ES2556635T3 - Formulaciones de compartimentos múltiples a base de moléculas o macromoléculas anfifílicas funcionales - Google Patents

Abstract

Formulación de compartimentos múltiples en forma de nanopartícula que tiene un diámetro medio de aproximadamente 1 a 200 nm formada por un núcleo sólido que contiene un agente terapéutico, rodeado por al menos dos capas lipídicas de polaridad diferente formadas a partir de moléculas o de macromoléculas anfifílicas funcionales, en la que cada capa lipídica está formada por al menos un compuesto anfifílico funcional de fórmula (I):**Fórmula** en la que: - X representa un átomo de oxígeno, de azufre o un grupo metileno, - B representa una base púrica o pirimídica tal como el uracilo, adenina, guanina, citosina, timina, hipoxantina, o sus derivados, o incluso una base heterocíclica mono o bicíclica no natural en la que cada ciclo comprende 4 a 7 eslabones, eventualmente sustituida; - L1 y L2, idénticos o diferentes, representan el hidrógeno, un grupo oxicarbonilo -O-C(O)-, un grupo tiocarbamato -OC( S)-NH-, un grupo carbonato -O-C(O)-O-, un grupo carbamato -O-C(O)-NH-, un átomo de oxígeno, un grupo fosfato, un grupo fosfonato o un grupo heteroarilo que comprende 1 a 4 átomos de nitrógeno, sustituido o no sustituido con una cadena hidrocarbonada, saturada o insaturada, lineal o ramificada de C2-C30, o también, L1 y L2, juntos, forman un grupo cetal de fórmula:**Fórmula** o también L1 o L2 representa hidrógeno, y el otro representa un grupo hidroxi o un grupo heteroarilo que comprende 1 a 4 átomos de nitrógeno, no sustituido o sustituido con una cadena alquilo lineal o ramificada de C2-C30: - R1 y R2, idénticos o diferentes, representan: - una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada de C2-C30, preferentemente C6-C25, principalmente C8-C25, saturada o parcialmente insaturada, eventualmente total o parcialmente fluorada, no sustituida o sustituida en el carbono del extremo de la cadena con un átomo de flúor o con un éster o un éter bencílico o naftílico, o - una cadena diacilo en la que cada cadena acilo de C2-C30, o - un grupo diacilglicerol, esfingosina o ceramida, o - cuando L1 o L2 representa hidrógeno, y el otro representa un grupo hidroxi o un grupo heteroarilo que comprende 1 a 4 átomos de nitrógeno, R1 y R2 no existen; - R3 representa: - un grupo hidroxi, amino, fosfato, fosfonato, fosfatidilcolina, O-alquil-fosfatidilcolina, tiofosfato, fosfonio, NH2-R4, NHR4R5 o NR4R5R6 en los que R4, R5 y R6, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o una cadena alquilo lineal o ramificada de C1-C5 o hidroxialquilo lineal o ramificado de C1-C5, o - una cadena alquilo lineal o ramificada de C2-C30 eventualmente sustituida con un grupo hidroxi, o - un resto ciclodextrina, o - un resto

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION

Formulaciones de compartimentos multiples a base de moleculas o macromoleculas anfifflicas funcionales

La invencion se refiere a nuevas formulaciones de compartimentos multiples a base de moleculas o macromoleculas anfifflicas funcionales segun la reivindicacion 1 para el transporte o la vectorizacion de al menos un agente terapeutico, en particular un agente antitumoral asf como su procedimiento de preparacion, y sus usos.

Entre los agentes antitumorales, el cisplatino es un agente antitumoral ampliamente utilizado, principalmente para el tratamiento de tumores solidos. Sin embargo, su utilizacion se encuentra limitada por su toxicidad asf como la aparicion de una resistencia adquirida.

Para paliar estos inconvenientes, se han propuesto diferentes formulaciones en la tecnica anterior: por ejemplo, la patente estadounidense 5178876 describe derivados de platino en forma de complejo hidrofobo destinados a una encapsulacion en liposomas.

La patente estadounidense 6001817 describe composiciones que contienen cisplatino y un vector que comprende al menos un nucleosido o desoxinucleosido.

La patente estadounidense 7908160 se refiere a derivados de cisplatino unidos a ligandos, cuya actividad es reversible en funcion del enlace al ligando.

La solicitud WO01/32139 describe composiciones de cisplatino encapsulado en nanopartfculas lipfdicas obtenidas por ciclos repetidos de calentamiento y congelacion, a base de lfpidos naturales cargados negativamente, en particular la dioleilfosfatidilserina. Se senala en esta solicitud que el cisplatino forma, en agua, agregados cargados positivamente que presentan una solubilidad mas elevada que las especies no cargadas, lo que permite su interaccion con las membranas lipfdicas cargadas negativamente y la reorganizacion de las membranas lipfdicas alrededor de los agregados de cisplatino.

La solicitud estadounidense US-A-2008/089836 describe nanopartfculas revestidas de una bicapa de moleculas formada a partir de:

(a) una capa de moleculas que une la superficie, en contacto directo con la nanopartfcula, que comprende:

(i) un motivo hidrofobo, y

(ii) un motivo de union que tiene una afinidad por la nanopartfcula y

(b) una capa de moleculas anfifflicas, en las que la capa (a) de moleculas que unen la superficie y la capa (b) de moleculas anfifflicas estan unidas por interacciones hidrofobas.

La solicitud WO-A-2009/098404 (mencionada a modo de estado de la tecnica con arreglo al artfculo 54(3) CBE) transmite un procedimiento de preparacion de nanopartfculas caracterizadas porque estan formadas por un nucleo rico en agente terapeutico, preferentemente un agente antitumoral, rodeado por una o varias capas lipfdicas formadas por un compuesto anfifflico funcional y su utilizacion para el transporte o la vectorizacion de agentes terapeuticos en particular de agente antitumoral.

Sin embargo, existe todavfa la necesidad de resolver los problemas ligados a la vectorizacion de los agentes terapeuticos, en particular los agentes antitumorales.

Principalmente, se investiga un medio que permita un transporte de los agentes terapeuticos (principalmente el cisplatino y/o sus derivados) rapidamente al interior de las celulas tumorales con una actividad farmacologica elevada, a la vez que preserva las celulas sanas, es decir reduciendo la toxicidad neurologica, renal, auditiva, digestiva, etc. limitando simultaneamente los fenomenos de aparicion de resistencia a este agente terapeutico.

Tambien se investiga el proporcionar un vector que presente una estabilidad en el tiempo suficiente para evitar la liberacion precoz del agente terapeutico y los inconvenientes ligados a la presencia del agente terapeutico libre en el medio biologico, principalmente en terminos de perdida de actividad y de toxicidad.

Por otra parte, la posibilidad de encapsular uno o varios agentes terapeuticos en una misma formulacion en diferentes compartimentos de una misma formulacion presenta el interes de permitir una liberacion simultanea o escalonada de este(os) agente(s) sobre un mismo blanco, pudiendo servir cada uno de los compartimentos de deposito.

Se ha encontrado ahora que formulaciones de compartimentos multiples, formadas a partir de moleculas o de macromoleculas anfifflicas funcionales, presentaban propiedades de estabilidad mejorada, en particular a 37°C, permitiendo una vectorizacion prolongada en el tiempo de dichos agentes terapeuticos y permitiendo la liberacion intracelular eficaz y rapida de agentes terapeuticos.

5

10

15

20

25

30

35

40

La invencion tiene por lo tanto como objetivo, segun un primer aspecto, una formulacion de compartimentos multiples en forma de nanoparflcula, que tiene un diametro medio de aproximadamente 1 a 200 nm formada por un nucleo solido que contiene un agente terapeutico, rodeado por al menos dos capas lip^dicas de polaridad diferente formadas a partir de moleculas o de macromoleculas anfifflicas funcionales, en la que cada capa lipidica esta formada por al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se define mas adelante.

Por "nanoparticula", se entiende una particula que tiene un diametro medio de aproximadamente 1 a 200 nm, preferentemente de 25 a 150 nm.

En la parte siguiente de la descripcion se entiende por "nanoparflcula segun la invencion" o "nanoparflcula de compartimentos multiples" una formulacion de compartimentos multiples en forma de nanoparflcula formada por un nucleo solido que contiene un agente terapeutico, rodeado por al menos dos capas lipidicas de polaridad diferente formadas a partir de moleculas o de macromoleculas anfifflicas funcionales, en la que cada capa lipidica esta formada por al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se define mas adelante.

Ventajosamente, cada capa lipidica constituye un compartimento susceptible de comprender un agente terapeutico identico o diferente al presente en el nucleo.

Segun un aspecto ventajoso, las formulaciones de compartimentos multiples segun la invencion se forman a partir de dichas capas lipidicas de polaridad diferente en presencia del o de los agente(s) terapeutico(s) y no a partir de una parflcula preformada, lo que permite una encapsulacion "a la carta" del principio activo en el o los compartimento(s) deseado(s), en funcion de la actividad deseada.

Esta estructura particular confiere a las nanoparflculas de compartimentos multiples segun la invencion una estabilidad (duracion de vida) compatible con la liberacion de un agente terapeutico, y permite su disgregacion despues de la liberacion de este agente terapeutico.

Preferentemente, la primera capa lipidica estara constituida por uno o varios flpido(s) anionico(s) y la segunda capa lipidica estara constituida por uno o varios flpido(s) cationico(s).

Por "de polaridad diferente", se entiende que cada capa lipidica sucesiva que rodea el nucleo esta formada por flpidos diferentes a la anterior y que cada capa tiene una carga de superficie global bien negativa (formada por flpidos anionicos), bien positiva (formada por flpidos cationicos), o bien neutra (formada por flpidos neutros). Por ejemplo, una primera capa lipidica puede estar formada por flpidos anionicos y llevara una carga de superficie negativa, mientras que la segunda capa lipidica puede estar formada por flpidos cationicos y llevara una carga de superficie positiva.

La carga de superficie de cada una de las capas se mide por su potencial zeta, por ejemplo, segun la tecnica descrita en Andrea Mayer et al. Toxicology, 2009, 258, 139-147 o K. Furusawa y K. Uchiyama, 1988, 140, 217-226.

Segun un aspecto ventajoso, las nanoparflculas de compartimentos multiples segun la invencion pueden comprender una alternancia de capas lipidicas anionicas y cationicas y una capa externa formada por uno o varios flpidos neutro(s).

Segun la invencion, cada capa lipidica esta formada por al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I):

imagen1

en la que:

• X representa un atomo de oxigeno, azufre o un grupo metileno,

• B representa una base purica o pirimidica tal como el uracilo, adenina, guanina, citosina, timina, hipoxantina, o sus derivados, o incluso una base heterodclica mono o bidclica no natural en la que cada ciclo comprende 4 a 7 eslabones, eventualmente sustituida;

• Li y L2, identicos o diferentes, representan el hidrogeno, un grupo oxicarbonilo -O-C(O)-, un grupo tiocarbamato -O-C(S)-NH-, un grupo carbonato -O-C(O)-O-, un grupo carbamato -O-C(O)-NH-, un atomo de oxigeno,

5

10

15

20

25

30

35

un grupo fosfato, un grupo fosfonato o un grupo heteroarilo que comprende 1 a 4 atomos de nitrogeno, sustituido o no sustituido con una cadena hidrocarbonada, saturada o insaturada, lineal o ramificada de C2-C30,

o tambien, Li y L2, juntos, forman un grupo cetal de formula:

imagen2

0 tambien Li o L2 representa hidrogeno, y el otro representa un grupo hidroxi o un grupo heteroarilo que comprende

1 a 4 atomos de nitrogeno, no sustituido o sustituido con una cadena alquilo lineal o ramificada de C2-C30:

• R1 y R2, identicos o diferentes, representan:

o una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada de C2-C30, preferentemente de C6-C25,

principalmente de C8-C25, saturada o parcialmente insaturada, eventualmente total o parcialmente fluorada, no sustituida o sustituida en el carbono del extremo de la cadena con un atomo de fluor o con un ester o un eter bencflico o naftflico, o

o una cadena diacilo en la que cada cadena acilo de C2-C30, o

o un grupo diacilglicerol, esfingosina o ceramida, o

o cuando Li o L2 representa hidrogeno, y el otro representa un grupo hidroxi o un grupo heteroarilo

que comprende 1 a 4 atomos de nitrogeno, R1 y R2 no existen;

• R3 representa:

o un grupo hidroxi, amino, fosfato, fosfonato, fosfatidilcolina, O-alquil-fosfatidilcolina, tiofosfato,

fosfonio, NH2-R4, NHR4R5 o NR4R5R6 en los que R4, R5 y R6, identicos o diferentes, representan un atomo de hidrogeno o una cadena alquilo lineal o ramificada de C1-C5 o hidroxialquilo lineal o ramificado de C1-C5, o

o una cadena alquilo lineal o ramificada de C2-C30 eventualmente sustituida con un grupo hidroxi, o

o un resto ciclodextrina, o

o un resto

r7

l

H -(-CH2-C-)n-H

I

co-v-

en el que V representa un enlace -O-,-S-, o -NH-, R7 representa H o CH3, y n= 1 a 500, o

o un grupo -(CH2)n-V-R8, en el que R8 representa un alquilo de C2-C30, y n=1 a 500, o

o un grupo heteroarilo que comprende 1 a 4 atomos de nitrogeno, no sustituido o sustituido con un

alquilo de C2-C30, o con un grupo (CH2)m-O-(CH2)p-R9 en el que m = 1 a 6 y p = 0 a 10 y R9 representa un grupo cetal

dclico que contiene 5 a 7 atomos de carbono, no sustituido o sustituido con al menos un alquilo lineal o ramificado de C2-C30 o con un resto esterol, o tambien

o R3 esta unido por enlace covalente a otro sustituyente R3, identico o diferente, de otro compuesto

de formula (I), identico o diferente, para formar un compuesto de formula (I) en forma de dimero,

y cada capa lipidica tiene una polaridad diferente de la de la anterior.

La carga de los compuestos de formula (I) esta determinada por los grupos polares que contienen, estando estos esencialmente presentes en o formados por los sustituyentes L1, L2 y/o R3.

Compuestos de formula (I) anionicos utilizables para preparar la primera capa lipidica pueden ser elegidos, por ejemplo, entre nucleolipidos anionicos tales como compuestos de formula (I) en la que L1, L2 y/o R3 representan un grupo cargado negativamente tal como, por ejemplo, un grupo fosfato, fosfonato, carboxilato, sulfato, etc., eventualmente sustituido.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Compuestos de formula (I) cationicos utilizables para preparar la primera capa lip^dica pueden ser elegidos, por ejemplo, entre nucleoUpidos cationicos tales como compuestos de formula (I) en la que Li, L2 y/o R3 representan un grupo cargado positivamente tal como, por ejemplo, un grupo amonio, fosfonio, imidazolio, etc., eventualmente sustituido.

La carga de estos grupos polares tambien puede variar en funcion del pKa de estos grupos, por ejemplo cuando se trata de un grupo amina, imidazol, fosfato, etc.

Por "agente terapeutico", se entiende, por ejemplo, una molecula natural o sintetica utilizada para la prevencion o el tratamiento de una patologfa o la restauracion de una funcion biologica, in vitro o in vivo, en particular en los animales, incluido el ser humano, o incluso en celulas aisladas, con excepcion de los acidos nucleicos o sus fragmentos.

Dicha molecula se puede elegir, por ejemplo, entre los principios activos de medicamentos, en particular entre los agentes antitumorales tales como, por ejemplo:

• los complejos de platino, entre los que se pueden citar principalmente el cisplatino, el carboplatino, el oxaliplatino, el nedaplatino, el lobaplatino, etc., o

• el rutenio capaz de unirse a complejos de platino, o incluso

• los complejos inorganicos sin platino a base de rutenio Il y/o III, de titanio, por ejemplo el dicloruro de titanoceno, o de galio, por ejemplo las sales de galio tales como el nitrato de galio, el cloruro de galio, el KP46, o

• los derivados de hierro, tales como, por ejemplo, las sales de ferroceno, los analogos nucleosfdicos que contienen hierro, los complejos de hierro (II) que contienen ligandos piridil-pentadentato, o

• los derivados del cobalto, tales como, por ejemplo, los complejos de hexacarbonil-dicobalto, los complejos de alquino-cobalto, el complejo de Co(III) que contienen un ligando de mostaza de nitrogeno, o

• los derivados de oro tales como, por ejemplo, el Auranofin, los complejos de oro (I), (III) y (III), aurotioglucosa, etc.

Ventajosamente, la formulacion de compartimentos multiples segun la invencion permite encapsular estas moleculas y asegurar su liberacion intracelular limitando los fenomenos de resistencia adquirida a estos compuestos.

Los complejos de platino, en particular el cisplatino, son agentes terapeuticos preferidos para los objetivos de la invencion.

Complejos inorganicos a base de rutenio II y/o III, pueden ser, por ejemplo, los complejos llamados NAMI-A, RAPTA- C, Kpl0l9. Tales complejos no platinados se describen en Ott I. y Gust R., Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2007, 340, 117-126 ; Reedijk J., Curr Opin Chem Biol., 1999, 3, 236-40 ; Haimei Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 173-186.

Analogos nucleosfdicos que contienen hierro se describen en Schlawe D. et al, Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 17311734.

De forma ventajosa, se ha encontrado que las estructuras moleculares y/o macromoleculares que forman los compuestos de formula (I), que comprenden al menos un ligando del agente terapeutico (nucleobase, nucleosido, nucleosido modificado, nucleotidos, oligonucleotido, heterociclo, etc.) representado por el sustituyente B, y que presenta un caracter anfifflico debido a la presencia de al menos una parte hidrofila (fosfato, carboxilato, etc.), y al menos una parte hidrofoba (segmentos hidrofobos monocatenarios, bicatenarios y partes polares derivadas de sintones de origen biologico, etc.), permitfan formar con el agente terapeutico nanopartfculas estables.

Por la combinacion de las propiedades anfifflicas de los compuestos de formula (I), de la presencia de ligandos del agente terapeutico (principio activo) en estos compuestos y de las eventuales interacciones electrostaticas entre los agentes terapeuticos y estos compuestos, las nanopartfculas asf obtenidas presentan una estructura que permite una liberacion intracelular eficaz y rapida de los principios activos encapsulados, en particular de los agentes antitumorales.

Sin pretender ligar la invencion a una teona, se puede emitir la hipotesis segun la cual las interacciones intermoleculares de los compuestos de formula (I) inducen un aumento de las fuerzas de cohesion en la superficie de las nanopartfculas, lo que se traduce en una estabilidad mayor en el tiempo, en las condiciones de utilizacion.

La estructura de compartimentos multiples de las nanopartfculas segun la invencion, a base de capas lipfdicas multiples que tienen una polaridad modulable, les confiere numerosas ventajas, en particular:

• una estabilidad mayor, principalmente en medio biologico,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

• la modulacion del potencial de superficie (potencial zeta) en funcion de su eficacia en la utilizacion prevista,

• su funcionalizacion (introduccion de una funcionalidad, agente de diana, etc.),

• la incorporacion de diferentes agentes terapeuticos.

Ventajosamente, dichas nanoparffculas presentan igualmente una duracion de vida compatible con su utilizacion como vector de agente terapeutico.

En la formula (I) anterior, n esta ventajosamente comprendido entre 1 y 500, preferentemente comprendido entre 1 y 100, principalmente comprendido entre 1 y 50, muy particularmente comprendido entre 1 y 10.

Por "alquilo lineal o ramificado C1-C5", se entiende por ejemplo un radical metilo, etilo, propilo, i-propilo, n-butilo, i- butilo, terc-butilo, preferentemente metilo o etilo.

Igualmente, en la formula (I) anterior, la base purica o piriirffdica, o la base heterodclica no natural se puede sustituir con al menos un sustituyente elegido, por ejemplo, entre un halogeno, un grupo amino, un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo carbonilamino, un grupo hidroxi, azido, ciano, alquilo, cicloalquilo, perfluoroalquilo, alquiloxi (por ejemplo, metoxi), oxicarbonilo, vinilo, etinilo, propinilo, acilo, etc.

Se entiende por "base heterodclica no natural" une base diferente al uracilo, adenina, guanina, citosina, timina o hipoxantina, que no existe en la naturaleza.

Por "grupo heteroarilo que contiene 1 a 4 atomos de nitrogeno", se entiende un grupo carbodclico monodclico o bidclico, aromatico o parcialmente insaturado, que contiene 5 a 12 atomos, interrumpido con 1 a 4 atomos de nitrogeno, en particular los grupos pirazol, triazol, tetrazol o imidazol.

Para la preparacion de los compuestos de formula (I), se puede hacer referencia a la solicitud WO 2005/116043, que describe diferentes vfas de acceso a este tipo de compuestos (vease principalmente p. 8-17 y ejemplos).

La invencion se refiere igualmente, segun un aspecto posterior, a un procedimiento de preparacion de una formulacion de compartimentos multiples en forma de nanoparffcula solida formada por un nucleo que contiene un agente terapeutico, rodeado por al menos dos capas lipfdicas de polaridad diferente formadas a partir de moleculas o macromoleculas anfifflicas funcionales tal como se ha definido en la reivindicacion 1, en la que cada capa lipfdica constituye un compartimento susceptible de comprender un agente terapeutico identico a o diferente del que esta presente en el nucleo, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar una mezcla de al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se ha definido anteriormente, y de un agente terapeutico,

b) someter dicha mezcla a ciclos repetidos de calentamiento y congelacion, de forma que se obtengan nanoparffculas que contienen dicho agente terapeutico, y

c) recuperar las nanoparffculas que contienen dicho agente terapeutico asf obtenidas,

d) poner dichas nanoparffculas en presencia de al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se ha definido anteriormente, que tenga una polaridad diferente al que se ha preparado en la etapa a), y

e) recuperar las nanoparffculas multi-compartimentos asf obtenidas.

Preferentemente, el agente terapeutico es un agente antitumoral, en particular un complejo de platino, en particular el cisplatino.

Ventajosamente, las etapas del procedimiento podran repetirse el numero de veces necesario para obtener el numero de capas lipfdicas deseado.

De forma opcional, se podffa realizar entre la etapa d) y la etapa e) una etapa suplementaria que consiste en la formacion de una capa lipfdica neutra formada por al menos una molecula o macromolecula anfifflica funcional, en particular un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se ha definido anteriormente, siendo dicha molecula o dicho compuesto de formula (I) neutro.

Segun un aspecto preferido, se utilizara en la etapa a) y/o la etapa d), como complemento del compuesto anfifflico funcional, al menos un co-lfpido.

Por "co-lfpido", se entiende un compuesto utilizado en asociacion con el compuesto de formula (I), que participa en la elaboracion de la estructura de la o de las capa(s) lipfdica(s) de la nanoparffcula.

Se utilizara, preferentemente, un co-lfpido de ion tffbrido.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Dicho cofflpido se puede elegir, por ejemplo, entre la dioleilfosfatidilcolina (DOPC), la dioleilfosfatidiluridina- fosfatidilcolina (DOUPC) o la dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE).

Estos compuestos pueden desempenar un papel de cofflpidos cuando se utilizan mezclados con un compuesto de formula (I). Alternativamente, pueden estar comprendidos en la formula (I), como por ejemplo, la dioleilfosfatidiluridina-fosfatidilcolina (DOUPC). En este caso, desempenaran, bien el papel de compuesto de formula (I), o bien, en combinacion con otro compuesto de formula (I), el papel de cofflpido.

Segun otro aspecto ventajoso, se introduce en la etapa d) un agente terapeutico identico o diferente al utilizado en la etapa a).

Preferentemente, el o los compuesto(s) anfifflico(s) funcional(es) de formula (I) utilizado(s) en la etapa a) es (son) anionico(s) y el o los compuesto(s) anfifflico(s) funcional(es) de formula (I) utilizado(s) en la etapa d) es (son) cationico(s).

Ventajosamente, se utilizara un compuesto anfifflico funcional de formula (I) neutro para formar la capa lipfdica mas externa, que se podra efectuar entre la etapa d) y la etapa e).

Mas particularmente, el procedimiento de preparacion de las formulaciones de compartimentos multiples puede comprender las etapas realizadas en las siguientes condiciones generales, que ilustran, por ejemplo, la obtencion de una formulacion de compartimentos multiples en forma de nanopartfcula formada por un nucleo solido que contiene un agente terapeutico, rodeado de dos capas lipfdicas de polaridad diferente formadas a partir de compuestos de formula (I):

1) Formacion de nanoparticulas segun la invencion que comprenden un nucleo rico en agente terapeutico y una primera capa lipidica

• se pone en disolucion un compuesto de formula (I) en un disolvente organico para formar una mezcla lipfdica, y luego el disolvente se evapora para formar una primera pelfcula lipfdica;

• paralelamente, la cantidad deseada de agente terapeutico, preferentemente un agente antitumoral, se pone en disolucion en agua destilada;

• la primera pelfcula lipfdica se rehidrata en la disolucion de agente terapeutico, preferentemente un agente antitumoral. Se obtiene una disolucion clara por sonicacion y calentamiento;

• la disolucion se enfna rapidamente, por ejemplo por inmersion en nitrogeno lfquido. Este ciclo calentamiento/enfriamiento se efectua preferentemente de 1 a 10 veces, en particular de 5 a 10 veces, principalmente 10 veces;

• despues de sonicacion y centrifugacion de la suspension obtenida, se separa el sobrenadante y el residuo se vuelve a poner en suspension;

• despues de centrifugacion, el residuo se separa y el sobrenadante se recupera.

2) Formacion de nanoparticulas segun la invencion que comprenden un nucleo rico en agente terapeutico y dos capas lipidicas de polaridad diferente

• se prepara una segunda pelfcula lipfdica a partir de un compuesto de formula (I) de polaridad diferente a la del compuesto de formula (I) utilizado en la primera parte del procedimiento;

• se rehidrata la segunda pelfcula lipfdica con el sobrenadante anteriormente recuperado,

• despues de sonicacion y centrifugacion de la suspension obtenida, se separa el sobrenadante y el residuo se vuelve a poner en suspension;

• despues de centrifugacion, el residuo se separa y el sobrenadante se recupera, conteniendo las nanoparticulas de compartimentos multiples que comprenden dos capas lipfdicas de polaridad diferente.

Ventajosamente, se repiten las etapas del procedimiento anterior el numero de veces necesario para obtener el numero de capas lipfdicas deseadas.

Preferentemente, el numero de capas lipfdicas estara comprendido entre 2 y 6.

De forma opcional, se podra efectuar durante la 2a parte del procedimiento, antes de la etapa final, una etapa suplementaria que consiste en la formacion de una capa lipfdica formada por al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se ha definido anteriormente, siendo dicho compuesto de formula (I) neutro, permitiendo la recuperacion de las nanoparticulas de compartimentos multiples segun la invencion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Segun un aspecto preferido, se utilizara durante la formacion de la mezcla lip^dica en la primera parte de la preparacion descrita anteriormente, o en su segunda parte, como complemento del compuesto de formula (I), al menos un co-Kpido, tal como se ha definido anteriormente.

Formulaciones preferidas segun la invencion son aquellas en las que la primera capa lipfdica es anionica y la segunda capa lipfdica es cationica.

El disolvente organico se puede elegir, por ejemplo, entre los disolventes organicos habituales en este campo, tales como el cloroformo o el diclorometano, un alcohol tal como el metanol o el etanol, etc.

El calentamiento se efectua, preferentemente, a una temperatura del orden de 20°C a 80°C, y el enfriamiento a una temperatura del orden de -190°C (nitrogeno lfquido) a 0°C (hielo). Un ciclo calentamiento/enfriamiento apropiado puede, por ejemplo, ser de 45°C para el calentamiento y de -78°C para el enfriamiento.

Preferentemente, el agente terapeutico se elige entre los complejos de platino (cisplatino, carboplatino, ...), siendo el cisplatino particularmente preferido, o bien el rutenio capaz de unirse a complejos de platino, o incluso los complejos inorganicos sin platino a base de rutenio II o III, de titanio, de galio, de cobalto, de hierro o de oro mencionados anteriormente.

La relacion molar R del compuesto de formula (I)/agente terapeutico puede estar comprendida, por ejemplo, entre 0,01 a 50, en particular R = 0,2.

Las nanopartfculas obtenidas se pueden extruir eventualmente con un filtro de policarbonato que tenga, por ejemplo, un diametro de poros del orden de 100 o 200 nm.

Se obtienen asf nanopartfculas de compartimentos multiples que estan formadas por un nucleo solido rico en agente terapeutico (principio activo) rodeado por al menos dos capas lipfdicas de polaridad diferente formadas por el compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se ha definido anteriormente, con o sin co-lfpido.

Segun un aspecto del procedimiento, dicha mezcla lipfdica contiene unicamente al menos un compuesto de formula (I) y no contiene co-lfpido.

Se utilizara preferentemente el agente terapeutico a una concentracion del orden de 0,1 ng/mL a 10 mg/mL en la fase acuosa, de forma que la liberacion intracelular del principio activo sea importante.

Compuestos preferidos de formula (I) utilizables para formar una capa lipfdica son aquellos en los que X representa el oxfgeno.

Los compuestos de formula (I) en los que B representa la timina o la adenida son igualmente compuestos preferidos.

Los compuestos de formula (I) en la que Li, L2 y/o R3 representan un grupo cargado negativamente tal como, por ejemplo, un grupo fosfato, fosfonato, carboxilato, sulfato, etc., eventualmente sustituidos, son compuestos preferidos para obtener una capa lipfdica anionica.

Los compuestos de formula (I) en la que L1, L2 y/o R3 representan un grupo cargado positivamente tal como, por ejemplo, un grupo amonio, fosfonio, imidazolio, etc., eventualmente sustituidos, son compuestos preferidos para obtener una capa lipfdica cationica.

Segun un aspecto preferido, la invencion se refiere a nanopartfculas de compartimentos multiples tal como se han definido anteriormente que comprenden estos compuestos de formula (I) y un agente terapeutico, en particular un agente antitumoral, en particular los complejos de platino (tales como, por ejemplo, el cisplatino, el carboplatino, el oxaliplatino, el nedaplatino, el lobaplatino), o el rutenio capaz de unirse a complejos de platino, o incluso complejos inorganicos sin platino a base de rutenio, titanio, galio, cobalto, hierro u oro mencionados anteriormente. El cisplatino es un agente antitumoral preferido para los fines de la invencion.

Los compuestos de formula (I) tambien pueden comprender derivados de base purica o piriirndica que tengan una actividad antineoplasica, tales, como por ejemplo, la ara-citosina (AraC), el 5-fluorouracilo (5-FU), la iododesoxiuridina (IdU), la 2'-desoxi-2'-metilidencitidina (DMDC) o la 5-cloro-6-azido-5,6-dihidro-2'-desoxiuridina.

La invencion tiene tambien como objetivo la utilizacion de las nanopartfculas de compartimentos multiples descritos anteriormente, como agentes para el transporte o la vectorizacion de agentes terapeuticos, en particular de agentes antitumorales.

En particular, la invencion se refiere a la utilizacion de las nanopartfculas de compartimentos multiples descritas anteriormente, como agentes para la liberacion intracelular de agentes terapeuticos, en particular de agentes antitumorales.

La invencion se refiere tambien a la utilizacion de las nanopartfculas de compartimentos multiples descritas anteriormente, para la preparacion de medicamentos antitumorales.

5

10

15

20

25

30

35

40

La invention se refiere tambien a las nanopartmulas de compartimentos multiples descritas anteriormente, para el tratamiento de enfermedades tumorales, en particular de canceres, tales como, por ejemplo, los canceres de ovario, de testiculo, de colon, del cuello del utero, del pulmon, o el adenosarcoma, etc.

Dichas nanopartmulas de compartimentos multiples son susceptibles de ser obtenidas mediante el procedimiento descrito anteriormente.

La invencion se refiere tambien a las composiciones farmaceuticas que comprenden formulaciones de compartimentos multiples en forma de nanopartmula formada por un nucleo solido que contiene un agente terapeutico, rodeado por al menos dos capas lipidicas de polaridad diferente formadas a partir de moleculas o macromoleculas anfifflicas funcionales (o nanopartmulas de compartimentos multiples), tal como se han descrito anteriormente, y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

La invencion se ilustra mediante los ejemplos siguientes.

El conjunto de los productos de partida proceden de proveedores de productos qmmicos (Aldrich, Alfa Aesar y Avanti Polar Lipid) y son utilizados sin purification posterior. Los disolventes se han utilizado sin destilacion suplementaria. Los compuestos sintetizados se han caracterizado mediante la ayuda de metodos analrticos espectroscopicos estandar tales como RMN 1H a 300,13 MHz, 13C a 75,46 mHz y 31P a 121,49 MHz) y espectroscopia de masas (Caracteristicas). Los desplazamientos qmmicos (5) en RMN se expresan en ppm y con respecto al TMS. Las constantes de acoplamiento J en RMN del 1H se expresan en Hz. Se han utilizado placas Merck RP-18 F254s para la cromatografia en capa fina (CCM). Se ha utilizado sflice SEPHADEX LH-20 (25-10o ^m) para las purificaciones mediante cromatografias cuantitativas.

Los ejemplos siguientes, titulados "Preparation" describen la preparation de intermedios de smtesis utilizados para preparar los compuestos de formula (I). La preparacion de los compuestos de formula (I) y el estudio de las nanopartmulas segun la invencion se describen a continuation en los ejemplos de smtesis y los ensayos titulados "Ejemplo".

Preparacion 1

5'- paratoluensulfoniltimidina

imagen3

En un matraz de dos bocas en atmosfera de nitrogeno anhidro, se introducen 2 g de timidina (8,26 mmol) en disolucion 0,1 M en piridina anhidra. La disolucion se enfria entonces a 0°C y se anaden 3,935 g de cloruro de acido paratoluenosulfonico (2,5 equivalentes, 20,6 mmol) en pequenas fracciones. Se deja que el medio de reaction vuelva a temperatura ambiente y luego se agita durante 10 horas. La reaccion se detiene entonces por adicion de 10 mL de metanol, manteniendo la agitation durante 30 min. Se anaden a la mezcla 50 mL de CH2Cl2 y luego se lava sucesivamente con 20 mL de una disolucion al 5% de NaHCO3, 20 mL de una disolucion saturada de NaCl y 20 mL de una disolucion al 5% de NaHCO3. El disolvente se elimina a presion reducida. El compuesto esperado se obtiene puro mediante recristalizacion en metanol.

RF: 0,47 (AcOEt/MeOH 9/1)

Rendimiento: 75 %

RMN 1H (300,13 MHz, DMSO da): 5 1,77 (s, 3H, CH3), 5 2,11 (m, 2H, CH2), 5 2,42 (s, 3H, CH3), 5 3,52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 5 4,18 (m, 1H, CH), 5 4,25 (m, 3H, CH, CH2), 5 5,42 (s, 1H, OH), 5 6,15 (t, j = 6 Hz, H, CH), 5 7,38 (s, 1 H, CH), 5 7,46 (s, 1 H, CH), 5 7,49 (s, 1 H, CH), 5 7,78 (s, 1H, CH), 5 7,81 (s, 1 H, CH), 5 11,28 (s, 1 H, NH).

RMN 13C (75,47 MHz, DMSO d6): 5 12,5 (CHs),5 21,6 (CH3), 5 38,9 (CH2), 5 70,4 (CH2), 5 70,6 (CH),5 83,7 (CH), 5 84,5 (CH), 5 110,3 (C), 5 128,1 (CH ar), 5 130,6 (2 CH ar), 5 132,6 (C ar), 5 136,4 (C ar), 5 145,6 (C), 5 150,8 (C=O), 5 164,1 (C=O).

EM Alta [M+H]+: 397,1

5

10

15

20

25

Preparation 2

2'-desoxi-5'-toluenosulfoniladenosina

imagen4

En un matraz de dos bocas en atmosfera de nitrogeno anhidro, se introducen 2 g de 2'-desoxiadenosina (8 mmol) en disolucion 0,1 M en piridina anhidra. La disolucion se enfria entonces a 0°C y se anaden 3,793 g de cloruro de acido paratolueno sulfonico (2,5 equivalentes, 20 mmol) en pequenas fracciones. Se deja que el medio de reaction vuelva a temperatura ambiente y luego se agita durante 10 horas. La reaccion se detiene entonces por adicion de 10 mL de metanol, manteniendo la agitation durante 30 min. Se anaden a la mezcla 50 mL de CH2Q2 y luego se lava sucesivamente con 20 mL de una disolucion al 5% de NaHCO3, 20 mL de una disolucion saturada de NaCl y 20 mL de una disolucion al 5% de NaHCO3. El disolvente se elimina a presion reducida. El compuesto esperado se obtiene puro mediante recristalizacion en metanol. Se aislan asi 2,1 g de un producto blanco.

RF: 0,37 (AcOEt/MeOH 9/1)

Rendimiento: 63%

Preparacion 3

5'azido-5'-desoxitimidina

imagen5

En un matraz de dos bocas provisto de un refrigerante y en atmosfera de nitrogeno anhidro, se introducen 2 g de 5'- paratoluenosulfoniltimidina (5 mmol) tal como se ha descrito en la preparacion 1 en disolucion 0,1M en DMF. Se anaden 1,3 g de aziduro de sodio (4 equivalentes, 20 mmol). Se agita entonces la disolucion y se calienta a 110°C durante 10 h. La mezcla se enfria a temperatura ambiente. Se anaden a la mezcla 50 mL de CH2Q2 y luego se lava sucesivamente 2 veces con 15 mL de agua y luego con 15 mL de una disolucion acuosa saturada de NaCl. La fase organica se seca sobre sulfato de sodio y luego el disolvente se elimina a presion reducida. El compuesto esperado se obtiene puro mediante recristalizacion en metanol. Se obtienen asi 0,8 g de un solido blanco.

RF: 0,47 (AcOEt/MeOH 9/1)

Rendimiento: 60%

EM [M+H]+: 268.1

Preparacion 4

5'-azido-5',2'-didesoxiadenosina

imagen6

En un matraz de dos bocas provisto de un refrigerante y en atmosfera de nitrogeno anhidro, se introducen 2 g de 2'- desoxi-5'-paratoluenosulfoniladenosina tal como se ha descrito en la preparation 2 (5 mmol) en disolucion 0,1M en DMF. Se anaden 1,3 g de aziduro de sodio (4 equivalentes, 20 mmol). Se agita entonces la disolucion y se caliente a 110°C durante 10 h. La mezcla se enfria a temperatura ambiente. Se anaden a la mezcla 50 mL de Ch2CI2 y luego 5 se lava sucesivamente 2 veces con 15 mL de agua y luego con 15 mL de una disolucion acuosa saturada de NaCl. La fase organica se seca sobre sulfato de sodio y luego el disolvente se elimina a presion reducida. El compuesto esperado se obtiene puro mediante recristalizacion en metanol. Se obtienen asi 0,8 g de un solido blanco.

RF: 0,37 (AcOEt/MeOH 9/1)

Rendimiento: 60%

10 EM Alta resolution [M+H]+: masa calculada: 277,1161, masa medida: 277,1157 Preparacion 5 1 -propargiloxioctadecano

imagen7

En un matraz limpio y seco, en atmosfera de nitrogeno anhidro, se introducen 673 mg de alcohol propargflico (12 15 mmol) en disolucion 0,5M en DMF. La disolucion se enfria entonces a 0°C y se anaden 180 mg de hidruro de sodio (0,625 equivalentes, 7,5 mmol) en pequenas fracciones. El medio de reaction se deja volver a temperatura ambiente. Se anaden 2 g de 1-bromo-octadecano (0,5 equivalentes, 6 mmol). La agitation se mantiene durante 5 horas. La reaccion se detiene entonces por adicion de 10 mL de metanol y la agitacion se mantiene durante 30 min. Se anaden a la mezcla 50 mL de CH2Q2 y luego se lava sucesivamente 2 veces con 20 mL y luego con 20 mL de 20 una disolucion saturada de NaCl. La fase organica se seca entonces sobre Na2SO4 y luego el disolvente se elimina a presion reducida. El compuesto esperado se obtiene puro despues de separation en columna cromatografica (hexano). Se aislan asi 1,2 g de un producto blanco.

RF: 0,82 (Hexano)

Rendimiento: 65%

25 RMN 1H (300,13 MHz, CDCls) : 5 0,90 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 5 1,28 (s, 30H, CH2), 5 1,61 (m, 2H, CH2),5 2,43 (t, j = 3 Hz, 1H, CH), 5 3,53 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 5 4.15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH2).

RMN 13C (75,47 MHz, CDCls) : RMN 13C (75,47 MHz, CDCls) : 5 14,2 (CH2), 5 22,7 (CH2),5 26,1 (CH2),5 29,4 (CH2),5 29,5 (CH2), 5 29,6 (CH2), 5 32,0 (CH2), 5 58,0 (CH2), 5 70,4 (CH2), 5 74,1 (CH), 5 80,1 (C).

Preparacion 6

30 1,12-propargiloxidodecano 12-propargiloxidodecan-1 -ol

En un matraz limpio y seco, en atmosfera de nitrogeno anhidro, se introduce 1 g de dodecan-1,12-diol (5 mmol) en disolucion 0,5M en DMF. La disolucion se enfria entonces a 0°C y se anaden 360 mg de hidruro de hidrogeno (3 equivalentes, 15 mmol) en pequenas fracciones. El medio de reaccion se deja volver a temperatura ambiente. Se 35 anaden 1.49 g de bromuro de propargilo (2,5 equivalentes, 12,5 mmol). La agitacion se mantiene durante 5 horas. La reaccion se detiene entonces por adicion de 10 mL de metanol, manteniendo la agitacion durante 30 min. Se anaden a la mezcla 50 mL de CH2Cl2 y luego se lava sucesivamente 2 veces con 20 mL y luego con 20 mL de una disolucion saturada de NaCl. La fase organica se seca entonces sobre Na2SO4 y luego el disolvente se elimina a presion reducida. Los productos obtenidos se separan entonces en columna cromatografica (Hex/ActEth 9/1). Dos 40 productos se aislan, es decir 370 mg de un aceite pardo correspondiente al 1,12-propargiloxidodecano y 430 mg de un solido pardo correspondiente al 12-propargiloxidodecan-1-ol.

1,12-propargiloxidodecano

imagen8

RF: 0,53 (Hexano/AcOtEt 9/1) 45 Rendimiento: 27%

RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 5 1,31 (m, 16H, CH2), 5 1,61 (m, 4H, CH2), 5 2,43 (t, j = 3 Hz, 1H, CH), 5 3,52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 5 4,15 (d, j = 3 Hz, 4H, CH2).

RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3) : 5 26,1 (CH2), 5 29,4 (CH2), 5 29,5 (CH2), 5 29,6 (CH2), 5 58,0 (CH2), 5 70,3 (CH2), 5 74,1 (CH), 5 80,1 (C).

5 12-propargiloxidodecan-1-ol

imagen9

RF: 0,10 (Hexano/AcOtEt 9/1)

Rendimiento: 36%

RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 5 1,32 (m, 16H, CH2), 5 1,59 (m, 4H, CH2), 5 2,43 (t, j = 3 Hz, 2H, CH), 5 3,52 (t, j = 6 10 Hz, 2H, CH2), 5 3,65 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 5 4,15 (d, j = 3 Hz, 2H; CH2).

RMN 13C (75,47 MHz, CDCI3): 5 25,8 (CH2), 5 26,0 (CH2), 5 29,4 (2 CH2), 5 29,5 (2 CH2), 5 29,6 (CH2), 5 32,7 (CH2), 5 57,9 (CH2), 5 62,7 (CH2), 5 70,2 (CH2), 5 74,2 (CH), 5 79,9 (C).

Preparation 7

o-propargilcolesterol

15

imagen10

En un matraz limpio y seco, en atmosfera de nitrogeno anhidro, se introducen 500 g de colesterol (1,3 mmol) en disolucion 0,5M en DMF. La disolucion se enfria entonces a 0°C y se anaden 47 mg de hidruro de sodio (1,5 equivalentes, 2 mmol) en pequenas fracciones. Se deja volver el medio de reaction a temperatura ambiente y se anaden 238 mg de bromuro de propargilo (1,5 equivalentes, 2 mmol). La agitation se mantiene durante 5 horas. La

20 reaccion se detiene entonces por adicion de 10 mL de metanol y la agitacion se mantiene durante 30 min. Se anaden a la mezcla 50 mL de CH2Cl2 y luego se lava sucesivamente 2 veces con 20 mL y luego con 20 mL de una disolucion saturada de NaCl. La fase organica se seca entonces sobre Na2SO4 y luego el disolvente se elimina a presion reducida. El compuesto esperado se obtiene despues de purification en columna cromatografica (hexano /AcOEt 8/2). Se aislan asi 215 mg de un producto blanco.

25 RF: 0,83 (Hexano/AcOEt 8/2)

Rendimiento: 39%

Ejemplo 1

3'-(1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato) de timidina (di c14dT)

imagen11

5

10

15

20

25

30

35

5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxitimidina,3'-[(2-ciano-etil)-N,N-diisopropil)] fosforamidita (0,500 g, 1 eq, 0,67 mmol), 1,2-dimiristoil-sn-glicerol (0,447 g, 1,3 eq, 0,87 mmol) y una disolucion de tetrazol 0,45M en acetonitrilo (2 mL, 1,3 eq, 0,87 mmol), se disuelven en 4 mL de acetonitrilo anhidro en nitrogeno. El medio de reaccion se pone con agitacion magnetica a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla se oxida a continuacion por adicion de 43 mL de una disolucion de diiodo 0,02M en THF/Pyr/H2O. Despues de 12 h a temperatura ambiente, el disolvente se evapora a vado. Se disuelve el residuo en 8 mL de diclorometano. A continuacion, se anaden 0,2 mL de 1,5- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) (1,3 eq, 0,87 mmol) al medio de reaccion durante 5 h. El medio de reaccion se lava con una disolucion de HCl 0,1N y luego con una disolucion saturada de Na2S2O7. La fase organica se concentra a vado. El compuesto se obtiene despues de purificacion por cromatografia ultrarrapida (381 mg) utilizando un gradiente de elucion (MeOH/DCM 9:1 hasta 1:1).

Rendimiento: 69%

Rf: 0,34 (DCM/MeOH 9 :1)

RMN 1H (300 MHz, CDCI3): 5 en ppm 0,84 (t, 6H, J=6,92 Hz, 2*CH3), 1,21 (m, 40H, 20*CH2), 1,42 (dd, 4H, J1=8,45 Hz, J2=15,68 Hz, 2*CH2), 1,89 (s, 3H, Me), 2,30 (dd, 4H, J1=7,43 Hz, J2=15,92 Hz, 2*CH2), 2,83. (t, 2H, J=5,84, H2'), 3,84 (m, 1H, H3'), 4,09-4,35 (m, 7H, 2*CH2(glicerol), H4', H5'), 5,27 (s, 1H, CHglicerol), 6,22 (t, 1H, J=6,81 Hz, H1'), 7.61 (s, 1H, Hbase).

RMN 13C (75 MHz, CDCI3): 5 en ppm 19,29 (CHs), 23,71 (CH2), 26,57 (CH2), 28,73 (CH2), 32,76 (CH2), 37,85 (CH2), 48,90 (CH2), 166,15 (C=O).

RMN 31P (121 MHz, CDCI3): 5 en ppm 0,61.

Masa Alta Resolucion FAB- teorico m/z = 815,4823 observado m/z = 815,4794.

Ejemplo 2

3'-(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato) de timidina (di c16dT)

imagen12

5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxitimidina,3'-[(2-ciano-etil)-N,N-diisopropil)] fosforamidita (0,500 g, 1 eq, 0,67 mmol), 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol (0,496 g, 1,3 eq, 0,87 mmol/solubilizado en 3 mL de THF) y una disolucion de tetrazol 0,45M en acetonitrilo (2 mL, 1,3 eq, 0,87 mmol), se disuelven en 3 mL de acetonitrilo anhidro en nitrogeno. El medio de reaccion se pone con agitacion magnetica a temperatura ambiente y en nitrogeno durante 24 horas. La mezcla se oxida a continuacion por adicion de 43 mL de una disolucion de diiodo 0,02M en THF/Pyr/H2O. Despues de 12 h a temperatura ambiente, el disolvente se evapora a vado y se seca en bomba con P2O5 durante toda la noche. Se disuelve el residuo en 8 mL de diclorometano; A continuacion, se anaden 0,2 mL de 1,5-diazabiciclo[5.4.0]undec-7- eno (DBU) (1,3 eq, 0,87 mmol) al medio de reaccion durante 5 h. El medio de reaccion se lava con una disolucion de HCl 0,1N y luego con una disolucion saturada de Na2S2O3. La fase organica se concentra a vado. El compuesto se obtiene despues de purificacion por cromatografia ultrarrapida (180 mg) utilizando un gradiente de elucion (MeOH/DCM 98:2 hasta 1:1).

Rendimiento: 24%

Rf: 0,3 (DCM/MeOH 8:2)

RMN 1H (300 MHz, CDCI3): 5 en ppm 0,88 (t, 6H, J=6,9 Hz, 2*CH3), 1,25 (m, 48H, 24*CH2), 1,42 (dd, 4H, J1=8,4 Hz, J2=15,6 Hz, 2*CH2), 1,90 (s, 3H, Me), 2,33 (m, 4H, 2*CH2), 2,83 (t, 2H, J=5,6 Hz, H2'), 3,84 (m, 1H, H3'), 4,094,35 (m, 7H, 2*CH2(glicerol), H4', H5'), 5,27 (s, 1H, CH glicerol), 6,21 (t, 1H, J=6,7 Hz, H1'), 7,54 (s,1H, H base).

RMN 13C (75 MHz, CDCI3): 5 en ppm 12,4 (CH3 base), 14,1 (CH3 cadena), 19,6 (CH2), 19,7 (CH2), 22,6 (CH2), 24,8 (CH2), 29,1-29,6 (CH2), 31,9 (CH2), 33,9 (CH2), 34,1 (CH2), 61,5 (CH2), 61,7 (CH2), 62,5 (CH2), 62,6 (CH2), 66,1 (CH2), 66,2 (CH2), 69,1 (CH), 78,8 (CH), 85,5 (CH), 86,1 (CH), 111,3 (C base), 136,8 (CH base), 150,5 (C=O base), 164,1 (C=O base), 173,0 (C=O cadena), 173,5 (C=O cadena).

5 RMN 31P (121 MHz, CDCI3): 5 en ppm 2,1.

Masa ESI-: teorico m/z = 872,5 observado m/z = 871,3.

Ejemplo 3

5'-(4-hexadeciloximetil-[1,2,3]triazol-1-il)-5',2'didesoxitimidina

imagen13

10 En un matraz, se introducen 200 mg de 5'-azido-5'-desoxitimidina tal como se ha descrito en la preparation 3 (0,75 mmol) y 231 mg de 1-propargiloxioctadecano tal como se ha descrito en la preparacion 5 (1 equivalente) en disolucion 0,1M en una mezcla de THF y agua (1/1). Se anaden entonces, sucesivamente: 30 mg de ascorbato de sodio (0,2 equivalentes, 0,15 mmol) y 12 mg de sulfato de cobre (0,1 equivalentes, 0,075 mmol). El medio de reaction se agita y se calienta a 60°C durante 5 horas. La mezcla se enfria entonces a temperatura ambiente. El 15 medio de reaccion se absorbe inmediatamente sobre sflice y el disolvente se elimina por evaporation. Se obtienen 180 mg de un solido blanco despues de cromatografia en columna de sflice (AcOEt/MeOH 8/2).

RF: 0,72 (AcOEt/MeOH 8/2)

Rendimiento: 42%

EM Alta resolution [M+H]+: masa calculada: 576,4125, masa medida: 576,4120 20 Ejemplo 4

5'-(4-Hexadeciloximetil-[1,2,3]triazol-1 -il)-5',2'didesoxiadenosina

imagen14

En un matraz, se introducen 200 mg de 5'-azido-5',2'-didesoxiadenosina tal como se ha descrito en la preparacion 4 (0,72 mmol) y 223 mg de 1-propargiloxioctadecano tal como se ha descrito en la preparacion 5 (1 equivalente) en

25 disolucion 0,1M en una mezcla de THF y agua (1/1). Se anaden entonces, sucesivamente: 30 mg de ascorbato de sodio (0,2 equivalentes, 0,15 mmol) y 12 mg de sulfato de cobre (0,1 equivalentes, 0,075 mmol). El medio de reaccion se agita y se calienta a 60°C durante 5 horas y luego la mezcla se enfria a temperatura ambiente. El medio de reaccion se absorbe inmediatamente sobre sflice y el disolvente se elimina por evaporacion. Se obtienen 150 mg de un solido blanco despues de cromatografia en columna de sflice (AcOEt/MeOH 8/2).

30 RF: 0,65 (AcOEt/MeOH 8/2)

Rendimiento: 35%

5

10

15

20

25

RMN 1H (300,13 MHz, CDCI3) : 5 0,89 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), 5 1,26 (m, 30H, CH2), 5 1,55 (m, 2H, CH2), 5 2,54 (m, 1H, CH2), 5 3,06 (m, 1H, CH2), 5 3,45 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), 5 4,50 (m, 4H, CH2, CH), 5 4,89 (m, ???), 5 5,88 (s, 2H, NH2), 5 6,40 (t, j = 6 Hz, 1H, CH), 5 7,42 (s, 1H, CH), 5 7,81 (s, 1H, CH), 5 8,35 (s, 1H, CH).

EM Alta resolution [M+H]+: masa calculada: 585,4241, masa medida: 585,4254

Ejemplo 5

5'-(4-((O-colesteril)-metil)-[1,2,3]triazol-1-il)-5',2'didesoxitimidina

imagen15

En un matraz, se introducen 170 mg de 5'-azido-5'-desoxitimidina tal como se ha descrito en la preparation 3 (0,63 mmol) y 270 mg de o-propargilcolesterol tal como se ha descrito en la preparacion 7 (1 equivalente) en disolucion 0,1M en una mezcla de THF y agua (1/1). Se anaden, sucesivamente: 20 mg de ascorbato de sodio (0,2 equivalentes, 0,13 mmol) y 10 mg de sulfato de cobre (0,1 equivalentes, 0,063 mmol). El medio de reaction se agita y se calienta a 60°C durante 5 horas. La mezcla se enfria a temperatura ambiente. El medio de reaccion se absorbe inmediatamente sobre sflice y el disolvente se elimina por evaporation. El compuesto se obtiene puro por cromatografia en columna (AcOEt/MeOH 8/2). Se obtienen 260 mg de un solido blanco.

RF: 0,57 (AcOEt/MeOH 8/2)

Rendimiento: 59%

EM [M+H]+: 692,3

Ejemplo 6

1,12-bis-[5'-(4-(metil)-[1,2,3]triazol-1-il)-5',2'didesoxitimidina]-oxidodecano

imagen16

En un matraz, se introducen 100 mg de 5'-azido-5'-desoxitimidina tal como se ha descrito en la preparacion 3 (0,375 mmol) y 52 mg de 1,12-dipropargiloxidodecano preparado a partir del compuesto descrito en la preparacion 6 (0,5 equivalentes) en disolucion 0,1M en una mezcla de THF y agua (1/1). Se anade, sucesivamente: 15 mg de ascorbato de sodio (0,2 equivalentes, 0,075 mmol) y 6 mg de sulfato de cobre (0,1 equivalentes, 0,0375 mmol). El medio de reaccion se agita y se calienta a 60°C durante 5 horas. La mezcla se enfria entonces a temperatura ambiente. El medio de reaccion se absorbe inmediatamente sobre sflice y el disolvente se elimina por evaporacion.

El compuesto se obtiene puro por cromatografia en columna (AcOEt/MeOH 8/2). Se obtienen 90 mg de un solido blanco.

Rendimiento: 59%

RMN 1H (300,13 MHz, MeOH d4): 5 1,28 (m, 16H, CH2), 5 0,83 (m, 4H, CH2), 5 1,89 (s, 6H, CH3), 5 2,17 (s, 2H, 5 CH2), 5 2,25 (m, 4H, CH2), 5 3,51 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), 5 4,18 (m, 2H, CH) 5 4,42 (m, 2H, OH) 5 4,58 (s, 4H, CH2), 5

4,76 (qd, j = 6 Hz, 4H, CH2), 5 6,21 (t, j = 6 Hz, 2H, CH), 5 7,23 (s, 2H, CH), 5 7,99 (s, 2H, CH).

Ejemplo 7

5'-(4-(1(R)-hidroxi-hexil)-[1,2,3]triazol-1-il)-5',2'didesoxitimidina

imagen17

10 En un matraz, se introducen 215 mg de 5'-azido-5'-desoxitimidina tal como se ha descrito en la preparation 3 (0,8 mmol) y 101,5 mg de (R)-oct-1-in-3-ol (1 equivalente) en disolucion 0,1M en una mezcla de THF y agua (1/1). Se anaden, sucesivamente: 31,5 mg de ascorbato de sodio (0,2 equivalentes, 0,15 mmol) y 13 mg de sulfato de cobre (0,1 equivalentes, 0,075 mmol). El medio de reaction se agita y se calienta a 60°C durante 5 horas. La mezcla se enfria entonces a temperatura ambiente. El medio de reaccion se absorbe entonces inmediatamente sobre sflice y el 15 disolvente se elimina por evaporation. El compuesto se obtiene puro por cromatografia en columna (AcEt/MeOH 9/1). Se obtienen 240 mg de un solido blanco.

RF: 0,48 (AcEt/MeOH 9/1)

Rendimiento: 76%

EM Alta resolution [M+H]+: masa calculada: 576,4125, masa medida: 576,4120 20 Ejemplo 8

5'-(4-(1(S)-hidroxi-hexil)-[1,2,3]triazol-1-il)-5',2'didesoxitimidina

imagen18

En un matraz, se introducen 215 mg de 5'-azido-5'-desoxitimidina tal como se ha descrito en la preparacion 3 (0,8 mmol) y 101,5 mg de (S)-oct-1-in-3-ol (1 equivalente) en disolucion 0,1M en una mezcla de THF y agua (1/1). Se 25 anaden, sucesivamente: 31,5 mg de ascorbato de sodio (0,2 equivalentes, 0,15 mmol) y 13 mg de sulfato de cobre (0,1 equivalentes, 0,075 mmol). El medio de reaccion se agita y se calienta a 60°C durante 5 horas. La mezcla se enfria entonces a temperatura ambiente. El medio de reaccion se absorbe entonces inmediatamente sobre sflice y el disolvente se elimina por evaporacion. El compuesto se obtiene puro por cromatografia en columna (AcOEt/MeOH 85/15). Se obtienen 255 mg de un solido blanco.

30 RF: 0,48 (AcOEt/MeOH 85/15)

Rendimiento: 78%

EM Alta resolucion [M+H]+: masa calculada: 576,4125, masa medida: 576,4120

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 9

5'-(4-(1 -hidroxi-hexil)-[1,2,3]triazol-1 -il)-5',2'didesoxiadenosina

imagen19

En un matraz, se introducen 200 mg de 5'-azido-5'-desoxitimidina tal como se ha descrito en la preparation 3 (0,75 mmol) y 95 mg de la mezcla racemica de oct-1-in-3-ol (1 equivalente) en disolucion 0,1M en una mezcla de THF y agua (1/1). Se anaden, sucesivamente: 30 mg de ascorbato de sodio (0,2 equivalentes, 0,15 mmol) y 12 mg de sulfato de cobre (0,1 equivalentes, 0,075 mmol). El medio de reaction se agita y se calienta a 60°C durante 5 horas. La mezcla se enfria entonces a temperatura ambiente. El medio de reaccion se absorbe inmediatamente sobre sflice y el disolvente se elimina por evaporation. El compuesto se obtiene puro por cromatografia en columna (AcOEt/MeOH 8/2). Se obtienen 240 mg de un solido blanco.

RF: 0,47 (AcOEt/MeOH 8/2)

Rendimiento: 80%

EM Alta resolution [M+H]+: masa calculada: 576,4125, masa medida: 576,4120 Ejemplo 10: preparacion de las nanoparticulas de compartimentos multiples

Se utiliza como compuesto de formula (I) anionico el compuesto 3'-(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato) de timidina (di C16 dT) preparado en el ejemplo 2, como co-lipido la dioleilfosfatidilcolina (DOPC) y como compuestos de formula (I) cationica el compuesto tosilato de (N-[5'-(2',3'-dioleoil)uridina]-N',N',N'-trimetilamonio) (DOTAU) preparado tal como se describe en Pauline Chabaud et al., Bioconjugate Chem., 2006, 17, 466-472.

1) Preparacion de las disoluciones madre

a) Preparacion de la disolucion de cisplatino:

Se disuelven 15 mg de cisplatino en 10 mL de agua milliQ (concentration final: 5 mM). Esta suspension se agita durante 1 minuto (vortex), y luego se incuba a 37°C durante 24 h.

b) Preparacion de las disoluciones de Kpidos:

Disolucion A: se disuelven 20 mg del diC16dT en 2 mL de diclorometano (10 mg/mL). Esta muestra se almacena a -20°C.

Disolucion B: DOPC: disolucion de 20 mg/mL en diclorometano almacenada a -20°C.

Disolucion C: DOTAU: disolucion de 20 mg/mL en diclorometano almacenada a -20°C.

2) Preparacion de la formulacion lipidica para la primera capa

En un tubo Eppendorf® de 2 mL, se mezclan 52,3 ^L de la disolucion A con 47,2 ^L de la disolucion B. Estos volumenes corresponden a una relation de 1/1 de los dos lipidos en moles.

El diclorometano se evapora en nitrogeno de forma que se obtenga una pelicula lipidica homogenea.

3) Preparacion de las nanoparticulas (primera capa lip^dica anionica)

Se utilizan 1,2 mL de la disolucion de cisplatino preincubada a 37°C para rehidratar la pelicula lipidica previamente preparada. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante una noche. Se realiza una serie de 10 ciclos de calentamiento (bano maria a 55°C) y de congelation (nieve carbonica/metanol -72°C).

4) Lavado y recuperacion de las nanoparticulas que comprenden una primera capa lip^dica anionica

Una vez haya terminado la serie de 10 ciclos, la suspension se agita y se pone en un tubo de hemolisis de vidrio y luego se somete a sonicacion durante 7 minutos. Despues de sonicacion, la suspension se centrifuga a 10.000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

rpm/5min/20°C. El sobrenadante se tira y el residuo de las nanopartfculas se vuelve a poner en suspension en 1 mL de agua milliQ. Esta etapa se repite una segunda vez.

La suspension se centrifuga a 1.000 rpm/2,5min/20°C. El residuo se tira y el sobrenadante contiene las nanopartfculas anionicas.

El potencial zeta, medido segun la tecnica descrita en Andrea Mayer et al. Toxicology, 2009, 258, 139-147 o K. Furusawa y K. Uchiyama, 1988, 140, 217-226, es de -43,3 ± 6 mV.

5) Preparacion de las nanoparticulas que comprenden una primera capa lipidica anionica y una segunda capa lipidica cationica.

En un tupo Eppendorf® de 2 mL, se depositan 180 pL de la disolucion C. El diclorometano se evapora con nitrogeno comprimido de forma que se obtenga una pelfcula lipidica homogenea.

6) Lavado y recuperacion de las nanopartfculas de compartimentos multipes (capa de superficie cationica)

La pelfcula lipidica cationica se rehidrata con la suspension de las nanopartfculas anionicas preparada en la etapa 4).

Se realiza una agitacion con vortex durante 5 minutos seguida de sonicacion de un minuto.

La suspension se centrifuga a 10.000 rpm durante 5 minutos a 20 °C para eliminar los lfpidos no unidos a las nanopartfculas. El sobrenadante se elimina y luego el residuo se rehidrata con 1 mL de agua milliQ.

La suspension se centrifuga a 1.000 rpm/2,5min/20°C. El residuo se tira y el sobrenadante contiene las nanopartfculas multi-compartimentos de capa de superficie cationica.

El potencial zeta, medido como antes, es de 42,3 ± 8mV.

Ejemplo 11: ensayo de estabilidad (% de cisplatino liberado)

Las nanopartfculas preparadas segun el protocolo del ejemplo 10 se dosifican por ICP-optico (el valor medido corresponde a la concentracion total). La suspension de las nanopartfculas es alicuotada en 5 tubos Eppendorf® (150 pL). Estos ultimos se incuban a 37°C con agitacion (300 rpm) durante diferentes tiempos (0, 2,5, 5, 10 y 24 h).

Para un tiempo dado (x), el tubo se centrifuga a 14.000 rpm/10min/20°C y se dosifican 50 pL de sobrenadante (recuperado lentamente para no volver a poner el residuo en suspension).

Se preparan nanopartfculas a base de1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina] (DOPS) con 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DOPC) como co-lfpido segun el mismo protocolo a modo comparativo. Estas nanopartfculas comprenden una sola capa lipidica anionica.

El porcentaje de liberacion de cisplatino se calcula segun la siguiente ecuacion:

% de cisplatino liberado = Cx-C0/Ct-C0

Cx: concentracion encontrada a un tiempo dado (x).

C0: concentracion encontrada en el sobrenadante antes de incubacion.

Ct: concentracion total encontrada sin incubacion y sin centrifugacion.

La curva de liberacion del cisplatino en funcion del tiempo de incubacion se representa en la figura 1.

Las nanopartfculas que comprenden una sola capa lipidica anionica obtenidas al termino de la etapa 4 del ejemplo 10 (denominadas NP-) se representan por el sfmbolo -♦-, las nanopartfculas segun la invencion (denominadas NP+) que comprenden una primera capa lipidica anionica y una segunda capa lipidica cationica obtenidas al termino de la etapa 6 del ejemplo 10 se representan por el sfmbolo -■- y las nanopartfculas a base de DOPC/DOPS (denominadas PS) por el sfmbolo -▲Los resultados muestran que el tiempo de semivida (tiempo de incubacion necesario para liberar el 50% del cisplatino) es superior a 24 h para las nanopartfculas NP+ segun la invencion, mientras que para las nanopartfculas de base DOPC/DoPS es del orden de 6,5 h.

Ademas, despues del mismo tiempo de incubacion (6,5 h), se observa que las nanopartfculas NP- (monocapa) han liberado mas del 30% de su contenido en cisplatino, mientras que las nanopartfculas NP+ segun la invencion han liberado menos del 20% de cisplatino, lo que subraya las propiedades destacadas de estabilidad de las nanopartfculas NP+ a 37°C.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplo 12: ensayo de estabilidad (% de cisplatino liberado) en presencia de suero de feto de ternera

Las nanopartmulas preparadas segun el protocolo del ejemplo 10 se dosifican por ICP-optico (el valor medido corresponde a la concentracion total). La suspension de las nanopartmulas es alicuotada en 5 tubos Eppendorf® (150 pL). Estos ultimos se centrifugan a 10.000 rpm durante 5 min a 20°C. 50 pL del sobrenadante se dosifican por ICP optico y los 100 pL restantes se separan. El residuo que contiene las nanopartmulas se rehidrata con 150 pL de suero de feto de ternera (SVF, ref Invitrogen10270-106). Las muestras se incuban a 37°C con agitacion (300 rpm) durante diferentes tiempos (0, 2,5, 5, 10 y 24 h).

Para un tiempo dado (x), el tubo se centrifuga a 14.000 rpm/10min/20°C y se dosifican 50 pL de sobrenadante (recuperado lentamente para no volver a poner el residuo en suspension).

Se preparan nanopartmulas a base de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina] (DOPS) con 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DOPC) como co-lfpido segun el mismo protocolo a modo comparativo.

El porcentaje de liberacion de cisplatino se calcula segun la siguiente ecuacion:

% de cisplatino liberado = Cx-C0/Ct-C0

Cx: concentracion encontrada a un tiempo dado (x).

C0: concentracion encontrada en el sobrenadante antes de incubacion y antes de contacto con el SVF.

Ct: concentracion total encontrada sin incubacion y sin centrifugacion.

La curva de liberacion del cisplatino en funcion del tiempo de incubacion se representa en la figura 2.

Las nanopartmulas segun la invencion (denominadas NP+) que comprenden una primera capa lipfdica anionica y una segunda capa lipfdica cationica obtenidas en el ejemplo 10 se representan por el sfmbolo -■- y las nanopartmulas a base de DOPC/DOPS (denominadas PS) por el sfmbolo -▲Los resultados muestran que el tiempo de incubacion necesario para liberar el 90% del cisplatino es superior a 24 h para las nanopartmulas NP+ segun la invencion, mientras que para las nanopartmulas PS es inferior a 2 h.

Ejemplo 13: dosificacion del cisplatino intracelular Protocolo

Se tratan celulas IGROV1 (lmea de adenocarcinoma ovarico sensible al cisplatino) al 80% de confluencia (placa de 10 cm de diametro) con 100 pM de cisplatino libre o encapsulado en las nanopartmulas del ejemplo 10 durante 2, 4 o 6 h. Al final de este tratamiento se efectuan dos lavados con PBS. Las celulas se tratan con tripsina y se ponen en suspension en PBS. Se efectuan dos lavados de las suspensiones celulares con PBS (centrifugacion 1.000 rpm/1min). Las celulas se ponen en suspension en 1 mL de PBS y se cuentan.

Se procede de la misma manera con celulas SKV03 (lmea de adenocarcinoma ovarico resistente al cisplatino). Dosificacion por ICP-optico

106 celulas son lisadas con 500 pL de la disolucion de lisis celular (tampon de lisis de SIGMA). El volumen se completa con agua milliQ al 1% de acido HNO3 para alcanzar 5 mL.

Resultados

Los resultados se representan en la figura 3, que muestra la concentracion de cisplatino liberado despues de la lisis celular (expresado en nanomoles/10°celulas/100pM de tratamiento) en funcion del tiempo, correspondiente a la concentracion de cisplatino internalizado en las celulas tratadas.

Las columnas sombreadas verticalmente (a la izquierda), horizontalmente (centro) y punteadas (a la derecha) corresponden a un tratamiento de las celulas durante 2h, 4h y 6h respectivamente.

Los resultados muestran que la internalizacion de cisplatino es claramente mas eficaz en presencia de las nanopartmulas segun la invencion (denominadas NP+) que comprenden una primera capa lipfdica anionica y una segunda capa lipfdica cationica obtenidas en el ejemplo 10 que en el caso de las nanopartmulas PS y del cisplatino libre.

Por ejemplo, en condiciones identicas (106 celulas IGROV1, 100 pM, 2 h) 0,5 nanomoles de cisplatino se internalizan en el caso del cisplatino libre mientras que la internalizacion es 40 veces mayor (20 nanomoles) en el caso de las nanopartmulas NP+ segun la invencion (figura 3A).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Con respecto a la lmea celular resistente al cisplatino SKOV3, en condiciones identicas (106 celulas SKOV3, 1.00 pM, 2 h), la internacionalizacion es 60 veces mayor (30 nanomoles) en el caso de las nanoparticulas NP+ segun la invencion que para el cisplatino libre (0,5 nanomoles) (figura 3B).

Ejemplo 14: Estudio de los efectos citotoxicos de las nanoparticulas de compartimentos multiples sobre diferentes lrneas tumorales

Protocolo

a/ Preparacion y tratamiento de las celulas:

El estudio consiste en determinar la concentracion que inhibe el 50% de proliferacion celular 50 (CI50) en un panel de lineas tumorales, por ejemplo

• A2780 (Human ovarian carcinoma epithelial tumor) sensible al cisplatino y A2780/CisPt resistente al cisplatino (Human ovarian carcinoma epithelial tumor)

• IGROV-1 sensible al cisplatino (Human ovarian carcinoma) y IGROV-1/CisPt resistente al cisplatino (Human ovarian carcinoma)

• L1210 (mouse lymphocytic leukemia) sensible al cisplatino y L1210/CisPt (mouse lymphocytic leukemia) resistente al cisplatino (leucemia humana)

• NIH: OVCAR3 (carcinoma ovarico), y

• P388 (mouse lymphoma)

En una placa de 96 pozos, se incuban 2.500 celulas (lineas de adenocarcinomas ovaricos, etc.) por pozo en 100 pL del medio con suero. Despues de 24 h el medio se aspira y las celulas se tratan con cisplatino libre o encapsulado en las nanoparticulas del ejemplo 10 en 100 pL del medio sin suero a diferentes concentraciones (500, 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 pM). Despues de 24 h de tratamiento, el medio se retira y las celulas se lavan 2 veces con 100 pL de PBS y luego se incuban con 100 pL del medio con suero.

b/ Revelado de la toxicidad:

48 h despues de los dos lavados, la viabilidad celular se revela anadiendo 20 pL de MTS. La absorbancia a 490 nm se mide despues de 2 a 4 horas de incubacion a 37°C. La absorbancia es proporcional a la viabilidad celular.

c/ Resultados

Los resultados se representan en la figura 4, que muestra la concentracion necesaria para obtener 50% de muerte celular (CI50) con cisplatino libre (columna gris claro a la izquierda) o las nanoparticulas segun la invencion que comprenden una primera capa lipfdica anionica y una segunda capa lipfdica cationica obtenidas al terminar la etapa 6 del ejemplo 10 (denominadas Np+) que contienen cisplatino (columna gris oscuro a la derecha).

Los resultados muestran que las nanoparticulas segun la invencion son mas eficaces que el cisplatino libre en todas las lrneas celulares sensibles o resistentes al cisplatino.

Por ejemplo, para la lmea celular A2780 sensible al cisplatino, se obtiene el 50% de muerte celular con 0,23 pM de nanoparticulas segun la invencion mientras que hace falta utilizar 4,68 pM de cisplatino libre para obtener la misma mortalidad.

En la lmea A2780 resistente al cisplatino; se obtiene el 50% de muerte celular con 0,21 pM de nanoparticulas segun la invencion contra 29,21 pM de cisplatino libre. En este caso las nanoparticulas segun la invencion son respectivamente 18 y 140 veces mas eficaces que el cisplatino libre en las lrneas A2780 sensibles y A2780 resistentes.

Ejemplo 15: Estudio de los efectos citotoxicos de las nanoparticulas de compartimentos multiples sobre diferentes lineas tumorales IGROV-1 y SKOV3

Protocolo

a/ Preparacion y tratamiento de las celulas:

En una placa de 96 pozos, se incuban 2.500 celulas (IGROV1, SKOV3, lrneas de adenocarcinomas ovaricos) por pozo en 100 pL del medio con suero. Despues de 24 h el medio se aspira y las celulas se tratan con cisplatino libre o encapsulado en las nanoparticulas del ejemplo 10 en 100 pL del medio sin suero a diferentes concentraciones (500, 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 pM). Despues de 24 horas de tratamiento, el medio se retira y las celulas se lavan 2 veces con 100 pL de PBS y luego se incuban con 100 pL del medio con suero.

5

10

15

20

25

30

35

40

b/ Revelado de la toxicidad:

48 h despues de los dos lavados, la viabilidad celular se revela anadiendo 20 pL de MTS. La absorbancia a 490 nm se mide despues de 2 a 4 horas de incubacion a 37°C. La absorbancia es proporcional a la viabilidad celular.

c/ Resultados

Los resultados se representan en la figura 5, que muestra la concentracion necesaria para obtener 50% de muerte celular (CI50) con cisplatino libre (columna 1, izquierda), las nanopartmulas control a base de DOPC/DOPS (denominadas PS) (columna 2, centro izquierda), las nanopartmulas que comprenden una sola capa lipfdica anionica obtenidas al termino de la etapa 4 del ejemplo 10 (denominadas NP-) (columna 3, centro derecha) y las nanopartmulas segun la invencion (denominadas NP+) que comprenden una primera capa lipfdica anionica y una segunda capa lipidica cationica obtenidas al termino de la etapa 6 del ejemplo 10 (columna derecha).

La figura 5A se refiere a la lmea celular IGROV1 y la figura 5B se refiere a la lmea celular SKOV3.

Los resultados muestran que las nanopartmulas NP+ que contienen cisplatino segun la invencion son mas eficaces que el cisplatino libre en las dos lmeas celulares, IGROV1 (sensible al cisplatino) y SKOV3 (resistente al cisplatino).

En la lmea IGROV1, se obtiene un 50% de muerte celular con 0,18 pM de nanopartmulas que contienen cisplatino NP+ mientras que es necesario utilizar 2,41 pM de cisplatino libre para obtener este resultado. En la lmea SKOV3, se obtiene un 50% de muerte celular con 0,29 pM de nanopartmulas NP+ que contienen cisplatino contra 4,3 pM de cisplatino libre.

Las nanopartmulas que contienen cisplatino segun la invencion (NP+) son respectivamente 13 y 14 veces mas eficaces que el cisplatino libre en las lmeas IGROV1 y SKOV3 respectivamente.

Ejemplo 16: Demostracion de la estructura de compartimentos multiples de las nanoparticulas segun la invencion

Se han preparado formulaciones de nanoparticulas con diferentes marcadores, con el fin de estudiar, por una parte, la localizacion del marcador en la capa lipidica y, por otra parte, el estado de las nanoparticulas despues de su entrada en las celulas.

Se han insertado sondas fluorescentes lipofilas en las formulaciones como marcador, por una parte, y como compuesto lipfdico que imita un profarmaco (por ejemplo, un conjugado lipidico analogo a un nucleosido anticanceroso tal como el 5-FU), por otra parte.

Se han realizado las diferentes formulaciones siguientes:

Formulacion A: diC16dT/DOPC 50/50

Formulacion B: DOTAU/DOPC 50/50

Formulacion C: diC16dT/DOPC/DOPE/fluorescema 49,25/49,25/0,5 (A ex = 483 nm, (A emision = 518 nm)

Formulacion D: DOTAU/DOPC/DOPE/rodamina 49,25/49,25/0,5 (A ex = 550 nm, (A emision = 590 nm)

Se han preparado asf las nanoparticulas NP1, NP2 y NP3 segun la invencion de diferentes composiciones, definidas como sigue:

Nanopartmula

Primera capa Segunda capa

NP1

formulacion C formulacion B

NP2

formulacion A formulacion D

NP3

formulacion C formulacion D

Las nanoparticulas NP1, NP2 y NP3 se representan en la figura 6. En cada una de las nanoparticulas, la capa blanca representa una capa lipidica no marcada, la capa gris representa la capa marcada con fluorescema (formulacion C), la capa negra representa la capa marcada con la rodamina (formulacion D) y el centro punteado representa el cisplatino incorporado.

Se han realizado medidas de FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) en las celulas SKV03 que han sido incubadas:

• en ausencia de nanopanculas segun la invencion a modo de control (figura 7A)

• en presencia de nanopartfculas NP1 en las que la primera capa esta marcada (figura 7B),

• en presencia de nanopartfculas NP2 en las que la segunda capa esta marcada (figura 7C), y

• en presencia de nanopartfculas NP3 en las que las dos capas estan marcadas (figura 7D).

5 Los datos de FACS obtenidos muestran la presencia de los dos marcadores fluorescentes (fluorescema, rodamina) en las celulas SKV03 despues de incubacion en presencia de las nanopartfculas NP3 que llevan estos marcadores. Estos resultados muestran, por una parte, que las nanopartfculas segun la invencion tienen una estructura con compartimentos multiples, y por otra parte, que permanecen intactos despues de la internalizacion en las celulas.

Experimentos de microscopfa de fluorescencia han confirmado los resultados obtenidos por FACS. Las imagenes 10 muestran que las nanopartfculas marcadas NP1, NP2 y NP3 son internalizadas intactas en las celulas SKVO3.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Formulacion de compartimentos multiples en forma de nanopartfcula que tiene un diametro medio de aproximadamente 1 a 200 nm formada por un nucleo solido que contiene un agente terapeutico, rodeado por al menos dos capas lipidicas de polaridad diferente formadas a partir de moleculas o de macromoleculas anfifflicas funcionales, en la que cada capa lipidica esta formada por al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I):

   imagen1

   en la que:

   - X representa un atomo de oxigeno, de azufre o un grupo metileno,

   - B representa una base purica o pirimidica tal como el uracilo, adenina, guanina, citosina, timina, hipoxantina, o sus derivados, o incluso una base heterodclica mono o bidclica no natural en la que cada ciclo comprende 4 a 7 eslabones, eventualmente sustituida;

   - Li y L2, identicos o diferentes, representan el hidrogeno, un grupo oxicarbonilo -O-C(O)-, un grupo tiocarbamato -O- C(S)-NH-, un grupo carbonato -O-C(O)-O-, un grupo carbamato -O-C(O)-NH-, un atomo de oxigeno, un grupo fosfato, un grupo fosfonato o un grupo heteroarilo que comprende 1 a 4 atomos de nitrogeno, sustituido o no sustituido con una cadena hidrocarbonada, saturada o insaturada, lineal o ramificada de C2-C30,

   o tambien, L1 y L2, juntos, forman un grupo cetal de formula:

   imagen2

   0 tambien L1 o L2 representa hidrogeno, y el otro representa un grupo hidroxi o un grupo heteroarilo que comprende

   1 a 4 atomos de nitrogeno, no sustituido o sustituido con una cadena alquilo lineal o ramificada de C2-C30:

   - R1 y R2, identicos o diferentes, representan:

   - una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada de C2-C30, preferentemente C6-C25, principalmente C8-C25, saturada o parcialmente insaturada, eventualmente total o parcialmente fluorada, no sustituida o sustituida en el carbono del extremo de la cadena con un atomo de fluor o con un ester o un eter bendlico o naftflico, o

   - una cadena diacilo en la que cada cadena acilo de C2-C30, o

   - un grupo diacilglicerol, esfingosina o ceramida, o

   - cuando L1 o L2 representa hidrogeno, y el otro representa un grupo hidroxi o un grupo heteroarilo que comprende 1 a 4 atomos de nitrogeno, R1 y R2 no existen;

   - R3 representa:

   - un grupo hidroxi, amino, fosfato, fosfonato, fosfatidilcolina, O-alquil-fosfatidilcolina, tiofosfato, fosfonio, NH2-R4, NHR4R5 o NR4R5R6 en los que R4, R5 y R6, identicos o diferentes, representan un atomo de hidrogeno o una cadena alquilo lineal o ramificada de C1-C5 o hidroxialquilo lineal o ramificado de C1-C5, o

   - una cadena alquilo lineal o ramificada de C2-C30 eventualmente sustituida con un grupo hidroxi, o

   - un resto ciclodextrina, o

   - un resto

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   R 7

   I

   H -(-CH2-C-)n-H

   I

   co-v-

   en el que V representa un enlace -O-,-S-, o -NH-, R7 representa H o CH3, y n = 1 a 500, o un grupo -(CH2VV-R8, en el que R8 representa un alquilo de C2-C30, y n =1 a 500, o

   - un grupo heteroarilo que comprende 1 a 4 atomos de nitrogeno, no sustituido o sustituido con un alquilo C2-C30, o con un grupo (CH2)m-O-(CH2)p-R9 en el que m = 1 a 6 y p = 0 a 10 y R9 representa un grupo cetal dclico que comprende 5 a 7 atomos de carbono, no sustituido o sustituido con al menos un alquilo lineal o ramificado de C2-C30 o con un resto esterol, o tambien

   - R3 esta unido por enlace covalente a otro sustituyente R3, identico o diferente, de otro compuesto de formula (I), identico o diferente, para formar un compuesto de formula (I) en forma de dimero,

   y cada capa lipidica tiene una polaridad diferente de la de la anterior.
2. 2. Formulacion segun la reivindicacion 1, caracterizada porque cada capa lipidica constituye un compartimento susceptible de comprender un agente terapeutico identico a o diferente del presente en el nucleo.
3. 3. Formulacion segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque un co-flpido puede estar presente en al menos una capa lipidica.
4. 4. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el agente terapeutico es un agente antitumoral.
5. 5. Formulacion segun la reivindicacion 4, caracterizada porque el agente terapeutico se elige entre los complejos de platino o el rutenio capaz de unirse a complejos de platino, o tambien los complejos inorganicos sin platino a base de rutenio II o III, de titanio, de galio, de cobalto, de hierro o de oro.
6. 6. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el agente terapeutico se elige entre el cisplatino, el carboplatino, el oxaliplatino, el nedaplatino y el lobaplatino.
7. 7. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque en la formula (I), X representa el oxigeno.
8. 8. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque en la formula (I), B representa la timina o la adenina.
9. 9. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque se utiliza al menos un compuesto de formula (I) en la que Li, L2 y/o R3 representan un grupo cargado negativamente para obtener una capa lipidica anionica.
10. 10. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque se utiliza al menos un compuesto de formula (I) en la que L1, L2 y/o R3 representan un grupo cargado cationico para obtener una capa lipidica cationica.
11. 11. Procedimiento para la preparacion de una formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

    a) preparar una mezcla de al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se ha definido en la reivindicacion 1, y de un agente terapeutico,

    b) someter dicha mezcla a ciclos repetidos de calentamiento y congelacion, de forma que se obtengan nanoparticulas que contienen dicho agente terapeutico, y

    c) recuperar las nanoparticulas que contienen dicho agente terapeutico asi obtenidas,

    d) poner dichas nanoparticulas en presencia de al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se ha definido anteriormente, que tenga una polaridad diferente del que se ha aplicado en la etapa a), y

    e) recuperar las nanoparticulas multi-compartimentos asi obtenidas.
12. 12. Procedimiento segun la reivindicacion 11, caracterizado porque se utiliza un coflpido durante las etapas a) y/o d).
13. 13. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque comprende una etapa suplementaria que consiste en la formacion de una capa lipfdica neutra formada por al menos un compuesto anfifflico funcional de formula (I) tal como se ha definido en la reivindicacion 1, siendo dicho compuesto de formula (I) neutro, para formar la capa lipfdica externa.

    5 14. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque se introduce en la

    etapa d) un agente terapeutico diferente al utilizado en la etapa a).
14. 15. Agente de transporte, de vectorizacion, o de liberacion intracelular de agentes terapeuticos, en particular de agentes antitumorales, que comprende una formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
15. 16. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su utilizacion en el tratamiento de 10 enfermedades tumorales.
16. 17. Composicion farmaceutica que comprende una formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un vetuculo farmaceuticamente aceptable.