ES2554773T3

ES2554773T3 - Insulina y análogos de la insulina resistentes a la fibrilación

Info

Publication number: ES2554773T3
Application number: ES07843856.1T
Authority: ES
Inventors: Michael Weiss
Original assignee: Case Western Reserve University
Current assignee: Case Western Reserve University
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2027-10-04
Also published as: EP2074140A4; US8192957B2; US20100099601A1; US8501440B2; US20120316107A1; WO2008043033A2; EP2074140B1; EP2074140B8; EP2074140A2; WO2008043033A3

Abstract

Análogo de insulina que comprende un polipéptido de cadena única que contiene un polipéptido de la cadena A de la insulina y un polipéptido de la cadena B de la insulina conectado mediante un conector truncado, en donde el conector truncado es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: un polipéptido con la secuencia GGGPRR (SEQ ID NO. 19), un polipéptido con la secuencia GGPRR (SEQ ID NO. 20), un polipéptido con la secuencia GSEQRR (SEQ ID NO. 21), un polipéptido con la secuencia RREQR (SEQ ID NO. 22), un polipéptido con la secuencia RREALQKR (SEQ ID NO. 23), un polipéptido con la secuencia GAGPRR (SEQ ID NO. 24), un polipéptido con la secuencia GPRR (SEQ ID NO. 25), en donde el polipéptido de la cadena B de la insulina contiene opcionalmente uno o más de: una sustitución de aspartato en la posición correspondiente a la posición B10 de la insulina, una sustitución de lisina o aspartato en la posición correspondiente a la posición B28 de la insulina, y una sustitución de prolina en la posición correspondiente a la posición B29 de la insulina, y en donde el polipéptido de la cadena A de la insulina contiene una sustitución de histidina en la posición correspondiente a la posición position A8 de la insulina.

Description

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Aún otras sustituciones son también compatibles con los análogos de insulina de cadena única de la presente invención. Tal como se ha mencionado anteriormente, las sustituciones de His en A4, A8 y B1 se describen en la Solicitud Internacional Nº PCT/US07/00320 (WO 2007/081824). Sin desear estar sujetos a la teoría, se cree que cuando la sustitución HisB1 está presente, la cadena lateral del residuo His B1, en combinación con la cadena lateral de Histidina B5 Histidina, proporciona un sitio de unión a B1-B5 bi-Histidina Zn-, que confiere una protección de la fibrilación dependiente de Zn. De manera similar, aunque sin desear estar sujetos a la teoría, se cree que las sustituciones [HisA4, HisA8] también proporcionan un potencial sitio de unión a bi-Histidina Zn-, que además confiere protección de la fibrilación. Se prevé además que la estabilización de la insulina con zinc no afectará la actividad in vivo porque se prevé que tales estructuras de zinc-proteína se disocian en concentraciones de proteína y zinc menores de aproximadamente 1 µM. El efecto protector de la unión del zinc puede estar mediado bien mediante la unión a la estructura molecular nativa, o bien a una estructura molecular distorsionada, ya que se cree ocurre como un intermedio en el proceso de fibrilación.

También se prevé que la resistencia intrínseca de estos análogos de insulina de cadena única a la fibrilación hace innecesario formular tales análogos como hexámeros estabilizados con zinc u otros oligómeros de orden superior. Debido a que el desensamblaje del hexámero estabilizado con zinc retrasa generalmente la absorción de la insulina

: o análogos de la insulina en las actuales formulaciones, se prevé que una formulación resistente a la fibrilación de un análogo de insulina de cadena única, tal como un monómero o dímero de insulina libre de zinc conferiría una adsorción más rápida en el torrente sanguíneo a continuación de la inyección subcutánea, o más rápida absorción en la circulación portal a continuación de una administración por vía intraperitoneal mediante una bomba de insulina implantable.

