ES2554482T3

ES2554482T3 - Un método para la expresión a alto nivel de proteínas de fusión del miembro lg de la familia del receptor de TNF activas y su purificación

Info

Publication number: ES2554482T3
Application number: ES10011212.7T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey Browning; Konrad Miatkowski; Werner Meier
Original assignee: Biogen MA Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2015-12-21
Anticipated expiration: 2019-12-16
Also published as: EA005270B1; CN100387708C; US8283138B2; EP3006563A1; SG123531A1; US20100136625A1; EP2374872A2; NZ549623A; JP2010158252A; NO20012991D0; KR100732934B1; BR9916325B1; US7585946B2; KR20060084860A; IS5959A; EP1141248B1; US8709759B2; AU2005200042A1; WO2000036092A3; AU777232B2

Abstract

Un método para la expresión de altos rendimientos de proteínas de fusión del miembro Ig de la familia del receptor de TNF activas y que minimiza la expresión de proteínas de fusión del miembro Ig de la familia del receptor de TNF inactivas, en donde las proteínas de fusión del miembro Ig de la familia del receptor de TNF activas se unen al ligando con alta afinidad, que comprende cultivar una célula huésped de mamífero transformada con una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión del miembro Ig de la familia del receptor de TNF deseada en un sistema de cultivo celular de mamífero que tiene una temperatura de 27ºC a 32ºC.

Description

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reductor (Figura 3). Las dos bandas difieren en aproximadamente 5 kDa en tamaño aparente. Cuando la proteína se reduce, se resuelven esencialmente dos bandas a aproximadamente 50 kDa que resultan de la glicosilación heterogénea (Figura 3). Las dos bandas observadas bajo condiciones no reductoras, sin embargo, no resultan directamente de las diferencias de glicosilación que dan lugar al par de bandas reducidas. Usando un panel de anticuerpos monoclonales a la LTβR humana, se mostró que los anticuerpos del grupo I, es decir AGH1 y BDA8 reconocen solo la forma de PM grande del receptor (Tabla I; todos los datos excepto la selectividad para las bandas superior e inferior se tomaron de Browning et al, 1996). Los anticuerpos de este grupo enlazan directamente a la región de unión del ligando como se evidencia por la observación de que un fragmento Fab de BDA8 puede aún bloquear. Los mAb del grupo II pueden también bloquear la unión del ligando, sin embargo, en ensayos biológicos, estos mAb muestran comportamiento agonista y antagonista mezclados. Cuando se hace una columna de afinidad de estos mAb (AGH1 se usó en estos experimentos) y aplica la mezcla de formas grande y pequeña de la LTβR-Ig, la forma menor del receptor circula y la forma mayor se pega a la matriz de la columna. La elución a bajo pH proporciona un preparado puro de la forma grande (Figura 4). Las dos fracciones se ensayaron por su capacidad para enlazar a la superficie de células de hibridoma de célula T II-23 activado por éster de forbol, es decir, células que expresan el complejo de linfotoxina de superficie (como se describe en Browning et al, 1995), y solo la fracción que se une al mAb era capaz de enlazar a la linfotoxina de superficie. La fracción de circulación, es decir, la banda de menor PM estaba completamente inactiva (Figura 5). Específicamente, los sobrenadantes de células CHO transfectadas de forma estable con el constructo LTβR-Ig se pasaron sobre una columna de proteína A para aislar la proteína. La proteína pura se eluyó con tampón de fosfato sódico 25 mM a pH 2,8 y las fracciones que contenían proteína se neutralizaron con volumen 1/10 de fosfato sódico 0,5 M, pH 8,6. Las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo en un volumen de 0,25 ml con 3 ug de LTβR-Ig y 4 ug de mAb anti-LTβR seguido de captura del mAb con gotas de KappaLock sefarosa que reconocen solo la cadena kappa en el mAb de ratón y no el dominio Fc humano. Las gotas se eliminaron por centrifugado y el sobrenadante se despejó de inmunoglobulina restante con sefarosa de proteína A. Las gotas se trataron con tampón de muestra de SDS PAGE (agente no reductor) y el tampón se cargó en geles de SDS PAGE. Los geles se operaron y se transfirieron en Hybond y se hizo transferencia de Western con un fragmento Fc de IgG anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano silvestre (mAb de LTβR seguido por IgG-HRP de anti-ratón y detección por quimioluminiscencia de HRP (Amersham).

