ES2554561B1

ES2554561B1 - Nuevos promotores derivados de baculovirus con elevada actividad en sistemas de expresión basados en baculovirus

Info

Publication number: ES2554561B1
Application number: ES201430914A
Authority: ES
Inventors: Salvador HERRERO SENDRA; Agata Karolina JAKUBOWSKA; María MARTÍNEZ SOLÍS; José Ángel Martínez Escribano; Silvia Gómez Sebastián; Javier López Vidal
Original assignee: Alternative Gene Expression SL ALGENEX; Universitat de Valencia
Current assignee: Alternative Gene Expression SL ALGENEX; Universitat de Valencia
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2014-06-16
Publication date: 2016-09-30
Anticipated expiration: 2034-06-16
Also published as: ES2554561A1

Abstract

La presente invención pertenece al campo de la biotecnología y comprende secuencias de ácidos nucleicos, incluyendo promotores capaces de incrementar la calidad y eficacia de la producción de proteínas recombinantes. Específicamente, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico adecuada para funcionar como un promotor de baculovirus que comprende:#a. la secuencia SEQ ID NO.: 1 ó su secuencia complementaria; o#b. una variante de cualquiera de las secuencias del apartado a) que posee al menos un 70% de identidad con dicha secuencia.

Description

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DESCRIPCION

Nuevos promotores derivados de baculovirus con elevada actividad en sistemas de

expresion basados en baculovirus

Sector de la tecnica

La presente invencion pertenece al campo de la biotecnolog^a y comprende secuencias de acidos nucleicos, incluyendo promotores capaces de incrementar la calidad y eficacia de la produccion de protemas recombinantes.

Antecedentes de la invencion

El sistema de expresion basado en baculovirus es un metodo de produccion de protemas recombinantes que posee una elevada capacidad de expresion. Las protemas recombinantes producidas pueden usarse por ejemplo como vacunas, moleculas terapeuticas o agentes diagnosticos. Los baculovirus son un tipo de virus que infectan artropodos, especialmente insectos. Recientemente, basandose en la secuencia de ciertos genes conservados en todos los baculovirus, se ha propuesto una nueva division en cuanto a los generos que componen la familia Baculoviridae. A diferencia de la clasificacion anterior que se basaba en caracteristicas morfologicas y con la cual no existia ninguna correlacion entre el grupo de virus y el tipo de huesped donde se encontraban, en esta nueva clasificacion existe una clara distincion en relacion al orden al que pertenece el insecto huesped. Con la nueva clasificacion la familia Baculoviridae constaria de 4 generos: Alphabaculovirus (nucleopoliedrovirus espedficos de lepidopteros), Betabaculovirus (granuloviruses espedficos de lepidopteros), Gammabaculovirus (nucleopoliedrovirus espedficos de himenopteros) y Deltabaculovirus (nucleopoliedrovirus espedficos de dipteros) (Jehle J.A., Lange M., Wang H., Hu Z., Wang Y. & Hauschild R. (2006), Molecular identification and phylogenetic analysis of baculoviruses from Lepidoptera. Virology 346, 180-193). El vector basado en baculovirus mas empleado en la industria para la expresion de protemas recombinantes procede del baculovirus Nucleopoliedrovirus multicapside de Autographa californica (AcMNPV). Las celulas de insecto de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) o 21 (Sf21) son dos ejemplos de lmeas celulares susceptibles de ser infectadas con baculovirus recombinantes ampliamente utilizadas (Nettleship, J. E. et al, J. Struct. Biol. 2010, 172, 55-56), y las larvas de insecto de Trichoplusia ni (T. ni) se emplean como biofactorias para la produccion de protemas recombinantes (Gomez-Casado, E. et al., Protein Exp. Purif. 2011, 79, 35-43). Desde que el sistema de expresion basado en baculovirus se desarrollo en los anos 80 (Smith, G. E. et al., Mol. Cell Biol. 1983, 65(3),

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2156-2165), cientos de protemas recombinantes se han producido empleando este sistema, desde enzimas citosolicas hasta protemas de membrana.

La smtesis de protemas en un sistema de baculovirus posee numerosas ventajas frente a la smtesis en otros microorganismos tales como E.coli. Tras la production y purification, la protema recombinante expresada por el sistema de baculovirus posee modificaciones post traduccionales tales como formation de enlaces disulfuro, glicosilaciones, miristilatciones, acetilaciones, fosforilaciones, ubiquitinaciones, etc. Estos factores constituyen claramente un adelanto y una mejora en procedimientos para la obtencion de protemas recombinantes respecto a procedimientos anteriores.

Mas recientemente se han desarrollado vectores de baculovirus con promotores y amplificadores que permiten la expresion de genes en celulas de eucariotas superiores, tales como hepatocitos humanos o celulas CHO (cancer de ovario de hamster).

Los siguientes articulos cientificos pueden resumir el estado de la tecnica con respecto a estos sistemas de expresion de protemas recombinantes:

1: Fernandes F, Teixeira AP, Carinhas N, Carrondo MJ, Alves PM. Insect cells as a production platform of complex virus-like particles. Expert Rev Vaccines. 2013 Feb;12(2):225-36.

2: Cox MM. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 2012 Feb 27;30(10):1759-66. 3: Hitchman RB, Locanto E, Possee RD, King LA. Optimizing the baculovirus expression vector system. Methods. 2011 Sep;55(1):52-7. 4: van Oers MM. Opportunities and challenges for the baculovirus expression system. J Invertebr Pathol. 2011 Jul;107 Suppl:S3-15.

Existen numerosas tecnologias disponibles comercialmente para la expresion de protemas recombinantes empleando el sistema de expresion basado en baculovirus. A modo de ejemplo se citan a continuation algunas de ellas: “Bac-to-Bac®” (Invitrogen™), “BacPAK™” (Clontech™), “FlashBAC™” (Oxford Expression Technologies™), “BacuVance™”

(GenScript™), “Bac-N-Blue DNATM” (Invitrogen™), “BaculoDirect™” (Invitrogen™),

“BacVector®” 1000, 2000, 3000 (Novagen®), “DiamondBac™” (Sigma-Aldrich®), “BaculoGold™” (BD Biosciences™) o “MultiBack” (ETH Zurich/Redbiotec AG).

La mayoria de los sistemas de expreson basados en baculovirus emplean el promotor polh para la expresion de protemas recombinantes. El gen polh no es un gen esencial para la

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replication del virus en celulas de insecto, por lo que puede ser retirado del genoma sin afectar la production de virus. En su lugar, se expresa la protema de interes.

Existe una necesidad imperiosa de desarrollar nuevos promotores que permitan una produccion mas eficaz de protemas recombinantes en sistemas de expresion basados en baculovirus.

Breve description de la invention

La presente invencion esta basada en las excelentes propiedades de los promotores que a continuacion se describen.

En particular, los inventores descubieron que la secuencia de acido nucleico que comprende:

a. la secuencia SEQ ID NO.: 1 o su secuencia complementaria; o

b. una variante de cualquiera de las secuencias del apartado a) que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias

es adecuada para funcionar como un promotor de baculovirus. Por lo tanto, la presente invencion proporciona una secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 1 o su secuencia complementaria, adecuada para funcionar como un promotor en un sistema de expresion basado en baculovirus.

La presente invencion se refiere a la secuencia de acido nucleico mencionada anteriormente, donde dicha secuencia comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de la lista que consiste en:

a. la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO.: 19, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.: 23, SEQ ID NO.: 24, SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 29, o SEQ ID NO.: 30, SEQ ID NO.: 44 o sus secuencias complementarias; o

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b. una variante de cualquiera de las secuencias del apartado a) que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 2 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 4 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 5 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 6 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 18 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 23 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 28 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

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La presente invention proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 29 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 30 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

La presente invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico segun lo descrito anteriormente, donde dicha secuencia es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 44 o una variante de la misma que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia.

Ademas, dicho promotor puede formar parte de un casete de expresion. Por lo tanto, la presente invencion proporciona ademas un casete de expresion que comprende, al menos, una secuencia de acido nucleico tal y como se define anteriormente operativamente unida a una secuencia de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protema.

En ocasiones el casete de expresion comprende adicionalmente una (o varias) region(es) de recombination homologa (hr), como amplificadores (enhancers), operativamente unida(s) al promotor que controla la expresion de la protema.

La presente invencion tambien se refiere a vectores de donation, de transferencia y/o bacmidos recombinantes que comprenden las secuencias de acido nucleico o casetes de expresion descritos anteriormente.

Ademas es objeto de la presente invencion un bacuolovirus que comprende una una secuencia de acido nucleico o un casete de expresion segun lo descrito anteriormente.

Tambien se hace referencia en la presente invencion a una celula, un insecto o una larva de insecto que comprende un baculovirus segun lo descrito anteriormente, y/o una celula, un insecto o larva de insecto que comprende una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion y/o un vector segun cualquiera de los mencionados anteriormente.

