ES2557740T3 - Procedimiento de separación de proteínas mediante electroforesis capilar y composiciones de tampón para electroforesis capilar - Google Patents
Procedimiento de separación de proteínas mediante electroforesis capilar y composiciones de tampón para electroforesis capilar Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de electroforesis capilar en disolución libre a pH alcalino para el análisis de muestras biológicas que comprenden constituyentes proteicos, caracterizado porque los constituyentes son la albúmina y las fracciones de α1, α2, β o (β1 y β2) y γ-globulina y porque comprende al menos una etapa en la que: se introduce la muestra en un tubo capilar que contiene un tampón de análisis que presenta un pH comprendido entre 9 y 11, comprendiendo dicho tampón de análisis además al menos un aditivo que puede producir interacción hidrófoba con uno o varios constituyentes proteicos y que puede aportar a este o estos constituyentes proteicos una o varias cargas negativas y disminuir la movilidad electroforética de la albúmina con respecto a la de las demás proteínas, comprendiendo dicho aditivo un polo aniónico cuando el pH es superior a 9 y una parte hidrófoba.
Description
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Procedimiento de separacion de protefnas mediante electroforesis capilar y composiciones de tampon para electroforesis capilar
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la separacion de protefnas y peptidos mediante electroforesis capilar asf como a composiciones de tampon que comprenden un aditivo util para esta separacion.
Se conoce analizar la tasa de las protefnas en lfquidos biologicos tales como suero, con fines analfticos y concretamente de diagnostico, y habitualmente separar protefnas mediante electroforesis, tanto en electroforesis en gel como en electroforesis capilar.
En electroforesis en gel, el documento US 5 928 484 describe la separacion especffica de la Lpa de otras lipoprotefnas con ayuda de compuestos anionicos o cationicos.
Uno de los intereses de la electroforesis capilar se encuentra en el hecho de que se necesitan cantidades muy pequenas de los lfquidos biologicos que van a analizarse. Ademas, la separacion mediante esta tecnica puede ser muy rapida, en la medida en que pueden usarse grandes tensiones sin que la muestra se caliente demasiado durante la separacion.
Para la separacion de las protefnas sericas, se realiza de manera clasica la electroforesis capilar con tampones alcalinos. Habitualmente, los perfiles proteicos obtenidos comprenden cinco o seis fracciones que son la fraccion de albumina, las fracciones de ai y a2-globulina, la fraccion de p-globulina o las fracciones de Pi y P2-globulina y la fraccion de y-globulina.
Concretamente, en electroforesis capilar, tales separaciones pueden realizarse con ayuda de tampones de analisis y tecnicas tales como los descritos en las patentes US Re 36 011 o EP 518 475.
No obstante, hasta ahora, concretamente en electroforesis capilar, la separacion de la albumina y de la a1-globulina es insatisfactoria.
El documento US 5 536 382 describe un metodo de analisis de constituyentes de muestras biologicas, concretamente de muestras de sangre previamente mezcladas con un reactivo marcado especffico. Se describe el analisis de una hemoglobina glicosilada, estando precedido este analisis por la etapa de marcaje y de incubacion con un anticuerpo marcado especffico para la hemoglobina humana A1C.
El solicitante ha demostrado ahora que usando un aditivo con el tampon de analisis, aditivo que comprende un polo anionico cuando el pH es superior a 9 y una parte hidrofoba, era posible obtener una separacion mejorada, concretamente la separacion de albumina/a1-globulina. Estos aditivos pueden, por un lado, producir interacciones hidrofobas con uno o varios constituyentes proteicos y, por otro lado, pueden aportar a este o estos constituyentes proteicos una o varias cargas negativas y modificar su movilidad electroforetica.
Por tanto, la invencion se refiere a un procedimiento de electroforesis capilar en disolucion libre a pH alcalino para el analisis de muestras que comprenden constituyentes proteicos, tal como se define mediante la reivindicacion 1, y en el que se introduce la muestra en un tubo capilar que contiene un tampon de analisis, comprendiendo dicho tampon de analisis ademas al menos un aditivo que puede producir interaccion hidrofoba con uno o varios constituyentes proteicos y que puede aportar a este o estos constituyentes proteicos una o varias cargas negativas y modificar su movilidad electroforetica. Esta etapa va seguida en general por la separacion de los constituyentes proteicos mediante migracion y deteccion de los constituyentes.