Para explotar la capacidad de AGH1 que reconoce exclusivamente la forma activa de LTβR:Ig; se preparó una columna de afinidad con AGH1 usando sefarosa activada con CNBr (Pharmacia, Piscataway, NJ) según el protocolo de los fabricantes. La columna se lavó de forma extensa con PBS y la LTβR-Ig purificada con proteína A se aplicó y la circulación se recogió. La columna se lavó con PBS y después se eluyó con fosfato sódico 25 mM, pH 2. Las fracciones que contenían eluyente se neutralizaron inmediatamente como se describe anteriormente. Las concentraciones de proteína se determinaron por absorbancia a 280 nm asumiendo que una disolución 1 OD es igual a 1 mg/ml. Las acumulaciones de circulación y elución que contenían LTβR-Ig se ensayaron para la unión por análisis FACS como se describe (Browning et al, 1995). La fracción de circulación no mostró tinción de FACS en células que expresan LT de superficie mientras la acumulación de elución retuvo toda la actividad de unión.

Ejemplo 2. Separación cromatográfica convencional de componentes vivos y muertos de LTβR-Ig humana.

Diferencias estructurales potenciales entre los componentes de PM grande y pequeño identificados anteriormente se explotan en el diseño de métodos de separación usando etapas de cromatografía convencional. Como un ejemplo, la proteína puede medirse por filtración en gel en PBS para obtener la separación parcial de las formas mayor y menor. Estos preparados pueden entonces aplicarse de nuevo a la misma columna para obtener preparados de las formas mayor y menor de LTβR-Ig humana que son mayores que el 90% enriquecido en los respectivos componentes. De forma alternativa, la cromatografía por interacción hidrófoba (HIC) puede emplearse para alcanzar el mismo resultado. La mezcla de proteína se diluye con sulfato de amonio, se carga en la columna de HIC y los componentes grande y pequeño se eluyen de forma diferencial con un gradiente de sal decreciente. Bajo estas condiciones, la separación de la línea base de los dos componentes de LTβR-Ig humana se obtiene (Figura 6). Estos métodos además del método de inmunoafinidad descrito anteriormente son útiles para preparar cantidades de mg de los preparados grande y pequeño de LTβR-Ig humana pero dejan mucho que desear para la preparación de grandes cantidades de estos componentes para uso farmacéutico. Los solicitantes han inventado un nuevo método adaptando el método de HIC a resinas que pueden obtenerse a granel y han identificado condiciones de cromatografía que permiten que la forma pequeña del material de LTβR-Ig humana circule a través de la columna mientras el componente grande se retiene y puede eludirse de forma selectiva (Figura 6). El material eludido puede someterse a una etapa de finalización tal como cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico para eliminar el material agregado y otras impurezas y, que después de la formulación en un tampón fisiológico adecuado puede usarse para un trabajo in vivo. El primer ejemplo posterior (A) describe las condiciones específicas que se usaron para evaluar analíticamente la cantidad de material inactivo en un preparado de LTβR-Ig. El segundo ejemplo

(B) describe el proceso de purificación preparativo que da por resultado un preparado de LTβR-Ig altamente enriquecido en el componente activo.

A) La cromatografía de interacción hidrófoba analítica (HIC) puede usarse como un ensayo cuantitativo para evaluar las cantidades de LTβR-Ig inactiva.

