ES2554981T3 - Nueva inmunoterapia contra tumores neuronales y cerebrales - Google Patents

Abstract

Péptido consistente en la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.º 1.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

respuesta de los linfocitos T. Ejemplos de tales proteínas son las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano de tipo 16, que se expresan en el carcinoma de cuello uterino.

Para que las proteínas sean reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos o asociados a tumor y puedan ser empleadas como parte de un tratamiento, deben cumplir ciertos prerrequisitos. El antígeno debe ser expresado principalmente por células tumorales y no por tejidos sanos normales o, de hacerlo, debe serlo en cantidades comparativamente pequeñas. Y no sólo es conveniente que el antígeno de interés esté presente únicamente en un tipo de tumor, sino que lo esté también en altas concentraciones (número de copias del péptido por célula). Los antígenos específicos de tumor y asociados a tumor proceden a menudo de proteínas que intervienen directamente en la transformación de una célula normal en una célula tumoral a causa de su función, por ejemplo, porque intervienen en el control del ciclo celular o en la supresión de la apoptosis. Además, también las dianas ulteriores de las proteínas que son las causantes directas de la transformación pueden estar reguladas al alza y, por tanto, estar asociadas indirectamente al tumor. Tales antígenos asociados indirectamente a los tumores también pueden ser las dianas para una estrategia de vacunación (Singh-Jasuja et al., 2004). En ambos casos es esencial que la secuencia de aminoácidos del antígeno contenga epítopos, puesto que el péptido («péptido inmunogénico») derivado de un antígeno asociado a tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T en condiciones in vitro o in vivo.

Básicamente, cualquier péptido capaz de unirse a una molécula de MHC puede actuar como un epítopo de linfocito

T. Un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito T dotado del correspondiente TCR y la ausencia de tolerancia inmunitaria hacia ese epítopo en particular.

Por consiguiente, los TAA son el punto de partida para el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los métodos para identificar y caracterizar los TAA están basados, entre otros, en el uso de CTL que pueden aislarse de pacientes o de individuos sanos, o en la generación de perfiles de transcripción diferenciales o patrones de expresión peptídica diferenciales entre los tumores y los tejidos normales (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002).

No obstante, la identificación de genes sobreexpresados o expresados selectivamente en tejidos tumorales o en estirpes de células tumorales humanas no aporta información precisa acerca del uso de los antígenos transcritos de esos genes en la inmunoterapia. Ello se explica porque solo una subpoblación individual de epítopos de esos antígenos resulta adecuada para aplicaciones de ese tipo, puesto que ha de haber un linfocito T con el TCR correspondiente y la inmunotolerancia hacia ese epítopo concreto ha de ser mínima o nula. Por tanto, es importante seleccionar sólo aquellos péptidos derivados de proteínas sobreexpresadas o selectivamente expresadas que sean presentados ligados a moléculas de MHC y que sean diana de linfocitos T funcionales. Un linfocito T funcional se define como un linfocito T que tras la estimulación con un antígeno específico puede sufrir una expansión clonal y ser capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»). Las funciones efectoras habituales de los linfocitos T incluyen la secreción de interferón-gamma, perforina y granzimas.

Los linfocitos T cooperadores desempeñan un papel importante en la coordinación de la función efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T cooperadores del tipo TH1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8+, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra las células tumorales que muestran en su superficie complejos de MHC/péptido asociado a tumor. De esta forma, los epítopos de los péptidos asociados a tumores que son reconocidos por los linfocitos T cooperadores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales.

Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de los antígenos asociados a tumor que son reconocidos por los CTL CD8+ (ligando: moléculas de MHC de clase I + epítopo peptídico) o por los linfocitos T cooperadores CD4 positivos (ligando: moléculas de MHC de clase II + epítopo peptídico) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales.

Por tanto, la presente invención tiene como uno de sus objetos proporcionar nuevas secuencias de aminoácidos de péptidos que son capaces de unirse a complejos MHC de cualquiera de las clases.

Breve descripción de las figuras

Las Fig. 1a y b muestran los espectros resultantes de la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas ESI que identifican los péptidos asociados a tumor (TUMAP) PTP-001 de la muestra de glioblastoma GB1006 y el PTP-002 de la muestra de glioblastoma GB6003 que se presentaron de un modo restringido a MHC de clase I.

La Fig. 2 expone el perfil de expresión del ARNm del gen PTPRZ1 que codifica los péptidos asociados a glioblastoma mostrados en la Tabla 1. La expresión de este gen es nula o muy baja en los tejidos normales pero es muy elevada en las muestras de glioblastoma (GB1006T a GB1011T; NCH359T y NCH361T).

La Figura 3 expone un ejemplo representativo de los linfocitos T CD8+ específicos para PTP-002 en un

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

donante sano HLA-A*0201 tras la estimulación in vitro con PTP-002 tal y como se ha determinado con el análisis por citometría de flujo. Los linfocitos T CD8+ se aislaron de PBMC humanas de donantes sanos y sensibilizadas in vitro con «células presentadoras de antígeno artificiales» (aAPC) molecularmente definidas cargadas con moléculas co-estimuladoras y A*0201/PTP-002 (diagrama izquierdo) o un péptido A*0201 irrelevante (diagrama derecho) (Walter et al., 2003). Al cabo de tres ciclos de estimulación, las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción de los tetrámeros peptídicos PTP-002 y delos tetrámeros peptídicos irrelevantes. Las células se seleccionaron entre la población de linfocitos CD8+; los porcentajes indicados representan la frecuencia de células positivas para cada tetrámero en dicha población.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona péptidos que son útiles para el tratamiento del glioblastoma. Con técnicas de espectrometría de masas se ha demostrado directamente la presentación natural por moléculas HLA de estos péptidos en muestras de glioblastoma humano primario (véanse el ejemplo 1 y la figura 1). El gen originario del cual derivan esos péptidos –PTPRZ1– está muy sobreexpresado en el glioblastoma en comparación con los tejidos normales (véase ejemplo 2y figura 2) lo cual demuestra el alto grado de asociación con el tumor de los mismos, es decir, que esos péptidos son presentados abundantemente en el tejido tumoral pero no en los tejidos normales. Los péptidos de unión a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario, específicamente por los linfocitos T. Los linfocitos T destruyen las células que presentan el complejo HLA/péptido reconocido, p. ej. células tumorales de glioblastoma que presentan péptidos derivados del PTPRZ1. Varios péptidos de la presente invención han demostrado ser capaces de estimular las respuestas de los linfocitos T (véanse el ejemplo 3 y la figura 3). Así pues, los péptidos de la presente invención son útiles para generar en un paciente una respuesta inmunitaria con la que destruir células tumorales. La respuesta inmunitaria se puede inducir en el paciente con la administración directa de los péptidos descritos o de sustancias precursoras adecuadas (p. ej. péptidos alargados, proteínas o ácido nucleicos que codifiquen dichos péptidos), idealmente en combinación con un agente que potencie la inmunogenicidad (un adyuvante). Cabe esperar que la respuesta inmunitaria generada por esa vacunación terapéutica sea muy específica contra las células tumorales porque los péptidos diana de la presente invención no son presentados en los tejidos normales, lo cual evita el riesgo de reacciones autoinmunitarias perjudiciales contra las células normales del paciente.