La invencion tambien se refiere a un procedimiento de separacion mediante electroforesis de los constituyentes proteicos de muestras que comprenden albumina y las fracciones de a1 a2; P (o P1 y P2); y y-globulina, en un tampon de analisis, en el que el tampon de analisis comprende ademas un aditivo que puede al menos producir interaccion hidrofoba con la albumina.
La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento de separacion electroforetica, mediante electroforesis capilar a pH alcalino en disolucion libre, de los constituyentes proteicos de un muestra lfquida, procedimiento en el que se hace pasar la muestra que comprende dichos constituyentes a un capilar que contiene un tampon de analisis que comprende ademas al menos un aditivo, siendo el aditivo un compuesto que comprende un polo anionico cuando el pH es superior a 9 y una parte hidrofoba.
Asf, los compuestos utiles como aditivo para tampon de analisis en electroforesis capilar de la invencion pueden concretamente producir interaccion hidrofoba con la albumina; estos compuestos pueden ser por ejemplo tensioactivos anionicos tales como los usados en MECC (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, cromatograffa capilar electrocinetica micelar), pero a una concentracion inferior a su concentracion micelar crftica.
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En la presente invencion, se usan estos compuestos en EC en disolucion libre: hay un aporte de cargas negativas sobre la albumina mediante interaccion hidrofoba entre los residuos hidrofobos de la albumina y la parte hidrofoba de estos compuestos, de ahf una diminucion de la movilidad de la albumina con respecto a la de las demas protefnas. Una de las consecuencias es la separacion mejorada de la albumina y de la fraccion de ai.
Finalmente, la invencion se refiere a composiciones de electrolito para electroforesis capilar tal como se definen mediante la reivindicacion 18 y que comprenden al menos un tampon y un aditivo que puede producir interaccion hidrofoba con la albumina, en un soporte aceptable.
Tal como aparece en los ejemplos, el uso de aditivos segun la invencion permite una separacion mejorada de las fracciones de albumina y ai-globulina. Permite ademas un retorno a la lfnea de base entre estas dos fracciones mejor que con los tampones habituales.
Otras caracterfsticas y ventajas de la invencion se desprenderan tras la lectura de la descripcion detallada, de los ejemplos y las figuras adjuntas.
La figura 1 representa un electroferograma de un suero humano normal analizado mediante electroforesis capilar usando un tampon de glicina.
La figura 2 representa un electroferograma de un suero humano normal analizado mediante electroforesis capilar usando el mismo tampon de glicina con un aditivo segun la invencion.
La figura 3 representa un electroferograma de un suero humano normal analizado mediante electroforesis capilar usando un tampon de borato.
La figura 4 representa un electroferograma de un suero humano normal analizado mediante electroforesis capilar usando el mismo tampon de borato con un aditivo segun la invencion.
La figura 5 representa un electroferograma de un suero humano normal, obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa.
La figura 6 representa un electroferograma de un suero de un paciente que presenta un sfndrome inflamatorio agudo, realizado en electroforesis capilar con un tampon de glicina.
La figura 7 representa un electroferograma de un suero de un paciente que presenta un sfndrome inflamatorio agudo realizado en electroforesis capilar usando el mismo tampon de glicina con un aditivo segun la invencion.
La figura 8 representa un electroferograma de un suero de un paciente que presenta un sfndrome inflamatorio agudo realizado en electroforesis capilar con un tampon de borato.
La figura 9 representa un electroferograma de un suero de un paciente que presenta un sfndrome inflamatorio agudo realizado en electroforesis capilar usando el mismo tampon de borato con un aditivo segun la invencion.
La figura 10 representa un electroferograma del suero de un paciente que presenta un sfndrome inflamatorio agudo, obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa.
La figura 11 ilustra para diversas longitudes de la cadena carbonada de un alquilsulfonato anadido a un tampon de borato habitual, la movilidad de la fraccion de a1-globulina y la de la fraccion de albumina.
A modo de aditivo para tampon util segun la invencion y que puede producir interaccion con la parte hidrofoba de la albumina, pueden mencionarse los compuestos que comprenden un polo anionico cuando el pH es superior a 9 y una parte hidrofoba. La parte hidrofoba puede estar compuesta por al menos una cadena de alquilo, ramificada o no, de 4 a 22 atomos de carbono, concretamente de 4 a 20 atomos de carbono, y/o por al menos una combinacion de 1 a 10 ciclos, aromaticos o no. Se prefieren combinaciones de 1 a 4 ciclos. Tal como comprendera facilmente el especialista, esta parte hidrofoba podra comprender residuos o funciones que no modifiquen de manera esencial su caracter hidrofobo, tales como uno o varios grupos hidroxilo o de amina, por ejemplo.
