ES2557286T3 - Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet) - Google Patents

Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet) Download PDF

Info

Publication number
ES2557286T3
ES2557286T3 ES10185426.3T ES10185426T ES2557286T3 ES 2557286 T3 ES2557286 T3 ES 2557286T3 ES 10185426 T ES10185426 T ES 10185426T ES 2557286 T3 ES2557286 T3 ES 2557286T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
cmet
binding
peptide
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES10185426.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Aaron K. Sato
Daniel T. Dransfield
Robert C. Ladner
Palaniappa Nanjappan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bracco Suisse SA
Dyax Corp
Original Assignee
Bracco Suisse SA
Dyax Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bracco Suisse SA, Dyax Corp filed Critical Bracco Suisse SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2557286T3 publication Critical patent/ES2557286T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)

Abstract

Un agente de contraste formador de imágenes diagnósticas que comprende un polipéptido o un polipéptido multimérico que tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF que comprende la secuencia de aminoácidos Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys (SEC ID N.º: 619), en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoácido, conjugado con un marcador apropiado para la detección diagnóstica, opcionalmente mediante un enlazador, para su uso en la formación de imágenes diagnósticas in vivo que implica detectar un trastorno hiperproliferativo, angiogénesis o neovascularización.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Usos de peptidos que se unen especfficamente al receptor del HGF (cMet).
Antecedentes de la invencion
El factor de crecimiento de hepatocitos (tambien conocido como factor de dispersion) es un factor de crecimiento multifuncional implicado en diversos procesos fisiologicos tales como la embriogenesis, la cicatrizacion de heridas y la angiogenesis. Se ha descubierto que el HGF, a traves de interacciones con su receptor de alta afinidad (cMet), esta implicado en el crecimiento, la invasion y la metastasis de tumores. De hecho, la desregulacion de la expresion de cMet (por ejemplo, la sobreexpresion de cMet en epitelio neoplasico de adenomas colorrectales y en otros carcinomas en comparacion con mucosa normal) y/o de su actividad, asf como la hiperactividad del receptor de cMet a traves de un bucle estimulador autocrino con HGF, se han demostrado en una variedad de tejidos tumorales e induce la transformacion oncogenica de lfneas celulares especfficas.
En general, el HGF lo producen las celulas estromales, que forman parte de muchos tumores epiteliales; sin embargo, se cree que la produccion de HFG por las propias celulas tumorales comprende la principal ruta que conduce a la hiperproliferacion de tumores especfficos. Los bucles estimuladores autocrinos de HGF/cMet se han detectado en gliomas, osteosarcomas y carcinomas mamarios, de prostata, de pecho, de pulmon y otros.
La interrupcion de la interaccion del HFG con el receptor cMet ralentiza la progresion tumoral en modelos animales. Ademas de estimular la proliferacion de determinadas celulas cancerosas a traves de la activacion de cMet, el HGF tambien protege frente a la citotoxicidad inducida por agentes que danan el ADN en una variedad de lfneas celulares susceptibles a fenotipos hiperproliferativos (por ejemplo, cancer de mama). Por lo tanto, evitar que el HGF se una a cMet podrfa predisponer determinadas celulas cancerosas a la citotoxicidad de determinados farmacos.
Ademas de los trastornos hiperproliferativos, cMet tambien se ha relacionado con la angiogenesis. Por ejemplo, la estimulacion de cMet conduce a la produccion de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), que, a su vez, estimula la angiogenesis. Adicionalmente, la estimulacion de cMet tambien se ha relacionado con la promocion de la cicatrizacion de heridas.
Ademas de identificar el receptor cMet como objetivo terapeutico para trastornos hiperproliferativos, angiogenesis y cicatrizacion de heridas, la gran discrepancia entre los niveles de expresion de tejidos neoplasicos y los correspondientes normales indica que cMet es un objetivo atractivo para aplicaciones de formacion de imagenes dirigidas a trastornos hiperproliferativos.
El documento WO 00/55199 desvela en la SEC ID N.°: 65 un polipeptido que comprende la secuencia de SEC ID N.°: 619 presente, pero el documento no proporciona ninguna funcion de dicho polipeptido. En Date et al. FEBS LETTERS 420 (1):1 -6(1997) y en el documento US 2002/0136721 se desvelan polipeptidos que se unen a cMET que pueden usarse para la formacion de imagenes medicas o diagnosticas. Estos polipeptidos difieren estructuralmente de los polipeptidos desvelados en el presente documento.
Sumario
La implicacion del eje HGF/cMet en diversas funciones celulares, incluyendo la proliferacion celular, curacion de heridas y angiogenesis, que conduce a enfermedades hiperproliferativas, tales como cancer, hace que la presente invencion sea particularmente util para formar imagenes en sitios importantes de hiperproliferacion celular.
En respuesta a la necesidad de materiales y metodos mejorados para detectar, localizar, formar imagenes, medir, por ejemplo, hiperproliferacion y/o angiogenesis, se ha descubierto sorprendentemente que doce clases de polipeptidos de origen no natural se unen especfficamente a cMet.
El marcaje apropiado de dichos polipeptidos proporciona agentes formadores de imagenes detectables que pueden unirse, por ejemplo, a alta concentracion, a celulas que expresan cMet o a celulas que presentan complejos HGF/cMet, proporcionando agentes formadores de imagenes especfficos para sitios de proliferacion celular y/o angiogenesis.
La invencion en su sentido mas amplio es: i) un agente para su uso en la formacion de imagenes de diagnostico in vivo que implica detectar un trastorno hiperproliferativo, angiogenesis o neovascularizacion, como se define en la reivindicacion 1, y ii) un metodo de purificacion de cMet o un complejo de cMet y HGF de una solucion que lo contiene, como se define en la reivindicacion 8. Solamente las realizaciones que se incluyen en las reivindicaciones 1 y 8 son realizaciones de la invencion; otras realizaciones son realizaciones de la divulgacion.
Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un agente de contraste de formacion de imagenes de diagnostico que comprende un polipeptido o polipeptido multimerico que tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y hGf que comprende la secuencia de aminoacidos
Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys (SEC ID n.°: 619),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
en la que Xi, X2, X3 y X4 pueden ser cualquier aminoacido,
conjugado con un marcador apropiado para la deteccion diagnostica, opcionalmente mediante un enlazador, para su uso en la formacion de imagenes diagnosticas in vivo que implica detectar un trastorno hiperproliferativo, angiogenesis o neovascularizacion.
La invencion incluye el uso de un solo polipeptido de union como un monomero o en una construccion multimerica o polimerica asf como el uso de mas de un polipeptido de union en construcciones multimericas o polimericas, como se define en las reivindicaciones. Los polipeptidos de union de acuerdo con esta divulgacion son utiles en cualquier aplicacion en la que la union, la deteccion o el aislamiento de cMet, o sus fragmentos, que conservan el sitio de union al polipeptido, resulta ser ventajosa.
La formacion de imagenes in vivo conlleva el uso de polipeptidos de union especfficos para detectar un sitio de proliferacion celular y/o angiogenesis, en el que los polipeptidos de union se han marcado de manera detectable para su uso como agentes formadores de imagenes, incluyendo agentes de contraste de formacion de imagenes de resonancia magnetica (MRI), agentes formadores de imagenes de rayos X, agentes formadores de imagenes radiofarmaceuticos, agentes formadores de imagenes ultrasonido, y agentes formadores de imagenes opticas, como se define en las reivindicaciones.
El receptor de cMet forma parte de la familia de receptores tirosina cinasa de moleculas de senalizacion. Para los propositos de la presente divulgacion, la funcion del receptor tirosina cinasa puede incluir una cualquiera de: oligomerizacion del receptor, fosforilacion de receptor, actividad cinasa del receptor, reclutamiento de moleculas de senalizacion posteriores, induccion de genes, induccion de proliferacion celular, induccion de migracion celular o sus combinaciones. En la presente divulgacion tambien se engloban moleculas "heteromericas", usado en el presente documento para referirse a moleculas que contienen mas de un peptido de union a cMet descrito en el presente documento, de forma que cada peptido de union de la molecula heteromerica se une a un sitio diferente, por ejemplo, "epftopo", de cMet. Por ejemplo, las construcciones heteromericas de polipeptidos de union proporcionados en el presente documento, podrfan, por ejemplo, unirse a traves de un peptido de union a, por ejemplo, el sitio de union de HGF de cMet, al mismo tiempo que otro peptido de union de la molecula heteromerica se une a un sitio de union de alta afinidad de cMet diferente.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere a construcciones que comprenden medios para producir moleculas multimericas que comprenden dos o mas polipeptidos de union, al menos uno de los cuales se une a cMet para su uso en la formacion de imagenes diagnosticas in vivo, como se define en las reivindicaciones. En una realizacion, las construcciones multimericas comprenden dos o mas copias de un unico polipeptido de union. En otra realizacion, las construcciones multimericas de la presente invencion comprenden dos o mas polipeptidos de union, de forma que al menos dos de los polipeptidos de union de la construccion son especfficos para epftopos diferentes de cMet. Estas construcciones tambien se denominan en el presente documento "construcciones heteromericas", "heteromultfmeros", etc. Las construcciones tambien pueden incluir peptidos no relacionados o de control. Las construcciones pueden incluir dos o mas, tres o mas, o cuatro o mas, polipeptidos de union. Con base en las ensenanzas proporcionadas en el presente documento, un experto en la tecnica puede ensamblar los polipeptidos de union proporcionados en el presente documento en construcciones multimericas y seleccionar construcciones multimericas con propiedades mejoradas, tales como capacidad mejorada para unirse a la molecula objetivo. Tales construcciones multimericas con propiedades mejoradas se incluyen en la presente invencion como definidos en las reivindicaciones.
Los polipeptidos descritos en el presente documento pueden tener aminoacidos adicionales unidos en cualquiera o en ambos extremos N- y C-terminal. Los polipeptidos de union preferidos pueden prepararse con peptidos flanqueantes en N-terminal y/o C-terminal de uno o mas, preferentemente dos, aminoacidos que corresponden a los peptidos flanqueantes de la construccion de presentacion del fago seleccionado a partir del cual se aislaron los polipeptidos de union. Los peptidos flanqueantes del N-terminal preferidos incluyen Gly-Ser- (mas preferentemente para secuencias TN6), Ala-Gly- (mas preferentemente para secuencias TN8 y tN9), Gly-Ser- (mas preferentemente para secuencias TN10 y TN11), Gly-Asp- (mas preferentemente para secuencias TN12), Ala-Gln- (mas preferentemente para secuencias lineales). Los peptidos flanqueantes C terminal preferidos incluyen -Ala-Pro (mas preferentemente para secuencias TN6), -Gly-Thr (mas preferentemente para secuencias TN8 y tN9), -Ala-Pro (mas preferentemente para secuencias TN10 y TN11), -Asp-Pro (mas preferentemente para secuencias TN12), -Asp-Phe (mas preferentemente para secuencias lineales). Tambien pueden anadirse aminoacidos terminales sencillos a los polipeptidos de union. Tambien se contemplan sustituciones conservativas (es decir, se sustituyen aminoacidos seleccionados de los siguientes grupos: {Arg, His, Lys}, {Glu, Asp}, {Asn, Cys, Glu, Gly, Ser, Thr, Tyr}, {Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val}) para dichos aminoacidos flanqueantes.
El analisis de la informacion de la secuencia y los datos de union de los aislados de las colecciones que contienen polipeptidos con el potencial de formar estructuras de bucle (por ejemplo, colecciones denominadas TN6, T8, TN9, TN10, TN11 y TN12; el numero se refiere al numero de aminoacidos de la secuencia de cistefna a cistefna; adicionalmente, tambien se rastreo la coleccion de presentacion lineal LN20) identifica una serie adicional de polipeptidos de union a cMet. Se obtuvo un motivo consenso a partir de esta exploracion inicial de una biblioteca de TN9 (CxGpPxFxC; SEC ID N.°: 512). La secuencia consenso se obtuvo de las secuencias indicadas en la Tabla 6.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Esta secuencia consenso, junto con tendencias de secuencias en los peptidos de union a cMet identificadas a partir de la biblioteca de peptidos lineales, se uso para disenar una biblioteca de segunda generacion que se uso en una exploracion secundaria. Se usaron las secuencias de ambas exploraciones para identificar las doce clases de motivos de union a cMet que se indican en la Tabla 6.
Otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a modificaciones de los polipeptidos para proporcionar agentes formadores de imagenes especfficos de proliferacion celular y/o angiogenesis, marcando de manera detectable un polipeptido o una construccion polipeptfdica multimerica, como se define en las reivindicaciones. Dicho marcado detectable puede implicar radiomarcado, marcado enzimatico o marcado con quelados paramagneticos MR o micropartfculas; la incorporacion en burbujas, micropartfculas, microesferas, emulsiones o liposomas ultrasonido; o la conjugacion con colorantes opticos. En una realizacion particular, X2 es Pro en la SEC ID N.°: 619.
En otra realizacion, los polipeptidos para el uso de la invencion comprenden adicionalmente peptidos flanqueantes en el N terminal y/o C terminal de uno o mas aminoacidos. Por ejemplo, el polipeptido puede comprender una modificacion seleccionada del grupo que consiste en: una sustitucion de aminoacido, y una sustitucion de enlace amida, una sustitucion de D-aminoacido, un aminoacido glucosilado, una sustitucion mimetico disulfuro, una translocacion de aminoacido, un peptido retro inverso, un peptoide, un peptoide retro inverso y un peptico sintetico. Los polipeptidos se conjugan con un marcador detectable, que opcionalmente comprenden tambien un enlazador o espaciador entre el polipeptido y el marcador detectable. En una realizacion particular, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en: una enzima, un compuesto fluorescente, un liposoma, un colante optico, un ion metalico paramagnetico, un agente de contraste ultrasonido y un radionuclido. En una realizacion particular, el marcador detectable comprende un radionuclido. Por ejemplo, el radionuclido puede ser uno o mas seleccionado del grupo que consiste en: 18F, 124I, 125I, 131I, 123I, 77Br, 76Br, 99mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 51Cr, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, 175Yb, 140La, 90Y, 88Y, 153Sm, 166Ho, 165Dy, 166Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi,
214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 198Au y 199Au. En otra realizacion, el agente terapeutico o marcador detectable comprende adicionalmente un quelante. Por ejemplo, el quelante puede comprender un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: las formulas 20, 21, 22, 23a, 23b, 24a, 24b y 25. En una realizacion particular, el radionuclido es 99mTc o 111In. En otra realizacion, el radionuclido se selecciona del grupo que consiste en: 177Lu, 90Y, 153Sm y 166Ho. En otra realizacion, el marcador detectable comprende un agente de contraste ultrasonido. Por ejemplo, el agente de contraste ultrasonido puede comprender una microburbuja o un microglobo, estabilizados por fosfolfpidos, que comprenden un gas, por ejemplo, un gas fluorado. En otra realizacion, el marcador detectable comprende un ion metalico paramagnetico y un quelante. El polipeptido puede tener una Kd aparente para cMet del complejo cMet/HGF menor de aproximadamente 10 pM, menor de aproximadamente 1,0 pM, menor de aproximadamente 0,1 pM o menor de aproximadamente 1 nM.
En una realizacion, la presente divulgacion se refiere a un polipeptido o construccion polipeptfdica multimerica que tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos de una de las siguientes clases: Clase III: X1-X2-X3-Cys-X4-Gly-X5-Pro-X6-Phe-X7-Cys-X8-X9 (TN9) (SEC ID N.°: 540), en la que X1 es Glu, Ser, Trp o Tyr; X2 es Phe, Thr o Trp; X3 es His, Phe o Trp; X4 es Ala, Lys, Ser o Thr; X5 es Pro o Trp; X6 es Ser o Thr; X7 es Glu o Ser; Xa es Ile, Trp o Tyr; y X9 es Glu, Met, Trp o Tyr; o
Clase, IV-1: X1 -X2-X3-Cys-X4-Gly-Pro-Pro-X5-Phe-X6-Cys-Trp-X7-X8-Xg-X10-X11, (TN9) (SEC ID n.°: 541), en la que X1 es Arg, Asp, Asn, Ile o Ser; X2 es Leu, Ile, Phe, Trp o Val; X3 es Asn, Gln, His, Leu, Tyr o Val; X4 es Leu, Lys o Ser;
X5 es Ala, Ser, Thr o Trp; X6 es Leu, Ser o Trp; X7 es Leu, Ser o Trp; Xa es Phe o Tyr; X9 es Asp, Glu, Gly o Val; X10
es Met, Pro, Thr o Ser; y X11 es Glu o Gly; o
Clase IV-2: X1-X2-Xa-X4-Trp-X5-Cys-X6-Gly-Pro-Pro-Thr-Phe-Glu-Cys-Trp-X7-Xa (TN9) (SEC ID N.°: 542), en la que X1 es Asp, Glu o Val; X2 es Ala, Asp, Gly, Ser o Val; X3 es Asp, Gly, Ser o Val; X4 es Arg, Asn, Gly, Ser o Thr; X5 es
Gln o His; X6 es Asn, Lys o Ser; X7 es Ser o Trp; y Xa es Phe o Tyr; o
Clase IX-1: Ser-Cys-X1-Cys-X2-Gly-Pro-Pro-Thr-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-X3-X4-Xa (SEC ID N.°: 546), en la que X1 es Asn, His o Tyr; X2 es Gly o Ser; X3 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser; X4 es Ser o Thr; y X5 es Asp o Glu; o
Clase IX-2: Glu-X1-Gly-Ser-Cys-His-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Thr-Phe-Glu-Cys-X2-Cys-X3 (SEC ID N.°: 547), en la que X1 es Ala, Glu, Gly o Ser; X2 es Phe, Trp o Tyr; y X3 es Phe o Tyr.
La formacion de imagenes diagnosticas in vivo, a la que se hace referencia en las reivindicaciones, puede comprender detectar cMet o un complejo que comprenda cMet y HGF en un sujeto animal o humano y la formacion de imagenes de al menos una parte del sujeto animal o humano usando un polipeptido o una construccion polipeptfdica multimerica marcados de manera detectable que tienen la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprenda cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 pueden ser cualquier aminoacido; en la que dicho polipeptido marcado o construccion polipeptfdica multimerica marcada, se administra al sujeto; y construir una imagen.
En una realizacion particular, el marcador se selecciona del grupo que consiste en: una enzima, un compuesto fluorescente, un agente de contraste ultrasonido, un liposoma y un colorante optico, en el que el marcador comprende ademas opcionalmente un enlazador y/o un espaciador. En una realizacion particular, el agente de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
contraste ultrasonido es una microburbuja o un microglobo, estabilizados por fosfolfpidos, que comprenden un gas, por ejemplo, un gas fluorado. En otras realizaciones, el marcador es un marcador radiactivo o un atomo metalico paramagnetico, y opcionalmente comprende ademas un enlazador o un espaciador. En otra realizacion, el marcador radiactivo comprende un radionuclido seleccionado del grupo que consiste en: F, I, I, I, I, Br, Br,
99mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 51Cr, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, 175Yb, 140La, 90Y, 88Y, 1s3Sm, 166Ho, 165Dy, 166Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 1 61Tb, 177Lu, 198Au y 199Au. En otra realizacion, el marcador radiactivo comprende adicionalmente un quelante, tal como, por ejemplo, los
quelantes seleccionados del i realizacion, el radionuclido es
rupo que consiste en: las formulas 20, 21, 22, 23a, 23b, 24a, 24b y 25. En otra 9mTc o 111In. En una realizacion particular, el marcador paramagnetico comprende un
1 2+ 2+ 2+ ^ 2+ 2+ 1 3+ 3+
atomo metalico paramagnetico seleccionado del grupo que consiste en: Mn , Cu , Fe , Co , Ni , Gd , Eu , Dy3+, Pr3+, Cr3+, Co3+, Fe3+, Ti3+, Tb3+, Nd3+, Sm3+, Ho3+, Er3+, Pa4+ y Eu2+. En otra realizacion, el marcador paramagnetico comprende adicionalmente un quelante, por ejemplo, un quelante seleccionado del grupo que consiste en: DTPA, DO3A, DOTA, EDTA, TETA, EHPG, HBED, NOTA, DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM, y MECAM. La deteccion del polipeptido marcado o de la construccion polipeptfdica multimerica marcada es indicativa de un trastorno hiperproliferativo, angiogenesis o neovascularizacion. En realizaciones particulares, el marcador es un agente de contraste ultrasonido que comprende un gas fluorado seleccionado en el grupo de: freones SF6, CF4, C2F6, C3F8, C4F10, CBrF3, CCI2F2, C2CIF5, CBrCIF2 y perfluorocarbonos. En realizaciones particulares, el agente de contraste ultrasonido comprende un perfluorocarbono gaseoso que tiene la formula CnFn+2 en la que n tiene un valor de 1 a 12.
La formacion de imagenes medicas de una preparacion farmaceutica de un agente de contraste que comprende al menos un polipeptido o una construccion polipeptfdica multimerica, que tienen la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X1-Gly- X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys (SEC ID N.°: 619), en la que X1, X2, X3 y X4 pueden ser cualquier aminoacido, puede comprender la formacion de imagenes del agente de contraste mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en: formacion de imagenes por resonancia magnetica, formacion de imagenes ultrasonido, formacion de imagenes opticas, formacion de imagenes sonoluminiscentes, formacion de imagenes fotoacusticas y formacion de imagenes nucleares.
En otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de purificacion de cMet o de un complejo cMet y HGF, a partir de una solucion que lo contenga, que comprenda las etapas de
a) poner en contacto la solucion con al menos un polipeptido o polipeptido multimerico que tenga la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprenda cMet y HGF que comprenda la secuencia de aminoacidos Cys-X1- Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys (SEC ID N.°: 619), en la que X1, X2, X3 y X4 pueden ser cualquier aminoacido, inmovilizado en un sustrato solido; y
b) separar dicho polipeptido o polipeptido multimerico de la solucion.
Breve descripcion de los dibujos
Las figura 1A-1C son representaciones de mimeticos, que pueden emplearse para imitar motivos estructurales y caracterfsticas de giro en un peptido y, simultaneamente, proporcionar estabilidad a la proteolisis y potenciar otras propiedades (estructura 1A: Hart, S. y Etzkorn, F., 1999. J. Org. Chem., 64:2998-2999; estructura 1B: Hanessian, S. y McNaughton-Smith, G., "Synthesis of a Versatile Peptidomimetic Scaffold" en Methods in Molecular Medicine, vol. 23: Peptidomimetics Protocols, W. Kazmierski, Ed. (Humana Press Inc., Totowa, N.J., 1999), capftulo 10, pag. 161174; estructura 1C: documento WO 01/16135.
La figura 2 es una representacion de los aminoacidos (4), que contienen una funcion aminoalcohol, y (5), que contienen una funcion alcoxiamino.
La figura 3 es una representacion que ilustra la ciclacion de la cistefna con una funcion bromoacetamida lateral (este procedimiento se denomina en el presente documento "esquema 1").
La figura 4 es una representacion que muestra la ciclacion intramolecular de funciones aminomercapto y funciones aldehfdo proximas situadas adecuadamente para proporcionar tiazolidinas que dan lugar a la formacion de un peptido bicfclico, uno de cuyos anillos es el formado por los residuos de la cadena principal y siendo el segundo anillo el anillo tiazolidina (este procedimiento se denomina en el presente documento "esquema 2").
La figura 5 es una representacion que muestra como una funcion lactama, disponible mediante acoplamiento intramolecular a traves de reactivos de acoplamiento de peptidos estandar (tales como HATU, PyBOP, etc.), puede actuar como sustituta del enlace disulfuro. Se muestra el enfoque de Dde/Dmab (y se denomina en el presente documento "esquema 3").
La figura 6 es una representacion que muestra la reaccion de Grubbs (denominada en el presente documento "esquema 4").
Las figura 7A y 7B son estructuras qufmicas de restos fosfolfpido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Las figura 8A-F representan estructuras de quelantes de metales preferidos.
La figura 9 es una representacion esquematica de la estrategia de seleccion que se empleo para identificar polipeptidos de union de cMet. TEA = trietilamina, Infeccion con perlas = captura de fagos no eluidos que permanecfan unidos a las perlas de cMet-Fc/protefna-A.
La figura 10 (cancelada).
La figura 11 muestra un diagrama esquematico para la preparacion de la SEQ ID NO: 514 conjugada con un resto 6- PnAO-Glut (denominado en el presente documento "esquema 5").
La figura 12 muestra un diagrama esquematico para la preparacion de un heterodfmero que contiene las SEQ ID NO: 514 y 515 unidas mediante un enlazador K(PnAO6-Glut) (denominado en el presente documento "esquema 5").
Las figura 13A-13C muestran las estructuras qufmicas de tres heterodfmeros como sigue: la figura 13A muestra la SEQ ID NO:514 enlazada a la SEQ ID NO:515 (Ac-GSPEMCMMFPFLYPCNHHAPGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac- GSFFPCWRIDRFGYCHAN-APGGGKJJ-Glut]-NH2}-NH2); la figura 13B muestra la SEQ ID NO: 515 enlazada a la SEQ ID NO:516 (Ac-GSFFPCWRIDRFGY-CHANAPGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-
AQEWEREYFVDGFWGSWFGIPHGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-NH2); y la figura 13C muestra la SEQ ID NO:514 enlazada a la SEQ ID NO:517 (Ac-GSPEMCMMFPFLYPCNHHAPGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-
GDYSECFFEPDSFEVKCYDRDPGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-NH2).
La figura 14 es una representacion grafica de datos que muestran la union de derivados de la SEQ ID NO: 514 con diferente longitud espaciadora y biotina. Los derivados tienen ninguno, uno y dos espaciadores J respectivamente entre la secuencia objetivo y la biotina.
Descripcion detallada
La presente invencion proporciona nuevas fracciones de union que se unen al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (“HGFr” o “cMet”) para su uso como se define en las reivindicaciones. Dichas fracciones de union hacen posible la deteccion, formacion de imagenes y localizacion eficiente de celulas que presentan expresion de cMet regulada positivamente y union de HGF a cMet. Dichas celulas activadas son iniciadores de proliferacion celular, y por tanto los polipeptidos descritos en el presente documento proporcionan un medio para detectar, monitorizar y localizar sitios de proliferacion. En particular, las fracciones de union de la presente invencion, que son polipeptidos y construcciones polipeptfdicas multimericas, cuando sea apropiado marcadas y como se define en las reivindicaciones son utiles para detectar, formar imagenes y localizar tumores u otros trastornos proliferativos que resultan de la proliferacion celular mal regulada (por ejemplo, cancer). Por tanto, los polipeptidos y construcciones polipeptfdicas multimericas de union pueden usarse para formar diversos agentes de diagnostico para diagnosticar crecimiento de tumores neoplasicos u otros trastornos proliferativos, como se define en las reivindicaciones.
Inicialmente, se aislaron polipeptidos de union a cMet especfficos de acuerdo con la presente divulgacion mediante rastreo de colecciones de presentacion en fagos, es decir, poblaciones de bacteriofagos transformadas para que expresen un peptido exogeno en su superficie. Con el fin de aislar nuevos restos de union polipeptfdicos para un objetivo en particular, tal como cMet, el rastreo de grandes colecciones de peptidos, por ejemplo, usando tecnicas de presentacion en fago, es especialmente ventajoso, en cuanto que se pueden probar cantidades muy grandes (por ejemplo, 5 x 109) de agentes de union potenciales y aislar agentes de union satisfactorios en un periodo de tiempo corto.
Con el fin de preparar una coleccion de fagos de presentacion de polipeptidos para rastrearla en busca de polipeptidos de union tales como polipeptidos de union a cMet y/o polipeptidos que se unen a un complejo que comprende HGF unido a cMet, se selecciona un dominio de union candidato para que sirva de molde estructural para los peptidos que se quieren presentar en la coleccion. La coleccion de fagos se compone de una multiplicidad de analogos del dominio original o molde. El molde del dominio de union puede ser una protefna natural o artificial, o una region o dominio de una protefna. El molde del dominio de union puede seleccionarse basandose en el conocimiento de una interaccion conocida entre el molde del dominio de union y el objetivo de union, pero esto no es crucial. De hecho, no es esencial que el dominio seleccionado actue como molde para la coleccion o que tenga afinidad alguna por el objetivo; su proposito es proporcionar una estructura a partir de la cual puede generarse una multiplicidad (coleccion) de polipeptidos de estructura similar (analogos), multiplicidad de analogos que incluira uno o mas analogos que muestren las propiedades de union deseadas (y cualquier otra propiedad que se haya buscado en el rastreo).
En la seleccion del dominio de union original o molde sobre el que basar las secuencias de aminoacidos variegadas de la coleccion, una consideracion importante es como se presentaran los dominios peptfdicos variegados al objetivo, es decir, en que conformacion se pondran en contacto los analogos peptfdicos con el objetivo. En metodologfas de presentacion en fago, por ejemplo, los analogos se generan por insercion de ADN artificial que codifica los analogos en el fago, dando lugar a la presentacion del analogo en la superficie del fago. Tales colecciones de fagos, tales como el fago M13, que presentan una amplia variedad de polipeptidos diferentes, pueden preparase usando tecnicas como las descritas, por ejemplo, en Kay y otros, Phage Display of Peptides and
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego, 1996) y en el documento US 5223409 (Ladner y otros).
En el aislamiento de los polipeptidos especfficos de acuerdo con la presente divulgacion, se rastrearon inicialmente siete colecciones de peptidos cfclicos (o "de bucle"), denominadas TN6, TN7, TN8, TN9, TN10, TN11, TN12, y una coleccion lineal, denominada LN20. Cada coleccion se construyo para la expresion de polipeptidos diversificados en el fago M13. Las siete colecciones que tienen una denominacion "TN" se disenaron para que presentaran un bucle de peptido exogeno variegado de 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoacidos, respectivamente, en la superficie del fago M13, en el extremo amino de la protefna III. Las colecciones se denominan TN6 (con una diversidad potencial de 3,3 x 1012 secuencias de aminoacidos), TN7 (con una diversidad potencial de 1,2 x 1014 secuencias de aminoacidos), TN8 (con una diversidad potencial de 2,2 x 1015 secuencias de aminoacidos), TN9 (con una diversidad potencial de 4,2 x 1016 secuencias de aminoacidos), TN10 (con una diversidad potencial de 3,0 x 1016 secuencias de aminoacidos), TN11 (con una diversidad potencial de 1,5 x 1019 secuencias de aminoacidos), TN12 (con una diversidad de secuencias de 4,6 x 1019) y LN20 (con una diversidad potencial de 3,8 x 1025 secuencias de aminoacidos).
La coleccion TN6 se construyo para presentar un unico bucle de union de microprotefna contenido en un molde de
12 aminoacidos. La coleccion TN6 utilizo una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Cys - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 (SEQ ID NO: 612). Los aminoacidos en las posiciones 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10 y 11 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys). Los aminoacidos de las posiciones 1 y 12 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys), acido glutamico (Glu), isoleucina (Ile), lisina (Lys), metionina (Met) y treonina (Thr).
La coleccion TN7 se construyo para presentar un unico bucle de union de microprotefna contenido en un molde de
13 aminoacidos. La coleccion TN7 utilizo una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Cys - Xaa1 Xaa12 - Xaa13 (SEQ ID NO: 613). Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 13 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys).
La coleccion TN8 se construyo para presentar un unico bucle de union de microprotefna contenido en un molde de
14 aminoacidos. La coleccion TN8 utilizo una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Cys - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 (SEQ ID NO: 614). Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13 y 14 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys).
La coleccion TN9 se construyo para presentar un unico bucle de union de microprotefna contenido en un molde de
15 aminoacidos. La coleccion TN9 utilizo una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Cys - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15 (SEQ ID NO: 615). Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14 y 15 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys).
La coleccion TN10 se construyo para presentar un unico bucle de union de microprotefna contenido en un molde de
16 aminoacidos. La coleccion TN10 utilizo una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Cys - Xaa14 - Xaa15 - Xaa16 (SEQ ID NO: 616). Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 15 y 16 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido seleccionado de un grupo de 10 aminoacidos: D, F, H, L, N, P, R, S, W o Y). Los aminoacidos en las posiciones 3 y 14 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido seleccionado de un grupo de 14 aminoacidos: A, D, F, G, H, L, N, P, Q, R, S, V, W o Y). Los aminoacidos en las posiciones 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys).
La coleccion TN11 se construyo para presentar un unico bucle de union de microprotefna contenido en un molde de
17 aminoacidos. La coleccion TN11 utilizo una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Cys - Xaa15 - Xaa16 - Xaa17 (SEQ ID nO: 617). Los aminoacidos en las posiciones de 1 a 3, de 5 a 13 y de 15 a 17 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys).
La coleccion TN12 se construyo para presentar un unico bucle de union de microprotefna contenido en un molde de
18 aminoacidos. La coleccion TN12 utilizo una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Cys - Xaa16 - Xaa17 - Xaa18 (SEQ ID NO: 618). Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 17 y 18 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido seleccionado de un grupo de 12 aminoacidos: A, D, F, G, H, L, N, P, R, S, W o Y). Los aminoacidos en las posiciones 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 16 se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys).
La coleccion LN20 se construyo para presentar multiples peptidos lineales en la superficie de un fago. Sin embargo, cada fago presenta multiples copias de la misma secuencia. Por lo tanto, un unico fago presentara, por ejemplo, cinco copias de una secuencia en particular, un fago diferente presentara, por ejemplo, cinco copias de una secuencia diferente, etc. Los peptidos lineales se proporcionan en un molde de 20 aminoacidos. Los aminoacidos en cada posicion del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistefna (Cys).
Los polipeptidos de union proporcionados en el presente documento pueden incluir adiciones o truncamientos en el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
- y/o extremo C. Se espera que dichos polipeptidos de union modificados se unan a cMet. Por ejemplo, un enlazador -GGGK (SEC ID N.°: 513) puede estar presente en el extremo N de los polipeptidos de union proporcionados en el presente documento. Podrfan usarse otros enlazadores, tales como -GSGK (SEC ID N.°: 651), o -GSGSK (SEC ID N.°: 652). Se espera que los polipeptidos de union que comprenden la porcion de bucle de los moldes y las secuencias proporcionadas en el presente documento se unan a cMet y tambien se engloban en la presente invencion. La porcion de bucle de los moldes y secuencias incluye las secuencias intermedias y que incluyen los dos residuos de cistefna que se espera que formen un enlace disulfuro, generando asf una estructura de bucle peptfdico. Ademas, los polipeptidos de union pueden incluir residuos de aminoacido adicionales en los extremos N y/o C.
Las colecciones de presentacion en fago se crearon preparando una serie determinada de mutaciones o variaciones dentro de una secuencia de codificacion para el molde de polipeptido, codificando cada secuencia mutante un analogo peptfdico de estructura general correspondiente al molde excepto porque tiene una o mas variaciones de aminoacido en la secuencia del molde. El ADN variegado (mutado) novedoso proporciona diversidad de secuencia y cada fago transformante presenta una variante de la secuencia de aminoacidos molde inicial codificada por el ADN, dando lugar a una poblacion de fagos (coleccion) que presentan un gran numero de secuencias de aminoacidos diferentes pero estructuralmente relacionadas. Se espera que las variaciones de aminoacidos modifiquen las propiedades de union del peptido o dominio de union sin modificar significativamente su estructura, al menos para la mayorfa de las sustituciones. Se prefiere que las posiciones de aminoacidos que se seleccionan para su variacion (posiciones de aminoacido variables) sean posiciones de aminoacido de superficie, es decir, posiciones en la secuencia de aminoacidos de los dominios que, cuando el dominio se encuentra en su conformacion mas estable, aparecen en la superficie exterior del dominio (es decir, la superficie expuesta a la solucion). Lo mas preferentemente, las posiciones de aminoacido que se van a variar seran adyacentes o se encontraran proximas, con el fin de maximizar el efecto de las sustituciones.
Como se indica anteriormente, las tecnicas analizadas en Kay y otros, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego, 1996) y en el documento US 5223409 son particularmente utiles para preparar una coleccion de agentes de union potenciales correspondientes al molde original seleccionado. Las colecciones analizadas anteriormente se prepararon de acuerdo con tales tecnicas y se rastrearon en busca de polipeptidos de union de cMet frente al objetivo inmovilizado, como se explica en los ejemplos siguientes.
En un rastreo tfpico, se pone en contacto una coleccion de fagos y se deja que se una al objetivo o a uno de sus subcomponentes en particular. Para facilitar la separacion de agentes de union y de no union, conviene inmovilizar el objetivo sobre un soporte solido. Los fagos que portan un resto de union a objetivo forman un complejo con el objetivo sobre el soporte solido, mientras que el fago que no se une permanece en la solucion y puede eliminarse por lavado con tampon en exceso. Despues, los fagos unidos se liberan del objetivo cambiando el tampon a un pH extremo (pH 2 o pH 10), cambiando la fuerza ionica del tampon, anadiendo desnaturalizantes o por otros medios conocidos. Para aislar el fago de union que muestra los polipeptidos de la presente divulgacion, se realiza una elucion de protefnas, es decir, se eluyen algunos fagos del objetivo usando HGF en solucion (elucion competitiva). Adicionalmente, por ejemplo, los fagos de union con afinidad muy alta que no pudieron eliminarse por competicion durante la incubacion con HGF de una noche se capturaron usando los fagos unidos todavfa al sustrato para la infeccion de celulas de E. coli.
Los fagos recuperados pueden amplificarse despues por medio de infeccion de celulas bacterianas y puede repetirse el procedimiento de rastreo con el nuevo conjunto que ahora carece de agentes de no union y esta enriquecido en agentes de union. La recuperacion de incluso unos pocos fagos de union es suficiente para llevar a cabo el procedimiento. Tras unos pocos ciclos de seleccion, las secuencias genicas que codifican los restos de union derivados de clones de fagos seleccionados del conjunto de union se determinan mediante procedimientos convencionales, descritos a continuacion, revelando la secuencia peptfdica que confiere afinidad de union del fago al objetivo. Cuando funciona el procedimiento de seleccion, la diversidad de secuencia de la poblacion disminuye con cada ciclo de seleccion hasta que quedan los agentes de union deseables. Las secuencias convergen en un numero pequeno de agentes de union relacionados, normalmente 10-50 de aproximadamente 109 a 1010 candidatos originales de cada coleccion. Un aumento del numero de fagos recuperados en cada ciclo de seleccion y, por supuesto, la recuperacion de secuencias estrechamente relacionadas, son buenos indicadores de que se ha producido la convergencia de la coleccion en un rastreo. Despues de identificar un juego de polipeptidos de union, puede usarse la informacion de secuencia para disenar otras colecciones de fagos secundarias, sesgadas hacia miembros que tienen propiedades deseadas adicionales La formacion del bucle de enlace disulfuro es ventajosa porque da lugar a una afinidad y especificidad aumentadas por tales peptidos. Sin embargo, en el suero, el enlace disulfuro puede abrirse por cistefnas libres u otras moleculas que contienen tioles. Por tanto, podrfa ser util modificar los residuos de cistefna para reemplazar el entrecruzamiento disulfuro con otro enlace menos reactivo. El entrecruzamiento -CH2-S-S-CH2 tiene una geometrfa preferida en la que el enlace diedrico entre los azufres es de casi 90 grados, pero la geometrfa exacta se determina por el contexto de otros grupos laterales y el estado de union de la molecula. Las modificaciones preferidas del entrecruzamiento de cierre del bucle de union conservaran las longitudes y angulos de enlace generales en la medida de lo posible. Entrecruzamientos alternativos de este tipo incluyen enlaces tioeter tales como -CH2-S-CH2-CH2-, -CH2-CH2-S-CH2-, -CH2-CH2-S-CH2-CH2-; enlaces lactama o amida tales como -CH2-NH-CO-CH2- y -CH2-CO-NH-CH2-; enlaces eter tales como -CH2-CH2-O-CH2-CH2-; puentes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
alquileno tales como -(CH2)n- (donde n = 4, 5 o 6); el enlace -CH2-NH-CO-NH-CH2- y grupos similares conocidos en la tecnica.