Además de ser útiles para el tratamiento del cáncer, los péptidos de la presente invención también son útiles para el diagnóstico. Dado que muchos de los péptidos son generados por el glioblastoma y se ha determinado que dichos péptidos no están presentes en tejidos normales, dichos péptidos pueden ser utilizados para diagnosticar la presencia de un cáncer.

La presencia de los TUMAP reivindicados en biopsias de tejido puede ayudar al anatomopatólogo a diagnosticar un cáncer. La detección de ciertos TUMAP mediante anticuerpos, espectrometría de masas u otros métodos conocidos en la técnica puede advertir al anatomopatólogo de que el tejido es maligno o está inflamado o enfermo. La presencia de grupos de TUMAP puede permitir la clasificación o subclasificación de los tejidos enfermos.

La detección de los TUMAP en una muestra de tejido enfermo puede ayudar a decidir si los tratamientos que implican al sistema inmunitario pueden ser beneficiosos, sobre todo si se sabe o se prevé que los linfocitos T estén implicados en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo conocido con el que las células infectadas o cancerosas logran eludir la vigilancia del sistema inmunitario. Así pues, la presencia de TUMAP indica que dicho mecanismo no es utilizado por las células analizadas.

Los TUMAP pueden ser utilizados para analizar las respuestas de los linfocitos contra ellos, como son las respuestas de los linfocitos T o las respuestas de anticuerpos contra el TUMAP o el TUMAP unido a moléculas de MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden ser utilizadas como marcadores pronósticos para decidir los pasos posteriores del tratamiento. Dichas respuestas también pueden ser utilizadas como marcadores indirectos en las estrategias de inmunoterapia destinadas a estimular respuestas linfocitarias a través de diferentes medios, como, por ejemplo, la vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, materiales autólogos, o la transferencia de linfocitos de donantes. En el ámbito de la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los TUMAP pueden tenerse en cuenta para la evaluación de efectos secundarios. El control regular de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta valiosa para el seguimiento en trasplantes, por ejemplo, con el fin de detectar enfermedades del injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.

Los TUMAP pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/TUMAP. Estos pueden ser utilizados como terapia, para dirigir toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra aplicación de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o determinar el tamaño y la ubicación precisa de los tejidos enfermos.

Además se pueden utilizar para verificar el diagnóstico histopatológico de cáncer basado en una muestra de biopsia.

La Tabla 1 muestra los péptidos descritos en la presente invención, sus respectivas SEQ ID N. º, los alelos HLA a los que se unen cada uno de ellos y las proteínas originarias de las que pueden surgir dichos péptidos.

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 1: Péptidos dados a conocer

SEQ ID N. º

Código del péptido Secuencia Alelos HLA Proteína(s) originaria(s)

1

PTP-001 ALTTLMHQL A*0205 PTPRZ1

2

PTP-002 FLYKVILSL A*02 PTPRZ1

3

PTP-003 AIIDGVESV A*02 PTPRZ1

4 5 6 7 8 9 10

PTP-004 PTP-005 PTP-006 PTP-007 PTP-008 PTP-009 PTP-010 FLLPDTDGL KVFAGIPTV QQSDYSAAL TQDDYVLEV QHEGTVNIF SVFGDDNKALSK EIGWSYTGALNQKN A*02 A*02 A*02# A*02# B*38 No determinado HLA-DR PTPRZ1 PTPRZ1 PTPRZ1 PTPRZ1, PTPRG PTPRZ1 PTPRZ1 PTPRZ1

# probablemente subtipo A*205

Proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, Zeta1 (PTPRZ1, PTP-ξ)

El PTPRZ1 es un miembro de la familia de las proteínas tirosina fosfatasa de tipo receptor y codifica una proteína de membrana de un solo paso de tipo 1 dotada de dos dominios citoplasmáticos de tirosina fosfatasa, un dominio alfaanhidrasa carbónica y un dominio de fibronectina de tipo III (Wu et al., 2006), en el cáncer de mama (Perez-Pinera et al., 2007), enlos oligodendrocitos remielinizantes de las lesiones de la esclerosis múltiple (Harroch et al., 2002), y en células renales embrionarias humanas en condiciones hipóxicas (Wang et al., 2005).

Tanto la proteína como el transcrito aparecen sobreexpresados en las células del glioblastoma, hecho que promueve su migración haptotáctica (Lu et al., 2005). Asimismo, el PTRPZ1 aparece con frecuencia amplificado a nivel del ADN genómico en el glioblastoma (Mulholland et al., 2006).

Kaplan y cols. clonaron 3 genes de la PTP de tipo receptor humana, entre ellosel PTP-γ (Kaplan et al., 1990). Se ha demostrado que un alelo PTPG se pierde en 3 de 5 estirpes celulares de carcinoma renal y en 5 de una decena de muestras de carcinoma pulmonar analizadas. El ARNm de la PTP-γ se ha hallado expresado en estirpes de células renales y pulmonares pero no en varias estirpes hematopoyéticas analizadas. Así pues, el gen PTP-γ parece tener características que hacen pensar en él como en un gen supresor de tumores en el carcinoma renal y el de pulmón. Gebbinket y cols. aislaron un ADNc de ratón de 5,7 kb, que codifica un 'nuevo' miembro de la familia de las proteínas-fosfatasas de tirosina de receptor, llamado RPTPµ (Gebbink et al., 1991). El ADNc predijo una proteína de 1432 aminoácidos (sin incluir el péptido señal) con una masamolecular calculada de 161. 636 Da. Además, clonaron el homólogo humano, cuya cadena de aminoácidos presentaba una homología del 98,7% con la proteína de ratón. La proteína de ratón predicha consistía en una región extracelular de 722 aminoácidos, que albergaba 13 posibles sitios de N-glucosilación, un solo dominio transmembrana, y una parte intracelular de 688 aminoácidos que contiene dos repeticiones en tándem homólogas a los dominios catalíticos de otras fosfatasas de tirosina. El análisis por electrotransferencia de ARN reveló un solo transcrito que abundaba sobre todo en el pulmón pero también estaba presente,aunqueen cantidades mucho menores, en el cerebro y en el corazón. El gen PTPµ humano se asignó al cromosoma 18pter-qll a raíz del análisis por transferencia Southern de clones híbridos de células somáticas humanas y de ratón.

