ES2556328T3 - Reactivos con funcionalidad tiol y sus usos - Google Patents

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Abstract

Un método para modificar un polipéptido que al menos tiene un grupo tiol reactivo, método que comprende poner en contacto el polipéptido con un reactivo funcionalizante el cual comprende un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno que tiene un sustituyente vinílico capaz de reaccionar con el al menos un grupo tiol del polipéptido, donde el reactivo funcionalizante está covalentemente enlazado a un grupo glicano, de modo que el sustituyente vinílico del reactivo funcionalizante reaccione con el grupo tiol del polipéptido, para de este modo enlazar covalentemente el grupo glicano al polipéptido, caracterizado porque el reactivo funcionalizante está representado por una de las fórmulas generales:**Fórmula** donde: al menos R1, y opcionalmente R2, están covalentemente enlazados a un grupo glicano; y además donde: R1, y opcionalmente R2, se seleccionan independientemente de: -(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R, en el que Z es S o NH, n es 0 a 10, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -(CH2)n-Z-(CH2)o-R, en el que Z es S o NH, n es 0 a 10, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -(CO)-Z-(CH2)o-R, en el que Z es S o NH, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R, en el que Z es S o NH, n es 0 a 10, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R, en el que Y es un grupo arilo, S o NH, Z es NH, n es 0 a 10, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -Y-R, en el que Y es S, R es un hidrógeno, un glicano, una molécula de polialquilenglicol, arilo o alquilo de C1-10; con la condición de que cuando R2 no esté enlazado a una molécula de polialquilenglicol o a un grupo glicano, puede adicionalmente seleccionarse de hidrógeno o de un grupo aceptor de electrones, tal como halógeno (F, Cl, o Br), -NO2, -CO2H, -CO2R4, COR4, -CHO, -CN, -CF3, -SO2NR4R5, alquilo o fenilo, en los que R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno o alquilo de C1-10.

Description

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se usan para fabricar vacunas conjugadas). Ejemplos específicos de polipéptidos que pueden emplearse incluyen el factor estimulante de colonias (CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), Factor VIIa, Factor VIII, Factor IX, hormona del crecimiento humano (hGH), DNasa, insulina, glucagón, VEGF, receptor de VEGF, TNF, receptor de TNF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), activador tisular del plasminógeno (tPA), eritropoyetina (EPO), enfurvirtida, factor del crecimiento semejante a la insulina (IGF), factor del crecimiento de los nervios (NGF), IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL18, IL-24, interferón beta-1a, interferón beta-1b, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa, o interferón gamma.
En la presente invención, las referencias a polipéptidos que son anticuerpos incluyen inmunoglobulinas, ya sean naturales o producidas parcial o completamente sintéticamente. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprenda un dominio enlazante de antígenos. Los fragmentos de anticuerpos que comprenden un dominio enlazante de antígenos incluyen Fab, scFv, FV, qAb, fragmentos Fd, diacuerpos, triacuerpos o nanocuerpos. Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de tecnología de DNA recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quimera que retengan la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden implicar introducir DNA que codifica la región variable de la inmunoglobulina, o las regiones que determinan la complementariedad (CDRs), de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones marco, de una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, los documentos EP 0 184 187 A, GB 2.188.638 A o EP 0 239 400 A. Los anticuerpos pueden modificarse de varias formas y el término debe interpretarse que cubre cualquier miembro o sustancia enlazante específico que tenga un dominio anticuerpo enlazante de antígenos con la requerida especificidad. Así, este término cubre fragmentos de anticuerpos y derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio enlazante de inmunoglobulinas, ya sea natural o completa o parcialmente sintético. Por lo tanto, están incluidas moléculas quimera que comprenden un dominio enlazante de inmunoglobulinas, o equivalente, condensado con otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quimera se describen en los documentos EP 0 120 694 A y EP 0 125 023 A.
Se ha mostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de antígenos enlazantes. Ejemplos de fragmentos enlazantes son (i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; ( iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un anticuerpo único; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos; (vii) moléculas Fv de cadena única (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un agente enlazante péptido el cual permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio enlazante de antígenos (Bird et al, Science, 242; 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988);
(viii) dímeros Fv biespecíficos de cadena única (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos por fusión de genes (documento WO 94/13804; Holliger et al, P.N.A.S. USA, 90: 6444-6448, 1993). Fv, scFv o moléculas diacuerpos pueden estabilizarse por la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter et al, Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996). También pueden fabricarse minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu et al, Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996).
