ES2556328T3 - Reactivos con funcionalidad tiol y sus usos - Google Patents

Reactivos con funcionalidad tiol y sus usos Download PDF

Info

Publication number
ES2556328T3
ES2556328T3 ES09795797.1T ES09795797T ES2556328T3 ES 2556328 T3 ES2556328 T3 ES 2556328T3 ES 09795797 T ES09795797 T ES 09795797T ES 2556328 T3 ES2556328 T3 ES 2556328T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
group
hydrogen
glycan
polypeptide
polyalkylene glycol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09795797.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Graham Watts
Terrence Kantner
Amanda Barbara Mackenzie
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iksuda Therapeutics Ltd
Original Assignee
Glythera Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glythera Ltd filed Critical Glythera Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2556328T3 publication Critical patent/ES2556328T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/28—Radicals substituted by singly-bound oxygen or sulphur atoms
    • C07D213/30—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/36—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms
    • C07D213/38—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms having only hydrogen or hydrocarbon radicals attached to the substituent nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/44—Radicals substituted by doubly-bound oxygen, sulfur, or nitrogen atoms, or by two such atoms singly-bound to the same carbon atom
    • C07D213/46—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/55—Acids; Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/79—Acids; Esters
    • C07D213/80—Acids; Esters in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/13—Labelling of peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Un método para modificar un polipéptido que al menos tiene un grupo tiol reactivo, método que comprende poner en contacto el polipéptido con un reactivo funcionalizante el cual comprende un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno que tiene un sustituyente vinílico capaz de reaccionar con el al menos un grupo tiol del polipéptido, donde el reactivo funcionalizante está covalentemente enlazado a un grupo glicano, de modo que el sustituyente vinílico del reactivo funcionalizante reaccione con el grupo tiol del polipéptido, para de este modo enlazar covalentemente el grupo glicano al polipéptido, caracterizado porque el reactivo funcionalizante está representado por una de las fórmulas generales:**Fórmula** donde: al menos R1, y opcionalmente R2, están covalentemente enlazados a un grupo glicano; y además donde: R1, y opcionalmente R2, se seleccionan independientemente de: -(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R, en el que Z es S o NH, n es 0 a 10, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -(CH2)n-Z-(CH2)o-R, en el que Z es S o NH, n es 0 a 10, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -(CO)-Z-(CH2)o-R, en el que Z es S o NH, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R, en el que Z es S o NH, n es 0 a 10, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R, en el que Y es un grupo arilo, S o NH, Z es NH, n es 0 a 10, o es 0 a 10 y en el que R es un hidrógeno, una molécula de polialquilenglicol o un grupo glicano; o -Y-R, en el que Y es S, R es un hidrógeno, un glicano, una molécula de polialquilenglicol, arilo o alquilo de C1-10; con la condición de que cuando R2 no esté enlazado a una molécula de polialquilenglicol o a un grupo glicano, puede adicionalmente seleccionarse de hidrógeno o de un grupo aceptor de electrones, tal como halógeno (F, Cl, o Br), -NO2, -CO2H, -CO2R4, COR4, -CHO, -CN, -CF3, -SO2NR4R5, alquilo o fenilo, en los que R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno o alquilo de C1-10.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
se usan para fabricar vacunas conjugadas). Ejemplos específicos de polipéptidos que pueden emplearse incluyen el factor estimulante de colonias (CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), Factor VIIa, Factor VIII, Factor IX, hormona del crecimiento humano (hGH), DNasa, insulina, glucagón, VEGF, receptor de VEGF, TNF, receptor de TNF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), activador tisular del plasminógeno (tPA), eritropoyetina (EPO), enfurvirtida, factor del crecimiento semejante a la insulina (IGF), factor del crecimiento de los nervios (NGF), IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL18, IL-24, interferón beta-1a, interferón beta-1b, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa, o interferón gamma.