Aunque los polipeptidos que contienen un bucle de union ligado a un enlace disulfuro estable son los mas preferidos, pueden prepararse facilmente polipeptidos lineales procedentes de las secuencias anteriores, por ejemplo, por sustitucion de uno o dos restos de cistefna, que pueden conservar al menos alguna actividad de union a cMet del polipeptido original que contiene el enlace disulfuro. Realizando dichas sustituciones para Cys, los aminoacidos Gly, Ser y Ala son los preferidos, y tambien se prefiere sustituir los dos restos de Cys, para no dejar una sola Cys lo que podrfa ocasionar que el polipeptido forme dfmeros o reaccione con otros grupos tiol libres en una solucion.
La sfntesis directa de los polipeptidos de la divulgacion puede lograrse usando tecnicas convencionales, incluidas la sfntesis peptfdica en fase solida, la sfntesis en fase de solucion, etc. Se prefiere la sfntesis en fase solida (veanse, por ejemplo, Stewart y otros, Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco, 1989); Merrifield, J., 1963, Am. Chem. Soc., 85:2149-2154; Bodanszky y Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer- Verlag, Nueva York, 1984)).
Los polipeptidos tambien pueden prepararse comercialmente por empresas que proporcionan servicios de sfntesis (por ejemplo, BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA).
Tambien estan disponibles maquinas de sfntesis peptfdica automatizada, tales como las fabricadas por Perkin-Elmer Applied Biosystems.
Preferentemente, el compuesto de polipeptido se purifica despues de haberlo aislado o sintetizado mediante tecnicas qufmicas o recombinantes. Para fines de purificacion, existen muchos procedimientos estandar que pueden emplearse, incluida la cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) usando una columna de sflice alquilada tal como sflice C4, C8 o C18. En general, se usa una fase movil en gradiente de contenido organico creciente para lograr la purificacion, por ejemplo, acetonitrilo en un tampon acuoso, conteniendo habitualmente una pequena cantidad de acido trifluoroacetico. Tambien puede usarse cromatograffa de intercambio ionico para separar peptidos basandose en su carga. El grado de pureza del polipeptido puede determinarse mediante diversos procedimientos, incluida la identificacion de un pico grande principal en la HPLC. Se prefiere un polipeptido que produzca un unico pico que sea al menos el 95 % del material de entrada en una columna de HPLC. Es incluso mas preferible un polipeptido que produzca un unico pico que sea al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 99,5 % o mas del material de entrada en una columna de HPLC.
Para garantizar que el peptido obtenido usando cualquiera de las tecnicas descritas anteriormente es el peptido deseado, puede llevarse a cabo el analisis de la composicion del peptido. Tal analisis de composicion puede realizarse usando espectrometrfa de masas de alta resolucion para determinar el peso molecular del peptido. De forma alternativa, puede confirmarse el contenido en aminoacidos del peptido hidrolizando el peptido en acido acuoso y separando, identificando y cuantificando los componentes de la mezcla usando HPLC o un analizador de aminoacidos. Tambien pueden usarse para determinar la secuencia de peptido secuenciadores de protefnas, que degradan secuencialmente el peptido e identifican los aminoacidos en orden.
Los polipeptidos de union a cMet tambien pueden producirse usando tecnicas de ADN recombinante, utilizando acido nucleicos (polinucleotidos) que codifican los polipeptidos y expresandolos despues de forma recombinante, es decir, manipulando celulas huesped mediante la introduccion de moleculas de acido nucleico exogeno de formas conocidas para hacer que las celulas huesped produzcan los polipeptidos de union a cMet deseados. Tales procedimientos se encuentran dentro de las capacidades de los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, David, y otros, Basic Methods in Molecular Biology (1986)). La produccion recombinante de peptidos cortos, tales como los descritos en el presente documento, podrfa no ser practica en comparacion con la sfntesis directa, aunque los medios recombinantes de produccion pueden ser muy ventajosos cuando se incorpora un resto de union a cMet en un polipeptido hfbrido o protefna de fusion.
En la puesta en practica de la presente divulgacion, una determinacion de la afinidad del resto de union a cMet por cMet con relacion a otras protefnas u objetivos es una medida util y se denomina especificidad por cMet. Los ensayos estandar para cuantificar la union y determinar la afinidad incluyen dialisis en el equilibrio, union en el equilibrio, filtracion en gel o la monitorizacion de numerosos cambios espectroscopicos (tales como un cambio en la polarizacion de la fluorescencia) que son consecuencia de la interaccion del resto de union y su objetivo. Estas tecnicas miden la concentracion de ligando unido y libre como una funcion de la concentracion de ligando (o protefna). La concentracion de polipeptido unido ([Unido]) se refiere a la concentracion de polipeptido libre ([Libre]) y la concentracion de sitios de union para el polipeptido, es decir, en cMet, (N), como se describe en la ecuacion siguiente:
[Unido] = N x [Libre]/((1/Ka)+(Libre]).
Una solucion de los datos para esta ecuacion proporciona la constante de asociacion Ka, una medida cuantitativa de la afinidad de union. La constante de asociacion, Ka es la inversa de la constante de disociacion, Kd. La Kd se registra mas frecuentemente en medidas de afinidad.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los polipeptidos de union a cMet preferidos tienen una Kd para cMet en el intervalo de, por ejemplo, menos de 1 nanomolar (nM), de 1 nM a 100 micromolar (pM), lo que incluye valores de Kd de menos de 10 nM, menos de 20 nM, menos de 40 nM, menos de 60 nM, menos de 80 nM, menos de 1 pM, menos de 5 pM, menos de 10 pM, menos de 20 pM, menos de 40 pM, menos de 60 pM y menos de 80 pM.
Cuando se emplean fracciones de union a cMet como agentes formadores de imagenes, otros aspectos de especificidad de union resultan ser importantes; los agentes formadores de imagenes funcionan en un sistema dinamico en el que la union del agente formador de imagen con la diana (cMet, por ejemplo, en celulas activadas) podrfa no estar en un estado de equilibrio estable durante todo el procedimiento de formacion de imagenes. Por ejemplo, cuando el agente formador de imagen se inyecta inicialmente, la concentracion del agente formador de imagen y del complejo diana-agente aumenta rapidamente. Sin embargo, inmediatamente despues de la inyeccion, el agente formador de imagen en circulacion (libre) comienza a eliminarse a traves de los rinones o hfgado, y la concentracion en plasma del agente formador de imagen comienza a disminuir. Esta disminucion de la concentracion del agente formador de imagen libre en el plasma, ocasionalmente causa que se disocie el complejo agente-diana. La utilidad de un agente formador de imagen depende de la diferencia en la velocidad de disociacion del agente-diana con respecto a la velocidad de eliminacion del agente. De manera ideal, la velocidad de disociacion sera lenta en comparacion con la velocidad de eliminacion, dando como resultado un tiempo de formacion de imagen prolongado, durante la cual hay una alta concentracion de complejo agente-diana y una baja concentracion de imagen formador de imagen libre (senal de fondo) en el plasma.
La medida cuantitativa de las velocidades de disociacion puede realizarse usando varios procedimientos conocidos en la tecnica, tales como fluorimetrfa de fibra optica (vease, por ejemplo, Anderson y Miller, 1988, Clin. Chem., 34:1417-21), resonancia de plasmon superficial (veanse, por ejemplo, Malmborg y otros, 1996, J. Immunol. Methods, 198:51-7; y Schuck, 1997, Curr. Op. Biotechnol., 8:498-502), espejo de resonancia y gufa de ondas plana acoplada a rejilla (vease, por ejemplo, Hutchinson, 1995, Molec. Biotechnol., 3:47-54). Existen biosensores automaticos comercialmente disponibles para medir cineticas de union: sensor de resonancia de plasmon superficial BIAcore (Biacore AB, Uppsala SE), sensor de espejo de resonancia lAsys (Fisons Applied Sensor Technology, Cambridge GB), sensor de gufa de ondas plana acoplada a rejilla BIOS-1 (Artificial Sensor Instruments, Zurich CH).
Metodos para explorar polipeptidos, identificados por presentacion de fagos, con respecto a su capacidad de unirse a celulas que expresan la diana.
A continuacion se proporcionan metodos de exploracion de polipeptidos de union, identificados por presentacion de fagos, con respecto a su capacidad para unirse a celulas que expresan la diana (y no a celulas que no la expresan). Estos metodos abordan un problema significativo asociado con la exploracion de peptidos identificados mediante presentacion de fagos: frecuentemente los peptidos identificados de este modo no tienen suficiente afinidad por la diana que va a explorarse frente a celulas que expresan la diana en ensayos convencionales. Sin embargo, considerando que un peptido particular, identificado por presentacion de fagos, se une a celulas que expresan la diana (y que no se unen a celulas que no la expresan) es una informacion crftica en la identificacion de peptidos de union que son posibles fracciones de direccionamiento in vivo, ya que se usan como monomeros o como parte de una construccion multimerica. El metodo tiene la ventaja de aumentar la afinidad y avidez asociadas con la union multivalente y permite explorar polipeptidos con bajas afinidades hacia celulas que expresan dianas.
El metodo generalmente consiste en la preparacion y exploracion de construcciones multimericas que incluyen uno o mas polipeptidos de union. Por ejemplo, polipeptidos identificados por presentacion de fagos que se unen a una diana estan biotinilados y formando complejos con avidina, estreptavidina o neutravidina para formar construcciones tetramericas. Estas construcciones tetramericas se incuban despues con celulas que expresan la diana deseada y con celulas que no la expresan, y se detecta la union de la construccion tetramerica. La union puede detectarse usando cualquier metodo de deteccion conocido en la tecnica. Por ejemplo, para detectar la union, la avidina, estreptavidina o neutravidina pueden conjugarse con un marcador detectable (por ejemplo, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente o un marcador enzimatico que experimenta un cambio de color, tal como HRP (peroxidasa de rabano picante), TMB (tetrametil bencidina) o fosfatasa alcalina).
Los peptidos biotinilados forman complejos preferentemente con neutravidina-HRP. La neutravidina presenta una union no especffica mas baja con moleculas que con las otras alternativas debido a la ausencia de fracciones de hidratos de carbono de union a lectina y del dominio RYD de union al receptor de adhesion celular en neutravidina (Hiller, Y. et al., 1987. Biochem. J., 248:167-171; Alon, R. et al., 1990. Biochem. Biophys. Res. Commun., 170:123641).
Las construcciones tetramericas pueden explorarse frente a celulas que expresan de manera natural la diana o celulas que se han modificado por ingenierfa genetica mediante tecnologfas de ADN recombinante para expresar la diana (por ejemplo, transfectantes, transformantes, etc.). Si se usan las celulas que se han transfectado para expresar la diana, como control pueden usarse celulas transfectadas simuladas (es decir, celulas transfectadas sin el material genetico que codifica la diana).
Los complejos tetramericos pueden opcionalmente explorarse en presencia de suero. Por lo tanto, el ensayo tambien puede usarse para evaluar rapidamente el efecto del suero sobre la union de los peptidos con la diana.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los metodos desvelados en el presente documento son particularmente utiles en la preparacion y evaluacion de combinaciones de distintos polipeptidos de union para su uso en construcciones de direccionamiento dimerico o multimerico que contienen dos o mas polipeptidos de union. El uso de complejos de biotina/ avidina permite realizar una preparacion relativamente facil de construcciones tetramericas que contienen de uno a cuatro peptidos de union diferentes. Ademas, ahora se ha descubierto que la afinidad y avidez de una construccion de direccionamiento puede aumentarse por inclusion de dos o mas fracciones de direccionamiento que se unen a diferentes epftopos en la misma diana. Los metodos de exploracion descritos en el presente documento son utiles para identificar combinaciones de polipeptidos de union que podrfan tener afinidad aumentada cuando se incluyen en dichas construcciones multimericas.
Los metodos de exploracion descritos en el presente documento pueden usarse para explorar polipeptidos de union a cMet identificados mediante presentacion de fagos, tales como los desvelados en el presente documento. Estos metodos pueden usarse para evaluar la union especffica de los polipeptidos de union a cMet a celulas que expresan cMet o que se han modificado por ingenierfa genetica para expresar cMet. Los complejos tetramericos de polipeptidos de union a cMet biotinilados y, por ejemplo, neutravidina-HRP pueden prepararse y explorarse frente a celulas transfectadas para expresar cMet asf como celulas transfectadas simuladas, que no expresan cMet.
El ensayo puede usarse para identificar polipeptidos de union a cMet que se unen especfficamente a celulas que expresan cMet (y que no se unen a celulas que no expresan cMet) incluso cuando la Kd del polipeptido monodentado es del orden de 200 nM a 300 nM. El ensayo puede usarse para explorar construcciones homotetramericas que contienen cuatro copias de un solo polipeptido de union a cMet asf como heterotetramericas (construcciones que contienen dos o mas polipeptidos de union a cMet diferentes). Los metodos descritos en el presente documento son particularmente utiles para evaluar combinaciones de polipeptidos que se unen a cMet para su uso en construcciones multimericas, particularmente construcciones que contienen dos o mas polipeptidos de union a cMet que se unen a diferentes epftopos de cMet.
El ensayo tambien puede usarse para evaluar el efecto del suero sobre los polipeptidos de union a cMet.
Modificacidn u optimizacion de polipeptidos de union a cMet
Como se ha indicado, una secuencia polipeptfdica identificada por presentacion de fagos puede modificarse para optimizar su fuerza, comportamiento farmacocinetico, estabilidad y/u otras propiedades biologicas, ffsicas y qufmicas.
Por ejemplo, se pueden realizar los siguientes cambios de aminoacidos isostericos y/o conservativos en la secuencia polipeptfdica parental con la esperanza de que los polipeptidos resultantes tengan un perfil similar o mejorado de las propiedades descritas anteriormente:
Sustitucion de aminoacidos hidrofobos sustituidos con alquilo: incluyendo alanina, leucina, isoleucina, valina, norleucina, acido S-2-aminobutfrico, S-ciclohexilalanina u otros alfa aminoacidos simples sustituidos con una cadena lateral alifatica de C1-10 carbonos incluyendo sustituciones ramificadas, cfclicas y de cadena lineal de alquilo, alquenilo o alquinilo.
Sustitucion de aminoacidos hidrofobos sustituidos con aromaticos: incluyendo fenilalanina, triptofano, tirosina, bifenilalanina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, 2-benzotienilalanina, 3-benzotienilalanina, histidina, amino, alquilamino, dialquilamino, aza, formas halogenadas (fluor, cloro, bromo, o yodo) o sustituidas con alcoxi (de C1-C4) de los aminoacidos aromaticos indicados anteriormente, cuyos ejemplos ilustrativos son: 2-, 3- o 4- aminofenilalanina, 2-,3- o 4-clorofenilalanina, 2-, 3- o 4-metilfenilalanina, 2-, 3- o 4-metoxifenilalanina, 5-amino-, 5-cloro-, 5-metil- o 5- metoxitriptofano, 2'-, 3'-, o 4'-amino-, 2'-, 3'-, o 4'-cloro-, 2, 3, o 4-bifenilalanina, 2',-3',-o 4'- metil-2, 3 o 4- bifenilalanina, y 2- o 3-piridilalanina.
Sustitucion de aminoacidos que contienen funciones basicas: incluyendo arginina, lisina, histidina, ornitina, acido 2, 3-diaminopropionico, homoarginina, derivados sustituidos con alquilo, alquenilo o arilo (de C1-C10 ramificados, lineales o cfclicos) de los aminoacidos anteriores, este el sustituyente en el heteroatomo (tal como el nitrogeno alfa o el nitrogeno o nitrogenos distales), o en el carbono alfa, en la posicion pro-R, por ejemplo. Los compuestos que sirven como ejemplos ilustrativos incluyen: N-epsilon-isopropil-lisina, 3-(4-tetrahidropiridil)-glicina, 3-(4- tetrahidropiridil)-alanina, N,N-gamma, gamma'-dietil-homoarginina. Se incluyen tambien compuestos tales como alfa metil arginina, acido alfa metil 2,3-diaminopropionico, alfa metil histidina, alfa metil ornitina en los que el grupo alquilo ocupa la posicion pro-R del carbono alfa. Tambien se incluyen las amidas formadas a partir de acidos carboxflicos de alquilo, aromaticos, heteroaromaticos (donde el grupo heteroaromatico tiene uno o mas atomos de nitrogeno, oxfgeno o azufre, individualmente o en combinacion) o cualquiera de los muchos derivados activados bien conocidos tales como cloruros de acido, esteres activos, azolidas activas y derivados relacionados) y lisina, ornitina, o acido 2,3-diaminopropionico.
Sustitucion de aminoacidos de caracter acido: incluyendo acido aspartico, acido glutamico, acido homoglutamico, tirosina, alquil, aril, arilalquil y heteroaril sulfonamidas del acido 2,4-diaminopriopionico, ornitina o lisina y alquil aminoacidos sustituidos con tetrazol.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Sustitucion de restos amida de cadena lateral: incluyendo asparagina, glutamina, y derivados sustituidos con alquilo o aromaticos de asparagina o glutamina.
Sustitucion de aminoacidos que contienen hidroxilo: incluyendo serina, treonina, homoserina, acido 2,3- diaminopropiocico, y derivados de alquilo o aromaticos sustituidos de serina o treonina. Tambien se entiende que los aminoacidos dentro de cada una de las categorfas indicadas anteriormente pueden sustituirse por otro del mismo grupo.
Otro tipo de modificacion es sustituir los enlaces amida dentro de la estructura del polipeptido. Por ejemplo, para reducir o eliminar proteolisis indeseada u otras rutas de degradacion que disminuyen la estabilidad en suero, resultante de la bioactividad reducida o anulada, o limitar o aumentar la flexibilidad conformacional, se pueden sustituir enlaces amida dentro de la estructura de los peptidos con funcionalidad que imita la conformacion existente o altera la conformacion de una manera deseada. Dichas modificaciones pueden producir aumento en la afinidad de union o un comportamiento farmacocinetico mejorado. Se entiende que los expertos en la materia de la sfntesis peptfdica pueden preparar los siguientes cambios de enlaces amida para cualquier enlace amida que conecte los aminoacidos con la esperanza de que los peptidos resultantes puedan tener la misma actividad o mejorada: insercion de alfa-N-metilamidas o tioamidas con estructura basica de amida peptfdica, retirada de carbonilo para producir las aminas secundarias afines, reemplazo de un amino acido con un aza-amino acido para producir derivados de semicarbazona y uso de E-olefinas y E-olefinas sustituidas como supuestos enlaces amida.
Otro enfoque es la introduccion de D-alanina, u otro D-amino acido distal o proximal al enlace peptfdico labil. En este caso, los expertos en la materia tambien entienden que dichas sustituciones de D-amino acido pueden, y algunas veces, deben realizarse, con D-aminoacidos cuyas cadenas laterales son reemplazos no conservativos para aquellas que se reemplazan en un L- amino acido. Esto se debe a la diferencia de quiralidad y, por tanto, a la orientacion de la cadena lateral que podia dar como resultado el acceso de una region previamente inexplorada del sitio de union de la diana que tiene fracciones de carga, hidrofobia, requisitos estericos, etc. diferentes, en comparacion con los ofrecidos por la cadena lateral del L-amino acido reemplazado.
Tambien se entiende que el uso de uno o mas polipeptidos de union a cMet en una aplicacion particular pueden aprovechar las modificaciones del peptido o formulaciones del peptido para mejorar el comportamiento farmacocinetico y farmacodinamico. Se espera que las propiedades del peptido puedan cambiarse por union previa de fracciones que han ocasionado las propiedades qufmicas o ffsicas deseadas. Dichas fracciones pueden anexarse al peptido usando acidos o aminas, mediante enlaces amida o enlaces urea, respectivamente, al extremo N o C del peptido o al grupo amino colgante de una lisina idoneamente localizada o un derivado de lisina, acido 2,3- diaminopropionico, ornitina, u otro amino acido en el peptido que posea un grupo amina colgante o un grupo alcoxiamina o hidrazina colgante. A la inversa, las cadenas laterales de aminoacidos con caracter acido tales como de Asp o Glu pueden no ocultarse selectivamente y amidarse con aminas portadoras de la funcionalidad modificadora deseada o pueden modificarse de esta manera antes de la incorporacion en la cadena peptfdica. Las fracciones introducidas pueden ser grupos que son hidrofilos, basicos, o grupos no polares alquilo o aromaticos dependiendo del peptido de interes y de los requisitos existentes para la modificacion de sus propiedades.
Incluso otra modificacion es la glucosilacion de uno o mas restos de aminoacido (por ejemplo, restos de serina o de treonina) en el polipeptido de union a cMet. La glucosilacion, que puede realizarse usando condiciones convencionales, puede usarse para potenciar la solubilidad, alterar las propiedades farmacocineticas y farmacodinamicas o potenciar la union mediante una interaccion especffica o no especffica que implica la fraccion glucosfdica.
Tambien se contempla formar diferentes sales que puedan aumentar o disminuir la solubilidad en agua o facilitar la formulacion de estos peptidos. Estas pueden incluir, pero sin limitacion, N-metilglucamina (meglumina), acetato, oxalatos, ascorbatos, etc.
Modificaciones estructurales que conservan caracteristicas estructurales
Incluso otra modificacion es el truncamiento de polipeptidos cfclicos. La naturaleza cfclica de muchos polipeptidos limita el espacio conformacional disponible en la secuencia peptfdica, particularmente dentro del ciclo. Por lo tanto el truncamiento del peptido mediante uno o mas restos distales o incluso proximales al ciclo, en la region N terminal o C terminal proporcionarfa peptidos truncados con actividad biologica similar o mejorada. Puede identificarse una sola secuencia de aminoacidos, incluso tan pequena como de tres aminoacidos, que es responsable de la actividad de union, como se observa en los peptidos RGD (Plow, E. et al., 1987. Blood, 70: 110-5; Oldberg, A. et al., 1988. J. Biol. Chem., 263: 19433-19436; Taub, R. et al., 1989. J. Biol. Chem., 264: 259- 65; Andrieux, A. et al., 1989. J. Biol. Chem., 264: 9258-65; y patentes de Estados Unidos n.°. 5.773.412 y 5.759.996).
Tambien se ha observado en la bibliograffa que los ciclos de peptidos grandes pueden acortarse sustancialmente, eliminando aminoacidos extranos, pero incluyendo sustancialmente los restos de union crfticos. Vease, patente de Estados Unidos n.° 5.556.939.
El acortamiento de los peptidos cfclicos puede formarse usando enlaces disulfuro o enlaces amida de grupos de acido carboxflico y grupos amino idoneamente localizados.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Ademas, a la secuencia peptfdica pueden anadirse D-aminoacidos para estabilizar caracterfsticas de giro (especialmente en el caso de la glicina). En otro enfoque, puede emplearse el dipeptido alfa, beta, gamma o delta o imitar el giro (tal como imitar el giro a, p, y o 6), algunos de los cuales se muestran en las FIGS. 1A-1C, para imitar motivos estructurales y caracterfsticas de giro en un peptido y simultaneamente proporcionar estabilidad para la proteolisis y potenciar otras propiedades, tales como, por ejemplo, estabilidad conformacional y solubilidad (estructura 1A: Hart et al., J. Org. Chem., 64, 2998- 2999(1999); estructura 1B: Hanessian et al., "Synthesis of a Versatile Peptidomimetic Scaffold" en Methods in Molecular Medicine, Vol. 23: Peptidomimetics Protocols, W. Kazmierski, Ed. (Humana Press Inc., Totowa, N.J., 1999), capftulo 10, paginas. 161-174; estructura 1C: documento WO 01/16135.
Tambien se desvela la sustitucion de mimeticos de disulfuro para enlaces disulfuro dentro de los peptidos de union a cMet.
Cuando se emplean peptidos que contienen disulfuro en la generacion de agentes radiofarmaceuticos basados en 99mTc u otros agentes radiofarmaceuticos utiles basados en otros isotopos, un problema significativo es la presencia del enlace disulfuro. Por ejemplo, la integridad del enlace disulfuro es diffcil de mantener durante los procedimientos disenados para incorporar 99mTc mediante por rutas basadas en la reduccion del ion pertecnetato y posterior incorporacion de las especies Tc reducidas en sustancias que llevan grupos quelantes especfficos para Tc. Esto se debe a que el enlace disulfuro se reduce muy facilmente mediante agentes reductores normalmente usados en kits disenados para la preparacion en una etapa de agentes radiofarmaceuticos. Por lo tanto, la facilidad con la que puede reducirse el enlace disulfuro durante la quelacion con Tc puede requerir la sustitucion con mimeticos de enlaces disulfuro. Por consiguiente, otra modificacion es sustituir la fraccion disulfuro que imita la utilizacion de los metodos desvelados en el presente documento conocidos por los expertos en la materia, conservando al mismo tiempo la actividad u otras propiedades deseadas de los polipeptidos de union a cMet.
1. ) Enlazador de oxima
Los investigadores han empleado la fraccion de oxima como un enlazador en diversos contextos (Wahl, F.y Mutter, M., 1996. Tetrahedron Lett., 37: 6861-6864). Como se observa en la FIG. 2, los aminoacidos 4, que contienen una funcion aminoalcohol, y 5, que contienen una funcion alcoxiamino, pueden incorporarse en la cadena peptfdica, no necesariamente en el extremo de la cadena peptfdica. Despues de la formacion del peptido, los grupos protectores de la cadena lateral pueden retirarse. Despues, el grupo aldehfdo se desenmascara y se forma un enlace oxima.
2. ) Enlazador de lantionina
Las lantioninas son sulfuros cfclicos, en los que el enlace disulfuro (S-S) se reemplaza por un enlace carbono-azufre (C-S). Por tanto, su labilidad para reducirse es muy baja. Las lantioninas pueden prepararse por diversos metodos que incluyen los analizados a continuacion.
1) Preparacion de lantioninas usando peptidos bromoacetilados
Las lantioninas pueden prepararse facilmente usando metodos conocidos (Robey, F. y Fields, R., 1989. Anal. Biochem., 177: 373-377; Inman, J. et al., 1991. Bioconjug. Chem., 2: 458-463; Ploinsky, A. et al., 1992. J. Med. Chem., 35: 4185-4194; Mayer et al., "Peptides, Frontiers of Peptide Science", en Proceedings of the 15th American Peptide Symposium, Tam y Kaumaya (Eds.), 14-19 junio, 1995, Nashville, Tenn. (Klumer Academic Pub., Boston), pag. 291-292; Wakao et al., Jpn. Kokai Tokyo Koho, JP 07300452 A2 (1995)). La preparacion de peptidos usando sfntesis peptfdica automatizada con Boc seguido por acoplamiento del extremo del peptido con acido bromoacetico proporciona peptidos bromoacetilados con un buen rendimiento. La escision y desproteccion de los peptidos puede realizarse usando HF/anisol. Si el peptido contiene un grupo cistefna su reactividad puede controlarse con un pH bajo. Si el pH del medio se eleva a 6-7, entonces tiene lugar la polimerizacion o la ciclacion del peptido. La polimerizacion se favorece a una concentracion alta (100 mg/ml), mientras que la ciclacion se favorece a concentraciones mas bajas (1 mg/ml), por ejemplo, 6 cicla a 7 (denominado en el presente documento como “esquema 1” como se muestra en la FIG. 3). Inman et al. demostraron el uso de Na-(Boc)-Ne-[N-(bromoacetil)-p- alanil]-L-lisina como un transportador del grupo bromoacetilo que podrfa emplearse en la sfntesis peptfdica con Boc, permitiendo de este modo la colocacion de una fraccion de bromoacetilo en cualquier lado en una secuencia. En experimentos preliminares se descubrio que los peptidos con 4-6 aminoacidos que separan el derivado bromoacetil- lisina de una cistefna tienden a ciclarse, indicando la posible utilidad de esta estrategia.
2) Preparacion de lantioninas mediante la adicion de tiol cistefna a acrilamidas
Pueden implementarse diversas variantes de esta estrategia. La serina unida a resina puede emplearse para preparar el anillo de lantionina en la resina usando una secuencia de bromacion-deshidrobromacion-adicion de tiol o por deshidratacion con carbonato de disuccinimidilo seguido por adicion de tiol. La adicion conjugada de este tiol con acrilamidas se ha mostrado ampliamente y se proporciona una referencia a la adicion de 2-mercaptoetanol a acrilamida (Wakao et al., Jpn. Kokai Tokyo Koho, Jp 07300452 A2, 1995).
3) Enlace diaril eter o diarilamina a partir de ciclacion intramolecular de acidos aril boronicos y tirosina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Se ha descrito la reaccion de acidos arilboronicos con fenoles, aminas y aminas heterocfclicas en presencia de acetato cuprico en el aire a temperature ambiente en diclorometano usando piridina o trietilamina como base para proporcionar diaril eteres no simetricos y las aminas relacionadas con buenos rendimientos (tan altos como 98 %) (Evans, D. et al., 1998. Tetrahedron Lett., 39: 2937-2940; Chan, D. et al., 1998. Tetrahedron Lett., 39: 2933-2936; Lam, P. et al., 1998. Tetrahedron Lett., 39: 2941-2944). En el caso de derivados de tirosina N-protegidos como el componente fenol los rendimientos tambien fueron tan altos como el 98 %. Esto demuestra que las amidas de amino acido (peptidos) se espera que sean estables con respecto a la transformacion y que sus rendimientos sean altos. Antes de que exista una reaccion intramolecular en vista de la facilidad de las ciclaciones intramoleculares de los peptidos con lactamas, la formacion de biaril eteres intramolecular basada en la reaccion de SNAr y la generalidad de reacciones de ciclacion intramoleculares en condiciones de alta dilucion en resina, en las que el efecto de pseudo dilucion imita condiciones de alta dilucion.
4) Formacion de peptidos cfclicos con un enlace de tiazolidina mediante reaccion intramolecular de aldehfdos peptfdicos con fracciones de cistefna
Puede emplearse otro enfoque que implica la ciclacion intramolecular de funciones amino mercaptano localizadas adecuadamente en posicion vecinal (normalmente derivadas de la colocacion de una cistefna en un extremo de la secuencia lineal o conectadas a la secuencia mediante nitrogeno de la cadena lateral de una lisina, por ejemplo) y funciones aldehfdo para proporcionar tiazolidinas que dan como resultado la formacion de un peptido bicfclico, un anillo del cual se forma por los restos en la cadena principal, y siendo un segundo anillo el anillo de tiazolidina. El esquema 2 (FIG. 4) proporciona un ejemplo. La funcion aldehfdo requerida puede generarse mediante escision con metaperyodato de sodio de una funcion aminoalcohol vecinal localizada adecuadamente, que puede estar presente como una serina desprotegida conectada a la cadena mediante un apendice a un grupo amino de la cadena lateral de una fraccion de lisina. En algunos casos, la funcion aldehfdo requerida se genera desenmascarando un derivado aldehfdo protegido en el extremo C o en el extremo N de la cadena (Botti, P. et al., 1996. J. Am. Chem. Soc., 118: 10018-10034).
5) Lactamas basadas en ciclacion intramolecular de grupos amino colgantes con grupos carboxilo en la resina
Pueden prepararse peptidos macrocfclicos mediante formacion de lactama por una ciclacion del grupo colgante o de cabeza a cola. La estrategia basica es preparar un peptido completamente protegido en el que es posible retirar selectivamente un grupo protector de amina y un grupo protector de carboxilo. Se han desarrollado esquemas protectores ortogonales. De estos que se han desarrollado los metodos de alilo, tritilo y Dde son los que mas se han empleado (Mellor et al., “Synthesis of Modified Peptides”, en Fmoc Solid Phase Synthesis: A Practical Approach, White y Chan (eds) (Oxford University Press, Nueva York, 2000), capftulo. 6, pag. 169-178). El enfoque Dde es de interes porque utiliza grupos protectores similares para la funcion del acido carboxflico (ester Dmab) y el grupo amino (grupo Dde). Ambos se retiran con hidrazina al 2-10 % en DMF a temperatura ambiente. Como alternativa puede usarse Dde para el grupo amino y el grupo alilo puede usarse para el carboxilo.
Una funcion lactama, disponible por acoplamiento intramolecular a traves de reactivos de acoplamiento peptfdicos convencionales (tales como HATu, PyBOP, etc.) puede actuar como un sustituto para el enlace disulfuro. La estrategia Dde/Dmab se muestra en el Esquema 3 (FIG. 5).
Por tanto, una secuencia lineal que contiene, por ejemplo, la lisina desprotegida Dde y el ester Dmab puede prepararse en una resina de amida Rink basada en Tentagel a una baja carga (~0,1-0,2 mmol/g). La desproteccion de ambas funciones con hidrazina se realiza despues por ciclacion sobre resina para dar los productos deseados. Posteriormente, tambien puede realizarse la escision de la resina y la purificacion. Por funcionalizacion del extremo N del peptido se entiende que los diaminoacidos tales como acido trans-4-(iv-Dde) metilaminociclohexano carboxflico o acido 4-(iv- Dde) metilamino benzoico serfan necesarios. Un escenario alternativo es emplear el metodo de captacion segura para la formacion de lactama intramolecular durante la escision de la resina.
6) Peptidos cfclicos basados en metatesis oleffnica
La reaccion de Grubbs (Esquema 4, FIG. 6) implica la metatesis/ciclacion de enlaces olefina (Schuster et al., 1997. Angew. Chem. Int. Edn Engl., 36: 2036-2056; Miller et al., 1996. J. Am. Chem. Soc., 118: 9606-9614). Se ha observado facilmente que si el material de partida es una diolefina 16 el producto resultante sera un compuesto cfclico 17. La reaccion se ha aplicado a la creacion de ciclos a partir de peptidos de olefina funcionalizados (Pernerstorfer et al., 1997. Chem. Commun., 20: 1949-50; Clark et al., 1999. Chem. Eur. J., 5: 782-792; Blackwell et al., 1998 Angew. Chem. Int. Ed., 37: 3281-3284; Ripka, A. et al., 1998. Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 357-360; Miller et al., 1996. J. Am. Chem. Soc., 118: 9606-9614; Clark et al., 1995. J. Am. Chem. Soc., 117: 12364-12365; Miller et al., 1995. J. Am. Chem. Soc., 117: 5855-5856). Se puede preparar cualquier amino acido C-alilado o posiblemente amino acido N-alilado y emplearlos en esta reaccion para preparar peptidos cfclicos con puentes con el grupo carba como sustitutos de peptidos que contienen enlaces disulfuro.
Tambien se pueden preparar nuevos compuestos con grupos oleffnicos. La funcionalizacion de la tirosina hidroxilo con una conexion que contiene olefina es una opcion. El grupo £-amino lisina es otra opcion cuando hay un apendice de la unidad que contiene olefina como parte de una fraccion acilante, por ejemplo. Si en vez de que el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
grupo amino de la cadena lateral de lisina este alquilado con una conexion que contiene olefina, este puede aun funcionar como un punto de union para un indicador tambien. El uso de acido 5-pentenoico como un agente acilante para los grupos amino de cadena lateral de lisina, ornitina o diaminopropionico es otra posibilidad. La longitud de la conexion que contiene olefina tambien puede variarse para explorar las relaciones de actividad estructural.
Otras modificaciones incluyen manipulaciones de las secuencias peptfdicas, que puede esperarse que produzcan peptidos con propiedades biologicas similares o mejoradas. Estas incluyen traslocaciones de amino acidos (intercambiando amino acidos en la secuencia), usando peptidos retroinversos en lugar de la secuencia original o una secuencia original modificada, peptoides y secuencias peptoides retroinversas. Se esperan tambien estructuras en las que los restos especfficos son peptoides en lugar de peptfdicos, que dan como resultado moleculas hfbridas, ni completamente peptfdicas ni completamente peptoides.
Enlazadores
Adicionalmente, las modificaciones incluyen la introduccion de enlazadores o espaciadores entre la secuencia diana de la fraccion de union o polipeptido de union y el marcador detectable. Por ejemplo, el uso de dichos enlazadores/espaciadores puede mejorar las propiedades relevantes de los peptidos de union (por ejemplo, aumentar la estabilidad en suero, etc.). Estos enlazadores pueden incluir, pero no estan limitados a, cadenas de alquilo sustituido o no sustituido, derivados de polietilenglicol, espaciadores de amino acidos, azucares o espaciadores alifaticos o aromaticos comunes en la tecnica.
Por ejemplo, los enlazadores adecuados incluyen moleculas reticulantes homobifuncionales y heterobifuncionales. Las moleculas homobifuncionales tienen al menos dos grupos funcionales reactivos que son iguales. Los grupos funcionales reactivos en una molecula homobifuncional incluyen, por ejemplo, grupos aldehfdo y grupos ester activos. Las moleculas homobifuncionales tienen grupos aldehfdo que incluyen, por ejemplo, glutaraldehido y subaraldehido.
Las moleculas enlazadoras homobifuncionales tienen al menos dos unidades ester activas que incluyen esteres de acidos dicarboxflicos y N-hidrocisucinimida. Algunos ejemplos de dichos esteres de N-sucinimida incluyen disucinimidil suberato y ditio-bis-(sucinimidil propionato), y sus acidos bis-sulfonicos solubles y sales bis-sulfonato como sus sales de sodio y potasio.
Las moleculas enlazadoras heterobifuncionales tienen al menos dos grupos reactivos diferentes. Algunos ejemplos de reactivos heterobifuncionales contienen enlaces disulfuro reactivos que incluyen N-sucinimidil 3-(2-piridil-ditio) propionato (Carlsson et al., 1978. Biochem. J., 173:723-737), S-4-sucinimidiloxicarbonil-alfa-metilbenciltiosulfato de sodio, y 4-sucinimidiloxicarbonil-alfa-metil-(2-piridilditio)tolueno. Se prefiere N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato. Algunos ejemplos de reactivos heterobifuncionales comprenden grupos reactivos que tienen un doble enlace que reaccionan con un grupo tiol incluyen sucinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato y sucinimidil m- maleimifobenzoato. Otras moleculas heterobifuncionales incluyen sucinimidil 3-(maleimido) propionato, sulfosucinimidil 4-(p-maleimido-fenil) butirato, sulfosucinimidil 4-(N-maleimidometil-ciclohexano)-1-carboxilato, maleimidobenzoil-5N-hidroxi-sucinimida ester.
Ademas, los enlazadores que son combinaciones de las moleculas y/o fracciones descritas anteriormente, tambien pueden emplearse para aprovechar en especial las propiedades del peptido. Las moleculas lipfdicas con enlazadores pueden unirse para permitir la formulacion de burbujas ultrasonicas, liposomas u otras construcciones basadas en agregacion. Dichas construcciones podrfan emplearse como agentes para dirigir y administrar un indicador de diagnostico.
Tambien se contemplan construcciones que emplean dfmeros, multfmeros o polfmeros de uno o mas polipeptidos de union a cMet. De hecho, existen gran cantidad de pruebas en la literatura de que la union de peptidos de baja potencia o moleculas pequenas puede aumentarse sustancialmente mediante la formacion de dfmeros y multfmeros. Por tanto, se contemplan construcciones dimericas y multimericas (tanto homogeneas como heterogeneas). Las secuencias polipeptfdicas de las construcciones dimericas pueden unirse en sus extremos N o C o en el nitrogeno N-epsilon de un resto de lisina situado de forma adecuada (u otra funcion que porte un grupo derivatizable de forma selectiva tal como un oxiamino u otro grupo nucleofilo lateral) o pueden unirse entre sf por medio de uno o mas enlazadores (por ejemplo, los analizados en el presente documento) empleando la qufmica de union adecuada. Esta qufmica de acoplamiento puede incluir amida, urea, tiourea, oxima o aminoacetilamida (de derivados de cloro o bromoacetamida, pero sin limitarse a ellos). Por ejemplo, los procedimientos para preparar construcciones dimericas o multimericas de polipeptidos de union a cMet de la invencion incluyen al menos los analizados a continuacion.
Procedimiento A
Los peptidos de union a cMet totalmente protegidos pueden construirse sobre resina de captura de seguridad de tipo Ellman usando protocolos de sfntesis peptfdica Fmoc automaticos o manuales (Backes y otros, 1996. J. Am. Chem. Soc, 118:3055-56). Por separado, puede construirse un derivado de dilisina en resina de 2-clorotritilo usando procedimientos estandar conocidos en la tecnica de la sfntesis peptfdica (Fields y otros, "Principles and Practice of Solid Phase Synthesis" en Synthetic Peptides, A Users Guide, Grant, Ed. (W.H. Freeman Co., Nueva York, 1992), cap. 3, pag. 77-183; Barlos y otros, "Convergent Peptide Synthesis" en Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
W.C. y White, P.D., Ed. (Oxford University Press, Nueva York, 2000), cap. 9, pag. 215-228). Su liberacion de la resina de 2-clorotritilo sin la eliminacion de los grupos protectores de la cadena lateral, la activacion del grupo carboxilo y el acoplamiento a cualquier grupo marcador funcionalizado con amina proporciona un derivado de dilisina cuyos atomos de nitrogeno laterales protegidos pueden desenmascararse para dar dos grupos amino libres. La resina de captura de seguridad mencionada anteriormente se activa y el derivado de dilisina funcionalizado con un grupo marcador con el N desprotegido deseado se anade a la resina de captura de seguridad activada. Los grupos amino laterales se acilan por medio del extremo carboxilo del peptido unido a la resina de captura de seguridad, que se separa ahora de la resina y representa una parte integral de la estructura de dilisina. Puede emplearse un exceso del peptido unido a la resina de captura de seguridad para asegurar la reaccion completa de los grupos amino de la construccion de dilisina. La optimizacion de la proporcion de los companeros de reaccion en este esquema optimiza el rendimiento. Los grupos protectores de los peptidos de union a cMet se eliminan empleando protocolos de escision a base de acido trifluoroacetico.
La sfntesis de construcciones dimericas y multimericas en las que dos o mas peptidos de union a cMet estan presentes en una construccion se logra facilmente. Pueden emplearse esquemas de proteccion ortogonal (tales como un grupo aliloxicarbonilo en un nitrogeno y un grupo Fmoc en el otro, o emplear el grupo Fmoc conjuntamente con el grupo protector iV-Dde en el otro, por ejemplo) para distinguir los atomos de nitrogeno laterales de los derivados de dilisina descritos anteriormente. El desenmascaramiento de uno de los grupos amino, seguido por la reaccion del producto resultante con un peptido de union a cMet unido a una resina de captura de seguridad activada como se describe anteriormente proporciona una construccion de dilisina con un unico peptido de union a cMet unido. La eliminacion del segundo grupo protector desenmascara el nitrogeno que queda (Mellor y otros, "Synthesis of Modified Peptides" en Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. y White, P.D., Ed. (Oxford University Press, Nueva York, 2000), cap. 6, pag. 169-176). El producto resultante puede hacerse reaccionar con una segunda resina de captura de seguridad que porta otro peptido de union a cMet para proporcionar una construccion homodimerica totalmente protegida, que despues de la eliminacion de los grupos protectores con acido trifluoroacetico proporciona el material deseado.
