ES2611302T3 - Elementos de ADN recombinante para la expresión de proteínas recombinantes en insectos - Google Patents

Elementos de ADN recombinante para la expresión de proteínas recombinantes en insectos Download PDF

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Abstract

Insecto derivado del género Lepidoptera, que comprende elementos de ácido nucleico introducidos en el insecto mediante un baculovirus recombinante que contiene un gen Ac-ie-01 endógeno, en el que dichos elementos de ácido nucleico comprenden [1] una copia adicional de ADNc de Ac-ie-01 de baculovirus como transgén bajo el control de un promotor adecuado que permite la expresión de las proteínas IE-1, IE-0 y/o fragmentos de las mismas que funcionan como reguladores de la transcripción por encima de niveles endógenos obtenidos durante la infección por baculovirus, en el que el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: (a) un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos indicada en cualquiera de SEQ ID NO: 1- 5; (b) una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75 %, preferiblemente al menos el 75 %, más preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 % y lo más preferiblemente al menos el 95 % con la secuencia de nucleótidos indicada en cualquiera de SEQ ID NO: 1-5 y que codifica una proteína que puede funcionar como regulador de la transcripción en un baculovirus recombinante; (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un aminoácido que contiene la secuencia de aminoácidos indicada en cualquiera de SEQ ID NO: 6-9; y (d) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud de secuencia de al menos el 70 %, preferiblemente al menos el 75 %, más preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 % y lo más preferiblemente al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos indicada en cualquiera de SEQ ID NO: 6-9 y que puede funcionar como regulador de la transcripción en un baculovirus recombinante; [2] en el que el insecto comprende además al menos una región homóloga (hr) recombinante como región de potenciador, unida operativamente a cualquier promotor que es adecuado para impulsar la expresión de una proteína recombinante, [3] en el que el promotor que impulsa la expresión de dicha proteína recombinante se selecciona del grupo 35 de ácidos nucleicos que comprende: i. un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos indicada en cualquiera de SEQ ID NO: 10- 16; y ii. una secuencia de ácido nucleico que puede funcionar como promotor en un baculovirus recombinante y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, preferiblemente al menos el 75 %, más preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 % y lo más preferiblemente al menos el 95 % con la secuencia de nucleótidos indicada en cualquiera de SEQ ID NO: 10-16.

Description

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“Baculovirus” se refiere a una familia de virus infecciosos para invertebrados, que infectan principalmente a insectos y artrópodos. Un “baculovirus recombinante” tiene ADN recombinante introducido adicional, por ejemplo, mediante transposición o recombinación homóloga. El baculovirus recombinante se origina preferiblemente de AcMNPV (virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica) o BmNPV (nucleopoliedrovirus de Bombyx mori).
“ADN recombinante” se refiere a una forma de ADN artificial que se modifica por ingeniería mediante la combinación
o inserción de una o más cadenas de ADN, combinando así ADN que normalmente no se produciría junto.
“Elemento de ADN recombinante” se refiere a un elemento funcional dentro de ADN recombinante, tal como un promotor, potenciador o un gen. Tal como se mencionó anteriormente, los elementos de ADN recombinante de la presente invención son secuencias que provocan la expresión de reguladores de la transcripción de baculovirus por encima de niveles endógenos, regiones homólogas (hr) de potenciador y promotores operativamente unidos a estos elementos anteriormente mencionados. Preferiblemente, los reguladores de la transcripción de baculovirus IE-1, IE-0
o fragmentos de las mismas se expresan por encima de niveles endógenos obtenidos durante la infección por baculovirus.
El baculovirus recombinante contiene además de (i) la secuencia para la expresión por encima de niveles endógenos de las proteínas IE-0, IE-1 y/o fragmentos de las mismas, (ii) una región homóloga (hr) recombinante unida a (iii) un promotor adecuado para impulsar la expresión de una proteína recombinante. Las combinaciones preferidas de estos elementos de ADN recombinante son tal como se describieron anteriormente para los insectos. Además, el baculovirus recombinante contiene preferiblemente una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante.