Se prevé además que los análogos de insulina de cadena única de la presente invención pueden además utilizar cualquier cantidad de cambios presentes en los análogos de insulina existentes, insulinas modificadas, o dentro de diversas formulaciones farmacéuticas, tales como la insulina habitual, insulina NPH, insulina lenta o insulina ultralenta, además de la insulina humana. Los análogos de la insulina de cadena única de la presente invención pueden además contener sustituciones presentes en análogos de la insulina humana que, mientras no se utilicen clínicamente, siguen siendo útiles experimentalmente, tales como la insulina DKP, que contiene las sustituciones AspB10, LysB28 y ProB29 o la sustitución AspB9 . La presente invención no está, sin embargo, limitada a la insulina humana y a sus análogos. También se contempla que estas sustituciones puedan además ser realizadas en insulinas de origen animal tales como en insulinas porcinas, bovinas, equinas y caninas, a modo de ejemplos no limitativos. Además, en vista de la similitud entre la insulina humana y la animal, y el uso en el pasado de insulinas animales en pacientes diabéticos humanos, se prevé también que puedan introducirse otras modificaciones menores en la secuencia de la insulina, especialmente aquellas sustituciones consideradas sustituciones “conservadoras”. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones adicionales de aminoácidos dentro de grupos de aminoácidos con cadenas laterales similares, sin alejarse de la presente invención. Estos incluyen los aminoácidos hidrófobos neutrales: Alanina (Ala o A), Valina (Val o V), Leucina (Leu o L), Isoleucina (Ile o I), Prolina (Pro o P), Triptófano (Trp

: o W), Fenilalanina (Phe o F) y Metionina (Met o M). De igual manera, los aminoácidos polares neutrales pueden ser sustituidos entre sí dentro de su grupo de Glicina (Gly o G), Serina (Ser o S), Treonina (Thr o T), Tirosina (Tyr o Y), Cisteína (Cys o C), Glutamina (Glu o Q), y Asparragina (Asn o N). Se considera que los aminoácidos básicos incluyen Lisina (Lys o K), Arginina (Arg o R) e Histidina (His o H). Los aminoácidos ácidos son el ácido Aspártico (Asp o D) y el ácido glutámico (Glu o E). En un ejemplo, el análogo de la insulina de la presente invención contiene tres o menos sustituciones conservadoras distintas del conector modificado de la presente invención. En otro ejemplo, el análogo de insulina de la presente invención contiene uno o menos sustituciones conservadoras distintas del conector modificado de la presente invención.

Se proporciona la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana, con propósitos de comparación, como SEQ. ID. NO. 1. Se proporciona la secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana como SEQ. ID. No. 2. Se proporciona la secuencia de aminoácidos de la cadena B de la insulina humana, con propósitos de comparación, como SEQ. ID. NO. 3. Se muestra la secuencia de aminoácidos de una insulina humana de cadena única, según se describe en la presente patente, como SEQ. ID. NO. 4, donde Xaa representa cualquier aminoácido. En diversos ejemplos, el conector representado por Xaa puede ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos de longitud. En un ejemplo, el conector comprende aminoácidos naturales que inmediatamente flanquean las cadenas A y B laterales. Las SEQ. ID. NOS. 5-14 proporcionan secuencias en las que el conector comprende aminoácidos en sus localizaciones naturales en la proinsulina. Expresado de otro modo, el conector natural de la proinsulina está truncado en diversas cantidades, dejando aminoácidos naturales inmediatamente adyacentes a las cadenas A y B de la proinsulina. En la SEQ. ID. NO. 5, están presentes los residuos de Arg que flanquean inmediatamente las cadenas A y B. En la SEQ. ID. NO. 6, están presentes los dos residuos de Arg que se encuentran normalmente adyacentes a la cadena B y los residuos de Arg y Lys que se encuentran normalmente adyacentes a la cadena A. En las SEQ. ID. NOS. 7 y 8, están presentes la secuencia de Arg-Arg-Glu que se encuentra normalmente adyacente a la cadena B, y la secuencia Gln-Lys-Arg que se encuentra normalmente adyacente a la cadena A. En la SEQ. ID. NO. 7 pueden estar presentes de manera opcional 1-4 aminoácidos adicionales. Las SEQ. ID. NOS. 9-14 proporcionan conectores de diversas longitudes, que consisten en varias secuencias que se encuentran de forma natural en la secuencia de la proinsulina.