Las celulas pueden ser eucariotas o procariotas.

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Los inventores describen ademas un medio de cultivo que comprende una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion, un vector de clonacion, un vector de transferencia, un bacmido, un baculovirus recombinante, una celula, un insecto o una larva de insecto segun lo mencionado anteriormente.

Es objeto de la presente invention un metodo para producir una proteina que comprende los pasos de:

a. infectar celulas de insecto con un baculovirus segun descrito anteriormente, o trasnfectarlas o transducirlas con el bacmido o con el vector de clonacion o de transferencia, o con un casete de expresion mencionados anteriormente;

b. expresar la proteina;

c. obtener dicha proteina.

La presente invencion proporciona tambien un metodo para producir una proteina que comprende los pasos de:

a. infectar insectos o larvas de insecto con baculovirus segun lo descrito anteriormente; o trasnfectarlas o transducirlas con el bacmido o con el vector de clonacion o de transferencia, o con un casete de expresion mencionados anteriormente;

b. expresar la proteina;

c. obtener dicha proteina.

La presente invencion tambien se refiere a una proteina recombinante obtenible mediante cualquiera de los metodos mencionados anteriormente.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere al uso de la proteina descrita anteriormente en terapia o diagnostico.

La invencion tambien describe el uso de una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion, un vector de clonacion, un vector de transferencia, un bacmido, un baculovirus recombinante, una celula, un insecto o una larva de insecto segun lo descrito anteriormente en un metodo para la production de una proteina.

Breve description de las figuras

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Figura 1. Production de GFP (de sus siglas en ingles, “green fluorescent protein’’, protema verde fluorescente) en tres lmeas celulares de insecto (Sf21 (J.L. Vaughn, R.H. Goodwin, G.J. Tompkins, P. McCawley. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro, 13 (1977), pp. 213-217), Se301 (K. Hara, M. Funakoshi, K. Tsuda, T. Kawarabata. New Spodoptera exigua cell lines susceptible to Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis virus. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 29A (1993), pp. 904-907) y Hi5 (Wickham TJ, Davis T, Granados RR, Shuler ML, Wood HA (1992). "Screening of insect cell lines for the production of recombinant proteins and infectious virus in the baculovirus expression system". Biotechnol Prog. 8 (5): 391-396.)) del promotor inicial (pSeL, L = largo, SEQ ID NO.: 2), su version truncada en 3' (pSeS, S = corto, SEQ ID NO.:3). Se empleo el promotor de polihedrina (pph, SEQ ID NO.: 11) como “gold standard’ (modelo de referencia estandard).

Figura 2. Produccion de GFP (de sus siglas en ingles, “green fluorescent protein’’, protema verde fluorescente) en tres lmeas celulares de insecto (Sf21 (A), Se301 (B) y Hi5 (C)). Deleciones en serie de la region 5 'del promotor pSeL (pSeL-140, SEQ ID NO.: 4 y pSeL- 120, SEQ ID NO.: 5) pueden aumentar la produccion de protemas en diferentes tipos de celulas (Sf21 (A), Se301 (B) y Hi5 (C)). Se empleo el promotor de polihedrina (pph, SEQ ID NO.: 11) como “gold standard’ (modelo de referencia estandard).

Figura 3. Representation esquematica de las diferentes variantes de algunos de los promotores mencionados en la presente description (pSeL, SEQ ID NO.: 2, pSeL-140, SEQ ID NO.: 4, pSeL-120, SEQ ID NO.:5, pSeS, SEQ ID NO.: 3 y pph, SEQ ID NO.:11).

Figura 4. Produccion de GFP (de sus siglas en ingles, “green fluorescent protein’’, protema verde fluorescente) en tres lmeas celulares de insecto (Sf21, Se301 y Hi5). La combination de los promotores (pph/pSeL-120 en la figura, SEQ ID NO.: 18) aumenta considerablemente los niveles de produccion de protema en estas celulas de insecto, en comparacion con el promotor pSeL (SEQ ID NO.:2), pSeL-120 (SEQ ID NO.:5) y promotor de polihedrina (pph, SEQ ID NO.: 11).

Figura 5. Produccion de GFP (de sus siglas en ingles, “green fluorescent protein’’, protema verde fluorescente) en larvas de T. ni. pSeL, (SEQ ID NO.: 2) y pSeL-120, (SEQ ID NO.: 5). Se empleo el promotor de polihedrina (pph, SEQ ID NO.: 11) como “goldstandard’ (modelo de referencia estandard).

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Figura 6. Representation de la position del promotor pSeL-120 en una alineacion de su secuencia con las secuencias homologas en diferentes especies de baculovirus (Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus (SeMNPV), Spodoptera litoralis nucleopolyhedrovirus (SpliMNPV), Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SpfrMNPV), Agrotis ipsilon nucleopolyhedrovirus (AgipMNPV), Agrotis segetum nucleopolyhedrovirus (AgseMNPV), Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), and Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)) (panel superior). El panel inferior muestra la identidad de secuencias entre los diferentes virus de la region representada en la alineacion (promotor pSeL-120, SEQ ID NO.:5).

Figura 7. Secuencias pSeL (SEQ ID NO.:2) y pSeS (SEQ ID NO.: 3) y su alineamiento, siendo la diferencia entre ambos la SEQ ID NO.:1 ("secuencia diferencial”).

Description detallada de la invention

Promotor

La presente invencion describe el uso de nuevos promotores de baculovirus para la expresion de protemas heterologas en celulas de insecto o en insectos (incluyendo larvas de insecto) empleando el sistema de expresion basado en baculovirus. La secuencia de acido nucleico del promotor deriva preferiblemente del genoma del nucleopoliedrovirus multiple de Spodoptera exigua (SeMNPV). La secuencia de acido nucleico del promotor puede tambien derivar del genoma de otros virus tales como Spodoptera litoralis nucleopoliedrovirus (SpliMNPV), Spodoptera frugiperda nucleopoliedrovirus (SpfrMNPV), Agrotis ipsilon nucleopoliedrovirus (AgipMNPV), Agrotis segetum nucleopoliedrovirus (AgseMNPV), Bombyx mori nucleopoliedrovirus (BmNPV), y Autographa californica nucleopoliedrovirus (AcMNPV). En particular, la secuencia de acido nucleico del promotor (o promotores) que deriva(n) del genoma del nucleopolyhedrovirus multiple de Spodoptera exigua (SeMNPV), se encuentra en en la region 5‘ de la orf46, controlando la expresion de dicho gen. En el transcriptoma de Spodoptera exigua infectado con SeMNPV hay una elevada presencia de transcritos correspondientes al gen orf46. Ademas, la protema ORF46 es una protema estructural. Los nuevos promotores presentan una actividad fuerte en el sistema de expresion basado en baculovirus, alcanzandose niveles de expresion superiores a los alcanzados bajo otros promotores de uso convencional como el promotor de polihedrina, polh o pph. El reducido tamano de su secuencia promotora hace posible su utilization conjunta con otros promotores.

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En un aspecto, la invencion se relaciona con una secuencia de acido nucleico, en adelante secuencia de acido nucleico de la invencion, adecuada para funcionar como un promotor de baculovirus que comprende:

a. la secuencia SEQ ID NO.: 1 o su secuencia complementaria; o

b. una variante de cualquiera de las secuencia del apartado a) que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias.

Ejemplos de promotores de baculovirus de la invencion, que comprenden

a) la SEQ ID NO.: 1 o su secuencia complementaria;

b) o una variante de cualquiera de las secuencia del apartado a) que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias

son la SEQ ID NO.: 2, la SEQ ID NO.: 4, la SEQ ID NO.: 5, la SEQ ID NO.: 6, la SEQ ID NO.: 7, la SEQ ID NO.: 8, la SEQ ID NO.: 10, la SEQ ID NO.: 12, la SEQ ID NO.: 13, la SEQ ID NO.: 14, la SEQ ID NO.: 15, la SEQ ID NO.: 17, la SEQ ID NO.: 18, la SEQ ID NO.: 19, la SEQ ID NO.: 20, la SEQ ID NO.: 22, la SEQ ID NO.: 23, la SEQ ID NO.: 24, la SEQ ID NO.: 25, la SEQ ID NO.: 27, la SEQ ID NO.: 28, la SEQ ID NO.: 29, la SEQ ID NO.: 30, la SEQ ID NO.: 44, o sus secuencias complementarias, o sus secuencias complementarias, o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores (SEQ ID NOs.: 2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30 y SEQ ID NO.: 44) que poseen al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias.

En una realization del primer aspecto de la invencion, la invencion comprende una secuencia de acido nucleico, en adelante secuencia de acido nucleico de la invencion, adecuada para funcionar como un promotor de baculovirus que comprende:

a. la secuencia SEQ ID NO.: 1 o su secuencia complementaria; o una variante de las mismas (SEQ ID NO.: 1 o su secuencia complementaria) que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias; y

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b. la secuencia SEQ ID NO.: 11, o su secuencia complementaria, o una variante de las mismas (SEQ ID NO.: 11, o su secuencia complementaria) que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias.

