN 13C con Sw de 22522,52 Hz con desacoplamiento de 1H con secuencia de pulso WALTZ; el tipo de carbono (es decir, C, CH, CH2, CH3) se determino usando experimentos de DEPT135. Todos los experimentos bidimensionales se realizaron usando secuencias de pulso estandar con el programa de software de Bruker XWIN-NMR vs 3.0. Los espectros de DQF- COSY y TOCSY se registraron con 2048 puntos en la dimension F2 y 512 incrementos en la dimension F1. Cada
5
10
15
20
25
30
incremento se obtuvo con 40 barridos y se uso una anchura espectral de 4084,97 Hz, un retraso de reciclaje de 2 s y un tiempo de mezclamiento de 80 ms para los experimentos de TOCSY. Los espectros de HSQC se obtuvieron con la constante de acoplamiento de 1H-13C de un enlace ajustada a 145 Hz, un desacoplamiento de 13C GARP WALTZ, 2048 puntos en la dimension F2 y 256 incrementos en la dimension F1, con un retraso de relajamiento de 2 s. La anchura espectral se ajusto a 10964,91 Hz en la dimension F2 y 4084,97 Hz en la dimension F1. Los experimentos de HMBC se realizaron con 40 barridos para cada 256 incrementos de F1, 2048 puntos de datos en F2. Se ha usado una anchura espectral de 4084,97 Hz y 22522,52 Hz en las dimensiones de 1H y 13C respectivamente.
El Acido betulfnico, anhfdrido acetico, PyBOP, DIEA, DMAP, anhfdrido 2,2-dimetilsuccfnico, 2,6-lutidina, trifluorometanosulfonato de terc-butildimetilsililo se adquirieron de Aldrich. Todos los aminoacidos, procedentes de Bachem, estaban protegidos O-tBu, y la cadena lateral de Lys se protegio como N-Boc.
En la parte experimental se han usado las siguientes abreviaturas:
Ac?O: anhfdrido acetico; f-BuMe?SiOTf: trifluorometanosulfonato de ferc-butildimetilsililo; nBu4NF: fluoruro de tetrabutilamonio; DEPT135: aumento sin distorsion por transferencia de polarizacion; DIEA: N,N-diisopropiletilamina; DMAP: 4-(dimetilamino)piridina; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfoxido; DQF-COSY: espectroscopfa de correlacion con filtro de doble cuanto; HMBC: correlacion heteronuclear a multiples enlaces; HSQC: correlacion heteronuclear de un solo cuanto; MeOH: metanol; PyBOP: hexafluorofosfato de (benzotriazol-1- iloxi)tripirrolodinofosfonio; THF: tetrahidrofurano; TOCSY: espectroscopfa de correlacion total.
Los compuestos se han sintetizado segun el siguiente esquema de reaccion:
Esquema 1a
a Reactivos y condiciones: (i) Ac2O, piridina; (ii) PyBop, DIEA, NH2-X-R, rt, 72 h; (iii) NaOH 4M, THF/MeOH, rt, 12 h; (iv) anhfdrido, DMAP, piridina, reflujo, 18 h; (v) 2,6-lutidina, f-BuMe2SiOTf, CH2O2, 30 mn, n-Bu4NF, THF, rt, 1 h; (vi)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
HCl 6M, THF, rt, 1 h
I.a) Procedimiento general para sintetizar derivados (4-7).
A una mezcla de 3-O-Ac-BA (3) (200-300 mg, 0,4-0,6 mmoles) y DIEA (0,28-0,42 ml, 1,6-2,4 mmoles) en DMF (2-3 ml) se le anadieron sucesivamente PyBOP (0,31-0,47 g, 0,6-0,9 mmoles) y la amina NH2-X-R1 apropiada (0,6-0,9 mmoles). La mezcla se agito durante 72 h, y despues se diluyo con CH2Cl2 (50 ml), se lavo con disolucion acuosa de acido cftrico (10%), con agua, con salmuera, y se seco sobre MgSO4. La capa organica se concentro a vacfo, y el residuo se purifico mediante cromatograffa en gel de sflice para proporcionar el producto intermedio deseado 4, 5, 6 o 7.
Ester t-butllico de N-(O3-acetil-betulinil)glicina (4): Rf: 0,38 (tolueno/acetona 10/0,5); Rendimiento: 64% (158 mg); RMN 1H (300 MHz, CDCla): 8 0,75 (m, 1H, -CH en 5), 0,82 (s, 3H, -CH3), 0,83 (s, 3H, -CH3), 0,91 (s, 3H, -CH3), 0,95 (s, 3H, -CH3), 1,09 (m, 2H), 1,10-1,45 (m, 11H), 1,47 (s, 12H, -CH3, t-Bu), 1,50-1,65 (m, 6H), 1,67 (s, 3H, -CH3), 1,752,0 (m, 3H), 2,03 (s, 3H, -COCH3), 2,45 (dt, 1H, J = 3,5 Hz, J = 13 Hz), 3,10 (dt, 1H, J = 3,5 Hz, J = 11 Hz), 3,89 (m, 2H, -CH2), 4,45 (t, 1H, J = 7,5 Hz), 4,58 (s, 1H, = CH), 4,73 (s, 1H, = CH), 6,10 (t, 1H, J = 5,2 Hz). RMN 13C (300 MHz, CDCla): 8 14,6; 16,0; 16,2; 16,5; 18,2; 19,4; 20,9; 21,3; 23,7; 25,5; 27,9; 28,0; 29,4; 30,8; 33,6; 34,3; 36,5; 37,1; 37,6; 37,8; 38,3; 38,4; 40,7; 41,9; 42,5; 45,9; 46,7; 50,0; 50,5; 55,4; 55,7; 80,9; 82,0; 109,4; 150,9; 169,6; 171,0; 176,4.
Ester t-butllico de N-(O3-acetil-betulinil)-B-alanina (5): Rf: 0,45 (tolueno/acetona 10/0,5); Rendimiento: 80% (300 mg); RMN 1H (400 MHz, C5D5N): 8 0,80 (m, 4H, -CH en 5, -CH3 en 25), 0,87-0,9 (m, 7H, -CH3 en 23 y 24, -CH en 1), 1,08 (1s, 3H, -CH3 en 27), 1,12 (1s, 3H, -CH3 en 26), 1,18 (m, 1H, -CH en 12), 1,19 (m, 1H, -CH en 11), 1,21 (m, 1H, -CH en 15), 1,33 (m, 1H, -CH en 9), 1,34 (m, 1H, -CH en 11), 1,35 (m, 1H, -CH en 6), 1,42 (m, 2H, -CH en 7), 1,45 (m, 1H, -CH en 6), 1,49 (s, 9H, -COOtBu), 1,5 (m, 1H, -CH en 21), 1,54 (m, 1H, -CH en 22), 1,6 (m, 2H, -CH en 1 y 16), 1,65 (m, 1H, -CH en 2), 1,7 (m, 1H, -CH en 2), 1,74 (m, 1H, -CH en 15), 1,77 (s, 3H, -CH3 en 30), 1,94 (m, 1H, -CH en 12), 2,08 (s, 3H, -COCH3), 2,13 (m, 1H, -CH en 22), 2,21 (m, 1H, -CH en 21), 2,4 (m, 1H, -CH en 16), 2,77 (m, 1H, -CH en 2”), 2,85 (m, 1H, -CH en 2”), 3,08 (m, 1H, -CH en 13), 3,62 (m, 1H, -CH en 19), 3,7 (m, 1H, -CH en 1”), 3,85 (m, 1H, -CH en 1”), 4,7 (dd, 1H, -CH en 3, J = 4,5 MHz y 11,5 Hz), 4,78 (s, 1H, = CH), 4,94 (s, 1H, = CH), 8,35, (d, 1H, -CO-NH-, J = 7 Hz). RMN 13C (400 MHz, C5D5N): 8 15,2 (C27); 16,8 (C25); 16,9 (C26); 17,2 (C24); 18,9 (C6); 20 (C30); 21,6 (C2'); 21,66 (C11); 24,5 (C2); 26,6 (C12); 28,5 (3C, t-Bu y C23); 30,3 (C15); 31,8 (C21); 34 (C16);
35.1 (C7); 36,3 (C2”); 36,5 (C1”); 37,7 (C10); 38 (C13); 38,5 (C4); 39 (C22 y C1); 41,6 (C8); 43,2 (C14); 47,65 (C19);
51.1 (C18); 51,3 (C9); 56,1 (C5); 56,3 (C17); 80,7 (Ct-Bu); 81,2 (C3); 110,2 (C29); 152,1 (C20); 171,1 (C1'); 172,4 (C COOt-Bu); 177,4 (C28).
N-(O3-acetil-betulinil)-N’-Boc-etilendiamina (6): Rf: 0,48 (tolueno/acetona 90/10); Rendimiento: 86% (330 mg); RMN 1H (300 MHz, CDCl3): 8 0,77 (m, 1H), 0,83 (s, 3H, -CH3), 0,84 (s, 6H, 2-CH3), 0,94 (s, 3H, -CH3), 0,96 (s, 3H, -CH3),
1.09 (m, 1H), 1,10-1,41 (m, 8H), 1,47 (s, 9H, t-Bu), 1,49-1,65 (m, 8H), 1,68 (s, 3H, -CH3), 1,70-1,80 (m, 3H), 1,98 (m, 3H), 2,04 (s, 3H, -COCH3), 2,45 (dt, 1H, J = 3,1 Hz, J = 12,5 Hz), 3,13 (dt, 1H, J = 4,4 Hz, J = 11 Hz), 3,27 (m, 2H, - CH2), 3,34 (m, 2H, -CH2), 4,46 (t, 1H, J = 7,0 Hz), 4,59 (s, 1H, = CH), 4,74 (s, 1H, = CH), 5,04 (m, 1H, -NH-CO-), 6,33 (m, 1H, -CO-NH-).
Ester t-butllico de N2-(O3-acetil-betulinil)-N6-Boc-L-Lisina (7): Rf: 0,28 (tolueno/acetona 95/5); Rendimiento: 73% (410 mg); RMN 1H (400 MHz, C5D5N): 8 0,80 (m, 4H, -CH en 5, -CH3 en 25), 0,90 (m, 7H, -CH3 en 23 y 24, -CH en 1),
1.09 (2s, 6H, -CH3 en 27 y 26), 1,16 (m, 1H, -CH en 11), 1,17 (m, 1H, -CH en 12), 1,29 (m, 1H, -CH en 15), 1,32 (m, 1H, -CH en 11), 1,33 (m, 1H, -CH en 9), 1,42 (m, 3H, -CH en 6 y 7), 1,48 (s, 9H, -COOtBu y m, 1H, -CH en 6), 1,52 (m, 2H, -CH en 21 y 22), 1,55 (s, 9H, -NHBoc), 1,58 (m, 2H, -CH en 1 y 2), 1,69 (m, 2H, -CH2g Lys), 1,70 (m, 3H, -CH en 18, -CH28 Lys), 1,71 (m, 1H, -CH en 2), 1,78 (s, 3H, -CH3 en 30), 1,80 (m, 1H, -CH en 15), 1,86 (m, 1H, -CHp Lys), 1,92 (m, 1H, -CH en 12), 2,07 (m, 1H, -CHb Lys), 2,08 (s, 3H, -COCH3), 2,30 (m, 1H, -CH en 21), 2,33 (m, 1H, - CH en 22), 2,54 (m, 1H, -CH en 16), 3,03 (m, 1H, -CH en 13), 3,40 (m, 2H, -CH2e Lys), 3,58 (m, 1H, -CH en 19), 4,7 (dd, 1H, -CH en 3, J = 5 Hz y 11,5 Hz), 4,75 (s, 1H, = CH), 4,91 (m, 2H, = CH y -CHa Lys), 7,55 (t, 1H, -NH-CO- J = 5 Hz), 8,22 (d, 1H, -CO-NH-, J = 8 Hz). RMN 13C (400 MHz, C5D5N): 8 15,3 (C27); 16,7 (C25); 17 (C26); 17,2 (C24); 19 (C6); 20 (C30); 21,6 (C2'); 21,7 (C11); 24,3 (CgLys); 24,5 (C2); 26,6 (C12); 28,4 (3C, t-Bu); 28,5 (C23); 29 (3C, Boc);
30.3 (C15); 30,5(C8Lys); 31,9 (C21); 32 (CpLys); 34 (C16); 35,1 (C7); 37,8 (C10); 38,1 (C13); 38,5 (C4); 38,65 (C22); 39 (C1); 41,3 (CeLys); 41,6 (C8); 43,2 (C14); 47,6 (C19); 51,1 (C18); 51,3 (C9); 53,4 (CaLys); 56,1 (C5); 56,4 (C17);
78.4 (CBoc); 81,2 (C3); 81,3 (Ct-Bu); 110,2 (C29); 152,1 (C20); 157,25 (C NHCOOt-Bu); 171,1 (C1'); 173,4 (C COOtBu); 177,3 (C28).
