ES2556630T3

ES2556630T3 - Medio condicionado para células progenitoras de hígado

Info

Publication number: ES2556630T3
Application number: ES09761761.7T
Authority: ES
Inventors: Maria Beatriz Herrera Sanchez; Valentina Fonsato; Ciro Tetta; Giovanni Camussi
Original assignee: Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Current assignee: Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2009-06-11
Publication date: 2016-01-19
Anticipated expiration: 2029-06-11
Also published as: PL2296672T3; PT2296672E; EP2296672B1; US10456425B2; CN103800895B; HUE028676T2; BRPI0909866A2; EP2296672A1; CA2727392C; US20170182100A1; JP2011522553A; US10357519B2; US20110129439A1; CA2727392A1; JP5632833B2; BRPI0909866B1; WO2009150199A1; CN103800895A; DK2296672T3; CN102119031A

Abstract

Un método para producir de un medio condicionado, que comprende las etapas de: (i) cultivar hepatocitos maduros humanos derivados de hígado de adulto en un medio de cultivo celular hasta la muerte de hepatocitos maduros y selección de una población de células supervivientes que tienen morfología epitelioide; (ii) expandir la población de células supervivientes que tienen morfología epitelioide cultivando en un medio de cultivo que contiene suero, que contiene glucosa suplementado con hEGF (factor de crecimiento epitelial humano) y bFGF (factor de crecimiento fibroblastos básico) y que contiene sales inorgánicas, aminoácidos y vitaminas usuales necesarios para el crecimiento de células de mamíferos; y (iii) separar las células del medio de cultivo celular.

Description

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DESCRIPCION

Medio condicionado para celulas progenitoras de hlgado

La presente invencion se desarrolla en el campo de las preparaciones farmaceuticas biologicas y medicina regenerativa.

Las preparaciones de celulas madre demostraron ejercer un efecto regenerativo en los tejidos humanos o animales. Las pruebas cllnicas que prueban la eficacia de soporte de hlgado bioartificial en el tratamiento de fallo hepatico fulminante (FHF) han demostrado algunos resultados prometedores, si bien la generation actual de dispositivos no ha demostrado suficiente eficacia y confiabilidad para uso de rutina, primariamente debido a la carencia de una fuente de hepatocitos humanos funcionalmente estables (Kobayashi N, Okitsu T, Tanaka N. Cell choice for bioartificial livers. Keio J Med. 2003;52(3):151-7.). Las celulas madre de hlgado, o incluso celulas madre derivadas de otros tejidos, podrlan proveer potencialmente una fuente alternativa de hepatocitos humanos. Ademas de la medula osea, las celulas madre residen en los tejidos adultos tales como hlgado y en el sistema nervioso central, y tienen una plasticidad mucho mayor que la conocida previamente.

Las celulas progenitoras/madre pluripotentes del hlgado humano descritas en la solicitud Internacional de patente WO2006/126236 demostraron experimentar diferenciacion en una variedad de tipos de celulas de tejidos y ejercer efectos regenerativos en organos. Estas celulas son derivadas de una llnea de celulas progenitoras pluripotentes de hlgado humanas no ovales que expresan marcadores celulares hepaticos.

La solicitud internacional de patente WO2006/126236 divulga tambien un metodo para aislar las celulas progenitoras/madre pluripotentes de hlgado humano antes mencionadas capaces de experimentar diferenciacion en una variedad de tipos de celulas, comprendiendo el metodo las etapas de:

(i) cultivar hepatocitos maduros humanos derivados de hlgado en un medio de cultivo celular hasta la muerte de hepatocitos maduros y selection de una poblacion de celulas supervivientes que tengan morfologla epitelioide;

(ii) expandir la poblacion de celulas supervivientes que tengan morfologla epitelioide por cultivo en un medio de cultivo que contiene suero, que contiene glucosa suplementado con hEGF (factor de crecimiento epitelial humano) y bFGF (factor de crecimiento basico de fibroblastos) y que comprende las sales inorganicas, aminoacidos y vitaminas usuales necesarios para el crecimiento de las celulas de mamlferos.

y en particular en donde los hepatocitos maduros son congelados en un medio de cultivo que contiene suero en presencia de un agente crioprotector y luego descongelados antes de su cultivo de acuerdo con la etapa (i).

Las celulas progenitoras pluripotentes humanas de WO2006/126236 (designadas como HLSCs en la description de patente) y el metodo de prepararlas se incorporan aqul completamente como referencia.

Las preparaciones de las celulas madre mesenquimales (MSCs) demostraron ejercer un efecto regenerativo sobre el tejido. Por ejemplo, las celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea son conocidas por soportar de manera natural la hematopoyesis secretando un cierto numero de moleculas troficas, glicoprotelnas de matriz extracelular solubles, citoquinas y factores de crecimiento.

Sin embargo, las preparaciones de celulas madre tienen la desventaja principal de producir reacciones inmunes cuando se administran. Algunas preparaciones de celulas madre tienen incluso el potencial de causar cancer.

NOWAK G. ET AL., GVT, vol. 54, No. 7, 1 de julio de 2005, paginas 972,979 divulga un medio condicionado obtenible a partir del cultivo de progenitores de celulas madre de hlgado fetal humano.

La WO00/69449A divulga un medio condicionado que contiene diferentes componentes como IL-6, IL-8 y HGF y puede ser utilizado para aplicaciones en curacion de heridas.

BANAS AGNIESZKA ET AL., STEM CELLS, vol. 26, No. 10, 5 de junio de 2008, paginas 2705-2712, divulga un medio condicionado obtenible a partir de celulas mesenquimales derivadas de tejido adiposo y comprende HGF, IL- 8, IL-6 y VEGF.

Parekkadan et al. (Parekkadan B, van Poll D, Suganuma K, Carter EA, Berthiaume F, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. PLoS ONE. 2007 Sep 26;2(9):e941) establecio primero diversos tratamientos con MSC, tales como la administration de un medio condicionado (CM), para probar su eficacia en un modelo de rata de dano severo en el hlgado inducido. En este artlculo, las ratas recibieron administracion intraperitoneal de un total de dos inyecciones de D-galactosamina (Gal-N). En un segundo estudio (Van Poll D, Parekkadan B, Cho CH, Berthiaume F, Nahmias Y, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro e in vivo. Hepatology. 2008 Jan 24;47(5):1634-1643.) el grupo del Parekkadan investigo si la infusion sistemica de MSC-CM podrla llevar a una

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respuesta hepatoprotectora en el hlgado agudamente lesionado, especlficamente inhibiendo la muerte celular y estimulando programas reparadores. Este grupo utilizo un regimen subletal de induccion por D-galactosamina, demostrando un beneficio de supervivencia significativo y la prevencion de la liberacion de enzimas hepaticas despues del tratamiento con MSC-CM.

A la vista de las desventajas antes mencionadas de tratamientos con celulas madre, el hecho de que preparaciones altamente eficientes del arte anterior en el campo de la medicina regenerativa contienen usualmente celulas es un problema tecnico que deberla ser superado.

Asl, el objetivo de la presente invencion es proveer una preparacion que es efectiva como composition farmaceutica en el campo de medicina regenerativa pero que no contiene celulas, evitando por lo tanto las desventajas causadas por las preparaciones del arte anterior las cuales contienen celulas, particularmente celulas madre.

Otro objetivo de la presente invencion es proveer un metodo para preparar una composicion farmaceutica que es efectiva en el campo de la medicina regenerativa pero que no contiene celulas, evitando por lo tanto las desventajas causadas por las preparaciones del arte anterior que contienen celulas, particularmente celulas madre.

Estos y otros objetivos son alcanzados mediante las preparaciones y el metodo tal como se define en las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes estan dirigidas a realizaciones preferidas de la invencion. El asunto objeto de las reivindicaciones tanto dependientes como independientes forma una parte integral de la descripcion.

El uso de un modelo en raton de fallo hepatico fulminante (FHF), el medio condicionado libre de celulas (CM libre de celulas) producido cultivando una llnea celular progenitora de hlgado, tal como por ejemplo la llnea de celulas progenitoras pluripotentes de hlgado humano no ovales divulgado en WO2006/126236, demostro por parte de los inventores ejercer un efecto regenerativo sobre el hlgado. El medio condicionado libre de celulas (CM libre de celulas) producido por cultivo de la llnea celular progenitora del hlgado demostro ser efectivo en la terapia de fallo de organos, particularmente en la terapia de fallo de hlgado y rinon. Sorprendentemente, tambien se encontro que una llnea celular progenitora de hlgado CM es significativamente mas efectiva que una celula madre mesenquimal CM preparado bajo las mismas condiciones.

En particular, en los estudios descritos en el ejemplo 1 de la presente description, ratones macho SCID de 6 a 7 semanas de edad recibieron una inyeccion intraperitoneal de 500 pL de solution salina que contenla 0,125 pg de LPS y 18 mg de D-galactosamina (GAlN) para inducir FHF. Despues de 30 minutos, 1 y 3 horas despues de la administration de LPS y GAlN, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 3 ml de medio condicionado derivado de HLSCs cultivadas en un biorreactor rotatorio. El analisis preliminar del medio condicionado revelo una gran fraction de citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento. Los niveles en suero de la alanina transaminasa y la aspartato transaminasa se incremento marcadamente despues de la induccion de lesiones y disminuyo significativamente despues de 6 dlas de la inyeccion con tratamientos con medio condicionado. Por otro lado, el analisis histopatologico del tejido de hlgado evaluado por BrdU, PCNA y el ensayo de Tunel revelo un Indice disminuido de apoptosis y necrosis y una recuperation de la morfologla del tejido.

Estos estudios proveyeron la primera evidencia experimental de uso terapeutico potencial de medio condicionado derivado de HLSCs en el tratamiento de condiciones inflamatorias y regeneration de organos.

Asl, un primer aspecto de la invencion es un medio condicionado tal como se define en la reivindicacion 4. Las llneas de celulas progenitoras de hlgado humanas mencionada en la reivindicacion 4 es preferiblemente una llnea de celulas progenitoras pluripotentes de hlgado humano no ovales, mas preferiblemente la llnea de celulas pluripotentes de hlgado humano no ovales divulgada en la solicitud internacional de patente WO2006/126236, la cual se incorpora aqul por referencia.

Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad efectiva de la preparacion definida mas arriba cae tambien dentro del alcance de la invencion.

En lo que sigue, el medio condicionado que forma el asunto objetivo de la invencion sera denominado como el "HLSC-CM libre de celulas".

El termino "HLSC" se refiere a una llnea de celulas progenitoras/madre pluripotente de hlgado. Preferiblemente, el termino "HLSC" se refiere a una llnea de celulas pluripotentes de hlgado no ovales, mas preferiblemente a la llnea de celulas progenitoras/madre pluripotentes de hlgado divulgada en WO2006/126236. Mas preferiblemente, la llnea celular HLSC tiene las caracterlsticas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 de la WO2006/126236 y/o las caracterlsticas resumidas en la Tabla 1, pagina 7 de la WO2006/126236. Tales caracterlsticas se incorporan aqul como referencia.

La HLSCs-CM libre de celulas que forma el asunto objeto de la invencion es adecuada para uso como una composicion farmaceutica como tal o en una forma concentrada. Una forma concentrada es concentrada por

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ejemplo al menos aproximadamente 5 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces, mas preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces, incluso mas preferiblemente de manera aproximada 25 veces.

Preferiblemente, la HLSC-CM libre de celulas de la invencion se obtiene a partir celulas progenitoras/madre pluripotentes de hlgado, preferiblemente la llnea celular HLSC divulgada en WO2006/126236, cultivada bajo condiciones de GMP, las cuales son conocidas para la persona experimentada. Alternativamente, puede ser obtenida de celulas progenitoras/madre pluripotentes de hlgado, preferiblemente la llnea celular HLSC divulgada en WO2006/126236 cultivada en un sistema BAL (Hlgado Bioartificial), el cual tambien es conocido para la persona experimentada.

Un ejemplo de condiciones GMP para el crecimiento de celulas progenitoras/madre pluripotentes de hlgado y recoleccion del medio condicionado libre de celulas (CM) de las mismas es como sigue.