Ejemplos de promotores de baculovirus de la invencion, que comprenden

b. la secuencia SEQ ID NO.: 11, o su secuencia complementaria, o una variante de las mismas (SEQ ID NO.: 11, o su secuencia complementaria) que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias

son la SEQ ID NO.: 6, la SEQ ID NO.: 7, la SEQ ID NO.: 8, la SEQ ID NO.: 10, la SEQ ID NO.: 14, la SEQ ID NO.: 15, la SEQ ID NO.: 17,la SEQ ID NO.: 18 y la SEQ ID NO.: 44.

En otra realization del primer aspecto de la invencion, la invencion comprende una secuencia de acido nucleico, en adelante secuencia de acido nucleico de la invencion, adecuada para funcionar como un promotor de baculovirus que comprende:

b. la secuencia SEQ ID NO.: 31, o su secuencia complementaria, o una variante de las mismas (SEQ ID NO.: 31, o su secuencia complementaria) que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias.

Ejemplos de promotores de baculovirus de la invencion, que comprenden estas secuencias (a y b) son la SEQ ID NO.: 19, la SEQ ID NO.: 20, la SEQ ID NO.: 22, la SEQ ID NO.: 23, la SEQ ID NO.: 24, la SEQ ID NO.: 25, la SEQ ID NO.: 27 y la SEQ ID NO.: 28.

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En el contexto de la presente invencion, el termino “promotor” se refiere a una secuencia de acido nucleico a la que la ARN polimerasa puede unirse para iniciar la transcripcion. Esta secuencia de acido nucleico puede ademas comprender sitios de union para varias protemas que regulan la transcripcion, como por ejemplo factores de transcripcion.

Los terminos "secuencia de acido nucleico", "secuencia de nucleotidos", "acido nucleico" y "molecula de acido nucleico" se usan aqu de manera intercambiable y se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud que pueden estar o no, quimica o bioqwmicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polidesoxirribonucleotido o polirribonucleotido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra.

Se dice que las moleculas o secuencias de acido nucleico son "complementarias" si se pueden hibridar una con la otra con suficiente estabilidad para permitirlas permanecer alineadas una con la otra en condiciones convencionales de "alta restrictividad". Las condiciones de restrictividad convencionales se describen por ejemplo por Sambrock y col., 1989 (Molecular cloning. Vol. 2. New York: Cold spring harbor laboratory press), y por Hames y col., en: Nucleic Acid Hybridation, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).

En el contexto de la presente invencion, la comparacion de identidad entre secuencias se puede obtener usando el algoritmo ClustalW (Larkin M.A. et al., Bioinformatics 2007, 23(21):2947-2948).

En una realization particular, la secuencia de acido nucleico de la invencion comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de la lista que consiste en: SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO.: 19, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.: 23, SEQ ID NO.: 24, SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 29, SEQ ID NO.: 30, SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias.

En otra realizacion, la secuencia de acido nucleico de la invencion consiste en la SEQ ID NO.: 1, o en la SEQ ID NO.: 2, o en la SEQ ID NO.: 4, o en la SEQ ID NO.: 5, o en la SEQ ID NO.: 6, o en la SEQ ID NO.: 7, o en la SEQ ID NO.: 8, o en la SEQ ID NO.: 10, o en la SEQ ID NO.: 12, o en la SEQ ID NO.: 13, o en la SEQ ID NO.: 14, o en la SEQ ID NO.: 15, o

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en la SEQ ID NO.: 17, o en la SEQ ID NO.: 18, o en la SEQ ID NO.: 19, o en la SEQ ID NO.: 20, o en la SEQ ID NO.: 22, o en la SEQ ID NO.: 23, o en la SEQ ID NO.: 24, o en la SEQ ID NO.: 25, o en la SEQ ID NO.: 27, o en la SEQ ID NO.: 28, o en la SEQ ID NO.: 29, o en la SEQ ID NO.: 30, en la SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias.

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico segun la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 2 o una variante de la SEQ ID NO.: 2 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico segun la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 5 o una variante de la SEQ ID NO.: 5 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico de la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 6 o una variante de la SEQ ID NO.: 6 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico de la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 18 o una variante de la SEQ ID NO.: 18 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico de la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 23 o una variante de la SEQ ID NO.: 23 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico de la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 28 o una variante de la SEQ ID NO.: 28 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

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Preferentemente, la secuencia de acido nucleico de la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 29 o una variante de la SEQ ID NO.: 29 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico de la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 30 o una variante de la SEQ ID NO.: 30 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico de la presente invencion es la secuencia de acido nucleico que comprende la SEQ ID NO.: 44 o una variante de la SEQ ID NO.: 45 que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 2, o una variante de la misma que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 5, o una variante de la misma que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 6, o una variante de la misma que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 18, o una variante de la misma que que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 23, o una variante de la misma que que posee al menos un

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70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 28, o una variante de la misma que que posee al menos un

70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha

secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 29, o una variante de la misma que que posee al menos un

70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha

secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 30, o una variante de la misma que que posee al menos un

70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha

secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

Preferentemente la secuencia de acido nucleico es la secuencia de acido nucleico que consiste en la SEQ ID NO.: 44, o una variante de la misma que que posee al menos un

70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dicha

secuencia, o la secuencia complementaria de alguna de ellas.

En el contexto de la presente invencion, el termino "ADN recombinante” se refiere a una forma de ADN artifical que ha sido disenado combinando o insertando una o mas hebras de ADN, de tal manera que ADN que normalmente no apareceria combinado, lo hace.

En general, las secuencias de acido nucleico de la invencion pueden derivar del genoma del nucleopoliedrovirus multiple de Spodoptera exigua (SeMNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus de Spodoptera litoralis (SpliMNPV), o del genoma del nucleopolyhedrovirus de Spodoptera frugiperda (SpfrMNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus de Agrotis ipsilon (AgipMNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus Agrotis segetum de (AgseMNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus de Bombyx mori (BmNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus de Autographa californica (AcMNPV).

Preferiblemente, las secuencias de acido nucleico de la invencion derivan del genoma del nucleopoliedrovirus multiple de Spodoptera exigua (SeMNPV).

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En una realization particular de la presente invention, la secuencia de acido nucleico incluye 301 nucleotidos aguas arriba (upstream) del codon de inicio del marco abierto de lectura (ORF) correspondiente al gen: ORF46calyx / polyhedron envelope protein" o „polyhedron envelope protein calyx/pep” (Genbank acc n AF169823.1). del genoma del nucleopoliedrovirus multiple de Spodoptera exigua (SeMNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus de Spodoptera litoralis (SpliMNPV), o del genoma del

nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (SpfrMNPV), o del genoma del

nucleopoliedrovirus de Agrotis ipsilon (AgipMNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus de Agrotis segetum (AgseMNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus de Bombyx mori (BmNPV), o del genoma del nucleopoliedrovirus de Autographa californica (AcMNPV).

Preferentemente, la secuencia de acido nucleico incluye 301 nucleotidos aguas arriba (upstream) del codon de inicio del marco abierto de lectura orf46 del genoma del nucleopolyhedrovirus multiple Spodoptera exigua (SeMNPV).

Casete de expresion

Las secuencias de acido nucleico de la invencion, como por ejemplo las secuencias representadas en SEQ ID NOs.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 1215, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30 y SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias, pueden estar operativamente unidas a una secuencia de nucleotidos que codifica una protema de interes, constituyendo de este modo un casete de expresion.

Tal y como se utiliza en esta description, el termino "operativamente unida” significa que la protema o protemas es (son) expresada(s) en el marco de lectura correcto bajo el control del promotor y las secuencias de control o reguladoras de expresion.

Por lo tanto, la invencion proporciona un casete de expresion que comprende una secuencia de acido nucleico que comprende cualquiera de las secuencias de nucleotidos de la presente invencion, operativamente unida a una secuencia de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica una protema.

Ademas, opcionalmente, el casete de expresion puede incorporar otras secuencias de control o secuencias reguladoras de la expresion. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcription y, en su caso, la traduction de la protema de interes. Ademas de promotores, incluyen secuencias que codifican reguladores transcripcionales,

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secuencias de union a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripcion. Dichas secuencias de control de expresion pueden ser funcionales en celulas y organismos procariotas y/o en celulas y organismos eucariotas.

Por lo tanto, el casete de expresion de la presente invention puede comprender adicionalmente una region de recombination homologa (hr), como amplificadores (enhancers), unida al promotor que controla la expresion de la protema.

Las regiones de recombinacion homologa (hr) en baculovirus, como por ejemplo en AcMNPV, se componen de unidades de unas 70 pb repetidas en tandem, cuya region central alberga un semipalmdromo de 28 pb caracterizado por contener una diana EcoRI. Se han identificado 8 regiones que contienen de 2 a 8 repeticiones de esta unidad. Su principal funcion es la de actuar como origen de replication del DNA vmco, la estabilizacion del genoma del virus y la intensification de la transcripcion.

