ME02267B - Nova imunoterapija protiv tumora nervnih ćelija i mozga - Google Patents

Description

Opis pronalaska

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane citotoksične T ćelije (CTL), samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima koji predstavljaju aktivne farmaceutske sastojke smeše za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore. Predmetni pronalazak odnosi se na novu peptidnu sekvencu dobijenu iz HLA molekula klase l humanih tumorskih ćelija koja može da se koristi u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora.

Osnovne informacije o pronalasku

Gliomi su moždani tumori koji potiču od glijalnih ćelija u nervnom sistemu. Glijalne ćelije, koje se obično nazivaju neuroglija ili jednostavno glija, su ne-neuronske ćelije koje obezbeđuju potporu i ishranu, održavaju homeostazu, obrazuju mijelin i učestvuju u prenošenju signala u nervnom sistemu. Dve najvažnije podgrupe glioma su astrocitomi i oligodendrogliomi, koji su dobili naziv u skladu sa vrstom normalnih glijalnih ćelija iz kojih vode poreklo (astrociti, odnosno oligodendrociti). Pripadajući podgrupi astrocitoma, glioblastoma multiforme (koji se u daljem tekstu naziva glioblastom) najčešći je maligni tumor mozga kod odraslih i čini približno 40% svih malignih tumora mozga i približno 50% glioma (CBTRUS, 2006). On vrši agresivnu invaziju centralnog nervnog sistema i rangiranje najvećim stepenom malignosti (gradus IV) među svim gliomima. Iako postoji konstantan napredak u njihovom lečenju zbog napredaka u neuroimidžingu, mikrohirurgiji, raznovrsnim opcijama lečenja, kao što su temozolomid i zračenje, glioblastomi ostaju neizlečivi (Macdonald, 2001; Burton and Prados, 2000; Prados and Levin, 2000). Stopa smrtnosti ovog tumora mozga je veoma visoka: prosečan očekivani životni vek iznosi 9 do 12 meseci nakon prvog postavljanja dijagnoze. Stopa petogodišnjeg preživljavanja između 1986. i 1990. godine iznosila je 8,0%. Do danas, stopa petogodišnjeg preživljavanja nakon agresivne terapije koja obuhvata opsežnu resekciju tumora je i dalje manja od 10% (Burton and Prados, 2000; Nieder et al., 2000; Napolitano et al., 1999; Dazzi et al., 2000). U skladu sa navedenim, postoji snažna medicinska potreba za alternativnim i efikasnim terapijskim metodom.

Tumorske ćelije glioblastoma su najnediferenciranije ćelije među tumorima mozga, tako da tumorske ćelije imaju visok potencijal za migraciju i proliferaciju i visoko su invazivne, što za posledicu ima veoma lošu prognozu. Glioblastomi dovode do smrtnog ishoda zbog brzog, agresivnog i infiltrativnog rasta u mozgu. Infiltrativni obrazac rasta je odgovoran za neresektabilnu prirodu ovih tumora. Glioblastomi su takođe relativno rezistentni na zračenje i hemioterapiju, te su zato stope postterapijske rekurencije visoke. Pored toga, imunski odgovor na neoplastične ćelije je prilično neefikasan u kompletnoj eradikaciji svih neoplastičnih ćelija nakon resekcije i zračne terapije (Roth and Weller, 1999; Dix et al., 1999; Sablotzki et al., 2000).

Glioblastom se klasifikuje kao primami glioblastom (de novo) i sekundarni glioblastom, u zavisnosti od razlika u genskom mehanizmu tokom maligne transformacije nediferenciranih astrocita ili glijalnih prekursorskih ćelija. Sekundarni glioblastom se javlja kod mlade populacije starosti do 45 godina. U toku 4 do 5 godina, u prošeku, sekundarni glioblastom se razvija od astrocitoma nižeg stepena do nediferenciranog astrocitoma. Suprotno tome, primarni glioblastom se predominantno javlja u starijoj populaciji sa prosečnom starošću od 55 godina. Uopšteno, primami glioblastom se javlja kao fulminantni glioblastom koji karakteriše progresija tumora unutar 3 meseca od stanja bez kliničkih ili patoloških abnormalnosti (Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, France, 2000)).

Glioblastom migrira duž mijelinizovanih nerava i širi se po čitavom centralnom nervnom sistemu. U većini slučajeva, hirurško lečenje pokazuje samo ograničen održiv terapijski efekat (Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 34, 91-94, 1994; Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 33, 425-458, 1993; Neuropathologv 17, 186-188, 1997) (Macdonald. 2001; Prados and Levin, 2000).

Maligne ćelije glioma izbegavaju detekciju od strane imunskog sistema domaćina tako što proizvode imunosupresivne supstance koje narušavaju proliferaciju T ćelija i proizvodnju imunostimulišućeg citokina IL-2 (Dix et al., 1999).

Intrakranijalne neoplazme mogu nastati od bilo koje strukture ili vrste ćelija prisutne u CNS-u, uključujući mozak, moždanice, hipofizu, lobanju, čak i rezidualno embrionsko tkivo.

Ukupna godišnja incidenca primarnih tumora mozga u Sjedinjenim Američkim Državama je 14 slučajeva na 100.000. Najčešći primarni tumori mozga su meningeomi, koji čine 27% svih primarnih tumora mozga, i glioblastomi, koji čine 23% svih primarnih tumora mozga (pri čemu glioblastomi čine 40% malignih tumora mozga kod odraslih). Mnogi od ovih tumora su agresivni i visokog su gradusa. Primami tumori mozga su najčešći solidni tumori kod dece i drugi su najčešći uzrok smrti usled raka nakon leukemije kod dece.

Potraga za efikasnom terapijom za glioblastome kod pacijenata se i danas sprovodi. Imunoterapija, ili lečenje putem regrutovanja imunskog sistema, za borbu protiv ovih neoplastičnih ćelija je ispitivana. Prvi ohrabrujući rezultati dobijeni su u imunoterapijskim studijama kod ljudi, kod kojih su mogli da se indukuju antigen-specifični CTL odgovori što je dovodilo do produženih prosečnih vremena preživljavanja u poređenju sa vremenima dobijenim primenom standardne terapije udružene sa minimalnom toksičnošću (Heimberger et al., 2006).

U dokumentu WO 2005/116051 izloženi su imunogeni protiv raka/tumora i fragment iz PTPRZ1 kao imunogen.

Tako je problem koji je rešen pomoću navedene primene bio da se ustanovi nova efikasna i bezbedna terapijska opcija za tumore mozga i da se poveća dobrobit pacijenata bez primene hemioterapeutika ili drugih agenasa koji mogu imati ozbiljna neželjena dejstva.

Kratak opis principa pronalaska

Na način kako su korišćeni u ovom tekstu, i sem ako nije naznačeno drugačije, svi termini su definisani kako je navedeno u nastavku.

Termin ,,peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su tipično dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, ili duži sa dužinom od 14 aminokiselina.

Termin ,,oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 14 aminokiselina.

Termin ,,polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi proteinske molekule koji su duži od oko 30 ostataka u dužinu.

Peptid, oligopeptid. protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je ,,imunogen“ (pa zato ,,imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju prikazanog pronalaska, imunogenost je specifičnije đefinisana kao sposobnost indukovanja CTL-posredovanog odgovora. Tako bi ,,imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju prikazanog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje CTL odgovor.

T-ćelijski ,,epitop“ je kratak peptidni molekul koji se vezuje za MHC molekul klase I ili II i kojeg nakon toga prepoznaje T ćelija. T-ćelijski epitopi koji se vezuju za MHC molekule I klase su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina. T-ćelijski epitopi koji se vezuju za MHC molekule II klase su tipično dužine 12-30 aminokiselina. U slučaju epitopa koji se vezuju za MHC molekule II klase, isti T-ćelijski epitopi mogu da imaju uobičajeni jezgreni segment, ali se razlikuju po dužini karboksi- i amino-terminalnih bočnih sekvenci zbog činjenice da krajevi peptidnog molekula nisu sakriveni u strukturi udubljenja za vezivanje peptida MHC molekula klase II kao što je slučaj sa udubljenjem za vezivanje peptida MHC molekula klase I.

Pošto je tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I: HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A1, HLA-A2 i HLA-A 11 su primeri različitih MHC molekula klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na DNK sekvencu obuhvata i jednolančanu i dvolančanu DNK. Tako se specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence. Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti iz normalnog, mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer deoksiribonukleotida.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno pošto jeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopsteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska se sastavljaju iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatome elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

Termin ,,fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo nukleinske kiseline koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatomim sekvencama. ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatome DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin ,,prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja je uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu deoksiribonukleotidnog lanca.

Termin ,,promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „otvoreni okvir čitanja (ORF) označava seriju trostrukih kodova za aminokiseline bez ikakvih kodona terminacije i sekvenca je koja (potencijalno) može da se translatira u protein,“

Termin „izolovan" označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno pošto jeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, je izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani u takvom vektoru ili smeši koji nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom" obliku. Termin „prečišćen" ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, jer se ti termini podrazumevaju od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; a čak poželjno i 99% po težini ili veću se izričito razmatra.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen11 znači daje koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini se takođe razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku.

Termin „aktivni fragment11 označava fragment koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, a takođe uključujući i ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše CTL odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment11 može takođe da se koristi za indukciju CTL odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo11, „segment11 i „fragment11, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Ovo znači da će bilo koji takav fragment nužno sadržati kao deo svog niza aminokiselina, segment, fragment ili deo, koji je u velikoj meri identičan, ako ne i potpuno identičan sekvenci ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 10, koje su istovetne sa prirodno pošto jećim, ili „roditeljskim11 proteinima sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 10. Kada se koriste u vezi sa polinukleotiđima, takvi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od uobičajenih endonukleaza.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti11 ili „procentualno identičan11, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca11) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:

Procenat identičnosti = 100 [I -(C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što

(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Originalni peptidi koji su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija4*.

Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zarnena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 - mali alifatični, nepolami ili malo polarni ostaci (Ala. Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 - polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp. Asn, Glu, Gln); Grupa 3 - polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 - veliki, alifatični, nepolami ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 - veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike, ali je malo drugačije veličine, kao što je zarnena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne1' supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi, a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koji inače ne bi mogli da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.

Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima pronalaska, a da i dalje budu obuhvaćene onim što je ovde objavljeno. Pored toga, aminokiseline koje poseduju nestandardne R grupe (tj. R grupe koje se ne nalaze u uobičajenih 20 aminokiselina prirodnih proteina) se takođe mogu koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Ako se pronađe da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.

Na osnovu eseja citotoksičnosti, epitop se smatra značajno identičnim referentnom peptidu ako ima najmanje 10% antigene aktivnosti referentnog peptida koja je definisana sposobnošću supstituisanog peptida da rekonstituiše epitop koji prepoznaje CTL u poređenju sa referentnim peptidom. Tako, kada se poredi litička aktivnost u linearnom delu krivulja efektor:cilj sa ekvimolarnim koncentracijama referentnog i supstituisanih peptida, opaženi procenat specifičnog ubijanja ciljnih ćelija inkubiranih sa supstituisanim peptiđom bi trebalo da bude jednak procentu referentnog peptida u odnosu efektoncilj koji nije veći od 10 puta od odnosa referentni peptidni efektoncilj sa kojim se vrši poređenje.

Poželjno, kada se CTL specifični za peptid sa 1D BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 10 testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja liže u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/1, poželjno nije veća od oko 1 μmol/1, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/1, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/1, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/1. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane CTL dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

Tako, epitopi predmetnog pronalaska mogu biti identični prirodno javljajućim tumor-asociranim ili tumor-specifičnim epitopima ili mogu obuhvatati epitope koji se razlikuju za ne više od 4 ostataka od referentnog peptida, dokle god imaju značajno identičnu antigenu aktivnost.

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena je sada uvećalo mogućnost upotrebe imunskog sistema domaćina da se podstakne imunski odgovor koji je specifičan za ciljne antigene eksprimirane na površini tumorskih ćelija i koji je sposoban da preko ovog mehanizma delovanja indukuje regresiju, stazu ili usporeni rast tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija citotoksičnih T ćelija (CTL) iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnim imunskim odbranama protiv raka (Cheever et ah, 1993; Zeh, III et ah, 1999). Na osnovu analize 415 uzoraka od pacijenata koji boluju od kolorektalnog karcinoma, Galon i saradnici su bili u stanju da pokažu da su vrsta, gustina i lokacija imunskih ćelija u tumorskom tkivu zapravo bolji pokazatelj za preživljavanje pacijenata nego naširoko korišćena TNM klasifikacija tumora (Galon et ah, 2006). U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije (TCD84), koje prepoznaju molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji nose peptide od obično 8 do 10 aminokiselinskih ostataka dobijene iz proteina, defektne proizvode ribozoma (DRIP) (Schubert et al., 2000). U literaturi su takođe opisani peptidi koji potiču od spojenih proteina. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

Pošto je dve klase MHC molekula: MHC molekuli klase 1 koji se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. MHC molekuli su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina (MHC klasa I receptori) odnosno alfa i beta lanca (MHC klasa II receptori). Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima. MHC klase I prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, DRIP-ova i većih peptida. MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju u toku procesa endocitoze, i nakon toga obrađuju (Cresswell, 1994). Komplekse peptida i MHC molekula klase 1 prepoznaju CD8-pozitivni citotoksični T limfociti koji nose odgovarajući TCR (T-ćelijski receptor), a komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). Iz tog razloga, identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih im unskih odgovora (Kobayashi et ah, 2002; Qin et ah, 2003; Gnjatic et ah, 2003).

U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, neočekivano je otkriveno da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et ah, 2006).

Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CTL efektorskih ćelija (tj. CD8-pozitivnih T limfocita), CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferona-gama (IFNy) (Qin and Blankenstein, 2000). Dodatno, pokazano je da CD4-pozitivne T ćelije koje prepoznaju peptide iz tumor-asociranih antigena prezentovanih od strane HLA molekula klase II mogu da se suprotstave progresiji tumora pomoću indukcije odgovora antitelima (At) (Kennedy et al., 2003). Za razliku od tumor-asociranih peptida koji se vezuju za HLA molekule klase I, do danas je opisan samo mali broj Uganda klase II TAA (vAvw.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de).

Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na ćelije imunskog sistema (Mach et al., 1996). mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora nije se smatrala mogućom. iMeđutim, Dengjel i saradnici nedavno su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1 760 088 BI; (Dengjel et al., 2006).

Da bi peptid pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji su vezani MHC klasom I su obično dužine 8-10 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka (,,sidra;‘) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MFIC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje (Rammensee et al., 1997).

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske recepiore (TCR).

Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični citotoksični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena sadrži sledeće velike grupe (Novellino et al., 2005):

1. Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije (van der Bruggen et al., 1991) pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije ili NY-ESO-l.

2. Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao; većina njih nalazi se u melanomima i normalnim meianocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za karcinom prostate.

3. Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA su detektovani u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

4. Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je (3-katenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore, a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora.

5. TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični (Hanada et al., 2004; Vigneron et ah, 2004).

6. Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane citotoksičnih T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora, a ne ili u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu takođe biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektno tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et ah, 2004). U oba slučaja, esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, budući da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena treba da dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije sa odgovarajućim TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Zato su TAA početna tačka za razvoj tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA zasnovani su na upotrebi C'TL koji mogu biti izolovani iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva (Lemmcl et ah, 2004; Weinschenk et ah, 2002).

Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna subpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. Zato je važno da se odaberu samo oni peptidi iz prekomerno eksprimiranih ili selektivno eksprimiranih proteina koji su prezentovani u vezi sa MHC molekulima protiv kojih se može naći funkcionalna T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija44). Tipične efektorske funkcije T ćelija uključuju sekreciju interferona-gama, perforina i granzima.

T pomoćničke ćelije imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički odgovor Th1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakter i zacija tumor-asociranib antigena koji se prepoznaju pomoću ili CD8+ CTL (ligand: MHC molekui klase I + peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekui klase II + peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

Tako je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi nove aminokiselinske sekvence za peptide koje su sposobne da se vežu za MHC komplekse ili jedne ili druge klase.

Kratak opis crteža

Sl. la i b pokazuju maseni spektar ESI tečne hromatografije koji identifikuje tumor-asocirane peptide (TUMAP) PTP-001 iz uzorka glioblastoma GB 1006 i PTP-002 iz uzorka glioblastoma GB6003 koji su bili prezentovani na MHC klasa I-restrikovan način.

Sl. 2 prikazuje profil ekspresije mRNK gena PTPRZ1 koji kodira glioblastom-asocirane peptide prikazane u tabeli 1. Ekspresija ovog gena je odsutna ili veoma mala u normalnim tkivima dok je veoma povećana u uzorcima glioblastoma (GB1006T do GB1011T; NCH359T

1 NCH361T).

Slika 3 prikazuje reprezentativan uzorak za PTP-002-specifične CD8+ T ćelije u jednom zdravom HLA-A*0201 donoru nakon in vitro stimulacije sa PTP-002 što je utvrđeno protočnom citometrijom. CD8+ T ćelije su izolovane iz humanih PBMC zdravog donora i pripremljene in vitro pomoću molekularno definisanih „veštačkih antigen-prezentujućih ćelija" (aAPĆ) u koje su ubačeni ko-stimulatorni molekuli i A*0201/PTP-002 (levi dijagram) ili irelevantni A*0201 peptid (desni dijagram) (Walter et ah, 2003). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem sa PTP-002- plus irelevantnim peptiđnim tetramerima. Ćelije su sinhronizovane na populaciji CD8+ limfocila, a procenti predstavljaju učestalosti tetramer-pozitivnih ćelija u okviru ove populacije.

Detaljan opis pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje peptide koji su korisni u lečenju glioblastoma. Za ove peptide je direktno pokazano masenom spektrometrijom da ih prirodno prezentuju HLA molekuli na uzorcima primarnog humanog glioblastoma (pogledajte primer 1 i sliku 1). Dokazano je da je izvorni gen iz kojeg su dobijeni ovi peptidi - PTPRZ1 - visoko prekomemo eksprimiran u glioblastomu u poređenju sa normalnim tkivima (pogledajte primer

2 i sliku 2) što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije ovih peptida, tj. ovi peptidi su snažno prezentovani na tumorskom tkivu, ali ne i na normalnim tkivima. HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita/T ćelija. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. tumorske ćelije glioblastoma koje prezentuju peptide dobijene iz PTPRZ1. Pokazano je da je nekoliko peptida predmetnog pronalaska sposobno da stimuliše T-ćelijske odgovore (pogledajte primer 3 i sliku 3). Tako su peptidi korisni za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansomj. Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetnog pronalaska nisu prezentovani na normalnim tkivima, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

Pored toga što su korisni za lečenje malignih tumora, peptidi predmetnog pronalaska su takođe korisni kao sredstva za dijagnostikovanje. Budući da su peptidi napravljeni iz glioblastoma i budući da je utvrđeno da ovi peptidi nisu prisutni u normalnim tkivima, ovi peptidi mogu da se koriste za dijagnostikovanje prisustva malignog tumora.

Prisustvo TUMAP patentnog zahteva na biopsijama tkiva može da pomogne patologu u postavljanju dijagnoze malignog tumora. Detekcija određenih TUMAP pomoću antitela, masene spektrometrije ili drugih metoda poznatih u stručnoj oblasti mogu da pokažu patologu da je tkivo maligno ili inflamirano ili uopšteno obolelo. Prisustvo grupa TUMAP može da omogući klasifikaciju ili subklasifikaciju obolelih tkiva.