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Los conectores truncados utilizados en los análogos de la invención, con secuencias que no se encuentran de forma natural en la insulina, son tal como sigue a continuación. La SEQ. ID. NO. 19 proporciona un conector con la secuencia Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Arg, la SEQ. ID. NO. 20 proporciona un conector con la secuencia Gly-Gly-Pro-Arg-Arg, la SEQ. ID. NO. 21 proporciona un conector con la secuencia Gly-Ser-Glu-Gln-Arg-Arg, la SEQ. ID. NO. 22 proporciona un conector con la secuencia Arg-Arg-Glu-Gln-Lys-Arg, la SEQ. ID. NO. 23 proporciona un conector con la secuencia Arg-Arg-Glu-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg, la SEQ. ID. NO. 24 proporciona un conector con la secuencia Gly-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg, la SEQ. ID. NO. 25 proporciona un conector con la secuencia Gly-Pro-Arg-Arg. Se prevé que cualquiera de estos conectores truncados pueden ser utilizados en los análogos de insulina de cadena única de la presente invención, ya sea solos o en combinación con otras sustituciones u otros cambios en la secuencia del polipéptido de insulina, tal como se señala en la presente patente.

Diversas sustituciones, incluyendo sustituciones de análogos de insulina conocidos anteriormente, pueden también estar presentes en el análogo de insulina de cadena única de la presente invención. Por ejemplo, se proporciona una secuencia de aminoácidos de un análogo de insulina de cadena única que también lleve las sustituciones LysB28 ProB29 de la insulina lispro como SEQ. ID. NO. 15. De igual manera, una secuencia de aminoácidos de un análogo de insulina de cadena única con la sustitución AspB28 de la insulina aspart, se proporciona como la SEQ. ID. NO. 16. Adicionalmente, se proporcionan ejemplos de secuencias de aminoácidos de análogos de insulina de cadena única que también tienen la sustitución AspB10 como las SEQ. ID. NOS. 17 y 18.

El aumento de actividad de la sustitución AspB10, junto con la estructura tridimensional alterada del análogo de cadena única de la presente invención proporciona un análogo de insulina que ha aumentado la actividad en comparación con la insulina natural, pero que no tiene una afinidad por el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina que sea más de dos veces superior que el de la insulina normal. La actividad de la insulina o análogo de insulina puede determinarse mediante ensayos de unión al receptor, según se describe en más detalle más adelante en la presente invención. La actividad relativa puede definirse en términos de valores ED50, la concentración de insulina o análogo de insulina sin marcar que se requiere para desplazar un 50 por ciento de la insulina humana marcada unida de forma específica, tal como insulina humana marcada radiactivamente (tal como insulina marcada con 125I) o análogo de insulina con una alta afinidad marcada radiactivamente. De manera alternativa, la actividad puede ser expresada simplemente como un porcentaje de la insulina normal. La afinidad para el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina puede determinarse también de la misma manera con el desplazamiento del IGFR que se está midiendo. En particular, resulta deseable que el análogo de insulina de cadena única tenga una actividad que sea mayor del 100 por cien de insulina, tal como 110, 120, 130, 140, 150, o 200 por cien de insulina normal o más, a la vez que presenta una afinidad para el IGFR que es menor o igual al 100 por cien de la insulina normal, tal como 90, 80, 70, 60 o 50 por cien de la insulina normal o menos. Es deseable determinar la actividad de la insulina in vitro según se describe en la presente patente, en lugar de in vivo. Se ha apreciado que in vivo, el aclaramiento de la insulina del torrente sanguíneo depende de la unión del receptor. De esta manera, los análogos de la insulina pueden mostrar una elevada actividad, incluso alcanzando aproximadamente el 100 por cien de actividad in vivo, incluso aunque son menos activos a nivel celular, debido al aclaramiento más lento del torrente sanguíneo. Sin embargo, un análogo de insulina puede aún ser útil en el tratamiento de la diabetes incluso si la actividad de unión al receptor in vitro es tan baja como un 20% debido a este aclaramiento más lento. En tales ejemplos, el análogo de insulina de cadena única tiene la secuencia de SEQ. ID. NOS. 4, 15, 16 o 17, donde los primeros aminoácidos de Xaa4-10 son aminoácidos distintos a Arg.

Se realizó un análogo de insulina de cadena única con la secuencia polipeptídica SEQ. ID. NO. 26 mediante síntesis química total, utilizando el ligamiento de un fragmento nativo mediado por tiol-éster de tres segmentos de polipéptido. Los segmentos comprendían residuos 1-6 (segmento I), 7-42 (segmento II), y 43-57 (segmento III). Cda segmento se sintetizó mediante el método de fase sólida. Los segmentos I y segmento II se prepararon mediante Nα-terc-butiloxicarbonilo con química-(Boc) en OCH2-Pam-resina (Applied Biosystems); el segmento III se preparó mediante N-α-(9-fluoronilmetoxicarbonilo con química-(Fmoc) en resina de Polietilenglicol-Poliestireno (PEG-PS) con grupos protectores de cadena única estándar. El segmento I se sintetizó como tioéster (beta-mercaptoleucina, βMp-Leu). La síntesis se comenzó a partir de Boc-Leu-OCH2-Pam resina, y la cadena peptídica se extendió por etapas hasta el residuo N-terminal. El segmento II también se sintetizó como tioéster con péptido, Arg-Arg-Gly, unido al extremo C-terminal del residuo βMp para aumentar la solubilidad del segmento. El aminoácido N-terminal, cisteína, del segmento II se protegió como tiazolidina (Thz) y se convirtió a Cisteína mediante MeONH2.HCl después del ligamiento. A continuación del ligamiento nativo, se permitió que la cadena polipeptídica en toda su longitud se plegara en una mezcla de 100 mM de glutatión (GSH) reducido, y 10 mM de glutatión oxidado (GSSG) a un pH 8,6 y sometido a purificación mediante HPLC utilizando una columna C4 (1,0 x 25 cm) en un gradiente de elución de 15 % a 35 % (A/B) durante 40 min a una tasa de flujo de 4 ml/min. Las fracciones puras correspondientes a SCI (1) se agruparon y se liofilizaron. La masa molecular prevista fue verificada mediante espectrometría de masas.

Con propósitos de comparación, se sintetizó un análogo de insulina de dos cadenas que contenía las mismas cuatro sustituciones que en los dominios A y B del análogo de cadena única anterior (HisA8, AspB10, AspB28, y ProB29). Este análogo de dos cadenas contiene por tanto una cadena A modificada de 21 residuos (SEQ. ID. NO. 29) y una cadena B modificada de 30 residuos (SEQ. ID. NO. 28), las mismas longitudes que están presentes en la insulina humana de tipo silvestre. La comparación de las propiedades del análogo de dos cadenas con la insulina humana

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aspiración, y se realizó recuento del granulado de la membrana para determinar la radiactividad. Los datos se corrigen para la unión no específica (cantidad de radiactividad restante asociada a la membrana en presencia de 1 µM de insulina humana. En todos los ensayos el porcentaje de trazador unido en ausencia de ligando competidos fue de menos del 15% para evitar la depleción de artefactos del ligando. Se realizó un ensayo adicional para monitorizar los cambios en la actividad durante el transcurso de la incubación del análogo de cadena única a 37 °C utilizando captura de anticuerpos en placa de microtitulación, según se conoce en el arte. Se incubaron placas de tiras de microtitulación (Nunc Maxisorb) durante la noche a 4 °C con AU5 IgG (100 µl/pocillo de 40 mg/ml en solución tampón de fosfatos). Los datos de unión se analizaron mediante un modelo secuencial de dos sitios. Se empleó un ensayo de anticuerpos en placa de microtitulación correspondiente utilizando el receptor de IGF de Tipo I para evaluar la unión cruzada a este receptor homólogo.

La actividad de unión al receptor del análogo de insulina de cadena única 57mer en relación a la insulina humana es 129% +/-8%, tal como se muestra en la Tabla I. La afinidad de la insulina humana, cuya afinidad es 0,05 nM bajo condiciones de ensayo, y la de la insulina DKP, se proporciona en la Tabla I con propósitos de comparación. Adicionalmente, la figura 4 ilustra un ensayo de unión al receptor en el que se evaluó la unión del análogo de insulina de cadena única 57mer (línea discontinua; triángulos) en relación a la insulina humana nativa (línea continua; cuadrados). Este ensayo mide el desplazamiento de la insulina marcada con 125I unida al receptor mediante bien un análogo o bien insulina (B/Bo) a través de un rango de concentraciones de análogo/insulina no marcados. Mientras que se ha mostrado previamente que la actividad de la mini-proinsulina se reduce en 10.000 veces, la actividad del análogo 57mer es esencialmente equivalente a la de la insulina humana de tipo silvestre. De hecho, el ligero cambio a la izquierda de la curva de desplazamiento del análogo 57mer indica un ligero aumento en la actividad biológica (129 ± 8 por ciento en cuatro réplicas).

Tabla I

Afinidad de la insulina y análogos de insulina con el receptor de la Insulina

Muestra: Afinidad (en relación a la insulina humana)

Insulina: 100 %

Insulina DKP: 161 ± 19 %

Análogo 57mer de cadena única: 129 ± 8 %

Análogo correspondiente de dos cadenas: 700 %

Estos datos indican que la afinidad de los análogos al receptor de insulina humana es tan grande o mayor que la de la insulina de tipo silvestre. Además, resulta evidente que el conector ha reducido la afinidad de un rango de superactividad (700%) a uno cercano nuevamente a la insulina humana de tipo silvestre (129 ± 8 %).

La potencia in vivo del análogo de insulina de cadena única 57mer se sometió a ensayo en ratas diabéticas que se observaron eran equivalentes a la insulina humana de tipo silvestre. Para este propósito, se volvieron diabéticas ratas Lewis macho (∼250 g de peso corporal) con estreptozotocina. La insulina humana y los análogos de insulina se purificaron mediante HPLC, se secaron hasta convertirlos en polvo, y se disolvieron en un diluyente de insulina (Eli Lilly Corp). Se inyectó a las ratas por vía subcutánea en la hora = 0 con 1,5 U/kg de peso corporal en 100 µl de diluyente. Se obtuvo sangre de la cola sujeta con pinzas en la hora 0 y cada 10 minutos hasta 90 minutos. La glucosa en sangre se midió utilizando un medidor Hypoguard Advance Micro-Draw. Se observó que las concentraciones de glucosa en sangre disminuyeron en tasas de 64,2 ± 16,9 y 62,0 ± 16,3 mg/dL por hora para la insulina humana y el análogo de insulina de cadena única 57mer, respectivamente. Estos valores son indistinguibles dentro de la variación.

La afinidad del análogo de insulina de cadena única 57mer para el receptor de IGF de tipo I es similar a la de la insulina humana; el grado de aumento de afinidad, si se encuentra presente, es menor que dos veces el de la insulina humana. Este valor es menor que el de la insulina lispro, que presenta una afinidad para el IGFR dos veces mayor que la de la insulina.

Se sometió a ensayo la mitogenicidad del análogo de insulina de cadena única 57mer en cultivo celular y se observó que era igualmente indistinguible de la insulina humana, en cada caso menos mitogénica que el IGF-I. Con esta finalidad, se cultivó la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 en una atmósfera húmeda de 5% CO2-95% aire a 37°C en un medio mínimo esencial de Eagle (MEM, Nacalai Tesque) complementado con aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio al 1%, y 2 mM de I-glutamina. Los medios de cultivo se complementaron con suero fetal bovino (FBS) al 10% (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, AA), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100ug/mL). Aproximadamente 1,0 x 105 células se sembraron en platos de 35-mm y se cultivaron hasta estar subconfluentes. Se emplearon dos ensayos: (i) Las curvas de cultivo celular se determinaron mediante

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4 °C y se ajustaron mediante mínimos cuadrados no lineales a un modelo de dos estados. Los espectros DC para los análogos fueron similares a las insulinas nativas y DKP (no se muestran los datos).

Ensayo de Fibrilación – Insulina humana y análogos se preparaon en una cantidad de 60 µM en un tampón desoxigenado que consiste en 10 mM de fosfato de sodio (pH 7,4), y 140 mM de NaCl. Las muestra (por triplicado) se colocaron en viales de cristal sellados y se colocaron en una mesa basculante automática a 37 °C. En tiempos sucesivos los alícuotas se retiraron y se analizaron mediante ensayo de espectroscopia de fluorescencia con tioflavina T (ThT) para determinar la aparición de la fibrilación como sigue a continuación.

Se preparó Tioflavina T (ThT) en una cantidad de 1 mM en agua bidestilada y se almacenó a 4 °C en la oscuridad. Para monitorizar la fibrilación, se obtuvieron 10-µl de alícuotas de las muestras en puntos de tiempo indicados y se mezclaron con 3 ml de tampón de ensayo con ThT (5 µM de ThT en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y 100 mM de NaCl). Se realizaron mediciones de la fluorescencia utilizando un espectrofluorómetro Aviv en cubetas de cuarzo de 1 cm. Se recogieron espectros de emisión de 470 a 500 nm a continuación de la excitación a 450 nm; el tiempo de integración fue de 1 segundo. Se utilizó ThT en tampón sin proteína como línea de referencia. El tiempo de retardo de la fibrilación se define como el tiempo requerido para observar un aumento del doble en la emisión de ThT. Al umbral de fluorescencia de la ThT con el doble de aumento, le sigue un rápido incremento de la turbidez asociada con un alargamiento de las fibrillas maduras y un incremento adicional de la fluorescencia de ThT. Bajo estas condiciones, la insulina humana sufre fibrilación en 3-4 días en ausencia de zinc. Los tiempos de retardo previos a la fibrilación de los análogos en una concentración de proteínas de 60 µM se proporcionan en la Tabla III. Se ha observado menos de un 1 % de fibrilación para el análogo de insulina de cadena única 57mer después de 4 meses de incubación a 37 °C.

También se ha examinado la resistencia a la fibrilación de un análogo de insulina de cadena única en una concentración más elevada. El análogo de insulina de cadena única 57mer (SEQ. ID NO. 26) se incubó a 37 °C en una concentración de proteína de 3 mM, según se describe de otro modo anteriormente. Una concentración de 3 mM es similar a la concentración que se observa en una formulación de insulina U-400 (400 U.I./ml) adecuada para su uso en una bomba de insulina implantable. Una formulación de este tipo es óptima para una bomba de insulina implantable para maximizar el tiempo entre el momento de rellenar el depósito de insulina. Sin embargo, la tasa de fibrilación de la insulina generalmente aumenta con la concentración de insulina. El 57mer resiste la fibrilación bajo estas condiciones durante más de 60 días. En comparación, bajo estas condiciones y en esta concentración, la insulina lispro(KP) forma fibrillas en aproximadamente un día.

Tabla III

Tiempos de retardo de la Fibrilación de la insulina libre de zinc y sus análogos en 60 µM

Muestra: Tiempo de retardo (días ± 10%)

Insulina: 3,5

Insulina KP: 2,0

Insulina DKP: 11,5

Insulina HisA8: 13

Insulina AspB10: 18

Insulina AspB12-DKP: 40

Insulina TrpA8-KP: 3

Análogo de cadena única 57mer: > 120

Análogo correspondiente de dos cadenas: 70 ± 5 días

Microscopía electrónica por transmisión – La presencia o ausencia de fibrillas (como un evento distinto de la precipitación o cristales amorfos) se verificó mediante MET. Se depositaron alícuotas (10 µl) en rejillas de cobre con malla de 400 recubierta con Formvar (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) durante 5 minutos. El exceso de solución fue adsorbido en papel de filtrado. Las rejillas se lavaron tres veces con agua bidestilada y tres veces con acetato de uranilo al 1% filtrado para una tinción negativa. Las rejillas coloreadas se dejaron secar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se observaron con un microscopio electrónico de transmisión Jeol 1200EX que opera con un voltaje de aceleración de 80 kV.

Se realizó una comparación adicional de un análogo de insulina de cadena única anterior con el actual análogo. Un análogo de insulina de cadena única que contiene una cadena A de insulina de tipo silvestre (SEQ. ID. NO. 2) y una

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