Por ejemplo, estas regiones de recombinacion homologa se repiten en ocho localizaciones en el genoma de AcMNPV, con de 2 a 8 repeticiones en cada uno de los lados.

Un amplificador o region amplificadora (enhancer) en el contexto de la presente invencion se entiende como una secuencia de control a la cual se unen elementos reguladores de la transcripcion, aumentando asi el nivel de transcripcion de los genes asociados.

Ventajosamente, dicho casete de expresion puede ademas comprender un marcador o gen que codifica para un motivo o fenotipo que permite la selection de la celula hospedadora transformada con dicho casete de expresion. Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podrian estar presentes en el casete de expresion de la invencion incluyen genes de resistencia a antibioticos, genes de resistencia a compuestos toxicos y, en general, todos aquellos que permitan seleccionar las celulas transformadas geneticamente.

Preferentemente, la protema codificada en el casete de expresion de la invencion se selecciona entre las siguientes: vacuna proteica, protema terapeutica, anticuerpo, enzima, citoquina, factor de coagulation, anticoagulante, receptor, hormona, protema con valor diagnostico o protemas de partmulas similares a virus (VLP).

El casete de expresion puede ademas comprender, si asi se desea, una secuencia de acido nucleico que codifica un peptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purification del producto de interes. Por lo tanto, el casete de expresion de la presente invencion comprende, si se desea, una secuencia de acido nucleico que comprende la

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secuencia de nucleotidos que codifica un peptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificacion. Dicha secuencia de acido nucleico puede estar situada en cualquier posicion siempre que no altere la funcionalidad del producto de interes.

Practicamente cualquier peptido o secuencia peptidica que permita el aislamiento o purificacion del peptido o protema de fusion podria ser empleado. Por ejemplo, secuencias de polihistidina, secuencias peptidicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos que puedan servir para purificar la protema de fusion resultante por cromatografia de immunoafinidad, peptidos etiqueta, etc. Una o mas secuencias de este tipo pueden ser inclddas, opcionalmente, en el casete de expresion de la presente invencion.

Si se desea, el casete de expresion puede comprender ademas una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos susceptible de ser escindida espedficamente por medios enzimaticos o qdmicos con el fin de liberar el producto de interes una vez aislada la protema de fusion. Practicamente cualquier secuencia de aminoacidos susceptible de ser escindida por medios enzimaticos o qdmicos puede ser empleada, como por ejemplo, sitios de reconocimiento de proteasas (enteroquinasa, Arg-C endoproteasa, Glu-C endoproteasa, Lys-C endoproteasa, Factor de coagulacion Xa, etc) o sitios susceptibles de ser espedficamente escindidos por reactivos qdmicos (bromuro de cianogeno, etc.).

Vectores

La secuencia de acido nucleico de la invencion o el casete de expresion de la invencion pueden ser insertados en un vector apropiado. Por tanto la presente invencion se relaciona con un vector recombinante, tal y como un vector de clonacion, vector de transferencia y/o bacmido recombinante que comprende las secuencias de acido nucleico o el casete de expresion de la invencion.

Un “vector de clonacion” se refiere a cualquier vector adecuado para clonar, lo que generalmente supone la presencia de sitios de restriccion, un origen de replicacion para su propagacion en bacterias y un marcador de seleccion.

En la presente invencion, el vector de clonacion comprende la secuencia de acido nucleico de la invencion. Por ejemplo, el vector de clonacion comprende al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID NOs.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30 y SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias

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anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invention comprende la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, el vector de clonacion de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 44. Ademas, la presente invencion proporciona un vector que comprende el casete de expresion de la presente invencion y puede ser empleado preferentemente para producir el bacmido, el baculovirus recombinante, la celula, el insecto (o larva) o el medio de cultivo de la invencion.

El vector de clonacion que comprende un casete de expresion se denomina tambien “vector donador”. Por ejemplo, el vector donador de la presente invencion comprende al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID NOs.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30, SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias. Por ejemplo, el vector donador de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo, el vector donador de la

presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo, el vector donador de la

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presente invention comprende la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, el vector donador de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, el vector donador de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 44.

En el contexto de la presente invencion, “vector de transferencia” hace referencia a un vector donador adecuado para su integration o transposition en el genoma de baculovirus. El vector de transferencia permite generalmente la insertion de material genetico en el genoma de un baculovirus.

Preferentemente, el vector de transferencia de la presente invencion comprende alguna de las secuencias de acido nucleico de la presente invencion, y/o alguno de los casetes de expresion de la presente invencion asi como elementos que permitan su integracion o transposicion en el genoma de baculovirus. La obtencion de dicho vector puede hacerse por metodos convencionales conocidos por tecnicos en la materia [por ejemplo, Sambrock et al., 1989, Molecular cloning. Vol. 2. New York: Cold spring harbor laboratory press]. Por ejemplo, la obtencion de dicho vector puede hacerse mediante el metodo convencional conocido como “Sistema Gateway” (Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 2000 Nov;10(11):1788-95). El vector de transferencia puede transformar celulas que comprenden una o varias copias del genoma de baculovirus. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID Nos.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30, SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo, el vector de transferencia de la

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presente invention comprende la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, el vector de transferencia de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 44.

El vector de transferencia de la presente invencion puede derivar de alguno de los sistemas de expresion basados en baculovirus disponibles comercialmente “Bac-to-Bac®” (Invitrogen™), “BacPAK™” (Clontech™), “FlashBAC™” (Oxford Expression Technologies™), “BacuVance™” (GenScriptTM), “Bac-N-Blue DNATM” (InvitrogenTM), “BaculoDirect™”

(InvitrogenTM), “BacVector®” 1000, 2000, 3000 (Novagen®), “DiamondBacTM” (Sigma- Aldrich®), “BaculoGold™” (BD BiosciencesTM) or “MultiBack” (ETH Zurich/Redbiotec AG).

Los vectores de donation, donadores o de transferencia de la presente invencion pueden ser adecuados para transformar o transducir celulas procariotas. Ademas, pueden ser adecuados para transfectar o transducir celulas eucariotas, preferentemente celulas de insecto, mas preferentemente celulas Sf21 y/o Hi5 y/o Sf9 y/o Se301. Los vectores de clonacion y transferencia de la presente invencion pueden ser adecuados para transfectar o transducir insectos o larvas de insecto, como por ejemplo Bombyx mori y Trichoplusia ni, preferentemente larvas de insecto de Trichoplusia ni.

La presente invencion tambien se refiere al uso de los vectores de la presente invencion para transformar, transfectar o transducir celulas procariotas, celulas eucariotas, preferentemente celulas de insecto, mas preferentemente celulas Sf21 y/o Hi5 y/o Sf9 y/o Se301. Asi mismo, la presente invencion se refiere al uso de los vectores de clonacion y transferencia de la presente invencion para transfectar o transducir insectos o larvas de insecto, como por ejemplo Bombyx mori y Trichoplusia ni, preferentemente larvas de insecto de Trichoplusia ni.

En el contexto de la presente invencion el termino “transformacion” se entiende como la introduction de material genetico externo en celulas procariotas mediante plasmidos, vectores virales (en ocasiones tambien referido como transduction) u otras herramientas para la transferencia.

En el contexto de la presente invencion, el termino “transduccion” se entiende como el proceso por el cual se introduce material genetico exogeno en una celula procariota u eucariota utilizando un virus como vector.

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En el contexto de la presente invention el termino “transfection” se entiende como la introduction de material genetico externo en celulas eucariotas u organismos mediante plasmidos, vectores virales u otras herramientas para la transferencia.

Bacmido

En un aspecto de la invencion el vector es un bacmido recombinante.

Un “bacmido” tal y como se entiende en la presente invencion es un plasmido que comprende una secuencia de acido nucleico suficiente como para generar un baculovirus.

El bacmido recombinante de la presente invencion comprende la secuencia de acido nucleico de la invencion y/o el casete de expresion de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID NOs 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30, SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion

comprende la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, el bacmido de la presente invencion

comprende la SEQ ID NO.: 44. El bacmido es preferentemente adecuado para producir un

baculovirus recombinante, una celula, un insecto (o larva) o el medio de cultivo de la

presente invencion.

El bacmido de la presente invencion puede ser adecuado para transformar o transducir celulas procariotas y/o transfectar o transducir celulas eucariotas, preferentemente celulas de insecto. Mas preferentemente, es adecuado para transfectar celulas Sf21 y/o Hi5 y/o Sf9

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y/o Se301, o para transfectar insectos o larvas de insecto, preferentemente larvas de insecto de Trichoplusia ni. Por lo tanto, la presente invencion se refiere al uso del bacmido de la presente invencion para transformar, transfectar o transducir celulas celulas procariotas, celulas eucariotas, preferentemente celulas de insecto, mas preferentemente celulas Sf21 y/o Hi5 y/o Sf9 y/o Se301. As^ mismo, la presente invencion se refiere al uso del bacmido de la presente invencion para transfectar insectos o larvas de insecto, preferentemente larvas de insecto de Trichoplusia ni.