La resolución de línea base de los componentes más pequeño inactivo y más grande activo de LTβR-Ig humana recombinante se alcanzó en una columna de éter/m de Perseptive Biosystems Poros (4,6x100 mm, núm. de catálogo P091M526) equilibrada en sulfato de amonio 1,5 M y la posterior elución en un gradiente decreciente de sulfato de amonio. Los preparados de LTβR-Ig se diluyeron a una concentración de 0,1 mg/ml y se llevaron a una composición de tampón final de sulfato de amonio 1,5 M, fosfato sódico 20 mM, pH 9 (tampón A). Una parte (1 ml que contiene 100 µg de proteína) se cargó en la columna de éter/m Poros. La columna se lavó con 8,3 ml de tampón

A. Los componentes activo e inactivo se eluyeron diferencialmente con un gradiente lineal (volumen de gradiente total de 16,6 ml) de tampón A al 100% a tampón B al 100% (fosfato sódico 20 mM, pH 9) seguido por un lavado de 16,6 ml de tampón B. El efluente de columna se monitorizó por absorbancia a 214 nm. El procedimiento total se llevó a cabo a temperatura ambiente usando un caudal de columna de 1 ml/min. El perfil de elución de un cromatograma HIC analítico representativo se muestra en la Figura 5. El pico 1 contiene la fracción inactiva y el pico 2 la fracción activa de LTβR-Ig. Para cuantificar la contribución relativa de las dos formas, las áreas de pico se integraron usando el software de integración Vison de instrumentos Perseptive.

B) Purificación preparativa de LTβR-Ig recombinante humana.

Clarificación y concentración de medios acondicionados: Los restos celulares se eliminaron de 10 L de los medios acondicionados cosechados de células CHO que secretan LTβR-Ig recombinante usando filtración final muerta a través de una cápsula de filtro Calyx de 5 pies cuadrados (46,45 m2) de polipropileno de 5 µ (Microseparations Inc, Westborogh, MA) seguido de un cartucho de filtro de 4 pulgadas (10,16 cm) Opticap de 0,2 µ (Millipore Corp., Bedford, MA). Los medios clarificados se concentraron por ultrafiltración a aproximadamente 1 L usando tres cartuchos de Ultrafiltración Espiral S1Y30 (Amicon, Beverly, MA) conectados en serie.

Cromatografía de afinidad de proteína A: El medio acondicionado concentrado se pasó por gravedad a través de una columna de flujo rápido de sefarosa de proteína A de 10 ml (Pharmacia) a 4ºC. La columna se lavó con 50 ml de PBS, 50 ml de PBS que contiene NaCl 0,5 M, y 50 ml de PBS. Para eliminar IgG bovino contaminante, la columna se lavó con 50 ml de fosfato sódico 25 mM, pH 5,5. La LTβR-Ig unida se eluyó por gravedad con fosfato sódico 25 mM, NaCl 100 mM, pH 2,8 en fracciones de 3 ml y se neutralizó inmediatamente con 0,3 ml de fosfato sódico 0,5 M, pH 8,6. Las fracciones que contienen proteína se identificaron por espectroscopia de absorción, se acumularon y se almacenaron a -70ºC.

Cromatografía de interacción hidrófoba: La acumulación de elución de proteína A (40 ml a una concentración de 2,5 mg/ml) se diluyó con 40 ml de cloruro sódico 3 M, fosfato sódico 40 mM a pH 7 y 20 ml de cloruro sódico 1,5 M, fosfato sódico 20 mM a pH 7 (todas las disoluciones estuvieron a temperatura ambiente). La acumulación diluida se cargó en una fuente PH15 de 10x100 mm (7,8 ml) (Pharmacia, Piscataway NJ) a un caudal de 2 ml/min. La columna se lavó con 79 ml de cloruro sódico 1,5 M, fosfato sódico 20 mM a pH 7 a un caudal de 20 ml/min. La proteína unida se eluyó con fosfato sódico 20 mM a pH 7 a un caudal de 2 ml/min. La absorbancia del efluente se monitorizó a 280 nm y se recogieron fracciones de 9 ml. Las fracciones de elución que contenían proteína se identificaron por espectroscopia de absorción de UV, se acumularon y se almacenaron a -70ºC. La Figura 7 representa un perfil de elución de HIC típico. Bajo estas condiciones, el material inactivo circula a través de la columna y el material activo se une a la resina. La inserción de la figura 7 contiene un barrido del análisis SDS-PAGE NR teñido de azul de coomassie de las acumulaciones de aplicación y elución, respectivamente.