La presente divulgación se refiere además a un vector de transferencia que puede usarse para producir el insecto de la presente invención y/o un baculovirus recombinante y comprende dicha secuencia para la expresión por encima de niveles endógenos de las proteínas IE-0, IE-1 y/o fragmentos de las mismas, además de una secuencia adecuada para la integración o transposición en un baculovirus.
Los vectores de transferencia permiten generalmente la inserción de información genética en un baculovirus.
El vector de transferencia contiene preferiblemente además de (i) la secuencia para la expresión por encima de niveles endógenos de las proteínas IE-0, IE-1 y/o fragmentos de las mismas, (ii) una región homóloga (hr) recombinante unida a (iii) un promotor adecuado para impulsar la expresión de una proteína recombinante. Las combinaciones preferidas de estos elementos de ADN recombinante son tal como se describieron anteriormente para los insectos.
En un aspecto preferido, el vector de transferencia comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinante, mientras que en otro modo de realización preferido, el vector de transferencia carece de tal secuencia.
En un modo de realización preferido, el vector de transferencia es un bácmido.
“Bácmido” se refiere a un constructo de plásmido que contiene la secuencia de ADN suficiente para generar un baculovirus cuando se transfecta en una célula.
En un aspecto preferido adicional, el vector de transferencia se deriva de cualquiera de los sistemas de expresión de baculovirus comercialmente disponibles “Bac-to-Bac®” (invitrogen™), “BacPAK™” (Clontech™), “FlashBAC™” (Oxford Expression Technologies™), “BacuVance™” (GenScript™). “Bac-N-Blue DNA™” (invitrogen™), “BaculoDirect™” (invitrogen™), “BacVector®” 1000, 2000, 3000 (Novagen®), “DiamondBac™” (Sigma-Aldrich®) o “BaculoGold™” (BD biosciences™).
La presente divulgación se refiere además a un vector de clonación que puede usarse para producir el insecto de la presente invención, un baculovirus recombinante y/o vector de transferencia y comprende dicha secuencia para la expresión por encima de niveles endógenos de las proteínas IE-0, IE-1 y/o fragmentos de las mismas, que es adecuado además para replicación bacteriana.
“Vector de clonación” se refiere a cualquier vector que es adecuado para la clonación, lo que generalmente implica la presencia de sitios de restricción, un origen de replicación para propagación bacteriana y un marcador seleccionable.
El vector de clonación contiene preferiblemente además de (i) la secuencia para la expresión por encima de niveles endógenos de las proteínas IE-0, IE-1 y/o fragmentos de las mismas, (ii) una región homóloga (hr) recombinante unida a (iii) un promotor adecuado para impulsar la expresión de una proteína recombinante. Las combinaciones preferidas de estos elementos de ADN recombinante son tal como se describieron anteriormente para los insectos.
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En un aspecto preferido, el vector de clonación comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinante (también denominada “vector donador”), mientras que en otro aspecto preferido, el vector de clonación carece de tal secuencia.
5 La presente divulgación también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que puede usarse para producir el insecto, baculovirus recombinante, vector de transferencia y/o vector de clonación y comprende dicha secuencia para la expresión por encima de niveles endógenos de las proteínas IE-0, IE-1 y/o fragmentos de las mismas.
La secuencia de ácido nucleico contiene preferiblemente además de (i) la secuencia para la expresión por encima
10 de niveles endógenos de las proteínas IE-0, IE-1 y/o fragmentos de las mismas, (ii) una región homóloga (hr) recombinante unida a (iii) un promotor adecuado para impulsar la expresión de una proteína recombinante. Las combinaciones preferidas de estos elementos de ADN recombinante son tal como se describieron anteriormente para los insectos.
15 En un aspecto preferido, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinante, mientras que en otro modo de realización preferido, la secuencia de ácido nucleico carece de tal secuencia.
Sumario de secuencias
20
SEQ ID NO:
Nombre:
1
ADNc de Ac-ie-01 completo
2
Secuencia codificante de proteína (CDS) de IE-1
3
CDS de IE-0
4
CDS del dominio N-terminal de IE-1
5
CDS del domino N-terminal de IE-0
6
Proteína IE-1
7
Proteína IE-0
8
Proteína de dominio N-terminal de IE-1
9
Proteína de dominio N-terminal de IE-0
10
polh (promotor)
11
p10 (promotor)
12
pB29p10 (promotor)
13
p6.9p10 (promotor)
14
pB29 (promotor)
15
pB2p10 (promotor)
16
polhp10 (promotor)
17
polhAc-ie-01/hr1p10
18
polhAc-ie-01/hr1pB29p10
19
polhAc-ie-01/hr1p6.9p10
20
pB29Ac-ie-01lhr1p10
21
pB29Ac-ie-01/hr1pB29p10
22
pB29Ac-ie-01/hr1p6.9p10
23
polhAc-ie-01/hr1polh
24
pB29Ac-ie-01/hr1polh
25
polhAc-ie-01/hr1polhp10
26
pB29Ac-ie-01/hr1polhp10
27
Potenciador de región homóloga hr1
28
polhAc-ie-01
29
polhGFP
Depósito de microorganismos según el tratado de Budapest
Se depositaron plásmidos en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (www.cect.org); Universidad de
25 Valencia, Parc Científic Universitat de València; Catedrático Agustín Escardino, 9; 46980 Paterna (Valencia), España, con el número de registro CECT 8031, a fecha del 4 de octubre de 2011.
Ejemplos
30 Ejemplo 1. La sobreexpresión de reguladores de la transcripción de baculovirus potencia la función de potenciador de una región homóloga hr funcionalmente unida a un promotor que aumenta la expresión de proteínas recombinantes en un sistema de expresión de vector de baculovirus (BEVS).
Las proteínas virales inmediatas tempranas codificadas por el ADNc de Ac-ie-01, es decir, IE-1 e IE-0, de AcMNPV
9 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
son potentes reguladores de la transcripción en baculovirus. La transactivación mediada por estas proteínas se potencia por su unión como homodímero a las secuencias de región homóloga (hr) de baculovirus, que actúan como potenciadores de la transcripción. IE-1/IE-0 de AcMNPV son proteínas de unión a ADN diméricas de 67-72 kDa que estimulan la transcripción en ensayos de transfección de plásmido mediante la actividad de su dominio ácido Nterminal (7, 8). Sintetizadas de manera muy temprana durante la infección, IE-1 e IE-0 se acumulan dentro del núcleo, en el que se mantienen a lo largo de momentos tardíos. Usando el plásmido doble pFastBac™ (invitrogen™), se clonó el ADNc de Ac-ie-01 bajo el control del promotor polh. En el mismo plásmido, pero en otro locus, se clonó el gen que codifica GFP en el sentido de 3’ del promotor quimérico hr1p6.9p10 que se sintetizó previamente y contiene la región homóloga hr1 fusionada a los promotores p6.9 y p10. En la figura 1 se muestra una representación esquemática del casete de expresión de baculovirus resultante de la presente invención y la supuesta función de los elementos de ADN recombinante. Se usó el plásmido resultante para generar un baculovirus recombinante mediante el sistema “Bac-to-Bac®” (invitrogen™). En paralelo, se generó mediante el mismo sistema un baculovirus convencional que expresaba la proteína GFP bajo el control de promotor polh.
Se estudió la expresión de proteína GFP mediada por los diferente baculovirus mediante fluorimetría a las 96 horas tras la infección en larvas de Trichoplusia ni usando una dosis de infección baja o alta (5 x 102 o 5 x 104 respectivamente). El nivel de expresión de GFP se aumentó en extractos de larvas mediante el baculovirus que contenía el casete de expresión anterior en de aproximadamente el 13 a más del 40 % dependiendo de la dosis de virus usada (figura 4A). Se observaron resultados similares usando baculovirus en los que se expresaba el ADNc de Ac-ie-01 bajo el control del promotor pB29 derivado de insecto o cuando se expresó la GFP bajo el control del promotor hr1pB29p10 (datos no mostrados).