Las celulas progenitoras/madre pluripotentes de hlgado son aisladas por el metodo divulgado en WO2006/126236, en el cual la etapa de expansion se lleva a cabo cultivando las celulas madre progenitoras en la presencia de suero de ternera fetal (FCS) preferiblemente a una concentracion de aproximadamente 10%, hEGF (factor de crecimiento epitelial humano) y bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos basicos). el FCS, bFGF y el hEGF son preferiblemente grado GMP, por ejemplo, los producidos por Invitrogen.

Para recolectar el medio condicionado en condiciones de GMP, el FCS es retirado del cultivo, puesto que esta es una protelna heterologa que no es adecuada para inyeccion en humanos. Con este fin, las celulas son lavadas y cultivadas durante 24 horas en un medio de recoleccion que comprende por ejemplo alfa-MEM suplementado con albumina humana grado GMP. La albumina esta preferiblemente a una concentracion de aproximadamente 0.05%. El medio condicionado libre de celulas es recolectado entonces por centrifugacion o filtracion.

En la experimentacion in vivo mencionado mas arriba, la administracion del HLSC-CM libre de celulas de la invencion a un modelo animal (ratones SCID) de fallo hepatico fulminante (FHF) demostro proveer un beneficio de supervivencia significativo en los ratones SCID tratados con MSC-CM.

El medio condicionado de acuerdo con la invencion es adecuado para uso como un medicamento:

En particular para el tratamiento de fallo y/o lesion en un organo, preferiblemente fallo y/o lesion en hlgado y/o rinon.

Ademas, los inventores analizaron la composicion del HLSC-CM libre de celulas de la invencion, con el fin de identificar aquellas protelnas (por ejemplo, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y/o otras protelnas) que mas probablemente provean una contribucion significativa a los efectos beneficiosos del CM mencionados mas arriba, de tal manera que se provean composiciones farmaceuticas simplificadas compuestas de una mezcla de protelnas capaces de imitar, al menos en parte, las capacidades regenerativas de organos del CM producido por cultivo del HLSCs como se describio mas arriba.

Asl, otro aspecto de la invencion es una composicion farmaceutica simplificada que comprende una cantidad farmaceuticamente efectiva de una mezcla de al menos factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), interleucinas 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a 10-400 ng/ml.

En una realization preferida, la composicion farmaceutica simplificada comprende una cantidad farmaceuticamente efectiva de una mezcla de al menos factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8) y protelna estimulante de macrofago (MSP) y opcionalmente factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

En aun otra realizacion preferida, la composicion farmaceutica simplificada comprende una cantidad farmaceuticamente efectiva de una mezcla de protelnas de acuerdo con cualquiera de las realizaciones definidas mas arriba y al menos una protelna adicional seleccionada del grupo consistente de activina C, molecula de adhesion celular de leucocitos activada (ALCAM ), receptor 4 de quimioquina (motivo C-C) (CCR4), regulador 1 de transmembrana BMP rico en cistelna (tipo cordina) (CRIM), Decorina, ectodisplasina A2 (EDA-A2), endotelina, factor de crecimiento de fibroblastos tipo receptor 1 (FGFR5 ), Glipicano 3, oncoprotelna relacionada con crecimiento (GRO), protelna 6 de enlazamiento a factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP-6), factor de crecimiento 1 tipo insulina (IGF-1), receptor de interleucina 20, alfa (IL-20 R alfa), protelna 2 de transmembrana que contiene Kringle (Kremen-2), protelna 1 de enlazamiento beta al factor de crecimiento de transformation latente (TGF-beta bp1 latente), protelna intrlnseca principal de fibra de lente (MIP-2), cadena beta de MSP, osteoprotegerina/TNFRSF11B (superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 11b), gp130 soluble (sgp130), protelna secretada, acida, rica en cistelna (osteonectina) (SPARC).

Los rangos de concentracion de citoquinas preferidos en la composicion farmaceutica simplificada de la invencion son como sigue:

- HGF: 1-100 ng/ml, preferiblemente 5-80 ng/ml, mas preferiblemente 10-65 ng/ml;

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- IL-6: 10-200 ng/ml, preferiblemente 20-100 ng/ml, mas preferiblemente 30-50 ng/ml;

- IL-8: > 35 ng/ml, preferiblemente 50-600 ng/ml, mas preferiblemente 100-300 ng/ml;

- VEGF (si esta presente): 10-400 ng/ml, preferiblemente 20-250 ng/ml, mas preferiblemente 35-175 ng/ml; and

- MSP (si esta presente): 1-100 pg/ml, preferiblemente 5-80 pg/ml, mas preferiblemente 5-65 pg/ml.

Sin embargo, el alcance de la invencion tambien incluye cualquier forma diluida o concentrada de la composicion farmaceutica simplificada. Una forma concentrada es concentrada por ejemplo al menos aproximadamente 5 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces, mas preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces, incluso mas preferiblemente de manera aproximada 25 veces. Una forma diluida esta diluida por ejemplo al menos aproximadamente 5 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces, mas preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces, incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 25 veces.

La composicion farmaceutica simplificada de la invencion es adecuada para uso como un medicamento, preferiblemente para el tratamiento de fallo y/o lesion de un organo, preferiblemente fallo y/o lesion de hlgado y/o rinon. De acuerdo con una realization preferida, la composicion farmaceutica es formulada de tal manera que se administran las dosis siguientes de citoquina:

- HGF: 0.01-1 mg/kg, preferiblemente 0.03-0.8 mg/kg, mas preferiblemente 0.1-0,5 mg/kg;

- interleucina 6 (IL-6): 0.01-1 mg/kg, preferiblemente 0.03-0.8 mg/kg, mas preferiblemente 0.05-0,5 mg/kg;

- interleucina 8 (IL-8): 0.01-1 mg/kg, preferiblemente 0.02-0.8 mg/kg, mas preferiblemente 0.03-0,5 mg/kg;

- VEGF (si esta presente): 0.01-1 mg/kg, preferiblemente 0.02-0.8 mg/kg, mas preferiblemente 0.04-0,5 mg/kg;

- MSP (si esta presente): 0.01-1 mg/kg, preferiblemente 0.02-0.8 mg/kg, mas preferiblemente 0.08-0,5 mg/kg.

En una realizacion particularmente preferida estas dosis de citoquinas son administran una vez por dla.

Debe entenderse que las composiciones farmaceuticas simplificadas definidas mas arriba se proveen puramente como ejemplos no limitantes de composiciones farmaceuticas simplificadas capaces de imitar, al menos en parte, las capacidades regenerativas de organos de un CM obtenible por cultivo de HLSCs como se describio mas arriba.

objetivos y ventajas adicionales de la invencion apareceran de manera mas clara a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se proveen unicamente a manera de ilustracion.

Ejemplo 1 - Estudios preliminares in vivo

Preparacion de cultivos de celulas HLSC y MSC

Se aislaron celulas progenitoras de hlgado humanas (HLSCs) como se describe en WO2006/126236. Las celulas se dejaron crecer a 60%-70% de confluencia (aproximadamente 2x106 HLSCs por matraz de 75 cm2), se lavaron exhaustivamente y se cultivaron en 10 mL de medio alfa-MEM libre de suero suplementado con 0.05% de albumina de suero humana (producida por GMP). Se aislaron celulas madre mesenquimales humanas (MSCs) a partir de aspirados de medula osea y se cultivaron y caracterizaron como se informo previamente. Las MSCs fueron cultivadas en medio MesenpRO RS™ el cual es un medio reducido en suero (2% de FCS) especlficamente formulado para soportar el crecimiento de MSCs.

Preparacion del medio condicionado

El medio condicionado libre de celulas fue preparado recolectando el medio despues de 24 horas de cultivo de MSCs y HLSCs por centrifugation. Los experimentos fueron llevados a cabo con una masa celular de 2x106 celulas. El medio fue concentrado entonces, aproximadamente 25 veces, utilizando unidades de ultrafiltracion (Amicon Ultra- PL 3, Millipore) con un corte de peso molecular de 3 kDa. Se obtuvo un total de 250 pl de medio condicionado. Este medio concentrado fue diluido en 3 ml de a-MEM (sin FCS) hasta un volumen final de 3 ml. se administro por via intraperitoneal 1 ml de medio condicionado 30 minutos, 1 y 3 horas despues de la induction de la lesion en el hlgado.

Modelo FHF in vivo.

Para la induccion de fallo hepatico fulminante (FHF), se desarrollo toxicidad letal de lipopolisacarido (LPS) sobre animales en tratamiento con D-galactosamina (2-amino-2-desoxi-D-galactosa) como se describio previamente (Lehmann V, Freudenberg MA, Galanos C. Lethal toxicity of ipopolysaccharide and tumor necrosis factor in normal

and D-galactosamine-treated mice. J Exp Med. 1987;165(3):657-63). En resumen, un grupo de 10 ratones SCID recibieron una inyeccion intraperitoneal de D-galactosamina (GalN) (600 mg/kg) y 0.125 pg de LPS por animal. Los inventores determinaron previamente que se indujo 100% de letalidad en GalN (600 m g/kg) y LPS (0.125 pg por animal) en ratones tratados durante 8 horas. Se administraron GalN y LPS como una mezcla en 500 pl de solucion 5 de NaCl libre de pirogenos. Las muertes fueron registradas hasta 24 horas despues de la inyeccion. 30 minutos, 1 y 3 horas despues de la inyeccion de LPS y GalN, los ratones fueron inyectados por via intraperitoneal tres veces con 1 ml de medio condicionado concentrado de HLSC y MSC. Como se muestra en la Figura 1, cuatro de cinco ratones inyectados con el CM derivado de HLSC sobrevivieron, mientras que ninguno de los ratones tratados con el CM derivado de MSC sobrevivieron.

10 Composicion en citoquina de medio condicionado con HLSC y MSC

Para estudiar la composicion de medio condicionado obtenido por cultivo de HLSCs y MSCs como se divulgo mas arriba, se midio un panel de 31 citoquinas diferentes por ELISA multiple (Bioclarma). Ambos tipos de celulas fueron cultivados en un medio con 10% de FCS. Los medios condicionados fueron recolectados despues de 24 horas de cultivo. La composicion en citoquinas del medio solo tambien fue medida. Los resultados se proveen a continuation 15 en la Tabla 1.

Tabla 1. HLSCs vs. MSCs: production de citoquinas*

: HLSCs MSCs condition de cultivo 10% FCS

IL1 p: 0 0 0.86

ILra: 0 0 0

IL-2: 0 0 0

IL-4: 0 0 0.73

IL-5: 0 0 0

IL-6: 1130.89 2434.4 0

IL-7: 0 0 0

IL-8: >4205.64 51.65 0.36

IL-9: 0 0 0

IL-10: 0.12 0.36 0.85

IL-12: 0 0.47 0.24

IL-13: 0 0 0

IL-15: 0 0 0

IL-17: 0 0 0

Eotaxina: 5.1 3.96 0

bFGF: 0 0 0

G-CSF: 43.17 11.06 0

GM-CSF: 1.75 0 0.03

IFNy: 38.46 104.73 0

IP-10: 0 0 0

MCP-1: 514.43 256.03 0

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: HLSCs MSCs condicion de cultivo 10% FCS

MIP-1a: 0 0 0

MIP-1p: 0 0 0

PDGF: 0 0 0

Rantes: 5.97 0 0

TNFa: 3.7 13.04 0.19

VEGF: 896.9 4961.43 0

HGF: 5179 2.3 0

M-CSF: 17.79 4.48 0

MIF: 159.26 32.51 5.29

SCF: 5.1 0.11 0

* (la concentracion de citoquina fue expresada en pg/ml x 106 celulas tanto de HLSC como MSC cultivados en condition de cultivo al 10% de FCS durante 24 horas)

Ejemplo 2 - Efecto de CM de HLSCs y MSCs obtenido de cultivo en matraz T y mezclas de protelnas en un modelo in vivo con D-galactosamina/endotoxina de (FHF).

Se llevaron a cabo los siguientes estudios experimentales en un modelo in vivo (ratones SCID) de fallo hepatico fulminante (FHF).

1) El primer protocolo experimental consistio en la inyeccion intraperitoneal de 1 ml de un sobrenadante concentrado 25 veces obtenido del matraz T de cultivo de HLSC. La concentration de 25 veces fue alcanzada con membranas 3KD (Millipore). El sobrenadante fue sometido a ultracentrifugacion antes del uso. La inyeccion fue administrada 30 minutos, 1 hora y 3 horas despues de la induction FHF mediante la inyeccion de D-GalN/LPS. En total se trataron doce ratones SCID.

2) El segundo protocolo experimental consistio en la inyeccion de una mezcla de citoquinas. Se inyecto a un total de 10 ratones SCID con la siguiente mezcla de citoquina recombinante. HGF: 870,75 ng/ml X 30 ml de alfa-MEM (inyecciones i.v.)=26 pg IL-6: 340,5 ng/ml X 30 (inyecciones i.v)= 10,4 pg IL-8: 261 ng/ml X 30 (inyecciones i.v)= 8 pg VEGF: 202 ng/ml X 30 (inyecciones i.v)= 6 pg. Se prepararon 30 ml de esta mezcla con el fin de tener 3 ml de mezcla para un total de 10 ratones SCID. Cada raton SCID fue inyectado con 1 ml de esta mezcla de citoquinas a los 30 minutos, 1 hora y 3 horas despues de la inyeccion intraperitoneal de GalN/LPS. Cada raton SCID recibio: [HGF]: 2,59 pg, [IL-6]: 1,02 pg, [IL-8]: 0,79 pg, [VEgF]: 0,6 pg. Esta mezcla es designada como MIX 4.

3) El tercer protocolo experimental consistio en la inyeccion de MIX 4 mas MSP-1. Un total de 5 ratones SCID fueron inyectaron. Cada raton SCID recibio: [HGF]: 2,59 pg, [IL-6]: 1,02 pg, [IL-8]: 0,79 pg, [VEGF]: 0,6 pg (las cuales son las concentraciones de citoquina obtenidas de los experimentos BAL) mas [MSP-1]: 2 ug.

4) El cuarto protocolo experimental consistio en la inyeccion de MSC-CM o HLSC-CM. Con el fin de obtener el MSCs- CM, los MSCs se dejaron crecer a 90% de confluencia (aproximadamente 2 x 106 MSCs por matraz de 75cm2), se lavaron exhaustivamente y cultivaron en 10 mL MesenPRO RS™, un medio cultivado con FCS al 2%. El medio condicionado fue recolectado 24 horas despues y concentrado 25 veces utilizando unidades de ultrafiltracion (Millipore, Bedford, MA) con un corte de 3-kDa. Para producir HLSCs-CM, el HLSCs se dejo crecer a 60% hasta 70% de confluencia (aproximadamente 2 x 106 HLSC por matraz de 75 cm2), se lavo exhaustivamente, y se cultivo en 10 ml de medio alfa-MEM libre de suero suplementado con 0.05% de albumina de suero humana (producida por GMP). El medio condicionado fue recolectado 24 despues y concentrado 25 veces utilizando unidades de ultrafiltracion (Millipore, Bedford, MA) con un corte de 3-kDa.

El peso medio de los ratones SCID usados en estos experimentos fue de aproximadamente 25 g.

Materiales y metodos

Modelo in vivo de FHF. Para la induccion de FHF, se desarrollo toxicidad letal de lipopolisacarido (LPS) sobre animales en tratamiento con D-galactosamina (2-amino-2-desoxi-D-galactosa) como se describio previamente (Lehmann V, Freudenberg MA,Galanos C. Lethal toxicity of lipopolysaccharide and tumor necrosis factor in normal and D-galactosamine-treated mice.J Exp Med. 1987;165(3):657-63). En resumen, los ratones SCID recibieron una 5 inyeccion intraperitoneal de D-galactosamina (GalN) (600 mg / kg, 18 mg por animal) y 0.125 pg de LPS por animal. Los inventores determinaron previamente que se indujo 100% de letalidad en GalN (600 mg/kg) y LPS (0.125 pg por animal) tratando ratones durante 8 horas. El GalN y el LPS fueron administrados como una mezcla en 500 pl de solucion de NaCl libre de pirogenos. Las muertes fueron registradas hasta 24 horas despues de la inyeccion. 30 minutos, 1 y 3 horas despues de la inyeccion de LPS y GalN, los ratones fueron inyectados por via intraperitoneal 10 con 1 mL de medio condicionado con HLSC, medio condicionado con MSC o mezcla de citoquinas.

Cultivo de celulas. Se aislaron celulas madre mesenquimales humanas (MSCs) a partir de aspirados de medula osea y se cultivaron y caracterizaron como se informo previamente. Los MSCs fueron cultivados en medio MesenPRO RS™ el cual es un medio reducido en suero (2% de FCS) formulado especlficamente para soportar el crecimiento de MSC. Se usaron celulas para experimentos durante los pasajes 3-5.

15 Preparacion del medio condicionado (CM) de MSCs. Se cultivaron MSC humanas y se caracterizaron para la expresion de marcador de superficie y adipogenico y para la capacidad de diferenciacion osteogenica tal como se describio previamente. Para obtener MSCs-CM, las celulas se dejaron crecer hasta 90% de confluencia (2 x 106 MSCs por matraz de 75 cm2), se lavaron exhaustivamente y cultivaron en 10 mL de MesenPRO RS™, un medio cultivado con 2% de FCS. El medio condicionado fue recolectado 24 horas despues y concentrado 25 veces 20 utilizando unidades de ultrafiltracion (Millipore, Bedford, MA) con un corte de 3 kDa.

Preparacion de HLSCs-CM. Se obtuvieron HLSCs humanos a partir de hepatocitos humanos congelados. Los HLSCs fueron cultivados y caracterizados en cuanto a la expresion del marcador de superficie y capacidad de diferenciacion como se describio previamente. Para obtener HLSCs- CM, las celulas se dejaron crecer a 60% hasta 70% de confluencia (aproximadamente 2 x 106 HLSC por matraz de 75 cm2), se lavaron exhaustivamente y 25 cultivaron en 10 mL de medio alfa-MEM libre de suero suplementado con 0.05% de albumina de suero humana (producida por GMP). El medio condicionado fue recolectado 24 horas despues y concentrado 25 veces utilizando unidades de ultrafiltracion (Millipore, Bedford, MA) con un corte de 3 kDa.

Concentration del medio condicionado: Los sobrenadantes fueron recolectados del matraz en T despues de 24 horas de cultivo. El sobrenadante fue concentrado entonces, aproximadamente 25 veces, utilizando unidades de 30 ultrafiltracion con un corte de peso molecular de 3 kDa de Millipore.

Analisis histologico: Se analizo la necrosis del hlgado a traves de tincion con H&E (tincion con hematoxilina y eosina), proliferation (tincion con PCNA) y TUNEL (celulas apoptoticas).

Analisis bioqulmicos. Los niveles de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) en suero fueron medidos utilizando un analizador cllnico automatico estandar.

35 Inmunoprecipitacion Western: La inmunoprecipitacion Western se llevo a cabo para la detection de BAX y BclXS/L. Los hlgados fueron homogeneizados y sometidos a lisis a 4°C durante 1 hora en regulador de lisis (Tris-HCl 50 mmol/L, pH 8.3, Triton X-100 al 1%, 10 pmol/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 pmol/L de leupeptina, y 100 U/ml de aprotinina) y se centrifugaron a 15,000 g. El contenido de protelna de los sobrenadantes fue medido por el metodo de Bradford. Allcuotas que contenlan 200 pg de protelna de lisados de hlgado fueron sometidas a 40 electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio al 10% en gel de poliacrilamida bajo condiciones reductoras y sometidas a electrodeposicion sobre filtros de membrana de nitrocelulosa. Las siembras fueron bloqueadas con leche desengrasada al 5% en 20 mmol/L de Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L de NaCl mas 0.1% de Tween (TBS-T). Las membranas fueron inmunosembradas subsecuentemente durante la noche a 4°C con los anticuerpos primarios relevantes en la concentracion apropiada. Despues de lavados extensos con TBS-T, las siembras fueron incubadas 45 durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios especlficos del isotipo conjugados con peroxidasa, lavada con TBS-T, desarrollada con reactivos de deteccion ECL durante 1 minuto, y expuesta a pellcula X-Omat. Se usaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal anti-BAX y anticuerpo policlonal anti-BclXS/L de Santa Cruz Biotechnology.

Resultados

50 Los resultados obtenidos se ilustran en las figuras 2-4.

La Figura 2 muestra la rata de supervivencia (%) de ratones SCID lesionados con GalN/LPS tratados con HLSC-CM (n = 22; 73% de supervivencia), a MSC-CM (n = 5; 0% de supervivencia) o con una mezcla de citoquinas (citoquinas: VEGF, lL6, IL8, HGF; n=10 con; 40% de supervivencia, y la mezcla de citoquinas mas MSP-1 (citoquinas*: VEGF, IL6, IL8, HGF + MSP-1; n=5;. 100% de supervivencia)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La figura 3 muestra los niveles en suero de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) de ratones de control, tratados con GalN/LPS y GalN/LPS inyectados con HLSC-CM despues de 6 dlas de induccion FHF

La figura 4 es una imagen que representa la tincion con H&E y PCNA de ratones SCID tratados con GalN/LPS inyectados con HLSC-CM despues de 3 y 6 dlas de induccion de FHF.

Ejemplo 3 - experimentos In vitro usando medio condicionado (CM) con HLSCs y MSCs y mezclas de citoquina

En este protocolo experimental, fue investigada la capacidad de HLSCs-CM para inhibir directamente la apoptosis en hepatocitos primarios humanos cultivados. Utilizando ensayos in vitro de apoptosis, el medio condicionado derivado de HLSCs demostro ejercer un efecto inhibidor directo sobre la muerte de hepatocitos. Esta actividad in vitro fue comparada tambien con la actividad in vitro de MSC-CM. El efecto de 6 citoquinas recombinantes humanas presentes en el medio condicionado producidas por las celulas tambien fue estudiado en los ensayos de apoptosis de hepatocitos humanos.

Materiales y metodos

Cultivo celular. Se aislaron celulas madre mesenquimales humanas (MSCs) a partir de aspirados de medula osea, se cultivaron y caracterizaron como se informo previamente. Las MSCs fueron cultivadas en medio MesenPRO RS™ el cual es un medio reducido en suero (2% de FCS) formulado especlficamente para soportar el crecimiento de MSCs. Las celulas fueron usadas para experimentos durante los pasajes 3-5. Las celulas progenitoras de hlgado humano (HLSCs) fueron aisladas como se describio previamente y se cultivaron en alfa-MEM/EBM (3:1) que contenla 10% de FCS (GMP; suero de ternera fetal) suplementado con 4ng/ml de hEGF y de hFGF.

Medio condicionado (CM) con MSCs. Se cultivaron MSCs humanos y se caracterizaron en cuanto a la expresion de marcador de superficie y capacidad de diferenciacion adipogenica y osteogenica como se describio previamente. Para obtener MSCs-CM, se dejaron crecer las celulas hasta 90% de confluencia (aproximadamente 2 x 106 MSCs por matraz de 75 cm2), se lavaron exhaustivamente, y se cultivaron en 10 mL de MesenPRO RS™, un medio cultivado con 2% de FCS. El medio condicionado fue recolectado 24 horas despues, se sometio a ultracentrifugacion y se concentro 25 veces utilizando unidades de ultrafiltracion (Millipore, Bedford, MA) con un corte de 3-kDa.

HLSCs-CM. Se obtuvieron HLSCs humanas de hepatocitos humanos congelados. Las HLSCs fueron cultivadas y caracterizadas en cuanto a la expresion del marcador de superficie y capacidad de diferenciacion como se describio previamente. Para obtener HLSCs-CM, se dejaron crecer las celulas a 60% hasta 70% de confluencia (aproximadamente 2 x 106 HLSC por matraz de 75 cm2), se lavaron exhaustivamente y se cultivaron en 10 mL de medio alfa-MEM libre de suero suplementado con 0.05 % de albumina de suero humana (producida por GMP). El medio condicionado fue recolectado 24 horas despues, sometido a ultracentrifugacion y concentrado 25 veces utilizando unidades de ultrafiltracion (Millipore, Bedford, MA) con un corte de 3-kDa.

Apoptosis de hepatocitos in vitro (TUNEL). Se cultivaron hepatocitos durante 1 dla en placas de 96 pozos a 30000 celulas/pozo en placas recubiertas con fibronectina. Se agrego galactosamina-D a una concentracion de 5 mM durante 24 horas, seguida por diferentes dosis de medios condicionados derivados de HLSC y MSC obtenidos como se describe previamente (de 0.5% a 16%), mezcla de cuatro citoquinas (MIX 4 significa IL-8, IL-6, HGF, VEGF). Los resultados se expresan como media ± SD de 8 experimentos diferentes.

Concentracion de citoquinas. La concentracion de citoquinas recombinantes humanas usadas en los experimentos in vitro fue seleccionada de las concentraciones producidas por HLSCs despues de 24 horas en condiciones de cultivo en matraz, concentradas 25 veces. En el caso de MSP, se uso la concentracion obtenida en condiciones de cultivo de BAL. La primera concentracion se considera la misma que la reserva de medio condicionado, las celulas fueron estimuladas con el 16% de cada concentracion de reserva que representaba la concentracion mas alta del medio condicionado usado in vitro.

IL-6=56,5 ng/ml, concentracion final usada = 9 ng/ml

IL-8=210 ng/ml, concentracion final usada= 33,6 ng/ml

HGF=259 ng/ml, concentracion final usada = 41,4 ng/ml

VEGF= 44,8 ng/ml, concentracion final usada= 7,2 ng/ml

MCP-1= 25,7 ng/ml, concentracion final usada = 4,1 ng/ml

MSP= 60 ng/ml, concentracion final usada= 9,6 ng/ml

Los resultados se ilustran en las Figuras 5-10.

La figura 5 muestra la inhibicion del apoptosis de hepatocitos in vitro por HLSCs-CM a concentraciones bajas. Los hepatocitos humanos primarios fueron cultivados en placas recubiertas con fibronectina. La apoptosis fue inducida con D-galactosamina (GalN). Durante la exposicion a GalN, los hepatocitos fueron cultivados en un medio de cultivo celular suplementado con 0.5; 2; 8 o 16% de HLSCs-CM concentrado 25 veces (producido por GMP). La muerte 5 celular fue cuantificada utilizando analisis de imagenes digital de cuatro imagenes por pozo. Los datos mostrados son la media ± SD de 8 experimentos. P <0.05.

La Figura 6 muestra micrograflas representativas del ensayo TUNEL de hepatocitos humanos tratados con GalN. (A) Los hepatocitos tratados con GalN 5 mM despues de 24 horas y (B) hepatocitos tratados con GalN 5 mM estimulados con 2% de HLSCs-CM despues de 24 horas.

10 La figura 7 muestra la inhibicion de la apoptosis de hepatocitos in vitro por MSCs-CM a bajas concentraciones. Los hepatocitos humanos primarios fueron cultivados en placas recubiertas con fibronectina. La apoptosis fue inducida con D-galactosamina (GalN). Durante la exposicion a GalN, los hepatocitos fueron cultivados en un medio de cultivo celular suplementado con 0.5; 2; 8 o 16% de MSC-CM concentrada 25 veces. La muerte celular fue cuantificada usando analisis de imagenes digital de cuatro imagenes por pozo. Los datos mostrados son la media ± SD de 8 15 experimentos. P <0.05.

La figura 8 muestra la inhibicion de apoptosis de hepatocitos in vitro por diversas mezclas de citoquinas. Los hepatocitos humanos fueron cultivados en la presencia de D-galactosamina (GalN; 5 mM) durante 24 horas. El uso de Mix4 + MSP sobre hepatocitos tratados con GalN dio como resultado la inhibicion de la apoptosis despues de 24 horas. Los hepatocitos tratados con GalN tambien fueron cultivados con Mix4 + MCP-1 o con la combinacion de 20 Mix4 + MSP + MCP-1. La muerte celular fue cuantificada usando analisis de imagenes digital para cuatro imagenes por pozo. Los datos mostrados son la media ± SD de 8 experimentos. *P <0.05.

Ejemplo 4 - analisis de la composicion de CM por ensayo multiplex y de inmunosorcion enlazada a enzima

Las citoquinas solubles producidas en los medios de cultivo por celulas madre de hlgado humanas (HLSCs) han demostrado potenciar la curacion del hlgado. Con el fin de elucidar adicionalmente los mecanismos involucrados, las 25 citoquinas liberadas por HLSCs fueron determinadas y comparadas con las citoquinas producidas por celulas madre mesenquimales de medula osea humana (MSCs). El analisis del perfil de las citoquinas secretadas fue extendido por la produccion de medio condicionado bajo diferentes condiciones de cultivo celular, tal como botellas rodantes, matraz T en condiciones normoxicas y matraz T bajo condiciones hipoxicas. En el caso de MSCs, las celulas fueron cultivadas solamente en un matraz T en condiciones de cultivo de normoxicas. Se obtuvo un total de 16 medios 30 condicionados diferentes. Todos los analisis hechos con el sistema Multiplex (de Bio-rad) del medio condicionado producido en 24 horas de cultivo por HLSCs y MSCs, indico la presencia de citoquinas y quimioquinas, tal como cantidades mayores de, entre otros, HGF, IL6, IL8 , VEGF, MCP1, con un total de 31 protelnas diferentes. Varios anticuerpos usados para el ensayo multiplex humano de Bio-Rad fueron tambien establecidos por ELISA (IL-6, IL-8, HGF, vEgF, MCP1 y MSP1). El ELISA fue llevado a cabo con los kits RayBio® Human ELIsA de acuerdo con las 35 instrucciones del fabricante. Los inventores tambien establecieron comparativamente el multiplex y el ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA). La comparacion fue basada en la medicion de seis citoquinas presentes en los 16 medios condicionados diferentes producidos. Las concentraciones de citoquina, tal como se miden de acuerdo con diferentes kits, mostraron tendencias similares, aunque las concentraciones absolutas medidas fueron diferentes.

40 Materiales y Metodos

Cultivo celular

HLSCs. Se aislaron celulas progenitoras de hlgado humanas (HLSC) como se describio previamente y se cultivaron en alfa-MEM/EBM (3:1) que contenla 10% de FCS (GMP; suero de ternera fetal) suplementado con 4ng/ml tanto de rhEGF como de rhFGF.

45 Las siembras celulares iniciales y las composiciones de los medios, para la recoleccion del medio condicionado (CM), en de todos los experimentos llevados a cabo con HLSCs cultivados por 24 horas, fueron como se describe a continuacion.

- 2 experimentos con celulas en pasaje 3 cultivadas en botella rodante: 20x106 HLSC culture in 100 ml of RPMI + 0,05% albumina humana

50 - 2 experimentos con celulas en pasaje 10 cultivadas en botella rodante : 20x106 HLSC culture in 100 ml of RPMI +

0,05% albumina humana

- 3 experimentos con celulas en pasaje 3 cultivadas en matraces T en condiciones normoxicas: 2x106 HLSC culture in 10 ml of RPMI+ 0,05% albumina humana

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

- 3 experimentos con celulas en pasaje 10 cultivadas en matraces T en condiciones normoxicas: 2x106 HLSC culture in 10 ml of RPMI+ 0,05% albumina humana

- 2 experimentos con celulas en pasaje 3 cultivadas en condiciones hipoxicas en matraz T: 2x106 HLSC culture in 10 ml of RPMI+ 0,05% albumina humana

- 2 experimentos con celulas en pasaje 10 cultivadas en condiciones hipoxicas en matraz T: 2x106 HLSC culture in 10 ml of RPMI+ 0,05% albumina humana

hMSCs. Se aislaron celulas madre mesenquimales humanas (hMSCs) a partir de aspirados de medula osea humana y se cultivaron y caracterizaron como se informo previamente. Las MSCs fueron cultivadas en medio MesenPRO RS™ el cual es un medio reducido en suero (2% de FCS) formulado especialmente para soportar el crecimiento de MSCs. Las celulas fueron usadas para experimentos durante el pasaje 3.

La siembra celular inicial y las composiciones de los medios, para la recoleccion del medio condicionado (CM), de los experimentos llevados a cabo con hMSCs cultivado durante 24 horas son como se discute a continuacion.

- 2 experimentos con celulas en pasaje 3 cultivadas en matraces T en condiciones normoxicas: 2x106 in 10 ml dePMI+ 0.05% de albumina humana.

Preparacion de CM. Se obtuvieron CM derivados de HLSCs obtenidos por siembra de las celulas a una concentracion de 2x106 en matraz T e incubandolas durante la noche en la incubadora. El dla siguiente, las celulas fueron lavadas exhaustivamente, y cultivadas en 10 mL de RPMI (sin rojo de fenol) en la presencia de 0.05% de albumina humana. El medio CM fue recolectado 24 horas despues y todas las allcuotas de cada experimento fueron congeladas a -20°C. Se concentro CM por centrifugacion durante 1, 30 horas a 4°C a 2700g, utilizando las unidades de ultrafiltracion de Millipore con un corte de 3-kDa de tamanos de poro.

El CM derivado de hMSCs fue obtenido permitiendo el crecimiento a 90% de confluencia (aproximadamente 2 x 106 MSCs por matraz de 75 cm2), lavando exhaustivamente, y cultivando en 10 ml de RPMI (sin rojo de fenol) en la presencia de 0.05% de albumina humana. El medio condicionado fue recolectado 24 horas despues y todas las allcuotas de cada experimento fueron congeladas a -20°C. Se concentro el CM por centrifugacion durante 1, 30 horas a 4°C a 2700g, utilizando las unidades de ultrafiltracion de Millipore con un corte de 3-kDa de tamanos de poro.

Despues de la recoleccion del CM, las celulas fueron recuperadas, se establecio la viabilidad celular mediante exclusion con colorante azul de triplano obteniendo mas de 95% de la viabilidad en todos los experimentos.

Cuantificacion de protelna total. La concentracion de protelna total en el CM fue determinada de acuerdo con el metodo de Bradford (Bio-Rad Laboratories) siguiendo el protocolo del fabricante. Se uso albumina de suero bovino (BSA) para crear una referencia estandar. Se agregaron 5 pl de cada muestra a 1 ml de colorante del reactivo Bradford diluido 1 a 5 con agua destilada y se mezclo. Despues de incubacion durante 5 minutos a temperatura ambiente, se detecto la absorbancia a 595 nm de luz optica con un fluorofotometro. La concentracion de protelna de cada muestra fue calculada de acuerdo con la curva de absorbancia de BSA linealizada.

ELISA. Se uso el RayBio® Human ELISA (ensayo inmunosorbente enlazado a enzima) para la medicion cuantitativa de IL-8, IL-6, VEGF, HGF, MCP1 y MSP1. Este ensayo emplea anticuerpos especlficos para las citoquinas humanas mencionadas, colocadas como recubrimiento sobre una placa de 96 pozos. Mediante una pipeta se depositan estandares y muestras en los pozos y las citoquinas presentes en una muestra se unen a los pozos por los anticuerpos inmovilizados. Los pozos fueron lavados y se agregan los anticuerpos de citoquina antihumana biotinilados. Despues de lavar los anticuerpos biotinilados no enlazados, se transfiere con pipeta estreptavidina conjugada a HRP a los pozos. Los pozos son lavados de nuevo, se agrega una solucion de sustrato TMB a los pozos y el color se desarrolla en proportion a la cantidad de citoquinas enlazadas. La Solution Stop cambia el color de azul a amarillo, y la intensidad del color se mide a 450 nm.

Ensayo Bioclarma. Un inmunoensayo biometrico multiplex de Bio-rad, que contiene microesferas coloreadas fluorescentes conjugadas con un anticuerpo monoclonal especlfico para las protelnas objetivo, fue utilizado para la medicion de citoquinas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Plex Human Cytokine Assay; Bio-Rad). Las siguientes citoquinas fueron ensayadas: IL-1 p, IL-1 ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, CXCL8 (IL-8), IL-9, IL-10, HgF, M-CSF, MIF, SCF, PDGF, Rantes, VEGF, Eotaxin, bFGF, IP-10, IFNy, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, factor estimulante de colonia de granulocitos (G -CSF), factor estimulante de colonia de granulocitomonocitos (GM-CSF), protelna quimioatrayente de monocitos (MCP-1), protelna inflamatoria de macrofago (MIP-1 p/CCl4), MIP-1a y TNF- a.

En resumen, se incubaron 250 pl de CM no diluido con perlas acopladas al anticuerpo. Los complejos fueron lavados, luego incubados con anticuerpo para detection biotinilado y, finalmente, con estreptavidina-ficoeritrina antes de establecer los tltulos de la concentracion de citoquina. Se utilizo un rango de 1.95-40,000 pg/ml de

citoquinas recombinantes para establecer curvas estandar y para maximizar la sensibilidad del rango dinamico del ensayo. Los niveles de citoquinas fueron determinados utilizando un lector de arreglo multiplex de Luminex™ Instrumentation System. La concentracion fue calculada utilizando el software provisto por el fabricante. Los resultados obtenidos se ilustran a continuacion en las Tablas 2-8.

5 Tabla 2. Numero de celulas recolectadas despues de 24 horas

Celulas: Cantidad de Celulas despues de 24 horas

HLSC Rodante 3p: 4,25 ± 0,49 x 106

HLSC Rodante 10p: 2,3 ± 2,1 x 106

HLSC Hip 10p: 1,82 ± 0,74 x 106

HLSC Hip 3p: 1,04 ± 0,88 x 106

HLSC Norm 10p: 2,56 ± 0,79 x 106

HLSC Norm 3p: 1,70 ± 0,18 x 106

Norm MSC 3p: 2,35 ± 0,78 x 106

Tabla 3. Concentracion de protelna de CM despues de 24 horas en cultivo despues de concentracion con filtro Amicon.

CM derivado de:: Concentracion de protelna de CM (mg/ml) ± SD Concentracion de protelna de CM despues de concentracion con Amicon (mg/ml) ± SD

HLSC Rodante 3p: 0,36 ± 0,004 7,405 ± 0,106

HLSC Rodante 10p: 0,335 ± 0,021 7,37 ± 0,141

HLSC Hip 10p: 0,315 ± 0,021 7,68 ± 0,396

HLSC Hip 3p: 0,31 ± 0,013 7,55 ± 0,707

HLSC Norm 10p: 0,29 ± 0,012 7,18 ± 0,490

HLSC Norm 3p: 0,28 ± 0,078 7,72 ± 0,132

Norm MSC 3p: 0,23 ± 0,042 7,75 ± 0,276

10

Tabla 4. Concentracion de citoquinas (pg/ml) determinada por Multiplex (Bioclarma) (pg/ml ± SD)

Citoquina

: Rodante 3p HLSC RodantelOp HLSC Hip 10p HLSC Hip 3p HLSC Norm 10p HLSC Norm 3p HLSC Norm 3p MSC

IL1 (3: 22 ± 0,14 34 ± 13 30,8 ± 19,8 83,4 ± 32,5 17,1 ± 9,9 51,8 ± 35,9 7,5 ± 2,6

ILra: 96 ± 0,32 87 ± 5 99,8 ± 26,5 163,4 ± 31,9 86,1 ± 7,9 91,7 ± 32,6 596 ± 404

IL-2: 0 0 0 0 0 0 0

IL-4: 2,6 ± 0,02 2,8 ± 0,05 2,9 ± 1,1 4,8 ± 0,9 2,4 ± 0,3 2,4 ± 1,3 2 ± 1.4

IL-5: 0 0 0 0 0 0 0

IL-6: >40000 >40000 >40000 >40000 >40000 >40000 >40000

IL-7: 0 4,4 ± 2,5 8,4 ± 2,4 24,1 ± 7,9 7,4 ± 3,7 18,5 ± 9 7,6 ± 1,6

IL-8: >35000 >35000 >35000 >35000 >35000 >35000 >35000

IL-9: 52 ± 0,8 42 ± 3,6 32,7 ± 12,4 41,9 ± 15,2 24,6 ± 7,7 26,1 ± 4,8 27,9 ± 3,0

IL-10: 32 ± 3,9 33 ± 5,5 32,9 ± 0,1 36 ±4,2 28,5 ± 3,7 31,3 ± 1,3 35,8 ± 7,9

IL-12: 59,1 ± 11 52,8 ±11,6 56,7 ± 8,7 74 ±6,6 56 ± 8,1 41,1 ± 17 36,6 ± 13

IL-13: 9,2 ± 2,2 7,7 ± 0,8 5,6 ± 2,1 7,8 ± 3,4 4,4 ± 2,0 2,2 ± 1 4,9 ± 1,3

IL-15: 93,3 ± 9,8 87,1 ± 8,3 94,6 ± 5,6 95,9 ± 13,4 93,9 ± 10,7 81,8 ± 9,7 64,5 ±22

IL-17: 0 0 0 0 0 0 0

Eotaxina: 81,3 ± 19 359 ± 227 2350 ± 532 2748 ± 76 1932 ± 133 2417 ±453 21 ± 17

bFGF: 49,8 ± 3,9 79 ± 14 30,1 ± 5,6 23,5 ± 2,8 44 ± 59 22,1 ± 26 6,7 ± 9,2

G-CSF: 1150 ±149 1714 ± 183 1371± 1670 16275± 8389 490 ± 468 2188 ± 921 359,3 ±212

GM-CSF: 47 ± 0,8 37,4 ± 5,6 49,5 ± 2,4 59 ± 51 38,8 ± 3,8 60,4 ± 21 65 ±65

Citoquina

IFNy: 156 ± 1,6 168 ± 10,1 171 ± 49,8 236 ± 27 147 ± 14,5 176,1 ±44 174,5 ± 38

IP-10: 0 54 ± 77 30 ±42 61 ± 86 14,5 ± 25 283,5 ± 132 28043,3 ± 13513

MCP-1: ? ? 5622 ±2131 2999 ± 494 4614± 872 5647,9 ± 2821 1410,5 ± 767

MIP-1a: 3,6 ± 1,4 2,1 ± 0,4 2,6 ± 0,2 2,8 ± 2,3 2,1 ± 0,5 5,8 ± 0,5 12,5 ± 1,1

MIP-1 (3: 0 0 0 0 0 0 0

bbPDGF: 0 0 0 0 0 0 0

Rantes: 109 ±28 328 ± 227 279 ±210 909 ± 566 576 ± 522 118 ± 24 11353 ± 9310

TNFa: 22 ±2 24 ±4 29 ±4 40,5 ± 7,7 22 ±2,5 24,6 ± 6,7 30,2 ± 5,3

VEGF: 33817 ±6318 24814±1567 22591 ± 7330 32286 ± 4297 14830± 3860 16664±10951 16485± 3722

HGF: 12238± 1109 6674 ± 2872 20901±1033 15508±1159 20642 ± 3543 15853 ± 4380 340 ±145

M-CSF: 555 ± 39 256 ± 26 496±177 538 ± 299 649 ± 628 548 ± 33 173 ±65

MIF: 35047 ±4014 45045±1835 30773 ± 9632 24216±11108 24719±14645 17956 ±4115 10512±1367

SCF: 119 ± 10 119 ± 64 209 ± 32 144 ± 31 265 ±216 211 ± 79 15,4 ± 3,6

Tabla 5. Rango de concentracion en pg/ml (o ng/ml cuando se indique) determinado por multiplex de todo el CM producido por HLSCs y MSCs en pasaje 3 (bioclarma)

: HLSC MSC

IL1P: 15,9-87,7 4,9-10,1

ILra: 59,1-124,3 192-1000

IL-2: 0 0

IL-4: 0-3,7 0-3,4

IL-5: 0 0

IL-6: >40000 >40000

IL-7: 6,7-27,9 6-9,2

IL-8: >35000 >35000

IL-9: 21,3-30,9 19,8-30,9

IL-10: 12,9-32,6 15-43,7

I L-12: 20,9-58,1 21,9-49,6

IL-13: 0-3,2 0-6,2

IL-15: 57-91,4 25-109

IL-17: 0 0

Eotaxina: 505-2870 10-38

bFGF: 22-6055 0

G-CSF: 1267-3109 11-571

GM-CSF: 19,8-81,4 0-130

IFNy: 97-220 107-213

IP-10: 152-416 0,9-41,6 (ng/ml)

MCP-1: 1658-8500 600-2296

MIP-1a: 5,3-13 11,4-90

MIP-1p: 4,4-6,2 0-1000

bbPDGF: 0 0

Rantes: 94-142 124-20700

TNFa: 17,9-31,3 24,9-35,5

VEGF: 34,9-91 (ng/ml) 25,9-65,9 (ng/ml)

HGF: 11,5-20,2 (ng/ml) 195-485

M-CSF: 515-1072 91-238

: HLSC MSC

MIF: 9114-22100 8280-11900

SCF: 128-290 9,9-19

Tabla 6. Concentracion de citoquinas (pg/ml) determinado por RayBio® Human ELISA

Citoquina: Rodante 3p HLSC Rodante 10p HLSC Hipoxico1 0p HLSC Hipoxico3 p HLSC Normoxico 10p HLSC Normoxico 3p HLSC Normoxico 3p MSC

VEGF: 154572 ± 3903 121884 ±50131 153456 ± 3479 132132 ± 297 118708 ± 16848 118936 ± 56365 157896 ± 4811

HGF: 33822 ± 823 24312 ± 3971 90540 ± 23215 49050 ± 9631 88488 ± 9267 51716 ± 12211 0

MCP1: ± 383 698 6397 ± 126 5966 ± 9 5635 ± 38 5823 ± 319 5680±189 5497 ± 465

MSP1: 20.4 ± 14.4 6,4 ± 4,5 5,4 ± 4,2 0 39,4 ± 1,4 34,4 ± 28 0

IL6: 20604 ± 453 27694 ± 3493 28744 ± 2008 33319 ± 1732 27264 ± 10578 37971 ± 4381 30389 ± 3444

IL8: 180432 ± 7682 183909 ± 10799 191568 ± 3311 189114 ± 803 203349 ± 13125 206652 ± 14639 227796 ± 12760

Tabla 7. Rango de concentracion determinado por ELISA.

Citoquina: HLSC MSC

VEGF: 63-175(ng/ml) 153-163(ng/ml)

HGF: 39,5-64(ng/ml) 0

IL-6: 33,6-42,3(ng/ml) 26,9-33,8(ng/ml)

IL-8: 192-221 (ng/ml) 215-240(ng/ml)

MCP1: 5491-5869 (pg/ml) 5032-5962 (pg/ml)

MSP1: 6,4-62,4 (pg/ml) 0

5

Tabla 8. Rango de concentracion de citoquinas seleccionadas determinado por multiplex y ELISA (ND: no determinado)

Citoquina: HLSC MSC HLSC MSC

VEGF: 34,9-91 (ng/ml) 25,9-65,9 (ng/ml) 63-175 (ng/ml) 153-163 (ng/ml)

HGF: 11,5-20,2 (ng/ml) 195-485 (pg/ml) 39,5-64 (ng/ml) 0

IL-6: >40 ng/ml >40 ng/ml 33,6-42,3 (ng/ml) 26,9-33,8 (ng/ml)

IL-8: >35 ng/ml >35ng/ml 192-221 (ng/ml) 215-240 (ng/ml)

5

10

15

20

25

30

35

40

Citoquina: HLSC MSC HLSC MSC

MCP1: 1658-8500 (pg/ml) 600-2296 (pg/ml) 5491-5869 (pg/ml) 5032-5962 (pg/ml)

MSP1: ND ND 6,4-62,4 (pg/ml) 0

Inmunoprecipitacion de MSP-1 a partir de medio condicionado con HLSC y transferencia Western

El MSP-1 en sobrenadantes de cultivo de HLSC fue determinado por inmunoprecipitacion y transferencia Western. Se centrifugaron 15 mL de sobrenadante de cultivo despues de 24 horas de cultivo durante 70 minutos a 4000 x g a 4°C, se concentro sobre un ultrafiltro Amicon 3kD hasta 250 pL. Para la precipitacion de la protelna, se agrego 1 ml de etanol puro frlo (-20°C) a 250 pl de sobrenadante concentrado y se incubo a -80°C durante la noche. Las protelnas precipitadas fueron recolectadas despues de centrifugacion a 1,200 g y se sometieron a lisis con 500 I de regulador RIPA. La inmunoprecipitacion se llevo a cabo durante 18 horas utilizando un anticuerpo anti-MSP (sistema R&D) entrecruzada a protelna A-Sefarosa. Para SDS-PAGE, las pellas fueron suspendidas en 40 pl de 2-beta- mercaptoetanol y se calentaron a 100°C. Las protelnas fueron separadas por SDS-PAGE en gel de acrilamida al 8%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Despues de 1 hora de bloqueo con leche no grasa seca al 5% en solucion salina regulada con Tris que contenla 0.05% de Tween 20, la membrana fue incubada durante la noche con 2 pg/ml de anticuerpo MSP antihumano a 4°C y, despues de lavar tres veces, se incubo 1 hora a temperatura ambiente con IgG anti raton de cabra conjugado con peroxidasa de rabano (BioRad). La membrana fue revelada con un reactivo de quimioluminiscencia y analizada con chemidoc.

Los resultados se ilustran en la Figura 9, mostrando inmunoprecipitacion de MSP a partir de medio condicionado de HLSCs en tres pasajes diferentes (1, 2, 5). Las bandas de 85 kDa representan MSP monomerico (pro-MSP), y las bandas de 55 kDa la cadena a de MSP dimerico (activo).

Ejemplo 5 - analisis de la composicion de CM por arreglo de anticuerpo basado en marcacion con Biotina Raybio

Los niveles de expresion de 507 protelnas objetivo humanas derivadas de HLSC y MSC CM. fueron detectados simultaneamente. Los CM fueron recolectados despues de 48 horas de cultivo de 1 x 106 celulas en presencia de aMEM suplementada con 0.2% de FCS como se describio en el protocolo de arreglo de protelnas. El panel de moleculas inclula citoquinas, quimioquinas, adipoquina, factores de crecimiento, factores angiogenicos, proteasas, receptores solubles, moleculas solubles de adhesion, y otras protelnas en el sobrenadante de cultivo celular.

Material y metodos

Preparacion de CM. Para preparar CM de HLSCs y MSC, se sembraron celulas en placas de cultivo de tejidos de 100 mm a una densidad de 1 x 106 celulas por placa. Las celulas fueron entonces cultivadas con medio de cultivo completo durante 24-48 horas. Despues de eso, el medio fue reemplazado con medio bajo en suero (0.2% de FCS) y luego las celulas fueron cultivadas durante 48 horas de nuevo una vez mas. Los CM fueron recolectados y centrifugados a 1000 g. Los CM de ambos tipos de celulas fueron dializados antes de la etapa de marcacion con biotina. A traves de un proceso simple, la amina primaria de las protelnas en las muestras fue biotinilada, seguida por dialisis para eliminar biotina libre. A partir de aqul, las muestras recien biotiniladas fueron agregadas sobre la membrana de arreglo e incubadas a temperatura ambiente. Despues de incubacion con HRP-estreptavidina, las senales fueron visualizadas por quimioluminiscencia. En esta disposicion, se utilizo un control interno para monitorizar el proceso completo incluyendo la marcacion con biotina-y el arreglo de anticuerpos. Los resultados fueron analizados con la RayBio Analysis Tool el cual es un programa especlficamente disenado para analisis de arreglo de anticuerpos basados en marcacion con biotina RayBio. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre esta disposicion en el Manual de Usuario de Arreglo I de Anticuerpos Humanos Basado en Marcacion con Biotina RayBio®.

La figura 10 muestra el mapa de arreglo humano basado en marcacion con Biotina RayBio y de sobrenadante (B), derivado de HLSCs (A) y MSC (B).

Los resultados completos del ensayo de arreglo de anticuerpos basado en marcacion con biotina RayBio se resumen a continuacion en la Tabla 9.

Tabla 9

Proteinas: (analisis densitometrico) relacion HLSC/MSC

quina: 6,11 2,06

a A: 6,54 2,16

a B: 5,42 2,18

Activina C

a RIA / ALK-2: 5,63 2,18

a RIB / ALK-4: 5,27 1,95

a RII A/B: 5,18 1,76

a RIIA: 5,28 1.71

a / Acrp30: 5,57 1,48

AgRP: 5,67 1,59

•I:::';: ;=• ALGAM ^-.1 i-&: -r 10';30'i ~ ! V ', miMmmmms

a: 9,40 2,38

yetina-1: 6,45 1,45

yetina-2: 5,92 1,48

yetrna-4: 5,62 1,40

Tipo Angiopoyetina 1: 5,76 1,36

Tipo Angiopoyetina 2: 6,51 1,51

Factor Tipo Angiopoyetina: 6,26 1,53

a: 6,90 1,66

APJ: 6,00 1,40

firegul ira): 6,34 1,47

APRIL: 7,03 1,47

a: 7,30 1,52

Axl: 8,83 1,70

B7-1 /CD30: 9.33 1,66

BAFFR^TNFRSMSC: 9,12 1,48

BCMA/TNFRSF17: 4,68 1,79

BD-1: 4.64 1,77

BDNF: 4,71 1.68

beta-C a Lenina: 4,23 1.61

beta-Defensina 2: 4.31 1,63

bela-NGF: 4,38 1,66

BIK: 4,56 1,73

BLC i BCA-11 CXCL13: 4,36 1,56

BMP-2: 4,25 1,50

BMP-3: 4,43 1,43

BMP-3b i GDF-10: 4,34 1,43

BMP-4: 4,60 1,41

BMP-5: 4,46 1,40

BMP-6: 4,47 1,34

BMP-7: 4,44 1,31

BMP-3: 4,87 1,31

BMP-15: 4,74 1,33

BMPR-IA i ALK-3: 5,30 1,49

bmpr-ib;alk-6: 6,35 1,69

BMPR-ll: 5.76 1,59

BTG: 5,71 1.61

Cardiotrofin-1 /CT -1: 5,89 1,61

CCL14 / HCC-1 ! HCC-3: 5,92 1,50

CCL28 / VIC: 6,67 1,57

CCR1: 7.76 1,42

CCR2: 9,00 1,63

CCR3: 3,21 1,49

: i is'&U k i\ ;; 1 :":$M IWit ll a x M v Si j* '■■]** ■. 1 v, S- := $ : y x*.K x -S*. •:

CCR5: 5,02 1.97

CCR6: 5,59 2,08

CCR7: 5,52 1,89

CCR3: 4.43 1,51

CCR9: 4,10 1.48

CD14: 4,21 1,55

CD27/TNFRSF7: 3,94 1.50

CD30! TNFRSF8: 3,70 1,38

LigandoCD30 / TNFSF8: 4,28 1,40

CD401TNFRSF5: 4,40 1,56

Uqando CD40 / TNFSF5 /CD154: 4,14 1,38

CD 163: 3,69 1,33

Cerberus 1: 3,66 1,29

Chem R23: 3,59 1.22

Tipo-Cordina 1: 3.62 1,14

Tipo-Gordina 2: 3J4 1,16

Csk: 5,97 1,51

CLC: 4,23 1,20

CNTF: 4,73 1,35

CNTF R a If a: 4.51 1,29

Factor de Coagulacion III / Factor de Tejido: 4.70 1,38

: - 8 QR - ! :'=• := f: =: : j:-5- :• Sf-fif 4P-.-4

Cripto-1: 5.26 1,50

CRTH-2: 5,11 1,44

Cripfico: 5,65 1,59

CTACK / GCL27: 6.33 1,66

CTGFlCCN2: 6,97 1,77

CTLA-4 /CD 152: 10,33 2,31

CV-2/ Sin interseccion venosa2: 7,80 1,61

CXCL14 / BRAK: 6.49 2,03

CXCL16: 4,64 1,67

CXCR1 / IL-B RA: 4,56 1,61

CXCR2/IL-SRB: 4,41 1,55

CXCR3: 4,01 1,56

CXCR4 (fusina): 3,85 1,44

CXCR5 /BLR-1: 3,84 1,41

CXCR6: 3,92 1,40

D6: 3,77 1,38

DAN: 4,02 1,36

DANCE: 3,78 1,38

DcR3 i TNFRSF6B: 3,62 1,28

k 11 ) ' H* w * 5 5: -U 6 CO Tl 113 W •*:■* S : *-:& $ $ =1

Dkk-1: 4,35 1,36

Dkk-3: 3,41 1,12

Dkk-4: 3,50 109

DR3 / TNFRSF25: 3,53 1,11

DR6 / TNFRSF21: 4,20 1.25

Dtk: 9,06 2,17


: : $ .ft ::::■ Q|ite ¥ " 4 ;

EDAR: 6.79 1,68

EDG-1: 4,43 125

EGF: 4,63 130

EGF R / ErbB1: 4,69 1,31

EG-VEGF t PK1: 5,03 1,34

EMAP4I: 6,15 1,75

ENA-78: 6,28 1,74

Enducan: 0.34 2,14

Endoglina /CD1Q5: 6,97 2,02

Endastatina: 6,59 1,53

en-rage: 5,09 2,04

Eotaxina/ CCL11: 4,52 1,77

Eotaxina-2 / MPIF-2: 4,27 147

Eotaxina-3/CCL26: 4,24 1,52

Epirregulina: 3,87 1,43

ErbB2: 3,90 1,43

ErbB3: 4,17 1,56

ErbB4: 3,82 1,34

Errtropoyetina: 4,16 1,26

E-Sel&ctina: 3,79 1,33

ndoteliira j'

FADD: 3,77 1,29

FAM3B: 6,05 1,76

Fas ITNFRSF6: 3,73 1,21

Liqando Fas: 3,61 1,11

FGF Basico: 3,67 1,08

FGF-BP: 3,78 1,16

FGFR3: 4,05 1.19

FGFR4: 4,72 1.29


: '.i-iZ.

FGF-4: 4,68 1.30

FGF-5: 4.05 1.13

FGF-6: 4,27 1,16

FGF-7 1 KGF: 4,93 1,22

fgf-g: 4,89 1,37

FGF-9: 5.40 1,49

FGF-10 t KGF-2: 5,74 1,56

FGF-11: 6,19 1,66

FGF-12: 8.68 1,98

FGF-131B: 7,74 1,60

FGF-16: 5,31 1,77 |

FGF-17: 3.91 1,37

FGF-18: 4,00 1,44

FGF-19: 3,88 1,37

FGF-20: 3,67 1,33

FGF-21: 3.88 1,42

FGF-23: 3,90 1,22

FLRG: 3,84 1,34

Ligando Flt-3: 3,69 1,32

Follistatina: 5,33 1,58

tipo-Folistatina 1: 5,81 1,15

Fractalquina: 3,94 1,28

Riz ado-1: 3,88 1,23

Riz ado-3: 3,80 1,18

Rizado^l: 3,78 1.21

Rizado-5: 4,52 1,36

Rizado-6: 5,46 1,62

Riz ado-7: 4,17 1,23

G a lectin a-3: 5,86 1,56

GASP-1 / WFIKKNRR: 5,03 1,44

GASP-2 j WFIKKN: 4,39 1,20

GCP-2 l CXCL6: 4,69 1,26

GCSF: 5,57 1,52

G-CSF R t CD 114: 4,68 1,26

GDF1: 5,00 1,28

GDF3: 6,38 1,77

GDF5: 6,55 1,74

GDF8: 6,08 1,53

GDF9: 10,31 2,25

GDF11: 8.84 1,70

GDF-15: 4.64 1,34

GDNF: 3,87 1,27

GFR affa-1: 3,67 1,25

GFR a [fa-2: 3,92 1,21

GFR a [fa-3: 4,09 1,39

GFR a [fa-4: 4.01 1,45

GITR / TNFRF18: 3,80 1,33

Ligando GITR /TNFSF18: 4,04 1,44

Glucagon: 3,89 1,31

Glun: 3,61 1,23

Glut2: 3,73 1,22

Glut3: 3,87 1,25

Gluts: 4,00 1,29

Glipicano 3: 7777 • 7 7 7 34,34 777>',& 77:

Glipicano 5: 5,27 1,48

GM-CSF: 4,20 1,24

alfa: 4,37 1,28

zima A: 4,92 1,41

GREMLIN: 8,49 2,19

•. gro7;: 7v.773,69. :7V .

GRO-a: 4,90 1,32

Hormona del Crecimiento: 5,17 1,34

Hormona del Crecimiento R: 5,42 1,36

HB-EGF: 5,37 1,46

HCC-4 / CCL16: 4,91 1,33

HCR / CRAM-A/B: 5,09 1,39

socina: 6,08 1,61

Heregulina a: 6,08 1,45

.: 7'7V 7' H. V-- 7*.: :V77:77.: Vk^i15,2^'7\7.&77;7 : 3;38: ;

HGFR: 6,53 1,31

alfa: 4,47 1,40

HRG-beta 1: 4,09 1,25

HVEM / TNFRSF14: 4,06 1,24

I-309: 3,67 1,25

I CAM-1: 3,49 1,25

I CAM-2: 3,28 1,16

I CAM-3 (CD50): 3,77 1,15

I CAM-5: 3,49 1,24

alfa: 3,50 1,19

alfa: 3,52 1,18

IFN-beta: 3,66 1,19

IFN-gamma: 3,67 1,17

IFN-gamma R1: 3,89 1,22

IGFBP-1: 4,95 1,39

IGFBP-2: 13,69 2,11

IGFBP-3: 6,11 1,66

IGFBP-4: 5,90 1,64

: ■-'1 IGFBP-6 : 7 (• s':' */: -.>sr:-27r76-'*'-f.::.'.. -J v : 4,59: ' .


: : = iGFBP-rpI / IGFBP-7 ;; ,7- 7 333,01 . ' •' ; ■ 7 .. 2,75


: V;;; : .^IGF^If :V777/7:f 7- : 13,74 v,:. ••' 7 3,15 :

IGF-I SR: 5,23 1,35

IGF-II: 4,76 1,26

IGF-I I R: 6,57 1,69

alfa: 9,12 2,26

IL-1 beta: 4,87 1,30

IL-1 F5/FIL1 delta: 5,25 1,42

e: 7,50 1,79

IL-1 F7 / FIL1 zeta: 5,73 1,37

IL-1 F8 / FIL1 eta: 5,91 1,25

IL-1 F9 / IL-1 H1: 6,37 1,24

IL-1 F10 / IL-1HY2: 4,26 1,19

IL-1 R3 / IL-1 R AcP: 4,11 1,25

IL-1 R4 /ST2: 4,29 1,33

IL-1 R6 / IL-1 Rrp2: 3,69 1,21

IL-1 R8: 3,32 1,13

IL-1 R9: 3,32 1,07

IL-1 ra: 3,36 1.11

IL-1 sRI: 3,29 1,09

IL-1 sRII: 3,25 1,03

IL-2: 3,53 1,12

alfa: 4,82 1,43

IL-2 R beta /CD122: 3,88 1,15

IL-2 R gamma: 4,07 1,17

IL-3: 4,34 1,26

alfa: 4,64 1,24

IL-4: 4,72 1,25

IL-4 R: 5,53 1,11

IL-5: 6,31 1,60

alfa: 16,15 2,21

IL-6: 35,23 1,46

IL-6 R: 6,41 1,51

IL-7: 6,01 1,51

alfa: 6,10 1,30

IL-8: 38,69 1,37

IL-9: 6,41 1,47

IL-10: 5,27 1,39

alfa: 5,42 1,36

IL-10 R beta: 5,54 1,38

IL-11: 5,71 1,20

IL-12 p40: 6,30 1,17

IL-12 p70: 4,14 1,22

IL-12 R beta 1: 3,44 1,08

IL-12 R beta 2: 8,52 1,70

IL-13: 3,81 1,11

alfa 1: 4,12 1,14

alfa 2: • 3,59 1,03

IL-15: 4,07 1,19

alfa: 4,37 1,19

IL-16: 4,16 1,17

IL-17: 4,13 1,18

• IL-17B: 4,59 1,17

IL-17B R: 4,89 1,16

IL-17C: 5,24 1,23

IL-17D: 5,18 1,24

IL-17E: 5,74 1,41

IL-17F: 5,96 1,40

IL-17R: 5,29 1,35

IL-17RC: 9,68 2,10

IL-17RD: 6,54 1,60

IL-18 BPa: 7,23 1,50

alfa: 5,76 1,44

IL-18 R beta /AcPL: 5,84 1,44

IL-19: 6,69 1,61

IL-20: 6,79 1,58

IL ' - 20 R alfa

IL-20 R beta: 7,48 1,34

IL-21: 3,14 0,98

IL-21 R: 3,18 0,95

IL-22: 3,34 0,91

IL-22 BP: 3,22 0,93

IL-22 R: 3,51 0,97

IL-23: 4,14 1,07

IL-23 R: 3,75 1,06

IL-24: 4,14 1,07

IL-26: 4,28 1,17

IL-27: 5,71 1,42

IL-28A: 9,23 2,20

IL-29: 5,31 1,18

IL-31: 4,89 1,23

IL-31 RA: 5,80 1,26

Inhibina: 5,19 1,31

Inhibina: 5,93 1,37

Insulina: 5,29 1,25

Insulina: 5,13 1,22

Insulisina: 7,60 1,78

IP-10: 5,86 1,36

l-TAC / CXCL11: 5,83 1,40

Quininostatina / Quininogeno: 7,18 1,75

Kremen-1: 6,35 1,54

' •': i Kreindn-2 I:’ 'y::- :-i' ■:' ,: i: ■Vi £0 00 OK :: <• -

Lck: 7,05 1,42

TGF-beta bp1 Latente 1: ^I28,04^:-.':1O: \11\ A,90, • ..

LBP: 4,34 1,23

LECT2: 3,38 1,00

Zurdo: 3,38 1,01

Leptina: 3,66 0,98

Leptina: 3,52 1,03

alfa: 3,75 1,05

LIF: 4,12 1,09

alfa: 4,43 1,02

LIGHT/TNFSF14: 4,34 1,09

Lipocalina-1: 4,58 1,14

LRP-1: 9,89 1,81

LRP-6: 29,80 2,28

L-Selectina: 5,94 1,51

Luciferasa: 5,29 1,25

Linfotactina: 8,21 1,50

Linfotoxina: 5,97 1,39

Linfotoxina: 5,61 1,30

MAC-1: 5,54 1,20

MCP-1: 22,87 1,84

MCP-2: 5,83 1,37

MCP-3: 6,96 1,65

MCP-4 / CCL13: 6,09 1,48

M-CSF: 6,90 1,65

M-CSF R: 7,02 1,62

MDC: 8,30 1,64

MFG-E8: 8,93 1,62

MFRP: 3,43 0,98

MIF: 3,73 1,02

MIG: 3,67 1,03

MIP-1a: 5,17 1,42

MIP-1b: 3,49 0,98

MIP-1d: 3,45 0,93

m * =vh: Av:■ '-13 ?4.5==':=Jr:V=^ =rJf/rsII 111!

alfa: 4,64 1,33

MIP-3 beta: 3,68 1,03

MMP-1: 5,06 1,20

MMP-2: 4,30 1,14

MMP-3: 4,08 0,75

MMP-7: 4,49 0,93

MMP-8: 4,80 1,15

MMP-9: 4,25 0,98

MMP-10: 6,05 1,44

Estromelisina: 5,23 1,22

MMP-12: 5,12 1,33

MMP-13: 5,75 1,40

MMP-14: 7,60 1,79

MMP-15: 5,71 1,39

MMP-16 / MT3-MMP: 7,86 1,80

MMP-19: 9,10 1,70

MMP-20: 8,06 1,68

MMP-24 / MT5-MMP: 6,44 1,48

MMP-25 / MT6-MMP: 6,20 1,36

Almizcle: 6,62 1,41

Cadena alfa: 6,85 1,40

cadena-beta: :?;VL:r-;1._6,76i:/:J:•=:-::

NAP-2: 9,61 1,71

NCAM-1 / CD56: 5,11 1,24

a: 4,04 1,06

NeuroDI: 3,86 1,07

a-2: 3,58 1,01

a: 3,58 0,94

NGF R: 3,63 1,03

NOV / CCN3: 3,58 1,13

Isoforma NRG1: 3,60 1,10

alfa alfa: 3,58 1,03

NRG1-beta1 /HRG1-beta1: 4,12 1,20

NRG2: 4,09 1,02

NRG3: 4,45 1,11

NT-3: 3,73 0,96

NT-4: 4,10 0,85

Orexina: 4,34 0,65

Orexina: 4,60 0,55

OSM: 4,89 0,69

Osteoactivina: 5,20 0,98

a: 8,16 1,73

Osteoprotegerina / TNFRSF11B: .i::.r.:-:.::;265,56l ^

Ligando OX40: 11,27 2,49

PARC / CCL18: 5,35 1,26

PD-ECGF: 5,31 1,20

alfa: 5,73 1,32

PDGF R beta: 6,80 1,49

PDGF-AA: 7,08 1,54

PDGF-AB: 6,91 1,52

PDGF-BB: 7,03 1,51

PDGF-C: 7,12 1,43

PDGF-D: 7,08 1,31

PECAM-1 /CD31: 4,21 1,18

Pentraxina 3 / TSG-14: 11,67 2,24

fin: 4,49 1,20

PF4 / CXCL4: 3,88 1,10

PIGF: 3,69 1,10

PLUNC: 3,72 1,17

Pref-1: 3,88 1,20

a: 4,96 1,52

a: 4,16 1,26

a: 3,86 1,10

RAGE: 3,93 1,06

RANK / TNFRSF11A: 4,43 1,17

RANTES: 3,86 1,05

RELM beta: 3,74 0,98

RELT /TNFRSF19L: 4,28 0,93

R0B04: 4,21 1,08

S100 A8/A9: 4,84 1,18

S100A10: 4,89 1,19

SAA: 5,14 1,23

SCF: 7,37 1,53

SCF R/CD117: 5,51 1,32

SDF-1 / CXCL12: 5,32 1,18

sFRP-1: 6,65 1,47

sFRP-3: 6,42 1,35

: :• :r % K:;; --69,46T.:.-. !5;43!!$i:|i;

: j sgp130: -if ' 15,48 | ■ ;;2,93,,:::

SIGIRR: 7,82 1,55

Siglec-5/CD170: 7,13 1,47

Siglec-9: 7,91 1,63

SLPI: 7,96 1,29

Smad 1: 4,78 1,23

Smad 4: 10,65 2,26

Smad 5: 4,59 1,15

Smad 7: 4,59 1,22

Smad 8: 3,92 1,09

Isoforma NRG1: 4,11 1,05

Soggy-1: 3,92 1,14

Eriao sonico: 3,77 1,10

■ .r^T^vyfcy.spARC^-: ..=v-£TiV'-Yi> 56,56 :<< v; : 3;63h :

a: 6,40 1,68

TACI / TNFRSF13B: 4,40 1,10

Tare: 3,85 1,07

TCCR / WSX-1: 3,80 1,00

TECK / CCL25: 3,79 0,98

TFPI: 5,18 1,22

alfa: 4,28 1,09

TGF-beta 1: 4,64 1,19

TGF-beta 2: 4,85 1,22

TGF-beta 3: 5,26 1,32

TGF-beta 5: 5,28 1,29

TGF-beta Rl / ALK-5: 6,94 1,51

TGF-beta Rll: 5,43 1,30

TGF-beta Rllb: 5,72 1,34

TGF-beta Rill: 6,70 1,53

Trombopoyetina (TPO): 7,40 0,94

Trombospodina (TSP)

Trombospodina - 1

Trombospodina - 2: 10,81 1,94

Trombospodina - 4: 7,96 1,57

Timopoyetina: 7,60 1,44

Tie-1: 4,03 0,88

Tie-2: 3,92 0,86

TIMP-1: 137,73 1,08

v'5 TIMP-2i j: :•.-7 i. ;• 1-54,09.•/

TIMP-3: 7,21 1,73

TIMP-4: 4,31 1,05

TL1A / TNFSF15: 4,70 1,14

TLR1: 4,81 1,21

TLR2: 5,77 1,36

TLR3: 4,47 1,06

TLR4: 4,16 1,01

TMEFF1 / Tomoregulin-1: 4,91 1,10

TMEFF2: 4,66 1,16

alfa: 5,07 1,26

TNF-beta: 5,36 1,26

TNF RI/TNFRSF1A: 8,08 1,77

TNF Rll / TNFRSF1B: 5,79 1,19

TRADD: 5,70 1,26

TRAIL /TNFSF10: 5,83 1,26

TRAIL R1 / DR4 / TNFRSF10A: 6,28 1,40

TRAIL R2 / DR5 / TNFRSF10B: 6,57 1,36

TRAIL R3/TNFRSF10C: 6,98 1,44

TRAIL R4/TNFRSF10D: 8,02 1,38

TRANCE: 9,17 1,53

TREM-1: 4,77 0,95

TROY / TNFRSF19: 5,21 1,04

TSG-6: 5,72 1,10

TSLP: 4,90 1,03

TWEAK / TNFSF12: 5,00 1,03

TWEAK R / TNFRSF12: 5,14 1,07

Ubiquitina: 4,92 1,03

uPA: 4,94 0,90

uPAR: 5,41 1,11

Vasorin: 6,12 1,27

VCAM-1 (CD106): 5,02 1,11

VE-Cadherina: 5,20 1,18

VEGF: 10,00 1,61

VEGF R2 (KDR): 5,73 1,25

VEGF R3: 5,48 1,19

VEGF-B: 5,24 1,15

VEGF-C: 7,98 1,60

VEGF-D: 6,11 1,18

VEGI / TNFSF15: 6,03 1,20

WIF-1: 6,07 1,21

WISP-1 / CCN4: 6,68 1,30

XEDAR: 7,81 1,46

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Con base en una relacion HLSC/MSC igual o superior a 2.5, se identified un total de 25 protelnas como aquellas que son las que mas probablemente proveen una contribucion a la actividad del CM. Tales protelnas estan resaltadas en la Tabla 9.

Ejemplo 6 - Comparacion de los efectos de tratamientos con CM de HLSCs y HLSCs sobre el modelo FHF in vivo Modelo in vivo de D-galactosamina/endotoxina de hepatitis letal toxica aguda.

Los mecanismos subyacentes a la accion hepatotoxica de la galactosamina se presentan debido a una alta acumulacion de derivados de UDP-galactosamina en el hlgado, llevando a la eliminacion del UTP hepatico. Como resultado cesa la bioslntesis de macromoleculas (ARN, protelnas, glicoprotelnas, glicogeno, etc.). Estas alteraciones llevan a un eventual dano celular y a muerte celular, los cuales en etapas posteriores de la reaccion pueden ser identificados por el incremento de las enzimas del hlgado en la sangre y por histologla. Al mismo tiempo, la endotoxina indujo la produccion de un factor de necrosis tumoral a (TNF-a) - que se desarrollo una apoptosis de hepatocitos masiva. Desarrollamos esto en un modelo in vivo en ratones SCID para estudiar la accion de HLSC en este sistema letal in vivo.

Metodos

Animales y protocolos experimentales. Se alojaron ratones SCID macho de 6 a 7 semanas de edad en instalaciones para animales con acceso libre a alimento y agua. A estos animales se aplico una inyeccion intraperitoneal de 500 pl de solucion salina que contenla 0.125 pg de LPS y 18 mg de GalN. Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 30 x 106 de HLSC despues de 2 horas de la inyeccion de D-GalN/LPS. Un segundo grupo de ratones SCID fue inoculado intraperitonealmente con 1 ml de sobrenadante de HLSC en solucion salina al mismo tiempo, 30 minutos y 2 horas despues de la inyeccion de LPS y GalN. Los ratones de control recibieron una inyeccion de una mezcla de LPS y GalN.

Produccion de sobrenadante a partir de HLSC en el matraz T: Para la generacion de CM a partir de HLSC (CM- HLSC), las celulas se dejaron crecer a 60% hasta 70% de confluencia (aproximadamente 2 x 106 de HLSC por matraz de 75 cm2), se lavaron exhaustivamente y se cultivaron en 10 mL de medio alfa-MEM libre de suero suplementado con 0.05% de albumina de suero humana (producida por GMP). El medio condicionado fue recolectado 24 horas despues y concentrado 25 veces utilizando unidades de ultrafiltracion (Millipore, Bedford, MA) con un corte de 3-kDa.

Analisis histologico: La necrosis del hlgado fue analizada a traves de tincion con H&E, proliferacion (tincion con PCNA) y TUNEL (celulas apoptoticas).

Transferencia Western: Se llevo a cabo Transferencia Western para la deteccion de BAX y BclXS/L. Los hlgados fueron homogeneizados y sometidos a lisis a 4°C durante 1 hora en regulador de lisis (Tris-HCl 50 mmol/L, pH 8.3, Triton X-100 al 1%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 10 pmol/L, leupeptina 10 pmol/L, y aprotinina 100 U/ml) y se centrifugaron a 15,000 g. El contenido de protelna de los CM fue medido por el metodo de Bradford. Las allcuotas que contenlan 200 pg de protelna de hlgados lisados fueron sometidas a electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras y electrotransferidas sobre filtros de membrana de nitrocelulosa. Las transferencias fueron bloqueadas con leche no grasa al 5% en Tris-HCl 20 mmol/L, pH 7.5, NaCl 500 mmol/L mas 0.1% de Tween (TBS-T). Las membranas fueron inmunotransferidas subsecuentemente durante la noche a 4°C con los anticuerpos primarios relevantes a la concentracion apropiada. Despues de lavados extensos con TBS-T, las transferencias fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios especlficos para el isotipo conjugados con peroxidasa, lavados con TBS-T, desarrollados con reactivos de deteccion de ECL durante 1 minuto, y expuestos a una pellcula X-Omat. Se usaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal anti-BAX y anticuerpo policlonal anti-BclXS/L de Santa Cruz Biotechnology.

Resultados

Para establecer posibles efectos beneficiosos de HLSC sobre la letalidad de ratones que recibieron endotoxina (LPS) y GalN, se llevaron a cabo estudios de supervivencia utilizando 6 ratones. El % de supervivencia de los animales inyectados con 0.125 pg de LPS y 18 mg de GalN y 30 x 106 HLSC fue de 75%. El % de supervivencia de los animales inyectados con 1 ml concentrado de sobrenadante de HLSC en solucion salina al mismo tiempo, 30 minutos y 2 horas despues de la inyeccion de LPS y 18 mg GalN fue de 70% (n=17). Los niveles en suero de alanina transaminasa (ALT) disminuyeron desde 273 U/L a 57 U/L y en suero de aspartato transaminasa (AST) disminuyeron de 1693 U/L a 291 U/L ambos despues de 7 dlas de inyeccion de HLSC. Los niveles de AST disminuyeron desde 1693 U/L a 1000 U/L ambos despues de 6 dlas de inyeccion de CM-HLSC.

El analisis histologico de secciones de hlgado despues de 7 dlas de inyeccion de HLSC mostro un Indice disminuido de apoptosis y necrosis.

El analisis histologico de secciones de hlgado despues de 3 y 6 dlas de tratamiento con sobrenadante mostro un Indice disminuido de apoptosis (TUNEL) y necrosis. Se observo una regeneracion masiva de tejido. Estos hallazgos se correlacionan con un incremento del Indice de proliferacion de tejido (tincion con PCNA). Por transferencia western se demostro que hubo una sobrerregulacion de la protelna proapoptotica BAX en animales tratados con 5 GalN/LPS junto con una subregulacion en el punto de tiempo diferente en ambos sobrenadantes concentrados. En el caso de la expresion de la protelna proapoptotica BclX/L se observo una sobrerregulacion de esta protelna en animales tratados con el sobrenadante concentrado y una subregulacion de la expresion en animales tratados con GalN/LPS solos.

Los resultados mencionados anteriormente se ilustran en las Figuras 11-13.

10 La figura 11a muestra la supervivencia de ratones en modelo letal LPS/GalN inyectados con HLSC (n=6).

La figura 11b muestra la supervivencia en ratones modelo letal LPS/GalN inyectado con HLSC concentrado (n=17).

La figura 12 muestra la tincion con H&E y PCNA de ratones SCID tratados GalN/LPS inyectados con CM concentrado a partir de HLSC purificadas de un matraz T despues de 3 y 6 dlas de induccion del fallo hepatico (GalN/LPS).

15 La figura 13 muestra los resultados del ensayo TUNEL para evaluar los hepatocitos apoptotico. La presencia de la protelna proapoptotica BAX y la protelna antiapoptotica BclX fue evaluada por el analisis de transferencia Western.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para producir de un medio condicionado, que comprende las etapas de:

(i) cultivar hepatocitos maduros humanos derivados de hlgado de adulto en un medio de cultivo celular hasta la muerte de hepatocitos maduros y seleccion de una poblacion de celulas supervivientes que tienen morfologla epitelioide;

(ii) expandir la poblacion de celulas supervivientes que tienen morfologla epitelioide cultivando en un medio de cultivo que contiene suero, que contiene glucosa suplementado con hEGF (factor de crecimiento epitelial humano) y bFGF (factor de crecimiento fibroblastos basico) y que contiene sales inorganicas, aminoacidos y vitaminas usuales necesarios para el crecimiento de celulas de mamlferos; y

(iii) separar las celulas del medio de cultivo celular.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde los hepatocitos maduros son congelados en un medio de cultivo que contiene suero en la presencia de un agente crioprotector y luego descongelados antes del cultivo de acuerdo con la etapa (i).
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde el medio de cultivo comprende alfa MEM suplementado con albumina humana grado GMP.
4. Un medio condicionado obtenible por el cultivo de una llnea de celulas progenitoras pluripotentes de hlgado humano, caracterizado porque esta libre de las celulas y caracterizado adicionalmente porque comprende una mezcla de al menos un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
5. La composition de medio condicionado de acuerdo con la reivindicacion 4, la cual es obtenible por el metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad farmaceuticamente efectiva del medio condicionado de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5.
7. Un composicion farmaceutica que comprende una cantidad farmaceuticamente efectiva de una mezcla de al menos un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a una concentration que varla de 10 a 400 ng/ml.
8. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde la mezcla comprende adicionalmente protelna estimulante de macrofago (MSP) en una cantidad farmaceuticamente activa.
9. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, en donde el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) esta a una concentracion que varla de 1 a 100 ng/ml, la interleucina 6 (IL-6) esta a una concentracion que varla de 10 a 200 ng/ml, la interleucina 8 (IL-8) esta a una concentracion igual a o superior a 35 ng/ml.
10. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, en donde la protelna estimulante de macrofago (MSP) esta a una concentracion que varla de 1 a 100 pg/ml.
11. Una composicion farmaceutica concentrada que consiste de la composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10 concentrada al menos 5 veces, preferiblemente al menos 10 veces, mas preferiblemente al menos 20 veces, aun mas preferiblemente al menos 25 veces.
12. Una composicion farmaceutica diluida consistente de la composicion farmaceutica de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10 diluida al menos 5 veces, preferiblemente al menos 10 veces, mas preferiblemente al menos 20 veces, incluso mas preferiblemente al menos 25 veces.
13. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 para uso en el tratamiento de lesion o fallo en un organo.
14. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde el organo es hlgado o rinon.
15. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, la cual se prepara como un medicamento adecuado para administrar una dosis de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que varla entre 0.01 a 1 mg/kg, una dosis de interleucina 6 (IL-6 ) que varla entre 0.01 a 1 mg/kg, una dosis de interleucina 8 (IL-8)

que varla entre 0.01 a 1 mg/kg y opcionalmente una dosis de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que varla entre 0.01 a 1 mg/kg.