Métodos de modificar o funcionalizar proteínas
La presente invención proporciona un método conveniente para modificar o funcionalizar una proteína de interés usando grupos tiol que están presentes en, o que han sido previamente introducidos en, el polipéptido, por ej., en uno o más residuos de cisteína. En realizaciones preferidas, los métodos descritos en la presente memoria emplean reactivos y condiciones que están bien adaptadas para modificar proteínas y otros materiales biológicos. En particular, las condiciones de reacción que se usan en el presente método ayudan a evitar los problemas que tienden a ocurrir cuando se usan reactivos de la técnica anterior tales como maleimida, los cuales tienen una tendencia para producir una mezcla de diferentes productos con una gama de diferentes propiedades.
Como se mencionó anteriormente, el polipéptido de interés puede modificarse usando grupos tiol existentes o introduciendo grupos tiol en una etapa inicial del método, por ejemplo haciendo reaccionar uno o más grupos funcionales del polipéptido para producir un grupo tiol, o introduciendo un grupo tiol o un precursor del mismo en el polipéptido. A modo de ejemplo, esto puede implicar la etapa de introducir un residuo de cisteína en el polipéptido en un sitio en el que se desee funcionalizar el polipéptido. Esto puede ser útil en situaciones en las que un residuo de cisteína conveniente para reaccionar según la presente invención no esté presente en un polipéptido de partida o de tipo natural. Convenientemente, esto puede lograrse usando mutagénesis dirigida al sitio del polipéptido, el uso de la cual está bien establecido en la técnica.
Los presentes métodos son particularmente apropiados para usar en la funcionalización de polipéptidos con moléculas de polialquilenglicol o grupos glicano. Un uso preferido de los métodos y reactivos de la presente invención es para glicosilar un polipéptido de interés con uno o más grupos glicano. El grupo carbohidrato puede ser un monosacárido, oligosacárido o polisacárido sintético o que se encuentre en la naturaleza. Este enfoque puede usarse para añadir glicosilación a una proteína de interés, o para introducir glicosilación donde se desea la glicosilación pero no se introduce en el curso de la producción de la proteína, por ej., en virtud del hecho de que la proteína ha sido producida en células bacterianas o, particularmente para péptidos, cuando han sido producidos por síntesis química.
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La capacidad para controlar la glicosilación en sitios definidos usando la presente invención representa una herramienta útil para proteínas recombinantes diseñadas por ingeniería genética, por ejemplo proteínas y anticuerpos terapéuticos, y sus fragmentos, en su fabricación y en el control de su inmunogenia y propiedades farmacológicas tales como la vida media. Actualmente, la fabricación de proteínas recombinantes terapéuticas es cara y lenta ya que las líneas de células de mamíferos son con frecuencia usadas en la fabricación para asegurar que las proteínas son glicosiladas. Los métodos descritos en la presente memoria pueden ser usados para añadir glicosilación a un polipéptido después de la producción en líneas de células bacterianas, en las cuales la expresión es en general más eficiente, ayudando de este modo a mejorar la velocidad y/o la economía de la producción de proteínas, a la vez que se retiene la glicosilación. Alternativamente, para polipéptidos expresados en líneas de células que glicosilan productos de expresión, la presente invención puede ser usada para modificar o añadir glicosilación.
En realizaciones preferidas, los carbohidratos empleados pueden comprender derivados químicamente modificados de oligosacáridos ramificados que se encuentran en la naturaleza, comúnmente mostrados en glicoproteínas N-u Oenlazadas, o en sus productos de degradación. Los grupos carbohidratos que pueden ser usados en la presente invención son bien conocidos en la técnica e incluyen grupo carbohidratos encontrados en la glicosilación N-y Oenlazada de grupos carbohidratos de proteínas eucariotas y sintetizadas por el hombre, véase, por ej., los grupos carbohidratos y los métodos de producirlos e identificarlos descritos en los documentos WO 03/025133 y W02004/083807.
Los glicanos N-enlazados se encuentran unidos al nitrógeno del grupo R (N) de la asparagina en el secuón. El secuón es una secuencia de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que x es cualquier aminoácido excepto prolina y puede estar compuesta de N-acetilgalactosamina, galactosa, ácido neuramínico, N-acetilglucosamina, fructosa, manosa, fucosa y otros monosacáridos.