El polo anionico puede estar constituido por uno o varios de los grupos o las funciones qufmicas de la siguiente lista: sulfonatos, carboxilatos, sulfatos, fosfatos, carbonatos.
Asf, pueden citarse concretamente los tensioactivos anionicos del tipo colato, los alquil-mono, di o trialquilsulfonatos C6-C22, el tetradecenosulfonato, los naftalenosulfonatos, los alquil-mono, di o tricarboxilatos C6-C22, los alquil- carboxisulfonatos C6-C22, los naftalenocarboxilatos, los alquil-sulfatos C4 a C14, los alquil-carbonatos C4 a C14, los bencenosulfonatos y los bencenocarboxilatos.
Los di y tri-carboxilatos, di y tri-sulfonatos y carboxisulfonatos anteriores son por tanto combinaciones de una o
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varias funciones carboxilato o sulfonato sobre cadenas de alquilo de 6 a 22 atomos de carbono. A modo de ejemplo no limitativo, puede mencionarse el acido 1,2,3-nonadecanotricarboxflico que comprende tres funciones carboxilato y una cadena Cig, el acido 2-metil-2-sulfooctadecanoico que comprende una funcion carboxilato y una funcion sulfonato y una cadena Ci8, y el acido 1,12-dodecanodicarboxflico que comprende dos funciones carboxilato y una cadena C12.
Mas precisamente, pueden mencionarse los alquil-sulfonatos C6 a C10 entre los alquil-mono, di o trialquilsulfonatos C6-C22 y los alquil-carboxilatos C6 a C14 entre los alquil-mono, di o tri-carboxilatos C6-C22.
En las denominaciones anteriores, los radicales alquilo son preferiblemente lineales.
Pueden usarse tampones biologicos como aditivo segun la invencion. Pueden mencionarse concretamente los tampones zwitterionicos del tipo de Good tales como CAPS (acido 3-ciclohexilamino-1-propano-sulfonico) y CHES (acido 2-(N-ciclohexilamino)etanosulfonico).
Segun la invencion pueden usarse otros tampones biologicos zwitterionicos. No obstante, no se considera que los tampones de aminoacidos formen parte de la presente invencion.
Entre los aditivos mencionados anteriormente, se prefieren los alquil-sulfonatos C6 a C10 y entre los alquil-sulfonatos C6 a C10, se prefiere particularmente el octanosulfonato.
Estos compuestos se conocen en si mismos y estan disponibles en el mercado. Pueden estar en forma acida o en forma de sales.
Por muestra, segun la invencion, se entiende la muestra biologica que va a analizarse, previamente diluida con una disolucion de dilucion apropiada o del tampon de analisis, por ejemplo, o pura.
Como muestra, puede analizarse cualquier lfquido biologico de pacientes sanos o enfermos. Asi, los lfquidos biologicos humanos pueden ser suero normal o no, y tambien sangre hemolizada, plasma, orina o lfquido cefalorraqrndeo. Ademas de las muestras biologicas humanas, pueden analizarse muestras de origen animal. Las muestras tambien pueden ser protemas sinteticas, y el procedimiento de la invencion puede entonces tener fines de control de produccion, por ejemplo.
Los aditivos segun la invencion son particularmente utiles para los analisis de suero, y la separacion de protemas sericas, en muestras humanas.
En las muestras de suero, las protemas sericas que van a separarse son la albumina y las fracciones de a1 a2; p (o P1 y P2): y y-globulina.
A modo de tampon de analisis, puede usarse cualquier tampon de analisis conocido, adecuado para la separacion deseada, y util en electroforesis en general, y en electroforesis capilar en particular. A modo de ejemplos, pueden mencionarse los tampones de borato, fosfato y carbonato, los tampones a base de aminoacido y los tampones denominados biologicos.