I.b) Procedimiento general para sintetizar derivados (8-11). A la disolucion del producto intermedio 4, 5, 6 o 7 anterior (0,3 mmoles) en THF/MeOH (1/1,4 ml) se le anadio NaOH acuoso (4 M, 0,75 ml). Tras agitar durante 12 h a temperatura ambiente, la mezcla se acidifico con HCl 1N. El precipitado resultante se recogio, se lavo con agua y se seco a vacfo para producir los compuestos correspondientes 8 y 9. Para el compuesto 10 y 11, la mezcla se extrajo con CH2Cl2 (50 ml), la capa organica se lavo con agua, con salmuera, y se seco sobre MgSO4, y despues se concentro a vacfo. El residuo se purifico mediante cromatograffa en gel de sflice para proporcionar el producto intermedio 8, 9, 10 u 11 deseado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
N-betulinil-glicina (8): Rendimiento: 83% (128 mg); RMN 1H (CDCI3): 8 0,70 (m, 1H, -CH en 5), 0,77 (s, 3H, -CH3),
0. 83 (s, 3H, -CH3), 0,93 (s, 3H, -CH3), 0,98 (s, 3H, -CH3), 0,99 (s, 3H, -CH3), 1,09 (m, 1H), 1,10-1,65 (m, 20H), 1,70 (s, 3H, -CH3), 1,90 (m, 3H), 2,40 (dt, 1H, J = 3,5 Hz, J = 13 Hz), 3,10 (dt, 1H, J = 3,5 Hz, J = 11 Hz), 3,20 (m, 1H), 4,05 (t, 2H, J = 7,5Hz), 4,61 (s, 1H, = CH), 4,75 (s, 1H, = CH), 6,14 (t, 1H, J = 5,2 Hz).
N-betulinil-b-alanina (9): Rendimiento: 89% (141 mg); RMN 1H (400 MHz, C5D5N): 8 0,86 (m, 1H, -CH en 5), 0,88 (m, 3H, -CH3 en 25), 0,99 (m, 1H, -CH en 1), 1,04 (s, 3H, -CH3 en 24), 1,08 (s, 3H, -CH3 en 27), 1,16 (s, 3H, -CH3 en 26),
1.2 (m, 1H, -CH en 12), 1,24 (m, 2H, -CH en 11 y -CH en 15), 1,27 (m, 3H, -CH3 en 23), 1,41 (m, 3H, -CH en 6 y -CH en 7), 1,42 (m, 1H, -CH en 9), 1,44 (m, 1H, -CH en 11), 1,5 (m, 2H, -CH en 21 y -CH en 22), 1,58 (m, 2H, -CH en 6 y -CH en 16), 1,68 (m, 1H, -CH en 1), 1,72 (m, 1H, -CH en 18), 1,8 (s, 3H, -CH3 en 30), 1,86 (m, 1H, -CH en 15), 1,89 (m, 2H, -CH en 2), 1,98 (m, 1H, -CH en 12), 2,13 (m, 1H, -CH en 22), 2,28 (m, 1H, -CH en 21), 2,44 (m, 1H, -CH en 16), 2,96 (m, 2H, -CH en 2”), 3,05 (m, 1H, -CH en 13), 3,46 (m, 1H, -CH en 3), 3,65 (m, 1H, -CH en 19), 3,93 (m, 1H, -CH en 1”), 3,98 (m, 1 H, -CH en 1”), 4,77 (s, 1H, = CH), 4,93 (s, 1H, = CH), 8,36 (d, 1H, -CO-NH-, J = 7 Hz). RMN 13C (400 MHz, C5D5N): 8 16,2 (C27); 17,8 (C24); 17,86 (C25); 17,92 (C26); 20,2 (C6); 21 (C30); 22,6 (C11); 27,6 (C12); 29,7 (C2); 30 (C23); 31,2 (C15); 32,8 (C21); 35 (C16); 36,2 (C7); 37,4 (C2”); 37,9 (C1”); 38,9 (C10); 39,2 (C13); 40,1 (C22); 40,6 (C1); 40,9 (C4); 42,6 (C8); 44,1 (C14); 48,7 (C19); 52,1 (C18); 52,4 (C9); 57,28 (C17); 57,34 (C5); 79,5 (C3); 110,1 (C29); 153,1 (C20); 177,5 (C3”); 178,1 (C28).
N-betulinil-N’-Boc-etilendiamina (10): Rf: 0,48 (tolueno/acetona 80/20); Rendimiento 67% (210 mg); RMN 1H (300 MHz, CDCla): 8 0,70 (m, 1H, -CH en 5), 0,77 (s, 3H, -CH3), 0,83 (s, 3H, -CH3), 0,94 (s, 3H, -CH3), 0,97 (s, 6H, 2-CH3),
1,09 (m, 1H), 1,10-1,40 (m, 9H), 1,45 (s, 9H, t-Bu), 1,50-1,65 (m, 7H), 1,69 (s, 3H, -CH3), 1,72 (m, 3H), 1,99 (m, 2H), 2,46 (dt, 1H, J = 3,5 Hz, J = 13 Hz), 3,20 (m, 6 Hz 3,20 (m, 1H), 4,60 (s, 1H, = CH), 4,74 (s, 1H, = CH), 5,01 (m, 1H, - NH-CO-), 6,33 (m, 1 H, -CO-NH-).
N2-betulinil-N6-Boc-L-Lisina (11): Rf: 0,32 (n-heptano/acetato de etilo/acido acetico 10/10/0,25); Rendimiento 97% (277 mg); RMN 1H (400 MHz, C5D5N): 8 0,86 (m, 4H, -CH en 5, -CH3 en 25), 1,02 (m, 1H, -CH en 1), 1,06 (s, 3H, - CH3 en 24), 1,10 (s, 3H, -CH3 en 27), 1,18 (s, 3H, -CH3 en 26), 1,20 (m, 1H, -CH en 12), 1,22 (m, 1H, -CH en 11), 1,26 (s, 3H, -CH3 en 23), 1,35 (m, 1H, -CH en 15), 1,42 (m, 1H, -CH en 11), 1,43 (m, 1H, -CH en 9), 1,48 (m, 1H, -CH en 6), 1,50 (m, 2H, -CH2 en 7), 1,52 (m, 1H, -CH en 21), 1,53 (m, 1H, -CH en 22), 1,55 (s, 9H, -NHBoc), 1,61 (m, 1H, -CH en 6), 1,67 (m, 1H, -CH en 16), 1,70 (m, 1H, -CH en 1), 1,75 (m, 1H, -CH en 18), 1,77 (s, 3H, -CH3 en 30), 1,80 (m, 2H, -CH28 Lys), 1,81 (m, 2H, -CHg Lys), 1,88 (m, 2H, -CH2 en 2), 1,91 (m, 1H, -CH en 15), 1,96 (m, 1H, -CH en 12), 2,05 (m, 1H, -CHb Lys), 2,30 (m, 1H, -CHb Lys), 2,36 (m, 1H, -CH en 21), 2,45 (m, 1H, -CH en 22), 2,58 (m, 1H, -CH en 16), 3,09 (m, 1H, -CH en 13), 3,43 (m, 2H, -CH2£ Lys), 3,49 (m, 1H, -CH en 3), 3,65 (m, 1H, -CH en 19), 4,77 (s, 1H, = CH en 29), 4,92 (s, 1H, = CH en 29), 5,16 (m, 1H, -CHa Lys), 7,58 (m, 1H, -NH-CO-), 8,25 (d, 1H, -CO-NH-, J = 8 Hz). RMN 13C (400 MHz, C5D5N): 8 15,3 (C27); 16,85 (C24); 17 (C25); 17,1 (C26); 19,3 (C6); 20 (C30); 21,7 (C11); 24,5 (CgLys); 26,7 (C12); 28,8 (C2); 29,1 (3C, Boc); 29,2(C23); 30,4 (C15); 30,6 (C8Lys); 31,9 (C21); 32,5 (CbLys); 34,2 (C16); 35,4 (C7); 38 (C10); 38,2 (C13); 38,8 (C22); 39,75 (C1); 40 (C4); 41,4 (CeLys); 41,7 (C8); 43,2 (C14); 47,7 (C19); 51,2 (C18); 51,6 (C9); 53 (CaLys); 56,4 (C5); 56,6 (C17); 78,4 (3CBoc); 78,6 (C3); 110,1 (C29);
152.2 (C20); 157,3 (C, NHCOOt-Bu); 176,6 (C, COOH); 177,4 (C28).
1. c) Procedimiento general para sintetizar derivados (12-15). Una mezcla del producto intermedio 8, 9, 10 u 11 anterior, anhfdrido 2,2-dimetilsuccfnico (10 equiv.) y DMAP (1 equiv.) en piridina anhidra (20 ml/mmoles) se puso a reflujo toda la noche. La mezcla se concentro entonces a vacfo, y el residuo se cromatografio sobre gel de Si para producir el compuesto 12, 13, 14 o 15 deseado.
N-[3b-(3-carboxi-3-metilbutanoiloxi)-luD-20.29-en-28-oin-glicina (12): Rf: 0,23 diclorometano/metanol/acido acetico (10/0,1/0,02); Rendimiento 58% (80 mg); HRMS (ESI) calc. para C38H58N07 [M-H]'640,4219 encontrado 640,4232; RMN 1H (400 MHz, C5D5N): 8 0,73 (s, 3H, -CH3 en 25), 0,77 (m, 1H, -CH en 5), 0,89 (m, 1H, -CH en 1), 0,92 (s, 3H, - CH3 en 24), 0,96 (s, 3H, -CH3 en 23), 1,06 (s, 3H, -CH3 en 27), 1,12 (s, 3H, -CH3 en 26), 1,15 (m, 1H, -CH en 12), 1,15 (m, 1H, -CH en 11), 1,26 (m, 1H, -CH en 15), 1,30 (m, 2H, -CH en 9, -CH en 11), 1,30-1,40 (m, 4H, -CH2 en 6, - CH2 en 7), 1,52 (m, 1H, -CH en 1), 1,54 (m, 1H, -CH en 21), 1,55 (s, 3H, -CH3 en 5'), 1,59 (m, 1H, -CH en 22), 1,67 (m, 2H, -CH en 2, -CH en 16), 1,74 (m, 1H, -CH en 18), 1,77 (m, 1H, -CH en 2), 1,78 (s, 3H, -CH3 en 30), 1,93 (m, 1H, -CH en 12), 2,03 (m, 1H, -CH en 15), 2,38 (m, 1H, -CH en 21), 2,39 (m, 1H, -CH en 22), 2,59 (m, 1H, -CH en 16), 2,91 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 2,95 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 3,08 (m, 1H, -CH en 13), 3,66 (m, 1H, -CH en 19),4,44-4,51 (dd, 2H, -CH2 en 1”, J = 6 Hz, J = 17,5 Hz), 4,75 (s, 1H, -CH en 29), 4,77 (d, 1H, -CH en 3, J = 5 Hz), 4,96 (s, 1H, -CH en 29), 8,76 (t, 1H, -NH-CO-, J = 5,5 Hz). RMN 13C (400 MHz, C5D5N): 8 15,3 (C27); 16,7 (C25); 17 (C26); 17,3 (C24); 18,9 (C6); 20 (C30); 21,6 (C11); 24,6 (C2); 26,6 (C12); 26,7 (C5'); 28,5 (C23); 30,3 (C15); 31,8 (C21); 34 (C16); 35 (C7); 37,7 (C10); 38,1 (C13); 38,5 (C4); 39 (C1); 39,1 (C22); 41,3 (C3'); 41,6 (C8);
42,4 (C1”); 43,2 (C 14); 45,6 (C2'); 47,7 (C 19); 51,0 (C 18); 51,2 (C9); 56,0 (C5); 56,4 (C17); 81,4 (C3); 110,3 (C29);
152.2 (C20); 172,1 (C1'); 174 (C6”); 177,9 (C28); 179,8 (C4').