Cromatografía por exclusión de tamaño: Aproximadamente 100 ml (1,3 mg/ml) de la acumulación de elución de HIC que contenía los componentes activos de LTβR-Ig se concentraron por ultrafiltración a 9 ml usando un concentrador centriprep30 (Amicon, Beverly, MA). El concentrado (10,3 mg/ml) se cargó en una columna graduada preparativa Superosa-6 de 1,6x100 cm (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equilibrada en PBS a un caudal de 1 ml/min. El efluente se recogió en fracciones de 3 ml. Las fracciones que contenían proteína se identificaron por espectroscopia de absorción de UV. Las fracciones seleccionadas se analizaron por contenido de agregado a una carga de 3 µg/pista usando electroforesis en gel de SDS-PAGE NR. Las fracciones con agregado visible mínimo se acumularon y se almacenaron congelados a -70ºC.

De esta forma, puede prepararse LTβR-Ig que contiene cantidades mínimas del componente LTβR-Ig inactivo que está presente en los medios de cultivo en bruto.

Ejemplo 3. Condiciones de fermentación a baja temperatura enriquecidas para el componente activo grande de LTβR-Ig humana durante la etapa de cultivo celular.

Bajo condiciones de cultivo celular de mamífero convencionales, se secreta LTβR-Ig humana como una mezcla de aproximadamente 50% de componentes pequeños y 50% de componentes grandes. El uso de células de insecto infectadas con baculovirus para expresar la misma proteína da por resultado niveles drásticamente reducidos de la forma pequeña. Como las células de insecto se cultivan a 28ºC, se exploró si LTβR-Ig humana secretada de células de mamífero cultivadas a baja temperatura tendrían una relación alterada de formas pequeña y grande. Se muestran en la Figura 8 los sobrenadantes de las células CHO que secretan LTβR-Ig humana cultivadas en matraces T a 28, 30, 33, 35 y 37ºC analizados por transferencia de Western. Las formas grande y pequeña (indicadas por flechas) están presentes en los cultivos hechos crecer a 33, 35 y 37ºC. Puede verse muy poca evidencia de la forma pequeña en las pistas que contienen sobrenadante de cultivo de células cultivadas a 30 y 28ºC. Así, la disminución de la temperatura durante el cultivo celular reduce dramáticamente la cantidad de la forma inactiva pequeña de LTβR-Ig humana. Para cuantificar la relación entre la temperatura de cultivo celular y la extensión del

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LIGHT de longitud completa en un vector CH269 para la expresión en la superficie de células 293-E como se describe (Chicheportiche et al, 1997). Se han descrito métodos de unión FACS para la detección del receptor Ig a superficies celulares y métodos BIAcore para medir la unión de ligandos solubles a receptor Ig inmovilizado (Mackay et al, 1997). La tecnología BIAcore proporciona medidas a tiempo real de proteína unida a los chips (es decir, el receptor).