Detekcija TUMAP na uzorku obolelog tkiva može da omogući donošenje odluke o koristima terapija koje uključuju imunski sistem, posebno ako je poznato ili se očekuje da T limfociti budu uključeni u mehanizam delovanja. Gubitak MHC ekspresije je dobro opisan mehanizam pomoću kojeg inficirane ili maligne ćelije izbegavaju imunološki nadzor. Tako, prisustvo TUMAP pokazuje da analizirane ćelije ne iskorišćavaju ovaj mehanizam.

TUMAP mogu da se koriste za analizu limfocitnih odgovora protiv tih TUMAP, kao što su T-ćelijski odgovori ili odgovori antitelima protiv TUMAP ili TUMAP u kompleksu sa MHC molekulima. Ovi limfocitni odgovori mogu da se koriste kao prognostički markeri za donošenje odluke o daljim koracima lečenja. Ovi odgovori mogu takođe da se koriste kao surogat markeri u imunoterapijskim pristupima čiji je cilj indukcija limfocitnih odgovora pomoću različitih sredstava, npr. vakcinacije proteinom, nukleinskim kiselinama, autolognim materijalom, ili adoptivni transfer limfocita. U smislu genske terapije, limfocitni odgovori protiv TUMAP mogu se razmatrati u pogledu procene neželjenih dejstava. Praćenje limfocitnih odgovora može takođe biti dragocena alatka za kontrolne preglede terapija transplantacijom, npr. za detekciju bolesti graft protiv domaćina i domaćin protiv grafta.

TUMAP mogu da se koriste za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/TUMAP. Oni se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Pored toga, ona mogu da se koriste za verifikaciju dijagnoze malignog tumora patologa postavljene na osnovu uzorka biopsije.

U tabeli 1 su prikazani peptidi opisani u predmetnom pronalasku, njihovi odgovarajući ID BR. SEKV, HLA aleli za koje se dati peptidi vezuju, kao i izvorni proteini iz kojih ovi peptidi mogu nastati.

Tabela 1: Izneti peptidi

Protein tirozin fosfataza, receptor tipa, Zetal (PTPRZ1, PTP-ξ)

PTPRZ1 je član familije protein tirozin fosfataza receptornog tipa koji kodira membranski protein jednostrukog prolaza tipa I sa dva citoplazmatska tirozin-protein fosfatazna domena, alfa-ugljena anhidraza domenom i fibronektin tip III domenom. (Wu et ah, 2006), u karcinomu dojke (Perez-Pinera et ah, 2007), u remijelinizirajućim oligodendrocitima lezija multiple skleroze (Harroch et ah, 2002), i u humanim embrionskim bubrežnim ćelijama u uslovima hipoksije (Wang et ah, 2005).

I protein i transkript su prekomerno eksprimirani u ćelijama glioblastoma, promovišući njihovu haptotaksičku migraciju (Lu et al., 2005). Poreci toga, PTRPZ1 je Često amplifikovan na nivou genomske DNK u glioblastomu (Mulholland et al., 2006).

Kaplan i saradnici su klonirali 3 humana receptorna PTP gena, uključujući PTP-γ (Kaplan et al., 1990). Pokazano je da je jedan PTPG alel izgubljen u 3 od 5 testiranih ćelijskih linija bubrežnog karcinoma i u 5 od 10 testiranih uzoraka karcinoma pluća. PTP-γ mRNK je bila eksprimirana u testiranim ćelijskim linijama bubrega i ćelijskim linijama pluća, ali ne i u nekoliko testiranih hematopoetskih ćelijskih linija. Stoga, izgleda da PTP-γ gen poseduje karakteristike koje ukazuju na to da on može biti tumor-supresorski gen u karcinomu bubrega i pluća. Gebink i saradnici su izolovali mišju cDNK veličine 5,7 kb, koja kodira ,,novi“ član familije receptoru sličnih protein-tirozin fosfataza, koju su nazvali RPTPμ (Gebbink et al., 1991). cDNK je predviđala protein od 1.432 aminokiseline (ne uključujući signalni peptid) sa izračunatom molekularnom masom od 161.636 Da. Pored toga, oni su klonirali humani homolog, koji je pokazivao homologiju aminokiselina sa mišjim proteinom od 98,7%. Predviđeni mišji protein se sastojao od ekstraćelijskog regiona koji čini 722 aminokiselina, koji sadrži 13 potencijalnih mesta N-glikozilacije, jednog transmembranskog domena i unutarćelijskog dela od 688 aminokiselina koji sadrži dva tandem ponavljanja homologna katalitičkim domenima drugih tirozin fosfataza. RNK blot analiza je pokazala jedan transkript koji je bio najzastupljeniji u plućima, ali je bio prisutan u mnogo manjim količinama u mozgu, kao i u srcu. Humani PTPμ gen je dodeljen 18pter-qll pomoću Southern analize hibridnih klonova humanih/glodarskih somatskih ćelija.

PTP-ε cDNK je izolovana od strane Krueger i saradnika (Krueger et al., 1990). Protein od 700 aminokiselina ima kratak ekstraćelijski domen i dva tandemski ponovljena unutarćelijska PTP-azna domena. Visoki nivoi transkripcije PTP-ε su zabeleženi u mozgu i testisima miševa. Čini se da oba izooblika PTP-ε- transmembranski izooblik, receptornog tipa, i kraći, citoplazmatski - nastaju iz jednog gena pomoću primene alternativnih promotera i 5-prim egzona.

Barnea i saradnici (Barnea et al., 1993) su klonirali više cDNK za humani i mišji PTP-γ gen (nazvane PTP-γ po toj grupi) iz biblioteka moždanih cDNK, i analizirali njihove predviđene polipeptidne sekvence. Plumane (1.445 aminokiselina) i mišje (1.442 aminokiseline) sekvence imaju 95% identičnost na nivou aminokiselina i predviđaju putativni ekstraćelijski domen. jedan transmembranski domen i citoplazmatski region sa 2 tandem katalitička tirozin fosfatazna domena. Ekstraćelijski domen sadrži produžetak od 266 aminokiselina koje su veoma slične enzimu ugljena anhidraza koji sadrži cink (MIM 114800), što sugeriše da PTP-γ i PTP-ξ (PTPRZ1) predstavljaju podfamiliju 25 receptornih tirozin fosfataza. Gen za PTP-γ ima 30 egzona i približne je veličine 780 kb. On je mnogo veći od drugih receptornih PTP gena, pri čemu je CD45 gen (MIM 151460) oko 100 kb dok su ostali i manji.

Druga tirozin fosfataza receptornog tipa, protein tirozin fosfataza zeta (PTPRZ1) [takođe poznata kao PTP-ξ, HPTP-ZETA, PIPTPZ, RPTP-BETA(β) ili RPTPB] je izolovana kao cDNK sekvenca od strane dve grupe u ranim devedesetim godinama prošlog veka. Levi i saradnici (Levy et al., 1993) su izolovali klonove cDNK iz biblioteke ekspresije mRNK u moždanom stablu humanog ođojčeta, i izveli kompletnu aminokiselinsku sekvencu velikog proteina tirozin fosfataza receptor tipa koji sadrži 2.307 aminokiselina.

Levi je otkrio da je protein, koji su nazvali PTP|3 (PTPRZ1), transmembranski protein sa dva citoplazmatska PTP-azna domena i ekstraćelijskim domenom od 1.616 aminokiselina. Kao i kod PTP-γ (MIM 176886), 266 N-terminalnih ostataka ekstraćelijskog domena imaju visok stepen sličnosti sa ugljenim anhidrazama (pogledajte MIM 1 14880). Humani gen koji kodira PTPRZ1 je mapiran na hromozomu 7q31.3-q32 pomoću hromozomske in situ hibridizacije (Ariyama et al., 1995). Northern blot analiza pokazala je da je PTP-zeta eksprimiran samo u humanom centralnom nervnom sistemu. In situ hibriđizacijom, (Levy et al., 1993) lokalizovali su ekspresiju na različite regione odraslog humanog mozga, uključujući sloj Purkinjeovih ćelija malog mozga, dentatni girus i subependimalni sloj prednjeg roga lateralne komore. Levi je naveo daje ovo prva sisarska tirozin fosfataza čija je ekspresija ograničena na nervni sistem. Pored toga, visoki nivoi ekspresije u mišjem embrionskom mozgu sugerišu značajnu ulogu u razvoju CNS-a.

Stoga je PTP receptor familija proteina okarakterisana kao prilično raznovrsna familija receptora vezanih za membranu, i nemembranski vezanih izooblika. koji dele zajedničku arhitekturu PTP-aznog citosolnog domena, lako je njihova ekspresija u fetalnim i embrionskim tkivima sugerisala razvojnu biološku ulogu za proteine, njihova kompletna funkcija u normalnom i obolelom biološkom stanju još uvek nije potpuno razjašnjena.

Patent registrovan u SAD-u pod br. 6,455,026 identifikuje PTP-c, (PTPRZ1) kao cilj u lečenju i vizuelizaciji tumora mozga. U prijavi su navedene metode i reagensi za specifično ciljanje ćelija tumora mozga kako za terapijske tako i za svrhe imidžinga. Obezbeđena su jedinjenja i smeše zasnovani na afinitetu prema PTP-ξ koji su korisni u lečenju tumora mozga kod pacijenta, pri čemu su smeše i jedinjenja uopšteno spadala u dve grupe: konjugatna jedinjenja koja vezuju PPTP-ξ, koja sadrže citotoksični deo, koji inhibira rast tumorskih ćelija; i smeše jedinjenja koja vezuju PTP-ξ, kod kojih deo koji vezuje PTP-ξ menja normalnu funkciju PTP-4 u tumorskim ćelijama, čime inhibira ćelijski rast.