En eucariotas, Los glicanos N-enlazados se derivan de un núcleo de 14 unidades de azúcar ensamblado en el citoplasma y en el retículo endoplasmático. En primer lugar, dos residuos de N-acetilglucosamina están unidos a fosfato de dolicol, un lípido, en el lado externo de la membrana del retículo endoplasmático. A continuación, a esta estructura se añaden cinco residuos de manosa. En este punto, el núcleo de glicano parcialmente acabado es volteado a lo largo de la membrana del retículo endoplasmático, de modo que ahora está localizado dentro del lúmen reticular. A continuación, el ensamblaje continúa dentro del retículo endoplasmático con la adición de cuatro residuos más de manosa. Finalmente, se añaden tres residuos de glucosa a esta estructura. Tras el ensamblaje total, el glicano es transferido en bloque mediante la glicosiltransferasa oligosacariltransferasa a una cadena de péptido naciente, dentro del lúmen reticular. Esta estructura núcleo de glicanos N-enlazados consiste de este modo en 14 residuos (3 glucosa, 9 manosa, y 2 N-acetilglucosamina).
En eucariotas, glicanos O-enlazados, se ensambla un azúcar a la vez en un residuo de serina o treonina de una cadena de péptido en el aparato de Golgi. A diferencia de con los glicanos N-enlazados, no existe hasta el momento ninguna secuencia de consenso conocida. Sin embargo, la colocación de un residuo de prolina en -1 ó +3 relativa a la serina o la treonina es favorable para la glicosilación O-enlazada.
El primer monosacárido unido en la síntesis de glicanos O-enlazados es N-acetil-galactosamina. Después de esto, son posibles varias rutas diferentes. Se genera una estructura núcleo 1 por la adición de galactosa. Se genera una estructura núcleo 2 por la adición de N-acetil-glucosamina a la N-acetil-galactosamina de la estructura núcleo 1. Se generan estructuras núcleo 3 mediante la adición de una única N-acetil-glucosamina a la N-acetil-galactosamina original. Se generan estructuras núcleo 4 mediante la adición de una segunda N-acetil-glucosamina a la estructura núcleo 3. Son posibles otras estructuras núcleo, aunque son menos comunes.
Un tema estructural común en glicanos O-enlazados es la adición de unidades de polilactosamina a las diversas estructuras núcleo. Éstas se forman mediante la adición repetitiva de galactosa y unidades de N-acetilglucosamina. Con frecuencia, las cadenas de polilactosamina en glicanos O-enlazados están rematadas mediante la adición de un residuo de ácido siálico (similar al ácido neuramínico). Si también se añade un residuo de fucosa, al residuo siguiente al penúltimo se forma una estructura sialil-lewis-X (SLex)).
Los métodos de la presente invención también pueden usarse para fabricar vacunas conjugadas, por ej., vacunas conjugadas formadas enlazando una o más moléculas de antígeno a una proteína portadora, confiriendo de este modo las características inmunológicas a la proteína vehículo sobre la molécula de antígeno. Este enfoque se usa con frecuencia cuando la molécula de antígeno es un grupo glicano (por ej., un polisacárido antigénico) ya que comparativamente tienden a ser peores antígenos.