N-[3b-(3-carboxi-3-metilbutanoiloxi)luD-20.29-en-28-oin-b-alanina (13): Rf: 0,27 n-heptano/acetato de etilo/acido acetico (10/10/0,5); Rendimiento 2,62% (166 mg); HRMS (ESI) calc. para C39H60N07 [M-H]- 654,4375 encontrado 654,4375, calc. para Cs9H59N07Na [M-2H+Na]- 676,4195 encontrado 676,4186; RMN 1H (400 MHz, C5D5N): 8 0,74
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(m, 1H, -CH en 5 y s, 3H, -CH3 en 25), 0,91 (m, 1H, -CH en 1), 0,94 (s, 3H, -CH3 en 24), 0,97 (s, 3H, -CH3 en 23),
1.04 (s, 3H, -CH3 en 27), 1,08 (s, 3H, -CH3 en 26), 1,17 (m, 2H, -CH en 11 y -CH en 12), 1,2 (m, 1H, -CH en 15), 1,30 (m, 2H, -CH en 9, -CH en 6), 1,31 (m, 1H, -CH en 11), 1,33 (m, 2H, -CH en 7), 1,4 (m, 1H, -CH en 6) 1,52 (m, 2H, -CH en 21 y -CH en 22), 1,55 (s, 3H, -CH3 en 5'), 1,58 (m, 2H, -CH en 1 y -CH en 16), 1,7 (m, 2H, -CH en 18 y - CH en 2), 1,81 (s, 3H, -CH3 en 30), 1,82 (m, 1H, -CH en 2), 1,85 (m, 1H, -CH en 15), 1,96 (m, 1H, -CH en 12), 2,16 (m, 1H, -CH en 22), 2,27 (m, 1H, -CH en 21), 2,47 (m, 1H, -CH en 16), 2,94 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 3,00 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 3,01 (m, 1H, -CH en 2”), 3,07 (m, 1H, -CH en 13), 3,67 (m, 1H, -CH en 19), 3,9 (m, 1H, - CH2 en 1”), 4,03 (m, 1H, -CH2 en 1”) 4,79 (m, 2H, -CH en 3 y -CH en -29), 4,97 (s, 1H, -CH en 29), 8,33 (t, 1H, -NH- CO-, J = 7 Hz). RMN 13C (400 MHz, C5D5N): 8 15,2 (C27); 16,7 (C25); 16,9 (C26); 17,4 (C24); 18,9 (C6); 20 (C30);
21.7 (C11); 24,6 (C2); 26,6 (C12); 26,7 (C5'); 28,6 (C23); 30,3 (C15); 31,8 (C21); 34 (C16); 35 (C7); 35,7 (C2”); 36,7 (C1”); 37,7 (C10); 38,2 (C13); 38,5 (C4); 39 (C1); 39,1 (C22); 41,3 (C3'); 41,6 (C8); 43,2 (C14); 45,7 (C2'); 47,7 (C19); 51,1 (C18); 51,2 (C9); 56,1(C5); 56,3 (C17); 81,4 (C3); 110,2 (C29); 152,2 (C20); 172 (C1'); 175,4 (C6”);
177,2 (C28); 179,8 (C4').
N-O3-(3-carboxi-3-metilbutiril)betulinill-N’-Boc-etilendiamina (14): Rf: 0,25 diclorometano/metanol/acido acetico (10/0,2/0,01); Rendimiento 82% (190 mg); RMN 1H (300 MHz, CDCI3): 8 0,72 (m, 1H, -CH en 5), 0,77 (s, 3H, -CH3),
0. 78 (s, 3H, -CH3), 0,79 (s, 3H, -CH3), 0,89 (s, 3H, -CH3), 0,92 (s, 3H, -CH3), 1,10 (m, 1H), 1,26 (s, 6H), 1,27-1,40 (m, 6H), 1,42 (s, 9H, t-Bu), 1,42-1,63 (m, 7H), 1,69 (s, 3H, -CH3), 1,72 (m, 2H), 1,99 (m, 2H), 2,46 (m, 1H), 2,57 (m, 2H),
3.08 (m, 1H), 3,31 (m, 9H), 4,42 (m, 1H), 4,55 (s, 1H, = CH), 4,69 (s, 1H, = CH), 5,17 (m, 1H, -NH-CO-), 5,28 (m, 1H, -CO-NH-).
N2-[O3-(3-carboxi-3-metilbutiril)betulinill-N6-Boc-L-lisina (15): Rf: 0,31 n-heptano/acetato de etilo/acido acetico (10/10/0,25); Rendimiento 36% (106 mg); HRMS (ESI) calc. para C47H75N2O7 [M-H]- 811,5478 encontrado 811,5476; RMN 1H (400 MHz, C5D5N): 8 0,76 (s, 3H, -CH3 en 25), 0,82 (m, 1H, -CH en 5), 0,9 (m, 1H, -CH en 1), 0,96 (s, 3H, - CH3 en 24), 0,97 (s, 3H, -CH3 en 23), 1,08 (s, 3H, -CH3 en 27), 1,09 (s, 3H, -CH3 en 26), 1,15 (m, 2H, -CH en 12 y - CH en 11), 1,3 (m, 1H, -CH en 9), 1,32 (m, 1H, -CH en 15), 1,33 (m, 1H, -CH en 11), 1,36-1,46 (m, 4H, -CH2 en 6, - CH2 en 7), 1,53 (m, 1H, -CH en 21), 1,54 (m, 1H, -CH en 22), 1,55-1,59 (s, 3H, -CH3 en 5' y s, 9H, -NHBoc y m, 1H, - CH en 1), 1,67-1,7 (m, 2H, -CH en 2, -CH en 16), 1,73 (m, 1H, -CH en 18), 1,78 (m, 1H, -CH en 2), 1,78 (s, 3H, -CH3 en 30), 1,8 (m, 2H, -CH2£ Lys), 1,83 (m, 1H, -CH28 Lys), 1,89 (m, 1H, -CH en 15), 1,95 (m, 1H, -CH en 12), 2,06 (m, 1H, -CH2P Lys), 2,3 (m, 1H, -CH2P Lys), 2,34 (m, 1H, -Ch en 21), 2,43 (m, 1H, -CH en 22), 2,58 (m, 1H, -CH en 16),
2.9 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 2,98 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 3,07 (m, 1H, -CH en 13), 3,43 (m, 2H, -CH2£ Lys), 3,63 (m, 1H, -CH en 19), 4,77 (s, 1H, -CH en 29), 4,78 (dd, 1H, -CH en 3, J = 5 Hz y J = 11,5 Hz), 4,92 (s, 1H, - CH en 29), 5,17 (m, 1H, -CHa Lys), 7,58 (m, 1H, -NH-CO-O), 8,26 (d, 1H, -CO-NH -, J = 8 Hz). RMN 13C (400 MHz, C5D5N): 8 15,3 (C27); 16,7 (C25); 17 (C26); 17,4 (C24); 19 (C6); 20,0 (C30); 21,7 (C11); 24,5 (CgLys); 24,6 (C2);
26.4 (C5'); 26,6 (C12); 28,6 (C23); 29,1 (3C, Boc); 30,3 (C15); 30,6 (C8Lys); 31,9 (C21); 32,4 (CpLys); 34,2 (C16);
35,1 (C7); 37,75 (C10); 38,1 (C13); 38,5 (C4); 38,8 (C22); 39 (C1); 41,3 (C3'); 41,4 (CeLys); 41,6 (C8); 43,2 (C14);
45.7 (C2'); 47,7 (C19); 51,1 (C18); 51,2 (C9); 53 (CaLys) 56,1 (C5); 56,5 (C17); 78,4 (COBoc); 81,4 (C3); 110,2 (C29); 152,2 (C20); 172,1 (C1'); 176,6 (C6”); 177,7 (C28); 179,8 (C4').
1. d) Procedimiento general para la sintesis del compuesto 16. A una disolucion agitada en argon del derivado N-t- Boc 14 (0,19 mg, 0,26 mmoles) y 2,6-lutidina (91 ml, 0,78 mmoles) en CH2Cl2 seco (1 ml) se le anadio gota a gota trifluorometanosulfonato de terc-butildimetilsililo (t-BuMe2SiOTf, 150 ml, 0,65 mmoles). La mezcla de reaccion se agito 30 min., y se paralizo con disolucion acuosa saturada de cloruro de amonio (2 ml). La mezcla se diluyo con CH2Cl2 (5 ml), la capa organica se lavo con agua, con salmuera, y se seco sobre MgSO4. El disolvente se concentro a vacfo, y el residuo se uso en la siguiente etapa sin purificacion.
A una disolucion agitada del derivado de N-(terc-butildimetilsililoxicarbonilo) en THF seco (0,5 ml) a temperatura ambiente se le anadio fluoruro de tetrabutilamonio (260 ml, disolucion 1 M en THF, 0,26 mmoles). La mezcla de reaccion se agito durante 1 h, y se paralizo con disolucion acuosa saturada de cloruro de amonio (2 ml). El precipitado resultante se recogio, se lavo con agua y se seco a vacfo para producir el compuesto 16 correspondiente.
Acido 4-({28-[(2-aminoetil)aminol-28-oxoluo-20.29-en-3Q-il}oxi)-2.2-dimetil-4-oxobutanoico (16): Rendimiento: 26% (45 mg); HRMS (ESI) calc. para C38H61N2O5 [M-H]- 625,4586 encontrado 625,4569; RMN 1H (400 MHz, C5D5N): 8 0,75 (s, 3H, -CH3 en 25), 0,77 (m, 1H, -CH en 5), 0,86 (m, 1H, -CH en 1), 0,93 (s, 3H, -CH3 en 24), 0,97 (s, 3H, -CH3 en 23), 1,03 (s, 3H, -CH3 en 27), 1,03 (s, 3H, -CH3 en 26), 1,12 (m, 1H, -CH en 12), 1,13 (m, 1H, -CH en 11), 1,17 (m, 1H, -CH en 15), 1,30 (m, 2H, -CH en 9, -CH en 11), 1,30-1,40 (m, 4H, -CH2 en 6, -CH2 en 7), 1,48 (m, 1H, -CH en 21), 1,54 (m, 1H, -CH en 1), 1,55 (s, 3H, -CH3 en 5'), 1,55 (m, 1H, -CH en 22), 1,64-1,67 (m, 2H, -CH en 2, -CH en 16), 1,70 (m, 2H, -CH en 15, -CH en 18), 1,77 (m, 1H, -CH en 2), 1,77 (s, 3H, -CH3 en 30), 1,92 (m, 1H, -CH en 12), 2,14 (m, 1H, -CH en 21), 2,25 (m, 1H, -CH en 22), 2,67 (m, 1H, -CH en 16), 2,90 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 2,96 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 3,03 (m, 1H, -CH en 13), 3,28 (m, 2H, -CH2 en 2”), 3,61 (m, 1H, -CH en 19), 3,87-3,81 (m, 2H, -CH2 en 1”), 4,75 (s, 1H, -CH en 29), 4,77 (d, 1H, -CH en 3, J = 5 Hz), 4,93 (s, 1H, -CH en 29), 8,74 (m, 1H, -NH-CO-). RMN 13C (400 MHz, C5D5N): 8 15,2 (C27); 16,7 (C25); 16,9 (C26); 17,4 (C24); 19 (C6); 20,0 (C30); 21,6 (C11); 24,6 (C2); 26,5 (C12); 26,7 (C5'); 28,5 (C23); 30,3 (C15); 31,8 (C21); 34,0 (C16); 35,0 (C7); 37,7 (C10); 38,1 (C13); 38,5 (C4); 39,0 (C22); 39,1 (C1); 41,0 (C1”); -41,4 (C3'); 41,5 (C8); 42,2 (C2”); 43,1 (C14); 45,7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(C2'); 47,7 (C19); 51,2 (C18); 51,3 (C9); 56,1 (C5); 56,5 (C17); 81,3 (C3); 110,2 (C29); 152,2 (C20); 172,1 (C1');
177,7 (C28); 179,9 (C4').