U prvoj grupi su obezbeđena terapeutska konjugatna jedinjenja koja vezuju PTP Ova jedinjenja su imala opštu formulu a(Pz)C, naznačeno time što je a(Pz) bio jedan ili više delova koji se specifično vezuju za humanu protein tirozin fosfatazu-ξ, a C je jedan ili više citotoksičnih delova jedinjenja. U poželjnim otelotvorenjima (što je bilo izneto za sve grupe), navedeno je da je a(Pz) antitelo ili fragment antitela. U drugoj grupi su obezbeđena terapeutska jedinjenja koja vezuju PTP-ξ koja su menjala normalnu funkciju PTP-ξ u ćelijama tumora mozga i inhibirala rast ćelija tumora mozga. Ova terapeutska jedinjenja koja vezuju PTPRZ1 imala su opštu formulu α(Pz) naznačeno time što je α(Pz) bio jedan ili više delova koji se specifično vezuju za humanu protein tirozin ffosfatazu-ξ, i naznačeno time što je vezivanje α(Pz) menjalo funkciju protein tirozin fosfatazu-ξ.

Patent registrovan u SAD-u pod br. 7,060,275 B2 iznosi spojene varijante PTPRZ1, vektore koji uključuju ove varijante i antigene protiv raznih varijanti.

Upotreba peptida koji se vezuju za MHC dobijenih iz PTPRZ1 u vidu aktivnih farmaceutskih sastojaka za lečenje tumora mozga nije razmatrana nigde u ranijoj stručnoj literaturi.

U prvom svom aspektu, predmetni pronalazak, stoga, obezbeđuje peptid koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV 1.

Peptidi pronalaska imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

U predmetnom pronalasku, termin ,,homologno“ odnosi se na stepen identiteta između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta ,,homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Sekvence koje se ovde upoređuju mogu imati adiciju ili deleciju (na primer, praznina i slično) u optimalnom poravnanju dveju sekvenci. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma (Nucleic Acid Res., 1994, 22(22): 4673 4680). Takođe, mogu da se koriste opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili alatke za analizu koje su dostupne u javnim bazama podataka, kao npr. http://dragon.bio.purdue.edu/bioinfolinks/.

Osoba stručna u ovoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Fong et al., 2001b); (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).

Kao što se može zaključiti iz naučne literature (Rammensee et al., 1997) i baza podataka (Rammensee et al, 1999), određeni položaji HLA vezujućih peptida su tipično ostaci sidra koji oblikuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, kojeg pak definišu polarne, elektrofizičke, hidrofobne i spacijalne osobine polipeptidnih lanaca koji sačinjavaju udubljenja za vezivanje Tako bi osoba stručna u ovoj oblasti mogla da modifikuje aminokiselinske sekvence navedene u ID BR. SEKV: 1-10, održavajući poznate ostatke sidra i mogla bi da utvrdi da li takve varijante zadržavaju sposobnost vezivanja MHC molekula klase I.

Oni aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa T-ćelijskim receptorom mogu da se modifikuju zamenom sa drugom aminokiselinom čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Tako, izuzev navedenog izuzetka, peptid pronalaska može biti bilo koji peptid (pod čime pronalazači podrazumevaju oligopeptide ili polipeptide) koji uključuje aminokiselinske sekvence, ili njihov deo ili varijantu, kako je naznačeno.

Tabela 2 Varijante i motiv peptida u skladu sa ID SEKV 1 do 10

Nadalje je poznato za MHC klasa 11-prezentovane peptide da se ovi peptidi sašto je od ,jezgrene sekvence“ koja ima aminokiselinsku sekvencu koja se uklapa u određeni HLA alel-specifičan motiv i, opciono, N- i/ili C-terminalne ekstenzije koje ne ometaju funkciju jezgrene sekvence (tj. smatraju se irelevantnim za interakciju peptida i svih ili podskupa T-ćelijskih klonova koji prepoznaju prirodni antipod). N- i/ili C-terminalne ekstenzije mogu. na primer, da budu dužine između 1, odnosno, do 10 aminokiselina. Ovi peptidi mogu da se koriste ili direktno da bi se ubacili MHC molekuli klase II ili sekvenca može da se klonira u vektore u skladu sa opisom navedenim u nastavku teksta. Budući da ovi peptidi predstavljaju konačni proizvod obrade većih peptida unutar ćelije, mogu da se koriste i duži peptidi. Ovako opisani peptidi mogu biti bilo koje veličine, ali tipično oni mogu biti manji od 100.000 u molekularnoj težini, poželjno manje od 50.000, još poželjnije manje od 10.000 i tipično oko 5.000. U pogledu broja aminokiselinskih ostataka, ovako opisani peptidi mogu imati manje od 1.000 ostataka, poželjno manje od 500 ostataka, još poželjnije manje od 100, još poželjnije manje od 100 i najpoželjnije između 30 i 8 ostataka.

Shodno tome, prirodno javljajuće ili veštačke varijante koje indukuju unakrsnu reakciju T ćelija sa peptidom pronalaska su često varijante u dužini.

Ako se peptid koji je duži od oko 12 aminokiselinskih ostataka koristi direktno za vezivanje za MHC molekul klase II, poželjno je da bočni ostaci jezgrenog HLA vezujućeg regiona budu oni koji ne utiču značajno na sposobnost peptida da se vezuje specifično za udubljenje za vezivanje MHC molekula klase II ili da prezentuje peptid T (-pomoćničkoj) ćeliji. Međutim, kako je već ranije naznačeno, podrazumeva se da se mogu koristiti i veći peptidi, npr. kada ih kodira polinukleotid. budući da ove veće peptide mogu da fragmentiraju prikladne antigen-prezentujuće ćelije.

Takođe je moguće da se obradom peptida iz dužih peptida ili proteina koji sadrže aktuelni epitop, stvore epitopi MHC klase I, mada su oni obično dužine između 8 i 10 aminokiselina. Poželjno je da ostaci koji su bočni na aktuelni epitop budu oni koji ne ometaju u značajnoj meri proteolitičko cepanje koje je neophodno da bi se aktuelni epitop eksponirao tokom obrade.

Naravno, peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I. Vezivanje peptida ili njegove varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u stručnoj oblasti, na primer onih koji su opisani u literaturi za različite alele MHC klase II (npr.

(Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins et al.. 1993; Bovton et al., 1998)).

Peptid pronalaska se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV 1.

U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, peptid je deo fuzionog proteina koji sadrži 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku ,,Ii“) koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497 (Strubin, M. et al 1984).

Dole opisani primeri za peptide su oni u kojima je peptid izabran od peptida koji ima specifičan HLA-podtip i koji je sposoban da stimuliše CD8 ćelije, a naznačeno time što navedeni peptid sadrži specifični sidreni aminokiselinski motiv koji je opisan u tabeli 2a u nastavku:

Tabela 2a HLA podtipovi i sidreni motivi poželjnih peptida

U reverznoj peptidnoj vezi aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u stručnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Meziere i saradnici (1997) pokazuju da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i T-pomoćničke ćelijske odgovore. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, su mnogo otporniji na proteolizu.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CPI2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent registrovan u Sjedinjenim Američkim Država pod brojem 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBHj.

Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, tako da se, na primer. pojačava stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajevima peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili t-butiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.

Nadalje, ovako opisani peptidi mogu biti sintetisani tako da njihova prostorna konfiguracija bude izmenjena. Na primer, može da se koristi D-izomer jednog ili više aminokiselinskih ostataka peptida, umesto uobičajenog L-izomera. Dodatno, najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka peptida pronalaska može da se supstituiše jednim od dobro poznatih aminokiselinskih ostataka koji se normalno ne javljaju u prirodi. Izmene poput ovih mogu služiti da se poveća stabilnost, bioraspoloživost i/ili vezivanje ovako opisanih peptida pronalaska.

Slično tome, opisani peptid može da se modifikuje hemijski, reakcijom sa specifičnim aminokiselinama bilo pre ili nakon sinteze peptida. Primeri za takve modifikacije su dobro poznati u stručnoj oblasti i sažeto predstavljeni, na primer, u radu R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3. izdanje, CRC Press, 2005. Hemijska modifikacija aminokiselina uključuje, ali nije i ograničeno na, modifikaciju pomoću acilacije, amidinacije, piridoksilacije lizina, redukcione alkilacije, trinitrobenzilacije amino grupa sa 2,4,6-trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS), amidne modifikacije karboksil grupa i sulfidrilne modifikacije pomoću oksidacije cisteina performinskom kiselinom do cisteinske kiseline, obrazovanja živinih derivata, obrazovanja mešovitih disulfida sa drugim tiolnim jedinjenjima, reakcije sa maleimidom, karboksimetilacije sa jodosirćetnom kiselinom ili jodoacetamidom i karbamilacije sa cijanatom u alkalnoj pH sredini, iako bez ograničenja na ovde navedeno. U ovom pogledu, osoba stručna u ovoj oblasti se upućuje na poglavlje 15 Trenutno važećih protokola u nauci o proteinima, izdanja Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000) za opsežniju metodologiju u vezi sa hemijskim modifikacijama proteina.

Ukratko, modifikacija, na primer, arginilskih ostataka u proteinima se često bazira na reakciji vicinalnih dikarbonilnih jedinjenja kao što su fenilglioksal, 2,3-butandion i 1,2-cikloheksandion kako bi obrazovao adukt. Drugi primer je reakcija metilglioksala sa argininskim ostacima. Cistein može da se modifikuje bez istovremene modifikacije drugih nukleofilnih mesta kao što su lizin i histidin. Kao rezultat, dostupan je veliki broj reagenasa za modifikaciju cisteina. Veb stranice kompanija kao što je Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pružaju informacije o specifičnim reagensima.