En la presente invención, las referencias a polipéptidos que son anticuerpos incluyen inmunoglobulinas, ya sean naturales o producidas parcial o completamente sintéticamente. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprenda un dominio enlazante de antígenos. Los fragmentos de anticuerpos que comprenden un dominio enlazante de antígenos incluyen Fab, scFv, FV, qAb, fragmentos Fd, diacuerpos, triacuerpos o nanocuerpos. Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de tecnología de DNA recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quimera que retengan la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden implicar introducir DNA que codifica la región variable de la inmunoglobulina, o las regiones que determinan la complementariedad (CDRs), de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones marco, de una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, los documentos EP 0 184 187 A, GB 2.188.638 A o EP 0 239 400 A. Los anticuerpos pueden modificarse de varias formas y el término debe interpretarse que cubre cualquier miembro o sustancia enlazante específico que tenga un dominio anticuerpo enlazante de antígenos con la requerida especificidad. Así, este término cubre fragmentos de anticuerpos y derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio enlazante de inmunoglobulinas, ya sea natural o completa o parcialmente sintético. Por lo tanto, están incluidas moléculas quimera que comprenden un dominio enlazante de inmunoglobulinas, o equivalente, condensado con otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quimera se describen en los documentos EP 0 120 694 A y EP 0 125 023 A.
Se ha mostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de antígenos enlazantes. Ejemplos de fragmentos enlazantes son (i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; ( iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un anticuerpo único; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos; (vii) moléculas Fv de cadena única (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un agente enlazante péptido el cual permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio enlazante de antígenos (Bird et al, Science, 242; 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988);
(viii) dímeros Fv biespecíficos de cadena única (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos por fusión de genes (documento WO 94/13804; Holliger et al, P.N.A.S. USA, 90: 6444-6448, 1993). Fv, scFv o moléculas diacuerpos pueden estabilizarse por la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter et al, Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996). También pueden fabricarse minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu et al, Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996).
Métodos de modificar o funcionalizar proteínas
La presente invención proporciona un método conveniente para modificar o funcionalizar una proteína de interés usando grupos tiol que están presentes en, o que han sido previamente introducidos en, el polipéptido, por ej., en uno o más residuos de cisteína. En realizaciones preferidas, los métodos descritos en la presente memoria emplean reactivos y condiciones que están bien adaptadas para modificar proteínas y otros materiales biológicos. En particular, las condiciones de reacción que se usan en el presente método ayudan a evitar los problemas que tienden a ocurrir cuando se usan reactivos de la técnica anterior tales como maleimida, los cuales tienen una tendencia para producir una mezcla de diferentes productos con una gama de diferentes propiedades.
Como se mencionó anteriormente, el polipéptido de interés puede modificarse usando grupos tiol existentes o introduciendo grupos tiol en una etapa inicial del método, por ejemplo haciendo reaccionar uno o más grupos funcionales del polipéptido para producir un grupo tiol, o introduciendo un grupo tiol o un precursor del mismo en el polipéptido. A modo de ejemplo, esto puede implicar la etapa de introducir un residuo de cisteína en el polipéptido en un sitio en el que se desee funcionalizar el polipéptido. Esto puede ser útil en situaciones en las que un residuo de cisteína conveniente para reaccionar según la presente invención no esté presente en un polipéptido de partida o de tipo natural. Convenientemente, esto puede lograrse usando mutagénesis dirigida al sitio del polipéptido, el uso de la cual está bien establecido en la técnica.
Los presentes métodos son particularmente apropiados para usar en la funcionalización de polipéptidos con moléculas de polialquilenglicol o grupos glicano. Un uso preferido de los métodos y reactivos de la presente invención es para glicosilar un polipéptido de interés con uno o más grupos glicano. El grupo carbohidrato puede ser un monosacárido, oligosacárido o polisacárido sintético o que se encuentre en la naturaleza. Este enfoque puede usarse para añadir glicosilación a una proteína de interés, o para introducir glicosilación donde se desea la glicosilación pero no se introduce en el curso de la producción de la proteína, por ej., en virtud del hecho de que la proteína ha sido producida en células bacterianas o, particularmente para péptidos, cuando han sido producidos por síntesis química.
7 5
15
25
35
45
55
La capacidad para controlar la glicosilación en sitios definidos usando la presente invención representa una herramienta útil para proteínas recombinantes diseñadas por ingeniería genética, por ejemplo proteínas y anticuerpos terapéuticos, y sus fragmentos, en su fabricación y en el control de su inmunogenia y propiedades farmacológicas tales como la vida media. Actualmente, la fabricación de proteínas recombinantes terapéuticas es cara y lenta ya que las líneas de células de mamíferos son con frecuencia usadas en la fabricación para asegurar que las proteínas son glicosiladas. Los métodos descritos en la presente memoria pueden ser usados para añadir glicosilación a un polipéptido después de la producción en líneas de células bacterianas, en las cuales la expresión es en general más eficiente, ayudando de este modo a mejorar la velocidad y/o la economía de la producción de proteínas, a la vez que se retiene la glicosilación. Alternativamente, para polipéptidos expresados en líneas de células que glicosilan productos de expresión, la presente invención puede ser usada para modificar o añadir glicosilación.