Procedimiento B
Se ensambla un peptido de union a cMet en una resina de amida Rink mediante procedimientos de acoplamiento de peptidos automaticos o manuales, habitualmente empleando protocolos de sfntesis peptfdica Fmoc. El peptido puede poseer un extremo C o un extremo N funcionalizado con un enlazador o una construccion de enlazador-grupo marcador que puede poseer un grupo nucleofilo adicional tal como el grupo e-amino de un resto de lisina, por ejemplo. La escision de los grupos protectores se logra empleando acido trifluoroacetico con modificadores adecuados en funcion de la naturaleza del peptido. El peptido totalmente desprotegido se hace reaccionar entonces con un gran exceso de un electrofilo bifuncional tal como el ester de bis-N-hidroxisuccinimida del acido glutarico comercialmente disponible (Tyger Scientific, Inc., Princeton, NJ). El ester de mono-N-hidroxisuccinimidilo del acido glutarico monoamidado resultante se trata despues con un equivalente adicional del mismo peptido o un equivalente de un peptido de union a cMet diferente. La purificacion del material resultante por HPLC proporciona la construccion homodimerica deseada que porta un grupo marcador adecuado.
Procedimiento C
Puede emplearse un esquema modular para preparar construcciones dimericas o multimericas superiores que portan grupos marcadores adecuados como se definen anteriormente. En una ilustracion sencilla, la resina de amida Rink de fmoc-lisina(iV-Dde) se trata con piperidina para eliminar el resto fmoc. Despues, se acopla una funcion marcadora, tal como biotina, 5-carboxifluorescefna o N,N-dimetil-Gly-Ser(O-t-Bu)-Cys(Acm)-Gly-OH, al atomo de nitrogeno. A continuacion, la resina se trata con hidrazina para eliminar el grupo iV-Dde. Despues de lavarla exhaustivamente, la resina se trata con cloruro cianurico y se une a la resina una base impedida tal como diisopropiletilamina en un disolvente adecuado tal como DMF, NMP o diclorometano para proporcionar una diclorotriazina monofuncionalizada unida a la resina. El desplazamiento sucesivo subsiguiente de los atomos de cloro restantes mediante dos equivalentes de un peptido de union a cMet proporciona una construccion homodimerica funcionalizada con un grupo marcador unida a la resina (Falorni, M. y otros, 1998. Tetrahedron Lett., 39:7607-7610; Johnson, C. y otros, 1998. Tetrahedron, 54:4097-4106; Stankova, M. y Lebl, M., 1996. Mol. Divers., 2:75-80). Los peptidos de entrada pueden estar protegidos o desprotegidos, segun requiera la situacion. La escision de grupos protectores se logra empleando reactivos de desproteccion a base de acido trifluoroacetico como se describe anteriormente y los materiales deseados se purifican mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento.
Se entiende que en cada uno de estos procedimientos pueden emplearse los derivados de lisina en serie para aumentar la multiplicidad de los multfmeros. El uso de moleculas mas rfgidas, relacionadas, que portan el numero necesario de atomos de nitrogeno ortogonalmente protegidos o enmascarados para que actuen como armazones para variar la distancia entre los peptidos de union a cMet, para aumentar la rigidez de la construccion (restringiendo el movimiento y las posiciones relativas de los peptidos de union a cMet unos con respecto a otros y al marcador) esta totalmente dentro del alcance de los procedimientos A-C y todos los demas procedimientos descritos en el presente documento.
Las fracciones de union a cMet como se define en las reivindicaciones (por ejemplo, polipeptidos y construcciones
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
polipeptfdicas multimericas) son utiles para la deteccion y/o formacion de imagenes de cMet in vivo, y particularmente para la deteccion y/o formacion de imagenes de sitios de angiogenesis, en las que HGF y cMet estan fntimamente implicados, como se explica en el presente documento.
In vivo
Formacion de imagenes de diagnostico
Un uso particularmente preferido para los polipeptidos y construcciones polipeptfdicas multimericas de acuerdo con la presente invencion como se define en las reivindicaciones es crear imagenes visualmente legibles de tejidos que expresan cMet, tales como, por ejemplo, tumores neoplasicos, que presentan hiperproliferacion. Los polipeptidos de union a cMet y construcciones polipeptfdicas multimericas desveladas en el presente documento y como se define en las reivindicaciones pueden transformarse en reactivos de formacion de imagenes conjugando los polipeptidos con un marcador apropiado para la deteccion de diagnostico, opcionalmente mediante un enlazador. Preferentemente, un peptido o construcciones polipeptfdicas multimericas, que presentan una especificidad mucho mas elevada por cMet o HGF/cMet que por otras protefnas en suero, se conjugan o se ligan con un marcador apropiado para la metodologfa de deteccion a emplear. Por ejemplo, el polipeptido que se une al complejo HGF/cMet o a cMet puede conjugarse con o sin un enlazador a un quelato paramagnetico adecuado para formacion de imagenes por resonancia magnetica (MRI), con un radiomarcador adecuado para rayos X, tomograffa de emision de positrones (PET) o formacion de imagenes escintigraficas (incluyendo un quelante para un metal radiactivo) con un agente de contraste de ultrasonidos (por ejemplo, una microburbuja estabilizada, un microglobo, una microesfera o lo que se denomina “Nposoma” cargado con gas) adecuado para la deteccion por ultrasonidos, o con un colorante optico de formacion de imagenes.
Los enlazadores adecuados pueden incluir los indicados en el presente documento, incluyendo cadenas de alquilo sustituido o no sustituido, cadenas de amino acidos (por ejemplo poliglicina), polietilenglicoles, poliamidas y otros enlazadores conocidos en la tecnica.
En general, la tecnica de usar una fraccion de union a cMet marcada detectable se basa en la premisa de que el marcador genera una senal que es detectable fuera del cuerpo del paciente. Por ejemplo, cuando la fraccion de union a cMet marcada de manera detectable se administra al paciente en el que es deseable detectar, por ejemplo, la hiperproliferacion, la alta afinidad de la fraccion de union a cMet por cMet causa que la fraccion de union se una al sitio de hiperproliferacion y acumule el marcador en el sitio. Se permite un tiempo suficiente para que la fraccion de union marcada se localice en el sitio de proliferacion. La senal generada por el peptido marcado se detecta mediante un dispositivo de exploracion que variara de acuerdo con el tipo de marcador usado, y la senal se convierte despues en una imagen del sitio de proliferacion.
En otra realizacion, en lugar de marcar directamente un polipeptido de union a cMet o una construccion polipeptfdica multimerica con un marcador detectable o una construccion radioterapeutica, pueden conjugarse uno o mas peptidos o construcciones como se define en las reivindicaciones, por ejemplo con avidina, biotina o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se unira al marcador detectable o radioterapeutico. Por ejemplo, uno o mas peptidos de union a cMet pueden conjugarse con estreptavidina (posiblemente generando una union multivalente) para la union in vivo a celulas que expresan cMet. Despues de que la construccion de direccionamiento no unida se elimine del cuerpo, puede infundirse un marcador detectable biotinilado o una construccion radioterapeutica (por ejemplo, una molecula de quelato complejada con un metal radioactivo) y rapidamente se concentra en el lugar donde se une la construccion de direccionamiento. Este enfoque, en algunas situaciones puede reducir el tiempo necesario despues de administrar el marcador detectable despues de que tenga lugar la formacion de la imagen. Tambien puede aumentar la senal de la proporcion de interferencia en el sitio diana, al disminuir la dosis del marcador detectable o la construccion radioterapeutica requerida. Esto es particularmente util cuando se usa un marcador radiactivo o un agente radioterapeutico a medida que se disminuye la dosis de radiacion que se administra a sitios de radiosensibilidad normales en el organismo, tal como, medula osea, rinones e hfgado. Este enfoque, en ocasiones denominado enfoque de pre-direccionamiento o de dos etapas o de tres etapas, se revisa en S. F. Rosebrough en Q. J. Nucl. Med., 40: 234-251 (1996).
A. Formacion de imagenes por resonancia magnetica
Las fracciones de union a cMet como se define en las reivindicaciones pueden conjugarse ventajosamente con un quelato metalico paramagnetico para formar un agente de contraste para su uso en MRI. Los iones metalicos paramagneticos preferidos tienen numeros atomicos 21-29, 42, 44 o 57-83. Esto incluye iones de las series de metales de transicion o lantanidos que tienen uno, y mas preferentemente cinco o mas, electrones no apareados y un momento magnetico de al menos 1,7 magnetones de Bohr. Los metales paramagneticos preferidos incluyen, pero sin limitacion, cromo (III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro (III), cobalto (II), nfquel (II), aluminio (II), praseodimio (III), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio (III) e iterbio (III), cromio (III), hierro (III) y gadolinio (III). El cation trivalente, Gd3+, se prefiere particularmente para agentes de contraste MRI, debido a su alta tasa de relajacion y baja toxicidad, con la ventaja adicional de que existe solamente en un estado de oxidacion biologicamente accesible, lo que minimiza la metabolisis indeseada de los metales por un paciente. Otro metal util es Cr, que es relativamente asequible. Los quelatos de Gd(III) se han
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
usado para aplicaciones MR radiologicas y clfnicas desde 1988, y aproximadamente el 30 % de los examenes MR normalmente emplean un agente de contraste basado en gadolinio.
El medico tratante seleccionara un metal de acuerdo con la dosis necesaria para detectar la proliferacion celular y considerar otros factores tales como toxicidad del metal contra el sujeto. Vease, Tweedle et al., Magnetic Resonance Imaging (2a ed.), vol. 1, Partain et al., Eds. (W.B. Saunders Co. 1988) pag. 796-797. Generalmente, la dosis deseada de un metal individual sera proporcional a su tasa de relajacion, modificada por la biodistribucion, farmacocinetica y metabolismo del metal.
El quelante metalico paramagnetico es una molecula que tiene uno o mas grupos polares que actuan como ligando para, y se complejan con, un metal paramagnetico. Los quelantes adecuados se conocen en la tecnica e incluyen acidos con grupos de metilen fosfonico, grupos acido metilen carbohidroxamina, grupos carboxietilideno, o grupos carboximetileno. Los ejemplos de quelantes incluyen, pero sin limitacion, acido dietilentriaminopentaacetico (DTpA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclo-tetradecan-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), 1,4,7-tricarboximetil-1,4,7,10-tetra- azaciclododecano 1 -sustituido (DO3A), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) y acido 1,4,8,11-tetra- azaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacetico (TETA). Los ligandos quelantes adicionales son etilen bis-(2-hidroxi- fenilglicina) (EHPG) y derivados de los mismos, incluyendo 5-Cl-EHPG, 5-Br-EHPG, 5-Me-EHPG, 5-t-Bu-EHPG y 5- sec-Bu-EHPG; acido benzodietilentriamina pentaacetico (benzo-DTPA) y derivados del mismo, incluyendo dibenzo- DTPA, fenil-DTPA, difenil-DTPA, bencil-DTPA y dibencil DTPA; acido bis-2 (hidroxibencil)-etilen-diaminodiacetico (HBED) y derivados del mismo; la clase de compuestos macrocfclicos que contienen al menos 3 atomos de carbono, mas preferentemente al menos 6, y al menos dos heteroatomos (O y/o N), con compuestos macrocfclicos pueden consistir en un anillo, o dos o tres anillos unidos entre si y a los elementos anulares del mismo, por ejemplo, benzo- DOTA, dibenzo-DOTA y benzo-NOTA, donde NOTA es acido 1,4,7-triazaciclononano N,N',N"-triacetico, benzo- TETA, benzo-DOTMA, donde DOTMA es acido 1,4,7,10-tetraazaciclotetradecan-1,4,7,10-tetra(metil tetraacetico) y benzo-TETMA, donde TETMA es 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-(acido metil tetraacetico); derivados de acido 1,3-propilen-diaminotetraacetico (PDTA) y acido trietilentetraaminohexaacetico (TTHA); derivados de 1,5,10?N,N',N"-tris(2,3-dihidroxibenzoil)-tricatecolato (LICAM); y 1,3,5-N,N',N"-tris(2,3-dihidroxibenzoil)
aminometilbenceno (MECAM). Un quelante preferido para su uso en la presente invencion es DTPA, y se prefiere particularmente el uso de DO3A. En los documentos WO 98/18496, WO 86/06605, WO 91/03200, WO 95/28179, WO 96/23526, WO 97/36619, PCT/US98/01473, PCT/US98/20182 y US 4.899.755, US 5.474.756, US 5.846.519 y US 6.143.274 se describen ejemplos de quelantes representativos y grupos quelantes contemplados por la presente invencion.
De acuerdo con la presente invencion, el quelante del agente de contraste MRI se acopla al polipeptido de union a cMet. El posicionamiento del quelante debe seleccionarse para no interferir con la afinidad de union o especificidad del polipeptido de union a cMet. Preferentemente, el quelante se anexara bien en el extremo N o en el extremo C, sin embargo el quelante tambien puede unirse en cualquier sitio dentro de la secuencia. En realizaciones preferidas, un quelante que tiene un grupo de acido carboxflico central libre (por ejemplo, DTPA-Asp(P-COOH)-)OtBu) hace facil su union en el extremo N del peptido por la formacion de un enlace amida. El quelante tambien puede unirse al extremo C con la ayuda de un enlazador. Como alternativa, puede emplearse qufmica de conjugacion con isotiocianato como una manera para unir el grupo isotiocianato apropiado portador de DTPA a un grupo amino libre en cualquier lado dentro de la secuencia peptfdica.
En general, la fraccion de union a cMet puede unirse directa o covalentemente al quelante metalico (u otro marcador detectable) o este puede acoplarse o conjugarse al quelante metalico usando un enlazador, que puede ser, sin limitacion, amida, urea, acetal, cetal, ester doble, carbonilo, carbamato, tiourea, sulfona, tioester, ester, eter, disulfuro, lactona, imina, fosforilo, o enlaces fosfodiester; cadenas de alquilo sustituido o no sustituido saturado o insaturado; cadenas de aminoacidos lineales, ramificadas o cfclicas de un solo aminoacido o de diferentes aminoacidos (por ejemplo, extensiones del extremo N o C de la fraccion de union a cMet); polietilenglicoles (PEG) derivatizados o no derivatizados, cadenas de polioxietileno o polivinilpiridina; cadenas de poliamidas sustituidas o no sustituidas; poliamina derivatizada o no derivatizada, poliester, polietilenimina, poliacrilato, alcohol (polivinflico), poliglicerol o cadenas de oligosacarido (por ejemplo, dextrano); copolfmeros de bloques alternos; acidos malonico, succfnico, glutarico, adfpico y pimelico; acido caproico; diaminas y dialcoholes simples; cualquiera de los otros enlazadores desvelados en el presente documento; o cualquier otro enlazador polimerico simple conocido en la tecnica (veanse, por ejemplo, los documentos WO 98/18497 y WO 98/18496). Preferentemente, el peso molecular del enlazador se controlara estrechamente. El tamano de los pesos moleculares puede variar de menos de 100 a 1000. Preferentemente, el peso molecular del enlazador es menor de 100. Ademas, puede ser deseable utilizar un enlazador que sea biodegradable in vivo para proporcionar vfas eficientes de excrecion para los reactivos formadores de imagenes para su uso en la presente invencion como se define en las reivindicaciones. Dependiendo de su localizacion dentro del enlazador, dichas funcionalidades biodegradables pueden incluir funcionalidades ester, doble ester, amida, fosfoester, eter, acetal y cetal.
En general, pueden usarse metodos conocidos para acoplar el quelante metalico y la fraccion de union a cMet usando dichos enlazadores (documentos WO 95/28967, WO 98/18496, WO 98/18497 y las discusiones en los mismos). La fraccion de union a cMet puede ligarse a traves de un extremo N o C mediante un enlace amida, por ejemplo, con un metal que coordina una estructura de nitrogeno de un quelante metalico o a un brazo de acetato del propio quelante metalico. La presente divulgacion contempla la union del quelante en cualquier posicion, siempre
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
que el quelante metalico conserve la capacidad de unirse al metal estrechamente para minimizar la toxicidad. De manera similar, la fraccion de union a cMet puede modificarse o alargarse para generar una localizacion para la union a un quelante metalico, siempre y cuando dicha modificacion o alargamiento no elimine su capacidad de unirse a cMet.
Los reactivos de contraste MRI preparados de acuerdo con la divulgacion del presente documento pueden usarse de la misma que los reactivos de contraste MRI convencionales. Cuando se realiza la formacion de imagenes de un sitio de hiperproliferacion, por ejemplo, pueden preferirse determinadas tecnicas MR y secuencias de pulso para potenciar el contraste del sitio en la sangre y tejidos de fondo. Estas tecnicas incluyen (pero sin limitacion), por ejemplo, secuencias de angiograffa con sangre negra, que pretenden oscurecer la sangre, tales como secuencias spin eco rapidas (Alexander, A. et al., 1998, Magn. Reson. Med., 40: 298-310) y secuencias gradiente eco de flujo deteriorado (Edelman, R. et al., 1990, Radiology, 177:45-50). Estos metodos tambien incluyen tecnicas independientes de flujo que potencian la diferencia de contraste, tales como secuencias preparadas para recuperacion por inversion o para recuperacion por saturacion, que aumentaran el contraste entre el tumor angiogenico y los tejidos de fondo. Finalmente, las preparaciones de transferencia de magnetizacion tambien pueden mejorar el contraste con estos agentes (Goodrich, K. et al., 1996. Invest. Radiol., 31:323-32).
El reactivo marcado se administra al paciente en forma de una composicion inyectable, preferentemente por via parenteral, lo que significa por via intravenosa, intraarterial, intratecal, intersticial o intracavital. Para la formacion de imagenes activas de angiogenesis, se prefiere la administracion intravenosa o intraarterial. Para MRI, se contempla que el sujeto reciba una dosificacion de agente de contraste suficiente para potenciar la senal MR en el sitio de la angiogenesis al menos 10 %. Despues de la inyeccion con el reactivo MRI que contiene la fraccion de union a cMet, al paciente se le realiza un escaner en el aparato MRI para determinar la localizacion de cualquier sitio de hiperproliferacion. En entornos terapeuticos, despues de la identificacion de un sitio de hiperproliferacion (por ejemplo, tumor), puede administrarse inmediatamente un agente tumoricida o un agente anti-hfperproliferativo (por ejemplo, inhibidores de HGF), si fuera necesario y al paciente posteriormente se le puede realizar un escaner para visualizar la regresion del tumor o la detencion de la angiogenesis.
B. Formacion de imagenes por ultrasonido
Cuando el ultrasonido se transmite a traves de una sustancia, las propiedades acusticas de la sustancia dependeran de la velocidad de las transmisiones y de la densidad de la sustancia. Los cambios en las propiedades acusticas seran mas acentuados en la interfaz de diferentes sustancias (solidos, lfquidos, gases). Los agentes de contraste de ultrasonido son reflectantes de ondas de sonido intensas debido a las diferentes acusticas entre el agente y el tejido circundante. Los agentes de contraste de ultrasonido que generan gas o que contienen gas son particularmente utiles debido a la diferencia acustica entre el lfquido (por ejemplo, sangre) y el agente de contraste de ultrasonido que genera gas o que contiene gas. Debido a su tamano, los agentes de contraste de ultrasonido comprenden microburbujas, microglobos y similares pueden permanecer durante mas tiempo en la corriente sangufnea despues de la inyeccion en comparacion con otras fracciones detectables; un agente de ultrasonido especffico de cMet dirigido, podrfa, por lo tanto, demostrar una formacion de imagenes superior de sitios de hiperproliferacion (por ejemplo, cancer) y angiogenesis.
En este aspecto de la invencion, la fraccion de union a cMet como se define en las reivindicaciones puede unirse a un material que es util para la formacion de imagenes por ultrasonidos. Por ejemplo, una o mas construcciones polipeptfdicas multimericas o polipeptidos de union a cMet, como se define en las reivindicaciones, pueden unirse a materiales empleados para formar vesfculas (por ejemplo, microburbujas, microglobos, microesferas, etc.) o emulsiones que contienen un lfquido o un gas, que funciona como marcador detectable (por ejemplo, un gas ecogenico o un material capaz de generar un gas ecogenico). Los materiales para la preparacion de dichas vesfculas incluyen tensioactivos, lfpidos, esfingolfpidos, oligolfpidos, fosfolfpidos, protefnas, polipeptidos, hidratos de carbono y materiales polimericos sinteticos o naturales (documentos WO 98/53857, WO 98/18498, WO 98/18495, WO 98/18497, WO 98/18496 y WO 98/18501).
Para los agentes de contraste que comprenden suspensiones de microburbujas estabilizadas (una realizacion preferida), se prefieren fosfolfpidos, y particularmente fosfolfpidos saturados. Como ejemplos de fosfolfpidos adecuados se incluyen esteres de glicerol con una o dos (iguales o diferentes) moleculas de acidos grasos y con acido fosforico, en los que el resto acido fosforico esta a su vez unido a un grupo hidrofilo, tal como colina, serina, inositol, glicerol, etanolamina y grupos similares. Los acidos grasos presentes en los fosfolfpidos son en general acidos alifaticos de cadena larga, que tfpicamente contienen de 12 a 24 atomos de carbono, preferentemente de 14 a 22, que pueden estar saturados o pueden contener una o mas instauraciones. Son ejemplos de acidos grasos adecuados acido laurico, acido mirfstico, acido palmftico, acido estearico, acido araquidonico, acido behenico, acido oleico, acido linoleico y acido linolenico. En la tecnica tambien se conocen monoesteres de fosfolfpidos como formas “liso” de los fosfolfpidos. Son ejemplos adicionales de fosfolfpidos los acidos fosfatfdicos, es decir, los diesteres de acido glicerol-fosforico con acidos grasos, esfingomielinas, es decir, los analogos de fosfatidilcolina en los que el resto del glicerol diester con acidos grasos esta reemplazado por una cadena de ceramida, cardiolipinas, es decir, los esteres de 1,3-difosfatidilglicerol con un acido graso, gangliosidos, cerebrosidos, etc.
Como se usa en el presente documento, el termino “fosfolfpidos” incluye productos de origen natural, semisinteticos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
o preparados sinteticamente que pueden emplearse individualmente o como mezclas.
Los ejemplos de fosfolfpidos de origen natural son lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)) tales como, tfpicamente, semilla de soja o lecitinas de yema de huevo. Los ejemplos de fosfolfpidos semisinteticos son los derivados parcial o completamente hidrogenados de las lecitinas de origen natural.
Los ejemplos de fosfolfpidos sinteticos son, por ejemplo, dilauriloil-fosfatidilcolina (“DLPC”), dimiristoil-fosfatidilcolina (“DMpC”), dipalmitoil-fosfatidilcolina (“DPPC”), diaraquidoilfosfatidilcolina (“DAPC”), distearoil-fosfatidilcolina (“DSPC”), 1 -miristoil-2-palmiltoilfosfatidilcolina (“MpPC”), 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina (“PMCP”), 1 -palmitoil-2- estearoilfosfatidilcolina (“PSPC”), 1 -estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (“SPPC”), dioleoilfosfatidilcolina (“DOPC”), 1-2 distearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dilauriloil-fosfatidilglicerol (“DLPG”) y sus sales metalicas alcalinas, diaraquidoilfosfatidilglicerol (“DAPG”) y sus sales metalicas alcalinas, dimiristoilfosfatidilglicerol (“DMPG”) y sus sales metalicas alcalinas, dipalmitoilfosfatidilglicerol (“DPPG”) y sus sales metalicas alcalinas, distearoilfosfatidilglicerol (“DSPG”) y sus sales metalicas alcalinas, dioleoilfosfatidilglicerol (“DOPG”) y sus sales metalicas alcalinas, acido dimiristoil fosfatidico (“DMPA”) y sus sales metalicas alcalinas, acido dipalmitoil fosfatfdico (“DPPA”) y sus sales metalicas alcalinas, acido distearoil fosfatfdico (“DSPA”), acido diaraquidoil fosfatidico (“DAPA”) y sus sales metalicas alcalinas, dimiristoil fosfatidil-etanolamina (“DMPE”), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (“DPPE”), distearoil fosfatidil-etanolamina (“DSPE”), dimiristoil fosfatidilserina (“DMPS”), diaraquidoil fosfatidilserina (“DAPS”), dipalmitoil fosfatidilserina (“DPPS”), distearoilfosfatidilserina (“DSPS”), dioleoilfosfatidilserina (“DOPS”), dipalmitoil esfingomielina (“DPSP”) y distearoil esfingomielina (“DSSP”). En una realizacion preferida, al menos una de las fracciones de fosfolfpido tiene la estructura mostrada en las FIGS. 7A o 7B, y se describe en el documento US 5.686.060.
Otros fosfolfpidos preferidos incluyen dipalmitoilfosfatidilcolina, acido dipamiltoilfosfatidico y
dipalmitoilfosfoatidilserina. Las composiciones tambien pueden contener PEG-4000 y/o acido palmftico. Puede emplearse cualquiera de los gases desvelados en el presente documento o conocidos por el experto en la materia; sin embargo, se prefieren los gases inertes, tales como SF6 o fluorocarbonos como CF4, C3F8 y C4F10.
Las microburbujas llenas de gas preferidas pueden prepararse por medios conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, por un metodo descrito en una cualquiera de las siguientes patentes: EP 554213, US 5.413.774, US
5.578.292, EP 744962, EP 682530, US 5.556.610, US 5.846.518, US 6.183.725, EP 474833, US 5.271.928, US
5.380.519, US 5.531.980, US 5.567.414, US 5.658.551, US 5.643.553, US 5.911.972, US 6.110.443, US 6.136.293, EP 619743, US 5.445.813, US 5.597.549, US 5.686.060, US 6.187.288 y US 5.908.610.
Las suspensiones de microburbujas preferidas pueden prepararse a partir de fosfolfpidos usando procesos conocidos tales como secado por congelacion o secado por pulverizacion de soluciones de los fosfolfpidos en bruto en un disolvente adecuado o usando los procesos expuestos en los documentos EP 554213; US 5.413.774; US
5.578.292; EP 744962; EP 682530; US 5.556.610; US 5.846.518; US 6.183.725; EP 474833; US 5.271.928; US
5.380.519; US 5.531.980; US 5.567.414; US 5.658.551; US 5.643.553; US 5.911.972; US 6.110.443; US 6.136.293; EP 619743; US 5.445.813; US 5.597.549; US 5.686.060; US 6.187.288 y US 5.908.610. Mas preferentemente, los fosfolfpidos se disuelven en un disolvente organico y la solucion se seca sin pasar a traves de una fase de formacion de liposomas. Esto puede realizarse disolviendo los fosfolfpidos en un disolvente organico adecuado junto con una sustancia estabilizadora hidrofila o un compuesto soluble tanto en el disolvente organico como en agua y secando por congelacion o por pulverizacion la solucion. En esta realizacion, los criterios usados para la seleccion del estabilizador hidrofilo es su solubilidad en el disolvente organico de eleccion. Son ejemplos de compuestos
estabilizadores hidrofilos solubles en agua y el disolvente organico, por ejemplo, un polfmero, como
polivinilpirrolidona (PVP), alcohol polivimlico (PVA), polietilenglicol (PEG), etc., acido malico, acido glicolico, maltol y similares. Dichos compuestos hidrofilos tambien ayudan a homogeneizar la distribucion del tamano de las microburbujas y potenciar la estabilidad durante el almacenamiento. Puede usarse cualquier disolvente organico adecuado siempre que su punto de ebullicion sea suficientemente bajo y su punto de fusion sea suficientemente alto para facilitar el secado posterior. Los disolventes organicos tfpicos incluyen, por ejemplo, dioxanos, ciclohexanol, butanol terciario, tetraclorodifluoro etileno (C2CI4F2) o 2-metil-2-butanol. Se prefiere 2-metil-2-butanol y C2CI4F2.
Antes de la formacion de la suspension de las microburbujas por dispersion en un vehfculo acuoso, los polvos
fosfolipfdicos secados por congelacion o por pulverizacion se ponen en contacto con aire u otro gas. Cuando se
ponen en contacto con el vehfculo acuoso los fosfolfpidos en polvo cuya estructura se ha alterado formaran segmentos lamelarizados o laminarizados que estabilizaran las microburbujas del gas disperso en su interior. Este metodo permite la produccion de suspensiones de microburbujas, que son estables incluso cuando se conservan durante periodos prolongados, y se obtienen mediante disolucion simple de los fosfolfpidos laminarizados secos, que se han conservado con un gas deseado, sin agitar ni remover violentamente.
A menos que contenga un gas hiperpolarizado, que se sabe que requiere condiciones de almacenamiento especiales, el resto liofilizado o secado por congelacion puede conservarse y transportarse sin necesidad de controlar la temperatura de su entorno y en particular puede proporcionarse a hospitales y a los medicos para la formulacion en el sitio en una suspension administrable lista para usar sin la necesidad de que dichos usuarios tengan instalaciones de almacenamiento especiales.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Preferentemente, en dicho caso esto puede proporcionarse en forma de un kit de dos componentes. El kit de dos componentes puede incluir dos envases distintos o un envase con una doble camara. En el primer caso, preferentemente, el envase es un vial cerrado con un tabique convencional, en el que el vial que contiene el resto liofilizado de la etapa b) se sella con un tabique a traves del cual puede inyectarse el vehfculo lfquido usando una jeringa opcionalmente precargada. En dicho caso la jeringa se usa como envase del segundo componente y tambien se usa despues para inyectar el agente de contraste. En el ultimo caso, preferentemente, el envase de doble camara es una jeringa de doble camara y una vez que el resto liofilizado/secado por congelacion se ha reconstituido y despues se mezcla adecuadamente o se agita suavemente, el envase puede usarse directamente para inyectar el agente de contraste. En ambos casos, se proporcionan medios para dirigir o permitir la aplicacion de suficiente energfa formadora de burbuja en el contenido del envase. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, en los agentes de contraste estabilizados el tamano de las microburbujas de gas es sustancialmente independiente de la cantidad de energfa de agitacion aplicada al producto seco reconstituido. Por consiguiente, no se requiere mas que una suave agitacion manual para proporcionar productos reproducibles con un tamano de microburbuja consistente.
El experto en la materia puede apreciar que pueden usarse otros sistemas de reconstitucion de dos camaras capaces de combinar el polvo seco con la solucion acuosa de una manera esteril. En dichos sistemas, es particularmente ventajoso si la fase acuosa puede interponerse entre el gas insoluble en agua y el entorno, para aumentar la vida util del producto. Cuando un material necesario para formar el agente de contraste no esta ya presente en el envase (por ejemplo, una fraccion de union a cMet para unirse al fosfolfpido durante la reconstitucion), este puede envasarse con el otro componente del kit, preferentemente en una forma o en un envase adaptado para facilitar la facil combinacion con los otros componentes del kit.
No se requieren envases, viales o sistemas de conexion especfficos; pueden usarse envases, viales y adaptadores convencionales. El unico requisito es un buen cierre entre el tapon y el envase. Por lo tanto, la calidad del cierre es un asunto de interes principal; cualquier degradacion de la integridad del cierre puede permitir que sustancias no deseables entren en el vial. Ademas, para asegurar la esterilidad, la retencion del vacfo es esencial para productos cerrados a presion ambiente o reducida para garantizar la seguridad y la correcta reconstitucion. El tapon, puede ser un compuesto o una formulacion multicomponente basada en un elastomero, tal como poli(isobutileno) o caucho de butilo.
Como alternativa, las microburbujas pueden prepararse suspendiendo un gas en una solucion acuosa a una alta velocidad de agitacion, como se desvela, por ejemplo, en el documento WO 97/29783. Un proceso adicional para preparar microburbujas se desvela en la solicitud de patente Europea en tramite junto con la presente n.° 03002373, que comprende la preparacion de una emulsion de un disolvente organico en un medio acuoso en presencia de un fosfolfpido y posteriormente liofilizar dicha emulsion, despues de etapas de lavado y/o filtracion opcionales.
Pueden incluirse aditivos conocidos por los expertos en la materia en las suspensiones de microburbujas estabilizadas. Por ejemplo, pueden anadirse tensioactivos no formadores de pelfcula, incluyendo polioxipropilenglicol y polioxietilenglicol y compuestos similares, asf como diversos copolfmeros de los mismos; acidos grasos tales como acido mirfstico, acido palmftico, acido estearico, acido araquidonico u otros derivados, ergoesterol, fitoesterol, sitoesterol, lanoesterol, tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbil e hidroxitolueno butilado. La cantidad de estos tensioactivos no formadores de pelfcula es normalmente hasta el 50 % en peso de la cantidad total de los tensioactivos pero preferentemente de entre el 0 y el 30 %.
En aplicaciones de ultrasonidos los agentes de contraste formados por microburbujas estabilizadas con fosfolfpidos pueden, por ejemplo, administrarse en dosis tales que la cantidad del fosfolfpido inyectado esta en el intervalo de 0,1 a 200 :g/kg de peso corporal, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 30 :g/kg.
Otras suspensiones que contienen gas incluyen las desveladas por ejemplo en los documentos US 5.798.091, WO 97/29783, EP 881 915. Estos agentes pueden prepararse como se describe en los documentos US 5.798.091 o WO 97/29783.
Otro agente de contraste de ultrasonidos preferido comprende microglobos. El termino “microglobo” se refiere a cuerpos rellenos de gas con un material de recubrimiento o envoltura. Pueden encontrarse mas formulaciones de microglobo y metodos de preparacion en los documentos EP 324 938 (US 4.844.882); US 5.711.933; US 5.840.275; US 5.863.520; US 6.123.922; US 6.200.548; US 4.900.540; US 5.123.414; US 5.230.882; US 5.469.854; US 5.585.112; US 4.718.433; US 4.774.958; WO 95/01187; US 5.529.766; US 5.536.490; y US 5.990.263.
Los microglobos preferidos tienen una envoltura que incluye un polfmero fisiologicamente compatible biodegradable o, un lfpido solido biodegradable. Los polfmeros utiles para la preparacion de microglobos pueden seleccionarse de polfmeros biodegradables fisiologicamente compatibles, tales como cualquiera de los descritos en cualquiera de las siguientes patentes: EP 458745; US 5.711.933; US 5.840.275; EP 554213; US 5.413.774; y US 5.578.292. En particular, el polfmero puede seleccionarse de polfmeros biodegradables fisiologicamente compatibles, tales como polisacaridos de baja solubilidad en agua, polilactidas y poliglicolidas y sus copolfmeros, copolfmeros de lactidas y lactonas tales como e-caprolactona, y-valerolactona y polipeptidos. Otros polfmeros adecuados incluyen poli(orto)esteres (veanse, por ejemplo, los documentos US 4.093.709; US 4.131.648; US 4.138.344; US 4.180.646); acido polilactico y poliglicolico y sus copolfmeros, por ejemplo DEXON (Heller, J., 1980. Biomaterials, 1: 51-57);
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
poli(DL-lactida-co-e-caprolactona), poli(DL-lactida-co-Y-valerolactona), poli(DL-lactida-co-Y-butirolactona),
polialquilcianoacrilatos; poliamidas, polihidroxibutirato; polidioxanona; poli-p-aminocetonas (Polymer, 23: 1693 (1982)); polifosfacenos (Allcock, H., 1976. Science, 193: 1214-1219); y polianhfdridos. Los microglobos de la presente invencion tambien pueden prepararse de acuerdo con los metodos del documento WO 96/15815, en el que los microglobos se preparan a partir de una membrana biodegradable que comprende lfpidos biodegradables, preferentemente seleccionados de mono- di-, tri-gliceridos, acidos grasos, esteroles, ceras y mezclas de los mismos. Los lfpidos preferidos son di- o tri-gliceridos, por ejemplo di- o tri-miristina, palmitina o estearina, en particular tripalmitina o triestearina.
Los microglobos pueden emplear cualquiera de los gases desvelados en el presente documento conocidos por los expertos en la materia; sin embargo, se prefieren gases inertes tales como gases fluorados. Los microglobos pueden suspenderse en un vehfculo lfquido farmaceuticamente aceptable con aditivos opcionales conocidos por los expertos habituales en la materia y estabilizantes.
Los microglobos que contienen agentes de contraste se administran tfpicamente en dosis tales que la cantidad del polfmero formador de pared o el lfpido es de aproximadamente 10 :g/kg a aproximadamente 20 pg/kg de peso corporal.
Otras formulaciones de agente de contraste que contienen gas incluyen micropartfculas (especialmente agregados de micropartfculas) que contienen gas contenido en su interior o asociadas con el mismo de otra manera (por ejemplo que se adsorbe en la superficie de las mismas y/o esta contenido dentro de espacios, cavidades o poros en su interior). Los metodos para la preparacion de estos agentes son como se describe en los documentos EP 0122624; EP 0123235; EP 0365467; US 5.558.857; US 5.607.661; US 5.637.289; US 5.558.856; US 5.137.928; WO 95/21631 o WO 93/13809.
Cualquiera de estas composiciones ultrasonidos tambien deben, en la medida de lo posible, ser isotonicas con la sangre. Por lo tanto, antes de la inyeccion, pueden anadirse pequenas cantidades de agentes isotonicos a cualquiera de las suspensiones de agente de contraste por ultrasonidos anteriores. Los agentes isotonicos son soluciones fisiologicas normalmente usadas en medicina y comprenden solucion salina acuosa (NaCl al 0,9 %), solucion de glicerol al 2,6 %, solucion de dextrosa al 5 %, etc. Ademas, las composiciones de ultrasonidos pueden incluir aditivos convencionales farmaceuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, agentes emulsionantes, agentes modificadores de viscosidad, crioprotectores, lioprotectores, agentes de volumen, etc.
Puede usarse cualquier gas biocompatible en los agentes de contraste por ultrasonidos utiles en la invencion como se define en las reivindicaciones. El termino “gas” como se usa en el presente documento incluyen cualquier sustancia (incluyendo mezclas) sustancialmente en forma gaseosa a la temperatura corporal humana normal. Por tanto, el gas puede incluir, por ejemplo, aire, nitrogeno, oxfgeno, CO2, argon, xenon o cripton, gases fluorados (incluyendo, por ejemplo, perfluorocarbonos, SF6, SeF6), un hidrocarburo de bajo peso molecular (que contiene, por ejemplo, de 1 a 7 atomos de carbono), por ejemplo, un alcano tal como metano, etano, propano, butano o pentano, un cicloalcano tal como ciclopropano, ciclobutano o ciclopenteno, un alqueno tal como etileno, propeno, propadieno o buteno, o un alquino tal como acetileno o propino y/o mezclas de los mismos. Sin embargo, se prefieren los gases fluorados. Las gases fluorados incluyen materiales que contienen al menos un atomo de fluor tales como SF6, freones (compuestos organicos que contienen uno mas atomos de carbono y fluor, es decir, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, CBrF3, CCI2F2,C2CIF5, y CBrClF2) y perfluorocarbonos. El termino perfluorocarbono se refiere a compuestos que solo contienen carbono y atomos de fluor e incluye, en particular, perfluorocarbonos saturados, insaturados y cfclicos. Los perfluorocarbonos saturados, que son los normalmente preferidos, tienen la formula CnFn+2, donde n es de 1 a 12, preferentemente de 2 a 10, mas preferentemente de 3 a 8 e incluso mas preferentemente de 3 a 6. Los perfluorocarbonos adecuados incluyen, por ejemplo CF4, C2F6, C3F8 C4F8, C4F10, C5F12, C6F12, C7F14, C8F18, y C9F20. Mas preferentemente, el gas o la mezcla de gas comprenden SF6 o un perfluorocarbono seleccionado del grupo que consiste en C3F8 C4F8, C4F10, C5F12, C6F12, C7F14, C8F18, siendo C4F10 particularmente preferido. Veanse ademas los documentos WO 97/29783, WO 98/53857, WO 98/18498, WO 98/18495, WO 98/18496, WO 98/18497, WO 98/18501, WO 98/05364, WO 98/17324.
En determinadas circunstancias puede ser deseable incluir un precursor para una sustancia gaseosa (por ejemplo, un material que es capaz de convertirse en un gas in vivo, a menudo denominado “gas precursor”). Preferentemente, el gas precursor y el gas que lo produce son fisiologicamente aceptables. El gas precursor puede activarse por pH, fotoactivarse, activarse con temperatura, etc. Por ejemplo, pueden usarse determinados perfluorocarbonos como precursores de gases activados por temperatura. Esto perflurocarbonos, tales como perfluoropentano, tienen una temperatura de transicion de fase lfquido/gas por encima de la temperatura ambiente (o la temperatura a la cual los agentes se producen y/o conservan) pero por debajo de la temperatura corporal; por tanto, se someten a un cambio de fase y se convierten en un gas dentro del cuerpo humano.
El gas puede comprender una mezcla de gases. Se prefieren particularmente las siguientes combinaciones de mezclas de gases: una mezcla de gases (A) y (B) en la que al menos uno de los gases (B), presente en una cantidad de entre 0,5 - 41 % por volumen, tiene un peso molecular mayor de 80 daltons y es un gas fluorado y (A) se selecciona del grupo que consiste en aire, oxfgeno, nitrogeno, dioxido de carbono y mezclas de los mismos, siendo el resto de la mezcla el gas A.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Dado que las vesfculas de ultrasonidos pueden ser mayores que los otros marcadores detectables descritos en el presente documento, estas pueden unirse o conjugarse a una pluralidad de polipeptidos de union a cMet o construcciones polipeptfdicas multimericas para aumentar la eficacia del direccionamiento del agente. La union de los agentes de contraste de ultrasonido descritos anteriormente (o conocidos por los expertos en la materia) puede ser mediante enlace covalente directo entre el polipeptido de union a cMet y el material usado para preparar la vesfcula o mediante un enlazador, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, vease el documento WO 98/53857 para una descripcion general de la union de un peptido a un enlazador PEG bifuncional, que despues se hace reaccionar con una composicion de liposomas (Lanza, G. et al, 1997. Ultrasound Med. Biol, 23: 863-870). La estructura de estos compuestos comprende tfpicamente:
a) Una parte hidrofoba, compatible con el material que forma la envoltura de la microburbuja o del microglobo, para permitir una incorporacion eficaz del compuesto en la envoltura de la vesfcula, dicha parte es tfpicamente una fraccion lipfdica (por ejemplo, dipalmitina, distearoflo);
b) Un espaciador (tfpicamente PEG de diferentes pesos moleculares), que puede ser opcional en algunos casos (las microburbujas, por ejemplo, pueden resultar diffciles de secar por congelacion si el espaciador es demasiado largo) o preferirse en algunos otros (por ejemplo, los peptidos pueden ser menos activos cuando se conjugan con un microglobo con un espaciador corto);
c) Un grupo reactivo capaz de reaccionar con una fraccion reactiva correspondiente en el peptido a conjugar (por ejemplo, maleimido con el grupo SH de cistefna).
Pueden usarse diversos metodos para preparar suspensiones de microburbujas conjugadas con polipeptidos de union a cMet. Por ejemplo, se pueden preparar microburbujas derivatizadas con maleimida incorporando 5 % (p/p) de N-MPB-PE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-4-(p-maleimido-fenil butiramida), (Avanti Polar-Lipids, Inc., Alabaster, AL) en la formulacion de fosfolfpido. Despues, las soluciones de peptidos de union a cMet mercaptoacetiladas (10 mg/ml en DMF), que se han incubado en solucion de desacetilacion (fosfato sodico 50 mM, EDTA 25 mM o dihidroxilamina HCl 0,5 M, pH 7,5) se anaden a la suspension de microburbujas activada por maleimida. Despues de la incubacion en la oscuridad, con una agitacion suave, las microburbujas conjugadas con peptido pueden purificarse por centrifugacion.
Como alternativa, el polipeptido de union a cMet conjugado con microburbujas puede prepararse usando biotina/avidina. Por ejemplo, las microburbujas conjugadas con avidina pueden prepararse usando una suspension de microburbujas de fosfolfpido activadas por maleimida, preparadas como se ha descrito anteriormente, que se anade a la avidina mercaptoacetilada (que se ha incubado con solucion de desacetilacion). Los peptidos de union a cMet biotinilados (preparados como se describe en el presente documento), se anaden despues a la suspension de microburbujas conjugadas con avidina, proporcionando una suspension de microburbujas conjugadas con peptidos de union a cMet.
Las tecnicas de formacion de imagenes por ultrasonido, que pueden usarse de acuerdo con la presente invencion, incluyen tecnicas conocidas tales como Doppler a color, Doppler de potencia, Doppler de amplitud, formacion de imagenes acusticas estimuladas, y tecnicas de formacion de imagenes bi y tridimensionales. La formacion de imagenes puede realizarse en modo armonico (frecuencia resonante) o fundamental, prefiriendose el modo armonico segundo.
C. Formacion de imagenes opticas, sonoluminiscentes o fotoacusticas
De acuerdo con la presente invencion, para determinar la localizacion de cMet o del complejo HGF/cMet pueden emplearse diversos parametros opticos con la formacion de imagenes lumfnicas in vivo despues de inyectar al sujeto un polipeptido de union a cMet marcado opticamente. Los parametros opticos a detectar en la preparacion de una imagen pueden incluir radiacion transmitida, absorcion, emision fluorescente o fosforescente, reflexion lumfnica, cambios en la absorbancia maxima o amplitud y radiacion dispersada elasticamente. Por ejemplo, los tejidos biologicos son relativamente translucidos a la luz en el intervalo de longitud de onda del infrarrojo cercano (NIR) de 650-1000 nm. La radiacion NIR puede atravesar los tejidos hasta varios centfmetros, permitiendo el uso de los polipeptidos o de las construcciones polipeptfdicas multimericas de union a cMet de la presente invencion para la formacion de imagenes opticas de cMet o del complejo HGF/cMet in vivo.
Los polipeptidos o las construcciones polipeptfdicas multimericas de union a cMet pueden conjugarse con fotomarcadores, tales como, por ejemplo, colorantes opticos, incluyendo cromoforos o fluoroforos organicos que tienen sistemas anulares deslocalizados amplios y que tienen absorcion o emision maxima en el intervalo de 4001500 nm. El polipeptido o la construccion polipeptfdica multimerica de union a cMet pueden, como alternativa, derivatizarse con una molecula bioluminiscente. El intervalo de maxima absorcion preferido para fotomarcadores es de entre 600 y 1000 nm para minimizar interferencias con la senal de la hemoglobina. Preferentemente, los marcadores de fotoabsorcion tienen absortividades molares grandes, por ejemplo, mayores de 105 cm'1M'1, aunque colorantes opticos fluorescentes tendran altos rendimientos de quantum. Los ejemplos de colorantes opticos incluyen, pero sin limitacion, los descritos en los documentos WO 98/18497, WO 98/18496, WO 98/18495, WO 98/18498, WO 98/53857, WO 96/17628, WO 97/18841, WO 96/23524, WO 98/47538, y en referencias citadas en su
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
interior. Los fotomarcadores pueden unirse directamente mediante enlace covalente con el peptido de union a cMet o unirse al peptido o a la construccion polipeptfdica multimerica de union a cMet mediante un enlazador, como se ha descrito anteriormente.
Despues de la inyeccion de la fraccion de union a cMet opticamente marcada, al paciente se le realiza un escaner con una o mas fuentes lummicas (por ejemplo, un laser) en el intervalo de longitud de onda apropiado para el fotomarcador empleado en el agente. La luz usada puede ser monocromatica o policromatica y continua o pulsada. La luz transmitida, dispersada o reflejada se detecta mediante un fotodetector adaptado a una o mas longitudes de onda multiples para determinar la localizacion de cMet o del complejo HGF/cMet en el sujeto. Los cambios en el parametro optico pueden monitorizarse a lo largo del tiempo para detectar la acumulacion del reactivo marcado opticamente en el sitio de hiperproliferacion. Pueden usarse dispositivos convencionales de procesamiento y deteccion de imagenes junto con reactivos formadores de imagenes opticas para su uso en la presente invencion como se define en las reivindicaciones.
Los reactivos formadores de imagenes opticas descritos anteriormente tambien pueden usarse para la formacion de imagenes acustoopticas o sonoluminiscentes realizadas con agentes formadores de imagenes opticamente marcados (veanse, los documentos US 5.171.298, WO 98/57666, y referencias citadas en su interior). En la formacion de imagenes acustoopticas, se aplica radiacion ultrasonido al sujeto y afecta a los parametros opticos de la luz transmitida, emitida o reflejada. En la formacion de imagenes sonoluminiscentes, el ultrasonido aplicado realmente genera la luz detectada. En el documento WO 98/57666 se describen metodos de formacion de imagenes adecuados usando dichas tecnicas.
D. Formacion de imagenes nucleares (formacion de imagenes con radionuclidos)
Los restos de union a cMet pueden conjugarse con un radionuclido indicador apropiado para formacion de imagenes escintigraficas, SPECT o PET.
Para su uso como un agente PET un peptido o una construccion polipeptfdica multimerica forma complejo con uno de los diversos iones metalicos emisores de positron, tales como 51Mn, 52Fe, 60Cu, 68Ga, 72As, 94mTc, o 110In. Las
1 1 Q 1 A OC A O A
fracciones de union tambien pueden marcarse con halogenacion usando radionuclidos tales como F, I, I I, 123I, 77Br, y 76Br. Los radionuclidos metalicos preferidos para escintigraffa o radioterapia incluyen 99mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 51Cr, 167Tm, 141Ce , 111In, 168Yb, 175Yb, 140La, 90Y, 88Y, 153Sm, 166Ho, 165Dy, 166Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 198Au y 199Au. La eleccion del metal se determinara basandose en las aplicaciones diagnosticas deseadas. Por ejemplo, para propositos de diagnostico los radionuclidos preferidos incluyen 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, y 111In. 99mTc es particularmente preferido para las aplicaciones diagnosticas debido a su bajo coste, a su disponibilidad, a sus propiedades de formacion de imagenes y a una alta actividad espedfica. Las propiedades nucleares y radioactivas de 99mTc hacen que este isotopo sea un agente formador de imagenes escintigraficas ideal. Este isotopo tiene una sola energfa fotonica de 140 keV y una semivida radioactiva de aproximadamente 6 horas, y se encuentra facilmente disponible a partir de un generador de 99Mo-99mTc.
Los radionuclidos metalicos pueden quelarse, por ejemplo, mediante quelantes lineales, macrodclicos, terpiridina y N3S, N2S2, o N4 (veanse tambien los documentos US 5.367.080, US 5.364.613, US 5.021.556, US 5.075.099, US 5.886.142) y otros quelantes conocidos en la tecnica que incluyen, pero sin limitacion HYNIC, DTPA, EDTA, DOTA, DO3A, TETA y quelantes de bisamino bistiol (BAT) (vease tambien el documento US 5.720.934). Por ejemplo, los quelantes N4 se describen en los documentos uS 6.143.274; US 6.093.382; US 5.608.110; Us 5.665.329; US 5.656.254; y US 5.688.487. Determinados quelantes N3S se describen en los documentos PCT/CA94/00395, PCT/CA94/00479, PCT/CA95/00249 y US 5.662.885; US 5.976,495; y US 5.780.006. El quelante tambien puede incluir derivados del ligando quelante mercapto-acetil-acetil-glicil-glicina (MAG3) que contiene un sistema N3S y N2S2 tal como MAMA (monoamidamonoaminaditioles), DADS (diaminaditioles N2S), CODADS y similares. Estos sistemas ligando y diversos otros se describen, por ejemplo, en Liu, S. y Edwards, D., 1999. Chem Rev., 99: 2235-2268 y referencias en su interior.
El quelante tambien puede incluir complejos que contienen atomos de ligando que no se donan al metal en una matriz tetradentada. Estos incluyen los aductos de acido boronico de tecnecio y dioximas de renio, como se describe en los documentos US 5.183.653; US 5.387.409; y US 5.118.797.
En otra realizacion, se usan enlaces disulfuro de un polipeptido de union a cMet como dos ligandos para la quelacion de un radionuclidos tal como 99mTc. De este modo el bucle peptfdico se expande por la introduccion de Tc (peptido-S-S-peptido cambiado a peptido-S-Tc-S-peptido). Esto tambien se ha usado en otros peptidos que contienen disulfuro en la bibliograffa (Chen, J. et al, 2001. J. Nucl. Med., 42: 1847-1855) manteniendo al mismo tiempo la actividad biologica. Los otros grupos quelantes para Tc pueden proporcionarse mediante nitrogenos de amida de la estructura, otros aminoacidos de cistema u otra modificacion de aminoacidos.
Los quelantes metalicos particularmente preferidos incluyen los de las Formulas 20, 21, 22, 23a, 23b, 24a, 24b y 25, expuestas en las FIGS. 8A-8F. Las formulas 20-22 son particularmente utiles para lantanidos tales como Gd3+ paramagnetico y lantanidos radioactivos tales como 177Lu, 90Y, 153Sm, 111In, o 166Ho. Las Formulas 23a-24b son
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
particularmente utiles para radionuclidos 99mTc, 186Re, o 188Re. La formula 25 es particularmente util para 99mTc. Estos y otros grupos quelantes metalicos se describen en los documentos US 6.093.382 y US 5.608.110. Adicionalmente, el grupo quelante de formula 22 se describe, por ejemplo, en el documento US 6.143.274; el grupo quelante de formula 24 se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.627.286 y US 6.093.382 y el grupo quelante de formula 25 se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.662.885; US 5.780.006; y US 5.976.495.
Para las formulas 24a y 24b de la FIG. 8E, X es cualquiera de CH2 u O; Y es alquilo C1-C10 ramificado o no ramificado, arilo, ariloxi, arilamino, arilaminoacilo o arilalquilo que comprenden grupos alquilo C1-C10 ramificados o no ramificados, grupos hidroxi o polihidroxialquilo C1-C10 ramificados o no ramificados, grupos hidroxi o polialcoxialquilo C1-C10 ramificados o no ramificados o grupos polihidroxi-polialcoxialquilo; J es C(=O)-, OC(=O)-, SO2-, NC(=O)-, NC(=S)-, N(Y), NC(=NCH3)-, NC(=NH)-, N=N-, homopoliamidas o heteropoliamidas derivadas de aminoacidos sinteticos o de origen natural; y n es 1-100. Otras variantes de estas estructuras se describen, por ejemplo, en el documento US 6.093.382.
Los quelantes pueden unirse directamente mediante enlace covalente a la fraccion de union a cMet o a la construccion polipeptfdica multimerica o unirse al polipeptido de union a cMet mediante un enlazador, como se ha descrito previamente, y despues marcarse directamente con el metal radioactivo de eleccion (veanse, los documentos WO 98/52618, US 5.879.658, y US 5.849.261).
Los complejos de tecnecio radioactivo son particularmente utiles para la formacion de imagenes de diagnostico y los complejos de renio radioactivo son particularmente utiles para radioterapia. La formacion de un complejo de tecnecio radioactivo con los reactivos para su uso en la presente invencion como se define en las reivindicaciones, el complejo de tecnecio, preferentemente una sal de pernectenato 99mTc, se hace reaccionar con el reactivo en presencia de un agente reductor. Los agentes reductores preferidos son ditionita, iones estannosos y ferrosos; siendo el agente reductor mas preferido el cloruro de estano. Los medios para preparar dichos complejos se proporcionan convenientemente en una forma de kit que comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de la invencion para el marcaje y una cantidad suficiente de agente reductor para marcar el reactivo con 99mTc. Como alternativa, el complejo puede formarse por reaccion de un peptido de esta invencion conjugado con un quelante apropiado con un complejo labil previamente formado de tecnecio y otro compuesto conocido como un ligando de transferencia. Este proceso se conoce como intercambio de ligando y los expertos en la materia lo conocen bien. El complejo labil puede formarse usando dichos ligandos de transferencia tales como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo. Entre las sales de pertecnetato 99mTc utiles con la presente invencion se incluyen las sales metalicas alcalinas tales como sal de sodio, sales de amonio o sales de alquil amonio inferior.
La preparacion de los complejos para su uso en la presente invencion como se define en las reivindicaciones en las que el metal es renio radioactivo pueden realizarse usando materiales de partida de renio en el estado de oxidacion +5 o +7. Los ejemplos de compuestos en los que el renio esta en el estado Re(VII) son NH4ReO4 o KReO4. Re(V) esta disponible como, por ejemplo, [ReOCU](NBu4), [ReOCLKAsPtu), ReOCl3(PPh3)2 y ReO2(piridina)4+, en el que Ph es fenilo y Bu es n-butilo. Pueden usarse tambien otros reactivos de renio capaces de formar un complejo de renio.
Se incluyen agentes de formacion de imagenes escintigraficas marcados radiactivamente que tienen una cantidad adecuada de radioactividad. Generalmente, la dosis unitaria a administrar tiene una radioactividad de aproximadamente 0,01 mCi a aproximadamente 100 mCi, preferentemente 1 mCi a 20 mCi. La solucion a inyectar a una dosificacion unitaria es de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml. En la formacion de complejos radioactivos 99mTc, generalmente se prefiere formar complejos radioactivos en soluciones que contengan radioactividad a concentraciones de aproximadamente 0,01 mCi a 100 mCi por ml.
Las dosis tfpicas de un agente formador de imagenes de union a cMet marcado con radionuclidos para su uso en la invencion como se define en las reivindicaciones proporcionan 10-20 mCi. Despues de inyectar al paciente el agente formador de imagen marcado con radionuclidos especffico de cMet, se usa una camara de rayos gamma calibrada para la energfa de rayos gamma del nuclido incorporado en el agente formador de imagenes para captar areas de imagen del agente y cuantificar la cantidad de radioactividad presente en el sitio. La formacion de imagenes del sitio in vivo puede realizarse en cuestion de escasos minutos. Sin embargo, la formacion de la imagen puede tener lugar, si se desea, en horas o incluso en mas tiempo, despues de inyectar el peptido radiomarcado en un paciente. En la mayorfa de los casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumulara en el area donde van a formarse las imagenes en aproximadamente 6 minutos para permitir realizar fotograffas de imagenes escintigraficas.
Se contempla un kit sencillo o multivial que contiene todos los componentes necesarios para preparar los complejos para su uso en la presente invencion, como se define en las reivindicaciones, distintos de los del radionuclido.
Un kit de vial unico contiene preferentemente un ligando quelante, una fuente de sal estannosa, u otro agente reductor farmaceuticamente aceptable, y esta tamponado apropiadamente con un acido o base farmaceuticamente aceptable para ajusta el pH a un valor de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. La cantidad y el tipo de agente reductor usado dependen de la naturaleza del complejo de intercambio que se quiera formar. Las condiciones adecuadas son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Se prefiere que los contenidos del kit esten en forma
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
liofilizada. Un kit de vial unico de este tipo puede contener opcionalmente ligandos labiles o de intercambio tales como glucoheptonato, gluconato, manitol, malato, acido cftrico o tartarico y tambien puede contener modificadores de reaccion tales como acido dietilentriamino pentaacetico (DPTA), acido etilendiamino tetraacetico (EDTA) o ciclodextrina a, p o y que sirven para mejorar la pureza y la estabilidad radioqmmica del producto final. El kit puede contener tambien estabilizantes, agentes voluminizadores tales como manitol, que estan disenados para ayudar en el procedimiento de liofilizacion, y otros aditivos conocidos por los expertos en la tecnica.
Un kit de varios viales contiene preferentemente los mismos componentes generales, pero emplea mas de un vial para reconstituir el radiofarmaco. Por ejemplo, un vial puede contener todos los ingredientes necesarios para formar un complejo de Tc(V) labil tras la adicion de pertecnetato (por ejemplo, la fuente estannosa u otro agente reductor). El pertecnetato se anade a este vial y, despues de esperar un periodo de tiempo apropiado, el contenido de este vial se anade a un segundo vial que contiene el ligando, asf como tampones apropiados para ajustar el pH a su valor optimo. Despues de un tiempo de reaccion de aproximadamente 5 a 60 minutos, se forman los complejos para su uso en la presente invencion, como se define en las reivindicaciones. Es ventajoso que el contenido de ambos viales de este kit de varios viales este liofilizado. Como anteriormente, modificadores de reaccion, ligandos de intercambio, estabilizantes, agentes voluminizadores, etc., pueden estar presentes en cualquiera de los viales o en ambos.
Las afecciones que implican angiogenesis incluyen, por ejemplo, tumores solidos, metastasis tumorales y tumores benignos. Los tumores provocados por la activacion de cMet o a traves de la angiogenesis son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, de mama, tiroides, glioblastoma, prostata, mesotelioma maligno, colorrectal, hepatocelular, hepatobiliar, renal, osteosarcoma y cervical. En la tabla 1 de la patente de EE.UU. n.° 6025331, concedida el 15 de febrero de 2000 a Moses, y otros, se enumeran tumores adicionales y trastornos relacionados. Los tumores benignos incluyen, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acusticos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogenos. Otras enfermedades relevantes que implican angiogenesis y/o hiperproliferacion incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedades oculares, tales como retinopatfa diabetica, retinopatfa de la prematuridad, degeneracion macular, rechazo de trasplante de cornea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, smdrome de Osler-Weber, angiogenesis miocardica, neovascularizacion de la placa, telangiectasia, articulaciones hemofflicas, angiofibroma y granulacion de heridas. Otras enfermedades o afecciones relevantes que implican crecimiento de vasos sangumeos incluyen adhesiones intestinales, ateroesclerosis, esclerodermia y cicatrices hipertroficas y ulceras.
Los polipeptidos de union, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados y construcciones pueden administrarse de forma local o sistemica mediante cualquier via adecuada. Las vfas de administracion adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aplicacion topica, transdermica, parenteral, gastrointestinal, intravaginal y transalveolar. Las composiciones para la via de administracion deseada pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en las tecnicas farmaceuticas, por ejemplo, los descritos en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams y Wilkins, 2000.
Para aplicacion topica, los polipeptidos de union, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados pueden suspenderse, por ejemplo, en una crema, gel o enjuague que permite que los polipeptidos o construcciones atraviesen la piel y entren en el torrente circulatorio, para su administracion sistemica, o que entren en contacto con el area de interes, para su administracion localizada. Las composiciones adecuadas para su administracion topica incluyen cualquier base farmaceuticamente aceptable en la que los polipeptidos o construcciones sean al menos mmimamente solubles.
Para administracion transdermica, los polipeptidos, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados pueden aplicarse en una suspension farmaceuticamente aceptable junto con un dispositivo transdermico o "parche" adecuado. Se describen ejemplos de dispositivos transdermicos adecuados para la administracion de los polipeptidos o construcciones, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6165458, concedida el 26 de diciembre de 2000 a Foldvari y otros y en la patente de EE.UU. n.° 6274166B1, concedida el 4 de agosto de 2001 a Sintov y otros.
Para administracion parenteral, los polipeptidos, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados pueden inyectarse por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea. Normalmente, las composiciones para administracion intravenosa son soluciones en tampon acuoso isotonico esteril. Otros vehfculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua esteril, solucion salina y solucion salina tamponada (incluidos tampones como fosfato o acetato), alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, acido silfcico, parafina, etc. En caso necesario, la composicion tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como lidocama para aliviar el dolor en el sitio de inyeccion, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales, lubricantes, etc., siempre que no reaccionen de manera perjudicial con los compuestos activos. De forma similar, la composicion puede comprender excipientes convencionales, es decir, sustancias vehfculo organicas o inorganicas farmaceuticamente aceptables adecuadas para aplicacion parenteral, enterica o intranasal que no reaccionen de forma perjudicial con los compuestos activos. En general, los ingredientes se suministraran bien por separado o bien mezclados juntos en una forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado sin agua en un recipiente cerrado hermeticamente, tal como una ampolla o una bolsita que indique la cantidad de agente activo en unidades de actividad. Cuando la composicion ha de administrarse por infusion, puede dispensarse con una botella de infusion que contenga solucion salina o "agua para inyectables" esteril de calidad farmaceutica. Cuando la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
composicion se ha de administrar por inyeccion, puede proporcionarse una ampolla de agua para inyectables o solucion salina esteril, de manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administracion.
Para administracion gastrointestinal e intravaginal, los polipeptidos, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados pueden incorporarse en polvos, pfldoras o lfquidos farmaceuticamente aceptables, y en supositorios para administracion rectal o vaginal.
Para administracion transalveolar, bucal o pulmonar, los polipeptidos, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados pueden suspenderse en un excipiente farmaceuticamente aceptable adecuado para aerosolizacion e inhalacion o como un colutorio. Tambien se contemplan dispositivos adecuados para administracion transalveolar, tales como atomizadores y vaporizadores. En la patente de EE.UU. n.° 6312665B1, concedida el 6 de noviembre de 2001 a Pankaj Modi, pueden encontrarse formulaciones adecuadas para administracion por aerosol de polipeptidos, etc. usando vfas bucales o pulmonares.
Ademas, los polipeptidos, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados pueden administrarse por via nasal u ocular, donde el polipeptido o construccion se suspende en un agente lfquido farmaceuticamente aceptable adecuado para administracion en gotas.
Los polipeptidos, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados pueden administrarse de forma que el polipeptido, etc., se libera en el individuo durante un periodo de tiempo prolongado (liberacion controlada o mantenida). Por ejemplo, el polipeptido, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados pueden formularse en una composicion tal que una unica administracion proporcione la administracion del polipeptido, etc., durante al menos una semana o durante el periodo de un ano o mas. Los sistemas de liberacion controlada incluyen microcapsulas monolfticas o de tipo reservorio, implantes de liberacion lenta, bombas osmoticas, vesfculas, micelas, liposomas, parches transdermicos y dispositivos iontoforeticos. Los polipeptidos, construcciones polipeptidicas multimericas y sus conjugados pueden ser encapsulados o se mezclan en un polfmero no toxico de degradacion lenta. En la patente de EE.UU. n.° 4391797, concedida el 5 de julio de 1983 a Folkman y otros, se describen formulaciones adicionales adecuadas para la liberacion controlada de los polipeptidos, construcciones polipeptfdicas multimericas y sus conjugados proporcionados en el presente documento.
Un metodo de purificacion de cMet y de complejo HGF usando polipeptidos de fracciones de union a cMet y la preparacion y uso de fracciones de union a cMet y conjugados del mismo, de acuerdo con la invencion como se define en las reivindicaciones se ilustrara adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los parametros especfficos incluidos en los siguientes ejemplos pretenden ser unicamente ilustrativos de la practica de la invencion y no se presentan de ninguna manera para limitar el ambito de la misma, que se define en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1: Procedimiento para la identificacion de polipeptidos de union a cMet
Se utilizo una estrategia de seleccion de cuatro frentes usando una variedad de colecciones de fagos presentadores de peptidos para rastrear los polipeptidos de union a cMet. Como herramientas para las selecciones se usaron tanto el dominio extracelular del receptor cMet (expresado como una protefna de fusion de Fc) como la lfnea celular de cancer colorrectal, DLD-1, que expresa niveles altos de cMet en su superficie celular.
Brevemente, las selecciones implicaron el uso como objetivo bien de la protefna de fusion de cMet-Fc o bien de las celulas DLD-1. Se realizaron eluciones especfficas con el HGF (en primer lugar durante 1 hora y despues durante una noche para identificar los agentes de union a cMet tanto de baja como de alta afinidad). Adicionalmente, aunque se uso el receptor de cMet soluble, se recogieron todos los fagos presentadores de peptidos que permanecfan unidos al receptor para identificar peptidos que no se unieron al sitio de union de ligando, pero que, no obstante, podrfan desarrollarse potencialmente en agentes de formacion de imagenes. La figura 9 ilustra la estrategia de seleccion que se empleo. Brevemente, se realizaron 21 combinaciones diferentes de campana de seleccion/elucion con el conjunto de cada coleccion. Tambien se realizaron 10 campanas de seleccion adicionales, que supusieron los ciclos 3 y 4, usando la protefna de fusion de cMet-Fc. Las eluciones con el HGF fueron a una concentracion de 100 ng/ml.
Ejemplo 2: "ELISA de fagos de protefna" para la determinacion de la union de fagos presentadores de peptidos a la protefna de fusion de cMet-Fc soluble
Se realizaron ELISA de fagos de protefna usando aislados de fagos presentadores de peptidos de las diversas campanas de seleccion para determinar la especificidad de los peptidos por cMet frente a una protefna de fusion de Fc no relacionada (TRAIL-Fc). Brevemente, se recubrieron placas de 384 pocillos durante una noche a 4 °C con 0,5 pg/ml de protefna de fusion de cMet-Fc o protefna de fusion TRAIL-Fc (antecedentes). Las placas se bloquearon durante 2 horas a 37 °C con BSA en PBS al 3 % (p/v) que contenfa Tween-20 al 0,05 % (v/v) (PBST). Las placas se lavaron con PBST y se anadieron 100 pl de fago presentador de peptidos a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron con PBST. Los fagos presentadores de peptidos de union a cMet se detectaron usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los fagos presentadores de peptidos que demostraron una union de > 3 veces a la protefna de fusion de cMet-Fc frente a la protefna de fusion Fc-TRAIL se denominan en el presente documento "impactos positivos". Los impactos positivos identificados en el rastreo anterior se sometieron a secuenciacion del ADN. A partir del analisis de secuencia subsiguiente, se identificaron 187 secuencias peptfdicas unicas. Las secuencias de aminoacidos correspondientes de los peptidos presentados por fagos de union a cMet se indican en la Tabla 1 (SEC ID N.°: 001101, 365-387, 390-404, 449-496).
Ejemplo 3: Determinacion de union a cMet en un modelo celular
Se realizaron ELISA de celulas completas para evaluar si los impactos positivos demostraban union especffica a cMet humano expresado en la superficie celular.
Los ELISA de celulas completas se realizaron usando celulas 3T3 que sobreexpresan cMet humano. Como lfnea celular de control se usaron celulas 3T3 que no expresan cMet ("celulas que no expresan"). Brevemente, se sembraron placas de 96 pocillos con 105 celulas por pocillo. Las placas se centrifugaron durante 5 minutos a 1600 rpm para sedimentar las celulas. La capa de celulas resultante se fijo con glutaraldehfdo al 0,1 % (v/v) durante 12 minutos a 37 °C. Las celulas se lavaron con PBS y posteriormente se bloquearon con BSA en PBST al 3 % durante 1 hora a 37 °C. Tambien se bloquearon fagos presentadores de peptidos en la solucion anterior durante 1 hora a 37 °C. Despues se anadieron 100 pl de fagos bloqueados a cada pocillo y se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBST. Los fagos presentadores de peptidos de union a cMet se detectaron usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP.
Ejemplo 4: ELISA de protefnas de competencia con HGF
Se realizaron ELISA de protefnas de competencia con HGF en un intento de determinar si alguno de los peptidos de union a cMet compite con el HGF por un sitio de union similar en cMet. Este ELISA de competencia identifica peptidos que sirven como "peptidos antagonistas de HGF", peptidos que bloquean acontecimientos de senalizacion mediados por HGF (por ejemplo, proliferacion). Estos ensayos se realizaron usando los fagos presentadores de peptidos descubiertos en la seleccion y las campanas de rastreo iniciales usando las colecciones de peptidos de primera generacion. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos durante una noche a 4 °C con 0,5 pg/ml de protefna de fusion de cMet-Fc o protefna de fusion TRAIL-Fc (antecedentes). Las placas se bloquearon durante 2 horas a 37 °C con BSA en PBST al 3 %. Las placas se lavaron con PBST y se anadieron 100 pl de HGF (bien a 100 ng/ml o a 500 ng/ml en PBST) a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, despues de lo cual se lavaron las placas con PBST y se anadieron 70 pl de HGF (143 ng/ml o 714 ng/ml) o 70 pl de PBST a los pocillos correspondientes. A esto le siguio la adicion de 30 pl de cultivo de una noche de fagos presentadores de peptidos a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron con PBST y se detectaron los fagos presentadores de peptidos de union a cMet usando un anticuerpo anti- M13 conjugado con HRP.
Los datos de los ELISA de protefnas, ELISA de celulas completas y de los experimentos de competencia de HGF se presentan en la Tabla 7.
Ejemplo 5: Sfntesis peptfdica y marcaje con fluorescefna
Se sintetizaron un numero selecto de peptidos de union a cMet correspondientes a aislados de fagos positivos en una matriz de fase solida usando protocolos de 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Estos peptidos se purificaron con cromatograffa de fase inversa. Las masas de los peptidos se confirmaron mediante espectrometrfa de masas por electropulverizacion y los peptidos se cuantificaron midiendo la absorbancia a 280 nm. Para la sfntesis, se retuvieron dos aminoacidos N-terminales y dos C-terminales de la secuencia del vector de fago a partir del cual se escindio el peptido y se anadio un enlazador, por ejemplo, -Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 513) en el extremo C de cada peptido. Se acetilo cada peptido en el extremo N. Se protegieron residuos de lisina seleccionados con 1 -(4,4-dimetil- 2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutil (ivDde) donde fue apropiado. El grupo protector permite el acoplamiento selectivo a la lisina C-terminal, no se elimina durante la escision del peptido, pero puede eliminarse despues del acoplamiento con hidrazina en DMF al 2 % o hidroxilamina 0,5 M, pH 8, en agua.
Cada peptido se marco con fluorescefna en la lisina C-terminal usando fluorescefna (derivado de ester de N- hidroxisuccinimida) o isotiocianato de fluorescefna (FITC) en DMF con diisopropiletilamina (DIPEA) al 2 %. En el caso en que el peptido contenfa una lisina protegida con ivDde, la reaccion se desactivo mediante la adicion de hidrazina al 2 %, que reacciona con toda la NHS-fluorescefna libre y elimina el grupo protector interno. Para todos los demas peptidos, la reaccion se desactivo mediante la adicion de un volumen equivalente de hidroxilamina 0,5 M, pH 8. Las reacciones desactivadas se diluyeron despues con agua hasta menos del 10 % de DMF y despues se purificaron usando cromatograffa de fase inversa C18. Los peptidos se verificaron analizandolos para evaluar las masas esperadas usando un sistema de CL-EM (HPLC HP1100 con espectrometro de masas cuadrupolar sencillo AP150 de SCIEX en lfnea) y se determino la pureza de los peptidos.
Ejemplo 6: Medidas de anisotropfa de fluorescencia
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se realizaron medidas de anisotropfa de fluorescencia en microplacas de 384 pocillos en un volumen de 10 pi de tampon de union (PBS, Tween-20 al 0,01%, pH 7,5) usando un lector de placas de polarizacion de fluorescencia Polarion de Tecan (Caracas, Venezuela). La concentracion de peptido marcado con fluorescefna se mantuvo constante (20 nM) y se vario la concentracion de protefna de fusion de cMet-Fc (o un objetivo similar). Las mezclas de union se equilibraron durante 10 minutos en la microplaca a 30 °C antes de la medida. El cambio observado en la anisotropfa se ajusto a la ecuacion que figuraura a continuacion mediante regresion no lineal para obtener la Kd aparente. Esta ecuacion (1) supone que los peptidos sinteticos y cMet forman un complejo reversible en solucion con estequiometrfa 1:1.
imagen1
donde robs es la anisotropfa observada, rlibre es la anisotropfa del peptido libre, runido es la anisotropfa del peptido unido, Kd es la constante de disociacion aparente, cMet es la concentracion total de cMet y P es la concentracion total de peptido marcado con fluorescefna. La Kd se calculo en un ensayo de union directa (Kd,u) y, por lo tanto, estos valores representan la union de cMet al peptido marcado con fluorescefna.
Ejemplo 7: Ensayos de polarizacion de fluorescencia de competencia de peptidos
Se realizaron ensayos de polarizacion de fluorescencia de competencia de peptidos para determinar que peptidos compiten entre sf por la union a cMet. Esto identificarfa complejos peptfdicos heteromericos potenciales que presentan una afinidad mayor por el receptor cMet que un peptido individual solo.
Brevemente, la competencia cruzada de peptidos de union a cMet se realizo en un manipulador de lfquidos cartesiano (Irvine, CA) en un volumen total de reaccion de 3 pl. Los peptidos marcados con fluorescefna se diluyeron hasta una concentracion final de 20 nM y los peptidos competidores no marcados se diluyeron hasta una concentracion final de 10 pM. La protefna de fusion de cMet-Fc se diluyo hasta la Kd para cada peptido marcado con fluorescefna en la reaccion. Las mezclas de union se equilibraron durante 10 minutos en la microplaca a 30 °C antes de medir ningun cambio en la anisotropfa. A partir de estos estudios, se identificaron como no competidores tres pares de peptidos de union a cMet y representan candidatos ideales para complejos de peptidos de union a cMet (vease la tabla 9).
Ejemplo 8: Procedimiento general para la preparacion de complejos heteromericos de peptidos de union a cMet
Cada uno de los dfmeros consiste en una secuencia que soporta el ligando 6-PnAO quelante de Tc (generalmente denominada A) y una porcion espaciadora funcionalizada (espaciador = JJ, J = acido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico) (denominada genericamente B). El compuesto B se trato con un exceso de 10 veces de ester de bis NHS de acido glutarico (Tyger Scientific, Princeton, NJ) y un exceso de ~20 veces de diisopropiletilamina a temperatura ambiente en DMF durante 30 minutos. La mezcla de reaccion se diluyo con eter (15 veces en volumen) lo que dio lugar a la precipitacion del ester de mono-NHS del peptido glutarilado. El eter se decanto y el solido se lavo tres veces mas con eter, lo que elimino cualquier traza de ester de bis NHS de acido glutarico sin reaccionar. El solido resultante se resuspendio en DMF seco y se anadio el compuesto A (1 equiv.) seguido por diisopropiletilamina (20 equiv) y la mezcla se agito durante 24 horas a temperatura ambiente. Se diluyo la mezcla con agua (50 veces) y se cargo la mezcla directamente en una columna de HPLC de fase inversa, que se eluyo con un gradiente de acetonitrilo (TFA al 0,1 %) en agua (TFA al 0,1 %). Las fracciones que contenfan el producto deseado se combinaron y liofilizaron para proporcionar los materiales deseados.
Ejemplo especffico: Preparacion de complejos heterodimericos de peptidos de union a cMet
1) Preparacion de un peptido de secuencia SEQ ID NO: 514 modificado con PnAOG-Glut (un compuesto de tipo A)
A una solucion de 6-Glutaril-PnAO (40 mg, 0,1 mmol) en DMF seco (0,2 ml) se le anadieron N-hidroxisuccinimida (NHS, 14 mg, 0,12 mmol) y diisopropilcarbodiimida (DIC, 15 mg, 0,12 mmol) y se agito durante 4 h a temperatura ambiente. Se anadio eter:hexano (5 ml, 1:1) a la mezcla de reaccion. Se agito la mezcla y se elimino la solucion sobrenadante por decantacion, dejando atras la pasta en el matraz. La pasta se lavo con eter:hexano (1:1) (3x5 ml) y se disolvio en DMF seco (0,2 ml). A esta solucion se le anadieron la SEQ ID NO: 518 modificada con K-(ivDde) (50 mg, 0,017 mmol) y diisopropiletilamina (DIEA, 10 mg, 0,08 mmol) y la mezcla resultante se agito durante 18 horas. Se anadio hidrazina (10 pl) y la solucion se agito durante 30 min. La mezcla de reaccion se diluyo con agua (20 ml), se cargo en una columna de HPLC de fase inversa (C18) y se eluyo con un sistema de agua (TFA al 0,1 %)- acetonitrilo (TFA al 0,1 %). Las fracciones que contenfan el producto requerido (pureza > 95 %) se recogieron y se liofilizaron para proporcionar la SEQ ID NO: 518-(6-PnAO-Glut)) (vease el esquema 5 mostrado en la figura 11) como un solido esponjoso incoloro. El rendimiento fue de 25,1 mg (47,4 %).
2) Preparacion de un dfmero que contiene la SEQ ID NO: 514 enlazada a la SEQ ID NO: 515
A una solucion del peptido que contenfa la SEQ ID NO: 515 (un compuesto de tipo B) (10 mg, 0,0034 mmol) y diisopropiletilamina (10 mg, 0,08 mmol) en DMF seco (0,2 ml) se le anadio glutarato de disuccinimidilo (10 mg, 0,031 mmol) y se agito a temperatura ambiente durante 30 min. La mezcla de reaccion se diluyo con eter (3 ml) y se agito. Se decanto el sobrenadante, dejando atras el semisolido en el matraz. Este procedimiento de lavado del producto de
5 reaccion se repitio con eter (3x5 ml). El semisolido asf obtenido se disolvio en DMF seco (0,2 ml) y se anadieron el
peptido de SEQ ID NO: 514-(6-PnAo-Glut)) (10 mg, 0,0032 mmol) y diisopropiletilamina (10 mg, 0,08 mmol) y se agito la mezcla de reaccion durante 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se diluyo con agua (10 ml), se cargo en una columna de HPLC de fase inversa (C18) y se eluyo con un sistema de agua (TFA al 0,1 %)- acetonitrilo (TFA al 0,1 %). Las fracciones que contenfan el producto requerido (pureza > 95 %) se recogieron y se
10 liofilizaron para proporcionar el heterodfmero con la SEQ ID NO: 514 enlazada a la SEQ ID NO: 515 por medio de un
enlace 6-PnAO-Glut (vease el esquema 6 mostrado en la figura 12) como un solido esponjoso incoloro. Rendimiento: 6,7 mg (33 %). Las estructuras para este y otros heterodfmeros se muestran en las figura 13A-13C.
Ejemplo 9: (cancelado)
Ejemplo 10: Diseno de una biblioteca peptfdica de union a cMet de segunda generacion
15 La seleccion inicial de bibliotecas peptfdicas lineales y cfclicas identifico diversos aciertos positivos para cMet. Los aciertos de TN9 contienen un motivo altamente conservado (CxGpPxFxC, SEC ID N.°: 512, la 'p' se selecciona con menos fuerza que los aminoacidos en mayusculas). Se construyo una biblioteca que tenia miembros tanto ciclicos como lineales y se construyo en fagos que tenian una presentacion improvisada del gen III.
Tabla 1: TN9 y componentes lineales en la biblioteca de segunda generacion:
Bibliotecas de TN9 para cMet (bibliot. 2a N.° 1 de TN9 para cMet)
E = 0,64A + 0,12C + 0,12G + 0,12T Q = 0,12A + 0,64C + 0,12G + 0,12T J = 0,12A + 0,12C + 0,64G + 0,12T Z = 0,12A + 0,12C + 0,12G + 0,64T Nota: (0,64)36 = l,E-7
(0,64)39 = 2,5 E -8
Componente 1: Consenso de TN9 con una extension a la izquierda de 3 AA
R P cgc cct
S M G
ctcagcagtcactgtct tCC ATG Ggt
SET tct gaa act
T
aca
' , Weal.... .
e a g s*w h C s G P P t F e C w w Y
jej jqz jjz ejz zjj qez tgt e j z ggt cct cct eqj ttc jej tgc zjj zjj zez
GTEPTEAS '
gga aeg gag ccg act gaa GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt
Mhel**.. '
(SEC ID N.°: 518)
Bibliot 2a N.° 2 de TN9 para cMet: consenso de TN9 con una extension a la derecha de 3 AA