Selektivna redukcija disulfidnih veza u proteinima je takođe uobičajena. Disulfidne veze mogu da se formiraju i oksidiraju u toku tretiranja biofarmaceutika toplotom.

Woodward-ov reagens K može da se koristi za modifikaciju specifičnih ostataka glutaminske kiseline. N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilkarbodiimid može da se koristi za obrazovanje intramolekularnih unakrsnih veza između lizinskog ostatka i ostatka glutaminske kiseline.

Na primer, dietilpirokarbonat je reagens za modifikaciju histidilskih ostataka u proteinima. Histidin može takođe da se modifikuje pomoću 4-hidroksi-2-nonenala.

Reakcija lizinskih ostataka i drugih a-amino grupa je. na primer, korisna u vezivanju peptida za površine ili unakrsno povezivanje proteina/peptida. Lizin je mesto vezivanja poli(etilen)glikola i glavno mesto modifikacije u glikaciji proteina.

Metioninski ostaci u proteinima mogu da se modifikuju pomoću npr. jodoacetamida, bromoetilamina i hloramina T.

Tetranitrometan i N-acetilimidazol mogu da se koriste za modifikaciju tirozilskih ostataka. Unakrsno povezivanje pomoću obrazovanja ditirozina može da se postigne vodonik peroksidom/jonima bakra.

U nedavnim studijama o modifikaciji triptofana korišćeni su N-bromosukcinimid, 2-hidroksi-5-nitrobenzil bromid ili 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmerkapto)-3H-indol (BPNS-skatol).

Uspešna modifikacija terapeutskih proteina i peptida sa PEG često je udružena sa produžavanjem poluživota u cirkulaciji dok se unakrsno povezivanje proteina sa glutaraldehidom, polietilen glikol diakrilatom i formaldehidom koristi za pripremanje hidrogelova. Hemijska modifikacija alergena za imunoterapiju se često postiže karbamilacijom sa kalijum cijanatom.

Opisan je peptid koji je naznačen time što je peptid modifikovan ili sadrži nepeptidne veze. Uopšteno, peptidi (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lu et al. (1981) i referencama u istom. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju).

Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N, N-dicikloheksil-karbodiimid/lhidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrina, trinitrobenzen sulfonske kiseline ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% srnešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste su etanditiol, fenol, anizol i voda, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, Bruckdorfer et al. 2004. i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo. sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni od npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK.

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su re-kristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ES1-Q-T0F maseno spektrometrijske analize.

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer. DNK, cDNK, PNK, CNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno pošto jeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji eksprimira polipeptid u skladu sa pronalaskom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarno kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimemih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Ine, New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska jeste da se koristi lančana reakcija polimeraze koja je izneta od strane (Saiki et al (1988)). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u stručnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, da se konstruiše vektor ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u patentima registrovanim u SAD-u pod br. 4,440.859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4.678,751,4,704,362, 4.710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini, koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska, se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u ovoj oblasti u pogledu učenja iznetih u ovom dokumentu kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillm subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan od kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takode dostupan od kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni od kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRPI, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer od kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim

kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.

Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/1 u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/1. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMBl (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za b-laktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor fl. Vektori koji sadrže preprotripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u stručnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na izolovanu ćeliju domaćin koja nije humana embrionska matična ćelija, transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan od kompanije Bethesda Research Laboratories Ine., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan od organizacije American Tvpe Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (Br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju kvasnice, ćelije insekata i si sara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne od kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog lučka (CPIO) dostupne od organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne od organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne od organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transficiraju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbas i Argelia Lorence „Methods in Molecular

Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols‘\ deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska se postiže dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, i Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY. Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor, NY. Metod koji je izložio Beggs (1978) Nature 275,104-109 takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su od kompanije Stratagene Cloning Systems, ili Life Technologies Ine., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u stručnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) trenutno se ispituju za lečenje karcinoma prostate (Sipuleucel-T) (Small EJ et al 2006; Rini et al 2006).

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida, metod koji obuhvata kultiviranje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njegovog medij uma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju peptida, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska se koriste u lečenju raka. Na primer, peptid može biti pripremljen za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 μg i 1,5 mg, poželjno 125 μg do 500 pg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Brunsvig et al 2006; Staehler et al 2007).

Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedena T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

U slučaju epitopa MHC klase II koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD4-pozitivne pomoćničke ćelije, poželjno tipa TH1. MHC molekuli klase II mogu biti eksprimirani na površini bilo koje prikladne ćelije. Poželjno, ćelija prirodno ne eksprimira MHC molekule klase II (u tom slučaju je ćelija transficirana kako bi eksprimirala takav molekul). Alternativno, ako ćelija prirodno eksprimira MHC molekule klase II, poželjno je da ona bude defektna u putevima obrade ili prezentovanja antigena. Na ovaj način, moguće je da ćelija koja eksprimira MHC molekul klase II bude kompletno napunjena odabranim peptidnim antigenom pre aktiviranja T ćelije.

Antigen-prezentujuća ćelija (ili stimulatorna ćelija) tipično ima MHC molekule klase II na svojoj površini i poželjno je sama u značajnoj meri nesposobna da napuni navedeni MHC molekul klase II sa odabranim antigenom. Odabrani antigen može lako da se ubaci u MHC molekul klase II in vitro.

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida je dostupna od organizacije American Type Culture Collection. 12301 Parklawn Drive. Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je od organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Karre et al 1985.

Prikladno, navedena ćelija domaćin pre transfekcije značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje ko-stimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2,1CAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase II i ko-stimulatornih molekula su javno dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

Slično, u slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivni CTL.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji može da eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV 1.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje CTL in vitro. Na primer, metode opisane u radovima Peoples et al (1995) i Kawakami et al (1992) koriste autologne tumor-infiltrirajuće limfocite za stvaranje CTL. Plebanski i saradnici (1995) upotrebljavaju autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje CTL. Jochmus i saradnici (1997) opisuju proizvodnju autolognih CTL pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Hill i saradnici (1995) i Jerorne i saradnici (1993) upotrebljavaju B ćelije u proizvodnji autolognih CTL. Pored toga, makrofagi pulsiram sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih CTL. S. Walter i saradnici 2003. opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentuj ući h ćelija (aAPC), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U ovoj studiji, aAPC su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHCkpeptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotimstreptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa ko-stimulatomom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga, takav sistem zasnovan na aAPĆ često iziskuje dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina kao što je interleukin-12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija, a metod je detaljno opisan u dokumentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga mogu da se koriste i virusi biljaka (pogledajte, na primer. Porta et al (1994)) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa crnog pasulja kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska su korisne u terapiji. Tako, opisane su aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodama pronalaska.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa 1D BR. SEKV 1 do 10.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentni imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD4-pozitivne T ćelije mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).

T ćelije, kao što je opisano, mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, pronalazak takođe opisuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, metod koji obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu definisan je ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran1' pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije ili daje gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao, ali daje eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u stručnoj oblasti, npr. ranije opisanih.

Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer '1' ćelija dobro su poznati u stručnoj oblasti i mogu se naći u npr. (Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudlev et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al.. 2005); pregledani u (Gattinoni et al., 2006) i (Morgan et al., 2006).

Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, vektor ekspresije ili ćelija korisni su za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).

Poželjno, lek predmetnog pronalaska je vakcina. Ona se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transficirane tako da ko-eksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku) ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulišućim citokinima, ili da se primenjuje sa prikladnim sistemom za dostavljanje, na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin - KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i Longenecker et al (1993)). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 CTL je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 CTL, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u ovoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.

U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 15 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest ili trinaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase 1 i/ili klase U.

Polinukleotid može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u stručnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, ili A Mahdavi 2006. Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herper virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“ može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Medikament pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvansa. Ađjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CTL i pomoćničkim T (Tu) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 1SS, soli aluminij uma, Amplivax, AS 15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, 1C30, IC31, Imikvimod (ALDARA), ImuFact IMP321, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, PL.G mikročestice, rezikvimod, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848. beta-glukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF. Nekoliko imunoloških adjuvanasa fnpr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema su opisani ranije (Dupuis M et al 1998; Allison 1998). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-α), ubrzavanjem sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD-u pod br. 5,849,589, koji je u celini pomoću reference posebno inkorporiran u ovaj dokument) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, lFN-beta) (Gabrilovich et al 1996).

Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja pošto jećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine đenđritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim tako i terapijskim vakcinama. što je važnije, on poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije Trn ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija Tm indukovana pomoću TLR9 stimulacije se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini kao što je aluminijum ili nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) koji normalno promovišu predominaciju TH1. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice. nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije.

koje su naročito neophodne za inđukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg et al 2006). Patent registrovan u SAD-u pod br. 6,406,705 BI opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za inđukovanje antigen-specifičnog imunskog odgovora. Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.

Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i AmpliGen, ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamiđa, sunitiniba, bevacizumaba, celebreksa, NCX-4016. sildenatila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 i SC58175. koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska stručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi bez izvođenja suvišnih eksperimenata. Preferirani adjuvansi su dSLIM, interferon-alfa, -beta, CpG7909, IC31, ALDARA (imikvimod), PeviTer, RNK, tadalafil, temozolomid i Juvlmmune.

Predmetni pronalazak obezbeđuje lek koji je koristan u lečenju raka, konkretno raka nervnih ćelija, konkretno malignih tumora mozga. Maligni tumor može biti nemetastatski ili metastatski, konkretno on može biti astrocitom, pilocitni astrocitom, disembrioplastični neuroepitelijalni tumor, oligodendrogliomi, ependimom, glioblastom multiforme, mešoviti gliomi, oligoastrocitomi, meduloblastom, retinoblastom, neuroblastom, germinom, teratom, gangliogliomi, gangliocitom, centralni gangliocitom, primitivni neuroektodermalni tumori (PNET), meduloblastom, meduloepiteliom, neuroblastom, retinoblastom, ependimoblastom, tumori parenhima epifize, pineocitom, pineoblastom, tumori ependimalnih ćelija, tumori horoidnog pleksusa, neuroepitelijalni tumori nejasnog porekla, gliomatoza mozga, astroblastom i glioblastom.

Budući da su peptidi pronalaska izolovani iz glioblastoma, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje glioblastoma.

Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju njegova poželjna otelotvorenja, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.

PRIMERI

PRIMER 1:

Identifikacija tumor-asociranih peptida (TUMAP) prezentovanih na površini ćelije

Uzorci tkiva

Tumorska tkiva pacijenata i zdrava tkiva su obezbedena od strane Hopital Cantonal Universitaire de Geneve (Medical Oncologv Laboratory of Tumor lmmunology) i Neurochirurgische IJniversitats-Klinik Heidelberg (Molekularbiologisches Lahor). Pre operacije su od svih pacijenata pribavljeni pisani informisani pristanci. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem u tečnom azotu neposredno nakon operacije i uskladištena na -80°C do izolacije TUMAP-a.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Skupovi HLA peptida iz brzo zamrznutih uzoraka tkiva su dobijeni imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk, K. et al 1991; Seeger, F.H. et al. T 1999) upotrebom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2 ili HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranjem kiselinom i ultrafiltracijom.

Detekcija TUMAP-a pomoću ESI-tečne hr ornatograjije spregnute sa masenom

spektrometrijom (ESI-LCMS)

Metod jedan:

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverzno-fazne hromatografije (CapLC, Waters), a eluirani peptidi su analizirani u hibridnom kvadrupolnom ortogonalnom akceleracija vreme-leta tandemskom masenom spektrometru (Q-TOF Ultima, Waters) opremljenom sa ESI izvorom. Pulovi peptida su postavljeni na Cl8 pre-kolonu radi koncentracije i desalinizacije. Nakon postavljanja, pre-kolona je postavljena na liniju za separaciju pomoću mikrokapilarne kolone od fuzirane silike (75 μm i.d. x 250 mm) upakovane sa 5 μm Cl8 reverzno-faznog materijala (Dionex). Rastvarač A je bio 4 mmol/1 amonijum acetat/voda. Rastvarač B je bio 2 mmol/1 amonijum acetat u 80% acetonitrilu/voda. Oba rastvarača su pomoću mravlje kiseline prilagođena na pH 3,0. Izvršen je binarni gradijent od 15% do 60% B u okviru 90 minuta, primenjivanjem brzine protoka od 5 pl/min koji je smanjen do približno 200 nl/min pomoću split sistema. Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, Nevv Objective) je korišćena za uvođenje u mikro-ESl izvor. Vreme integracije za TOF analizator iznosilo je 1,9 s sa kašnjenjem međuskeniranja od 0,1 s. Nakon toga, peptidne sekvence su otkrivene masonom spektrometrijom kolizijom indukovane disocijacije (CID) (ESI-LCMS/MS). Identifikovana TUMAP sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog TUMAP-a sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.

Metod dva:

Dobijeni skupovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hiđrofobnosti pomoću reverzno-fazne hromatografije (Acauitv UPEC sistem, Waters), a eluirani peptidi su analizirani u ETQ-Orbitrap hibridnom masenom spektrometru (ThermoElectron) opremljenom ESI izvorom. Skupovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilamu kolonu od fuzirane silike (75 μm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 μm Cl8 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta iz 10% do 33% B pri brzinama protoka od 300 ni u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0.1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, Nevv Objective) je korišćena za uvođenje u mikro-ESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometar je radio u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciranje ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u orbitrap (R = 30 000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana TUMAP sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog TUMAP-a sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence. Na slikama la i b prikazan je primemi spektar koji je dobijen iz tumorskog tkiva za MHC klasa I-asocirane TlJMAP-e.

Tabela 3: Popis uzoraka tumora na kojima su identifikovani peptidi

PRIMER 2

Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju peptid pronalaska

Nisu svi peptidi koji su identifikovani kao da su prezentovani na površini tumorskih ćelija od strane MHC molekula pogodni za imunoterapiju, zato što je većina ovih peptida dobijena iz normalnih ćelijskih proteina koje eksprimiraju mnoge vrste ćelija. Samo nekoliko ovih peptida je tumor-asocirano i verovatno je da su sposobni da indukuju T ćelije sa velikom specifičnošću prepoznavanja za tumor iz kojeg su dobijeni. Da bi identifikovali takve peptide i sveli rizik od autoimunosti indukovane vakcinacijom na minimum, pronalazači su se fokusirali na one peptide koji su dobijeni od proteina koji su prekomerno eksprimirani na tumorskim ćelijama u poređenju sa većinom normalnih tkiva.

Idealni peptid će biti izveden iz proteina koji je jedinstven za tumor i nije prisutan u bilo kom drugom tkivu. Da bi se identifikovali peptidi koji su dobijeni iz gena sa profilom ekspresije sličnim idealnom, identifikovani peptidi su dodeljeni proteinima, odnosno genima, iz kojih su dobijeni i generisani su profili ekspresije ovih gena.

RNK izvori i priprema

Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su od strane dve različite kliničke lokacije (pogledajte primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem u tečnom azotu neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani sa malterom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna

RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRlzol (Invitrogen, Karlsruhe. Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Milden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva dobijena je komercijalno (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Nemačka; Stratagene, Amsterdam, Holandija; BioChain, Hayward, CA, SAD). RNK od nekoliko pojedinaca (između 2 i 123 osobe) je izmešana tako da je RNK od svakog pojedinca bila težinski podjednaka. Leukociti su izolovani iz uzoraka krvi 4 zdrava dobrovoljca.

Kvalitet i kvantitet svih RNK uzoraka procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).

Eksperimenti na mikročipu

Analiza genske ekspresije svih uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je pomoću Affymetrix Human Genome (HG) U133A ili HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotidnih mikročipova (Affymetrix, Santa Clara, CA, SAD). Svi koraci su izvršeni u skladu sa priručnikom za Affymetrix

(http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx). Ukratko, sintetisana je dvolančana cDNK iz 5-8 μg ukupne RNK, primenom SuperScript RTU (Invitrogen) i oligo-dT-T7 prajmera (MWG Biotech, Ebersberg, Nemačka) kako je opisano u priručniku. In vitro transkripcija je izvršena sa kompletom BioArray Iligh Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Ine., Farmingdale, NY, SAD) za U133A čipove ili sa kompletom GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) za U133 Plus 2.0 čipove, nakon čega je sledila fragmentacija, hibridizaeija i bojenje cRNK sa streptaviđin-fikoeritrin i biotiniHranim anti-streptavidin antitelom (Molecular Probes, Leiden, Holandija). Slike su skenirane skenerom Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) ili Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), a podaci su analizirani sa GCOS softverom (Affymetrix), upotrebom pođrazumevanih podešavanja za sve parametre. Za normalizaciju je korišćeno 100 konstitutivnih gena obezbeđenih od strane kompanije Affymetrix (http://www.affymetrix.com/support/technical/mask_files.affx). Vrednosti relativne ekspresije izračunate su iz logaritamskih odnosa signala đatih od strane softvera, a normalni uzorak je arbitrarno podešen na 1,0.

Profil ekspresije izvornog gena peptida predmetnog pronalaska (PTPRZ1) pokazuje visoku ekspresiju u tumorskom tkivu glioblastoma pri čemu gen nije eksprimiran ili je eksprimiran u veoma malim nivoima u normalnim tkivima (si. 2).

PRIMER 3

In vitro imunogenost MHC klasa I-prezentovanih peptida

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Kako bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPC) napunjenih sa kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, pronalazači su prvo izolovali PBMC (mononukleame ćelije periferne krvi) iz svežih HLA-A*02+ trombocitno-leukocitnih međuslojeva primenom standardnog medijuma za separaciju na osnovu gradijenta gustine (PAA, Cölbe, Nemačka). Trombocitno-leukocitni međuslojevi su dobijeni od Katharinenhospital Stuttgart. Izolovane PBMC su inkubirane preko noći u T-ćelijskom medijumu (TCM) za humanu in vitro pripremu koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAA, C5lbe, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 μm/ml streptomicina (Cambrex„ Verviers, Belgija), 1 mmol/1 natrijum piruvata (CC Pro, Neustadt, Nemačka) i 20 μm/ml gentamicina (Cambrex,). CD8+ limfociti su izolovani primenom CD8+ MACS kompleta za pozitivnu selekciju (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Nemačka) u skladu sa uputstvima proizvođača. Dobijene CD8+ T ćelije su inkubirane do upotrebe u TCM u koji je dodato 2.5 ng/ml 1L-7 (PromoCell, Heidelberg, Nemačka) i 10 U/ml 1L-2 (Chiron, Munich, Nemačka). Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanja su izvršena na ranije opisan način (Walter et al., 2003) sa manjim modifikacijama. Ukratko, biotinilirani rekombinantni HLA-A*0201 molekuli kojima nedostaje transmembranski đomen i koji su biotinilirani na karboksi kraju teškog lanca su proizvedeni pomoću metoda opisanog od strane (Altman et al., 1996). Prečišćeno ko-stimulatomo mišje IgG2a anti humano CD28 At 9.3 (Jung et al., 1987) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom veličine 5,60 μm (Bangs Laboratories, Illinois/SAD). pMHC koje su korišćene kao pozitivna i negativna kontrola bile su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIG1LTV iz modifikovanog Melan-A/MART-1), odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPA1VHI iz DDX5).

800.000 perli / 200 pl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 600 ng biotin anti-CD28 plus 200 ng relevantnih biotin-pMHC (perle velike gustine) ili 2 ng relevantnih plus 200 ng irelevantnih (pMHC biblioteka) MHC (perle male gustine). Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem lxl06 CD8+ T ćelija sa 2xl05 ispranih obloženih perli u 200 μl TCM u koji je dodato 5 ng/ml 1L-12 (PromoCell) u toku 3-4 dana na 37°C. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 3-4 dana na 37°C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Na kraju, tetrameme analize su izvršene sa fluorescentnim MHC tetramerima (proizvedenim na način opisan od strane (Altman et al., 1996)) plus klonom SK1 antitela CD8-FITC (BD, Heidelberg, Nemačka) na FACSCalibur ili LSR II protočnom citometru (BD). Peptidno-specifične ćelije su izračunate kao procenat ukupnih CD8+ T ćelija. Evaluacija tetrameme analize izvršena je korišćenjem softvera FCS Express (De Novo Software). In vitro priprema specifičnih tetramer+ CD8+ limfocita detektovana je odgovarajućom sinkronizacijom i upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih tetramer+ među CD8+ T ćelijama, a procenat specifičnih tetramer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od srednje vrednosti stimulacija negativne kontrole).

Reprezentativno bojenje koje prikazuje stvaranje T-ćelijskih linija specifičnih za PTP-002 i PTP-001 prikazano je na slici 3. Rezultati su sumirani u tabeli 4 ispod.

Tabela 4: In vitro imunogenost peptida, PTP-001 je peptid pronalaska

Rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane pronalazača i podnosioca immatics koji pokazuju procenat pozitivnih testiranih donora i mesta sumirani su ovde. Prikazani rezultati dobijeni su stimulacijom CD8+ ćelija sa perlama velike gustine. Kako različite serije humanih seruma mogu jako da utiču na rezultate imunogenosti, samo eseji u kojima je korišćena jedna te ista serija seruma su evaluirani zajedno.

Allison AC 1998; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand.; 92:3-11

Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, Heyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Daviš MM (1996). Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274, 94-96.

Appay V, Speiser DE, Rufer N, Reynard S, Barbey C, Cerottini JC, L.eyvraz S, Pinilla C, Romero P (2006). Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition follovving vaccination with Melan-A peptide. Eur. J Immunol. 36, 1805-1814.

Ariyama T, Elasegawa K, Inazawa J, Mizuno K, Ogimoto M, Katagiri T, Yakura H (1995). Assignment of the human protein tyrosine phosphatase, receptor-type. zeta (PTPRZ) gene to chromosome band 7q31.3. Cytogenet. Cell Genet. 70,52-54.

Bamea G, Silvennoinen O, Shaanan B, Honegger AM, Canoll PD, D'Eustachio P, Morse B, Levy JB, Laforgia S, Huebner K, . (1993). Identification ofa carbonic anhvdrase-like domain in the extracellular region of RPTP gamma defmes a new subfamily of receptor tyrosine phosphatases. Mol. Cell Biol. 13, 1497-1506.

Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H. Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM (1998). Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic miče and HLA-DQ transgenic miče. Int. Immunol. 10, 1765-1776.

Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F.(2004) From production of peptides in milligram amounts for research to multi-ton quantities for drugs of the future Curr Pharm Biotechnol. Feb; 5(l):29-43

Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markov/ski-Grimsrud CJ, Sve 1, Dyrhaug M, Trachsel S, Moller M, Eriksen JA, Gaudemack G (2006); Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother.; 55(12):1553-1564

Burton EC, Prados MD (2000). Malignant gliomas. Curr. Treat. Options. Oncol 1, 459-468.

CBTRUS. Primary Brain Tumors in the United States, Statistica! Report. 2006.

Ref Type: Internet Communication

Cheever MA, Chen W, Disis ML, Takahashi M, Peace DJ (1993). T-cell immunity to oncogenic proteins including mutated ras and chimeric bcr-abl. Ann N. Y. Acad. Sci. 690, 101-112.

Colombetti S, Basso V, Mueller DL, Mondino A (2006). Prolonged TCR/CD28 engagement drives IL-2-independent T cell clonal expansion through signaling mediated by the mammalian target of rapamycin. J Immunol. 176, 2730-2738.

Cresswell P (1994). Assembly, transport, and function of MHC class 11 molecules. Annu.

Rev. Immunol. 12, 259-293.

Dazzi C, Cariello A, Giannini M, Del DM, Giovanis P, Fiorentini G, Leoni M, Rosti G, Turci D, Tienghi A, Vertogen B, Zumaglini F, De GU, Marangolo M (2000). A sequential chemo-radiotherapeutic treatment for patients with malignant gliomas: a phase 11 pilot stuđy. Anticancer Res. 20, 515-518.

Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wemet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S (2006). Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas. Clin Cancer Res. 12, 4163-4170.

Dix AR, Brooks WH, Roszman TL, Morforđ LA (1999). fmmune defects observed in patients with primary malignant brain tumors. J Neuroimmunol. 100, 216-232.

Dudley ME, Wunderlich JR, Robbins PF, Yang JC, Hwu P, Schwartzentruber DJ. Topalian SL, Sherry R, Restifo NP, Hubicki AM, Robinson MR, Raffeld M, Duray P, Seipp CA, Rogers-Freezer L, Morton KE, Mavroukakis SA, White DE, Rosenberg SA (2002). Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation vvith antitumor lymphocytes. Science 298, 850-854.

Dudley ME, Wunderlich JR, Yang JC, Sherry RM, Topalian SL, Restifo NP, Royal RE, Kammula U, White DE, Mavroukakis SA, Rogers LJ, Gracia GJ, Jones SA, Mangiameli DP, Pelletier MM, Gea-Banacloche J, Robinson MR, Berman DM, Filie AC, Abati A. Rosenberg SA (2005). Adoptive cell transfer therapy foiiovving non-myeloablative but iymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients vvith refractory metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 23, 2346-2357.

Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM (1998); Dendritic cells intemalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol.;

186(1): 18-27

Falk,K., Rotzschke,0., Stevanovic,S., Jung,G. & Rammensee,H.G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 351,290-296 (1991)

Fong L, Brockstedt D, Benike C, Wu L, Engleman EG (2001a). Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. J. Immunol. 166, 4254-4259.

Fong L, Hou Y, Rivaš A, Benike C, Yuen A, Fisher GA, Daviš MM, Engleman EG (2001b). Altered peptide ligand vaccination vvith Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 8809-8814.

Gabrilovich Dl, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418

Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pages C. Tosolini M, Camus M, Berger A, Wind P, Zinzindohoue F, Bruneval P, Cugnenc PH, Trajanoski Z, Fridman WH, Pages F (2006). Type, density, and location of immune cells vvithin human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313, 1960-1964.

Gattinoni L, Povvell DJ, Jr., Rosenberg SA, Restifo NP (2006). Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat. Rev. Immunol. 6, 383-393.

Gebbink MF, van E, I, Hateboer G, Suijkerbuijk R, Beijersbergen RL, Geurts van KA, Moolenaar WH (1991). Cloning, expression and chromosomal localization of a new putative receptor-like protein tyrosine phosphatase. FEBS Lett. 290. 123-130.

Gnjatic S, Atanackovic D, Jager E, Matsuo M, Selvakumar A, Altorki NK, Maki RG, Dupont B, Ritter G, Chen YT, Knuth A, Old LJ (2003). Survey of naturally occurring CD4+ T cell responses against NY-ESO-l in cancer patients: correlation with antibody responses. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 8862-8867.

Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F (1995). Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association. J Exp. Med 181, 1847-1855.

Hanada K, Yewdell JW, Yang JC (2004). Immune recognition of a human renal cancer antigen through post-translational protein splicing. Nature 427, 252-256.

Harroch S, Furtado GC, Brueck W, Rosenbluth J, Lafaille J, Chao M, Buxbaum JD, Schlessinger J (2002). A critical role for the protein tyrosine phosphatase receptor type Z in functional recovery from demyelinating lesions. Nat. Genet. 32, 411-414.

Heimberger AB, Hussain SF, Aldape K, Sawaya R, Archer GA, Friedman H, Reardon D, Friedman A, Bigner DD, Sampson JH. Tumor-specific peptide vaccination in newly-diagnosed patients vvith GBM. Journal of Clinical Oncologv. 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part 1 Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: 2529. 6-20-2006.

Hill et al (1995) J. Exp. Med. 181,2221-2228

Jerome et al (1993) J. Immunol. 151, 1654-1662

Jochmus et al (1997) J. Gen. Virol. 78, 1689-1695

Jung G, Ledbetter JA, Muller-Eberhard HJ (1987). Induction of cvtotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc Natl Acad Sci U S A 84, 4611-4615.

Kaplan R, Morse B, Huebner K, Croce C, Howk R, Ravera M, Ricca G, Jave M. Schlessinger J (1990). Cloning of three human tyrosine phosphatases reveals a multigene family of receptor-linked protein-tyrosine-phosphatases expressed in brain. Proc Natl. Acad. Sci. U. S.

A 87, 7000-7004.

Karre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162. 1745 Kavvakami et al (1992) J. Immunol. 148, 638-643

Kennedy RC, Shearer MH, Watts AM, Bright RK (2003). CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 63, 1040-1045.

Kobayashi H, Omiya R, Ruiz M, Huarte E, Sarobe P, Lasarte .1.1, Herraiz M. Sangro B, Prieto J, Borras-Questa F, Celis E (2002). Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin Cancer Res. 8, 3219-3225.

Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation 2006, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, JUNE, 471-484

Krueger NX, Streuli M, Saito H (1990). Structural diversity and evolution of human receptor-like protein tyrosine phosphatases. EMBO J 9, 3241-3252.

Lemmel C, Weik S, Eberle U, Dengjel J, Kratt T, Becker HD, Rammensee HG, Stevanovic S (2004). Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol. 22, 450-454.

Levy JB, Canoll PD, Silvennoinen O, Bamea G, Morse B, Honegger AM, Huang JT, Cannizzaro LA, Park SH, Druck T,. (1993). The cloning of a receptor-type protein tyrosine phosphatase expressed in the Central nervous system. J Biol. Chem. 268, 10573-10581.

Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291

Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433

Lu KV, Jong KA, Kim GY, Singh J, Dia EQ, Yoshimoto K, Wang MY, Cloughesy TF, Nelson SF, Mischel PS (2005). Differential induction of glioblastoma migration and grovvth by two forms of pleiotrophin. J Biol Chem. 280, 26953-26964.

Macdonald DR (2001). Temozolomide for recurrent high-grade glioma. Semin. Oncol 28, 3-12.

Mach B, Steimle V, Martinez-Soria E, Reith W (1996). Regulation of MHC class 11 genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14, 301-331.

A Mahdavi and BJ Monk Recent advances in human papillomavirus vaccines Curr Oncol Rep 2006, 6, 465-472.

Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A (1994). Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands. .1 Immunol. 153, 1141-1149.

Manici S, Stumiolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP (1999). Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DRI 1. J Exp. Med 189, 871-876.

Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, Hughes MS, Yang JC, Sherry RM, Royal RE, Topalian SL, Kammula US, Restifo NP, Zheng Z, Nahvi A, de Vries CR, Rogers-Freezer LJ, Mavroukakis SA, Rosenberg SA (2006). Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes. Science.

Mulholland PJ, Fiegler H, Mazzanti C, Gorman P, Sasieni P, Adams .1, Jones TA, Babbage JW, Vatcheva R, Ichimura K, East P, Poullikas C, Collins VP, Čarter NP, Tomlinson IP, Sheer D (2006). Genomic profiling identifies discrete deletions associated with translocations in glioblastoma multiforme. Cell Cycle 5, 783-791.

Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. (1984) The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872.

Napolitano M, Keime-Guibert F, Monjour A, Lafitte C, Ameri A, Comu P, Broet P, Delattre JY (1999). Treatment of supratentorial glioblastoma multiforme with radiotherapy and a combination of BCNU and tamoxifen: a phase IJ study. J Neurooncol. 45, 229-235.

Nieder C, Grosu AL, Moliš M (2000). A comparison of treatment results for recurrent malignant gliomas. Cancer Treat. Rev. 26, 397-409.

Novellino L, Castelli C, Parmiani G (2005). A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update. Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207.

Pascolo S. 2006: Vaccination with messenger RNA Methods Mol Med, 127; 23-40

Peoples et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,432-436

Perez-Pinera P, Garcia-Suarez O, Menenđez-Rodriguez P, Mortimer J, Chang Y. Astudillo A, Deuel TF (2007). The receptor protein tyrosine phosphatase (RPTP)beta/zeta is expressed in different subtvpes of human breast cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 5-10.

Plebanski et al (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1783-1787

Porta et al (1994) Virology 202, 449-955

Prados MD. Levin V (2000). Biologv and treatment of malignant glioma. Semin. Oncol 27. 1-

10.

Qin Z, Blankenstein T (2000). CD4+ T cell—mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamraa receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12, 677-686.

Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T (2003). A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells. Cancer Res. 63, 4095-4100.

Rammensee HG, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1999). SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50, 213-219.

Rammensee,H.G., Bachmann,J., and Stevanovic,S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany).

Rini BI, Weinberg V, Fong L, Conry S, Hershberg RM, Small EJ (2006); Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells (Provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy; Cancer.; 107(l):67-74)

Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitman S, Linehan WM, Robertson CN, Lee RE, Rubin JT,. (1987). A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone. N. Engl. J. Med. 316, 889-897.

Rosenberg SA, Packard BS, Aebersold PM, Solomon D, Topalian SL. Toy ST, Simon P, Lotze MT, Yang JC, Seipp CA,. (1988). Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminarv report. N. Engl. J Med 319, 1676-1680.

Roth W, Weller M (1999). Chemotherapy and immunotherapy of malignant glioma: molecular mechanisms and clinical perspectives. Cell Mol. Life Sci. 56, 481-506.

Sablotzki A, Ebel H, Muhling J, Dehne MG, Nopens H, Giesselmann H, Hempelmann G (2000). Dysregulation of immune response follovving neurosurgieal operations. Acta Anaesthesiol. Scand. 44, 82-87.

Saiki et al (1988) Science 239,487-491

Small EJ, Schellhammer PF, Higano CS, Redfem CH, Nemunaitis JJ, Valone FH, Verjee SS, Jones LA, Hershberg RM. (2006); Placebo-controlled phase 3 trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients vvith metastatic, asymptomatic hormone refractorv prostate cancer; J Clin Oncol.; 24(19):3089-3094

Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR (2000). Rapid degradation of a large fraction of newly svnthesized proteins by proteasomes. Nature 404, 770-774.

Seeger,F.FI. et al. 1999 The HLA-A*6601 peptide motif: prediction by pocket structure and verification by peptide analysis. Immunogenetics 49, 571-576.

Shedlock DJ, Shen H (2003). Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science 300. 337-339.

Singh-Jasuja H, EmmerichNP, Rammensee HG (2004). The Tubingen approach: iđentification, selection, and validation of tumor-associated HLA peptides for cancer therapv. Cancer Immunol. Jmmunother. 53, 187-195.

M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. F.isen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief (2008); An open label study to evaluate the safety and immunogenicity ofthe peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017

R. Stan, JD Wolchok and AD Cohen DNA vaccines against cancer Hematol Oncol Clin North Am 2006, 3; 613-636

Sun JC, Bevan MJ (2003). Defective CD8 T cell memory following acute infection vvithout CD4 T cell help. Science 300, 339-342.

Sylvester-Hviđ C, Kristensen N, Blicher T, Ferre H, Lauemoller SL, Wolf XA, Lamberth K., Nissen MH, Pedersen LO, Buus S (2002). Establishment of a quantitative ELISA capable of determining peptide - MHC class I interaction. Tissue Antigens 59. 251-258.

Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE (1993). A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins. J Immunol. Methods 163, 209-216.

van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De PE, Van den EB, Knuth A. Boon T (1991). A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254, 1643-1647.

Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van đer BP, Boon T, Van Den Eynde BJ (2004). An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome. Science 304, 587-590.

Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R (1994). Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 andDRBl*1501 molecules delineated from self-peptides. J Immunol. 153, 1665-1673.

Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wemet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S (2003). Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 171, 4974-4978.

Wang JC, Livingstone AM (2003). Cutting edge: CD4+ T cell help can be essential for primary CD8+ T cell responses in vivo. .1 Immunol. 171, 6339-6343.

Wang V, Daviš DA, Haque M, Huang LE, Yarchoan R (2005). Differential gene up-regulation by hypoxia-inducible factor-lalpha and hypoxia-inducible factor-2alpha in HEK293T cells. Cancer Res. 65, 3299-3306.

Weinschenk T, Gouttefangeas C, Schirle M, Obermayr F, Walter S, Schoor O, Kurek R, Loeser W, Bichler KH, Wemet D, Stevanovic S, Rammensee HG (2002). Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. <52,5818-5827.

Wu CW, !Lost Data, Li AF, Chi CW, Lin WC (2006). Protein tyrosine-phosphatase expression profiling in gastric cancer tissues. Cancer Lett. 242, 95-103.

Yee C-, Thompson JA, Byrd D, Riddell SR, Roche P, Celis E, Greenberg PD (2002). Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173.

Zaremba S, Barzaga E, Zhu M, Soares N, Tsang KY, Schlom .1 (1997). Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen. Cancer Res. 57, 4570-4577.

Zeh HJ, III, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC (1999). High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy. J Immunol. 162, 989-994.

Claims (12)

1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID. BR. SEKV 1.

2.Peptid u skladu sa patentnim zahtevom l, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog peptida koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (li).

3.Nukleinska kiselina koja kodira peptid u skladu sa patentnim zahtevom I ili 2.

4.Vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 3.

5.Peptid u skladu sa patentnim zahtevom l ili 2, nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 3 ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4 za upotrebu u medicini.

6.Izolovana ćelija domaćin koja nije humana embrionska matična ćelija. koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnm zahtevom 3 ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno antigen-prezentujuća ćelija ili konkretno dendritična ćelija.

7.Metod za proizvodnju peptida u skladu sa patentnim zahtevom I ili 2, metod koji sadrži kultiviranje ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 6 koja eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 3 ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, i izolovanje peptida iz ćelije domaćina ili njegovog medijuma za kultivaciju.

8.ln vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), metod koji se sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase l sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid u skladu sa patentnim zahtevom l.

9.Peptid u skladu sa patentnim zahtevom l ili 2, nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 3, vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 6 za upotrebu u lečenju raka.

10.Peptid u skladu sa patentni m zahtevom l ili 2, nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 3, vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 6 za upotrebu u proizvodnji leka protiv raka.

11.Peptid u skladu sa patentnim zahtevom l ili 2, nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 3, vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 6 za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom l O, naznačeno time što je navedeni lek vakcina.

12.Peptid u skladu sa patentnim zahtevom l ili 2, nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 3, vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 6 za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom l O ili ll, naznačeno time što je navedeni maligni tumor tumor izabran iz grupe koju čine astrocitom, pilocitni astrocitom, disembrioplastični neuroepitelijalni tumor, oligodendrogliomi, ependimom, glioblastom multifonne, mešoviti gliomi. oligoastrocitomi, meduloblastom, retinoblastom, neuroblastom, germmom, teratom, gangliogliomi, gangliocitom, centralni gangliocitom, primitivni neuroektodermalni tumori (PNET), meduloblastom, meduloepiteliom, neuroblastom, retinoblastom, ependimoblastom, tumori parenhima epifize (npr. pineocitom, pineoblastom), tumori ependimalnih ćelija, tumori horoidnog pleksusa, neuroepitelijalni tumori nejasnog porekta, gliomatoza mozga, astroblastom i glioblastom.