Baculovirus

Por lo tanto, la presente invencion se relaciona con un baculovirus que comprende una secuencia de acido nucleico o un casete de expresion segun la presente invencion.

Por ejemplo, el baculovirus de la invencion comprende al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID NOs.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30, SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un

99%, de: identidad con d dichas secuencias. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion: comprende la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, el baculovirus de la presente

invencion comprende la SEQ ID NO.: 44.

El baculovirus de la presente invencion puede derivar de cualquier baculovirus. Por ejemplo, el baculovirus de la presente invencion puede derivar de nucleopoliedrovirus multiple Spodoptera exigua (SeMNPV), o de nucleopoliedrovirus Spodoptera litoralis (SpliMNPV), o de nucleopoliedrovirus Spodoptera frugiperda (SpfrMNPV), o de

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nucleopoliedrovirus Agrotis ipsilon (AgipMNPV), o de nucleopoliedrovirus Agrotis segetum (AgseMNPV), o de nucleopoliedrovirus Bombyx mori (BmNPV), o de nucleopoliedrovirus Autographa califomica (AcMNPV).

Preferentemente, el baculovirus de la presente invention deriva de AcNMPV, BmNPV o SeMNPV.

El baculovirus de la presente invencion es adecuado para infectar celulas de insecto, insectos y/o larvas de insecto. Preferentemente, el baculovirus de la presente invencion es adecuado infectar larvas de insecto de Trichoplusia ni. Por lo tanto la presente invencion se refiere al uso del baculovirus de la presente invencion para infectar celulas de insecto, insectoso larvas de insecto, preferentemente larvas de insecto de Trichoplusia ni.

La generation de baculovirus puede estar basada en sistemas de expresion basados en baculovirus disponibles comercialmente: “Bac-to-Bac®” (Invitrogen™), “BacPAK™”

(Clontech™), “FlashBAC™” (Oxford Expression Technologies™), “BacuVance™”

“BacVector®” 1000, 2000, 3000 (Novagen®), “DiamondBac™” (Sigma-Aldrich®),

“BaculoGold™” (BD Biosciences™) or “MultiBack” (ETH Zurich/Redbiotec AG).

Celulas

Los vectores recombinantes proporcionados por esta invencion pueden ser utilizados para transformar, transducir y/o transfectar celulas eucariotas o procariotas. Por tanto, en otro aspecto, la invencion se relaciona con una celula huesped transformada, transducida o transfectada que comprende el vector recombinante y/o la secuencia de acido nucleico proporcionada por la invencion. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID NOs.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 1215, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30, SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o

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transfectada de la presente invention comprende la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, la celula transformada, transducida y/o transfectada de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 44.

Se pueden obtener celulas transformadas, transducidas o transfectadas mediante metodos convencionales conocidos por los tecnicos en la materia, e.g. [Sambrock et al., 1989, citado supra, Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 2000 Nov;10(11):1788-95].

Por consiguiente, en otro aspecto, la invencion se relaciona con una celula huesped transformada, transducida o transfectada que comprende, al menos, una secuencia de acido nucleico de la invencion, un casete de expresion proporcionado por la presente invencion o un vector recombinante de la invencion.

La celula de la presente invencion puede ser infectada con el baculovirus de la presente invencion. En el contexto de la presente invencion, el termino “infection” se entiende como entrada de virus en la celula hospedadora que genera un dano estructural del hospedero.

Preferentemente, la celula de la presente invencion comprende una o varias copias del genoma del baculovirus, para la obtencion de bacmidos recombinantes segun la presente invencion. En un aspecto de la presente invencion, la celula transformada es Escherichia coli. Por ejemplo, cuando se emplea el sistema de expresion basado en baculovirus comecial Bac-to-Bac®, la celula empleada es DH10BacTM. En otro aspecto, la celula transformada transducida, transfectada o infectada es una celula eucariota, preferentemente una celula de insecto, como por ejemplo Sf21, Hi5, Sf9 o Se301.

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La presente invention se refiere ademas a una celula que comprende un baculovirus segun la presente invencion. En otro aspecto, la invencion proporciona una celula transgenica que comprende, insertada en su genoma, al menos, una secuencia de acido nucleico o un casete de expresion proporcionados por la presente invencion. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende, insertada en su genoma, al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID NOs.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30, SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende, insertada en su genoma, la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende, insertada en su genoma, la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende, insertada en su genoma, la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende, insertada en su genoma, la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, la celula transgenica de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 44. En una realization particular dicha celula transgenica es una celula eucariota, preferentemente una celula animal, preferentemente una celula de insecto.

Cuando la celula es una celula de insecto, pertenece preferentemente a una lmea celular derivada de un insecto del genero Lepidoptera o Diptera. Mas preferentemente, se trata de una celula que deriva de alguna de las siguientes: Trichoplusia ni, Spodoptera frugiperda, Ascalapha odorata, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Stigmene acrea y Aedes aegypti. Aun mas preferentemente, la celula se selecciona de entre el grupo de celulas de insecto consistente en Hi-5TM, Sf9, Sf21, BTI-Tn5B-1, Tn368, ExpresSf+®, BTI-TnAo38, ATC- 10, Mimic™ Sf9, SfSWT-1, SfSWT-3, SfSWT-5, TriEx™, Se301y Schneider's Drosophila Line 2. Preferentemente, la celula de insecto es Hi-5™, Sf9, Sf21 o Se301. La celula de la presente invencion puede crecer en cultivos en monocapa o en suspension.

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Insectos

Ademas, la invention tambien proporciona un animal transgenico, particularmente un insecto o una larva de insecto que comprende una secuencia de acido nucleico o un casete de expresion, un vector o un bacmido segun la presente invencion. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID NOs.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30, SEQ ID NO.: 44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, el insecto o larva de insecto de la presente invencion comprende la SEQ ID NO.: 44. Preferentemente, el insecto o larva de insecto es capaz de expresar y/o expresa la protema recombinante de interes. Por lo tanto, la presente invencion se refiere ademas al uso del insecto o larva de insecto de la presente invencion para la production de protemas recombinantes.

En otra realization de la presente invencion, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la secuencia de acido nucleico, el casete de expresion, el vector de clonacion, el vector de transferencia, el bacmido o el baculovirus recombinante de la presente invencion. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con al menos una secuencia de las secuencias representadas en SEQ ID NOs.: 1-2, SEQ ID NOs.: 4-8, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NOs.: 12-15, SEQ ID NOs.: 17-20, SEQ ID NOs.: 22-25, SEQ ID NOs.: 27-30, SEQ ID NO.:

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44, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 70%, o un 80%, o un 90%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 1. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 2. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 5. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 6. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 12. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 13. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 14. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 18. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 23. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 28. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 29. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 30. Por ejemplo, el insecto (o la larva) ha sido infectado, transfectado, transducido o transformado con la SEQ ID NO.: 44.

En una realizacion preferida de la presente invencion, el insecto o larva de insecto comprende un baculovirus segun la presente invencion. El baculovirus se puede administrar al insecto, o a la larva por via oral (per os) o mediante inyeccion tal y como se describe por ejemplo en (Hughes P.R and Wood H.A. (1996). In vivo production, stabilization and infectivity of Baculovirus preoccluded virions. Applied and Environmental Microbiology, 62: 105-108; per os; Perez-Filgueira DM, Gonzalez-Camacho F, Gallardo C, Resino-Talavan P, Blanco E, Gomez-Casado E, et al. Optimization and validation of recombinant serological tests for African Swine Fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae. J Clin Microbiol 2006;44(9):3114-21)).

Preferentemente, el insecto o larva de insecto es un insecto transgenico.

El insecto es preferentemente un lepidoptero y mas preferentemente un insecto seleccionado de entre: Trichoplusia ni, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Ascalapha odorata, Bombix mori, Rachiplusia ni y Stigmene acrea. En una realizacion preferida, el insecto es una larva.

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Medio de cultivo

Ademas, la presente invention proporciona un medio de cultivo que comprende una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion, un vector de donation, un vector de transferencia, un bacmido, un baculovirus recombinante, una celula o un insecto (o larva) segun la presente invencion.