Las células CHO que expresan HVEM-Ig se cultivaron para confluir a 37ºC en botellas de cultivo rotatorias usando medios de crecimiento suplementados con FBS al 10%. Cuando las células alcanzaron la confluencia, el medio gastado se intercambió con medios de crecimiento fresco y los cultivos se incubaron a 37, 32 y 28ºC. Los cultivos a 28 y 32ºC se cosecharon una vez a la semana, el cultivo a 37ºC cada 4 días. El HVEM-Ig secretado se purificó usando cromatografía de afinidad a Proteína A como se describe. Los preparados purificados se almacenaron a 70ºC hasta el análisis. Cuando HVEM-Ig se produjo a 28, 32 y 37ºC y se purificó, todos los preparados se comportaron de forma similar en el análisis SDS-PAGE (figura 10) sugiriendo que no ocurrieron grandes alteraciones en la proteína. Por lo tanto, si se diera un plegado/formación de puente disulfuro aberrante, sería o bien intra-brazo o se daría cerca de la región bisagra del dominio Fc, es decir, formación de puentes entre brazos y por lo tanto no afectó de forma apreciable la forma total de la molécula en SDS-PAGE. La capacidad del receptor Ig para unirse a LIGHT expresado en células 293-E o LIGHT en células II23 activas se evaluó en ensayos de unión FACS (figura 11). En ambos tipos de células, la capacidad de HVEM-Ig para unirse al ligando de superficie celular se mejoró bruscamente 2-3 veces en la expresión a 32ºC. Usando tecnología BIAcore, se observó que cuando se cargaban chips BIAcore con HVEM-Ig a niveles similares (los valores RU reflejan la cantidad de proteína en el chip), el HVEM-Ig producido a menores temperaturas unió más ligando que las proteínas producidas a las temperaturas más altas (figura 12). Este resultado se obtuvo si LIGHT o LTα era el ligando. Las curvas de unión a BIAcore muestran los sucesos de unión on y off a tiempo real y puede verse que los sucesos de unión fueron similares a pesar de la temperatura de producción. Por lo tanto, una parte del preparado está efectivamente muerto y esta proporción se minimiza mediante menores temperaturas de producción. Se especula que la menor temperatura ha corregido un problema de plegado aberrante y mejorado el porcentaje de moléculas vivas incluso aunque no se pueda observar directamente la fracción de moléculas muertas. Las técnicas cromatográficas de afinidad como se perfilan anteriormente podrían servir para resolver las formas viva/muerta después de la optimización del preparado disminuyendo las temperaturas de crecimiento y o mutagénesis de varias cisteínas o bien en la bisagra o en el receptor en sí mismo para evitar el plegado incorrecto.

Ejemplo 7: Esquemas genéricos para minimizar las formas muertas de otras proteínas de fusión del receptor Ig de la familia de TNF

La mayoría de los receptores de la familia de TNF se han preparado como constructos de proteína de fusión con dominios Fc de inmunoglobulina:

Referencia

TNF-R p55: (Loestcher et al, 1991, Marsters et al. 1992; Ashkenazi et al, 1991)

TNF-R p75: (Mohler et al, 1993)

LTβ-R: (Crowe et al, 1994)

Fas: (Suda et al, 1993)

CD27: (Goodwin et al, 1993)

CD30: (Smith et al, 1993)

CD40: (Fanslow et al, 1992)

Ox40: (Baum et al, 1994)

4-1BB: (Alderson et al, 1994)

HVEM (Mauri et al, 1998)

En varios casos, lo más notablemente, Fas-Ig y CD40-Ig por ejemplo Fanslow et al, 1992, las quimeras son pobremente activas respecto a las formas Fc solubles de los dos receptores de TNF. Es posible que algunos de estos preparados sean mezclas de formas vivas y muertas en relaciones variables. Una forma muerta se refiere simplemente a una molécula que se une con una afinidad esencialmente menor (10-1000 veces) que la forma viva, es decir, no carecería completamente de actividad de unión, pero en vez de eso tiene una afinidad reducida por el ligando respecto a la forma de alta afinidad encontrada en las células de forma natural. Las uniones disulfuro entre brazos de receptor o intra-brazo de receptor aberrantes pueden darse llevando a una proteína menos activa.