En realizaciones preferidas, los carbohidratos empleados pueden comprender derivados químicamente modificados de oligosacáridos ramificados que se encuentran en la naturaleza, comúnmente mostrados en glicoproteínas N-u Oenlazadas, o en sus productos de degradación. Los grupos carbohidratos que pueden ser usados en la presente invención son bien conocidos en la técnica e incluyen grupo carbohidratos encontrados en la glicosilación N-y Oenlazada de grupos carbohidratos de proteínas eucariotas y sintetizadas por el hombre, véase, por ej., los grupos carbohidratos y los métodos de producirlos e identificarlos descritos en los documentos WO 03/025133 y W02004/083807.
Los glicanos N-enlazados se encuentran unidos al nitrógeno del grupo R (N) de la asparagina en el secuón. El secuón es una secuencia de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que x es cualquier aminoácido excepto prolina y puede estar compuesta de N-acetilgalactosamina, galactosa, ácido neuramínico, N-acetilglucosamina, fructosa, manosa, fucosa y otros monosacáridos.
En eucariotas, Los glicanos N-enlazados se derivan de un núcleo de 14 unidades de azúcar ensamblado en el citoplasma y en el retículo endoplasmático. En primer lugar, dos residuos de N-acetilglucosamina están unidos a fosfato de dolicol, un lípido, en el lado externo de la membrana del retículo endoplasmático. A continuación, a esta estructura se añaden cinco residuos de manosa. En este punto, el núcleo de glicano parcialmente acabado es volteado a lo largo de la membrana del retículo endoplasmático, de modo que ahora está localizado dentro del lúmen reticular. A continuación, el ensamblaje continúa dentro del retículo endoplasmático con la adición de cuatro residuos más de manosa. Finalmente, se añaden tres residuos de glucosa a esta estructura. Tras el ensamblaje total, el glicano es transferido en bloque mediante la glicosiltransferasa oligosacariltransferasa a una cadena de péptido naciente, dentro del lúmen reticular. Esta estructura núcleo de glicanos N-enlazados consiste de este modo en 14 residuos (3 glucosa, 9 manosa, y 2 N-acetilglucosamina).
En eucariotas, glicanos O-enlazados, se ensambla un azúcar a la vez en un residuo de serina o treonina de una cadena de péptido en el aparato de Golgi. A diferencia de con los glicanos N-enlazados, no existe hasta el momento ninguna secuencia de consenso conocida. Sin embargo, la colocación de un residuo de prolina en -1 ó +3 relativa a la serina o la treonina es favorable para la glicosilación O-enlazada.
El primer monosacárido unido en la síntesis de glicanos O-enlazados es N-acetil-galactosamina. Después de esto, son posibles varias rutas diferentes. Se genera una estructura núcleo 1 por la adición de galactosa. Se genera una estructura núcleo 2 por la adición de N-acetil-glucosamina a la N-acetil-galactosamina de la estructura núcleo 1. Se generan estructuras núcleo 3 mediante la adición de una única N-acetil-glucosamina a la N-acetil-galactosamina original. Se generan estructuras núcleo 4 mediante la adición de una segunda N-acetil-glucosamina a la estructura núcleo 3. Son posibles otras estructuras núcleo, aunque son menos comunes.
Un tema estructural común en glicanos O-enlazados es la adición de unidades de polilactosamina a las diversas estructuras núcleo. Éstas se forman mediante la adición repetitiva de galactosa y unidades de N-acetilglucosamina. Con frecuencia, las cadenas de polilactosamina en glicanos O-enlazados están rematadas mediante la adición de un residuo de ácido siálico (similar al ácido neuramínico). Si también se añade un residuo de fucosa, al residuo siguiente al penúltimo se forma una estructura sialil-lewis-X (SLex)).
Los métodos de la presente invención también pueden usarse para fabricar vacunas conjugadas, por ej., vacunas conjugadas formadas enlazando una o más moléculas de antígeno a una proteína portadora, confiriendo de este modo las características inmunológicas a la proteína vehículo sobre la molécula de antígeno. Este enfoque se usa con frecuencia cuando la molécula de antígeno es un grupo glicano (por ej., un polisacárido antigénico) ya que comparativamente tienden a ser peores antígenos.
Los métodos descritos en la presente memoria permiten que se unan múltiples moléculas de antígeno a la proteína portadora, preferiblemente en una posición de la proteína portadora, mediante el uso de los reactivos funcionalizantes de la presente invención. Ejemplos de vacunas conjugadas incluyen: vacunas de Haemophilus influenzae tipo B ("vacuna Hib”), en las cuales un polisacárido Hib está conjugado a una proteína portadora tal como tetanospasmina, una proteína mutante de la difteria o una proteína de la membrana externa de los meningococos del grupo B; vacunas de conjugados de meningococos en las cuales están conjugados uno o más polisacáridos del serogrupo de la meningitis meningocócica (por ej., A, C, Y o W-135) a una proteína portadora; vacunas pneumocócicas de polisacáridos (PPSV) en las cuales los polisacáridos son azúcares de membranas celulares de
8
imagen6
imagen7
imagen8
Se disolvió (4-bromopiridin-2-il)metanol (100 mg, 0,53 mmol) en THF seco (10 mL) y se enfrió a 0°C. Se añadieron cloruro de tosilo (2 eq., 202,8 mg, 1,06 mmol) y NaOH 1M (0,7 mL) y la reacción se agitó rápidamente durante 2 horas mientras se dejó calentar a temperatura ambiente. La reacción se concentró, a continuación se resuspendió 5 en 100 mL de diclorometano. Éste se extrajo con agua y salmuera. El diclorometano se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se secó. El producto bruto se purificó por cromatografía de gel de sílice: acetato de etilo 10% 50%/éter de petróleo para dar un aceite amarillo (171 mg, 94%). 1H RMN, 270 MHz (CDCl3): 8,30 (d, 1 H, J = 5,5 Hz), 7,81 (aparentemente d, 2 H), 7,53 (dd, 1 H, J = 0,5 y 1,9 Hz), 7,35 -7,31 (m, 3 H), 5,10 15 (s, 2 H), 2,43 (s, 3 H). 13C RMN, 67,5 MHz (CDCl3): 155,4, 150,0, 145,4, 133,9, 130,1, 128,2, 126,8, 125,2, 70,9, 21,8. ESI-MS: esperado
10 para C13H12Br1N1O3S1 = 340,9721 y 342,9701. Encontrado M+H = 341,9790 y 343,9770.
imagen9
Se disolvió 4-metilbencensulfonato de (4-bromopiridin-2-il)metilo (170 mg, 0,50 mmol) en DMF seco (10 mL). Se añadieron carbonato de cesio (2 eq., 325,7 mg, 1,00 mmol) y tioglicolato de metilo (5 eq., 2,50 mmol, v = 0,23 mL) y la reacción se agitó rápidamente en nitrógeno a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se concentró, a 15 continuación se resuspendió en diclorometano. Éste se extrajo con agua y salmuera. El diclorometano se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se secó. El producto bruto se purificó por cromatografía de gel de sílice: acetato de etilo 10% -50%/éter de petróleo para dar un aceite amarillo (99,4 mg, 72%) 1H RMN, 270 MHz (CDCl3): 8,35 (d, 1 H, J = 5,2 Hz), 7,54 (d, 1 H, J = 2,0 Hz), 7,34 (dd, 1 H, J = 1,9 y 5,2 Hz), 3,90 (s, 2 H), 3,70 (s, 3 H), 3,22 (s, 2 H). 13C RMN, 67,5 MHz (CDCl3): 170,6, 159,4, 150,3, 133,5, 126,6, 125,7, 52,6, 37,9, 32,8. ESI-MS: esperado para
20 C9H10Br1N1O2S1 = 274,9616 y 276,9595. Encontrado M+H = 275,9691 y 277,9667.
imagen10
Se disolvió 2-((4-bromopiridin-2-il)metiltio)acetato de metilo (0,62 g, 2,25 mmol) en tolueno seco desoxigenado. Se añadieron paladio tetrakis (10% en moles, 259,6 mg, 0,22 mmol) y tributil(vinil)estaño (1,8 eq., v = 1,18 mL) y la reacción se mantuvo a reflujo en nitrógeno 2 horas. La reacción se dejó enfriar, a continuación se purificó por
25 cromatografía de gel de sílice (que contenía 10% en peso de fluoruro de potasio): acetato de etilo 10% -50%/éter de petróleo para dar un aceite amarillo (416 mg, 83%). 1H RMN, 270 MHz (CDCl3): 8,47 (d, 1 H, J = 5,3 Hz), 7,31 (s, 1 H), 7,15 (dd, 1 H, J = 1,6 y 5,3 Hz), 6,63 (dd, 1 H, J = 10,7 y 17,6 Hz), 5,96 (d, 1 H, J= 17,6 Hz), 5,48 (d, 1 H, J= 10,7 Hz), 3,92 (s, 2 H), 3,69 (s, 3 H), 3,21 (s, 2 H). ESI-MS: esperado para C11H13N1O2S1 = 223,0667. Encontrado M+H = 224,0720.
11
imagen11
imagen12
imagen13
El glicol-conjugado (2 mg) se disolvió en 180 uL of agua desoxigenada, que contenía TCEP 10 mM. Se añadió glutatión (forma reducida, 3,1 mg, 1,2 eq) y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante toda la noche. La espectroscopía de masas confirmó la presencia de producto. ESI-MS: esperado para ion molecular de C24H36N4O12S = 604,2050. Encontrado M-H = 603,1955.
Este ejemplo confirma que los compuestos y métodos de la presente invención pueden emplearse para conjugar covalentemente un polipéptido a un grupo glicano. El ejemplo también muestra que la reacción es específica para el grupo tiol presente en glutatión y que no se producen reacciones secundarias con otros grupos funcionales tales como aminas y ácido carboxílicos.
imagen14
El haluro de arilo anterior (0,5 g) se disolvió en 12 mL de DME y se trató con tetrakis-(trifenilfosfina)paladio (0) (10% en moles, 0,41 g). La disolución se dejó agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadió K2CO3 (1,5 eq., 0,73 g) junto con agua (3 mL) y complejo de 2,4,6-trivinilciclotriboroxano-piridina (1,5 eq., 1,27 g). La reacción se mantuvo a reflujo durante 24 horas. Se dejó que la reacción se enfriara a temperatura ambiente, a continuación se
15 filtró a través de celite. La mezcla de reacción se concentró, a continuación se resuspendió en 200 mL de EtOAc. Éste se lavó con agua (2 x 100 mL). Los lavados con agua se juntaron y concentraron hasta 5 mL. El concentrado se cargó en una columna C-18 de fase inversa y se eluyó con MeOH/H2O 1/10. Las fracciones relevantes se juntaron y se liofilizaron para dar el producto como un sólido blanco (188 mg, rendimiento 40%). ESI -MS: esperado para ion molecular de C8H10N2 = 134,0844. Encontrado M+H = 135,0922.
imagen15
El mPEG-SK-COOH (100 mg) se co-evaporó con tolueno anhidro (3 x 25 mL), a continuación se dejó que secara con la bomba de alto vacío funcionando durante 2 horas. Subsecuentemente, el PEG se disolvió en 5 mL de DMF anhidra en condiciones inertes. Se añadieron la amina aromática (13,4 mg, 5 eq.), PyBOP (52,1 mg, 5 eq.) y DIPEA (0,05 mL). La reacción se dejó en agitación bajo N2 gas a 30ºC durante toda la noche. La reacción se concentró y
25 co-evaporó a continuación con tolueno (4 x 25 mL). El material bruto se suspendió en etanol caliente, a continuación se dejó en el congelador a -20°C durante una hora lo cual dio lugar a la precipitación del PEG-conjugado. La mezcla se filtró y lavó con etanol frío. El producto blanco céreo (31 mg) se dejó secar en la bomba de alto vacío durante dos horas.
imagen16
30 El mPEG-2K-NH2 (100 mg) se co-evaporó con tolueno anhidro (3 x 25 mL) y se dejó a continuación que secara con la bomba de alto vacío funcionando durante 2 horas. Subsecuentemente, el PEG se disolvió en 5 mL de DMF
14 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
anhidra en condiciones inertes. Se añadieron la amina aromática (37,3 mg, 5 eq.), PyBOP (130,1 mg, 5 eq.) y DIPEA (0,05 mL). La reacción se dejó en agitación bajo N2 gas a 30ºC durante toda la noche. La reacción se concentró y co-evaporó a continuación con tolueno (4 x 25 mL). El material bruto se suspendió en CH2Cl2 y se purificó por cromatografía de gel de sílice (CH2Cl2 100% a MeOH 15%/CH2Cl2). Las fracciones relevantes se juntaron y concentraron para dar el producto como un sólido transparente (52 mg).
Estos ejemplos confirman que los compuestos y métodos de la presente invención pueden emplearse para conjugar covalentemente un polipéptido a moléculas de PEG de una manera específica.
Velocidades relativas de reacción de una gama de agentes enlazantes con glutatión.
Se añadió una disolución de la vinil piridina o de la vinil pirimidina (1,2 eq.) en 200 uL de DMSO deuterado a una disolución de glutatión reducido (6-10 mg) en D2O (800 uL) a pH 7,0 en un tubo de RMN. Una vez mezclados, el tubo se transfirió rápidamente al espectrómetro de RMN. Se reajustaron el cierre y las cuñas (1-2 min). Se adquirieron espectros continuamente durante el tiempo de reacción designado (16-32) barridos por punto de datos, con un espectrómetro Varian Mercury (400MHz). Las velocidades de reacción relativas fueron determinadas midiendo la pérdida de intensidad de la señal de los protones vinílicos ( 6,6-6,9 ppm) en el tiempo.
Marcado de IFN-beta recombinante de ser humano con derivado vinilpiridina-PEG frente a maleimida-PEG
Se llevó a cabo una reacción para comparar el marcado del polipéptido interferón beta con un conjugado PEGpiridina según la presente invención y el uso de PEG y del agente de reticulación de la técnica anterior maleimida. Se hizo reaccionar interferón beta recombinante (C17S, D80N) con PEG-piridina o PEG-maleimida. Interferón beta-1 de ser humano, fibroblastos (Origene Technologies) mutados en C17S para separar la cisteína libre endógena y D80C para reemplazar el sitio endógeno de glicosilación por mutagénesis dirigida al sitio (Stragene Quickchange). El interferón beta recombinante se redujo con TECP 0,1 mM durante 12 h seguido por reacción con PEG/piridina o PEG/maleimida en el momento especificado en el diagrama a pH 7,5, 37ºC. Las proteínas se resolvieron usando SDS-PAGE y fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se sondearon con anticuerpo anti-interferón b para determinar el IFNb sin reaccionar y el pegilado. La reacción secundaria del anticuerpo se detectó usando un sistema de detección ECL (Amershan, GE Healthcare). En ambos casos, la molécula de PEG tuvo un peso molecular de 5kD. Los resultados se muestran en la Figura 2 y muestran que el uso del conjugado de la presente invención condensó una media de un PEG conjugado al interferón beta, aumentando el peso molecular de aproximadamente 20kD a 25kD, que aumentó con el tiempo de reacción. En contraste, la reacción con maleimida fue significativamente menos específica y condujo a la conjugación de múltiples moléculas de PEG al interferón beta.
Efecto del pH sobre la tasa de marcado de BSA con vinilpiridina-SkPEG
Se investigó la dependencia del pH de albúmina de suero bovino (Sigma) funcionalizada con PEG 5kD/piridina. Se redujo BSA con DTT 1 mM a 4ºC durante 12 h seguido por reacción con PEG 5kD/piridina a temperatura ambiente en el momento indicado. Las proteínas se resolvieron por SDS-PAGE y se tiñeron con azul de Commassie para verlas.
Los resultados de la Figura 3 se obtuvieron a pH 5,5 y 7,5 y muestran que la reacción de conjugación transcurre a ambos pHs, pero es más rápida a pH 7,5. Esto se ha confirmado en otros experimentos que muestran que la reacción puede usarse en un amplio intervalo de pH, incluyendo el intervalo de pH fisiológico relevante para la bioquímica de las proteínas. Los resultados también muestran que el pH puede ser usado para controlar la velocidad de la reacción de conjugación.
Dependencia con la temperatura de la reacción de PEG 5kD/piridina con IFN beta recombinante (C17S, N80C).
Se trató IFN beta mutante con reactivo 5mM PEG 5kDa -vinil piridina a pH 7, a las temperaturas indicadas. Se tomaron partes alícuotas en momentos indicados y la reacción se inactivó por adición de DTT. Las proteínas se resolvieron usando SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se sondearon con anticuerpo anti-interferón beta para determinar el IFN-beta sin reaccionar y el pegilado. La reacción secundaria del anticuerpo se detectó usando un sistema de detección ECL (Amershan, GE Healthcare). Los resultados se presentan en la Figura 4.