Los métodos descritos en la presente memoria permiten que se unan múltiples moléculas de antígeno a la proteína portadora, preferiblemente en una posición de la proteína portadora, mediante el uso de los reactivos funcionalizantes de la presente invención. Ejemplos de vacunas conjugadas incluyen: vacunas de Haemophilus influenzae tipo B ("vacuna Hib”), en las cuales un polisacárido Hib está conjugado a una proteína portadora tal como tetanospasmina, una proteína mutante de la difteria o una proteína de la membrana externa de los meningococos del grupo B; vacunas de conjugados de meningococos en las cuales están conjugados uno o más polisacáridos del serogrupo de la meningitis meningocócica (por ej., A, C, Y o W-135) a una proteína portadora; vacunas pneumocócicas de polisacáridos (PPSV) en las cuales los polisacáridos son azúcares de membranas celulares de
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Se disolvió (4-bromopiridin-2-il)metanol (100 mg, 0,53 mmol) en THF seco (10 mL) y se enfrió a 0°C. Se añadieron cloruro de tosilo (2 eq., 202,8 mg, 1,06 mmol) y NaOH 1M (0,7 mL) y la reacción se agitó rápidamente durante 2 horas mientras se dejó calentar a temperatura ambiente. La reacción se concentró, a continuación se resuspendió 5 en 100 mL de diclorometano. Éste se extrajo con agua y salmuera. El diclorometano se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se secó. El producto bruto se purificó por cromatografía de gel de sílice: acetato de etilo 10% 50%/éter de petróleo para dar un aceite amarillo (171 mg, 94%). 1H RMN, 270 MHz (CDCl3): 8,30 (d, 1 H, J = 5,5 Hz), 7,81 (aparentemente d, 2 H), 7,53 (dd, 1 H, J = 0,5 y 1,9 Hz), 7,35 -7,31 (m, 3 H), 5,10 15 (s, 2 H), 2,43 (s, 3 H). 13C RMN, 67,5 MHz (CDCl3): 155,4, 150,0, 145,4, 133,9, 130,1, 128,2, 126,8, 125,2, 70,9, 21,8. ESI-MS: esperado
10 para C13H12Br1N1O3S1 = 340,9721 y 342,9701. Encontrado M+H = 341,9790 y 343,9770.
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Se disolvió 4-metilbencensulfonato de (4-bromopiridin-2-il)metilo (170 mg, 0,50 mmol) en DMF seco (10 mL). Se añadieron carbonato de cesio (2 eq., 325,7 mg, 1,00 mmol) y tioglicolato de metilo (5 eq., 2,50 mmol, v = 0,23 mL) y la reacción se agitó rápidamente en nitrógeno a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se concentró, a 15 continuación se resuspendió en diclorometano. Éste se extrajo con agua y salmuera. El diclorometano se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se secó. El producto bruto se purificó por cromatografía de gel de sílice: acetato de etilo 10% -50%/éter de petróleo para dar un aceite amarillo (99,4 mg, 72%) 1H RMN, 270 MHz (CDCl3): 8,35 (d, 1 H, J = 5,2 Hz), 7,54 (d, 1 H, J = 2,0 Hz), 7,34 (dd, 1 H, J = 1,9 y 5,2 Hz), 3,90 (s, 2 H), 3,70 (s, 3 H), 3,22 (s, 2 H). 13C RMN, 67,5 MHz (CDCl3): 170,6, 159,4, 150,3, 133,5, 126,6, 125,7, 52,6, 37,9, 32,8. ESI-MS: esperado para
20 C9H10Br1N1O2S1 = 274,9616 y 276,9595. Encontrado M+H = 275,9691 y 277,9667.
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Se disolvió 2-((4-bromopiridin-2-il)metiltio)acetato de metilo (0,62 g, 2,25 mmol) en tolueno seco desoxigenado. Se añadieron paladio tetrakis (10% en moles, 259,6 mg, 0,22 mmol) y tributil(vinil)estaño (1,8 eq., v = 1,18 mL) y la reacción se mantuvo a reflujo en nitrógeno 2 horas. La reacción se dejó enfriar, a continuación se purificó por
25 cromatografía de gel de sílice (que contenía 10% en peso de fluoruro de potasio): acetato de etilo 10% -50%/éter de petróleo para dar un aceite amarillo (416 mg, 83%). 1H RMN, 270 MHz (CDCl3): 8,47 (d, 1 H, J = 5,3 Hz), 7,31 (s, 1 H), 7,15 (dd, 1 H, J = 1,6 y 5,3 Hz), 6,63 (dd, 1 H, J = 10,7 y 17,6 Hz), 5,96 (d, 1 H, J= 17,6 Hz), 5,48 (d, 1 H, J= 10,7 Hz), 3,92 (s, 2 H), 3,69 (s, 3 H), 3,21 (s, 2 H). ESI-MS: esperado para C11H13N1O2S1 = 223,0667. Encontrado M+H = 224,0720.
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El glicol-conjugado (2 mg) se disolvió en 180 uL of agua desoxigenada, que contenía TCEP 10 mM. Se añadió glutatión (forma reducida, 3,1 mg, 1,2 eq) y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante toda la noche. La espectroscopía de masas confirmó la presencia de producto. ESI-MS: esperado para ion molecular de C24H36N4O12S = 604,2050. Encontrado M-H = 603,1955.
Este ejemplo confirma que los compuestos y métodos de la presente invención pueden emplearse para conjugar covalentemente un polipéptido a un grupo glicano. El ejemplo también muestra que la reacción es específica para el grupo tiol presente en glutatión y que no se producen reacciones secundarias con otros grupos funcionales tales como aminas y ácido carboxílicos.
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El haluro de arilo anterior (0,5 g) se disolvió en 12 mL de DME y se trató con tetrakis-(trifenilfosfina)paladio (0) (10% en moles, 0,41 g). La disolución se dejó agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadió K2CO3 (1,5 eq., 0,73 g) junto con agua (3 mL) y complejo de 2,4,6-trivinilciclotriboroxano-piridina (1,5 eq., 1,27 g). La reacción se mantuvo a reflujo durante 24 horas. Se dejó que la reacción se enfriara a temperatura ambiente, a continuación se
15 filtró a través de celite. La mezcla de reacción se concentró, a continuación se resuspendió en 200 mL de EtOAc. Éste se lavó con agua (2 x 100 mL). Los lavados con agua se juntaron y concentraron hasta 5 mL. El concentrado se cargó en una columna C-18 de fase inversa y se eluyó con MeOH/H2O 1/10. Las fracciones relevantes se juntaron y se liofilizaron para dar el producto como un sólido blanco (188 mg, rendimiento 40%). ESI -MS: esperado para ion molecular de C8H10N2 = 134,0844. Encontrado M+H = 135,0922.
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El mPEG-SK-COOH (100 mg) se co-evaporó con tolueno anhidro (3 x 25 mL), a continuación se dejó que secara con la bomba de alto vacío funcionando durante 2 horas. Subsecuentemente, el PEG se disolvió en 5 mL de DMF anhidra en condiciones inertes. Se añadieron la amina aromática (13,4 mg, 5 eq.), PyBOP (52,1 mg, 5 eq.) y DIPEA (0,05 mL). La reacción se dejó en agitación bajo N2 gas a 30ºC durante toda la noche. La reacción se concentró y
25 co-evaporó a continuación con tolueno (4 x 25 mL). El material bruto se suspendió en etanol caliente, a continuación se dejó en el congelador a -20°C durante una hora lo cual dio lugar a la precipitación del PEG-conjugado. La mezcla se filtró y lavó con etanol frío. El producto blanco céreo (31 mg) se dejó secar en la bomba de alto vacío durante dos horas.
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30 El mPEG-2K-NH2 (100 mg) se co-evaporó con tolueno anhidro (3 x 25 mL) y se dejó a continuación que secara con la bomba de alto vacío funcionando durante 2 horas. Subsecuentemente, el PEG se disolvió en 5 mL de DMF
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anhidra en condiciones inertes. Se añadieron la amina aromática (37,3 mg, 5 eq.), PyBOP (130,1 mg, 5 eq.) y DIPEA (0,05 mL). La reacción se dejó en agitación bajo N2 gas a 30ºC durante toda la noche. La reacción se concentró y co-evaporó a continuación con tolueno (4 x 25 mL). El material bruto se suspendió en CH2Cl2 y se purificó por cromatografía de gel de sílice (CH2Cl2 100% a MeOH 15%/CH2Cl2). Las fracciones relevantes se juntaron y concentraron para dar el producto como un sólido transparente (52 mg).
Estos ejemplos confirman que los compuestos y métodos de la presente invención pueden emplearse para conjugar covalentemente un polipéptido a moléculas de PEG de una manera específica.
Velocidades relativas de reacción de una gama de agentes enlazantes con glutatión.
Se añadió una disolución de la vinil piridina o de la vinil pirimidina (1,2 eq.) en 200 uL de DMSO deuterado a una disolución de glutatión reducido (6-10 mg) en D2O (800 uL) a pH 7,0 en un tubo de RMN. Una vez mezclados, el tubo se transfirió rápidamente al espectrómetro de RMN. Se reajustaron el cierre y las cuñas (1-2 min). Se adquirieron espectros continuamente durante el tiempo de reacción designado (16-32) barridos por punto de datos, con un espectrómetro Varian Mercury (400MHz). Las velocidades de reacción relativas fueron determinadas midiendo la pérdida de intensidad de la señal de los protones vinílicos ( 6,6-6,9 ppm) en el tiempo.
Marcado de IFN-beta recombinante de ser humano con derivado vinilpiridina-PEG frente a maleimida-PEG
Se llevó a cabo una reacción para comparar el marcado del polipéptido interferón beta con un conjugado PEGpiridina según la presente invención y el uso de PEG y del agente de reticulación de la técnica anterior maleimida. Se hizo reaccionar interferón beta recombinante (C17S, D80N) con PEG-piridina o PEG-maleimida. Interferón beta-1 de ser humano, fibroblastos (Origene Technologies) mutados en C17S para separar la cisteína libre endógena y D80C para reemplazar el sitio endógeno de glicosilación por mutagénesis dirigida al sitio (Stragene Quickchange). El interferón beta recombinante se redujo con TECP 0,1 mM durante 12 h seguido por reacción con PEG/piridina o PEG/maleimida en el momento especificado en el diagrama a pH 7,5, 37ºC. Las proteínas se resolvieron usando SDS-PAGE y fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se sondearon con anticuerpo anti-interferón b para determinar el IFNb sin reaccionar y el pegilado. La reacción secundaria del anticuerpo se detectó usando un sistema de detección ECL (Amershan, GE Healthcare). En ambos casos, la molécula de PEG tuvo un peso molecular de 5kD. Los resultados se muestran en la Figura 2 y muestran que el uso del conjugado de la presente invención condensó una media de un PEG conjugado al interferón beta, aumentando el peso molecular de aproximadamente 20kD a 25kD, que aumentó con el tiempo de reacción. En contraste, la reacción con maleimida fue significativamente menos específica y condujo a la conjugación de múltiples moléculas de PEG al interferón beta.
Efecto del pH sobre la tasa de marcado de BSA con vinilpiridina-SkPEG
Se investigó la dependencia del pH de albúmina de suero bovino (Sigma) funcionalizada con PEG 5kD/piridina. Se redujo BSA con DTT 1 mM a 4ºC durante 12 h seguido por reacción con PEG 5kD/piridina a temperatura ambiente en el momento indicado. Las proteínas se resolvieron por SDS-PAGE y se tiñeron con azul de Commassie para verlas.
Los resultados de la Figura 3 se obtuvieron a pH 5,5 y 7,5 y muestran que la reacción de conjugación transcurre a ambos pHs, pero es más rápida a pH 7,5. Esto se ha confirmado en otros experimentos que muestran que la reacción puede usarse en un amplio intervalo de pH, incluyendo el intervalo de pH fisiológico relevante para la bioquímica de las proteínas. Los resultados también muestran que el pH puede ser usado para controlar la velocidad de la reacción de conjugación.
Dependencia con la temperatura de la reacción de PEG 5kD/piridina con IFN beta recombinante (C17S, N80C).
Se trató IFN beta mutante con reactivo 5mM PEG 5kDa -vinil piridina a pH 7, a las temperaturas indicadas. Se tomaron partes alícuotas en momentos indicados y la reacción se inactivó por adición de DTT. Las proteínas se resolvieron usando SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se sondearon con anticuerpo anti-interferón beta para determinar el IFN-beta sin reaccionar y el pegilado. La reacción secundaria del anticuerpo se detectó usando un sistema de detección ECL (Amershan, GE Healthcare). Los resultados se presentan en la Figura 4.
Reacciones de funcionalización de proteínas
Condiciones de reacción
La proteína se diluyó (5 mg/mL) en tampón de reacción desoxigenado (NaC2H3O, 20 mM, pH 5,5) y se redujo en nitrógeno 3 horas con hidrocloruro de tris-(carboxietil)-fosfina (TCEP, 5 mM) o -mercaptoetilamina (BMEA, 5 mM). El agente reductor en exceso se separó subsecuentemente mediante tres rondas de ultrafiltración (Milipore centricons, peso molecular de corte 10 kDa) o dos rondas de diálisis (membrana de acetato de celulosa, peso molecular de corte 6 -8 kDa). Se preparó una disolución 10 veces concentrada de PEG en el tampón de reacción y se añadió a la disolución de proteína para dar la mezcla de reacción que contenía la proteína (1 mg/mL) más 1,5 a 5
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Claims (1)

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