Con cualquiera de estos receptores u otros como receptores aún no definidos, se prepararía un panel de mAb antireceptores mediante tecnologías convencionales. Esos anticuerpos capaces de bloquear la unión del ligando al

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receptor preferiblemente como se evalúa usando un ensayo de unión al ligando al receptor nativo en una superficie celular (aunque otros métodos que usan formas de receptor recombinante pueden ser suficiente) se usarían para formar columnas de afinidad. La preparación de la mezcla de formas de receptor Fc vivas o muertas pasaría sobre la columna y se recogió la circulación. El material que se une a la columna se eluiría con un tampón a pH bajo (típicamente pH 2,5 a 4,0) inmediatamente neutralizado. Las dos fracciones se unirían o bien a células en un ensayo de unión FACS (o cualquier otro formato de unión estándar) o a ligando a concentraciones de proteína variables. Algunos de estos mAb se unirán de forma selectiva a la forma viva y se verá una diferencia entre la concentración necesaria para conseguir el 50% de la unión de la circulación frente a eluato. Este resultado marca a ese mAb como un mAb desmarcante. La relación de la proteína en el eluato a la circulación indicará el porcentaje de forma viva en el preparado.

Estos mAb así identificados pueden usarse para purificar por afinidad la forma viva. Además, su uso en varios formatos de inmunoensayo puede usarse para optimizar la expresión de la forma correcta de la forma de receptor Fc deseada. El ensayo puede usarse además en conjunto con otros métodos de purificación convencionales para encontrar métodos que purificarían la forma activa del receptor sin recurrir a técnicas de afinidad. Usando estos Abs para delinear las formas vivas y muertas, la temperatura de cultivo podría optimizarse y los métodos cromatográficos desarrollarse para enriquecer la forma viva. De forma alternativa, los métodos de columna HIC podrían explotarse para separar las formas viva y muerta y usando este método, las condiciones de cultivo podrían optimizarse. Asimismo, estos ensayos formarían la base para mutagénesis de cisteína de la parte de receptor para definir el problema de enlaces disulfuro que al eliminarse darían material funcionalmente activo.

Como muchos de estos receptores tendrán aplicación como agentes terapéuticos en enfermedad humana y se querrá poner solo formas plegadas de forma apropiada en un paciente, estos métodos tendrán utilidad tanto para definir la preparación como para eliminar las formas de unión pobre.

Será evidente para los expertos en la técnica que varias modificaciones y variaciones pueden hacerse en los métodos de la presente invención. Así, se pretende que la presente invención cubra las modificaciones y variaciones de esta invención con tal que vengan en el alcance de las reivindicaciones anexadas.

Tabla I: Resumen de mAbs anti-LT-b-R

Citotoxicidad de HT29

Tinción Grupog de unión* mAb mAb soluble

Nombre mAb soluble mAb

celular al receptor de inmovilizado con banda

de mAb solo receptor

precipitadaf bloqueoa en plásticob LTa1/b2

BDA8 +++ +++ ++ +/----c superior I AGH1 +++ +++ +/----superior I

BCG6: +++ ++ +++ +/ +/ ambos II

BHA10: +++ +++ +/-e +/ +/ nd II

BKA11: +++ +/ +++ - +++d ambos III

CDH10: +++ +++ +/ +++ nd III

CBE11 +++ nd +++ +/--ambos IV

aEl ensayo evaluó si el anticuerpo bloquea la unión del receptor soluble a II-23 activado, nd = no hecho bPlato recubierto de Fc anti-ratón de cabra, mAb anti-receptor capturado, HT29s más IFNg. cBloquea dPotencia eVariable, alguna inhibición parcial en algunos ensayos, ninguno en otros. fLa forma de receptor precipitó usando mAb más sistema KappaLock. gLos grupos se definieron en la base de los datos en esta tabla más mapeo de epítopo hecho usando tecnología

BIAcore.

Tabla II. Expresión de constructos LTβR-Ig en células CHO cultivadas a diferentes temperaturas de cultivo

Constructo: Temperatura de fermentación ºC Expresión mg/La % de componentes inactivosb

LTβR05: 37 32 28 6 12 20 50 17 10

LTβR09: 37 32 28 10 -76 50 -6

aEl nivel de expresión se evaluó usando cromatografía de afinidad de Proteína A. bLa cantidad de componentes inactivos presentes en el preparado de LTβR-Ig se evaluó después de purificación de afinidad de Proteína A usando el método HIC analítico.