I.e) Procedimiento general para la sintesis del compuesto 17 (no segun la presente invencion). La proteccion N-Boc del producto 15 se escindio con HCl 6N en THF durante una hora. El compuesto 17 se obtuvo tras purificar mediante cromatograffa ultrarrapida.
N2-[3Q-(3-carboxi-3-metilbutanoiloxi)luD-20.29-en-28-oin-L-lisina (17). Rendimiento: 45% (20 mg); HRMS (ESI) calc. para C42H67N2O7 [M-H]- 711,4954 encontrado 711,4960; RMN 1H (400 MHz, CD3OD): 8 0,82 (m, 1H, -CH en 5), 0,85
(s, 3H, -CH3 en 24), 0,87 (s, 3H, -CH3 en 23), 0,92 (s, 3H, -CH3 en 25), 0,96 (s, 3H, -CH3 en 26), 0,99 (m, 1H, -CH en 1), 1,01 (s, 3H, -CH3 en 27), 1,04 (m, 1H, -CH en 12), 1,18 (m, 1H, -CH en 15), 1,25 (s, 3H, -CH3 en 5'), 1,26 (m, 1H, -CH en 11), 1,35 (m, 1 H, -CH en 21), 1,36 (m, 1 H, -CH en 9), 1,38-1,52 (m, 9H, -CH2 en 6, -CH2 en 7, -CH en 11, - CH en 15, -CH en 22, -CH2 en 3”), 1,56 (m, 1H, -CH en 16), 1,6 (m, 1H, -CH en 2), 1,64 (m, 1H, -CH en 18), 1,68 (m, 1H, -CH en 2), 1,7 (m, 6H, -CH3 en 30, -CH en 12, 2H, -CH2 en 4”), 1,72 (m, 1H, -CH en 1), 1,75 (m, 1H, -CH en 2”), 1,89 (m, 1H, -CH en 2”), 1,9 (m, 1H, -CH en 21), 1,93 (m, 1H, -CH en 22), 2,17 (m, 1H, -CH en 16), 2,53 (m, 1H, -CH en 13), 2,55 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 2,62 (d, 1H, -CH en 2', J = 15,5 Hz), 2,90 (t, 2H, -CH en 5”, J = 8 Hz), 3,06 (m, 1H, -CH en 19), 4,3 (m, 1H, -CH en 1”), 4,44 (dd, 1H, -CH en 3, J = 5 Hz y J = 10 Hz ), 4,57 (s, 1H, -CH en 29), 4,7 (s, 1H, -CH en 29), 7,1 (m, 1H, -NH-CO-). RMN 13C (400 MHz, CD3OD): 8 15,2 (C27); 17 (C25); 17,1 (C26);
17,2 (C24); 19,4 (C6); 19,8 (C30); 22,3 (C11); 24,05 (C3”); 24,8 (C2); 26,2 (C5'); 27,2 (C12); 28,2 (C4”); 28,7 (C23);
30,9 (C15); 32,1 (C21); 32,7 (C2”); 34,4 (C16); 35,7 (C7); 38,4 (C10); 39 (C4); 39,2 (C13); 39,3 (C22); 39,8 (C1);
40,7 (C5”); 41,5 (C3'); 42,2 (C8); 43,7 (C14); 45,8 (C2'); 48,3 (C19); 51,4 (C18); 52,1 (C9); 54 (C1”); 57 (C5); 57,4 (C17); 82,8 (C3); 110,2 (C29); 152,4 (C20); 173,1 (C1'); 177,3 (C6”); 178,9 (C28); 180,8 (C4').
II. Ensayos bioloaicos
Materiales y procedimientos:
Ensayos de inhibicion de la infeccion.
La evaluacion de la inhibicion del VIH-1 se llevo a cabo usando celulas indicadoras MAGIC-5B, que expresan de forma estable el gen informador de b-galactosidasa clonado en direccion 3' del promotor de LTR del VIH-1. Las celulas se sembraron en placas a 8 x 104 celulas por pocillo, en placas de 24 pocillos, y se expusieron a VIH-1 (x ng p24). Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, la infecciosidad vfrica se monitorizo cuantificando la hidrolisis de o-nitrofenil b-D-galactopiranosido de lisados celulares (kit). La actividad de b-galactosidasa se normalizo segun el contenido proteico total en el lisado celular. Tambien se prepararon pocillos de control que contienen virus y celulas solamente (sin farmaco) y celulas solamente (sin virus ni farmaco).
La inhibicion de la infeccion del 50% (IC50) se definio como la concentracion del compuesto que redujo el nivel de infeccion del VIH-1 en 50% en comparacion con los controles no tratados (Tabla 1).
Citotoxicidad.
La toxicidad celular de los diferentes compuestos se evaluo usando los ensayos de MTT. La concentracion citotoxica del 50% (CC50) se definio como la concentracion de los compuestos que redujo la viabilidad celular en 50% en comparacion con aquella para los controles no tratados. El fndice de selectividad (SI) se definio como la relacion CC50:IC50 (Tabla 1).
Analisis de microscopia electronica.
Unas Celulas 293T se transfectaron en presencia o ausencia de BA, DSB, 12, 15 y 16 (5 mg/ml) con clones moleculares del VIH-1 (pNL4-3) usando el reactivo de transfeccion JetPei (QBiogen). Dos dfas despues de la transfeccion, las celulas 293T se procesaron para la microscopia electronica de capa fina segun lo siguiente:
las celulas se fijaron in situ con 2,5% de glutaraldehido en tampon de cacodilato (pH 7,4) durante 60 min. a 4°C. Las celulas se fijaron entonces posteriormente con 2% de tetraoxido de osmio, se lavaron en tampon de cacodilato que contiene 0,5% de acido tanico, y se embebieron en epon (Embed-812, Electron Microscopy Sciences Inc.). Las secciones se contratineron con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se examinaron con un microscopio electronico de transmision Hitachi H7100.
Ensayo de inhibicion de la maduracion del VIH-1.
Se produjeron virus mediante transfeccion de clones moleculares del VIH-1 (pNL4-3) en celulas 293T mantenidas en presencia o ausencia de compuestos BA, DSB, 12, 15 y 16 en DMSO usando el reactivo de transfeccion JetPei (QBiogen). Dos dfas despues de la transfeccion, los sobrenadantes que contienen virus se concentraron mediante ultracentrifugacion a traves de una capa de 20% de sacarosa a 25000 rpm durante 2h30. Los sedimentos viricos se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
resuspendieron entonces en tampon de lisis RIPA [10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM de EDTA, 100 mM de NaCI, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, 0,25% de desoxicolato de sodio, 0,2% de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)]. Las protefnas vfricas se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 12,5%. Las protefnas transferidas a membrana de PVDF (Millipore) se revelaron usando suero con anticuerpo de cabra anti-CAp24 de VIH (AbD Serotec). El anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rabano picante se revelo mediante deteccion quimioluminiscente potenciada (Pierce Biotechnology, Inc).
Celulas y baculovirus recombinantes.
(i) Celulas de insectos. Celulas de Spodoptera frugiperda Sf9 se mantuvieron como monocapas, y se infectaron con baculovirus recombinantes a una multiplicidad de infeccion (MOI) que oscila de 5 a 10 PFU/celula, como se describio previamente [1, 2].
(ii) Clones de Gag. El gen gag del VIH-1, asf como el gen de fusion de luciferasa-vpr, usados en el presente estudio, se insertaron en el genoma del virus de la nucleopoliedrosis multicapside de Autographa californica (AcMNPV) bajo el control de un promotor quimerico de polihedrina AcMNPV-GmMNPV, y los fenotipos de protefnas Gag recombinantes descritos con detalle en estudios previos [1, 2]. AcMNPV-Pr55Gag expreso la poliprotefna Gag de tipo salvaje (WT) de longitud completa (Pr55Gag). El recombinante que expresa la version N-miristoilada del mutante de supresion que carece del dominio carboxi-terminal p6, denominado como AcMNPV-GagDp6(myr+) en estudios previos [3], se denomino simplemente como AcMNPV-GagDp6 por razones de simplificacion de acronimos. En el mutante AcMNPV-GagA364V, el primer resto del dominio de SP1, la alanina, se muto en valina, usando el procedimiento de solapamiento de PCR convencional. GagA364V es el prototipo de mutantes resistentes a la inhibicion por DSB del procesamiento de Gag [4].
(iii) Vpr. El clon de vaculovirus que expresa la protefna Vpr etiquetada con oligohistidina (AcMNPV-Vpr) se obtuvo de Nathaniel Landau via Eric Cohen [5].
(iv) Constructo de fusion luciferasa-Vpr (LucVpr). El plasmido que porta el gen vpr (aislado LAI) se obtuvo de Serge Benichou [6]. La secuencia del gen de luciferasa de luciernaga (Photinus piralis) se aislo mediante PCR del plasmido pGL2 (plasmido de control n° de Cat. E1611; Promega). Tras la supresion de su codon de parada, se inserto en su extremo 3' una secuencia que codifica una etiqueta de 6-histidina y un ligador GSGS, y se fusiono al extremo 5' del gen vpr. El detalle de este constructo se comunicara cuando se solicite. El constructo de fusion final luc(his)e-vpr se inserto en AcMNPV para generar el recombinante AcMNPV- LucVpr. De manera importante, tambien se construyo la fusion del gen inverso vpr-3’-luc(his)e, pero se encontro que la protefna de fusion VprLuc fue incapaz de coempaquetarse con Pr55Gag en VLP. (iii) Vpr. El clon de vaculovirus que expresa la protefna Vpr etiquetada con oligohistidina (AcMNPV-Vpr) se obtuvo de Nathaniel Landau via Eric Cohen.
(iv) Constructo de fusion luciferasa-Vpr (LucVpr). El plasmido portador del gen vpr (aislado LAI) se obtuvo de Serge Benichou. La secuencia del gen de luciferasa de luciernaga (Photinus piralis) se aislo mediante PCR del plasmido pGL2 (plasmido de control n° de Cat. E1611; Promega). Tras la supresion de su codon de parada, se inserto en su extremo 3' una secuencia que codifica una etiqueta de 6-histidina y un ligador GSGS, y se fusiono al extremo 5' del gen vpr. El constructo de fusion final luc(his)e-vpr se inserto en AcMNPV para generar el recombinante AcMNPV-LucVpr.
Aislamiento de partfculas similares a virus (VLP) extracelulares.
Los sobrenadantes del cultivo de celulas Sf9 se aclararon mediante centrifugacion de baja velocidad, despues las VLP se recuperaron usando un procedimiento de dos etapas que comprende una centrifugacion en gradiente por etapas de agarosa [7], seguido de una ultracentrifugacion en gradiente lineal de D2O-sacarosa [8, 9]. (i) En la primera etapa, las VLP contenidas en el medio de cultivo celular se sedimentaron a traves de una almohadilla de sacarosa (20%, p:v, en tampon de TNE; TNE: 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl pH 7,4, 1 mM de Na2EDTA) a 30 krpm durante 1 h a 15°C en un rotor Kontron TST55.5 [8]. Las VLP sedimentadas de la etapa (i) se resuspendieron entonces suavemente en PBS (0,20-0,25 ml), y (ii) se analizaron adicionalmente mediante ultracentrifugacion isopfcnica en gradientes de sacarosa-D2O [8, 9]. Los gradientes lineales (volumen total de 10 ml, 30-50%, p:v) se centrifugaron durante 18 h a 28 krpm en un rotor Beckman SW41. La disolucion de sacarosa al 50% se obtuvo en D2O tamponada a pH 7,2 con NaOH, y la disolucion de sacarosa al 30% se obtuvo en 10 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM de NaCl, 5,7 mM de Na2EDTA. Se recogieron alfcuotas de 0,5 ml de la parte superior, y las fracciones se analizaron para determinar el contenido de protefna mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia, y mediante ensayo de luciferasa como se describe a continuacion.
Ensayos de inhibicion del ensamblaje de Gag.
Se infectaron alfcuotas de celulas Sf9 (106) con dos baculovirus recombinantes a igual multiplicidad de infeccion (MOI de 10 PFU/celula, cada uno). Uno expreso el precursor de Gag del VIH-1 (AcMNPV-Pr55Gag o control, AcMNPV-GagDp6 al que se le suprimio p6), el otro la protefna Vpr de control (AcMNPV-Vpr) o la fusion LucVpr
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(AcMNPV-LucVpr). A 24 h post-infeccion (pi), se anadieron cantidades crecientes de PA-457, 12, 16 o 15 en DMSO a los cultivos celulares infectados. Para evitar cualquier interferencia con un posible efecto del DMSO, este se mantuvo constante en volumen en las diferentes muestras. En experimentos estandar, se diluyeron disoluciones madre de PA-457,12, 16 o 15 (10 mg/ml en DMSO) con DMSO para obtener un intervalo de concentraciones de inhibidor desde 0,5 hasta 20 mg por alfcuota de 2 ml de DMSO, y cada alfcuota de 2 ml se anadio por volumen de 1 ml de monocapas de celulas que cubren el medio de cultivo. Las celulas se cosecharon a 48 h pi, y las VLP extracelulares liberadas en el medio de cultivo se cuantificaron usando ensayo de luciferasa. Las VLP envueltas en la membrana se sedimentaron y se resuspendieron en tampon de lisis KDT (KDT:0,1 M de tampon de fosfato de potasio, pH 7,8, 1 mM de DTT, que contiene 0,2% de Triton X100) durante 30 min. a 37°C con vortice cada 10 min. La actividad de luciferasa asociada con VLP se midio como se describio previamente [10] usando un luminometro Lumat LB-9501 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). Digno de mencion, se encontro que concentraciones finales de Triton X100 mayores que 0,2% en las muestras tienen un efecto perjudicial sobre la actividad enzimatica de la luciferasa. Para compensar efectos negativos eventuales de los farmacos sobre la expresion de LucVpr, la actividad de luciferasa se midio en los lisados celulares correspondientes, obtenidos tras la lisis de las celulas sedimentadas con tampon KDT. Los resultados se expresaron como unidades de luz relativas (RLU) por mg de protefna. Los valores de la relacion de la actividad de luciferasa intracelular asociada a VLP se representaron graficamente frente a la concentracion de inhibidor. La concentracion inhibidora del 50% (IC50) se definio como la concentracion de compuesto requerida para reducir esta relacion en 50%, en comparacion con la relacion obtenida con celulas no tratadas a las que se atribuyo el valor de 100%.
Ensayos de citotoxicidad.
La toxicidad celular de los diferentes compuestos se evaluo usando los ensayos de MTT [11]. La concentracion citotoxica del 50% (CC50) se definio como la concentracion del compuesto que redujo la viabilidad celular en 50%, en comparacion con la de los controles no tratados. El fndice de selectividad (SI) se definio como la relacion de CC50 a
IC50.
Electroforesis en gel y ensayos cuantitativos de proteinas.
La electroforesis en gel de poliacrilamida de muestras de proteinas desnaturalizadas con SDS (SDS-PAGE), y el analisis de inmunotransferencia se han descrito con detalle en estudios previos [1, 2]. De forma breve, las proteinas se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% o 15% desnaturalizante con SDS, junto con marcadores proteicos previamente tenidos (escalera proteica previamente tenida (PageRuler™; Fermentas Inc., Hanover, MD, o Dual Color™ Standards, BioRad) y se transfirieron electricamente a membrana de nitrocelulosa (Hybond™-C-extra; GE Healthcare Bio-Sciences). Las transferencias se bloquearon en leche desnatada al 50% en disolucion salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 0,05% de Tween-20 (TBS-T), se enjuagaron en TBS-T, se incubaron entonces sucesivamente con anticuerpos anti-Gag primarios de conejo o de raton, y anticuerpos secundarios anti-IgG relevantes, a diluciones de trabajo que oscilan de 1:1.000 a 1:10.000. El anticuerpo policlonal anti-Gag del VIH-1 (obtenido en el laboratorio; [9]) se produjo en conejo mediante inyeccion de protefna Gag truncada en C expresada bacterianamente, fusionada a GST y purificada por afinidad, que consiste en el dominio MA de longitud completa y los primeros setenta y ocho restos del dominio CA (sitio Pst I; secuencia gagLai). El anticuerpo monoclonal de raton (mAb) anti-CAp24 (Epiclone #5001) y el mAb anti-MAp17 (Epiclone #5003) se obtuvieron de Cylex Inc. (Columbia, MD). El anticuerpo monoclonal de raton anti-oligo-histidina se adquirio de Quiagen S.A. (Courtaboeuf, Francia). Los conjugados de IgG anti-conejo o anti-raton marcados con fosfatasa se adquirieron de Sigma (St Louis, MO). Para la cuantificacion inmunologica de VLP o del contenido de protefna VLP, la protefna transferida a la membrana se hizo reaccionar con su anticuerpo primario especffico, despues con protefna A marcada con 125I (MP Biomedicals France, 67402 Illkirch; actividad especffica 30 mCi/mg) usada a 20-30 mCi por 100 cm2 de membrana, y se expuso a pelfculas radiograficas (Kodak BioMax HE film™, Sigma-Aldrich, 38297-St Quentin-Fallavier). Los autorradiogramas se escanearon y se cuantificaron mediante analisis densitometrico, usando el analizador de imagenes VersaDoc y el programa Quantity One (BioRad), o las bandas de protefna se cortaron de las transferencias y se midio la radioactividad en un contador de centelleo (Beckman LS-6500), como se describio previamente [8, 9]. Alternativamente, la cuantificacion de las proteinas en VLP tambien se llevo a cabo usando el radiomarcaje de proteinas. Muestras de celulas infectadas con baculovirus se marcaron con 35S-aminoacidos (ICN Pharmaceuticals France, 91898-Orsay; Tran35S-LABEL™; actividad especffica >1.000 Ci/mmol), anadidos a 15 mCi/ml en medio libre de metionina durante 30 h a 18 h pi en ausencia o presencia de inhibidor en DMSO. Las VLP se recuperaron del medio de cultivo celular como se describio anteriormente, y las proteinas radioactivas se analizaron mediante SDS-PAGE y autorradiograffa de geles secos.
Microscopia electronica y microscopia inmunoelectronica.
Unas celulas Sf9 infectadas con baculovirus se cosecharon a 48 h pi, se sedimentaron, se fijaron con 2,5% de glutaraldehfdo en 0,1 M de tampon de fosfato, pH 7,5, se fijaron posteriormente con tetroxido de osmio (2% en H2O) y se trataron con disolucion de acido tanico al 0,5% en H2O. Las muestras se deshidrataron y se embebieron en Epon (Epon-812; Fulham, Latham, NY). Secciones ultrafinas se tineron con citrato de plomo alcalino al 2,5% y acetato de uranilo al 0,5% en etanol al 50%, y se tineron posteriormente con disolucion de acetato de uranilo al 0,5% en H2O [8, 9]. Las rejillas se examinaron bajo un microscopio electronico Jeol JEM-1400, equipado con una camara
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
digitalizada ORIUS™ (Gatan France, 78113-Grandchamp). Para los analisis de EM estadfsticos, se examino un mfnimo de 30 cuadrados de rejilla que contienen 10 a 20 secciones celulares cada uno para contar la germinacion de VLP en la superficie celular, o la germinacion en el compartimento vesicular intracelular.
Para la microscopfa inmunoelectronica, las muestras se fijaron con paraformaldehfdo al 4% en 0,1 M de tampon de fosfato pH 7,3 durante 4 h, se fijaron posteriormente con glutaraldehfdo al 1% en 0,1 M de tampon de fosfato pH 7,4 durante 4 h, despues se enjuagaron toda la noche en 0,1 M de tampon de fosfato pH 7,3. Tras la deshidratacion, las muestras se incluyeron en resina hidrofila LR White (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA; n° de Catalogo de EMS 14380), y se depositaron secciones ultrafinas sobre rejillas revestidas con nfquel. Las rejillas se incubaron con anticuerpo de conejo anti-Gag (obtenido en el laboratorio; [9]) a una dilucion de 1:50 en TBS durante 1 h a temperatura ambiente (RT). Tras enjuagar con TBS, las rejillas se incubaron posteriormente con anticuerpo de cabra etiquetado con oro coloidal de 6 nm anti-IgG de conejo (British Biocell International Ltd, Cardiff, UK; diluido hasta 1:50 en TBS) durante 30 min. a RT. Tras enjuagar con TBS, las muestras se tineron posteriormente con acetato de uranilo al 1% en H2O durante 1 min. a RT, se enjuagaron nuevamente con TBS, y se examinaron bajo el microscopio electronico.
Reticulacion quimica de Pr55Gag intracelular.
Unas lfcuotas de celulas Sf9 infectadas con baculovirus recombinante (5 x 105 celulas) no tratadas o tratadas con 16 a 10 ug/ml durante 24 h a 24 h pi se centrifugaron a baja velocidad, se resuspendieron en 200 ml de PBS que contiene el reticulador suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3; Pierce Biotechnology, Rockford, IL) a molaridades crecientes, que oscilan de 0 a 50 mM [12], y se incubaron en este tampon durante 30 min. a temperatura ambiente (RT). Las muestras celulares se centrifugaron entonces, se resuspendieron y se lisaron en 200 ml de NaCl 0,015 M, tampon de fosfato 0,5 mM pH 7,3 que contiene BS3 a las mismas molaridades como en las mezclas originales, y se incubaron adicionalmente durante 30 min. a RT. Los lisados celulares se mezclaron con 30 ml de tampon de muestra con SDS concentrado 6 veces (6x) sin b-mercaptoetanol, se calentaron hasta 100°C durante 1 min., y las protefnas Gag se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. Las transferencias Western (Amersham Hybond™- ECL; GE-Healthcare) se incubaron con suero de conejo policlonal anti-Gag (obtenido en el laboratorio; [9]) diluido hasta 1:3.000 durante 3 h a RT, seguido de anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa (Sigma; dilucion 1:10.000) durante 1 h a RT. Las transferencias se hicieron reaccionar entonces con sustrato quimioluminiscente SuperSignal® West Pico (Pierce Biotechnology), y los luminogramas se visualizaron usando el sistema de formacion de imagenes Fusion X7 con el software Bio1 D (Vuilbert-Lourmat, Marne-la-Vallee, Francia).
RESULTADOS:
Los compuestos segun la invencion se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir el ensamblaje y/o maduracion del VIH-1, y con respecto a las consecuencias sobre la infecciosidad vinca.
Capacidad para infectar celulas MAGIC-5B.
Para este fin, los virus producidos mediante transfeccion de clones moleculares NL4.3 del VIH-1 en celulas 293T mantenidas en presencia de los compuestos recientemente sintetizados 12, 13, 15 y 16 se analizaron para determinar su capacidad para infectar celulas MAGIC-5B en paralelo con BA (1) y dSb (2). Los datos de los bioensayos obtenidos se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Eficiencia de la inhibicion de la infeccion del VIH-1 de derivados del acido betulfnico (a)
- Compuesto
- IC50 (mM) CC50 (mM) SIm
- BA
- 5,315 4,52 0,85
- DSB
- 0,040 31,0 775,00
- (12) (ejemplo de referenda)
- 0,160 49,5 309,37
- (15) (ejemplo de referenda)
- 0,170 33,0 199,41
- (16)
- 0,016 33,9 2118,75
(a) Los valores medios (m) para la actividad inhibidora del 50% (IC50) de la infeccion se dan como mM (m). Los valores medios (m) para la citotoxicidad (CC50) se dan como mM (m). (b) El fndice de selectividad (SI) represento la relacion CC50/IC50.