El ADNc de la PTP-ε fue aislado por Krueger y cols. (Krueger et al., 1990). La proteína de 700 aminoácidos tiene un dominio extracelular corto y dos dominios intracelulares PTPasa repetidos en tándem. En el cerebro y en el testículo de ratón se han registrado altos niveles de transcripción de PTP-e. Ambas isoformas de la PTP-ε –la isoforma de tipo receptor y transmembrana y la otra más corta, la citoplasmática– parecen proceder de un mismo gen a través de promotores y exones 5-prima alternativos.

Barnea y cols. (Barnea et al., 1993) clonaron los ADNc del gen PTP-γ humano y de ratón (designado PTP-γ por dicho grupo de investigación) a partir de genotecas de ADNc del cerebro y analizaron sus secuencias polipeptídicas predichas. Las secuencias humana (1445 aminoácidos) y de ratón (1442 aminoácidos) comparten una identidad del 95% en cuanto a secuencia de aminoácidos y predicen un dominio extracelular putativo, un solo dominio transmembrana y una región citoplasmática dotada de dos dominios catalíticos fosfastasa de tirosina en tándem. El

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

dominio extracelular contiene un segmento de 266 aminoácidos que son muy similares a la enzima anhidrasa carbónica dotada de cinc (MIM 114800), lo cual sugiere que la PTP-γ y la PTP-ξ (PTPRZ1) representan una subfamilia de 25 fosfatasas de tirosina de receptor. El gen de la PTP-γ tiene 30 exones y un tamaño aproximado de 780 kb. Es mucho más grande que los demás genes de las PTP de receptor, pues el gen CD45 (MIM 151460) ronda las 100 kb y los demás son más pequeños aún.

Otra fosfatasa de tirosina de tipo receptor, la proteína-fosfatasa de tirosina zeta (PTPRZ1) [también llamada PTP-ξ, HPTP-ZETA, HPTPZ, RPTP-BETA(β) o RPTPB] fue aislada en forma de secuencia de ADNc por dos grupos de investigación a inicios de la década de 1990. Levy y cols. (Levy et al., 1993) aislaron clones de ADNc de una genoteca de expresión de ARNm del tronco encefálico de lactante humano, y dedujeron la secuencia completa de aminoácidos de una gran proteína fosfatasa de tirosina de tipo receptor que contenía 2307 aminoácidos.

Levy descubrió que la proteína, designada por ellos como PTPβ (PTPRZ1), es una proteína transmembrana con dos dominios PTPasa citoplasmáticos y un dominio extracelular de 1616 aminoácidos. A semejanza de la PTP-γ (MIM 176886), los 266 residuos N-terminales del dominio extracelular presentan un gran similitud con los de las anhidrasas carbónicas (véase MIM 114880). El gen humano que codifica la PTPRZ1 ha sido localizado en el cromosoma 7q31. 3-q32 mediante hibridación in situ cromosómica (Ariyama et al., 1995). El análisis por electrotransferencia Northern ha demostrado que la PTP-zeta solo se expresa en el sistema nervioso central humano. Por medio de la hibridación in situ (Levy et al., 1993) localizaron la expresión en diferentes regiones del cerebro humano adulto, tales como la capa de neuronas de Purkinje del cerebelo, el giro dentado y la capa subependimaria del asta anterior del ventrículo lateral. Levy afirmó que esta era la primera fosfatasa de tirosina de mamífero cuya expresión estaba circunscrita al sistema nervioso. Además, los altos niveles de expresión en el cerebro embrionario de ratón indicaban un papel importante en el desarrollo del SNC.

Así pues, la familia de proteínas de receptores con actividad PTP ha sido caracterizada como una familia bastante diversa de receptores de membrana y de isoformas no unidas a membrana, que tienen en común una estructura dotada de un dominio citosólico PTPasa. Aunque su expresión en los tejidos fetales y embrionarios parece indicar un papel en la biología del desarrollo para estas proteínas, su cometido biológico en la salud y en la enfermedad no se conoce totalmente.

La patente de EE. UU. 6. 455. 026 señala a PTP-ξ (PTPRZ1) como una diana para el tratamiento y la visualización de tumores cerebrales. La solicitud aportaba métodos y reactivos para reconocer específicamente células tumorales cerebrales con fines terapéuticos y de diagnóstico por la imagen. Proporcionaba compuestos y composiciones basadas en la afinidad por la PTP-ξ que eran útiles para tratar tumores cerebrales en pacientes, recayendo en general dichas composiciones y compuestos en dos grupos: Compuestos conjugados que se unen a la PTP-ξ y que dotados de una fracción citotóxica inhiben el crecimiento de las células tumorales; y composiciones con compuestos que se unen a la PTP-ξ, en los que la fracción de unión a la PTP-ξ altera la función normal de ésta en la célula tumoral, inhibiendo su crecimiento.

En un primer grupo, se proporcionan compuestos conjugados que se unen a la PTP-ξ con efectos terapéuticos. Estos compuestos tienen la fórmula general α(Pz)C, en la cual α(Pz) era una o varias fracciones que se unen específicamente a la proteína-fosfatasa de tirosina humana ξ, y la C representaba una o varias fracciones citotóxicas. En formas de realización preferidas (reveladas para todos los grupos) se daba a conocer que α(Pz) era un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En un segundo grupo se proporcionaban compuestos terapéuticos que se unían a PTP-ξ y que alteraban la función normal de la PTP-ξ en las células tumorales cerebrales inhibiendo su crecimiento. Estos compuestos terapéuticos que se unen al PTPRZ1 tenían la fórmula general α(Pz), siendo α(Pz) una o varias fracciones que se unen específicamente a la proteína fosfatasa de tirosina humana ξ, y en que la unión de α(Pz) altera la función de la proteína-fosfatasa de tirosina humana ξ.

La patente de EE. UU. 7. 060. 275 B2 da a conocer variantes de empalme del PTPRZ1, vectores que incluyen esas variantes y antígenos contra diversas variantes.

En ningún ámbito de la técnica se ha considerado el uso de péptidos que se unen al MHC derivados de la PTPRZ1 como principios activos farmacéuticos para el tratamiento de tumores cerebrales.

En un primer aspecto de la misma, la presente invención proporciona pues un péptido consistente en la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.º 1.

Los péptidos de la invención tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I.

En la presente invención el término «homólogo» se refiere al grado de identidad (véase antes Identidad porcentual) entre las secuencias de dos secuencias de aminoácidos, es decir secuencias peptídicas o polipeptídicas. La susodicha «homología» se determina comparando las dos secuencias alineadas en condiciones óptimas con las secuencias a comparar. Las secuencias que se comparan en la presente memoria pueden tener una adición o deleción (por ejemplo, un hueco o similar) en la alineación óptima de las dos secuencias. La homología de secuencia se puede calcular creando una alineación con el algoritmo ClustalW, por ejemplo, (Nucleic Acid Res., 1994, 22(22): 4673 4680). También se puede usar software para el análisis de secuencias comúnmente disponible,

en concreto, Vector NTI y GENETYX o herramientas de análisis facilitadas por bases de datos públicas, como por ejemplo http://dragon.bio.purdue.edu/bioinfolinks/.