Como tampon biologico, pueden mencionarse los tampones conocidos con los nombres de Bis-TRIS (2-bis[2- hidroxietil]amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol), ADA (acido N-[2-acetamido]-2-iminodiacetico), ACES (acido 2-[2- acetamino]-2-aminoetanosulfonico), PIPES (acido 1,4-piperazindietanosulfonico), MOPSO (acido 3-[N-morfolino]-2- hidroxipropanosulfonico), Bis-TRIS-PROPANO (1,3-bis[tris(hidroximetil)metilamino-propano]), BES (acido N,N-bis[2- hidroxietil]-2-aminoetanosulfonico), MOPS (acido 3-[N-morfolino]propanosulfonico), TES (acido 2-[2-hidroxi-1,1- bis(hidroximetil)etilamino]etanosulfonico), HEPES (acido N-[2-hidroetil]piperazin-N'-(2-etanosulfonico)), DIPSO (acido 3-N,N-bis[2-hidroxietil]amino-2-hidroxipropanosulfonico), MOBS (acido 4-N-morfolinobutanosulfonico), TAPSO (acido 3-[N-tris-hidroximetil-metilamino]-2-hidroxipropanosulfonico), TRIS (2-amino-2-[hidroximetil]-1,3-propanodiol), HEPPSO (acido N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-hidroxipropanosulfonico]), POPSO (acido piperazin-,N'-bis[2- hidroxipropanosulfonico], TEA (trietanolamina), EPPS (acido N-[2-hidroxietil]-piperazin-N'-[3-propano-sulfonico]), TRICiNa (N-tris[hidroximetil]metilglicina), GLY-GlY (diglicina), BICINA (N,N-bis[2-hidroxietil]-glicina), HEPBS (acido N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[4-butanosulfonico]), TAPS (acido N-tris[hidroximetil]-metil-3-aminopropanosulfonico), AMPD (2-amino-2-metil-1,3-propanodiol), TaBs (acido N-tris[hidroximetil]metil-4-aminobutanosulfonico), AMPSO (acido 3-[(1,1-dimetil-2-hidroxietil)amino]-2-hidroxipropanosulfonico), CHES (acido 2-(N-
ciclohexilamino)etanosulfonico), CAPSO (acido 3-[ciclohexilamino]-2-hidroxi-1-propanosulfonico), AMP (2-amino-2- metil-1-propanol), CAPS (acido 3-ciclohexilamino-1-propano-sulfonico) o CABS (acido 4-[ciclohexilamino]-1- butanosulfonico), preferiblemente AMPD, TABS, AMPsO, ChES, CAPSO, AMP, CAPS o CABS.
Desde el punto de vista del pH del lfquido biologico en el tampon de analisis, incluido el aditivo, este puede variar entre 2 y 12. No obstante, en electroforesis capilar a pH alcalino, el pH esta comprendido entre 8 y 12. Segun la invencion, el pH esta comprendido entre 9 y 11, y, de manera mas particularmente preferida tiene un valor de aproximadamente 10.
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Los tampones de analisis segun la invencion pueden comprender ademas al menos un compuesto que modifica el pH. A modo de modificador del pH, puede usarse un compuesto elegido de hidroxido de litio, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de rubidio, hidroxido de cesio, hidroxido de francio, un hidroxido de mono, di, tri o tetra-alquilamonio que tiene de 1 a 8 atomos de carbono en la parte alquilo.
Segun la invencion, los tampones de analisis se usan en las condiciones y concentraciones habituales, a saber del orden de 10 a 500 mM, preferiblemente de 20 a 400 mM.
Los aditivos segun la invencion se usan en concentraciones que van de 0,1 mM a 500 mM, sin superar no obstante su concentracion micelar crftica en el tampon de analisis.
Este valor de concentracion micelar crftica interviene para los aditivos que son tensioactivos.
Cuando se usa el octanosulfonato, su concentracion en el tampon es del orden de 1 a 5 mM, y preferiblemente de 1 a 4 mM. De manera preferida, la concentracion puede ser de aproximadamente 2,5 mM.
En los procedimientos de la invencion, el tampon de analisis puede comprender ademas sulfato de sodio.
Las composiciones de tampon de la invencion se preparan de manera habitual para composiciones de tampon de analisis, a saber mediante la adicion de los constituyentes en forma lfquida, o solida para diluir, a un soporte aceptable. De manera habitual, el soporte es agua, destilada o desmineralizada.
Desde el punto de vista de los materiales usados para los capilares, estos son habituales en la electroforesis capilar. Asf, pueden usarse capilares de sflice fundida. Su diametro interno puede ir de 5 a 2.000 pm. De manera preferida, segun la invencion se usan capilares con un diametro interno inferior a 200 pm, preferiblemente inferior a 100 pm. Se usan preferiblemente capilares con una superficie interior no tratada. El especialista sabra adaptar la naturaleza del capilar y su tamano a las necesidades del analisis.
Ejemplos
MATERIALES Y METODOS
A) Electroforesis capilar (metodo A)
La electroforesis capilar de muestras clfnicas se realiza con un aparato de EC equipado con un capilar de sflice fundida con un diametro interno de 25 micrometres. La deteccion se realiza a 200 nm. Se colocan las muestras en el inyector de muestras del aparato y se inyectan automaticamente mediante inyeccion hidrodinamica (50 mbar durante 7 s). La separacion de las muestras se realiza en menos de 10 minutos aplicando un campo electrico de aproximadamente 400 V/cm. Se lava el capilar antes de cada analisis mediante sosa 0,5 M, despues mediante el tampon de analisis.
Tampones de analisis:
Los productos qufmicos usados son de calidad analftica.
Se prepara el tampon de glicina 150 mM disolviendo 11,26 g de glicina (masa molar: 75,07 g/mol) en 1 I de agua desmineralizada. La concentracion final es de 150 mM y se ajusta el pH a 10,0 mediante la adicion de pastillas de sosa (masa molar: 40,0 g/mol).
Se prepara el tampon de borato 150 mM disolviendo 9,3 g de acido borico (masa molar: 61,83 g/mol) en 1 I de agua desmineralizada, y 5,1 g de sosa (masa molar: 40,0 g/mol). La concentracion final es de 150 mM y el pH de 10,0.
B) Electroforesis en gel de agarosa (metodo B)
Se realiza el analisis comparativo de protefnas sericas en gel de agarosa. Se cargaron 10 pl de suero en cada pocillo del aplicador de membrana descrito en las patentes EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516. A continuacion se aplico el aplicador asf cargado a la superficie de un gel de agarosa durante 30 s. Se obtuvo la separacion de estas muestras aplicadas sobre este gel de agarosa mediante electroforesis durante aproximadamente 7,5 minutos y a una potencia de 20 W, en un instrumento que permite regular la temperatura a 20°C. Tras la migracion, se seco el gel y se coloreo con negro de amido. Tras la coloracion, se descoloro el gel y se seco de nuevo. Entonces se analizaron los geles mediante densitometrfa, lo que permite obtener los perfiles proteicos.
C) Muestras clfnicas:
Para la EC, se diluyen los sueros humanos a 1/10 en el tampon de analisis.
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Ejemplo 1 (comparative)
Se prepara un tampon de analisis de glicina tal como anteriormente. Se analizo suero normal.
Se realizo la electroforesis segun el metodo A anterior.
Tal como aparece en la figura 1, el electroferograma obtenido presenta, de izquierda a derecha, cinco picos sucesivos atribuidos respectivamente a las fracciones de y, p, a2, a1-globulina y albumina.
Ejemplo 2
Al tampon de analisis del ejemplo 1, se le anade octanosulfonato a una concentracion de 2,5 mM.
Se realizo la electroforesis como en el ejemplo 1.
Tal como aparece en la figura 2, el electroferograma obtenido presenta, de izquierda a derecha, cinco picos sucesivos atribuidos respectivamente a las fracciones de y, p, a2, a1-globulina y albumina. Mediante comparacion con el resultado del ejemplo 1, la separacion entre las dos fracciones de a1-globulina y albumina se mejora netamente y el retorno a la lfnea de base es mejor.
Ejemplo 3 (comparativo)
Se trabaja como en el ejemplo 1, siendo el tampon de analisis usado un tampon de borato preparado tal como se indico anteriormente.
Se realizo la electroforesis como en el ejemplo 1.
Tal como aparece en la figura 3, el electroferograma obtenido presenta, de izquierda a derecha, seis picos sucesivos atribuidos respectivamente a las fracciones de y, P2, P1, a2, a1-globulina y albumina.
Ejemplo 4
Al del ejemplo 3, se le anade octanosulfonato a una concentracion de 2,5 mM.
Se realizo la electroforesis como en el ejemplo 1.
Tal como aparece en la figura 4, el electroferograma obtenido presenta, de izquierda a derecha, seis picos sucesivos atribuidos respectivamente a las fracciones de y, P2, P1, a2, a1-globulina y albumina. La separacion entre las dos fracciones de a1 y albumina se mejora netamente y el retorno a la lfnea de base es mejor.