. S M G
ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt
Weal.....
S E T R P T tet gaa act ege cct AcA
e a g s i q C k G P P w F s C a m

y ■ . . ' ■ -
jej jqz jjz ejz ezz qej tgc eej ggt cct cct zjj' ttc ejz tgfe jqj ezj zez

.G T E P T . .E A S . -... ■ ■
ggA Acg gAg ccg AcT gAA GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt
NheI...
(SEC ID N.°: 519)
Bibliot 2a N.° 3 de TN9 para cMet SIQCKGPPWFSCAMY (SEC ID N.°: 537) con una extension a la izquierda de 3 AA
. SMG SETRPT
ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tet gaa act ege cct AcA
Weal.... . '
e a .g s i q C k G P P w F s C a m’
y '' . . -
jej jqz jjz ejz ezz qej tgc eej ggt cct cct zjj ttc ejz tgt jqj ezj zez
.G T E P .T. .E A ...S'. . -... ■ ■ - -..
ggA Acg gAg ccg AcT gAA GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt
Whel...
(SEC ID N.°: 520)
Bibliot 2a N.° 4 de TN9 para cMet SIQCKGPPWFSCAMY (SEC ID N.°: 537) con una extension a la derecha de 3 AA
SM G SE TRPT
ctcagcagtcactgtct E A G s i
y
gag gcc ggt ejz ezz zez
g t e P
jjz eqj jej ccg ctctgacagtctctgt
(SEC ID N.°: 521)
tcc atg ggt tct gaa
Ncol....

q C k G P P
qej tgc eej ggt cct cct

T E R P S A
AcT gAA cgt cct agt GOT
- NheI *..
act cgc cct AcA ■

w F s C a m
zjj ttc ejz tgt jqj ezj

S ' ' '
AGC Gtga ..
Bibliot 5a de TN9 para cMet 330-F05 YYGCKGPPTFECQWM (SEC ID N.°: 531) con extension a la derecha de 3 AA tres peptidos tienen la secuencia nucleo CKGPPTFEC (SEC ID N.°: 548)

‘ .. S K G S E T. R P T '
ctcagcaqtcactgtct tcc’atg ggt tct gAa act cgc cct AcA ■

■ ■ . - ■ - Neal...__ .. ......... .
EA Gyyg .CkG P P t Fe C qw
m
GAG GCT GGT zez zez jjz tgc eej ggt cct cct eqz ttc jej tgt qee zjj

ezj ' . ■ ' 1 ' * ■ :

g t e P T E R P S A S
jjz eqj jej ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt

. Nil el... , ■
(SEC ID N.°: 522)
Bibliot 6a de TN9 para cMet: 550-G12 AFFCSGPPTFMCSLY (SEC ID N.°: 536) con una extension a la derecha de 3 AA
dos peptidos tienen la secuencia nucleo CSGPPTFMC (SEC ID N.°: 549)
SMG SETRPT
ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gAa act cgc cct AcA
Ncol...
EAGa f fCs Gp Pt FmCs 1
y
GAG GCT GGT jqz zzq zzq tgt zqz ggt qqj cct eqz ttc ezj tgc ejq qzz zez '
g tePTERPSAS jjz eqj jej ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt
. Nhel..,
(SEC ID N.°: 523)
Bibliot 7a de TN9 para cMet, tres AA a la izquierda y se deja variar la primera P de gPP.
SMG
ctcagcagtcactgtct tCC ATG Ggt . Wcol....
eagqfkCaGpPs FaCwm t .
jej jqz jjz qej zzq eej tgt jqz ggt qqj ccg ejz ttc jqq tgt zjj ezj eqq — . '
G TEPTEAS gga acg gag ccg act gaa GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt
Nhel.. .
SETRPT tct gaa act cgc cct aca
(SEC ID N.°: 524)
Ejemplo 11: Analisis de 94-E08 y otros peptidos lineales seleccionados para la union a cMet.
El aislado lineal 94-E08 (SEC ID N.°: 454) tiene alta afinidad por cMet incluso aunque haya algunos otros peptidos aislados que tengan alguna homologfa con 94-E08 y con los que hayan tenido similitud muy limitada sobre regiones 5 muy cortas. Por lo tanto, se prepararon tres oligonucleotidos variables basados en 94-E08: (1) variando 13 primeros codones, manteniendo constantes los 7 ultimos; (2) variando 13 de los primeros 18, manteniendo 5 que mostraron alguna similitud con otros aislados fijos; y (3) variando los 13 ultimos codones, manteniendo los 5 primeros fijos, vease la Tabla 4 a continuacion.
Tabla 4.
Componente n.° 8 con variacion en las 13 primeras posiciones (SEC ID N.°: 550).