Una persona versada en la materia será capaz de valorar si los linfocitos T inducidos por una variante del péptido específico serán capaces de reaccionar con el propio péptido (Fong et al., 2001b) (Zaremba et al., 1997; Colombetti 5 et al., 2006; Appay et al., 2006).

Como se puede deducir de la bibliografía (Rammensee et al., 1997) y de las bases de datos científicas (Rammensee et al, 1999), ciertas posiciones de los péptidos de unión a HLA son normalmente residuos de anclaje que forman una secuencia central que encaja en el motivo de unión del receptor HLA, que queda definido por las propiedades polares, electrofísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas polipeptídicas que constituyen la hendidura de

10 unión. Por tanto, una persona versada en la materia sería capaz de modificar las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID N.º 1 a 10, manteniendo los residuos de anclaje conocidos, y sería capaz de determinar si tales variantes conservan la capacidad de unirse a moléculas MHC de clase I.

Aquellos residuos de aminoácidos que no contribuyen sustancialmente a las interacciones con el receptor del linfocito T pueden ser modificados sustituyéndolos por otros aminoácidos cuya incorporación no afecte

15 sustancialmente a la reactividad de los linfocitos T y no suprima la unión al MHC pertinente. Así pues, aparte de la condición dada, el péptido de la invención puede ser cualquier péptido (término en el que los inventores engloban oligopéptido y polipéptido) que incluya secuencias de aminoácidos o una porción o variante de las mismas como las dadas a conocer.

Tabla 2: Variantes y motivos de los péptidos acordes con las SEQ ID n. º 1 a 10

PTP-001

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido

A L T T L M H Q L

Variantes

V P E V I H Y

Y

F D L V V

I

K I L

M

N A

P

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PTP-002

Código del péptido F L Y K V I L S L

Variantes

M L

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y S

F

F

D Y T H

K

P T N

M

M

G

Y

S F

V

R

V

K

H

PTP-003

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

(continuación)

Código del péptido

A I I D G V E S V

Variantes

M L

L

L

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

PTP-004

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido

F L L P D T D G L

Variantes

M L

E

K

I

A G I I A E

L

Y D K L Y S

K

F T Y H

M

P N

Y

M G

V

S F

R

V

K

H

PTP-005

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido

K V F A G I P T V

Variantes

M L

L

L

E

K

I

A G I A E

L

Y P K L Y

F

P T Y T H

M

M

N

(continuación)

PTP-005

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Y

S F

V

PTP-006

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido

Q Q S D Y S A A L

Variantes

V P E V I H Y

Y

F K L V V

I

N I L

M

P A

PTP-007

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido

T Q D D Y V L E V

Variantes

V P E V I H Y L

Y

F K L V V

I

N I L

M

P A

PTP-008

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido

Q H E G T V N I F

Variantes

D

I

E M V Y K

P

V I V Y

L

A T N N

E

R K R

G

N

L

H

K

S

Es sabido que los péptidos que son presentados por MHC de clase II están compuestos por una «secuencia central»

5 dotada de un secuencia de aminoácidos que se ajusta a cierto motivo específico del alelo de HLA y, opcionalmente, de extensiones N-y/o C-terminales que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir, que se consideran irrelevantes para la interacción del péptido y todos o una parte de los clones de linfocitos T que reconocen la contrapartida natural). Las extensiones N-y/o C-terminales pueden, por ejemplo, tener entre 1 y 10 aminoácidos de longitud, respectivamente. Estos péptidos se pueden utilizar directamente para cargar las moléculas

10 MHC de clase II o bien la secuencia se puede clonar en vectores de acuerdo con la descripción ofrecida abajo en la presente memoria. Dado que estos péptidos constituyen el producto final del procesamiento de péptidos más grandes en el interior de la célula, también pueden utilizarse péptidos más largos. Los péptidos descritos pueden tener cualquier tamaño, pero normalmente suelen tener un peso molecular inferior a 100.000, preferiblemente

10

15

20

25

30

inferior a 50.000, más preferiblemente inferior a 10.000 y normalmente unos 5.000. En cuanto al número de residuos de aminoácidos, los péptidos descritos pueden tener menos de 1.000 residuos, preferiblemente menos de 500 residuos, más preferiblemente menos de 100, más preferiblemente menos de 100 y aún más preferiblemente entre 30 y 8 residuos.

En consecuencia, las variantes naturales o artificiales que estimulan la reacción cruzada de los linfocitos T con un péptido de la invención son a menudo variantes de longitud.

Si un péptido que es más largo de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos se utiliza directamente para unirse a una molécula MHC de clase II, es preferible que los residuos que flanquean la región de unión a HLA central sean residuos que no afecten sustancialmente a la capacidad del péptido para unirse específicamente a la hendidura de unión de la molécula MHC de clase II o presentar el péptido al linfocito T (cooperador). No obstante, como se ha indicado arriba, se apreciará que es posible usar péptidos más grandes, p. ej., los codificados por un polipéptido, ya que estos péptidos más grandes pueden ser fragmentados por células presentadoras de antígeno adecuadas.

También es posible que los epítopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 10 aminoácidos de longitud, sean generados por el procesamiento de péptidos más largos o proteínas que incluyen el epítopo real. Se prefiere que los residuos que flanquean el epítopo de interés sean residuos que no afecten sustancialmente a la digestión proteolítica necesaria para exponer el epítopo durante el procesamiento.

Por supuesto, el péptido conforme a la presente invención tendrá la capacidad para unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I.

La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC puede ser analizada mediante métodos conocidos en la técnica, como, por ejemplo, los descritos en la bibliografía para diferentes alelos de MHC de clase II (p. ej. ,(Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins et al., 1993; Boyton et al., 1998)).

El péptido de la invención consiste en una secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID n. º

1.

En una forma de realización de la presente invención, el péptido es parte de una proteína de fusión que comprende los 80 aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo “Ii”) tal y como aparece en el NCBI, número de acceso de GenBank X00497 (Strubin, M. et al 1984).

Ejemplos descritos en mayor detalle corresponden a casos en que el péptido es seleccionado entre péptidos dotados de un subtipo de HLA específico y es capaz de estimular linfocitos CD8, y en que dicho péptido comprende el motivo de aminoácidos de anclaje específico mostrado a continuación en la tabla 2a.