Tabla III. Suplementos de medios de crecimiento DME/HAM’s F-12

Componente: Cantidad en 1L de medios de crecimientoa

Suero bovino fetal: 100 ml

Glucosa: 1,85 g

Bicarbonato de amonio: 2,2 g

Estreptomicina: 140 mg

Gentamicina: 50 mg

Etanolamina (existencias 1M): 0,1 ml

Ácido lipoico: 91,2 mg

Ácido linoleico: 38,4 mg

Triyodo-L-tironina: 0,2 mg

Ex -Cyte VLE (Bayer): 1 ml

Insulina bovina: 10 mg

Transferrina bovina: 10 mg

Albúmina de suero bovino: 50 mg

Plurónico F-68: 1 g

Cisteína: 82 mg

Metionina: 34 mg

Serina: 52 mg

Vaina: 105,6 mg

Glicina: 50 mg

Ácido aspártico: 24,4 mg

Prolina: 52,2 mg

aLos componentes se mezclan con el polvo de medios base y el volumen se lleva entonces a 1L. El pH de los medios se ajusta a 7,20 ñ 7,25 usando HCl al 50%.

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20.: Un método para la expresión de altos rendimientos de fusiones de proteína Ig activas que comprende cultivar levadura transformada con ADN que codifica una fusión de proteína Ig deseada en un sistema de cultivo que tiene una baja temperatura de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 25ºC.

21.: El método del punto 20 en donde la temperatura es aproximadamente 15ºC a aproximadamente 20ºC.

22.: El método del punto 20 en donde dicho huésped transformado se cultiva primero a una temperatura por encima de aproximadamente 30ºC durante un periodo de tiempo suficiente para permitir el crecimiento de dicho huésped.

23.: El método del punto 20 en donde dicha fusión de proteína Ig comprende un miembro de la familia de receptor de TNF.

24.: El método del punto 23 en donde dicho miembro de la familia del receptor de TNF es un receptor de linfotoxina-β

o un fragmento del mismo.

25.: El método del punto 20 que comprende además la etapa de recuperación de fusiones de proteína Ig activas desde dicho sistema de cultivo por cromatografía de interacción hidrófoba.

26.: Una fusión de proteína Ig activa obtenida cultivando levadura transformada con ADN que codifica la fusión en un sistema de cultivo que tiene una baja temperatura de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 25ºC.

27.: La fusión del punto 26 que comprende un miembro de la familia de TNF.

28.: La fusión del punto 27 que comprende receptor de LT-β o un fragmento del mismo.

29.: La fusión del punto 26 que comprende HVEM o un fragmento del mismo.

30.: Un preparado farmacéutico que comprende una fusión de proteína Ig activa que tiene un dominio Fc de Ig y unas cadenas peptídicas, en donde el domino Fc de Ig está alterado alterando así la velocidad de formación de disulfuro en la región bisagra de dicha fusión de proteína Ig.

31.: El preparado del punto 30, en donde dicho dominio Fc de Ig está alterado sustituyendo al menos un residuo de cisteína con alanina.

32.: Una fusión de proteína Ig que comprende un dominio Fc de Ig reticulado a un péptido derivado de la familia de TNF en donde al menos un residuo de cisteína en el dominio Fc de Ig está sustituido con alanina.

33.: La fusión de proteína Ig del punto 32 en donde dicho péptido está derivado de un receptor de linfotoxina-β.

34.: Un método para fabricar una fusión de proteína Ig que comprende un dominio Fc de Ig reticulado a un péptido derivado de la familia del receptor de TNF por mutagenización de al menos un residuo de cisteína a una alanina, aumentando así el rendimiento de formas activas de fusión expresadas.

35.: El método del punto 34 en donde dicho péptido es LTBR, y las cisteínas en la posiciones 101 y 108 están mutagenizadas a alaninas.

36.: Una proteína de fusión LTBR-Ig que comprende alanina en las posiciones 101 y 108 del péptido LTBR.

Claims

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