Ejemplo 2. Los casetes de expresión de baculovirus aumentan las tasas de supervivencia de larvas de insectos infectadas por baculovirus y la biomasa de insectos recuperada usando altas dosis de infección mediante los reguladores de la transcripción codificados por el ADNc de Ac-ie-01
En el ejemplo anterior se mostró una ventaja de baculovirus que expresan la proteína recombinante en el contexto del casete de baculovirus en cuanto a la productividad de proteína. Sin embargo, la diferencia principal observada era con respecto al porcentaje de larvas supervivientes a altas dosis de infección (productividad máxima). En tales condiciones de infección, el baculovirus que contenía el casete de expresión aumentó en aproximadamente el 70 % las tasas de supervivencia de larvas (figura 4B). Esto significa que usando un baculovirus convencional las condiciones de infección óptimas eran usando una dosis de infección de 5 x 102 ufp (tasa de supervivencia de larvas máxima). En cambio, usando un baculovirus que contenía el casete de expresión, podía usarse una dosis de 5 x 104, recuperando el mismo número de larvas al final del procedimiento de producción (figura 4B). En tales condiciones de producción óptimas (infección con 5 x 104 ufp), el baculovirus que contiene el casete de expresión proporciona más del doble de la cantidad de proteína recombinante producida en larvas de insectos infectadas con la dosis óptima para el baculovirus convencional (5 x 102 ufp) (figura 4 A y B).
Estudios de infección de larvas usando diferentes dosis de infección de un baculovirus convencional (polhGFP) o un baculovirus que contenía el casete de expresión polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP, expresando ambos las proteínas GFP, revelaron tasas de supervivencia crecientes de larvas infectadas cuando se usó el baculovirus que contenía el casete de expresión (figura 5A). A la dosis de infección más alta (5 x 104), la tasa de supervivencia de larvas infectadas con el casete de expresión aumentó en más del 70 % en comparación con larvas infectadas con un baculovirus convencional. Este aumento en las tasas de supervivencia de larvas infectadas tuvo drásticas consecuencias directas en la biomasa de insectos recuperada al final del procedimiento de producción, con un aumento del 80 % cuando se usó el baculovirus que contenía el casete de expresión a la dosis de infección más alta (productividad máxima) (figura 5B).
Para determinar el/los elemento(s) genético(s) responsable(s) de tales propiedades interesantes relacionadas con el aumento de las tasas de supervivencia tras la infección con altas dosis del baculovirus, se generó un baculovirus recombinante que expresaba los reguladores de la transcripción codificados por el ADNc de Ac-ie-01 bajo el control del promotor polh. Después se infectaron larvas de T. ni con una alta dosis de infección (5 x 104 ufp) de este baculovirus. Como control, se usó un baculovirus que expresaba la proteína GFP bajo el control del mismo promotor. De manera similar a las larvas infectadas con el casete de expresión polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP, las larvas infectadas con el baculovirus que sobreexpresaba el ADNc de Ac-ie-01 (polhAc-ie-01) también mostraron tasas de supervivencia aumentadas en comparación con larvas infectadas con un baculovirus convencional que expresaba la proteína indicadora GFP bajo el control del mismo promotor (polhGPF) (figura 6A). Esto sugiere fuertemente que la sobreexpresión de los reguladores de la transcripción usados en el casete de expresión de baculovirus protege a las larvas de insectos de la mortalidad inducida por baculovirus, permitiendo la expresión a largo plazo (más producción de proteínas recombinantes) y aumentando la recuperación de biomasa de insectos usando altas dosis de infección (productividad máxima) (figura 6B).
Ejemplo 3. La sobreexpresión en un sistema de expresión de baculovirus de reguladores de la transcripción codificados por el ADNc de Ac-ie-01 facilita el procesamiento postraduccional de proteínas recombinantes en larvas de insectos infectadas usadas como biofábricas.
10
imagen7
imagen8
imagen9

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  1. imagen1
    imagen2
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