Ejemplo 5 (comparativo)
Se obtiene el electroferograma de la figura 5 analizando el mismo suero que en los ejemplos anteriores mediante el metodo B anterior. Mediante comparacion con el resultado obtenido en los ejemplos 2 y 4, se constata que estos modos de realizacion permiten obtener una resolucion practicamente comparable a la resolucion obtenida en gel de agarosa.
Ejemplo 6 (comparativo)
Se preparo un tampon de analisis de glicina 150 mM.
Se analizo suero con grandes cantidades de a1 y a2-globulinas.
Se realizo la electroforesis como en el ejemplo 1.
Tal como aparece en la figura 6, el electroferograma obtenido presenta, de izquierda a derecha, cinco picos sucesivos atribuidos respectivamente a las fracciones de y, p, a2, a1-globulina y albumina.
Ejemplo 7
Al tampon de analisis del ejemplo 6, se le anade octanosulfonato a una concentracion de 2,5 mM.
Se realizo la electroforesis como en el ejemplo 6.
Tal como aparece en la figura 7, el electroferograma obtenido presenta, de izquierda a derecha, cinco picos
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sucesivos atribuidos respectivamente a las fracciones de y, p, a2, ai-globulina y albumina. Mediante comparacion con el resultado del ejemplo 6, la separacion entre las dos fracciones de a1-globulina y albumina se mejora netamente y el retorno a la lfnea de base es mejor.
Ejemplo 8 (comparativo)
Se trabaja como en el ejemplo 6, siendo el tampon usado un tampon de borato 150 mM.
Se realizo la electroforesis como en el ejemplo 6.
Tal como aparece en la figura 8, el electroferograma obtenido en las mismas condiciones presenta, de izquierda a derecha, seis picos sucesivos atribuidos respectivamente a las fracciones de y, P2, P1, a2, a1-globulina y albumina.
Ejemplo 9
Al tampon del ejemplo 8, se le anade octanosulfonato a una concentracion de 2,5 mM.
Se realizo la electroforesis como en el ejemplo 6.
Tal como aparece en la figura 9, el electroferograma obtenido en las mismas condiciones presenta, de izquierda a derecha, seis picos sucesivos atribuidos respectivamente a las fracciones de y, P2, P1, a2, a1-globulina y albumina. La separacion entre las dos fracciones de a1 y albumina se mejora mediante un mejor retorno a la lfnea de base. Se observa que la fraccion de a1 esta compuesta por dos picos, de los cuales uno, que corresponde a la orosomucoide se confundfa, en ausencia de octanosulfonato, con el pico de la albumina.
Ejemplo 10 (comparativo)
Se obtiene el electroferograma de la figura 10 analizado el mismo suero que en los ejemplos 6 a 9 mediante el metodo B anterior. Mediante comparacion con el resultado obtenido en los ejemplos 7 y 9, se constata que estos modos de realizacion permiten obtener una resolucion practicamente comparable a la resolucion obtenida en gel de agarosa.
Ejemplo 11
Se midio la movilidad (mn-1) comparada de la a1-globulina y de la albumina, en un tampon de borato (150 mM) a pH 10, mediante el metodo A anterior. Se anadieron alquilsulfonatos con longitud (n) de cadena de alquilo creciente (n representa 4, 6, 8 y 10 respectivamente para C4, C6, C8 y C10 y n=0 corresponde a un tampon sin alquilsulfonato) a una concentracion de 2,5 mM al tampon de borato. Se calcularon las movilidades de las fracciones de alfa-1 y albumina y se notifican en el grafico de la figura 11. Se observa una neta disminucion de la movilidad de la albumina (■) con respecto a la de la fraccion de alfa-1 (♦) a partir de una cadena C6.
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1. Procedimiento de electroforesis capilar en disolucion libre a pH alcalino para el analisis de muestras biologicas que comprenden constituyentes proteicos, caracterizado porque los constituyentes son la albumina y las fracciones de ai, a2, P o (Pi y P2) y y-globulina y porque comprende al menos una etapa en la que:
se introduce la muestra en un tubo capilar que contiene un tampon de analisis que presenta un pH comprendido entre 9 y 11, comprendiendo dicho tampon de analisis ademas al menos un aditivo que puede producir interaccion hidrofoba con uno o varios constituyentes proteicos y que puede aportar a este o estos constituyentes proteicos una o varias cargas negativas y disminuir la movilidad electroforetica de la albumina con respecto a la de las demas protefnas, comprendiendo dicho aditivo un polo anionico cuando el pH es superior a 9 y una parte hidrofoba.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque comprende ademas la separacion de los constituyentes mediante migracion y la deteccion de estos constituyentes.
3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque la muestra es una muestra de suero, sangre hemolizada, plasma, orina o lfquido cefalorraqufdeo.
4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los constituyentes son protefnas sericas.
5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho aditivo comprende una parte hidrofoba compuesta por al menos una cadena de alquilo, ramificada o no, de 4 a 22 atomos de carbono, y/o por al menos una combinacion de 1 a 10 ciclos, aromaticos o no, y un polo anionico constituido por uno o varios grupos elegidos de los sulfonatos, carboxilatos, sulfatos, fosfatos y carbonatos.
6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho aditivo se elige de los tensioactivos anionicos del tipo colato, los alquil-mono, di o tri-sulfonatos C6 a C22, el tetradecenosulfonato, los naftalenosulfonatos, los alquil-mono, di o tri-carboxilatos C6 a C22, los alquilcarboxisulfonatos C6-C22, los naftalenocarboxilatos; los alquilsulfatos C4 a C14, los alquilcarbonatos C4 a C14; los bencenosulfonatos, los bencenocarboxilatos y los tampones biologicos zwitterionicos.
7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho aditivo se elige de los tensioactivos anionicos del tipo colato, los alquil-mono, di o tri-sulfonatos C6 a C22, el tetradecenosulfonato, los naftalenosulfonatos, los alquil-mono, di o tri-carboxilatos C6 a C22, los alquilcarboxisulfonatos C6-C22, los naftalenocarboxilatos, los alquilsulfatos C4 a C14, los alquilcarbonatos C4 a C14, los bencenosulfonatos y los bencenocarboxilatos.
8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque los radicales alquilo son lineales.
9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el aditivo es un alquilsulfonato C6 a C10.
10. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el aditivo es el octanosulfonato.
11. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la concentracion de aditivo en el tampon esta comprendida entre 0,1 mM y 500 mM, sin superar dado el caso la concentracion micelar crftica de dicho aditivo en dicho tampon.
12. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la concentracion de dicho aditivo en dicho tampon esta comprendida entre 1 mM y 5 mM.
13. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la concentracion de aditivo en el tampon es del orden de 2,5 mM.
14. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el capilar es de sflice fundida.
15. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el tampon de analisis comprende ademas al menos un modificador del pH.
16. Procedimiento segun la reivindicacion 15, caracterizado porque el modificador del pH se elige de hidroxido
de litio, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de rubidio, hidroxido de cesio, hidroxido de francio, un hidroxido de mono, di, tri o tetra-alquilamonio de 1 a 8 atomos de carbono en la parte alquilo.
- 17. 5
- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el tampon de analisis comprende ademas sulfato de sodio.
- 18.
- Composicion de electrolito para electroforesis capilar adecuada para la puesta en practica del procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende al menos un tampon y al menos un aditivo en un soporte aceptable, pudiendo el aditivo producir interaccion hidrofoba con la albumina,
- 10
- eligiendose dicho aditivo, que comprende un polo anionico cuando el pH es superior a 9 y una parte hidrofoba, de los tensioactivos anionicos del tipo colato, los alquil-mono, di o tri-sulfonatos C6 a C22, el tetradecenosulfonato, los naftalenosulfonatos, los alquil-mono, di o tri-carboxilatos C6 a C22, los alquil- carboxisulfonatos C6-C22, los naftalenocarboxilatos, los alquilsulfatos C4 a C14, los alquilcarbonatos C4 a C14, los bencenosulfonatos y los bencenocarboxilatos, estando el pH de dicha composicion comprendido entre 9
- 15
- y 11.
- 19.
- Composicion segun la reivindicacion 18, caracterizada porque los radicales alquilo son lineales.
- 20. 20 21.
- Composicion segun la reivindicacion 18 o 19, caracterizada porque el aditivo es un alquilsulfonato C6 a C10. Composicion segun una de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizada porque el aditivo es el octanosulfonato.
- 22. 25
- Composicion segun una de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizada porque el octanosulfonato esta presente a una concentracion de 1 a 5 mM en el tampon.
- 23.
- Composicion segun una de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizada porque la composicion comprende ademas sulfato de sodio.
- 30
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