Conversion de p25 no escindida (CA-SP1) en p24 madura (CA).
Para elucidar adicionalmente el mecanismo de accion, las muestras vincas usadas para ensayos de infeccion se sometieron a caracterizacion bioqufmica (Figura 1). El analisis de la conversion de p25 sin escindir (CA-SP1) en p24 madura (CA) revelo que los compuestos 2, 12, 15 y 16 inhiben la escision de CA-SP1.
Analisis de la morfologia del virus.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Para determinar si el defecto en el procesamiento de p25 a p24 inducido por BA, DSB, 12, 15 y 16 afecto a la morfologfa del virus, se llevo a cabo el analisis mediante EM. En ausencia de compuestos, las celulas transfectadas con pNL4-3 produjeron partfculas vfricas con la morfologfa madura clasica caracterizada por la presencia de nucleos conicos condensados (Figura 2A). Por el contrario, los virus de celulas tratadas con DSB, 12, 15 y 16 carecieron de nucleos conicos. En su lugar, estos viriones presentaron nucleos acentricos esfericos, y se distinguieron ademas de las partfculas no tratadas por la presencia de una capa densa en electrones adicional en el interior de la membrana vfrica (Figura 2C, 2D, 2E, 2F). Por el contrario, BA tiene un efecto moderado sobre la inhibicion de la maduracion vfrica. Tomados juntos, estos resultados indican que DSB, 12, 15 y 16 bloquean efectivamente la maduracion apropiada de los viriones.
Los compuestos segun la invencion funcionan de este modo como inhibidores de la modulacion, e inhiben la conversion de p25 (CA-SP1) en p24 (CA) en lisados virionicos, conduciendo a un procesamiento defectuoso de Gag y a la produccion de partfculas morfologicamente anormales y no infecciosas.
Empaquetamiento de protefnas Vpr y luciferasa etiquetada con Vpr (LucVpr) en VLP de VIH-1 producidas en celulas de insecto.
Se ha encontrado que Vpr esta coencapsidado con el precursor de Gag del VIH-1 (Pr55Gag) en relacion aproximadamente equimolar a Pr55Gag, una estequiometrfa que se reevaluo posteriormente hasta una relacion menor de 1 copia de Vpr por 7 moleculas de Gag [13]. Celulas Sf9 se coinfectaron con dos baculovirus recombinantes a multiplicidad igual (MOI 10 cada uno), uno que expresa Pr55Gag del VIH-1 y el otro Vpr o la protefna de fusion LucVpr. Las VLP recuperadas del medio de cultivo celular a 48 h pi se analizaron mediante SDS- PAGE y transferencia Western usando anticuerpos anti-Gag y anti-etiqueta de His. Ambas protefnas Vpr y LucVpr se empaquetaron eficientemente en VLP. Tambien se observo una actividad enzimatica de luciferasa asociada con VLP extracelulares recuperadas de celulas que coexpresan Pr55Gag y LucVpr, como se detalla a continuacion. Esto sugirio que (i) la protefna de fusion LucVpr fue competente para el empaquetamiento en las VLP, y (ii) que el resto de luciferasa de LucVpr retuvo su actividad enzimatica tras la fusion con Vpr. Puesto que se pudo portar algo de enzima luciferasa durante la purificacion de las VLP, se diseno el siguiente conjunto de experimentos para discriminar entre material adsorbido a VLP y material incorporado a VLP.
Especificidad de encapsidamiento de LucVpr en VLP: dependencia del domino p6 de Gag.
Para determinar si la actividad de luciferasa que se encontro asociada con VLP de VIH-1 represento LucVpr encapsidada, y no contaminantes enzimaticos adsorbidos sobre VLP, se coinfectaron celulas Sf9 con AcMNPV- LucVpr y AcMNPV-GagDp6, un baculovirus recombinante que expreso una version del precursor de Gag del VIH-1 a la que se le suprimio p6. En estudios previos, se ha mostrado que el dominio p6 es indispensable para la germinacion y salida de VLP de celulas de insecto infectadas con baculovirus recombinante, y, de forma interesante, que VLP constituidas por moleculas precursoras de Gag a las que se les suprimio p6 (GagDp6 de 47 kDa) mostraron una forma mas regular y una mayor esfericidad que las VLP constituidas de Pr55Gag de WT [3]. Las celulas Sf9 coinfectadas con AcMNPV-LucVpr y AcMNPV-Pr55Gag (precursor de Gag de tipo salvaje, de longitud completa) sirvieron como control positivo, y para el control negativo para la produccion de VLP, se infectaron celulas Sf9 con AcMNPV-LucVpr solo.
El medio de cultivo celular de las celulas Sf9 que coexpresan LucVpr y Pr55Gag o GagDp6 se recogio a 48 h pi, usando ultracentrifugacion a traves de una almohadilla de sacarosa seguida de una segunda etapa de ultracentrifugacion en gradiente isopfcnico [8, 9]. Las fracciones de los gradientes se analizaron para determinar el contenido de poliprotefna Gag (Figura 3a), y se procesaron para el ensayo de luciferasa (Figura 3b). Las muestras de celulas que coexpresan Pr55Gag+LucVpr mostraron un pico de actividad de luciferasa que coincidio con la densidad aparente de VLP en densidad de sacarosa-D2O, a saber, 1,15-1,25 [8, 9]. En contraste con estas muestras de control, no se detecto actividad significativa de luciferasa en las fracciones que contienen VLP procedentes del medio de cultivo de celulas que coexpresan GagDp6+LucVpr: el nivel de actividad de luciferasa observado fue comparable al nivel de fondo encontrado en el medio de cultivo de celulas infectadas con AcMNPV-LucVpr (Figura 3b). Este resultado sugirio que la actividad de luciferasa que se encontro asociada con VLP del VIH-1 encerrada en la membrana fue especffica del empaquetamiento, y resulto de un proceso de empaquetamiento dependiente de p6 mediado por el resto Vpr de la protefna de fusion LucVpr.
Cuantificacion del ensamblaje de VLP sobre la base de ensayo de luciferasa, segun se aplica al inhibidor del ensamblaje prototipo PA-457.
Unas celulas Sf9 se coinfectaron con AcMNPV-Pr55Gag y AcMNPV-LucVpr (a una MOI de 10 cada una), y se anadio DSB al cultivo celular a 24 h pi a dosis crecientes, que oscilan de 0 a 10 mg/ml, y se mantuvieron durante 24 h. El medio de cultivo celular se cosecho entonces a 48 h pi, se sometio al analisis de ultracentrifugacion de 2 etapas, y cada fraccion de gradiente se sondo para la poliprotefna Gag y la actividad de luciferasa, como anteriormente. Se observo que el pico de actividad de luciferasa asociada a VLP disminuyo progresivamente de una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
manera dependiente de la dosis de DSB (Figura 4). Las fracciones de gradiente correspondientes al pico de actividad de luciferasa se reunieron, y las VLP contenidas en estas fracciones se sedimentaron, se lisaron y se ensayaron para determinar el contenido de luciferasa. La actividad de luciferasa se determino paralelamente en los lisados celulares correspondientes, y los valores de la relacion de la actividad de luciferasa intracelular asociada a VLP se representaron graficamente frente a las concentraciones de DSB. La curva confirmo la disminucion, dependiente de la dosis, de luciferasa asociada a VLP en presencia de DSB. Se correlaciono con la disminucion progresiva de los niveles de VLP extracelulares, como se muestra mediante la senal de Pr55Gag en el analisis de transferencia Western. La expresion intracelular de Pr55Gag permanecio virtualmente sin cambios dentro de este intervalo de concentraciones de DSB, como ya se observo [8].
Estos datos sugirieron que un ensayo de luciferasa a base del empaquetamiento de VLP de la protefna de fusion LucVpr se pudo usar legftimamente para cuantificar la produccion de VLP y evaluar la eficacia de los antivirales que actuan en la etapa del ensamblaje y de la germinacion extracelular de las partfculas vfricas. Como se ejemplifica mediante este experimento particular, la inhibicion del 50% de la formacion de VLP se observo a una concentracion de DSB de 2,2-2,5 mg/ml, que corresponde a una IC50 de 3,8-4,2 pMI. Este valor fue consistente con el valor de IC50 de 8-10 mM previamente determinado usando un ensayo inmunorradioqufmico de VLP [8], un procedimiento que no se pudo comparar con el ensayo de luciferasa, en terminos de sensibilidad y linealidad de la respuesta a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones enzimaticas.
Sin embargo, se concibio la posibilidad de que DSB (o cualquier miembro de esta clase de inhibidores) pueda interferir negativamente con funciones celulares implicadas indirectamente en el coempaquetamiento de LucVpr y Pr55Gag. Para abordar este aspecto, se marcaron cultivos celulares infectados con baculovirus con 35S-metionina y 35S-cistefna, las VLP marcadas con 35S se purificaron mediante ultracentrifugacion, y se analizo su contenido proteico usando SDS-PAGE y autorradiograffa y transferencia Western. Las bandas de las protefnas Gag y Vpr se cortaron del gel, y su contenido de radioactividad respectivo se determino mediante recuento por centelleo. Notablemente, Gag se evaluo como el contenido total de Gag, incluyendo todas las especies proteicas de Gag en nuestro calculo, es decir, Pr55Gag, Pr41Gag, CAp24, y MAp17, y se corrigio para el contenido respectivo de restos de aminoacidos que contienen azufre en las diferentes especies proteicas. Se encontro una relacion molecular promedio de 5,60 ± 0,68 copias de Gag por molecula de VPr (m ± SD; n = 8) en VLP producidas mediante celulas Sf9, un valor que estaba proximo al valor de 7:1 dado a conocer para viriones del VIH-1 liberados por celulas humanas [13].
Se aplico el mismo protocolo a VLP aisladas de celulas Sf9 tratadas con PA-457 que coexpresan LucVpr y Pr55Gag. Cuando se representan frente a las dosis de DSB, las relaciones de Gag a LucVpr permanecieron virtualmente constantes, independientemente de la dosis de DSB, con un valor promedio de 4,92 ± 0,25 copias de Gag por molecula de LucVpr (m ± SD; n = 8). La ausencia de disminucion significativa de la relacion LucVpr:Gag en presencia de dosis crecientes de DSB excluyo por lo tanto una posible interferencia directa de DSB con la maquinaria de encapsidamiento de LucVpr, que podrfa dar como resultado valores aparentemente menores de la actividad de luciferasa a concentraciones elevadas de DSB.
La menor diferencia en los valores medios de las relaciones Vpr:Gag y LucVpr:Gag (5,60 ± 0,68 frente a 4,92 ± 0,25) no fue significativa al nivel de P = 0,05, y sugirio que la fusion de luciferasa al termino N de Vpr no altero significativamente la eficiencia del encapsidamiento de la protefna de fusion LucVpr, en comparacion con Vpr no fusionada. Si se considera un valor promedio de 1 copia de Vpr o LucVpr por 5 moleculas de Gag (aprox. 20%), el empaquetamiento de Vpr y LucVpr en VLP producidas en celulas Sf9 fue tan eficiente como el empaquetamiento de Vpr en los viriones de VlH-1 (15% Vpr; [13]). Este punto importante valido nuestro procedimiento de cuantificacion de las VLP usando ensayo de luciferasa a base de Vpr y el precursor de Gag del VIH-1 recombinante en el sistema de expresion de baculovirus-celulas de insecto.
Evaluacion de los inhibidores potenciales del ensamblaje del VIH-1 usando el ensayo basado en el empaquetamiento de LucVpr.
BA, PA-457, 12, 15 y 16 se administraron a clls Sf9 coinfectadas con AcMNPV-Pr55Gag y AcMNPV-LucVpr a 24 h pi, y a concentraciones crecientes. El tratamiento farmaceutico se mantuvo durante otras 24 h, y las VLP liberadas en el medio de cultivo celular se sedimentaron a traves de una almohadilla de sacarosa [8]. Las cantidades de VLP extracelulares recuperadas en los sedimentos a las 48 h obtenidas en presencia de los diferentes inhibidores se determinaron usando los ensayos de luciferasa. Tras la normalizacion a la actividad de luciferasa determinada en los lisados celulares correspondientes, los valores de la relacion de la actividad de luciferasa asociada a VLP incorporada a las celulas se representaron graficamente frente a las concentraciones de farmaco. 12 y 15, asf como el compuesto lfder PA-457, mostraron un efecto inhibidor neto sobre el ensamblaje de las VLP con algunas diferencias en su eficacia respectiva. 15 presento la actividad inhibidora mas elevada, oscilando IC50 entre 1 y 2 mg/ml, con un valor medio a 1,9 mM, frente a 5,1 mM para DSB y 5,9 mM para ST-327 (Figura 5 y Tabla 2 mas abajo). Los valores del fndice de selectividad (SI) estaban en el mismo orden de magnitud para 15 y PA-457, pero 3 veces menor que DSB para 12 (Tabla 2).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tabla 2. Eficiencia de la inhibicion del ensamblaje de VLP de VIH-1 por derivados del acido betulfnico
(a)
- Compuesto
- IC50 (mg/ml) IC50 (mM) CC50 (mM) SIm
- BA
- 18,0 ± 3,0 39,4 43,8 1,1
- DSB
- 3,0 ± 1,0 5,1 93,5 18,7
- 12 (compuesto de referencia)
- 3,8 ± 1,6 5,9 31,1 5,3
- 15 (compuesto de referencia)
- 1,6 ± 0,5 1,9 24,7 13,0
- 16
- NA (c) NA (c) 120,0 ND w
(a) Los valores medios (m) para la actividad inhibidora del 50% (IC50) sobre el ensamblaje
de las VLP se dieron como mg/ml (media, m ± SEM; n = 4), o como mM (m). Los valores
medios para la citotoxicidad (CC50) solamente se dieron como mM.
(b) El fndice de selectividad (SI) se dio mediante la relacion CC504C50.
(c) NA, no aplicable.
(d) ND, no determinado.
Curiosamente, la curva de respuesta frente a la dosis de la inhibicion del ensamblaje de VLP obtenida con 16 mostro una pendiente suave hasta 8 mg/ml, seguido de una meseta a una produccion de VLP de 60-50% a concentraciones mayores que 10 mg/ml (que corresponden a una molaridad de 15,6 mM; Figura 5 y Tabla 2). Ademas, EP-39 mostro el nivel mas bajo de citotoxicidad, en comparacion con los otros farmacos, incluyendo BA (Tabla 2). La meseta observada en la curva de inhibicion de 16 implico la aparicion de una produccion residual de VLP positivas a luciferasa en presencia de dosis elevadas de 16. Este resultado fue en cierto modo inesperado, puesto que 16 inhibio la escision de la maduracion de CAp24-SP1 y disminuyo la infecciosidad vfrica con una IC50 media de 16 nM y una SI de alrededor de 2.000 [14], es decir, una eficiencia significativamente mayor en comparacion a la del compuesto lfder PA-457. Entonces se llevo a cabo un analisis posterior de los efectos biologicos de 16 para excluir posibles resultados de falsos negativos.
Propiedades bioffsicas de particulas positivas a luciferasa producidas por celulas tratadas con 16.
Las VLP extracelulares recuperadas en el sedimento a las 48 h de medio de cultivo de celulas tratadas con 16 se analizaron mediante ultracentrifugacion isopfcnica en gradiente de densidad de sacarosa-D2O [8, 9], como en los experimentos de las figuras 3 y 4. Las VLP de control liberadas por celulas no tratadas se equilibraron a una densidad aparente de 1,15, consistente con la de particulas retrovfricas encerradas en la membrana [15]. Sin embargo, las VLP residuales producidas en presencia de 16 mostraron un pico mas amplio de actividad de luciferasa, que corresponde a una densidad promedio de 1,17. Esto sugirio heterogeneidad y un cambio en la composicion de las VLP de 16 en comparacion con las VLP de control, con una diferencia en la relacion de protefna a lipidos que consiste en una mayor proporcion de protefnas frente a lipidos en VLP de 16. Nuestros proximos experimentos estuvieron dirigidos a elucidar este punto usando otro enfoque, basado en un analisis estructural.
Analisis estructural de las particulas de 16.
En un estudio previo, se ha demostrado que DSB anadido a cultivos celulares en el intervalo micromolar tuvo un efecto drastico sobre el ensamblaje vfrico. A 10 mg/ml (17 mM), DSB abolio totalmente la germinacion y salida de VLP desde celulas Sf9 infectadas con AcMNPV-Gag [8]. Tambien bloqueo completamente el ensamblaje citoplasmico de particulas similares a nucleos formadas de precursor de Gag no N-miristoilada [8]. Por el contrario, las celulas Sf9 de control, infectadas con AcMNPV-Gag, no tratadas, se decoraron abundantemente con germinacion de VLP desde la membrana plasmatica [8, 9]. Para investigar adicionalmente la base molecular y celular para la diferencia en el efecto inhibidor entre los tres inhibidores PA-457, 12 y 15 por un lado, y 16 por otro lado, se examinaron mediante microscopfa electronica (EM) celulas Sf9 infectadas con AcMNPV-Gag tratadas con los diferentes farmacos a 5 y 10 mg/ml durante 24 h a 24 h pi. El patron de microscopfa electronica (EM) mostro que las celulas tratadas con 12 y con 15 fue similar al de celulas tratadas con DSB a las mismas concentraciones: se observo un efecto inhibidor neto sobre el ensamblaje y germinacion de VLP con 12 y 15.
Sin embargo, las celulas Sf9 que expresan Pr55Gag mostraron una respuesta diferente a 16, con tipos diferentes de patrones de EM que a menudo coexistieron en las mismas celulas. (i) Se observaron unas particulas densas en electrones de aprox. 100 nm de diametro en el citoplasma, dispersas o dispuestas como pequenos agrupamientos rodeados por una membrana; (ii) tambien se acumularon particulas de 100 nm en grandes inclusiones citoplasmicas; (iii) tambien se observaron agregados irregulares de nanopartfculas de aprox. 20 nm de diametro en el citoplasma, y estas nanopartfculas se inmunomarcaron con oro con anticuerpo anti-Gag. (iv) Ocasionalmente, se observaron particulas de 100 nm en el proceso de salida al medio extracelular, directa o indirectamente via vesfculas que se abren al medio.
Las particulas de 100 nm ensambladas en celulas tratadas con 16 difirieron estructuralmente de las particulas similares a nucleos intracitoplasmicas, no encerradas, de 100-130 nm de diametro ensambladas por Pr55Gag no N- miristoilada [8, 9], y de las VLP encerradas en la membrana, extracelulares, liberadas por celulas que expresan Pr55Gag N-miristoilada. A gran aumento, las subestructuras eran discernibles, confiriendo las particulas inducidas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
por 16 el aspecto de morulas. Las partfculas similares a morulas tuvieron un diametro que oscila de 87 a 120 nm (diametro medio, m ± SD = 109,1 ± 9,2, SD, n = 14). Cada morula parecfa estar constituida por subunidades con forma de perla que se asemejan a las nanopartfculas ya observadas en agregados irregulares, que oscilan de 14 a 27 nm de diametro (m ± SD = 19,4 ± 3,2; n = 17). Se encontro que muchas partfculas similares a morulas tenfan una forma irregular, y/o se encontraron en el proceso de desmantelamiento y liberacion de nanopartfculas aisladas.
Efecto de 16 sobre el mutante de dominio SP1 GagA364V.
GagA364V del VIH-1 es el prototipo de una serie de mutantes de Gag resistentes a PA-457 que muestran un patron normal o subnormal de procesamiento de Gag mediado por PR en presencia de dosis inhibidoras de DSB [4]. En base a la resistencia a DSB conferida por A364V y otros mutantes de fenotipo similar, se ha supuesto que el resto de alanina en la posicion 364 en la secuencia de Pr55Gag (posicion 1 del dominio de SP1), y sus regiones de flanqueo en los dominios de CA y SP1, representan la diana principal de DSB [4]. Por lo tanto, se sustituyo el resto de alanina por valina en el codon 364 en la secuencia de gag del clon baculovfrico AcMNPV-Pr55Gag, a fin de analizar la sensibilidad del mutante GagA364V a 16 en terminos de ensamblaje y germinacion de VLP a partir de celulas que expresan GagA364V.
Inesperadamente, sin embargo, se descubrio que el mutante GagA364V fue inestable: los analisis de SDS-PAGE y de transferencia Western de los lisados de celulas que expresan GagA364V mostraron que las protefnas que reaccionan con el anticuerpo anti-Gag consistieron en una banda apenas visible a 55 kDa, la masa molecular de Pr55Gag de WT sin escindir, y una banda principal a 41 kDa. La especie Pr41Gag correspondio a los dominios de MA-CA, puesto que reacciono con anticuerpos monoclonales tanto anti-MA como anti-CA. Se sabe que la supresion de los dominios de NC y p6 en Pr41Gag es perjudicial para el ensamblaje de VLP [1]. El analisis mediante EM de celulas que expresan GagA364V confirmo el patron de la protefna Gag: se observaron VLP muy raras en el proceso de ensamblaje y germinacion en la membrana plasmatica o en vesfculas citoplasmicas. El mutante GagA364V se verifico mediante secuenciacion del ADN, que mostro la ausencia de codon de parada accidental en el extremo C- terminal del dominio de CA que podrfa explicar la aparicion de la especie Pr41Gag. Los datos insinuan que se produjo una escision prematura en o cerca de la union de CA-SP1 de la poliprotefna mutante GagA364V. Las proteasas de la celula hospedante fueron responsables de esta escision, puesto que la PR del VIH-1 estaba ausente de nuestro sistema de expresion. La inestabilidad de GagA364V no nos permitio estudiar la posible influencia de la mutacion Ala a Val en la posicion 1 del dominio de SP1 en la inhibicion del ensamblaje de VLP mediada por 16.
Reticulacion qufmica de Pr55Gag en celulas tratadas con 16 y celulas no tratadas.
Para analizar adicionalmente el mecanismo del efecto de 16 sobre el ensamblaje de la poliprotefna Gag, se incubaron celulas Sf9 que expresan Pr55Gag, no tratadas y tratadas con 16 (10 mg/ml), con cantidades crecientes del reticulador qufmico BS3 a 48 h pi durante 30 min. a temperatura ambiente, y despues se lisaron en medio hipotonico en presencia de BS3 usado en el mismo intervalo de concentraciones. El estado oligomerico de las protefnas Gag se evaluo mediante analisis de SDS-PAGE y transferencia Western, usando anticuerpo anti-Gag, anticuerpo complementario marcado con peroxidasa, y quimioluminiscencia potenciada (ECL). En muestras de control, no reticuladas, la proporcion de Pr41Gag (el producto de escision espontanea principal de Pr55Gag) fue mayor en celulas tratadas con 16 en comparacion con celulas no tratadas. Esto sugirio que 16 modifico la conformacion de Pr55Gag, y la hizo mas sensible a proteasas celulares. En muestras reticuladas sin tratamiento con 16, la banda de monomeros de Pr55Gag disminuyo rapidamente a concentraciones de BS3 mayores que 10 mM de BS3, y de una manera dependiente de la dosis. La disminucion fue menos pronunciada en muestras tratadas con 16. Tambien se observaron diferencias en el patron de los oligomeros de Pr55Gag entre celulas no tratadas y celulas tratadas con 16, como se evidencia en sobreexposiciones y agrandamientos de los luminogramas de las transferencias Western. Una banda discreta de protefna que reacciona con anti-Gag, que migra con una masa molecular aparente de 140-150 kDa y compatible con el estado de trfmeros de Gag, se detecto a una concentracion entre 2 y 10 mM de BS3 en muestras de control. Esta banda desaparecio a concentraciones mayores de BS3, mientras que, paralelamente, el material que reacciona con anti-Gag de masa molecular elevada se hizo visible como una mancha dentro del gel espaciador o los pocillos de carga. Sin embargo, en muestras tratadas con 16, la banda de trfmeros de Gag putativos alcanzo progresivamente un maximo a 25 mM de BS3, y todavfa era detectable hasta 50 mM. Esto sugirio que 16 favorecio la aparicion y/o la estabilidad y persistencia de trfmeros de Gag, frente a oligomeros de mayor orden, en comparacion con muestras de control. El patron de reticulacion de Gag in situ confirmo nuestra observacion mediante EM, e indico que el estado de oligomerizacion de Gag y el modo del ensamblaje de las partfculas fueron diferentes en celulas no tratadas y en celulas tratadas con 16.
Referencias:
1. Carriere C, Gay B, Chazal N, Morin N, Boulanger P (1995) Sequence requirement for encapsidation of deletion mutants and chimeras of human immunodeficiency virus type 1 Gag precursor into retrovirus-like particles. J Virol 69: 2366-2377.
2. Chazal N, Carriere C, Gay B, Boulanger P (1994) Phenotypic characterization of insertion mutants of the human immunodeficiency virus type 1 Gag precursor expressed in recombinant baculovirus-infected cells. J
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Virol 68: 111-122.
3. Gay B, Tournier J, Chazal N, Carriere C, Boulanger P (1998) Morphopoietic determinants of HIV-1 GAG particles assembled in baculovirus-infected cells. Virology 247: 160-169.
4. Aiken C, Chen CH (2005) Betulinic acid derivatives as HIV-1 antivirals. Trends Mol Med 11: 31-36.
5. Yao XJ, Rougeau N, Duisit G, Lemay J, Cohen EA (2004) Analysis of HIV-1 Vpr determinants responsible for cell growth arrest in Saccharomyces cerevisiae. Retrovirology 1: 21.
6. Selig L, Pages J-C, Tanchou V, Preveral S, Berlioz-Torrent C, et al. (1999) Interaction with the p6 domain of the Gag precursor mediates incorporation into virions of Vpr and Vpx proteins from primate lentiviruses. J Virol 73: 592-600.
7. Muriaux D, Mirro J, Harvin D, Rein A (2001) RNA is a structural element in retrovirus particles. Proc Natl Acad Sci USA 98: 5246-5251.
8. DaFonseca S, Blommaert A, Coric P, Hong SS, Bouaziz S, et al. (2007) The 3-O-(3',3'-dimethylsuccinyl) derivative of betulinic acid (DSB) inhibits the assembly of virus-like particles in HIV-1 Gag precursorexpressing cells. Antiviral Ther 12: 1185-1203.
9. Huvent I, Hong SS, Fournier C, Gay B, Tournier J, et al. (1998) Interaction and co-encapsidation of HIV-1 Vif and Gag recombinant proteins. J Gen Virol 79: 1069-1081.
10. Hong SS, Karayan L, Tournier J, Curiel DT, Boulanger PA (1997) Adenovirus type 5 fiber knob binds to MHC class I alpha2 domain at the surface of human epithelial and B lymphoblastoid cells. EMBO J 16: 2294-2306.
11. Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65: 55-63.
12. Knoller S, Shpungin S, Pick E (1991) The membrane-associated component of the amphiphile-activated, cytosol-dependent superoxide-forming NADPH oxidase of macrophages is identical to cytochrome b559. J Biol Chem 266: 2795-2804.
13. Muller B, Tessmer U, Schubert U, Krausslich H-G (2000) Human immunodeficiency virus type 1 Vpr protein is incorporated into the virion in significantly smaller amounts than Gag and is phosphorylated in infected cells. J Virol 74: 9727-9731.
14. Turcaud S, Chazal N, Coric P, Souquet F, Briand L, et al. (2011) Synthesis of new derivatives of Bevirimat, showing a higher activity against HIV-1 maturation. J Med Chem, submitted.
15. Wilk T, Gross I, Gowen BE, Rutten T, de Haas F, et al. (2001) Organization of immature human immunodeficiency virus type 1. J Virol 75: 759-771.
Claims (8)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Compuesto de la formula (I) siguiente:
imagen1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, un estereoisomero o una mezcla de estereoisomero en cualquier proporcion, en particular una mezcla de enantiomeros, y particularmente una mezcla de racemato,en el que R representa un grupo -(CHR2)-(CHR3)n-X, en el que:- n representa 1,- X representa un grupo COOH o NHR1, representando R1 un atomo de hidrogeno o un grupo -Alk, -C(O)- Alk o -C(O)O-Alk, representando Alk un grupo alquilo (C1-C6), y- R2 y R3 representan, independientemente entre si, un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo (C1-C8), preferentemente un grupo alquilo (C1-C4), opcionalmente sustituido con un grupo COOH o NHR1, representando preferentemente por lo menos R2 y R3 un atomo de hidrogeno - 2. Compuesto segun la reivindicacion 1, caracterizado por que R1 representa un atomo de hidrogeno o un grupo -C(O)O-Alk, en particular un atomo de hidrogeno o un grupo ferc-butiloxicarbonilo.
- 3. Compuesto segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que R se selecciona de entre los grupos siguientes:
- c .OH )
- 4. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como un medicamento.
- 5. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su utilizacion en el tratamiento de una infeccion con un retrovirus, tal como el VIH, en particular el VIH-1.
- 6. Composicion farmaceutica que comprende por lo menos un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y por lo menos un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
- 7. Procedimiento para preparar un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas sucesivas siguientes:(i) hacer reaccionar un compuesto de la formula (II) siguiente:510152025303540en el
imagen2 - n representa 1,- X representa un grupo COOH o NHR1, representando R1 un grupo -Alk, -C(O)-Alk o -C(O)O-Alk, representando Alk un grupo alquilo (C1-C6), y- R2 y R3 representan, independientemente entre si, un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo (CrCs), preferentemente un grupo alquilo (C1-C4), opcionalmente sustituido con un grupo COOH o NHR1,con anhfdrido 2,2-dimetilsuccfnico, y(ii) opcionalmente, cuando R comprende un grupo NHR1, desproteger este grupo NHR1 para producir un grupo NH2. - 8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, caracterizado por que el compuesto de formula (II) se prepara segun las etapas sucesivas siguientes:(a) acoplar un compuesto de formula (III)en el que GP representa con una amina de la (IV) R4-NH2 (IV)
imagen3 siguiente:en la que R4 representa un grupo -(CHR2)-(CHR3)n-X, en el que:- n representa 1,- X representa un grupo COO-Alk1 o NHR1, representando R1 un grupo -Alk, -C(O)-Alk o -C(O)O-Alk, representando Alk y Alk1, independientemente entre si un grupo alquilo (C1-C6), y- R2 y R3 representan, independientemente entre si, un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo (C1-C8), preferentemente un grupo alquilo (C1-C4), opcionalmente sustituido con un grupo COO-Alk1 o NHR1,10representando R1 un grupo -Alk, -C(O)-Alk o -C(O)O-Alk, representando Alk y Alk1, independientemente entre si, un grupo alquilo (Ci-Ca),para producir un compuesto de la formula (IV) siguiente:en el que R4 y GPimagen4 (b) desproteger el grupo hidroxilo y, cuando resulte apropiado, el grupo -COO-Alk1 del compuesto de formula (IV) obtenido en la etapa (a) previa para producir un compuesto de formula (II).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP11306138.6A EP2567965B1 (en) | 2011-09-12 | 2011-09-12 | Derivatives of 3-O-(3',3'-dimethylsuccinyl)-betulinic acid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2553900T3 true ES2553900T3 (es) | 2015-12-14 |
Family
ID=44785766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES11306138.6T Active ES2553900T3 (es) | 2011-09-12 | 2011-09-12 | Derivados del ácido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)-betulínico |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9056888B2 (es) |
| EP (1) | EP2567965B1 (es) |
| ES (1) | ES2553900T3 (es) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7026305B2 (en) * | 2003-04-14 | 2006-04-11 | Meharry Medical College | Anti-HIV agents with dual sites of action |
| TW200628161A (en) * | 2004-11-12 | 2006-08-16 | Panacos Pharmaceuticals Inc | Novel betulin derivatives, preparation thereof and use thereof |
| CN101374527A (zh) * | 2005-12-16 | 2009-02-25 | 帕纳克斯医药公司 | 3-o-(3’,3’-二甲基琥珀酰基)桦木酸的药物盐的制备方法 |
| WO2008115281A2 (en) * | 2006-10-16 | 2008-09-25 | Myriad Genetics, Inc. | Compounds for treating viral infections |
| US20110152229A1 (en) * | 2006-11-22 | 2011-06-23 | Duke University | Betulinic acid derivatives as anti-hiv agents |
-
2011
- 2011-09-12 ES ES11306138.6T patent/ES2553900T3/es active Active
- 2011-09-12 EP EP11306138.6A patent/EP2567965B1/en active Active
-
2012
- 2012-09-10 US US13/608,486 patent/US9056888B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2567965B1 (en) | 2015-09-02 |
| US20130096094A1 (en) | 2013-04-18 |
| EP2567965A8 (en) | 2013-06-19 |
| EP2567965A1 (en) | 2013-03-13 |
| US9056888B2 (en) | 2015-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5537431B2 (ja) | ウイルス融合のインヒビターのコレステロール誘導体 | |
| ES2934810T3 (es) | Moléculas químicas que inhiben el mecanismo de empalme para tratar enfermedades causadas por anomalías de empalme | |
| CN1646558A (zh) | 组蛋白脱乙酰酶抑制剂及其制备方法 | |
| JP2010505831A (ja) | 安定化した、治療用の小型のヘリックス性抗ウイルスペプチド | |
| US8318425B2 (en) | Inhibition of HIV-1 replication by disruption of the processing of the viral capsid-spacer peptide 1 protein | |
| EP1112284A1 (en) | Piperazine-4-phenyl derivatives as inhibitors of the interaction between mdm2 and p53 | |
| CN107428797A (zh) | 作为hiv抑制剂的具有c‑28反向酰胺衍生物的c‑3新三萜烯酮 | |
| Cao et al. | Myristoylation of EV71 VP4 is essential for infectivity and interaction with membrane structure | |
| US20080233559A1 (en) | Inhibition of HIV-1 Replication by Disruption of the Processing of the Viral Capsid-Spacer Peptide 1 Protein | |
| CN103717757A (zh) | 用于调节爱泼斯坦-巴尔核抗原1的活性的组合物和方法 | |
| ES2553900T3 (es) | Derivados del ácido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)-betulínico | |
| WO2021229237A1 (en) | Cyclosporine analogues | |
| JPH0714875B2 (ja) | ウイルス阻害医薬組成物 | |
| KR100891699B1 (ko) | 7-아미노-4-((ｓ)-3-(4-플루오로페닐)-2-((r)-3-메틸-2-(5-메틸이소옥사졸-3-카복사미도)부탄아미도)프로판아미도)-7-옥소-2-헵테노에이트 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 | |
| CN114224896A (zh) | 病毒感染症的预防和早期治疗用组合物 | |
| WO2015002512A1 (ko) | 뎅기 바이러스 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제용 조성물 | |
| Curreli et al. | Synthesis, antiviral activity and resistance of a novel small molecule HIV-1 entry inhibitor | |
| EP4543902A1 (en) | Cyclosporine analogues | |
| Bhatia et al. | Mutation of critical serine residues in HIV-1 matrix result in an envelope incorporation defect which can be rescued by truncation of the gp41 cytoplasmic tail | |
| Liang et al. | An effective conjugation strategy for designing short peptide-based HIV-1 fusion inhibitors | |
| CN115380040A (zh) | 作为hiv抑制剂的新型三萜衍生物 | |
| Sha et al. | A convenient cell fusion assay for the study of SARS‐CoV entry and inhibition | |
| CN116585484B (zh) | 多肽偶联小分子化合物及其抗病毒应用 | |
| US12378281B2 (en) | Triterpenone derivatives as HIV inhibitors | |
| ZA200610825B (en) | Inhibition of HIV-1 replication by disruption of the processing of the viral capsid-spacer peptide 1 protein |