Tabla 2a Subtipos HLA y motivos de anclaje de los péptidos preferidos

Péptido

Subtipo HLA Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1

A*0205 Código del péptido A L T T L M H Q L

Motivo de anclaje

x L x x x x x x L

2

A*02 Código del péptido F L Y K V I L S L

Motivo de anclaje

x L x x x x x x L

3

A*02 Código del péptido A I I D G V E S V

Motivo de anclaje

x I x x x x x x V

4

A*02 Código del péptido F L L P D T D G L

Motivo de anclaje

x L x x x x x x L

5

A*02 Código del péptido K V F A G I P T V

Motivo de anclaje

x V x x x x x x V

5

10

15

20

25

30

35

40

(continuación

Péptido

Subtipo HLA Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

6

A*02 (probable-mente subtipo A*205) Código del péptido Q Q S D Y S A A L

Motivo de anclaje

x Q x x x x x x L

7

A*02 (probable-mente subtipo A*205) Código del péptido T Q D D Y V L E V

Motivo de anclaje

x Q x x x x x x V

8

B*38 Código del péptido Q H E G T V N I F

Motivo de anclaje

x H E x x x x x F

X

A*02 Motivo de anclaje general para los péptidos x L/I/V x x x x x x L/V

En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino que el enlace peptídico está invertido. Estos peptidomiméticos retro-inversos pueden sintetizarse con métodos conocidos en la técnica, como, por ejemplo, los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Esta estrategia implica la síntesis de seudopéptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere y cols. (1997) demuestran que estos seudopéptidos resultan útiles para la unión al MHC y las respuestas de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteolisis.

Enlaces no peptídicos son, por ejemplo: -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos 4. 897. 445 proporciona un método para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas polipeptídicas que implica la obtención de polipéptidos con procedimientos estándar y la síntesis del enlace no peptídico mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en presencia de NaCNBH3.

Péptidos que comprenden las secuencias descritas arriba pueden ser sintetizados con otros grupos químicos añadidos en los extremos amino y/o carboxi, con el fin de mejorar, por ejemplo, la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la afinidad de los péptidos. Por ejemplo, grupos hidrofóbicos como los grupos carbobenzoxilo, dansilo, o tbutiloxicarbonilo pueden añadirse a los extremos amino de los péptidos. De manera similar, se puede colocar un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo en los extremos amino de los péptidos. Asimismo, p. ej., el grupo hidrofóbico t-butiloxicarbonilo, o un grupo amido pueden ser añadidos en los extremos carboxi de los péptidos.

Adicionalmente, los péptidos descritos pueden ser sintetizados de tal modo que se altere su configuración estérica. Por ejemplo, puede utilizarse el D-isómero de uno o más de los residuos de aminoácidos del péptido en lugar del Lisómero habitual. Y aún más, al menos uno de los residuos de aminoácidos de los péptidos de la invención puede ser sustituido por uno de los consabidos residuos de aminoácidos no naturales. Alteraciones como éstas pueden servir para aumentar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la capacidad de unión de los péptidos descritos de la invención.

De manera similar, un péptido descrito puede ser modificado químicamente mediante la reacción con aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Ejemplos de tales modificaciones son bien conocidos en la técnica y aparecen resumidos, por ejemplo, en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005. La modificación química de aminoácidos incluye, sin ánimo limitativo, la modificación por acilación, amidinación, piridoxilación de lisina, alquilación reductora, trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), transformación de grupos carboxilo en grupos amida y oxidación del grupo sulfhidrilo con ácido perfórmico para convertir la cisteína en ácido cisteico, formación de derivados mercuriales, formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol, reacción con maleimida, carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida y carbamoilación con cianato a pH alcalino, aunque sin limitación a ello. A este respecto, se remite a las personas versadas en la técnica al capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000), donde hallarán una metodología más extensa relacionada con la modificación química de proteínas.

En resumen, la modificación de, p. ej., los residuos arginilos de las proteínas se basa a menudo en la reacción de

imagen7

imagen8

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

ofrece Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU. Un ejemplo de vector de expresión inducible para mamífero es el pMSG, también suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmídicos de levadura son pRS403-406 y pRS413-416, en general proveídos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centroméricos de levadura (Ycp). Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo, de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresión transitoria

o estable, expresión en el citoplasma o secreción, y marcaje de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la detección.

La potente región reguladora promotora del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresión constitutiva de la proteína muy elevados, de hasta 1 mg/l en células COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de proteínas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicación del SV40 genera niveles elevados de replicación del ADN en células COS que toleran la replicación del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicación en células bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la selección por resistencia a la ampicilina, hGH poliA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia líder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secreción de las proteínas de fusión FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos ANTI-FLAG, resinas y placas. En la técnica se conocen otros vectores y sistemas de expresión aptos para el uso con una variedad de células hospedadoras.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora aislada que no es una célula madre embrionaria humana, transformada con un vector polinucleotídico de la presente invención. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células bacterianas pueden ser las células hospedadoras procariotas más adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como, por ejemplo, las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE. UU., y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EE. UU. (N. º ATCC 31343). Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de ratón, rata, mono o ser humano. Las células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general están disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California 92037, EE. UU. Las células hospedadoras de mamífero preferidas incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las células COS-1 de riñón de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las células 293 que son células renales embrionarias humanas. Las células de insecto preferidas son las células Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresión baculovíricos. Se puede encontrar una revisión general referente a la elección de las células hospedadoras más adecuadas, por ejemplo, en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols”, Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliografía conocida por las personas versadas en la materia.

La transformación de las células hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente invención se consuma con métodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformación de células hospedadoras procariotas, véanse, por ejemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. La transformación de células de levadura aparece descrita en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. El método de Beggs (1978) Nature 275,104-109 también resulta útil. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo, el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o transfección de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.

Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente invención, se pueden identificar con técnicas bien conocidas, como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.

Se apreciará que ciertas células hospedadoras de la invención son útiles para la preparación de péptidos de la invención, por ejemplo, las células bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos métodos terapéuticos pueden ser útiles otras células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar células presentadoras de antígeno como las células dendríticas para expresar los péptidos de la invención de tal forma que puedan ser cargados en las moléculas MHC oportunas. Así pues, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la invención.

En una forma de realización preferida la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP) son en la actualidad objeto de investigación como tratamiento contra el cáncer de próstata (Sipuleucel–T) (Small EJ et al 2006; Rini et al 2006).

Otro aspecto más de la invención proporciona un método para la producción de un péptido, comprendiendo dicho

imagen9

imagen10

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

la técnica e incluyen los identificados en la presente invención.

En un aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 15 y más preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o trece péptidos. Los péptidos pueden derivar de uno o más TAA específicos y se pueden unir a moléculas MHC de clase I y/o II.

El polinucleótido puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o un sistema de liberación adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, ARN o una combinación de los mismos. Los métodos para diseñar e introducir ese ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede consultar una revisión general, por ejemplo, en Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, o A Mahdavi 2006. Las vacunas polinucleotídicas son fáciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberación adecuados incluyen los de ADN y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunales, retrovirus, herpesvirus, virus adeno-asociados o híbridos que contienen elementos de varios virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos que son bien conocidos como técnicas para la introducción de ADN. Los métodos de introducción físicos, como la «pistola génica», también pueden utilizarse. El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico pueden ser una proteína de fusión, por ejemplo, con un epítopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto tal y como se ha indicado antes.

El medicamento de la invención también puede incluir uno o varios adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que potencian o estimulan de forma inespecífica la respuesta inmunitaria (p. ej., respuestas inmunitarias mediadas por CTL y linfocitos T cooperadores (TH) contra un antígeno, y podrían ser considerados útiles en el medicamento de la presente invención. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen, entre otros: 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax®, AS15, BCG, CP-870. 893, CpG7909, CyaA, dSLIM, ligandos de flagelina o TLR5 derivados de flagelina, ligando de FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), ImuFact IMP321, interferón alfa o beta o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, lípido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartículas de PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, extractos de micobacterias y miméticos sintéticos de la pared bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil

o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el adyuvante de Freund o el GM-CSF. Con anterioridad se han descrito varios adyuvantes inmunológicos (p. . ej., MF59) específicos para las células dendríticas, así como la preparación de los mismos (Dupuis M et al 1998; Allison 1998). También se pueden usar citocinas. A varias citocinas se las ha atribuido una influencia directa en la migración de las células dendríticas hacia los tejidos linfoides (p. ej., el TNF-α), como parte de un proceso que acelera su maduración hasta convertirlas en células presentadoras de antígeno de los linfocitos T (p. ej., GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Patente de EE. UU. n. º 5. 849. 589, incorporada íntegramente a la presente memoria como referencia) y en el que actúan como inmunoadyuvantes (p. ej., la IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al 1996).

También se ha descrito que los oligonucleótidos de CpG inmunoestimuladores potencian los efectos de los adyuvantes en vacunas. Sin limitarse a la teoría, los oligonucleótidos de CpG actúan activando el sistema inmunitario innato (no adaptativo) a través de los receptores de tipo Toll (TLR), principalmente el TLR9. La activación del TLR9 desencadenada por los CpG potencia las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno contra una amplia gama de antígenos, incluidos antígenos peptídicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas de células autólogas y conjugados de polisacáridos, tanto en vacunas profilácticas como terapéuticas. Más importante aún, potencian la maduración y la diferenciación de las células dendríticas, lo cual resulta en una mayor activación de los linfocitos TH1 y una generación más potente de linfocitos T citotóxicos (CTL), incluso sin la ayuda de los linfocitos T CD4. La tendencia hacia la respuesta TH1 provocada por la estimulación del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacunales como el aluminio o el adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueven un sesgo hacia la respuesta TH2. Los oligonucleótidos de CpG muestran incluso una mayor actividad adyuvante cuando se formulan o administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones de lípidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmunitaria y permiten reducir las dosis de antígeno aproximadamente en dos órdenes de magnitud, habiendo obtenido en algunos experimentos respuestas de anticuerpos comparables a las conseguidas con la dosis completa de vacuna sin CpG (Krieg et al. 2006). La patente de EE. UU. n. º 6. 406. 705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes sin ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención es un antagonista CpG del TLR9 conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlín, Alemania). También se pueden utilizar otras moléculas que se unen a los TLR como ARN que se unen a TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.

Entre los ejemplos de adyuvantes útiles también se incluyen, sin limitación, CpG modificados químicamente (p. ej., CpR, Idera), análogos de ARNdc como poli(I:C) y AmpliGen, ARN o ADN bacteriano sin CpG, así como anticuerpos y moléculas pequeñas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo,

imagen11

10

15

20

25

30

35

una columna microcapilar de sílice fundido (75 µm d. i. x 250 mm) rellena con material de fase inversaC18 de 1,7 µm (Waters) aplicando un caudal de 400 nl por minuto. Posteriormente los péptidos se separaron con un gradiente binario de 180 minutos en dos fases con 10% al 33% de B con un caudal de 300 nl por minuto. El gradiente estaba compuesto por solvente A (ácido fórmico al 0,1% en agua) y solvente B (ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo). Para la introducción en la fuente de micro-ESI se empleó un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap se hizo operar en el modo dependiente de datos con el método TOP5. En resumen, se inició un ciclo de barrido con un barrido completo de alta precisión de masa en el orbitrap (R = 30 000), al que siguieron barridos EM/EM también en el orbitrap (R = 7500) con los 5 iones precursores más abundantes y exclusión dinámica de los iones preseleccionados. Los espectros de masas en tándem se interpretaron con SEQUEST y control manual adicional. La secuencia del TUMAP identificada se confirmó comparando el patrón de fragmentación generado por el TUMAP natural con el patrón de fragmentación de un péptido de referencia sintético de secuencia idéntica. Las Figuras 1a y b muestran espectros de ejemplo de varios TUMAP asociados a MHC de clase I obtenidos de tejido tumoral.

Tabla 3: Lista de muestras de tumores en las que se identificaron los péptidos

SEQ ID N.º

Código del péptido Procedencia de los tumores

1

PTP-001 GB1006T, GB1012T

2

PTP-002 GB1023T, GB6003T

3

PTP-003 081012T, GB1014T, GB1020T, GB1021T, GB1023T, GB1026T, GB6003T, GB6010T, GB6015T, GB6016T, GB6019T

4 5 6 7

PTP-004 PTP-005 PTP-006 PTP-007 GB1023T, GB6010T GB6010T GB1012T GB1023T, GB6010T

8 9 10

PTP-008 PTP-009 PTP-0010 NCH361T GB6003T GB6010T

EJEMPLO 2

Perfiles de expresión de genes que codifican los péptidos de la invención

No todos los péptidos identificados como presentes en la superficie de las células tumorales a través de las moléculas MHC son adecuados para la inmunoterapia, porque la mayoría de ellos proceden de proteínas celulares normales que se expresan en multitud de tipos de células. Muy pocos de esos péptidos están asociados a tumores y probablemente sean capaces de estimular los linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento contra el tumor del cual derivan. A fin de descubrirlos y de minimizar el riesgo de que la vacuna genere autoinmunidad los inventores se centraron en los péptidos derivados de proteínas que aparecen sobreexpresadas en las células tumorales en comparación con la mayoría de los tejidos normales.

El péptido ideal sería el derivado de una proteína que sea exclusiva del tumor y no esté presente en ningún otro tejido. Para identificar los péptidos que derivaban de genes dotados con un perfil de expresión similar al ideal los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y después a los genes originarios y se generaron los perfiles de expresión de dichos genes.

Fuentes de ARN y preparación

Las muestras de tejido extirpado fueron facilitadas por dos centros clínicos (véase Ejemplo 1); todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido tumoral se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y se homogeneizaron a mano en un mortero con nitrógeno líquido. El ARN total se preparó a partir de estas muestras con TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y después se purificaron con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos métodos se efectuaron siguiendo las

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

instrucciones del fabricante.

El ARN total procedente de tejidos humanos sanos se obtuvo por canales comerciales (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Ámsterdam, Holanda; BioChain, Hayward, CA, EE. UU.). El ARN de varios individuos (de 2 a 123 individuos) se mezcló de tal modo que el ARN de cada uno de ellos estuviera representado en la misma proporción. Cuatro voluntarios sanos donaron sangre de la que se extrajeron los leucocitos.

La calidad y la cantidad de las muestras de ARN se valoró con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) y el RNA 6000 Pico Lab Chip Kit (Agilent)

Experimentos con micromatrices

El análisis de la expresión génica de todas las muestras de ARN de tejido tumoral y normal se efectuó con micromatrices oligonucleotídicas Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2. 0 (Affymetrix, Santa Clara, California, EE. UU.). Todos los pasos se llevaron a cabo siguiendo el manual de Affymetrix (http://www. affymetrix. com/support/technical/manual/expression_manual. affx). En resumen, a partir de 5–8 µg de ARN total se sintetizó ADNc bicatenario con SuperScript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) siguiendo las indicaciones del manual. La transcripción in vitro se llevó a cabo con el BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EE. UU.) en el caso de las matrices U133A y con el GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) en el de las matrices U133 Plus 2.0, y después se procedió a la fragmentación del ARNc, a su hibridación y tinción con estreptavidina-ficoeritrina y un anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Las imágenes se analizaron con el Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) o con el Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), y los datos se analizaron con el software GCOS (Affymetrix), aplicando los ajustes preprogramados en todos los parámetros. Para la normalización se utilizaron 100 genes constitutivos (Housekeeping) suministrados por Affymetrix (http://www. affymetrix. com/support/technical/mask_files. affx). Los valores de expresión relativa se calcularon a partir de los ratios logarítmicos de la señal dados por el software y la muestra normal se ajustó de forma arbitraria en 1,0.

El perfil de expresión del gen del que deriva el péptido de la presente invención (PTPRZ1) muestra una elevada expresión en el tejido tumoral del glioblastoma, mientras que el gen no se expresa o lo hace muy poco en los tejidos normales (Fig. 2).

EJEMPLO 3

Inmunogenicidad in vitro de los péptidos presentados por MHC de clase I

Sensibilización in vitro de los linfocitos T CD8+

Para llevar a cabo las estimulaciones in vitro con células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) cargadas con un complejo péptido-MHC (pMHC) y anticuerpo anti-CD28, los inventores aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capas leucocíticas HLA-A*02+ frescas por medio de un medio de separación en gradiente de densidad ordinario (PAA, Cölbe, Alemania). Las capas leucocíticas procedían del Katharinenhospital de Stuttgart. Las PBMC aisladas se incubaron hasta el día siguiente con medio para linfocitos T (TCM) para la sensibilización humana in vitro. El medio consistía en RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) suplementado con suero AB humano termoinactivado al 10% (PAA, Cölbe, Alemania), penicilina 100 U/ml/estreptomicina 100 µg/ml (Cambrex, Verviers, Bélgica), piruvato sódico 1 mM (CC Pro, Neustadt, Alemania) y gentamicina 20 µg/ml (Cambrex). Los linfocitos CD8+ se aislaron con un kit de selección positiva MACS para CD8+ (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD8+ obtenidos se incubaron hasta su uso en TCM suplementado con IL-7 2,5 ng/ml (PromoCell, Heidelberg, Alemania) e IL-2 10 U/ml (Chiron, Munich, Alemania). La fabricación de las microperlas recubiertas de pMHC/anti-CD28, las estimulaciones de los linfocitos T y las lecturas se llevaron a cabo del modo descrito por otros (Walter et al., 2003) con pequeñas modificaciones. En suma, con el método descrito por (Altman et al., 1996) se sintetizaron moléculas recombinantes y biotiniladas de HLA-A*0201 desprovistas del dominio transmembrana y biotiniladas en el extremo carboxi de la cadena pesada. El anticuerpo coestimulador purificado Ab 9. 3, una IgG2a de ratón anti-CD28 humana (Jung et al., 1987) se biotiniló químicamente con sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las microperlas utilizadas consistían en partículas de poliestireno de 5,60 µm recubiertas de estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EE. UU.). Los complejos pMHC usados como controles positivo y negativo fueron A*0201/MLA-001 (péptido ELAGIGILTV de Melan-A/MART-1modificado) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5), respectivamente.

Se tapizaron placas de 96 pocillos con 800. 000 microperlas/200 µl en presencia de 600 ng de anti-CD28 biotinilado más 200 ng de pMHC-biotina relevante (microperlas de alta densidad) o de 2 ng del relevante más 200 ng de MHC irrelevante (genoteca de pMHC) (microperlas de baja densidad). Las estimulaciones se iniciaron en placas de 96 pocillos en las que se incubaron simultáneamente 1x106 linfocitos T CD8+ con 2x105 microperlas recubiertas y lavadas en 200 µl de TCM suplementado con IL-12 5 ng/ml (PromoCell) durante 3-4 días a 37 °C. La mitad del medio se renovó con TCM fresco suplementado con IL-2 80 U/ml y la incubación continuó otros 3-4 días a 37 °C. Este ciclo de estimulación se efectuó en total tres veces. Por último, se llevarán a cabo análisis tetraméricos de los

10

15

20

25

30

35

40

45

tetrámeros de MHC fluorescentes (producidos del modo descrito por (Altman et al., 1996) más anticuerpo CD8-FITC del clon SK1 (BD, Heidelberg, Alemania) en un citómetro LSR II FACSCalibur (BD). Las células específicas de péptido se calcularon en forma de porcentaje respecto al total de linfocitos T CD8+. La evaluación del análisis tetramérico se hizo con el programa FCS Express (De Novo Software). La sensibilización in vitro de los linfocitos CD8+ tetrámero+ específicos se detectó aplicando el acotamiento de subpoblaciones (gating) adecuado y comparando los resultados con las estimulaciones del control negativo. La inmunogenicidad para un antígeno dado quedaba confirmada si al menos un pocillo estimulado in vitro y evaluable de un donante sano contenía una línea de linfocitos T CD8+ específica después de la estimulación in vitro (esto es, el pocillo contenía al menos un 1% de tetrámero+ específico entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células tetrámero+ específicas era al menos 10x de la mediana de las estimulaciones del control negativo).