S M G S E
5'-tcactgtct tCC ATG Ggt tct gaa-
Scab.......| Ncol |

ydtwvfqfih zez jez eqz zjj jzj zzz qej .zzz ezz qez - .

e v p .G E L V A M Q

,j ej jzj qqj ggt gag ctg gtt get atg cag -
GGSGTEAS . ggt ggt agt ggt act gaa GCT AGO Gtga ctctgac-3*
I NheI |Scab........
Componente n.° 9 se fijan cinco AA y se extiende la variegacion a la posicion 18 (SEC ID N.°: 551).

S M G S E

5'-tcactgtct tCC ATG Ggt tct gaa- .
Scab........| Ncol |
yDTwvFqfih 2e2 gat act zjj jzj ttt qej 222 ezz qez -

EVpg elva MQ '
gag gtt qqj jjz jej qzj jzj jqj atg caa!
G G S G T E A S
ggt ggt agt ggt act gaa GCT AGC Gtga ctctgac-3'
I Wbel |Scab........
Componente n.° 10 se fijan los siete primeros AA y varfan los 13 ultimos (SEC ID N.°: 552).
S M G . s E 5'-tcactgtct tCC ATG Ggt tct gaa-
Scab.......| Ncol |
YDTWVFQFih tat gat act tgg gtt ttt caa ttt ezz qez - .
evpgelvamq jej jzz qqj jjz jej-qzj j z.j jqj ezj qzz!
G G S G T E A S ,
ggt ggt agt ggt act gaa GCT AGC Gtga ctctgac-3'
I NheI |Scab........
Diseno de oligonucleotidos para la construccion de la biblioteca peptfdica de segunda generacion (SEC ID N.°: 553-602; N.B. Loa oligonucleotidos marcados con "[RC]" constan del complemento inverso de la secuencia mostrada):
imagen2
gga acg gag ccg act gaa gct-3*

(CM2_BPL1) [RC] S’- gga acg gag ccg act gaa GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt-3’ .
(CM2_XBPS) [RC] 5'-CA Gtga
ctctgacagtctctgt-3'

<BPL1_CM2) [RC] 5’- gga acg gag ccg act gaa GCT AGC Gtga ctctgac -3*
<XBPS_CM2) [RC] 5’-act gaa GCT AGC Gtga

ctctgac -3-'
Atfiel. . .
vg n.° 2
(CM2_ZTPS) 5'-ctcagcagtcactgtct tcc at-3'
(CM2_TPLong) 5' -ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gAa act
egc cct AcA-3'
(CM2_V2) 5'-tct gAa act
ege cct AcA -
GAG GCT GGT ej2 zjj qez tgt ejz ggt cct cct eqj ttc jej tgc zjj zjj zez -
jjz eqj jej ccg AcT gAA cgt cct agt g-3'
(CM2_2BPL) [RC] 5'- ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt-3'
(CM2_XBPS) [RC] . 5'-CA Gtga

ctctgacagtctctgt-3' •

(BPL2_CM2) [RC] 5'- ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgac -3' ■
(XPL2_CM2) [RC] 5'- ct agt GCT AGC Gtga

ctctgac -3'
vg n.° 3 (CM2_ZTPS) (CM2__TPLong) ege cct AcA-3' [CM2_V3) ege cct AcA -
5'-ctcagcagtcactgtct tcc at-3'
5'-ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gAa act
5'-tct gaa act
jej jqz jjz ejz ezz qej tgc eej ggt cct cct zjj ttc ejz tgt j qj ezj zez -
ggA Acg gAg ccg AcT gAA GC-3*
(CM2_BPL1) [RC] 5'- gga acg gag ccg act gaa GCT AGC Gtga . ctctgacagtctctgt-3' .
(CM2_XBPS) [RC] S'-CA Gtga
ctctgacagtctctgt-3' ' . .
vg n.° 4
(CM2_ZTPS) 5'-ctcagcagtcactgtct tcc at-3'
(CM2_TPLong) 5 ’ -ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gAa act
cgc cct AcA-3'
(CM2_V4) 5'-tct gaa act

cgc cct AcA - . ;
gag gcc ggt ejz ezz qej tgc eej ggt cct cct zjj ttc ejz tgt jqj ezj zez -
jjz eqj jej ccg AcT gAA cgt cct agt GC -3’

(CM2_2BPL) [RC] 5'- ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt-3' .
<CM2 XBPS) [RC] S'-CA Gtga

ctctgacagtctctgt-3' - - - •
vg n.° 5
(CM2_ZTPS.) 5'-ctcagcagtcactgtct tcc at-3'
(CM2_TPLong). . 5 *-ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt. tct gAa . act

cgc cct AcA-3' . t--. '
(CM2_V5) 5*-tct gAa act
cgc cct AcA -
GAG GCT GGT zez zez jjz tgc eej ggt cct cct eqz ttc jej tgt qee zjj ezj -
jjz eqj jej ccg AcT gAA cgt cct agt GC-3'
(CM2_2BPL) [RC] 5'- ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt-3'
(CM2_XBPS) [RC] 5'-CA Gtga
ctctgacagtctctgt-3' vg n.° 6
(CM2_ZTPS) 5'-ctcagcagtcactgtct tcc at-3*
{CM2_TPLong) 5'-ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gAa act
cgc cct AcA-3'
(CM2_V6) 5'-tct gAa act
cgc cct AcA -
GAG GCT GGT jqz zzq zzq tgt zqz ggt qqj cct eqz ttc ezj tgc ejq qzz zez
jjz eqj jej ccg AcT gAA cgt cct agt GC-3’
(CM2_2BPL) [RC] 5'- ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt-3'
(CM2_XBPS) [RC] 5 ’ —CA Gtga
ctctgacagtctctgt-3' vg n.° 7
(CM2_ZTPS) 5'-ctcagcagtcactgtct tcc at-3'
(CM2_TPLong) 5' -ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gAa act
cgc cct AcA-3'
(CM2_V7) - 5'-tct gaa act
cgc cct aca -
jej jqz jjz qej Z2q eej tgt jqz ggt qqj ccg ejz zzq jqq tgt zjj ezj eqq -
gga acg gag ccg act gaa GC-3’
(CM2_BPL1) [RC] 5*- gga acg gag ccg act gaa GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt-3'
<CM2_XBPS) [RC] 5'-CA Gtga
' !
ctctgacagtctctgt-3 ’
Componente n.° 8 varfan las 13 primeras posiciones.
(CM2_ZTPSAlt) 5'-tcactgtct tcc atg ggt tct gAa-3’
(CM2C8vg) 5'-tcactgtct tCC ATG Ggt tct gaa-
zez jez eqz zjj jzj zzz qej zzz ezz qez -
jej jzj qqj ggt gag ctg gtt get atg cag -
ggt ggt agt ggt act gaa GCT-3'
(L20botamp)[RC] 5'-ggt ggt agt ggt act gaa GCT AGC Gtga ctct
3’
Componente n.° 9 se fijan cinco AA y se extiende la variegacion a la posicion 18.
imagen3
Componente n.° 10 se fijan los siete primeros AA y varfan las 13 ultimos.
imagen4
Ejemplo 12: Construccion de una biblioteca peptfdica de union a cMet de segunda generacion.
El vector fagico DY3P82 se digirio con Nhel y Ncol, se depuro y se trato con fosfatasa alcalina. Los 10 moldes, CM2- V1 a CM2-V7, mas CM2-V8vg, CM2-V9vg y CM2-V10vg, se amplificaron por separado, usando los pares de cebadores indicados en la Tabla 5 a continuacion.
Tabla 5.
Molde
Sentido Antisentido
CM2_V1
CM2_TPLONG CM2_BPL1
CM2_V2
CM2J_TPLONG CM2_BPL1
CM2_V3
CM2_TPLONG CM2_BPL1
CM2_V4
CM2_TPLONG CM2_BPL1
CM2_V5
CM2_TPLONG CM2_BPL1
CM2_V6
CM2_TPLONG CM2_BPL1
CM2_V7
CM2_TPLONG CM2_BPL1
CM2_V8vg
CM2_ZTPSALT L20BOTAMP
CM2_V9vg
CM2_ZTPSALT L20BOTAMP
CM2_V10vg
CM2_ZTPSALT L20BOTAMP
5 Cada muestra se digirio por separado con Nhel y Ncol, se extrajo con fenol/cloroformo, y se mezclo en una
proporcion equimolar antes de realizar el ligamiento. Se uso una proporcion de vector:inserto de 1:5. Las
construcciones de ADN ligadas se sometieron a electroporacion en celulas DH5a. El tamano de la biblioteca
resultante fue de 1,12x105 * * 8 * 10 transformantes diferentes.
Ejemplo 13: Medida de la union de dimeros peptidicos a cMet
10 Usando una maquina BIAcore, se determinaron las constantes de union de los dimeros peptidicos (mostrado en las figura 13A-13C) unidos a cMet-Fc inmovilizado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Se entrecruzaron tres densidades de cMet-Fc (R&D Systems) con la superficie de dextrano de un chip sensor CM5 mediante el procedimiento de acoplamiento de aminas estandar (solucion 3 :M diluida 1:100, 1:50 o 1:20 con acetato 50 mM, pH 5,5). La celula de flujo I se activo y despues se bloqueo para que sirviera como sustraccion de referencia. Niveles de inmovilizacion finales alcanzados:
Rl Fc 2 cMet-Fc = 2582
Rl Fc 3 cMet-Fc = 5048
Rl Fc 4 cMet-Fc = 9721
Se realizaron experimented en tampon de PBST (fosfato 5,5 mM, pH 7,65, NaCl 0,15 M) + Tween-20 al 0,05 % (v/v)). Se disolvieron dfmeros peptfdicos en soluciones de H2O desionizada a 1 mg/ml. Los dfmeros se diluyeron hasta 50 nM en PBS. Se realizaron diluciones seriadas para producir soluciones 25, 12,5, 6,25 y 3,125 nM. Todas las muestras se inyectaron por duplicado. Por asociacion, los dfmeros se inyectaron a 30 :l/minuto durante 3 minutos usando el programa kinject. Tras una disociacion de 10 minutos, se separo todo el peptido restante de la superficie de cMet con dos quickinject de MgCl2 4 M durante 2 minutos a 50 :l/minuto. Se analizaron los sensogramas usando el programa informatico BIAevaluation 3.1. El heterodfmero, Ac-GSPEMCMMFP-FLYPCNHHAPGGGK{PnAO6-Glut- K[Ac-GSFFPCWRIDRFGYCHANAPGGGKJJ-Glut]-NH2}-NH2 (la SEQ ID NO: 514 enlazada a la SEQ ID NO: 515), presenta una Kd de 0,79 nM.
Ejemplo 14: Potenciacion de la residencia en suero de peptidos de union a cMet: conjugacion con maleimida
En la tecnica se sabe que los compuestos que contienen maleimida y otros grupos que pueden reaccionar con tioles reaccionan con tioles de protefnas sericas, especialmente albumina serica, cuando se inyectan los compuestos. Los aductos tienen tiempos de vida en suero similares al de la albumina serica, mas de 14 dfas en seres humanos, por ejemplo.
Se dispone de procedimientos que permiten la sfntesis directa de peptidos lineales marcados con maleimida (Holmes, D y otros, 2000. Bioconjug. Chem., 11:439-444).
Los peptidos que incluyen disulfuros pueden derivatizarse con maleimida de una de varias maneras. Por ejemplo, puede anadirse una tercera cistefna en el extremo carboxilo. La cistefna anadida se protege con un grupo protector que es ortogonal al tipo de grupos usados para las cistefnas que van a formar el disulfuro. El disulfuro se forma desprotegiendo selectivamente las cistefnas indicadas y oxidando el peptido. Despues, se desprotege la cistefna final y se hace reaccionar el peptido con un gran exceso molar de una bismaleimida. El compuesto resultante tiene una de las maleimidas libre para reaccionar con la albumina serica u otra protefna serica que contenga tiol.
De forma alternativa, se sintetiza un peptido cfclico de la presente invencion con una extension C-terminal que contiene lisina, tal como -GGGK (SEQ ID NO: 513). Las lisinas del motivo de union a cMet se protegen con ivDde y la lisina C-terminal se desprotege. Esta lisina se hace reaccionar con un compuesto que contiene maleimida, tal como ester de N-[e-maleimidocaproiloxi]succinimida (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) o ester de N-[a- maleimidoacetoxi]succinimida (Pierce Biotechnology).
Ejemplo 15: Potenciacion de la residencia en suero de peptidos de union a cMet: conjugacion con un resto que se une a albumina serica de forma no covalente
Los polipeptidos que tienen un peso molecular inferior a 50-60 kDa se excretan rapidamente. Muchas moleculas pequenas, tales como acidos grasos, se unen a la albumina serica. La union de un acido graso u otro resto de union a albumina serica a un peptido hace que este se una de forma no covalente a la albumina serica y puede prolongar enormemente la residencia en suero. Los acidos grasos unidos a peptidos de la presente invencion deberfan contener al menos 12 carbonos, preferentemente al menos 14 carbonos y, mas preferentemente al menos 16 carbonos. Los acidos grasos podrfan ser de cadena lineal o ramificada. Los acidos grasos podrfan ser saturados o insaturados. El palmato (CH3-(CH2)14-CO- es un acido graso preferido. Esta union en suero puede reducir la velocidad de excrecion (Knudsen, L. y otros, 2000. J. Med. Chem., 43:1664-1669). Usando procedimientos conocidos en la tecnica, pueden conjugarse restos de union a albumina serica con uno cualquiera de los peptidos o construcciones polipeptfdicas multimericas de union divulgadas en el presente documento. El resto de union a albumina serica puede unirse al peptido de union a cMet a traves de un enlazador. El enlazador puede ser peptfdico o de otro tipo, tal como PEG. Se prefieren enlazadores de cero a aproximadamente treinta atomos. Se prefiere que el enlazador sea hidrofilo. El resto de union a albumina serica puede conjugarse con el peptido o construccion de union a cMet en cualquiera de sus extremos a traves de un grupo lateral de un aminoacido unido. Los grupos laterales adecuados incluyen lisina y cistefna. Tales compuestos tambien pueden comprender, por ejemplo, quelantes para radionuclidos u otras marcas o construcciones terapeuticas detectables, como se analiza en el presente documento. Un peptido o construccion de cMet unido a un resto de union a albumina serica se unira a cMet.
Ejemplo 16: Potenciacion de la residencia en suero de peptidos de union a cMet: conjugacion con PEG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La union de PEG a protefnas y peptidos potencia la residencia en suero de estas moleculas. Se espera que la union de PEG (lineal o ramificado) a un peptido o construccion polipeptfdica multimerica de union a cMet proporcione una potenciacion sustancial del tiempo de residencia en suero. El peso molecular del PEG debe ser de al menos 10 kDa, mas preferentemente de al menos 20 kDa y, lo mas preferentemente, de 30 kDa o mas. El PEG puede unirse en los extremos N o C. Los procedimientos de union de PEG a peptidos son bien conocidos en la tecnica. El PEG puede unirse a grupos laterales reactivos tales como lisina o cistefna.
Ejemplo 17: Potenciacion de la residencia en suero de peptidos de union a cMet: fusion a protefnas sericas
Protefnas que comprenden albumina serica (AS) y otras protefnas tienen tiempos de residencia potenciados. La secuencia de aminoacidos de la AS humana (ASh) se muestra en la tabla 10. La tabla 11 1 muestra una protefna de fusion que comprende la (SEQ ID NO: 604), ASh madura y la SEQ ID NO: 605. Los peptidos de union a cMet estan separados de la ASh mediante enlazadores que son ricos en glicina para permitir un espaciamiento flexible. No es necesario usar toda la ASh para obtener una protefna inyectable que tendra un tiempo de residencia en suero potenciado. Grupos qufmicos, tales como la maleimida y los alfa bromo carboxilatos, reaccionan con la cistefna desapareada (residuo 34) para formar aductos estables. Por tanto, puede unirse un solo quelante a la protefna de fusion de ASh de forma que el aducto se unira a un radionuclido. Se puede preparar un quelante con un grupo maleimida y acoplarlo a la ASh o a un derivado de ASh. De forma alternativa, puede hacer reaccionar la ASh o el derivado de ASh con una bismaleimida y podrfa hacerse reaccionar un quelante que porte un grupo tiol reactivo con la ASh derivatizada con bismaleimida.
La construccion de genes que codifican una secuencia de aminoacidos dada se conoce en la tecnica. La expresion de fusiones de ASH en Saccharomyces cerevisiae se conoce en la tecnica.
Ejemplo 18: (cancelado)
Ejemplo 19: Union de peptidos de union a cMet/complejo de avidina HRP a celulas MDA-MB-231
Se determinaron los requisitos de longitud del espaciador para la union de un derivado biotinilado de un peptido de union a cMet, SEQ ID NO: 514, a celulas MDA-MB-231 que expresan cMet. Con el fin de decidir la longitud del espaciador que se debe situar entre el peptido y la biotina, se sintetizaron derivados sin espaciador, con un unico espaciador, J, y con dos espaciadores, JJ. Estos tres derivados diferentes del peptido de union a cMet de SEQ ID NO: 514 y un peptido de control que no se une a cMet, se probaron como complejos tetramericos con neutravidina HRP para evaluar su capacidad para unirse a celulas MB-231 que expresan cMet. Los tres complejos tetramericos de peptidos de union a cMet se unieron a las celulas MB231 en comparacion con el peptido de control; sin embargo, el peptido con el espaciador JJ presento la mejor Kd (12,62 nM). Esto indica que la inclusion de dos espaciadores (JJ) entre el peptido de union a cMet y la biotina es mejor que un espaciador o ninguno.
Cultivo Celular: se obtuvieron celulas MDA-MB231 de la ATCC y se hicieron crecer como un cultivo monocapa en su medio recomendado mas 1 ml/l de pen/step (InVitrogen, Carlsbad, CA). Las celulas se dividieron el dfa antes del ensayo, se anadieron 35000 celulas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
Union de peptido/neutravidina HRP a celulas MDA-MB-231
Se prepararon como se describe anteriormente complejos de peptido de control, y los derivados de SEQ ID NO: 514 descritos anteriormente, con neutravidina-HRP, y se probaron para evaluar su capacidad de unirse a celulas MDA- MB-231. Durante la preparacion del complejo de peptido/neutravidina-HRP, se uso un exceso de 7,5 veces de peptidos biotinilados con respecto a neutravidina-HRP para garantizar que se ocupaban los cuatro sitios de union de biotina de la neutravidina. Despues de la formacion del complejo, se elimino el exceso de peptidos biotinilados libres usando sefarosa-avidina de liberacion suave para evitar cualquier competicion entre los peptidos biotinilados libres y los peptidos biotinilados complejados con neutravidina-HRP. El experimento se realizo a varias concentraciones diferentes de peptido/neutravidina-HRP, desde 0,28 nM hasta 33,33 nM, para generar curvas de saturacion de union para derivados sin un espaciador J y con un unico espaciador J (figura 14), y de 0,28 nM a 16,65 nM para generar una curva de saturacion de union para el derivado con el espaciador JJ (figura 14). Con el fin de deducir la curva de saturacion de union, se resto la union de fondo del control de peptido/complejo de neutravidina HRP de la union de los derivados de SEQ ID NO: 514 complejados con neutravidina-HRP para cada concentracion probada. Por lo tanto, la absorbancia en el eje Y de la figura 14 es la absorbancia diferencial (peptido de union a cMet menos peptido de control) y no la absorbancia absoluta. El analisis de los datos de saturacion de union de la figura usando el programa informatico Graphic Pad Prism (version 3.0) proporciono una Kd de 12,62 nM (+/-3,16) para el derivado tetramerico con el espaciador JJ, de 155,4 nM (+/- 86,56) para el derivado tetramerico con el espaciador J y de 123,8 nM (+/- 37,71) para el derivado tetramerico sin un espaciador complejos peptfdicos. Tal como se esperaba, estas constantes de union son mas baja que las medidas por PF para el peptido de SEQ ID NO: 514 monodentado relacionado (880 nM).
Resultados: resulta evidente a partir de la figura 14 que el derivado con el espaciador JJ mostro una union a cMet sobre celulas MDA-MB-231 mucho mejor que cualquiera de los otros dos derivados, con una Kd de 12,62 nM despues de restar la union del peptido de control como union de fondo (n = 1). Esto indica que puede ser necesaria una determinada longitud minima de espaciador para alcanzar varios sitios de union diferentes en celulas lograr asf
la union multimerica. Esta longitud minima de espaciador podria depender del espaciado entre diferentes moleculas objetivo en celulas. Como en el caso donde el objetivo de union era el KDR, el ensayo de neutravidina-HRP con peptidos biotinilados identificados con presentacion en fagos fue util para identificar peptidos que pueden unirse a un objetivo inmovilizado incluso cuando la afinidad de la secuencia de union monomerica es demasiado baja para que 5 funcione bien un ensayo de tipo ELISA (con etapas de lavado despues de la union).
Tabla 6. Secuencias de peptidos de union a cMet
CLASE III
TN9 n.° 1:
SEQ ID NO:
Aislado Secuencia
SEQ ID NO:048
325-H05, AGSIQCKGPPWFSCAMYGT
SEQ ID NO:049
330-F05, AGYYGCKGPPTFECQWMGT
SEQ ID NO:050
333-F09, AGQFKCAGPPSFACWMTGT
SEQ ID NO:051
336-G04, AGWFQCKGPPSFECERHGT
SEQ ID NO:052
334-G06, AGWTHCIGPPTFECIPMGT
SEQ ID NO:053
330-B07, AGSFACKGPPTFACVEFGT
SEQ ID NO:054
330-C10, AGNYFCAGSPSFSCYFMGT
SEQ ID NO:055
331-G04, AGSWHCAGPPSFECWEFGT
SEQ ID NO:056
548-F06, AGWISCAGPPTFACWPGGT
SEQ ID NO:057
538-F08, AGFVNCKGPPTFECILTGT
SEQ ID NO:058
547-H07, AGDWICHGPPMFECEWVGT
SEQ ID NO:059
323-A11, AGYTSCVGPPSFECTPYGT
SEQ ID NO:060
333-H03, AGYFECKGPPTFECWLSGT
SEQ ID NO:061
329-D02, AGHAWCSGPPRFECWPPGT
SEQ ID NO:062
550-C09, AGHYWCAGPPTFICMGPGT
SEQ ID NO:063
548-E08, AGETTCLGWPTFVCVDYGT
SEQ ID NO:064
332-A05, AGHGTCRGWPTFECIYFGT
SEQ ID NO:065
330-C01, AGDWHCQGPPAFMCWMIGT
SEQ ID NO:066
545-A09, AGLPKCSGPPWFSCYYGGT
SEQ ID NO:067
334-C08, AGGWECTGPPWFQCGYYGT
SEQ ID NO:068
333-C05, AGDIVCTGHPYFECWSWGT
SEQ ID NO:069
551-B02,
SEQ ID NO:070
551-G12
SEQ ID NO:071
330-G09
SEQ ID NO:072
331-F01,
SEQ ID NO:073
274-B07,
SEQ ID NO:074
335-D11,
SEQ ID NO:075
336-D07,
SEQ ID NO:076
332-C03,
SEQ ID NO:077
331-D03,
SEQ ID NO:078
331-G06
SEQ ID NO:079
552-G03
SEQ ID NO:080
552-G11
SEQ ID NO:081
550-G08
SEQ ID NO:082
550-G12
SEQ ID NO:083
552-A01,
SEQ ID NO:084
548-C06,
SEQ ID NO:085
545-B12,
SEQ ID NO:086
549-F06,
SEQ ID NO:087
552-F01,
SEQ ID NO:088
547-H12,
SEQ ID NO:089
550-F11,
SEQ ID NO:090
548-D08,
SEQ ID NO:091
549-D02,
SEQ ID NO:092
552-F02,
SEQ ID NO:093
545-E04,
SEQ ID NO:094
545-E05,
SEQ ID NO:095
547-H03,
SEQ ID NO:096
552-G09
AGTWHCAGPPWFTCYMDGT
AGSWECTGPPSFHCQWYGT
AGHWICVGPPTFSCQWHGT
AGEWWCHGPPEFLCYWTGT
AGETVCYWLNGWFCVDDGT
AGSIQCVGPPSFECTPYGT
AGYSVCKGYPSFECAFFGT
AGVNSCLGPPTFECYQMGT
AGYWHCKGPPHFACEFHGT
AGNWICTGPPSFGCWYHGT
AGYWSCAGPPMFMCTWQGT
AGYWDCKGPPHFFCEWHGT
AGYFHCSGSPWFQCDYYGT
AGWYNCSGENFWNCKWIGT
AGWSDCLGPPQFTCVHWGT
AGTMYCLGPPTFICQQYGT
AGSYWCSGPPTFMCRYEGT
AGSTDCRGHPTFECWGWGT
AGSSPCKGWPTFECYFYGT
AGSIATTGWPYFSCIDLGT
AGQFYCSGPPTFQCIMIGT
AGPWKCTGPPTFSCIQFGT
AGNYWCSGPPSFICHAVGT
AGMTLCAGPPTFECYEVGT
AGETKCSGPPYFYCWMEGT
AGETFCVGNPSFECWSWGT
AGETFCSGWPTFECMQWGT
AGEIFCVGPPTFTCMWTGT
SEQ ID NO:097
550-A08, AGDFICQGPPSFVCTNIGT
SEQ ID NO:098
550-G07, AGAFFCSGPPTFMCSLYGT
SEQ ID NO:099
551-A05, AGWGWCSGPPMFMCTEYGT
SEQ ID NO:100
548-C10, GSEFECTGWPEFRCYEYAP
SEQ ID NO:101
465-C10, GSILYCINRNDPQCPYTAP
Motivo de consenso: G-X1-X2-X3-C-X4-G-X5-P-X6-F-X7-C-X8-X9-X10-G-T (SEQ ID NO: 527), donde: X1 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E, S, Y o W,
X2 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W, T o F,
X3 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W, H o F,
5 X4 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente A, K, S o T,

X5 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente P o W,

X6 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente T o S,

X7 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E o S,
X8 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W, Y, o I,