Reacciones de funcionalización de proteínas
Condiciones de reacción
La proteína se diluyó (5 mg/mL) en tampón de reacción desoxigenado (NaC2H3O, 20 mM, pH 5,5) y se redujo en nitrógeno 3 horas con hidrocloruro de tris-(carboxietil)-fosfina (TCEP, 5 mM) o -mercaptoetilamina (BMEA, 5 mM). El agente reductor en exceso se separó subsecuentemente mediante tres rondas de ultrafiltración (Milipore centricons, peso molecular de corte 10 kDa) o dos rondas de diálisis (membrana de acetato de celulosa, peso molecular de corte 6 -8 kDa). Se preparó una disolución 10 veces concentrada de PEG en el tampón de reacción y se añadió a la disolución de proteína para dar la mezcla de reacción que contenía la proteína (1 mg/mL) más 1,5 a 5
15
imagen17

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES09795797.1T 2008-12-19 2009-12-21 Reactivos con funcionalidad tiol y sus usos Active ES2556328T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US139014P 1999-06-14
US13901408P 2008-12-19 2008-12-19
GB0823309 2008-12-19
GBGB0823309.0A GB0823309D0 (en) 2008-12-19 2008-12-19 Functionalising reagents and their uses
PCT/GB2009/002924 WO2010070300A2 (en) 2008-12-19 2009-12-21 Functionalising reagents and their uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2556328T3 true ES2556328T3 (es) 2016-01-15

Family

ID=40343997

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09795797.1T Active ES2556328T3 (es) 2008-12-19 2009-12-21 Reactivos con funcionalidad tiol y sus usos
ES15151649.9T Active ES2674099T3 (es) 2008-12-19 2009-12-21 Reactivos con funcionalidad tiol y sus usos

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15151649.9T Active ES2674099T3 (es) 2008-12-19 2009-12-21 Reactivos con funcionalidad tiol y sus usos

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8785595B2 (es)
EP (2) EP2886132B1 (es)
JP (2) JP5877712B2 (es)
CN (2) CN102317305B (es)
ES (2) ES2556328T3 (es)
GB (1) GB0823309D0 (es)
PL (2) PL2886132T3 (es)
WO (1) WO2010070300A2 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0823309D0 (en) 2008-12-19 2009-01-28 Univ Bath Functionalising reagents and their uses
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
EP2741611A4 (en) 2011-08-08 2015-03-04 California Inst Of Techn SMALL MOLECULAR COMPOUNDS FOR COMBATING PATHOGENIC NEMATODES IN PLANTS AND INSECTS
BR112014003008A2 (pt) 2011-08-08 2017-02-21 Boyce Thompson Intitute For Plant Res "compostos e métodos de modificação de comportamento de um nemátodo”
EP2907823A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-19 Gene Signal International SA Polypeptide fragments of 168A-T2 and compositions comprising them for use in treating cancer
GB201419108D0 (en) * 2014-10-27 2014-12-10 Glythera Ltd Materials and methods relating to linkers for use in antibody drug conjugates
US11464810B2 (en) 2016-08-25 2022-10-11 California Institute Of Technology Ascaroside treatment of eosinophilic esophagitis
US12377164B2 (en) 2018-07-31 2025-08-05 Astrazeneca Ab Linkers and conjugates
CA3140784A1 (en) 2019-05-17 2020-11-26 California Institute Of Technology Ascaroside derivatives and methods of use
CN115998707A (zh) * 2021-10-21 2023-04-25 福州大学 一种聚二硫多肽纳米粒及其制备方法和多肽药物口服制剂
CN115181091A (zh) * 2022-06-21 2022-10-14 江苏联环药业股份有限公司 一种贝他斯汀的制备方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
CA1236454A (en) * 1984-06-27 1988-05-10 John J. Tsai Monomeric cationic glycoside derivatives
US4719272A (en) * 1984-06-27 1988-01-12 National Starch And Chemical Corporation Monomeric cationic glycoside derivatives
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
WO1988005433A1 (en) * 1987-01-15 1988-07-28 Celltech Limited Thiol-reactive cross-linking reagents
DE3942355A1 (de) * 1989-12-21 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh N- und o-substituierte aminophenolderivate, zwischenprodukte zu deren herstellung, deren verwendung als hydrolasesubstrate, ein entsprechendes bestimmungsverfahren und hierfuer geeignetes diagnostisches mittel
ATE240740T1 (de) * 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
ES2156149T3 (es) 1992-12-04 2001-06-16 Medical Res Council Proteinas de union multivalente y multiespecificas, su fabricacion y su uso.
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US6309646B1 (en) 1996-05-09 2001-10-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Protein-polysaccharide conjugate vaccines and other immunological reagents prepared using homobifunctional and heterobifunctional vinylsulfones, and processes for preparing the conjugates
US6602498B2 (en) * 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
EP1438387A4 (en) 2001-09-14 2004-10-13 Momenta Pharmaceuticals Inc METHODS OF MAKING GLYCOMOLECULES WITH IMPROVED ACTIVITY, AND USES THEREOF
US20040214228A9 (en) 2001-09-14 2004-10-28 Ganesh Venkataraman Methods of evaluating glycomolecules for enhanced activities
PT3025726T (pt) * 2002-01-18 2020-01-09 Biogen Ma Inc Compostos do polímero polialquileno e utilizações dos mesmos
KR20050093856A (ko) * 2002-09-09 2005-09-23 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 수용성 중합체 알카날
JP2004262781A (ja) * 2003-02-28 2004-09-24 Noguchi Inst 蛍光糖鎖プローブ
US20050074895A1 (en) 2003-09-05 2005-04-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Alkyl-substituted vinyl pyridines for mass-coded tagging of proteins
CN101223137A (zh) * 2005-07-11 2008-07-16 默克公司 制备氢化异二氢吲哚速激肽受体拮抗剂的方法
GB0823309D0 (en) 2008-12-19 2009-01-28 Univ Bath Functionalising reagents and their uses
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010070300A2 (en) 2010-06-24
JP5877712B2 (ja) 2016-03-08
US9212148B2 (en) 2015-12-15
US8785595B2 (en) 2014-07-22
EP2373675A2 (en) 2011-10-12
EP2373675B1 (en) 2015-10-21
HK1210026A1 (en) 2016-04-15
CN104558098A (zh) 2015-04-29
HK1165435A1 (zh) 2012-10-05
US20120101254A1 (en) 2012-04-26
ES2674099T3 (es) 2018-06-27
GB0823309D0 (en) 2009-01-28
PL2373675T3 (pl) 2016-03-31
WO2010070300A3 (en) 2010-10-14
JP6240122B2 (ja) 2017-11-29
CN104558098B (zh) 2020-06-30
JP2015221812A (ja) 2015-12-10
EP2886132A1 (en) 2015-06-24
CN102317305B (zh) 2016-03-23
CN102317305A (zh) 2012-01-11
EP2886132B1 (en) 2018-04-04
US20140364586A1 (en) 2014-12-11
JP2012512858A (ja) 2012-06-07
PL2886132T3 (pl) 2018-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2556328T3 (es) Reactivos con funcionalidad tiol y sus usos
US12214050B2 (en) C-terminal lysine conjugated immunoglobulins
ES2905842T3 (es) Derivados de 6-amino-7,9-dihidro-8h-purin-8-ona como agonistas del receptor tipo Toll 7 (TLR7) como inmunoestimulantes
BR112020002953A2 (pt) derivados de 6-amino-7,9-di-hidro-8h-purin-8-ona como agonistas do receptor imunoestimulante do tipo toll 7 (tlr7)
US20240252670A1 (en) Antibody drug conjugate, preparation method therefor and application thereof
CN113548984A (zh) 一种非天然氨基酸及其应用、包含其的重组蛋白以及重组蛋白偶联物
US7569706B2 (en) Glycerol derivative
CN114144201B (zh) 含可裂解连接基的抗体药物缀合物
CN102481377B (zh) 糖基化相关的材料和方法
EP4141017A1 (en) Duocarmycin derivative and use thereof
CA3236102A1 (en) Pyridazinedione-based heterobicyclic covalent linkers and methods and applications thereof
HK1210026B (en) Thiol-functionalising reagents and their uses
US20230125454A1 (en) Conjugate of phthalocyanine dye and antibody or peptide
ES2889775T3 (es) Proceso mejorado para la síntesis del fármaco-enlazador vc-seco
US20250042936A1 (en) Method for glycosylation modification of proteins and/or polypeptides
HK1165435B (en) Thiol-functionalising reagents and their uses
HO et al. 6.3 Glycopeptide Synthesis
KR20260049791A (ko) 라이게이션을 위한 환형 카바메이트 화합물
Alexander The use of sulfur in aqueous carbohydrate chemistry