En la Figura 3 se expone una tinción representativa que muestra la generación de estirpes de linfocitos T específicas para PTP-002 y PTP-001. Los resultados se resumen a continuación en la tabla 4.

Tabla 4: Inmunogenicidad in vitro de péptidos, PTP-001 es de la invención

Antígeno

Inmunogenicidad detectada Donantes positivos/donantes analizados Pocillos positivos/ pocillos analizados

PTP-001

sí 6 / 6 (100%) 33 / 96 (34%)

PTP-002

sí 3 / 4 (50%) 9 / 48 (17%)

Aquí se resumen los resultados de los experimentos de inmunogenicidad in vitro llevados a cabo por los inventores y por el solicitante immatics, que muestran el porcentaje de donantes analizados y de pocillos que han resultado positivos. Los resultados mostrados han sido obtenidos con la estimulación de linfocitos CD8+ con microperlas de alta densidad. La variabilidad de los lotes de suero humano puede influir mucho en los resultados de las pruebas de inmunogenicidad, por lo que solo se evaluaron los ensayos en que se usó un único lote de suero.

Lista de referencias citadas

Allison AC 1998; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand.; 92:3-11.

Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, Heyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM (1996).

Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274, 94-96.

Appay V, Speiser DE, Rufer N, Reynard S, Barbey C, Cerottini JC, Leyvraz S, Pinilla C, Romero P (2006). Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide. Eur. J Immunol. 36, 1805-1814.

Ariyama T, Hasegawa K, Inazawa J, Mizuno K, Ogimoto M, Katagiri T, Yakura H (1995). Assignment of the human protein tyrosine phosphatase, receptor-type, zeta (PTPRZ) gene to chromosome band 7q31.3. Cytogenet. Cell Genet. 70, 52-54.

Barnea G, Silvennoinen O, Shaanan B, Honegger AM, Canoll PD, D’Eustachio P, Morse B, Levy JB, Laforgia S, Huebner K, . (1993). Identification of a carbonic anhydrase-like domain in the extracellular region of RPTP gamma defines a new subfamily of receptor tyrosine phosphatases. Mol. Cell Biol. 13, 1497-1506.

Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM (1998). Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice. Int. Immunol. 10, 1765-1776.

Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F.(2004) From production of peptides in milligram amounts for research to multiton quantities for drugs of the future Curr Pharm Biotechnol. Feb; 5(1):29-43

Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Møller M, Eriksen JA, Gaudernack G (2006); Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother.; 55(12):1553-1564

Burton EC, Prados MD (2000). Malignant gliomas. Curr. Treat. Options. Oncol 1, 459-468.

CBTRUS. Primary Brain Tumors in the United States, Statistical Report. 2006. Ref Type: Internet Communication Cheever MA, Chen W, Disis ML, Takahashi M, Peace DJ (1993). T-cell immunity to oncogenic proteins including mutated ras and chimeric bcr-abl. Ann N. Y. Acad. Sci. 690, 101-112.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Colombetti S, Basso V, Mueller DL, Mondino A (2006). Prolonged TCR/CD28 engagement drives IL-2-independent T cell clonal expansion through signaling mediated by the mammalian target of rapamycin. J Immunol. 176, 2730-2738.

Cresswell P (1994). Assembly, transport, and function of MHC class II molecules. Annu. Rev. Immunol. 12, 259-293.

Dazzi C, Cariello A, Giannini M, Del DM, Giovanis P, Fiorentini G, Leoni M, Rosti G, Turci D, Tienghi A, Vertogen B, Zumaglini F, De GU, Marangolo M (2000). A sequential chemo-radiotherapeutic treatment for patients with malignant gliomas: a phase II pilot study. Anticancer Res. 20, 515-518.

Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S (2006). Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas. Clin Cancer Res. 12, 4163-4170.

Dix AR, Brooks WH, Roszman TL, Morford LA (1999). Immune defects observed in patients with primary malignant brain tumors. J Neuroimmunol. 100, 216-232.

Dudley ME, Wunderlich JR, Robbins PF, Yang JC, Hwu P, Schwartzentruber DJ, Topalian SL, Sherry R, Restifo NP, Hubicki AM, Robinson MR, Raffeld M, Duray P, Seipp CA, Rogers-Freezer L, Morton KE, Mavroukakis SA, White DE, Rosenberg SA (2002). Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 298, 850-854.

Dudley ME, Wunderlich JR, Yang JC, Sherry RM, Topalian SL, Restifo NP, Royal RE, Kammula U, White DE, Mavroukakis SA, Rogers LJ, Gracia GJ, Jones SA, Mangiameli DP, Pelletier MM, Gea-Banacloche J, Robinson MR, Berman DM, Filie AC, Abati A, Rosenberg SA (2005). Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 23, 2346-2357.

Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM (1998); Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol.; 186(1):18-27

Falk,K., Rotzschke,O., Stevanovic,S., Jung,G. & Rammensee,H.G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 351, 290-296 (1991)

Fong L, Brockstedt D, Benike C, Wu L, Engleman EG (2001a). Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. J. Immunol. 166, 4254-4259.

Fong L, Hou Y, Rivas A, Benike C, Yuen A, Fisher GA, Davis MM, Engleman EG (2001b). Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 8809-8814.

Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418

Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pages C, Tosolini M, Camus M, Berger A, Wind P, Zinzindohoue F, Bruneval P, Cugnenc PH, Trajanoski Z, Fridman WH, Pages F (2006). Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313, 1960-1964.

Gattinoni L, Powell DJ, Jr., Rosenberg SA, Restifo NP (2006). Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat. Rev. Immunol. 6, 383-393.

Gebbink MF, van E, I, Hateboer G, Suijkerbuijk R, Beijersbergen RL, Geurts van KA, Moolenaar WH (1991). Cloning, expression and chromosomal localization of a new putative receptor-like protein tyrosine phosphatase. FEBS Lett. 290, 123-130.

Gnjatic S, Atanackovic D, Jager E, Matsuo M, Selvakumar A, Altorki NK, Maki RG, Dupont B, Ritter G, Chen YT, Knuth A, Old LJ (2003). Survey of naturally occurring CD4+ T cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: correlation with antibody responses. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 8862-8867.

Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F (1995). Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association. J Exp. Med 181, 1847-1855.

Hanada K, Yewdell JW, Yang JC (2004). Immune recognition of a human renal cancer antigen through posttranslational protein splicing. Nature 427, 252-256.

Harroch S, Furtado GC, Brueck W, Rosenbluth J, Lafaille J, Chao M, Buxbaum JD, Schlessinger J (2002). A critical role for the protein tyrosine phosphatase receptor type Z in functional recovery from demyelinating lesions. Nat. Genet. 32, 411-414.

imagen12

imagen13

Claims (1)

1. imagen1