10 X9 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W, Y, M o E;
y
X10 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente Y.
CLASE IV 15 TN9 n.° 2:
SEQ ID NO:
Aislado Secuencia
SEQ ID NO:102
605-G10, SETRPTEAGDLICSGPPTFICTLYHTEPTE
SEQ ID NO:103
593-C01, SETRPTQAVRSQCSGPPTFECWYFGTEPTE
SEQ ID NO:104
592-C01, SETRPTEGGSWYCSGPPAFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:105
591-E01, SETRPTVASRWHCNGPPTFECWRYGTEPTE
SEQ ID NO:106
590-E01, SETRPTEAGTFHCSGPPTFECWSYGPKPTE
SEQ ID NO:107
589-B01, SETRPTEAGSLWCMGPPWFCCVIYGTQPTE
SEQ ID NO:108
607-A02, SETRPTEAGILHCSGPPTFECWWNYTEPTE
SEQ ID NO:109
590-F01, SETRPTESGRVHCPGPPWFRCARNGTEPTE
SEQ ID NO:110
589-C01, SETRPTAAGRILCTGPPWFSCAMYGTEPTE
SEQ ID NO:111
606-B11, SETRPTEAADWLCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:112
593-E01, SETRPTQVGRWQCDGPPTFACRSYGTEPTE
SEQ ID NO:113
592-F12, SETRPTEAGSTKCSGPPTFECWWFDTEPTE
SEQ ID NO:114
590-F07, SETRPTVAGSWHCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:115
588-D02, SETRPTEAGRNHCKGPPGFRCAMTDTEPTE
SEQ ID NO:116
607-H09, SETRPTETDFVYCRGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:117
590-H01, SETRPTSSGSRHCKGPPTFECWGYGTEPTE
SEQ ID NO:118
589-F01, SETRPTEAGSWRCSGPPTFECWWYETSPTE
SEQ ID NO:119
608-F11, SETRPTDAIRSYCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:120
606-D11, SETRPTEAGSWNCSGPPAFECWWYGSEP.TE
SEQ ID NO:121
604-D04, SETRPTEAGSWQCSGPPTFECWSFGTEPTE
SEQ ID NO:122
602-A11, SETRPTEAGSWHCNGPPTFECWWYDMEPTE
SEQ ID NO:123
593-F02, SETRPTEAGRVSCLGPPTFECWWFVPEPTE
SEQ ID NO:124
591-H05, SETRPTDAGSWRCAGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:125
590-H06, SETRPTEPVTWQCTGPPTFECWWLGTEPTE
SEQ ID NO:126
588-F10, SETRPTDAVSTHCNGPPTFECYIYGTEPTE
SEQ ID NO:127
608-G03, SETRPTVAESWYCVGPPSFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:128
604-D09, SETRPTEAGSWNCSGPPTFECWSYQTEPTE
SEQ ID NO:129
602-A12, SETRPTEAGSGHCNGPPTFKCWWYDMEPTE
SEQ ID NO:130
592-G11, SETRPTDQDSWQCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:131
588-G01, SETRPTESTQVQCAGPPSFACWMTGTEPTE
SEQ ID NO:132
606-E05, SETRPTEVESWHCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:133
594-C07, SETRPTEAGSFHCSGPPTFECWLYWTDPTE
SEQ ID NO:134
592-H01, SETRPTEAGQFGCKGPPPFECKLMGRVPTE
SEQ ID NO:135
605-C05, SETRPTDTVTWHCNGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:136
594-E08, SETRPTEADRWHCDGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:137
593-B11, SETRPTEAGSIQCVGPPWFSCRMYVTEPTE
SEQ ID NO:138
590-C01, SETRPTVSGSWQCVGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:139
612-G11, SETRPTENGSWHCNGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:140
612-E08, SETRPTEAGSWHCSGPPIFECWWYDMEPTE
SEQ ID NO:141
612-A02, SETRPTVDGGWHCNGPPTFECWMYGTEPTE
SEQ ID NO:142
611-G01, SETRPTDAGTWNCTGPPSFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:143
610-G04, SETRPTWDGKWHCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:144
610-E06, SETRPTEAGSWRCSGPPTFECWWYYTEPTE
SEQ ID NO:145
610-C06, SETRPTEAGNWLCSGPPTFECWWYVTGPTE
SEQ ID NO:146
610-A04, SETRPTEGGNWHCSGPPTFECWLYGTEPTE
SEQ ID NO:147
612-D02, SETRPTEAGGWHCSGPPTFECWWFNMEPTE
SEQ ID NO:148
612-A12, SETRPTEVISWHCSGPPTFECYRYGTEPTE
SEQ ID NO:149
611-D03, SETRPTEVGSWHCNGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:150
610-G10, SETRPTLASTWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:151
610-A11, SETRPTEAGGWYCKGPPTFECWWDGTEPTE
SEQ ID NO:152
612-H02, SETRPTEAGGWFCSGPPTFECWWYDTVPTE
SEQ ID NO:153
612-B01, SETRPTEAATWQCSGPPTFECWGYGTEPTE
SEQ ID NO:154
610-C12, SETRPTEAGDYVCVGPPTFECYLMDAEPTE
SEQ ID NO:155
610-B01, SETRPTEAGGWYCSGPPSFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:156
612-H04, SETRPTESSSWHCSGPPTFECWRFGTEPTE
SEQ ID NO:157
612-B09, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWWYYAEPTE
SEQ ID NO:158
611-G07, SETRPTLAGNWQCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:159
611-E10, SETRPTEAGSWHCNGPPTFECWQYGTEPTE
SEQ ID NO:160
610-H02, SETRPTEAGSWECHGPPSFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:161
610-D03, SETRPTEAGSWRCSGPPTFECWWYDAEPTE
SEQ ID NO:162
610-B03, SETRPTEAGSWNCAGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:163
612-H05, SETRPTEAGSFYCSGPPTFECWQYVPEPTE
SEQ ID NO:164
612-F05, SETRPTEAGSWMCSGPPTFECWQYFTEPTE
SEQ ID NO:165
612-B10, SETRPTEAGSLHCSGPPTFECWWWETEPTE
SEQ ID NO:166
611-E11, SETRPTEEGVWHCNGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:167
610-F08, SETRPTEAGRWNCSGPPTFECWWYSTEPTE
SEQ ID NO:168
610-D05, SETRPTEAGSWRCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:169
610-B04, SETRPTQAVSSYCSGPPTFECWSFGTEPTE
SEQ ID NO:170
612-B12, SETRPTEAGRSYCSGPPTFECWWYATEPTE
SEQ ID NO:171
611-H01, SETRPTVVAKVHCAGPPTFECWTYGTEPTE
SEQ ID NO:172
610-H05, SETRPTEPGSWHCSGPPTFVCWWWGTEPTE
SEQ ID NO:173
610-F10, SETRPTEAGRWHCSGPPTFECWWHDTEPTE
SEQ ID NO:174
612-H07, SETRPTEAGSWQCTGPPTFECWGYVEEPTE
SEQ ID NO:175
612-G09, SETRPTEAGSWQCGGPPTFECWWYYTGPTE
SEQ ID NO:176
612-F08, SETRPTEAGSWYCTGPPTFECWLYETYPTE
SEQ ID NO:177
611-H08, SETRPTAAWSGSCSGPPSFECWNYGTEPTE
SEQ ID NO:178
610-E01, SETRPTEAGSWQCSGPPTFACWWYGTEPTE
SEQ ID NO:179
610-B09, SETRPTEAGILHCSGPPTFECWWEVMEPTE
SEQ ID NO:180
612-E07, SETRPTEAGRVACSGPPTFECWSYDEEPTE
SEQ ID NO:181
612-C11, SETRPTEAGNWECQGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:182
610-E04, SETRPTLASNGYCNGPPTFECWHYGTEPTE
SEQ ID NO:183
610-B12, SETRPTEAGSFHCSGPPTFECIWYGSEPTE
SEQ ID NO:184
616-B11, SETRPTEAGSWYCSGPPTFACWWDGTEPTE
SEQ ID NO:185
615-H08, SETRPTQGDNWNCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:186
615-B11, SETRPTEAGRWHCNGPPTFECWRYDYDPTE
SEQ ID NO:187
614-C07, SETRPTEAYSWECTGPPMFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:188
613-H12, SETRPTEVVDWHCSGPPQFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:189
613-F02, SETRPTEAGSWNCSGPPTFECWWYGSEPTE
SEQ ID NO:190
613-D05, SETRPTASGSWHCSGPPTFECWIFGTEPTE
SEQ ID NO:191
612-H12, SETRPTEAGAWYCMGPPTFECWWYDRGPTE
SEQ ID NO:192
616-D05, SETRPTEAGGLHCSGPPTFECWWYDTEPTE
SEQ ID NO:193
615-C01, SETRPTVGGSWDCKGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:194
614-E09, SETRPTEAGAWSCLGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:195
614-A03, SETRPTEAGSLHCSGPPTFECWWFDTEPTE
SEQ ID NO:196
616-C02, SETRPTAGRSWECSGPPTFECWVFGTEPTE
SEQ ID NO:197
615-C04, SETRPTDNGSWHCNGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:198
614-C12, SETRPTEAGSWQCKGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:199
615-C11, SETRPTEVGNYKCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:200
614-H08, SETRPTEAGSWHCVGPPTFECWGYVTEPTE
SEQ ID NO:201
614-E11, SETRPTEAGSFVCKGPPTFECYWFGQDPTE
SEQ ID NO:202
616-E10, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWWYGPDPTE
SEQ ID NO:203
615-D02, SETRPTEAERWHCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:204
614-F04, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWFYVKEPTE
SEQ ID NO:205
614-D06, SETRPTEAGSWDCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:206
614-B08, SETRPTEPAGWECRGPPSFECLWYGTEPTE
SEQ ID NO:207
613-H01, SETRPTDAGPWNCTGPPSFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:208
613-E04, SETRPTEARGWHCSGPPTFECWLWGTEPTE
SEQ ID NO:209
613-B08, SETRPTEAGRWNCSGPPTFECWQYEMDPTE
SEQ ID NO:210
615-D04, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECFWYDTEPTE
SEQ ID NO:211
615-A05, SETRPTESGSWHCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:212
614-E04, SETRPTEAGSWLCTGPPTFECWWFDTDPTE
SEQ ID NO:213
613-E06, SETRPTEPSHWHCVGPPTFACWWYVTDPTE
SEQ ID NO:214
613-C05, SETRPTEAGSWYCSGPPMFECYLFVTEPTE
SEQ ID NO:215
616-C07, SETRPTEAVNWHCLGPPSFECWQFGTEPTE
SEQ ID NO:216
615-G02, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWWYGTDPTE
SEQ ID NO:217
615-E06, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWSFVSLPTE
SEQ ID NO:218
615-A08, SETRPTEGSEWSCIGPPSFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:219
614-G01, SETRPTEDGYWNCSGPPTFECWWHGTEPTE
SEQ ID NO:220
613-001, SETRPTEAGSWSCSGPPTFECWPYYTEPTE
SEQ ID NO:221
614-G02, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWWYWPEPTE
SEQ ID NO:222
614-E06, SETRPTDDGRWSCAGPPTFECWRYGTEPTE
SEQ ID NO:223
620-E11, SETRPTEGGSWSCGGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:224
620-A11, SETRPTVTGSWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:225
618-F04, SETRPTEASSWYCTGPPAFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:226
617-G06, SETRPTEAGSWLCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:227
616-G06, SETRPTESVRWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:228
620-F10, SETRPTEAGRLVCSGPPTFMCRTYATDPTE
SEQ ID NO:229
619-G04, SETRPTEAGSWECTGPPWFVCRQYAIEPTE
SEQ ID NO:230
618-F12, SETRPTEAGYLYCSGPPTFECWWYDTMPTE
SEQ ID NO:231
618-B06, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:232
617-E09, SETRPTEAGNWHCLGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:233
616-F10, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWWYDTEPTE
SEQ ID NO:234
620-B11, SETRPTESGGWYCSGPPAFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:235
619-G07, SETRPTVAGAVSCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:236
619-E11, SETRPTEAGRWYCSGPPTFECWWFLPDPTE
SEQ ID NO:237
619-B12, SETRPTEAGGWHCSGPPSFECWWFDTVPTE
SEQ ID NO:238
618-G11, SETRPTGVGGWYCSGPPSFECWLYGTEPTE
SEQ ID NO:239
618-B11, SETRPTQADYLHCSGPPTFECFWYGTEPTE
SEQ ID NO:240
617-F01, SETRPTGDGNWHCNGPPTFECWRFGTEPTE
SEQ ID NO:241
617-B01, SETRPTEASNYHCIGPPTFECFWYGTEPTE
SEQ ID NO:242
616-G12, SETRPTEAGDWLCKGPPTFECWWQVTDPTE
SEQ ID NO:243
620-G01, SETRPTEAGSWHCNGPPTFECWWYSSDPTE
SEQ ID NO:244
620-C10, SETRPTEDGGWRCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:245
619-G09, SETRPTEAGRIECKGPPWFSCVIYGTEPTE
SEQ ID NO:246
619-F06, SETRPTGGGSWNCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:247
618-C03, SETRPTEAGSLYCSGPPTFECWWYITHPTE
SEQ ID NO:248
617-F02, SETRPTEAGRWHCSGPPRFECWWYDTEPTE
SEQ ID NO:249
616-H01, SETRPTEYGSWHCSGPPTFECWYHGTEPTE
SEQ ID NO:250
618-D01, SETRPTEAGNWHCSGPPSFECWWYATEPTE
SEQ ID NO:251
617-F03, SETRPTEQGSWHCKGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:252
616-H03, SETRPTDAANYHCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:253
616-G02, SETRPTEAGSWYCSGPPMFECWWLAEEPTE
SEQ ID NO:254
620-G09, SETRPTEAGGWYCSGPPAFECWWYATEPTE
SEQ ID NO:255
620-D12, SETRPTEAGIWSCSGPPTFECWWYESSPTE
SEQ ID NO:256
619-A09, SETRPTEEGLRVCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:257
618-D06, SETRPTEAGSWLCFGPPTFECWSFGTEPTE
SEQ ID NO:258
617-H12, SETRPTVAGSWDCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:259
616-H05, SETRPTKADNWHCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:260
619-H10, SETRPTEAGIVYCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:261
619-D03, SETRPTEAGYWHCLGPPTFECWWYVKEPTE
SEQ ID NO:262
618-D12, SETRPTEPGLLHCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:263
620-E04, SETRPTEASSWYCSGPPSFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:264
620-A05, SETRPTEAGSWHCLGPPTFECWWYVKEPTE
SEQ ID NO:265
619-D04, SETRPTEAGIILCKGPPWFSCDIYDTGPTE
SEQ ID NO:266
618-A11, SETRPTAAGNWHCSGPPTFECWAYGTEPTE
SEQ ID NO:267
617-D07, SETRPTVGGSWYCSGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:268
627-A10, SETRPTEDGWLDCKGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:269
626-H02, SETRPTEDGNWHCSGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:270
626-F06, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWYYWPEPTE
SEQ ID NO:271
624-D02, SETRPTEAGSLYCSGPPMFECWWYDWYPTE
SEQ ID-NO:272
622-D09, SETRPTEAGGWYCMGPPAFECWWYASEPTE
SEQ ID NO:273
621-F11, SETRPTNAGSWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:274
621-B11, SETRPTEASRWHCNGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:275
627-B03, SETRPTEAGSFVCSGPPTFECWWYNTGPTE
SEQ ID NO:276
626-H03, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:277
626-F07, SETRPTESDIWLCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:278
626-D02, SETRPTDADPWHCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:279
625-B03, SETRPTEAGVVLCSGPPTFECWWYDTEPTE
SEQ ID NO:280
622-D10, SETRPTEVGSVHCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:281
621-G02, SETRPTEAGRWLCSGPPTFECWEYDTEPTE
SEQ ID NO:282
621-E04, SETRPTDAGWLQCSGPPTFECWWYGTEPTE.
SEQ ID NO:283
621-B12, SETRPTEASRRHCNGPPTFECWRYGTEPTE
SEQ ID NO:284
626-H04, SETRPTEAGRWYCSGPPTFECWLFVEEPTE
SEQ ID NO:285
626-F11, SETRPTAADSWQCSGPPTFECWSFGTEPTE
SEQ ID NO:286
626-D03, SETRPTEAGSWHCGGPPTFECWMYVTEPTE
SEQ ID NO:287
626-A02, SETRPTDDGSWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:288
623-E07, SETRPTEAGYWHCLGPPTFECWWYDMEPTE
SEQ ID NO:289
622-G09, SETRPTEAGILRCSGPPTFECWYYETEPTE
SEQ ID NO:290
622-E05, SETRPTEDVSVHCAGPPTFECWLYGTEPTE
SEQ ID NO:291
622-B12, SETRPTEEGVFQCVGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:292
621-G07, SETRPTEDGGFFCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:293
621-E07, SETRPTEPGSWHGSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:294
621-C01, SETRPTEAGSWHCSGPPTFECWWYDRAPTE
SEQ ID NO:295
626-A05, SETRPTEAGTWYCSGPPTFECWYYATEPTE
SEQ ID NO:296
623-G02, SETRPTEAGSLYCSGPPAFECYWYGTVPTE
SEQ ID NO:297
622-H11, SETRPTDPGVLHCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:298
622-C04, SETRPTEAGTWYCLGPPTFECWSFWQDPTE
SEQ ID NO:299
621-G11, SETRPTEAGRWGCSGPPTFECWWYVAEPTE
SEQ ID NO:300
621-C07, SETRPTEAGIWHCAGPPTFICWLYETEPTE
SEQ ID NO:301
627-C03, SETRPTEAGSWHCSGPPSFECWQYSTEPTE
SEQ ID NO:302
626-D12, SETRPTEAGSWQCSGPPTFECWVYETEPTE
SEQ ID NO:303
626-A06, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWWYDVGPTE
SEQ ID NO:304
623-H02, SETRPTDEVSWECRGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:305
623-B05, SETRPTEGGSWVCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:306
622-E10, SETRPTEYGSWYCSGPPTFECWWLGTEPTE
SEQ ID NO:307
622-C06, SETRPTEAGVWLCSGPPTFECWWYDTDPTE
SEQ ID NO:308
621-H03, SETRPTMAGSYYCSGPPTFECWVYGTEPTE
SEQ ID NO:309
621-E11, SETRPTEAGYVQCYGPPSFVCHPMVPDPTE
SEQ ID NO:310
621-C08, SETRPTEDGFVLCKGPPWFSCEMYGTEPTE
SEQ ID NO:311
627-C04, SETRPTEAGGWNCSGPPTFECWWYVTEPTE
SEQ ID NO:312
626-A07, SETRPTEDGSWECFGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:313
623-H08, SETRPTDAVSYVCKGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:314
622-F05, SETRPTEARSWHCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:315
627-A04, SETRPTASVSWHCSGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:316
626-G05, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWYYDMDPTE
SEQ ID NO:317
623-H11, SETRPTEAGSWLCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:318
622-F11, SETRPTGDGSWYCSGPPTFECWWLGTEPTE
SEQ ID NO:319
621-F03, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWWYFLDPTE
SEQ ID NO:320
626-F01, SETRPTEAGGWYCSGPPTFECWWFATEPTE
SEQ ID NO:321
621-F04, SETRPTEAGDLDCLGPPTFICRIYGTEPTE
SEQ ID NO:322
630-F06, SETRPTEAGSWQCVGPPTFECWSFGTEPTE
SEQ ID NO:323
630-A03, SETRPTEADSWYCSGPPTFECWLFGTEPTE
SEQ ID NO:324
629-F10, SETRPTQADSWYCSGPPTFECWWWGTEPTE
SEQ ID NO:325
629-D11, SETRPTEAFSWDCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:326
629-B06, SETRPTEAGSWQCSGPPVFECWWYDTEPTE
SEQ ID NO:327
628-H01, SETRPTEAGNVQCSGPPTFECWWFDTEPTE
SEQ ID NO:328
628-F03, SETRPTEAGSWCSGPPRFECWAFVTEPTE
SEQ ID NO:329
627-G02, SETRPTEDGTLHCSGPPTFACWWYGTEPTE
SEQ ID NO:330
629-E01, SETRPTDAEVWVCNGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:331
628-H09, SETRPTEDVTFHCSGPPTFECWLYGTEPTE
SEQ ID NO:332
628-A05, SETRPTSDFDWHCKGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:333
627-G04, SETRPTEADSWYCSGPPTFECWWYVPEPTE
SEQ ID NO:334
630-A05, SETRPTDDGNWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:335
629-E03, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWRYDTDPTE
SEQ ID NO:336
629-C02, SETRPTEAGPWSCSGPPTFECWWFDTEPTE
SEQ ID NO:337
628-H10, SETRPTEAGMFLCSGPPAFECWWYDTEPTE
SEQ ID NO:338
628-F12, SETRPTEAGSLYCSGPPTFECWLYDVEPTE
SEQ ID NO:339
627-D12, SETRPTEAGQWNCSGPPTFECWWYDIEPTE
SEQ ID NO:340
630-G02, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWWFETEPTE
SEQ ID NO:341
629-E06, SETRPTEAGSFVCSGPPTFECWGYVTEPTE
SEQ ID NO:342
628-D07, SETRPTQDGTWFCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:343
627-E06, SETRPTEGDSWHCAGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:344
629-E07, SETRPTEAGSWSCSGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:345
629-C11, SETRPTEAGRIQCSGPPTFECWWYDEEPTE
SEQ ID NO:346
629-A03, SETRPTEAGTIVCKGPPWFSCEIYETEPTE
SEQ ID NO:347
628-A12, SETRPTEAGDWYCSGPPAFECWEYLGEPTE
SEQ ID NO:348
627-E08, SETRPTEAGSWFCSGPPSFECWSYVTEPTE
SEQ ID NO:349
629-E08, SETRPTEAGSWHCSGPPAFECWWYDNEPTE
SEQ ID NO:350
629-B02, SETRPTEAGRWTCSGPPTFECWWYVSDPTE
SEQ ID NO:351
628-E06, SETRPTEAGEWYCGGPPTFECWWFDTAPTE
SEQ ID NO:352
627-G09, SETRPTEAGSWHCSGPPSFECWWFDTGPTE
SEQ ID NO:353
631-A11, SETRPTEAGSFICSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:354
630-C10, SETRPTEDVRWYCSGPPTFECWWFGTEPTE
SEQ ID NO:355
628-B08, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWWYVPEPTE
SEQ ID NO:356
629-F03, SETRPTEAGNWLCSGPPAFECWWFVAEPTE
SEQ ID NO:357
632-A09, SETRPTEAGSWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:358
632-G07, SETRPTEAGDWLCAGPPTFECWWWGTDPTE
SEQ ID NO:359
631-F12, SETRPTEAGSWHCVGPPTFECWWFDTEPTE
SEQ ID NO:360
633-A02, SETRPTEAGEWSCSGPPTFECWWWDMEPTE
SEQ ID NO:361
633-B06, SETRPTYYVSWYCSGPPTFECWSYGTEPTE
SEQ ID NO:362
632-D11, SETRPTEDGSWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:363
631-D10, SETRPTEDGTWYCSGPPTFECWWYGTEPTE
SEQ ID NO:364
633-F09, SETRPTETDSWVCSGPPTFECWWYGTEPTE
Motivo de consenso n.° 1: G-X1-X2-X3-C-X4-G-P-P-X5-F-X6-C-X7-X8-X9-X10-X11-X12-P-T-E (SEQ ID NO: 528), donde:
XI es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente S, R, I, D o N,
X2 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W, L, F, V o I,
5 X3 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente H, Y, L, Q, N, o V,
X4 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente S, K o L,
X5 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente T, S, A o W,
X6 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E o S,
X7 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W,
10 X8 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W, S o L,
X9 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente Y o F,
X10 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente D, G, V o E,
XII es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente T, P, M o S,
y
15 X12 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E o G.
Motivo n.° 2: T-X2-X2-X3-X4-X5-X6-C-X7-G-P-P-X8-F-X9-C-X10-X11-X12-G (SEQ ID NO: 529), donde:
X1 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E, D, o V,
X2 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente A, D, G, S o V,
X3 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente G, V, D o S,
20 X4 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente S, N, R, T o G,
X5 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W,
X6 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente H o Q,
X7 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente S, N o K, X8 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente T,
X9 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E,
X10 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W,
5 X11 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W o S,
y
X12 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente Y o F. CLASE V (no reivindicada)
TN10:
SEQ ID NO:
Aislado Secuencia
SEQ ID NO:369
548-F07, GSPEMCMMFPFLYPCNHHAP
SEQ ID NO:370
551-H10, GSFFPCWRIDRFGYCHANAP
10 CLASE VIII (no reivindicada) TN12:
SEQ ID NO:
Aislado Secuencia
SEQ ID NO:399
545-H12, GDYSECFFEPDSFEVKCYDRDP
CLASE IX TN9 n.° 3:
SEQ ID NO:405
606-B08, SETRPTEAGSCHCSGPPTFQCWCYEVEPTE
SEQ ID NO:406
602-G12, SETRPTEAGSCHCSGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:407
603-E09, SETRPTGESDCHCSGPPTFECYCYGTEPTE
SEQ ID NO:408
606-C12, SETRPTESGNCYCSGPPWFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:409
603-H03, SETRPTEAGACRCSGPPTFECYCYDMAPTE
SEQ ID NO:410
604-G01, SETRPTEAGSCYCSGPPRFECWCYETEPTE
SEQ ID NO:411
602-G04, SETRPTEAGSCHCSGPPSFECWCFGTEPTE
SEQ ID NO:412
611-G11, SETRPTVSVSCSCGGPPTFECWCFGTEPTE
SEQ ID NO:413
611-F02, SETRPTEAGSCHCNGPPTFECFCFGTEPTE
SEQ ID NO:414
610-G02, SETRPTEAGSCYCGGPPSFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:415
614-E08, SETRPTEAGSCHCSGPPTFECWCYGSNPTE
SEQ ID NO:416
615-A01, SETRPTEAGSCHCSGPPAFECWCYRAEPTE
SEQ ID NO:417
617-H02, SETRPTEAGSCDCSGPPTFECWCFGTEPTE
SEQ ID NO:418
616-F12, SETRPTEAGKCHCGGPPSFECWCYATEPTE
SEQ ID NO:419
620-G06, SETRPTEAGKCHCSGPPTFECTCYHTDPTE
SEQ ID NO:420
627-B04, SETRPTEAGFCQCSGPPAFECWCYDTEPTE
SEQ ID NO:421
627-B06, SETRPTEAVSCECKGPPTFECWCFGTEPTE
SEQ ID NO:422
626-H05, SETRPTEAGDCHCSGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:423
626-D11, SETRPTEAGACDCIGPPTFECWCYDTYPTE
SEQ ID NO:424
626-E05, SETRPTEAGNCLCSGPPTFECACYHSEPTE
SEQ ID NO:425
621-D01, SETRPTEAGSCHCSGPPTFQCWCYSTEPTE
SEQ ID NO:426
622-A10, SETRPTEAGICHCSGPPTFECWCYATEPTE
SEQ ID NO:427
630-D09, SETRPTEEGSCHCSGPPTFECWCFGTEPTE
SEQ ID NO:428
628-D01, SETRPTEAGICNCSGPPTFECWCYSMGPTE
SEQ ID NO:429
628-F11, SETRPTQGGNCHCSGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:430
628-D04, SETRPTEAGSCNCSGPPTFECYCYTLDPTE
SEQ ID NO:431
630-G01, SETRPTDNGSCQCSGPPTFECWCFGTEPTE
SEQ ID NO:432
627-G06, SETRPTESGSCHCSGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:433
630-G05, SETRPTEAGSCNCSGPPSFECWCYVTEPTE
SEQ ID NO:434
630-C03, SETRPTEGGSCYCGGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:435
627-G07, SETRPTEAGRCHCSGPPTFECWCYVQEPTE
SEQ ID NO:436
630-H10, SETRPTESGSCLCSGPPQFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:437
628-B01, SETRPTETDSCHCIGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:438
630-F01, SETRPTEAGFCRCSGPPTFECWCYDTEPTE
SEQ ID NO:439
629-D01, SETRPTEHGSCNCYGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:440
633-G02, SETRPTALGGCLCSGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:441
631-F07, SETRPTEGGSCECSGPPTFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:442
633-G08, SETRPTEEGSCHCSGPPAFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:443
632-H07, SETRPTEAGTCYCSGPPTFECWCYGTEPTE
5
10
15
20
SEQ ID NO:444
631-D03, SETRPTEDGSCHCSGPPRFECWCYGTEPTE
SEQ ID NO:445
633-G12, SETRPTEAGSCHCSGPPTFECWCYSTEPTE
SEQ ID NO:446
633-H03, SETRPTEAGSCYCSGPPTFECWCYAEEPTE
SEQ ID NO:447
632-F05, SETRPTEAGSCHCSGPPTFECWCFEPEPTE
Motivo 13-1 G-X1-C-X2-C-X3-G-P-P-X4-F-X5-C-X6-C-X7-X8-X9-X10-P (SEQ ID NO: 534), donde X1 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente S,
X2 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente H, Y o N,
X3 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente S o G,
X4 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente T,
X5 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E,
X6 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W,
X7 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente Y,
X8 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente G, D, A, E o S,
X9 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente T o S, y X10 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E o D.
Motivo 13-2 es T-X1-X2-X3-X4-C-X5-C-X6-G-P-P-X7-F-E-C-X8-C-X9-G (SEQ ID NO: 535), donde: X1 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente E,
X2 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente A, S, E o G,
X3 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente G,
X4 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente S,
X5 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente H,
X6 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente S,
X7 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente T,
X8 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente W, Y o F, y X9 es cualquier aminoacido distinto de C, preferentemente Y o F.
CLASSE XI (no reivindicada)
Linear n.° 1:
SEQ ID NO:
Aislado Secuencia
SEQ ID NO:472
130-E10, AQEWEREYFVDGFWGSWFGIPH
Tabla 7. CLASE III
SEC ID N.°:
Aislado
ELISA de proteinas
ELISA de CC
HGF 100 ng/ml HGF 500 ng/ml
SEC ID N.°:048
325-H05 15,9 1,47 41 % 32 %
SEC ID N.°:049
330-F05 13,8 1,33 51 % 27 %
SEC ID N.°:050
333-F09 14,8 1,43 52 % 32 %
SEC ID N.°:051
336-G04 5,4 1,33 46 % 23 %
SEC ID N.°:052
334-G06 8,0 1,30 56 % 43 %
SEQ ID N.: 053
330-B07 18,1 1,27 58 % 40 %
SEC ID N.°:054
330-C10 13,4 1,33 48 % 25 %
SEC ID N.°:055
331-G04 18,3 1,47 56 % 36 %
SEC ID N.°:056
548-F06 14,3 1,23 76 % 18 %
SEC ID N.°:057
538-F08 12,3 1,23 55 % 43 %
SEC ID N.°:058
547-H07 15,9 1,17 60 % 45 %
SEC ID N.°:059
323-A11 21,2 1,43 41 % 18 %
SEC ID N.°:060
333-H03 8,1 1,43 55 % 37 %
SEC ID N.°:061
329-D02 3,2 1,27 53 % 31 %
SEC ID N.°:062
550-C09 10,2 1,40 25 % 25 %
SEC ID N.°:063
548-E08 5,3 1,27 102 % 50 %
SEC ID N.°:064
332-A05 6,0 1,40 40 % 21 %
SEC ID N.°:065
330-C01 4,7 1,30 58 % 43 %
SEC ID N.°:066
545-A09 13,5 1,30 44 % 22 %
SEC ID N.°:067
334-C08 8,0 1,47 7.0 % 57 %
SEC ID N.°:068
333-C05 6,3 1,33 83 % 6.6 %
SEC ID N.°:069
551-B02 9,0 1,30 69 % 43 %
SEC ID N.°:070
551-G12 3,9 1,37 88 % 46 %
SEC ID N.°:071
330-G09 13,5 1,40 42 % 26 %
SEC ID N.°:072
331-F01 12,6 1,47 77 % 73 %
SEC ID N.°:073
274-B07 7,8 1,10 342 % 296 %
SEC ID N.°:074
335-D11 6,7 1,37 56 % 37 %
SEC ID N.°:075
336-D07 5,8 1,33 44 % 37 %
SEC ID N.°:076
332-C03 5,7 1,20 37 % 95 %
SEC ID N.°:077
331-D03 5,5 1,40 64 % 55 %
SEC ID N.°:078
331-G06 4,7 1,40 59 % 51 %
SEC ID N.°:079
552-G03 10,7 1,27 101 % 83 %
SEC ID N.°:080
552-G11 7,4 1,23 55 % 41 %
SEC ID N.°:081
550-G08 9,1 1,40 79 % 58 %
SEC ID N.°:082
550-G12 14,3 1,43 61 % 79 %
SEC ID N.°:083
552-A01 3,9 1,33 76 % 81 %
SEC ID N.°:084
548-C06 13,0 1,23 94 % 77 %
SEC ID N.°:085
545-B12 17,1 1,27 51 % 42 %
SEC ID N.°:086
549-F06 5,2 1,30 96 % 40 %
SEC ID N.°:087
552-F01 4,8 1,30 56 % 37 %
SEC ID N.°:088
547-H12 5,6 1,10 92 % 81 %
SEC ID N.°:089
550-F11 12,4 1,23 58 % 23 %
SEC ID N.°:090
548-D08 19,5 1,23 97 % 62 %
SEC ID N.°:091
549-D02 8,9 1,27 47 % 36 %
SEC ID N.°:092
552-F02 12,3 1,23 60 % 40 %
SEC ID N.°:093
545-E04 16,3 1,23 48 % 17 %
SEC ID N.°:094
545-E05 10,3 1,27 70 % 32 %
SEC ID N.°:095
547-H03 16,2 1,23 109 % 53 %
SEC ID N.°:096
552-G09 9,7 1,27 98 % 68 %
SEC ID N.°:097
550-A08 8,4 1,27 52 % 51 %
SEC ID N.°:098
550-G07 6,2 1,27 63 % 36 %
SEC ID N.°:099
551-A05 4,0 1,30 68 % 42 %
SEQ ID N.°:100
548-C10 8,4 1,20 69 % 57 %
SEC ID N.°:101
465-C10 3,0 1,27 95 % 71 %
Nota: Los ELISA de protefna se midieron como numero de veces sobre el fondo (cMet-Fc frente a TRAIL-Fc).
Los ELISA de celulas completas se midieron como numero veces sobre el fondo (celulas 3T3 que expresan cMet humano frente a celulas 3T3 que no lo expresan).
El ELISA de competencia de HGF se midio como u % de union en ausencia de HGF.
5 Tabla 8: Analisis de polarizacion de fluorescencia de aciertos positivos de los peptidos seleccionados de la biblioteca peptfdica de primera generacion
CLASE III SEC ID N.°:
Aislado Kd (ser humano) Kd (raton)
SEC ID N.°: 048
325-H05 3,50 NE
SEC ID N,°: 051
336-G04 3,20 NE
SEC ID N,°: 052
334-G06 2,70 NE
SEC ID N,°: 053
330-B07 2,90 NE
SEC ID N,°: 055
331-G04 0,90 1,10
SEC ID N,°: 056
548-F06 2,70 NE
SEC ID N,°: 059
323-A11 4,30 NE
SEC ID N,°: 061
329-D02 5,20 NE
SEC ID N,°: 067
334-C08 1,65 NE
SEC ID N,°: 068
333-C05 2,80 NE
SEC ID N,°: 071
330-G09 1,85 NE
SEC ID N,°: 072
331-F01 0,98 NE
SEC ID N,°: 074
335-D11 3,30 NE
SEC ID N,°: 078
331-G06 2,90 NE
Los valores de Kd se dan en pm. SU= sin union, NE= no ensayado.
Tabla 9: complejos heteromericos de peptidos de union a cMet (PAR I-III no reivindicados)
PAR I
SEQ ID NO:
Aislado CLASE
SEQ ID NO:472
130-E10 XI
SEQ ID NO:370
551-H10 V
PAR II
SEQ ID NO:
Aislado CLASE
SEQ ID NO:369
548-F07 V
SEQ ID NO:370
551-H10 V
PAR III
SEQ ID NO:
Aislado CLASE
SEQ ID NO:370
551-H10 V
SEQ ID NO:399
545-H12 VIII
Tabla 10: Secuencia de aminoacidos de la SAH madura de la entrada de GenBank AAN17825
DAHKSEVAHR
FKDLGEENFK ALVLIAFAQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA
KTCVADESAE
NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNE
CFLQHKDDNP
NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY
APELLFFAKR
YKAAFTECCQ AADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC
ASLQKFGERA
FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTK VHTECCHGDL
LECADDRADL
AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA
DLPSLAADFV
ESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSWLLLRLA
KTYKTTLEKC
CAAADPHECY AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQ NCELFEQLGE
YKFQNALLVR
YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAE
DYLSVVLNQL
CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK
EFNAETFTFH
ADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD
FAAFVEKCCK
ADDKETCFAE EGKKLVAASR AALGL (SEQ ID NO: 603)
Tabla 11: Secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:604::ASH:
:SEQ ID NO:605
GSFFPCWRIDRFGYCHANAP
GSGGSGG
DAHKSEVAHR
FKDLGEENFK ALVLIAFAQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA
KTCVADESAE
NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNE
CFLQHKDDNP
NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY
APELLFFAKR
YKAAFTECCQ AADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC
ASLQKFGERA
FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTK VHTECCHGDL
LECADDRADL
AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA
DLPSLAADFV
ESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSWLLLRLA
KTYKTTLEKC
CAAADPHECY AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQ NCELFEQLGE
YKFQNALLVR
YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAE
DYLSVVLNQL
CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK
EFNAETFTFH
ADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD
FAAFVEKCCK
ADDKETCFAE EGKKLVAASR AALGL
GSGGEGGSG
GSWIICWWDNCGSSAP (SEQ ID NO: 606)