Metodos para producir el producto de interes

Cualquiera de las secuencias de la presente invencion pueden ser utilizadas para producir productos de interes. La invencion tambien proporciona un metodo para expresar un gen que codifica un producto de interes en un animal no humano, preferentemente en un insecto o larva y mas preferentemente en una larva de insecto. Por tanto, en otra realization particular, la invencion proporciona un metodo para producir un producto de interes que puede ser una protema recombinante, que comprende el uso de una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion, un vector de clonacion, un vector de transferencia, un bacmido, un baculovirus recombinante, una celula o un insecto (o larva de insecto) segun la presente invencion, y la obtencion de la protema recombinante o producto de interes. En una realizacion particular, la presente invencion se relaciona con un metodo para producir una protema que comprende los pasos de:

a) infectar celulas de insecto con un baculovirus segun la presente invencion, o transfectarlas, transducirlas o transformarlas con el bacmido, o con el vector de clonacion o de transferencia, o con un casete de expresion segun la presente invencion;

b) expresar la protema;

c) obtener dicha protema.

Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para producir una protema que comprende los pasos de:

a) infectar insectos o larvas de insecto con un baculovirus segun la presente invencion, o transfectarlas, transducirlas o transformarlas con el bacmido, o con el vector de clonacion o de transferencia, o con un casete de expresion segun la presente invencion;

b) expresar la protema;

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c) obtener dicha protema

Los metodos descritos en la presente invention comprenden el uso de las celulas, insectos o larvas de insecto descritos en la presente invencion.

La transfection, transduction o transformation de celulas, mas preferentemente de celulas de insecto, puede realizarse por metodos convencionales. Para una revision de la transferencia genica a insectos, incluyendo vectores, metodos de transferencia de ADN, etc., vease, por ejemplo, Tomita, M. et al., Nature Biotechnology 2003, 21:53-56 o Perez- Filgueira, M et al., Virology 2007, 364:422-443.

Las condiciones para optimizar el cultivo de dichas celulas u organismos dependeran de la celula u organismo utilizado. Si se desea, los metodos para producir un producto de interes como por ejemplo una protema recombinante proporcionados por la presente invencion incluyen, ademas, el aislamiento y/o purification de dicho producto de interes.

En general, el producto de interes obtenible por el metodo de la presente invencion se encuentra en forma de peptido o protema, preferentemente protema. Por lo tanto, la presente invencion proporciona ademas una protema recombinante obtenible mediante los metodos de la presente invencion. En una realization particular, la protema obtenible mediante los metodos de la presente invencion es una protema recombinante para su uso en metodos de tratamiento, terapia o diagnostico. Por lo tanto la presente invencion se refiere al uso de la protema recombinante de la invencion en terapia o diagnostico.

A modo de ejemplo, la protema obtenible por los metodos de la presente invencion puede ser una vacuna recombinante, una vacuna proteica, una protema terapeutica, un anticuerpo, una enzima, una citoquina, un factor de coagulation, un anticoagulante, un receptor, una hormona, una protema con valor diagnostico o protemas de partmulas similares a virus (VLP).

La presente invencion se refiere ademas el uso de una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion, un vector de donation, un vector de transferencia, un bacmido, un baculovirus recombinante, una celula, un insecto o una larva de insecto segun segun la presente invencion para la production de una protema.

LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO.:: Nombre:

1: Secuencia diferencial (aaaattaaatttttgctacaatata)

2: Promotor pSeL (atcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggccttttt ggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaatt gttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactt tgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatata)

3: Promotor pSeL A-D o pSeS (atcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggccttttt ggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaatt gttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactt tgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggca)

4: Promotor pSeL-140 (cgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccat tgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatata)

5: Promotor pSeL-120 (gttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttg gcaaaaattaaatttttgctacaatata)

6: Promotor pSeL-120-pph (gttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttg gcaaaaattaaatttttgctacaatataatcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtatttta ctgttttcgtaacagttttgtaataaaaaaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcg)

7: Promotor Secuencia diferencial-pph (aaaattaaatttttgctacaatataatcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactg ttttcgtaacagttttgtaataaaaaaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcg)

8: Promotor pSeL-pph (atcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggccttttt ggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaatt gttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactt tgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatataatcatggagataattaaaatg ataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaaaaacctataaatattccggatta

: ttcataccgtcccaccatcgggcgcg)

9: Promotor pSeL A-D-pph (atcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggccttttt ggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaatt gttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactt tgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaatcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaata agtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaaaaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcggg cgcg)

10: Promotor pSeL-140-pph (cgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccat tgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatataatcatggagataattaaaatgataaccat ctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaaaaacctataaatattccggattattcatacc gtcccaccatcgggcgcg)

11: Promotor pph (atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaa aaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcg)

12: Promotor pSeL-pSeL (atcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggccttttt ggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaatt gttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactt tgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatataatcatgtgtttgaacggcgac tgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggcctttttggattttgtcaaaaagaacga cgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaattgttactggaccgaatgtacaat attgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttatt aagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatata)

13: Promotor pSeL-pSeL-pSeL (atcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggccttttt ggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaatt gttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactt tgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatataatcatgtgtttgaacggcgac tgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggcctttttggattttgtcaaaaagaacga cgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaattgttactggaccgaatgtacaat attgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttatt aagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatataatcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagc gtcgctacctcgaccgacgaaccggcggcctttttggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatg

: ttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaattgttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatc aataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaa atttttgctacaatata)

14: Promotor pph-Secuencia diferencial (atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaa aaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcgaaaattaaatttttgctacaatata)

15: Promotor pph-pSeL (atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaa aaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcgatcatgtgtttgaacggcgactgtttggcg gtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggcctttttggattttgtcaaaaagaacgacgcagcg aaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaattgttactggaccgaatgtacaatattgttga aatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtctttt ggcaaaaattaaatttttgctacaatata)

16: Promotor pph-pSeL A-D (atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaa aaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcgatcatgtgtttgaacggcgactgtttggcg gtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggcctttttggattttgtcaaaaagaacgacgcagcg aaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaattgttactggaccgaatgtacaatattgttga aatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtctttt ggca)

17: Promotor pph-pSeL-140 (atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaa aaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcgcgaatgtacaatattgttgaaatgttcaat aatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaa ttaaatttttgctacaatata)

18: Promotor pph-pSeL-120 (atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaa aaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcggatccaaggccactagtgcggccgctct gcagtctcgaggttcaataatcaataaacctctctattatcctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatcattta ttaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatata)

19: Promotor Secuencia diferencial-p10 (aaaattaaatttttgctacaatataatacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattatt atcaaatcatttgtatattaattaaaatactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgac)

20: Promotor pSeL-p10

: (atcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggccttttt ggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaatt gttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactt tgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatataatacggacctttaattcaacc caacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaaatactatactgtaaattacatttt atttacaatcactcgac)

21: Promotor pSeL A-D-p10 (atcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcaggagcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggccttttt ggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaatgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaatt gttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactt tgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaatacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaat aagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaaatactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgac)

22: Promotor pSeL-140-p10 (cgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccat tgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatataatacggacctttaattcaacccaacacaa tatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaaatactatactgtaaattacattttatttacaatc actcgac)

23: Promotor pSeL-120-p10 (gttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttg gcaaaaattaaatttttgctacaatataatacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaatt attatcaaatcatttgtatattaattaaaatactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgac)

24: Promotor p10-Secuencia diferencial (atacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaa atactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgacaaaattaaatttttgctacaatata)

25: Promotor p10-pSeL (atacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaa atactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgacatcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcagga gcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggcctttttggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaa tgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaattgttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataat caataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaatta aatttttgctacaatata)

26: Promotor p10-pSeL A-D (atacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaa atactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgacatcatgtgtttgaacggcgactgtttggcggtatgcagga gcgtcgctacctcgaccgacgaaccggcggcctttttggattttgtcaaaaagaacgacgcagcgaaaacgccaa

: tgttgcaaattgtggaccggcacgaacacgttgaattgttactggaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataat caataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggca)

27: Promotor p10-pSeL-140 (atacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaa atactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgaccgaatgtacaatattgttgaaatgttcaataatcaataaac ctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgct acaatata)

28: Promotor p10-pSeL-120 (atacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaa atactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgacgttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaatttttt atttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatata)

29: Promotor pSeL-120-pSeL-120 (gttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttg gcaaaaattaaatttttgctacaatatagttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgt ccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatata)

30: Promotor pSeL- 120-pSeL- 120-pSeL-120 (gttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttg gcaaaaattaaatttttgctacaatatagttcaataatcaataaacctctctattatgctttgtaaattttttatttactttgttgt ccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatatagttcaataatcaataaacctctctatt atgctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatata )

31: Promotor p10 (atacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaa atactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgac)

32: Cebador pSeLF (ggatccgtatacatcatgtgtttgaacggcgactg)

33: Cebador pSeLR (gactagtatattgtagcaaaaatttaatttttgccaaaag)

34: Cebador pSeS (ggatccgtatacatcatgtgtttgaacggcgactg)

35: Cebador pSeSR (gactagtgccaaaagacttaataaatcatcagc)

36: Cebador pSeL-140F (tagtataccgaatgtacaatattgttg)

37: Cebador pSeL-140R (ctgggtgtagcgtcgtaagc)

38: Cebador pSeL-120F (tagtatacgttcaataatcaataaacctctc)

39: Cebador pSeL-120R (ctgggtgtagcgtcgtaagc)

40: Cebador pph-pSeLF (atctcgaggttcaataatcaataaacctctctattatcctttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatcat)

41: Cebador pph-pSeLR (ctgggtgtagcgtcgtaagc)

42: Secuencia del sitio multiclonaje (PL) (GGATCCaaggccactagtgcggccgctctgcagtctcgagcatgcggtaccaagcttGAATTC)

43: eGFP (enhanced GFP) (atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacg gccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgc accaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgc taccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccat cttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgc atcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaaca gccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcatggtgaacttcaagatccgccacaacatc gaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctg cccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa)

44: Promotor pph-pSeL-120 teorico (atcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaa aaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcggttcaataatcaataaacctctctattatgc tttgtaaattttttatttactttgttgtccattgctgatgatttattaagtcttttggcaaaaattaaatttttgctacaatata)

F = forward

p

R = reverse

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Ejemplos

Ejemplo 1. Materiales y metodos Clonacion de GFP bajo los distintos promotores

En el vector pFB-PL-GFP (pph-GFP), el gen que codifica para la protema GFP (SEQ ID NO.: 43) fue clonado bajo el control del promotor de poliedrina (pph, SEQ ID NO.: 11),. Este vector (pFB-PL-GFP (pph-GFP)) es un derivado del pFasTBacl que expresa la protema GFP, y sobre el que se inserto, aguas arriba de la GFP, un sitio de multi-clonaje (PL). La secuencia del sitio multiclonaje (PL) es

GGATCCaaggccactagtgcggccgctctgcagtctcgagcatgcggtaccaagcttGAATTC (SEQ ID NO.: 42). El fragmento de ADN correspondiente a los promotores pSeL y pSeS se obtuvo mediante amplificacion por PCR usando como molde ADN del genoma de SeMNPV y cebadores espedficos que incorporaban sitios de restriccion para los enzimas BstZ17I y Spel (cebadores, SEQ ID NOs.: 32, 33, 34, 35). Despues el promotor de poliedrina en pph- GFP fue sustituido por los promotores pSeL y pSeS empleando los sitios de restriccion BstZ17I y Spel (New England biolabs, Ipswich, EUA) y generando los vectores pSeL-GFP y pSeS-GFP.

A partir del vector pSeL-GFP, se amplificaron mediante PCR el fragmento pSeL140 y pSeL120. Para ello se emplearon 2 cebadores espedficos, uno incluyendo la region 5’ correspondiente asi como un sitio de restriccion para BstZ17I (cebadores, SEQ ID NOs.: 36, 38) y un segundo cebador que fue disenado para amplificar la region 3’ de gen GFP la cual conteda un sitio de restriccion AvrII (cebadores, SEQ ID NOs.: 37, 39). El vector pphGFP fue digerido con los enzimas BstZ17I y AvrII a 37°C durante 3 horas, liberando el fragmento conteniendo el pph-GFP el cual fue reemplazado por los fragmentos generados previamente para pSeL140 (SEQ ID NO.: 4) y pSeL120 (SEQ ID NO.: 5) y dando lugar a los vectores pSeL140-GFP y pSeL120-GFP, respectivamente.

Para la generacion de la construccion conteniendo el pph y el pSeL120 (SEQ ID NOs.: 11 y SEQ ID NO.: 5, respectivamente) en tandem (pph-pSeL-120-GFP) el fragmento pSeL-120 (SEQ ID NO.: 5) fue amplificado mediante PCR con cebadores espedficos que contedan los sitios de restriccion XhoI y AvrII (secuencias de los cebadores: SEQ ID NOs.: 40, 41). Dicho fragmento se clono en el plasmido pph-GFP abierto con dichos enzimas de restriccion. El plasmido resultante se nombro como pph-pSeL-120-GFP.

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Generation de los baculovirus recombinantes

Los baculovirus recombinantes se generaron empleando el sistema de expresion en baculovirus Bac-to-Bac® (Invitrogen, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plasmidos resultantes del paso previo se usaron para transformar celulas de E. coli DH10Bac™ para la transposition en el genoma viral y generacion de los bacmidos recombinantes. El ADN de cada uno de los bacmidos recombinantes obtenidos se purifico siguiendo el protocolo descrito en el manual Bac-to-Bac® (Invitrogen™), y se empleo para transfectar celulas de Spodoptera frugiperda, Sf21 empleando Cellfectin® II Reagent (Invitrogen™) como reactivo de transfection, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los virus generados se recogieron tras 3 dias de incubation a 27°C. Los virus resultantes de la transfeccion se amplificaron, infectando de nuevo celulas Sf21 para poder obtener asi un stock viral.

Las lmeas celulares de insecto se crecieron en Grace’s Insect Medium (1X) (Gibco®, Life technologies™) suplementado con FBS (suero bovino fetal) 10%. Los diferentes stocks de virus generados se cuantificaron mediante PCR cuantitativa (qPCR) empleando cebadores espedficos para la ADN polimerasa viral.

Ensayos de infection en celulas de insecto

Para los ensayos de infeccion con baculovirus se emplearon tres tipos de celulas de insecto diferentes: S. exigua, Se301; S. frugiperda, Sf21; y Trichoplusia ni, Hi5. Aproximadamente 2x105 celulas (70% de confluencia) se infectaron con cada uno de los virus a una multiplicidad de infeccion (MOI) 5, anadiendo la solution de virus directamente sobre el medio de cultivo de las celulas, y a los distintos tiempos post infeccion, las celulas se recogieron mediante centrifugation a 3000 rpm durante 5 minutos y la actividad promotora se determino mediante la cuantificacion de su fluorescencia.

Ensayos fluorescencia

Las celulas obtenidas en los pasos previos se lisaron empleando un tampon de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerol) y se midio la fluorescencia emitida por el gen reportero GFP a 535 nm tras haber sido excitado a 485 nm. Cada valor se obtuvo haciendo 4-5 medidas para cada muestra. El porcentaje de intensidad de fluorescencia GFP esta directamente relacionado con los niveles de expresion de GFP (se entiende que se trabaja a concentraciones mas bajas que la concentration de saturation, lo cual se

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confirma para cada medida). Los valores que se muestran son el promedio resultante de al menos dos ensayos independientes.

Ensayos de infection en insecto

Se usaron larvas en el quinto estadio larvario (el ultimo antes de la pupation) del lepidoptero Trichoplusia ni (T. ni) para todos los ensayos con insectos. Se inocularon con 5 ^l de los baculovirus recombinantes conteniendo 50,000 BVs y se recolectaron a las 72 hpi (horas post infeccion). Estas larvas se mantuvieron a -20°C hasta su uso. La extracion de las protemas solubles en condiciones nativas se hizo homogenizando las larvas en un tampon de extraction compuesto por: PBS 1x, 0.01% de Triton X-100, 1mM de PMSF y DTT 25 mM. Para su procesado se uso un triturador del tipo Bag Mixer® blender (Interscience™, France). Los homogenizados se centrifugaron 30 minutos a 1800 g y a 4 °C. Se descarto el sedimento y la fraction soluble, filtrada con miracloth (Calbiochem), (20 ^g/pocillo) se analizo por fluorimetria, del mismo modo que se describe el apartado anterior. Cada valor se obtuvo midiendo cada muestra 4-5 veces. Los valores que se muestran son el promedio resultante de al menos dos ensayos independientes.

Ejemplo 2. Expresion de la protema GFP en celulas de insecto Sf21, Se301 y Hi5 bajo los promotores pph, pSeL y pSeS.

Las celulas de insecto de S. exigua, Se301; S. frugiperda, Sf21; y Trichoplusia ni, Hi5 se infectaron con baculovirus recombinantes que incorporaban los siguientes casetes de expresion (Figura 3):

- pph-GFP (pph en la Figura 1)

- pSeL-GFP (pSeL en la Figura 1)

- pSeS-GFP (pSeS en la Figura 1)

Los resultados se observan en la Figura 1. La expresion de GFP en las lmeas celulares Sf21 (A), Se301 (B) y Hi5 (C) es superior cuando esta proteina se expresa bajo el promotor pSeL (SEQ ID NO.: 2) que cuando la proteina se expresa bajo el promotor pph (el “gold standard’ (modelo de referencia estandar, SEQ ID NO.: 11) hasta 72 horas despues de la infeccion. Ademas, la expresion de GFP en Hi5 es superior cuando la proteina se expresa bajo el promotor pSeL que cuando la proteina se expresa bajo el promotor pph incluso despues de 72 horas tras la infeccion. Estos resultados muestran la idoneidad de este promotor (pSeL) para la expresion de protemas recombinantes en celulas de insecto. Ademas, la expresion de GFP bajo el promotor pSeS (SEQ ID NO.: 3) fue practicamente

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nula tras la infeccion. Por lo tanto, la SEQ ID NO.: 1 es una secuencia esencial del promotor de la invencion (ver Figura 7).

Ejemplo 3. Expresion de la protema GFP en celulas de insecto Sf21, Se301 y Hi5 bajo los promotores pph, pSeL, pSeL-140 y pSeL-120.

- pph-GFP (pph en la Figura 2)

- pSeL-GFP (pSeL en la Figura 2)

- pSeL-140-GFP (pSeL-140 en la Figura 2)

- pSeL-120-GFP (pSeL-120 en la Figura 2)

Los resultados se observan en la Figura 2. La expresion de GFP en las lmeas celulares Sf21 (A), Se301 (B) y Hi5 (C) es superior cuando esta proteina se expresa bajo el promotor pSeL-120. En la lmea celular Se301 los niveles de expresion de GFP bajo los promotores pSeL-120 (SEQ ID NO.: 5) y pSeL-140 (SEQ ID NO.: 4) son parecidos, y superiores a los niveles de expresion de GFP cuando esta proteina se expresa bajo el promotor pSeL (SEQ ID NO.: 2) o pph (SEQ ID NO.: 11). Por lo tanto, ambos promotores pSeL-120 y pSeL-140, y principalmente pSeL-120 permiten una elevada expresion de la proteina recombinante, bastante superior a la expresion bajo el promotor polihedrina (“gold standard’).

Ejemplo 4. Expresion de la proteina GFP en celulas de insecto Sf21, Se301 y Hi5 bajo los promotores pph, pSeL, pSeL-120 y pph-pSeL-120.

Las celulas de insecto de S. exigua, Se301, S. frugiperda, Sf21, y Trichoplusia ni, Hi5, se infectaron con baculovirus recombinantes que incorporaban los siguientes casetes de expresion (Figura 3):

- pph-GFP (pph en la Figura 4)

- pSeL-GFP (pSeL en la Figura 4)

- pSeL-120-GFP (pSeL-120 en la Figura 4)

- pph-pSeL-120-GFP (pph/pSeL-120 en la Figura 4)

Los resultados se observan en la Figura 4. La expresion de GFP en las lmeas celulares Sf21 (A), Se301 (B) y Hi5 (C) es superior cuando esta proteina se expresa bajo el promotor pph-

pSeL-120 (pph/pSeL-120 en la Figura 4, SEQ ID NO.:18) que cuando se expresa bajo

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cualquiera de los otros promotores (pSeL, SEQ ID NO.: 2 y pSeL-120, SEQ ID NO.: 5). Se observan los mayores niveles de expresion cuando el promotor de polihedrina (pph) y la secuencia pSeL-120 y se disponen en tandem (pph-pSeL-120, SEQ ID NO.:18). Por lo tanto, la expresion de protemas recombinantes en celulas de insecto es maxima cuando la 5 secuencia que codifica para dicha protema recombinante esta bajo el control del promotor pph-pSeL-120 (SEQ ID NO.:18).

Ejemplo 5. Expresion de la protema GFP en larvas de insecto de T. ni

Larvas de T. ni en el quinto estadio larvario se inocularon con los baculovirus recombinantes y se recolectaron a las 72 hpi. La Figura 5 muestra la expresion de la proteina recombinante 10 GFP bajo los distintos promotores (distintos casetes de expresion):

- pph-GFP (pph en la Figura 5)

- pSeL-GFP (pSeL en la Figura 5)

- pSeL-120-GFP (pSeL-120 en la Figura 5)

La Figura 5 demuestra la utilidad de los nuevos promotores (pSeL, SEQ ID NO.: 2 y pSeL- 15 120, SEQ ID NO.: 5) para la expresion de protemas recombinantes en larvas de insecto

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Secuencia de acido nucleico adecuada para funcionar como un promotor de baculovirus que comprende:

a. la secuencia SEQ ID NO.: 1 o su secuencia complementaria; o

b. una variante de cualquiera de las secuencias del apartado a) que posee al menos un 70% de identidad con dicha secuencia.
2. Secuencia de acido nucleico segun la reivindicacion 1, donde dicha secuencia comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de la lista que consiste en:

a. la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO.: 2, o SEQ ID NO.: 4, o SEQ ID NO.: 5, o SEQ ID NO.: 6, o SEQ ID NO.: 7, o SEQ ID NO.: 8, o SEQ ID NO.: 10, o SEQ ID NO.: 12, o SEQ ID NO.: 13, o SEQ ID NO.: 14, o SEQ ID NO.: 15, o SEQ ID NO.: 17, o SEQ ID NO.: 18, o SEQ ID NO.: 19, o SEQ ID NO.: 20, o SEQ ID NO.: 22, o SEQ ID NO.: 23, o SEQ ID NO.: 24, o SEQ ID NO.: 25, o SEQ ID NO.: 27, o SEQ ID NO.: 28, o SEQ ID NO.: 29, o SEQ ID NO.: 30, o SEQ ID NO.: 44, o sus secuencias complementarias; o

b. una variante de cualquiera de las secuencias del apartado a) que posee al menos un 70% de identidad con dichas secuencias.
3. Secuencia de acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicha secuencia comprende la SEQ ID NO.: 5 o una variante de la SEQ ID NO.: 5 que posee al menos un 90% de identidad con dicha secuencia, o su secuencia complementaria.
4. Secuencia de acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicha consiste en una secuencia de acido nucleico seleccionada de la lista que consiste en la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO.: 23, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 29, SEQ ID NO.: 30, SEQ ID NO.: 44.
5. Casete de expresion que comprende una secuencia de acido nucleico tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 operativamente unida a una secuencia de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protema.

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6. Casete de expresion segun la reivindicacion 5, que adicionalmente comprende una region de recombinacion homologa (hr), como amplificadores (enhancers), operablemente unida al promotor que controla la expresion de la protema.
7. Casete de expresion segun la reivindicacion 5 o 6 en el que la protema se selecciona entre las siguientes: vacuna proteica, protema terapeutica, anticuerpo, enzima, citoquina, factor de coagulacion, anticoagulante, receptor, hormona, protema con valor diagnostico o protemas de partmulas similares a virus (VLP).
8. Vector de clonacion, vector de transferencia o bacmido recombinante que comprende las secuencias de acido nucleico segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 4 y/o el casete de expresion segun una o mas de las reivindicaciones 5 a 7.
9. Vector segun la reivindicacion 8 adecuado para transformar o transducir celulas procariotas.
10. Vector segun la reivindicacion 8 adecuado para transfectar o transducir celulas eucariotas.
11. Vector segun la reivindicacion 10 adecuado para transfectar o transducir celulas de insecto, o insectos o larvas de insecto.
12. Vector segun la reivindicacion 11 en la que las celulas transfectadas o transducidas son Sf21, o Hi5, o Sf9, o Se301.
13. Vector segun la reivindicacion 11 en la que las larvas pertenecen a Trichoplusia ni.
14. Celula huesped transformada, transformada, transducida o transfectada con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, y/o con el casete de expresion de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
15. Baculovirus que comprende una una secuencia de acido nucleico segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 4, y/o un casete de expresion segun una o mas de las reivindicaciones 5 a 7.
16. Baculovirus segun la reivindicacion 15 adecuado para infectar celulas de insecto, insectos o larvas de insecto.
17. Celula que comprende un baculovirus segun la reivindicacion 15 o 16.

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18. Insecto o larva de insecto que comprende una secuencia de acido nucleico segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 4, y/o un casete de expresion segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
19. Insecto o larva de insecto que comprende un baculovirus segun la reivindicacion 15 o 16.
20. Medio de cultivo que comprende una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion, un vector de clonacion, un vector de transferencia, un bacmido, un baculovirus recombinante, una celula, un insecto o larva de insecto segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Metodo para producir una protema que comprende los pasos de:

a. infectar celulas de insecto con un baculovirus segun cualquiera de las reivindicaciones 15 y/o 16, o trasnfectarlas o transducirlas con el bacmido o con el vector de clonacion o de transferencia segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, o con un casete de expresion segun una o mas de las reivindicaciones 5 a 7;

b. expresar la protema;

c. obtener dicha protema.
22. Metodo para producir una protema que comprende los pasos de:

a. infectar insectos o larvas de insecto con baculovirus segun cualquiera de las reivindicaciones 15 y/o 16, o trasnfectarlas o transducirlas con el bacmido o con el vector de clonacion o de transferencia segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, o con un casete de expresion segun una o mas de las reivindicaciones 5 a 7;

b. expresar la protema;

c. obtener dicha protema.
23. Protema recombinante obtenible mediante el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22.
24. Uso de la protema recombinante segun la reivindicacion 23 en terapia o diagnostico.
25. Uso de una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion, un vector de clonacion, un vector de transferencia, un bacmido, un baculovirus recombinante, una celula, un insecto o una larva de insecto segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 19 para la produccion de una protema.

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