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un agente de contraste formador de imageries diagnosticas que comprende un polipeptido o un polipeptido multimerico que tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF que comprende la secuencia de aminoacidos
    Cys-Xi-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys (SEC ID N.°: 619), en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido,
    conjugado con un marcador apropiado para la deteccion diagnostica, opcionalmente mediante un enlazador,
    para su uso en la formacion de imagenes diagnosticas in vivo que implica detectar un trastorno hiperproliferativo, angiogenesis o neovascularizacion.
  2. 2. El agente de contraste formador de imagenes diagnosticas para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicha formacion de imagenes es una formacion de imagenes por resonancia magnetica, formacion de imagenes por ultrasonido, formacion de imagenes optica, formacion de imagenes por sonoluminiscencia, formacion de imagenes fotoacusticas, formacion de imagenes de rayos x, o formacion de imagenes por radionuclidos.
  3. 3. El agente de contraste formador de imagenes diagnosticas para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el marcador se selecciona de una enzima, un compuesto fluorescente, un agente de contraste por ultrasonido, un liposoma y un colorante optico.
  4. 4. El agente de contraste formador de imagenes diagnosticas para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el marcador se selecciona de un marcador radioactivo o un atomo metalico paramagnetico.
  5. 5. El agente de contraste formador de imagenes diagnosticas para el uso de la reivindicacion 4, en el que el
    ^ ^ ^ * 1S3 104 1 ho-'I 77 1 ~7f\
    marcador detectable es un marcador radioactivo seleccionado del grupo que consiste en F, 1, 1, I, Br, Br,
    99mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, 175Yb, 140La, 9oY, 88Y, 153Sm, 166Ho4 165Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 198Au y 199Au.
  6. 6. El agente de contraste de formacion de imagenes diagnosticas para el uso de la reivindicacion 4 en el que el marcador detectable es un atomo metalico paramagnetico seleccionado del grupo que consiste en Gd, Mn2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Eu3+, Dy3+, Pr3+, Cr3+, Co3+, Fe3+, TT, Tb3+, Nd3+, Sm3+, Ho3+, Er3+, Pa4+, y Eu2+.
  7. 7. El agente de contraste formador de imagenes diagnosticas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el polipeptido o polipeptido multimerico se incorpora en burbujas, micropartfculas, microesferas, emulsiones o liposomas, por ultrasonido.
  8. 8. Un metodo de purificacion de cMet o de un complejo de cMet y HGF de una solucion que lo contiene, que comprende las etapas de
    a) poner en contacto la solucion con al menos un polipeptido o un polipeptido multimerico que tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF que comprende la secuencia de aminoacidos Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys (sEc ID N.°: 619), en el que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido, inmovilizado sobre un sustrato solido; y
    b) separar dicho polipeptido o polipeptido multimerico de la solucion.
ES10185426.3T 2003-03-03 2004-03-03 Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet) Expired - Lifetime ES2557286T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45158803P 2003-03-03 2003-03-03
US451588P 2003-03-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2557286T3 true ES2557286T3 (es) 2016-01-25

Family

ID=32962606

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08008144T Expired - Lifetime ES2396368T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos
ES15157779.8T Expired - Lifetime ES2692166T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos
ES10185426.3T Expired - Lifetime ES2557286T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet)

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08008144T Expired - Lifetime ES2396368T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos
ES15157779.8T Expired - Lifetime ES2692166T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos

Country Status (13)

Country Link
US (6) US20050214859A1 (es)
EP (4) EP2284180B1 (es)
JP (4) JP5466350B2 (es)
AU (2) AU2004217894B2 (es)
CA (1) CA2517939C (es)
CY (1) CY1120683T1 (es)
DK (2) DK2284180T3 (es)
ES (3) ES2396368T3 (es)
HU (1) HUE039154T2 (es)
PL (2) PL2949658T3 (es)
PT (1) PT2949658T (es)
SI (1) SI2949658T1 (es)
WO (1) WO2004078778A2 (es)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8623822B2 (en) 2002-03-01 2014-01-07 Bracco Suisse Sa KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy
AU2003278807A1 (en) 2002-03-01 2004-08-13 Bracco International B.V. Kdr and vegf/kdr binding peptides and their use in diagnosis and therapy
US7261876B2 (en) 2002-03-01 2007-08-28 Bracco International Bv Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
US7794693B2 (en) 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
US7211240B2 (en) 2002-03-01 2007-05-01 Bracco International B.V. Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
ES2396368T3 (es) * 2003-03-03 2013-02-21 Dyax Corporation Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
NO20034350D0 (no) * 2003-09-29 2003-09-29 Amersham Health As Optisk avbilding av kolorektal kreft
US20060008844A1 (en) * 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
JP2008516629A (ja) * 2004-10-20 2008-05-22 ペアス インスティテュート アーベー 肝細胞増殖因子（ｈｇｆ）の生物活性に関する評価
WO2008005531A2 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Washington State University Research Foundation C-met receptor regulation by angiotensin iv (at4) receptor ligands
US8236761B2 (en) 2006-07-07 2012-08-07 Washington State University Research Foundation C-Met receptor regulation by angiotensin IV (AT4) receptor ligands
EP2114427B1 (en) 2007-01-30 2014-06-25 New York University Peptides for treatment of conditions associated with nitric oxide
ATE551073T1 (de) * 2007-05-16 2012-04-15 Ge Healthcare As Markierte hgf-bindende peptide für bildgebung
GB0718957D0 (en) * 2007-09-28 2007-11-07 Ge Healthcare Ltd Optical imaging agents
GB0718967D0 (en) * 2007-09-28 2007-11-07 Ge Healthcare Ltd Peptide imaging agents
US20100196272A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Neoprobe Corporation Compositions for radiolabeling diethylenetriaminepentaacetic acid (dtpa)-dextran
GB0918321D0 (en) 2009-10-20 2009-12-02 Ge Healthcare As Cyclic peptide synthesis
WO2011057078A2 (en) 2009-11-05 2011-05-12 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for detecting plectin-1 as a biomarker for cancer
GB201013808D0 (en) 2010-08-18 2010-09-29 Ge Healthcare Ltd Peptide radiotracer compositions
GB201103696D0 (en) * 2011-03-04 2011-04-20 Ge Healthcare Ltd Technetium labelled peptides
GB201116733D0 (en) 2011-09-28 2011-11-09 Ge Healthcare As Peptide margin imaging agents
GB201116862D0 (en) 2011-09-30 2011-11-09 Ge Healthcare As Infusion imaging method
GB201121914D0 (en) 2011-12-20 2012-02-01 Ge Healthcare Ltd Method for patient selection
WO2014074907A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-15 Indi Molecular, Inc. C-met-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
MX2015014438A (es) 2013-04-18 2016-05-18 Armo Biosciences Inc Metodos de uso de interleucina-10 para tratar enfermedades y trastornos.
EP3010527B1 (en) 2013-06-17 2018-08-08 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
CA2920835A1 (en) 2013-08-20 2015-02-26 Anutra Medical, Inc. Syringe fill system and method
GB201314936D0 (en) 2013-08-21 2013-10-02 Ge Healthcare Ltd Radiolabelling method
CN105658232A (zh) 2013-08-30 2016-06-08 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法
CA2927592C (en) 2013-10-28 2020-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Fgf-19 variants for treating a fgf-19 dependent cancer or tumor
CN120242030A (zh) 2013-11-11 2025-07-04 阿尔莫生物科技股份有限公司 将白细胞介素-10用于治疗疾病和病症的方法
GB201322456D0 (en) 2013-12-18 2014-02-05 Ge Healthcare Ltd Radiotracer compositions and methods
WO2015187295A2 (en) 2014-06-02 2015-12-10 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
USD763433S1 (en) 2014-06-06 2016-08-09 Anutra Medical, Inc. Delivery system cassette
USD750768S1 (en) 2014-06-06 2016-03-01 Anutra Medical, Inc. Fluid administration syringe
USD774182S1 (en) 2014-06-06 2016-12-13 Anutra Medical, Inc. Anesthetic delivery device
US10806803B2 (en) 2014-07-17 2020-10-20 Ohio State Innovation Foundation Compositions for targeting macrophages and other CD206 high expressing cells and methods of treating and diagnosis
EP3180431A1 (en) * 2014-08-11 2017-06-21 Miti Biosystems GmbH Cyclic peptides expressed by a genetic package
US20170343557A1 (en) * 2014-09-22 2017-11-30 Kenneth Kun-Yu WU Use of 5-methoxytryptophan as diagnostic agent of inflammatory diseases
WO2016060996A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
AU2015336101A1 (en) 2014-10-22 2017-04-20 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
US20160361415A1 (en) 2015-05-28 2016-12-15 Armo Biosciences, Inc. Methods of Using Interleukin-10 for Treating Diseases and Disorders
HK1245671A1 (zh) 2015-05-29 2018-08-31 Armo Biosciences, Inc. 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法
AU2016279804B2 (en) 2015-06-15 2019-03-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for treating aging-associated conditions
KR20180038553A (ko) 2015-08-25 2018-04-16 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 질환 및 장애를 치료하기 위한 인터류킨-10을 사용하는 방법
US11021514B2 (en) * 2016-06-01 2021-06-01 Athira Pharma, Inc. Compounds
WO2018022603A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of making 18f-labeled precursors and peptides, labeled c-met binding peptides, and methods of use thereof
WO2018052002A1 (ja) * 2016-09-13 2018-03-22 第一三共株式会社 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ １結合ペプチド
US11739163B2 (en) 2016-09-29 2023-08-29 Aebi Ltd. Therapeutic multi-targeting constructs and uses thereof
MX2019004029A (es) 2016-10-07 2019-09-27 Navidea Biopharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para diagnosis y tratamiento de infecciones virales.
GB201804835D0 (en) * 2018-03-26 2018-05-09 Ge Healthcare As Formulation and method of preparation
SG11202113333SA (en) * 2019-06-14 2021-12-30 Edinburgh Molecular Imaging Ltd Compounds and methods of use
JP7725466B2 (ja) 2019-11-13 2025-08-19 アムニクス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド バーコード化されたｘｔｅｎポリペプチドおよびその組成物、ならびにその作製および使用方法
TW202305012A (zh) * 2021-03-22 2023-02-01 日商肽夢想股份有限公司 c-Met 蛋白質結合肽複合物
JP7162853B1 (ja) 2021-07-02 2022-10-31 ペプチスター株式会社 液相ペプチド合成用担体結合ペプチドの分析方法
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
JP2025517414A (ja) 2022-05-20 2025-06-05 ナビディア、バイオファーマスーティカルズ、インコーポレイテッド 分解性リンカーを介して新規ビスホスホネート薬物ペイロードを担持するｃｄ２０６標的化薬物送達ビヒクル

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4180646A (en) 1975-01-28 1979-12-25 Alza Corporation Novel orthoester polymers and orthocarbonate polymers
US4093709A (en) 1975-01-28 1978-06-06 Alza Corporation Drug delivery devices manufactured from poly(orthoesters) and poly(orthocarbonates)
US4131648A (en) 1975-01-28 1978-12-26 Alza Corporation Structured orthoester and orthocarbonate drug delivery devices
US4391797A (en) 1977-01-05 1983-07-05 The Children's Hospital Medical Center Systems for the controlled release of macromolecules
US4718433A (en) 1983-01-27 1988-01-12 Feinstein Steven B Contrast agents for ultrasonic imaging
DE3313946A1 (de) 1983-04-15 1984-10-18 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Mikropartikel und gasblaeschen enthaltende ultraschall-kontrastmittel
DE3313947A1 (de) 1983-04-15 1984-10-18 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Mikropartikel und gasblaeschen enthaltende ultraschall-kontrastmittel
DE3834705A1 (de) 1988-10-07 1990-04-12 Schering Ag Ultraschallkontrastmittel aus gasblaeschen und fettsaeure enthaltenden mikropartikeln
US4900540A (en) 1983-06-20 1990-02-13 Trustees Of The University Of Massachusetts Lipisomes containing gas for ultrasound detection
US4899755A (en) 1985-05-08 1990-02-13 The General Hospital Corporation Hepatobiliary NMR contrast agents
MX174467B (es) 1986-01-23 1994-05-17 Squibb & Sons Inc 1,4,7-triscarboximetil-1,4,7,10-tetraazaciclodo decano substituido en 1 y compuestos analogos
US5021556A (en) 1987-07-22 1991-06-04 Neorx Corporation Method of radiolabeling chelating compounds comprising sulfur atoms with metal radionuclides
IE61591B1 (en) 1987-12-29 1994-11-16 Molecular Biosystems Inc Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent and method of production
US4844882A (en) 1987-12-29 1989-07-04 Molecular Biosystems, Inc. Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent
US5075099A (en) 1988-05-31 1991-12-24 Neorx Corporation Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5364613A (en) 1989-04-07 1994-11-15 Sieving Paul F Polychelants containing macrocyclic chelant moieties
WO1991003200A1 (en) 1989-08-28 1991-03-21 The General Hospital Corporation Hydroxy-aryl metal chelates for diagnostic nmr imaging
US5118797A (en) 1989-08-28 1992-06-02 E. R. Squibb & Sons, Inc. Rhenium tris dioxime complexes
US5585112A (en) * 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5305757A (en) 1989-12-22 1994-04-26 Unger Evan C Gas filled liposomes and their use as ultrasonic contrast agents
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US6146657A (en) * 1989-12-22 2000-11-14 Imarx Pharmaceutical Corp. Gas-filled lipid spheres for use in diagnostic and therapeutic applications
US5123414A (en) 1989-12-22 1992-06-23 Unger Evan C Liposomes as contrast agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same
US5230882A (en) 1989-12-22 1993-07-27 Unger Evan C Liposomes as contrast agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same
US5773024A (en) * 1989-12-22 1998-06-30 Imarx Pharmaceutical Corp. Container with multi-phase composition for use in diagnostic and therapeutic applications
US5871959A (en) * 1989-12-27 1999-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing hepatocycte growth factor/scatter factor and related cell lines
CA2034042C (en) 1990-01-18 1999-08-17 Adrian D. Nunn Boronic acid adducts of rhenium dioxime and technetium-99m dioxime complexes containing a biochemically active group
US5556610A (en) 1992-01-24 1996-09-17 Bracco Research S.A. Gas mixtures useful as ultrasound contrast media, contrast agents containing the media and method
IN172208B (es) 1990-04-02 1993-05-01 Sint Sa
US5578292A (en) 1991-11-20 1996-11-26 Bracco International B.V. Long-lasting aqueous dispersions or suspensions of pressure-resistant gas-filled microvesicles and methods for the preparation thereof
US5445813A (en) 1992-11-02 1995-08-29 Bracco International B.V. Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography
US5183653A (en) 1990-04-13 1993-02-02 E. R. Squibb & Sons, Inc. Boronic acid adducts of metal dioxime complexes useful in labelling proteins and other amine-containing compounds
US5137928A (en) 1990-04-26 1992-08-11 Hoechst Aktiengesellschaft Ultrasonic contrast agents, processes for their preparation and the use thereof as diagnostic and therapeutic agents
AU636481B2 (en) 1990-05-18 1993-04-29 Bracco International B.V. Polymeric gas or air filled microballoons usable as suspensions in liquid carriers for ultrasonic echography
US5173298A (en) 1990-09-27 1992-12-22 Allergan, Inc. Nonaqueous fluorinated drug delivery vehicle suspensions
US5367080A (en) 1990-11-08 1994-11-22 Sterling Winthrop Inc. Complexing agents and targeting radioactive immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic imaging compositions and methods
DE69230525T2 (de) 1991-02-08 2000-06-21 Diatide, Inc. Technetium-99m markierte Polypeptide zur Bildformung
US5849261A (en) 1991-02-08 1998-12-15 Diatide, Inc. Radiolabeled vasoactive intestinal peptides for diagnosis and therapy
US5965107A (en) 1992-03-13 1999-10-12 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for imaging
DE69232718T2 (de) 1991-02-22 2003-04-03 American Cyanamid Co., Madison Identifizierung eines menschlichen rezeptor-tyrosinkinasegens
GB9106686D0 (en) 1991-03-28 1991-05-15 Hafslund Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9106673D0 (en) 1991-03-28 1991-05-15 Hafslund Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
DK0586524T3 (es) 1991-06-03 1997-05-20 Nycomed Imaging As
FI940027A7 (fi) 1991-07-05 1994-01-04 Nycomed Imaging As Parannuksia itse varjoaineisiin tai parannuksia, jotka liittyvät niihi n
US5808091A (en) 1991-10-29 1998-09-15 Bracco International B.V. Rhenium and technetium complexes containing a hypoxia localizing moiety
GB9200387D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9200391D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9200388D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
IL104084A (en) 1992-01-24 1996-09-12 Bracco Int Bv Long-lasting aqueous suspensions of pressure-resistant gas-filled microvesicles their preparation and contrast agents consisting of them
US5861301A (en) 1992-02-20 1999-01-19 American Cayanamid Company Recombinant kinase insert domain containing receptor and gene encoding same
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
US5965132A (en) * 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5316921A (en) * 1992-05-18 1994-05-31 Genentech, Inc. Single-chain hepatocyte growth factor variants
ATE222603T1 (de) * 1992-05-18 2002-09-15 Genentech Inc Hepatozytwachstumfaktor variante
EP0656069A4 (en) * 1992-08-10 1996-07-10 Cambridge Neuroscience Inc CELL PROLIFERATION INHIBITORS, THEIR PRODUCTION AND USE.
AU687727B2 (en) 1992-10-28 1998-03-05 Genentech Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US5608110A (en) 1993-06-15 1997-03-04 Bracco International B.V. Heteroatom-bearing ligands and metal complexes thereof
PL312387A1 (en) 1993-07-02 1996-04-15 Molecular Biosystems Inc Proteinous microbeads of encapsulated non-dissolving gas and method of making them and their application as ultrasonic visualisation medium
ES2114209T3 (es) 1993-07-19 1998-05-16 Resolution Pharm Inc Queladores de radionuclidos de tipo hidrazino que tienen una configuracion n3s.
US5798091A (en) 1993-07-30 1998-08-25 Alliance Pharmaceutical Corp. Stabilized gas emulsion containing phospholipid for ultrasound contrast enhancement
US5574140A (en) 1993-09-03 1996-11-12 Resolution Pharmaceutical Inc. Hydrazino-type N2 S2 chelators
PT682530E (pt) 1993-12-15 2003-06-30 Bracco Research Sa Misturas de gases uteis como meios de contraste para ultrassons
GB9402867D0 (en) 1994-02-15 1994-04-06 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
EP0751992B1 (en) * 1994-03-08 2005-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
JP2891647B2 (ja) 1994-03-11 1999-05-17 株式会社日本触媒 有機スルフィド化合物及びその製造方法
US5770565A (en) 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
US5582814A (en) 1994-04-15 1996-12-10 Metasyn, Inc. 1-(p-n-butylbenzyl) DTPA for magnetic resonance imaging
CA2188292A1 (en) 1994-04-20 1995-11-02 Larry Margerum Contrast agents
US5707624A (en) * 1994-06-03 1998-01-13 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of Kaposi's sarcoma by inhibition of scatter factor
US5650135A (en) 1994-07-01 1997-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
US5662885A (en) 1994-07-22 1997-09-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Peptide derived radionuclide chelators
GB9417941D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
US5556939A (en) 1994-10-13 1996-09-17 Merck Frosst Canada, Inc. TC or RE radionuclide labelled chelate, hexapeptide complexes useful for diagnostic or therapeutic applications
US6645933B1 (en) * 1995-08-01 2003-11-11 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Receptor ligand VEGF-C
US6221839B1 (en) * 1994-11-14 2001-04-24 Helsinki University Licensing Ltd. Oy FIt4 ligand and methods of use
US6245530B1 (en) * 1995-08-01 2001-06-12 Ludwig Institute For Cancer Research Receptor ligand
US6403088B1 (en) * 1995-08-01 2002-06-11 Helsinki University Licensing, Ltd. Antibodies reactive with VEGF-C, a ligand for the Flt4 receptor tyrosine kinase (VEGFR-3)
US6333021B1 (en) 1994-11-22 2001-12-25 Bracco Research S.A. Microcapsules, method of making and their use
DE4445065A1 (de) 1994-12-07 1996-06-13 Diagnostikforschung Inst Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung
IL116328A (en) 1994-12-16 1999-09-22 Bracco Research Sa Frozen suspension of gas microbubbles in frozen aqueous carrier for use as contrast agent in ultrasonic imaging
TW319763B (es) 1995-02-01 1997-11-11 Epix Medical Inc
GB9502065D0 (en) 1995-02-02 1995-03-22 Nycomed Imaging As Contrast media
US5686292A (en) * 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US6521211B1 (en) 1995-06-07 2003-02-18 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Methods of imaging and treatment with targeted compositions
EP0831932B1 (en) 1995-06-07 2004-05-06 Imarx Pharmaceutical Corp. Novel targeted compositions for diagnostic and therapeutic use
US6361946B1 (en) * 1997-02-05 2002-03-26 Licentia Ltd Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
ES2202469T5 (es) * 1995-09-08 2011-06-06 Genentech, Inc. Proteína relacionada con el vegf.
AU1116297A (en) 1995-11-08 1997-05-29 Immunex Corporation Flk-1 binding protein
US5837680A (en) 1996-02-16 1998-11-17 Children's Medical Center Corporation Pharmaceutical compositions comprising troponin subunits, fragments and analogs thereof and methods of their use to inhibit angiogenesis
ES2197986T3 (es) 1996-02-19 2004-01-16 Amersham Health As Mejoras introducidas en o relacionadas con agentes de contraste.
AU726914B2 (en) 1996-04-01 2000-11-23 Epix Pharmaceuticals, Inc. Bioactivated diagnostic imaging contrast agents
NZ334365A (en) 1996-08-02 1999-10-28 Nycomed Imaging As Use of a contrast agent comprising microbubbles of biocompatible gas stabilised by opsonisable amphiphilic material for ultrasound imaging of the liver
TW320761B (en) * 1996-10-03 1997-11-21 Mos Electronics Taiwan Inc Manufacturing method of high density DRAM with cylindrical stack capacitor
JP2001502349A (ja) 1996-10-21 2001-02-20 ニユコメド・イメージング・アクシエセルカペト 造影剤におけるまたはこれに関する改良
EP0991427A2 (en) 1996-10-28 2000-04-12 Marsden, John Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
ATE314097T1 (de) 1996-10-28 2006-01-15 Amersham Health As Kontrastmittel
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
US6261537B1 (en) * 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
AU733495B2 (en) * 1996-10-28 2001-05-17 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
GB9708265D0 (en) 1997-04-24 1997-06-18 Nycomed Imaging As Contrast agents
ES2206689T3 (es) 1996-10-28 2004-05-16 Amersham Health As Agentes de contraste.
WO1998018498A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Marsden, John, Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
WO1998018501A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Marsden, John, Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
US7125714B2 (en) * 1997-02-05 2006-10-24 Licentia Ltd. Progenitor cell materials and methods
US5919967A (en) 1997-04-11 1999-07-06 Epix Medical, Inc. Process for synthesizing phosphodiesters
DE19717904A1 (de) 1997-04-23 1998-10-29 Diagnostikforschung Inst Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
US5886142A (en) 1997-05-20 1999-03-23 Thomas Jefferson University Radiolabeled thrombus imaging agents
US6245318B1 (en) 1997-05-27 2001-06-12 Mallinckrodt Inc. Selectively binding ultrasound contrast agents
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
GB9712525D0 (en) 1997-06-16 1997-08-20 Nycomed Imaging As Method
WO1998058053A1 (en) * 1997-06-18 1998-12-23 Merck & Co., Inc. Human receptor tyrosine kinase, kdr
AU742438C (en) 1997-10-02 2003-05-22 Lantheus Medical Imaging, Inc. Contrast-enhanced diagnostic imaging method for monitoring interventional therapies
CA2313390A1 (en) 1997-12-09 1999-06-17 Children's Medical Center Corporation Peptide antagonists of vascular endothelial growth factor
US6165458A (en) 1997-12-26 2000-12-26 Pharmaderm Laboratories Ltd. Composition and method for dermal and transdermal administration of a cytokine
JP4772958B2 (ja) 1998-02-09 2011-09-14 ブラッコ・リサーチ・ソシエテ・アノニム 生物学的に活性な媒質の標的に向けた送達
CA2320339A1 (en) 1998-02-11 1999-08-19 Resolution Pharmaceuticals Inc. Angiogenesis targeting molecules
US20020136721A1 (en) * 1998-02-17 2002-09-26 Schwall Ralph H. Hepatocyte growth factor receptor antagonists and uses thereof
EP1068224B1 (en) 1998-03-31 2005-05-11 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders
US6093382A (en) 1998-05-16 2000-07-25 Bracco Research Usa Inc. Metal complexes derivatized with folate for use in diagnostic and therapeutic applications
JP2002529421A (ja) 1998-11-06 2002-09-10 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト 血管過浸透性の阻害方法
US6312665B1 (en) 1998-12-21 2001-11-06 Generex Pharmaceuticals Incorporated Aerosol formulations for buccal and pulmonary application
JP2002542766A (ja) * 1999-03-12 2002-12-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ５０個のヒト分泌タンパク質
AU3249300A (en) * 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. 47 human secreted proteins
US20090087878A9 (en) * 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
US6294525B1 (en) 1999-09-01 2001-09-25 Molecumetics Ltd. Reverse-turn mimetics and methods relating thereto
GB9928950D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Metris Therapeutics Limited Binding protein
WO2001052875A1 (en) * 2000-01-18 2001-07-26 Ludwig Institute For Cancer Research Vegf-d/vegf-c/vegf peptidomimetic inhibitor
US7740841B1 (en) 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
AU2001228742A1 (en) * 2000-02-04 2001-08-14 Supratek Pharma, Inc. Ligand for vascular endothelial growth factor receptor
AU2001239884B2 (en) 2000-02-25 2006-08-10 Vegenics Limited Materials and methods involving hybrid vascular endothelial growth factor DNAs and proteins and screening methods for modulators
ATE284701T1 (de) 2000-03-02 2005-01-15 Ludwig Inst Cancer Res Methode zur behandlung von tumoren welche den vaskulären endothelialen wachstumsfaktor d exprimieren
US20020102260A1 (en) * 2000-03-02 2002-08-01 Marc Achen Methods for treating neoplastic disease characterized by vascular endothelial growth factor D expression, for screening for neoplastic disease or metastatic risk, and for maintaining vascularization of tissue
US6769080B2 (en) * 2000-03-09 2004-07-27 Texas Instruments Incorporated Scan circuit low power adapter with counter
US20010031485A1 (en) 2000-03-22 2001-10-18 Sibtech, Inc. Recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor fragments
EP1265635A1 (en) 2000-03-22 2002-12-18 Glaxo Group Limited Pharmaceutical comprising an agent that blocks the cell cycle and an antibody
AU4445601A (en) * 2000-03-31 2001-10-08 Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2001083693A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Glaxo Group Limited Compounds having affinity for the vascular endothelial growth factor receptor-2 (vegfr-2) and associated uses
AU2001264565B2 (en) 2000-05-03 2006-12-07 Vegenics Limited A method for activating only the vascular endothelial growth factor receptor-3 and uses thereof
KR100457350B1 (ko) * 2000-06-01 2004-11-16 이경림 ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ)의 수용체,ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및그들의 용도
EP1166798A1 (en) 2000-06-23 2002-01-02 Schering Aktiengesellschaft Combinations and compositions which interfere with VEGF/VEGF and angiopoietin/ Tie receptor function and their use
EP1166799A1 (en) 2000-06-28 2002-01-02 Schering Aktiengesellschaft Combinations and compositions which interfere with VEGF/VEGF and angiopoietin/Tie receptor function and their use (II)
AU784231B2 (en) 2000-06-23 2006-02-23 Schering Aktiengesellschaft Combinations and compositions which interfere with VEGF/VEGF and angiopoietin/tie receptor function and their use (II)
EP1311277A4 (en) 2000-07-18 2004-08-25 Joslin Diabetes Center Inc METHODS OF FIBROSIS MODULATION
US20020091082A1 (en) * 2000-09-13 2002-07-11 Aiello Lloyd P. Methods of modulating symptoms of hypertension
FR2814744B1 (fr) * 2000-10-04 2002-11-29 Commissariat Energie Atomique Cyclopeptides, leur procede de preparation et leur utilisation comme inhibiteur ou activateur de l'angiogenese
US20030082103A1 (en) * 2000-10-11 2003-05-01 Targesome, Inc. Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets
US7611711B2 (en) 2001-01-17 2009-11-03 Vegenics Limited VEGFR-3 inhibitor materials and methods
CA2435503C (en) 2001-01-19 2011-02-22 Ludwig Institute For Cancer Research Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
AU2002252631A1 (en) 2001-04-13 2002-10-28 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
JP2005518185A (ja) * 2001-06-04 2005-06-23 キュラジェン コーポレイション 新規タンパク質およびそれをコード化する核酸
US20050069877A1 (en) * 2001-06-22 2005-03-31 Gandhi Ameena R. Protein modification and maintenance molecules
AU2002362461A1 (en) 2001-10-01 2003-04-14 Targesome, Inc. Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets
US6766860B2 (en) * 2002-02-22 2004-07-27 Globalsantafe Corporation Multi-activity offshore drilling facility having a support for tubular string
US7211240B2 (en) * 2002-03-01 2007-05-01 Bracco International B.V. Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
US7794693B2 (en) * 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
EP1501357A4 (en) 2002-05-06 2009-10-21 Genentech Inc USE OF VEGF FOR THE TREATMENT OF BONE DEFECTS
ES2396368T3 (es) * 2003-03-03 2013-02-21 Dyax Corporation Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos
CA2631716C (en) * 2005-12-09 2013-11-26 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
AU2009219437B2 (en) * 2008-02-25 2014-10-16 Nestec S.A. Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
US9801473B2 (en) 2012-09-13 2017-10-31 Kids Ii, Inc. Play yard with removable liner
EP3020171B1 (en) 2013-07-12 2017-12-20 Telefonaktiebolaget LM Ericsson (publ) Method for enabling control of data packet flows belonging to different access technologies

Also Published As

Publication number Publication date
US20100260672A1 (en) 2010-10-14
US8044175B2 (en) 2011-10-25
EP2949658A3 (en) 2016-01-13
EP1603935A4 (en) 2007-03-21
JP2014159434A (ja) 2014-09-04
DK2284180T3 (en) 2015-12-21
US20100261875A1 (en) 2010-10-14
US20050214859A1 (en) 2005-09-29
SI2949658T1 (sl) 2018-10-30
EP2284180A3 (en) 2011-10-05
EP1944312B1 (en) 2012-06-27
PL2949658T3 (pl) 2018-11-30
EP1603935A2 (en) 2005-12-14
EP2949658B1 (en) 2018-08-08
ES2692166T3 (es) 2018-11-30
JP2017019787A (ja) 2017-01-26
DK2949658T3 (en) 2018-10-01
EP1944312A1 (en) 2008-07-16
CA2517939C (en) 2015-11-24
AU2004217894A1 (en) 2004-09-16
AU2010235865B2 (en) 2012-11-15
CA2517939A1 (en) 2004-09-16
AU2010235865A1 (en) 2010-11-11
HUE039154T2 (hu) 2018-12-28
JP5876644B2 (ja) 2016-03-02
JP6374913B2 (ja) 2018-08-15
US20110311446A1 (en) 2011-12-22
JP2007524598A (ja) 2007-08-30
JP2011037872A (ja) 2011-02-24
JP5466350B2 (ja) 2014-04-09
US20150218218A1 (en) 2015-08-06
EP2284180A2 (en) 2011-02-16
PT2949658T (pt) 2018-10-18
JP6216280B2 (ja) 2017-10-18
EP2949658A2 (en) 2015-12-02
WO2004078778A2 (en) 2004-09-16
US9845340B2 (en) 2017-12-19
EP2284180B1 (en) 2015-09-09
US9000124B2 (en) 2015-04-07
US20120039802A1 (en) 2012-02-16
WO2004078778A3 (en) 2004-11-18
CY1120683T1 (el) 2019-12-11
ES2396368T3 (es) 2013-02-21
AU2004217894B2 (en) 2010-07-15
PL1944312T3 (pl) 2012-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2557286T3 (es) Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet)
CN101573143B (zh) 纤维蛋白结合肽及其缀合体
CA2512780C (en) Multivalent constructs that bind the vegf receptor-2 kdr for therapeutic and diagnostic applications
US7666979B2 (en) Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same
JP2010512400A5 (es)
CA2477935A1 (en) Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
AU2015201413B2 (en) Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof
AU2012241087B2 (en) Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof