ES2558007T3 - Procedimiento de inhibición de amplificación de ácidos nucleicos usando luz y procedimiento muy sensible de amplificación selectiva de ácidos nucleicos - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de detección de un ácido nucleico mutado que comprende las etapas de: (a) permitir a una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia complementaria a un sitio diana que tiene una secuencia de un ácido nucleico de tipo silvestre, y a una muestra de ácido nucleico, coexistir entre sí, y formar específicamente un híbrido de la sonda de fijación con una molécula de ácido nucleico de tipo silvestre que tiene el sitio diana; (b) fotorreticular la sonda de fijación/molécula de ácido nucleico diana que forman el híbrido mediante fotoirradiación; (c) someter el producto de reacción obtenido en las etapas (a) y (b) a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, y (d) analizar el producto amplificado resultante, en el que una región de detección que comprende un sitio diana del ácido nucleico mutado se amplifica selectivamente para detectar la presencia o la ausencia del ácido nucleico mutado.
Description
[6] El procedimiento según uno cualquiera de [1] a [3], en el que la sonda de fijación tiene una secuencia complementaria a la cadena sentido y/o la cadena antisentido de la molécula de ácido nucleico diana.
[7] El procedimiento según uno cualquiera de [1] a [6], en el que la longitud de cadena de la sonda de fijación es de 7 a 30 nucleótidos.
5 [8] El procedimiento según una cualquiera de [1] a [7], en el que la fotoirradiación se realiza a una longitud de onda de 350 a 380 nm.
[9] El procedimiento según uno cualquiera de [1] a [8], en el que la fotoirradiación se realiza una o más veces en un ciclo de temperatura en el que las cadenas complementarias ordinarias se unen y se disocian entre sí, a una temperatura en la que las cadenas complementarias pueden unirse entre sí.
10 [10] El procedimiento según uno cualquiera de [1] a [9], en el que la fotoirradiación se realiza usando un aparato de amplificación de ácidos nucleicos con una unidad de fotoirradiación a una longitud de onda de 350 a 380 nm.
[11] Un kit para inhibir la amplificación de una región de detección que comprende un sitio diana, realizándose dicha amplificación mediante un procedimiento de amplificación génica que comprende:
una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia 15 complementaria al sitio diana y
un cebador capaz de amplificar la región de detección que comprende el sitio diana,
[12] Un kit para detectar un ácido nucleico mutado que comprende: una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia complementaria a un sitio diana que tiene una secuencia de un ácido nucleico de tipo silvestre y 20 un cebador capaz de amplificar una región de detección que comprende un sitio diana,
en el que una región de detección que comprende un sitio diana del ácido nucleico mutado se amplifica selectivamente para detectar la presencia o la ausencia del ácido nucleico mutado.
[13] Un aparato de amplificación de ácidos nucleicos con una unidad de fotoirradiación a una longitud de onda de 350 a 380 nm.
25 [14] Un aparato de amplificación de ácidos nucleicos con una unidad de fotoirradiación a una longitud de onda de 350 a 380 nm que comprende las etapas de:
(a) permitir a una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia complementaria a una sitio diana, y 30 a una muestra de ácido nucleico.
coexistir entre sí, y formar específicamente un híbrido de la sonda de fijación con una molécula de ácido nucleico que tiene el sitio diana;
(b) fotorreticular la sonda de fijación/molécula de ácido nucleico diana que forman el híbrido mediante fotoirradiación y
35 (c) someter el producto de reacción obtenido en las etapas (a) y (b) a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.
[15] Un aparato de amplificación de ácidos nucleicos con una unidad de fotoirradiación a una longitud de onda de 350 a 380 nm que comprende las etapas de:
(a) permitir a
40 una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia complementaria a una sitio diana y una muestra de ácido nucleico. coexistir entre sí, y formar específicamente un híbrido de la sonda de fijación con una molécula de ácido
nucleico que tiene el sitio diana;
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como un promotor que se requiera para la expresión génica. A este respecto, la mutación en un ácido nucleico mutado no requiere un cambio funcional. La "mutación" incluye mutaciones congénitas y adquiridas.
La expresión "sitio diana", tal como se usa en el presente documento, significa un sitio que es una diana de una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante en una secuencia de ácidos nucleicos y que tiene una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la totalidad o con parte de la sonda de fijación.
La expresión "sitio diana", tal como se usa en realizaciones ordinarias, significa un sitio en el que una base mutada existe en un ácido nucleico mutado, y un sitio que se va a detectar con una diana en la presente invención, que incluye un ácido nucleico de tipo silvestre. Por ejemplo, en el caso de la sustitución de una base, el sitio diana es la base que está sustituida tanto en un ácido nucleico de tipo silvestre como en un ácido nucleico mutado. En el caso de una inserción, el sitio diana en un ácido nucleico mutado es una base insertada y el sitio diana en un ácido nucleico de tipo silvestre es un sitio en el que la base se inserta en el ácido nucleico mutado. En el caso de una deleción, el sitio diana en un ácido nucleico mutado es un sitio en el que se ha eliminado una base por deleción y el sitio diana en un ácido nucleico de tipo silvestre es la base eliminada en el ácido nucleico mutado. La secuencia de un sitio diana puede ser una cadena que tiene una secuencia que codifica información genética (en adelante denominada una cadena sentido) o una cadena que tiene una secuencia complementaria con la cadena sentido (en adelante denominada una cadena antisentido).
La expresión "reacción de amplificación de ácidos nucleicos", tal como se usa en el presente documento, significa una reacción de amplificación de una plantilla de ácidos nucleicos usando una reacción de la polimerasa conocida. La expresión "aparato de amplificación de ácidos nucleicos", tal como se usa en el presente documento, significa un aparato mediante el que puede realizarse la "reacción de amplificación de ácidos nucleicos".
El procedimiento para inhibir la amplificación de la presente invención es un procedimiento en el que, aunque se realice un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos ordinario usando cebadores capaces de amplificar una región de detección que comprende un sitio diana, se inhibe la amplificación de un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico de tipo silvestre), mientras que el otro ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico mutado) se amplifica selectivamente, en base a la mutación en el sitio diana.
En la presente invención, el objeto de la inhibición de la amplificación no está limitado, y pueden seleccionarse apropiadamente o bien un ácido nucleico de tipo silvestre o bien un ácido nucleico mutado como el objeto según este fin. Por ejemplo, en el caso en el que existe una diferencia significativa en los contenidos en una muestra de ácidos nucleicos, la presencia o la ausencia de un ácido nucleico que existe en una pequeña cantidad (por ejemplo, un ácido nucleico mutado) puede detectarse inhibiendo la amplificación de un ácido nucleico que existe en una gran cantidad (por ejemplo, un ácido nucleico de tipo silvestre) y amplificando selectivamente el ácido nucleico que existe en una pequeña cantidad.
A continuación se explicará fundamentalmente el procedimiento de la presente invención en base a una realización de la presente invención, un procedimiento para detectar un ácido nucleico mutado para detectar la presencia o la ausencia del ácido nucleico mutado. No obstante, una característica esencial del procedimiento de la presente invención es, tal como se describe en el presente documento, la inhibición de la amplificación de solo un ácido nucleico en base a la mutación en el sitio diana aunque se realice un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos ordinario usando cebadores capaces de amplificar una región de detección que comprende el sitio diana.
La primera realización del procedimiento de la presente invención es un procedimiento de detección de un ácido nucleico mutado que comprende las etapas de:
(a) permitir a
una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia complementaria a un sitio diana que tiene una secuencia de un ácido nucleico de tipo silvestre, y
a una muestra de ácido nucleico
coexistir entre sí, y formar específicamente un híbrido de la sonda de fijación con una molécula de ácido nucleico de tipo silvestre que tiene el sitio diana;
- (b)
- fotorreticular la sonda de fijación/molécula de ácido nucleico diana que forman el híbrido mediante fotoirradiación;
- (c)
- someter el producto de reacción obtenido en las etapas (a) y (b) a una reacción de amplificación de ácido nucleico y
- (d)
- analizar el producto amplificado resultante,
en el que una región de detección que comprende un sitio diana del ácido nucleico mutado se amplifica selectivamente para detectar la presencia o la ausencia del ácido nucleico mutado.
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La segunda realización del procedimiento de la presente invención es un procedimiento de detección de un ácido nucleico mutado que comprende las etapas de:
(a) permitir a
una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia complementaria a un sitio diana que tiene una secuencia de un ácido nucleico de tipo silvestre, y
a una muestra de ácido nucleico
coexistir entre sí, y formar específicamente un híbrido de la sonda de fijación con una molécula de ácido nucleico de tipo silvestre que tiene el sitio diana;
- (b)
- fotorreticular la sonda de fijación/molécula de ácido nucleico diana que forman el híbrido mediante fotoirradiación;
- (c)
- realizar las etapas (a) y (b) durante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos y
- (d)
- analizar el producto amplificado resultante,
en el que una región de detección que comprende un sitio diana del ácido nucleico mutado se amplifica selectivamente para detectar la presencia o la ausencia del ácido nucleico mutado.
En la presente invención, un ácido nucleico mutado puede detectarse con alta sensibilidad mediante esas etapas, es decir, inhibiendo la amplificación de un ácido nucleico de tipo silvestre y amplificando selectivamente el ácido nucleico mutado.
A continuación se explicará cada etapa individualmente. Dado que la primera realización es la misma que la segunda realización excepto por la etapa (c), cada etapa se explicará principalmente en base a la primera realización y, después, la segunda realización se explicará con respecto a las características diferentes de las de la primera realización.
En la etapa (a), una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia complementaria a un sitio diana que tiene una secuencia de un ácido nucleico de tipo silvestre se permite coexistir con una muestra de ácido nucleico, y se forma específicamente un híbrido de la sonda de fijación con una molécula de ácido nucleico diana que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de tipo silvestre. Esta reacción puede realizarse en condiciones convencionales adecuadas para la formación de híbridos (temperatura, pH, concentración salina, tampón y similares) y la formación específica del híbrido de la sonda de fijación con el ácido nucleico de tipo silvestre puede promoverse añadiendo, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO) o formamida a la solución de reacción. Con respecto a esto, es preferible evitar la incorporación de una sustancia que inhiba una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que se realice después o simultáneamente a la formación del híbrido. En particular, una formulación de reacción adecuada para una reacción de amplificación de ácidos nucleicos es preferible cuando la formación del híbrido se realiza al mismo tiempo que la reacción de amplificación de ácidos nucleicos.
La "muestra de ácidos nucleicos" usada en la etapa (a) no está limitada, siempre que sea una muestra que contenga ácidos nucleicos y se sospeche que contenga un ácido nucleico que comprenda un sitio diana. Es preferentemente una muestra sospechosa de contener al menos un ácido nucleico de tipo silvestre que tenga un sitio diana y su ácido nucleico mutado, y más preferentemente una muestra sospechosa de contener ambos ácidos nucleicos. Los ejemplos de la muestra de ácidos nucleicos incluyen ARN o ADN genómico obtenidos de células completas contenidas en una muestra tal como sangre o tejidos. El ácido nucleico puede extraerse de una muestra mediante un procedimiento convencional tal como un procedimiento de fenol/cloroformo. Con respecto a esto, el porcentaje de presencia del ácido nucleico mutado en los ácidos nucleicos diana que se van a detectar no está limitado. Por ejemplo, puede ser el 100 % de un ácido nucleico de tipo silvestre, o el 50 % de un ácido nucleico de tipo silvestre y el 50 % de un ácido nucleico mutado. La muestra de ácidos nucleicos puede ser ADN obtenido de células, ARNm preparados a partir de células o ADNc obtenidos mediante una reacción de transcripción inversa usando ARNm como plantilla. Además, la muestra de ácidos nucleicos puede ser una mezcla artificial de un número de genes clonados, ácido nucleico amplificado artificialmente por un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos o una mezcla de los mismos.
El ácido nucleico fotorreticulante que puede usarse en la presente invención no está limitado, siempre que puede reticularse con ácidos nucleicos en un sitio diana o ácidos nucleicos cerca del sitio diana por fotorreticulación. Por ejemplo, pueden usarse derivados de psoraleno (Chang, E. y col. Biochemistry 1991, 30, 8283), derivados de aminopurina (documento JP 2001-206896 A), o 4-tiouracilo. Dado que los derivados de psoraleno tienen propiedades de que reaccionan específicamente con timina en la secuencia de nucleótidos 5’-AT-3’, y los derivados de aminopurina no dependen de la secuencia, pero son específicos de citidina, la aplicación de estos derivados es limitada y, por lo tanto, los ácidos nucleicos fotorreticulantes siguientes sin dichas limitaciones son preferentes.
Los primeros ácidos nucleicos fotorreticulantes preferentes son ácidos nucleicos que tienen, como resto básico, el grupo de la fórmula I:
[Prod. quim. 1]
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ensamblan solo mediante estabilidad térmica, la unión se mantiene sin disociación incluso cuando las moléculas reticuladas están bajo las condiciones en las que se disocian entre sí cadenas bicatenarias complementarias.
La reacción de fotorreticulación de la etapa (b) puede llevarse a cabo en una solución de reacción que contiene una sal con actividad tamponadora. Los ejemplos de la sal con actividad tamponadora incluyen sal de cacodilato, sal de fosfato y sal tris. La concentración de la sal con actividad tamponadora es preferentemente de 5 a 250 mmol/l. Además, es preferente que la solución de reacción contenga una sal de metal alcalino y/o sal de metal alcalinotérreo. Los ejemplos del metal alcalino y/o metal alcalinotérreo incluyen cloruro de sodio y cloruro de magnesio. Además, la reacción de fotorreticulación específica entre la sonda de fijación y el ácido nucleico de tipo silvestre puede promoverse añadiendo un disolvente orgánico, tal como DMSO o formamida, a la solución de reacción. En asociación a esto, es preferible evitar la incorporación de una sustancia que inhiba una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que se realice después o simultáneamente a la fotorreticulación. En particular, una formulación de reacción adecuada para una reacción de amplificación de ácidos nucleicos es preferente cuando la reticulación se realiza al mismo tiempo que la reacción de amplificación de ácidos nucleicos.
En la fotoirradiación de la etapa (b), la longitud de onda de la luz es generalmente de 350 a 380 nm, y preferentemente de 366 nm. La luz láser de una única longitud de onda a 366 nm es la más preferente. En una realización preferente, la reacción de la luz mediante fotoirradiación se realiza preferentemente en un periodo de uno o varios segundos. Con respecto a esto, tomando en consideración la transparencia óptica de un recipiente de reacción y una solución de reacción, el tiempo de reacción de la luz puede prolongarse.
Dado que la fotorreticulación de la etapa (b) puede mantener la unión incluso en las condiciones en las que se disocian entre sí cadenas bicatenarias complementarias preparadas mediante formación de híbridos convencional, tal como se ha descrito anteriormente, la reticulación de una molécula de ácido nucleico de tipo silvestre complementaria a la sonda de fijación puede acumularse repitiendo la fotoirradiación en un ciclo de temperatura en el que las cadenas complementarias ordinarias se unen y se disocian entre sí a una temperatura en la que las cadenas complementarias pueden unirse entre sí.
En el caso en el que la muestra de ácidos nucleicos usada en las etapas (a) y (b) sea ARN tal como ARNm, después de realizar una reacción de fotorreticulación con la sonda de fijación, puede sintetizarse ADNc y someterse a una reacción de amplificación tal como PCR, o puede realizarse una amplificación génica mediante una PCR de 1 etapa
o similar. Como alternativa, después de sintetizar ADNc, puede amplificarse ARN mediante un procedimiento de transcripción in vitro.
En el caso en el que la muestra de ácidos nucleicos usada en las etapas (a) y (b) sea ADN monocatenario tal como ADNc, después de realizar una reacción de fotorreticulación con la sonda de fijación, el producto de reacción puede someterse a una reacción de amplificación tal como PCR, o puede amplificarse ARN mediante un procedimiento de transcripción in vitro.
En el caso en el que la muestra de ácidos nucleicos usada en las etapas (a) y (b) sea ADN bicatenario tal como ADN cromosómico después de tratar en condiciones desnaturalizantes ADN bicatenario hibridado, tal como desnaturalización con calor o condiciones ácidas, para convertirlo en un ADN monocatenario, la etapa (a) puede realizarse de un modo similar al caso del ADN monocatenario.
En la etapa (c), la muestra de ácidos nucleicos que se ha sometido a la reacción de fotorreticulación se usa como plantilla y se realiza un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo PCR) usando cebadores de amplificación para amplificar una región de detección que comprende el sitio diana. El cebador de amplificación usado en la etapa (c) es un cebador que es capaz de amplificar una región de detección que comprende el sitio diana de un ácido nucleico mutado y que es también capaz de amplificar una región de detección que comprende el sitio diana de un ácido nucleico de tipo silvestre con el que la sonda de fijación no está fotorreticulada. Dado que la molécula que tiene la secuencia de tipo silvestre está reticulada con la sonda de fijación mediante fotoirradiación, no procede una reacción de alargamiento a partir del nucleótido reticulado al extremo terminal 3’ y la molécula que tiene la secuencia de tipo silvestre no se amplifica. Por el contrario, dado que casi todas las moléculas que tienen la secuencia mutada no están reticuladas con la sonda de fijación, tiene lugar una reacción de alargamiento, y como resultado, se logra la amplificación selectiva de ácidos nucleicos.
En el caso en el que el procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos sea PCR, los cebadores de amplificación usados en la etapa (c) son cebadores capaces de amplificar una secuencia de nucleótidos (secuencia de nucleótidos para amplificación) que comprende una secuencia de nucleótidos diana o dos o más secuencias de nucleótidos diana y dos clases de cebadores entre los que se encuentra emparedada la secuencia de nucleótidos para amplificación. Por ejemplo, los cebadores pueden ser dos clases de cebadores que consisten en un cebador directo que tiene una secuencia de nucleótidos homóloga a la región cadena arriba de la secuencia de nucleótidos para amplificación y un cebador inverso que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la región cadena debajo de la secuencia de nucleótidos para amplificación. Las concentraciones de los dos cebadores usados en PCR no están limitadas, siempre que la relación de concentración sea un valor capaz de obtener ácidos nucleicos bicatenarios como producto de PCR. Es preferente que se usen los dos cebadores en concentraciones iguales.
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El aparato de la presente invención es un aparato de amplificación de ácidos nucleicos con una unidad de fotoirradiación a una longitud de onda de 350 a 380 nm. El aparato de amplificación de ácidos nucleicos no está limitado, siempre que pueda realizar cada reacción de la presente invención e incluya una unidad de amplificación de ácidos nucleicos conocida. Puede usarse preferentemente un aparato de PCR en tiempo real capaz de cuantificar ácido nucleico amplificado. Puede añadirse a dicho aparato una unidad de fotoirradiación a una longitud de onda de 350 a 380 nm.
El aparato de la presente invención puede comprender preferentemente
un programa que puede realizar las etapas (a) a (c) siguientes de la primera realización de la presente invención:
- (a)
- permitir a una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una secuencia complementaria con un sitio diana y una muestra de ácido nucleico coexistir entre sí, y formar específicamente un híbrido de la sonda de fijación con una molécula de ácido nucleico que tiene el sitio diana;
- (b)
- fotorreticular la sonda de fijación/molécula de ácido nucleico diana que forman el híbrido mediante fotoirradiación, y
- (c)
- someter el producto de reacción obtenido en las etapas (a) y (b) a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos y/o
un programa que puede realizar las etapas (a) a (c) siguientes de la segunda realización de la presente invención:
- (a)
- permitir a una sonda de fijación que comprende un ácido nucleico fotorreticulante y que tiene una complementariedad de secuencia con un sitio diana y una muestra de ácido nucleico coexistir entre sí, y formar específicamente un híbrido de la sonda de fijación con una molécula de ácido nucleico que tiene el sitio diana;
- (b)
- fotorreticular la sonda de fijación/molécula de ácido nucleico diana que forman el híbrido mediante fotoirradiación, y
- (c)
- realizar las etapas (a) y (b) durante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.
Ejemplos
La presente invención se ilustrará adicionalmente ahora mediante los ejemplos siguientes, pero no está limitada de ningún modo a los mismos.
«Ejemplo 1»
Evaluación de la inhibición de la amplificación por PCR con respecto al gen de tipo silvestre
(Material y procedimientos)
1. Preparación de sondas de fijación fotorreticulantes
Los puntos de mutación Gly12 y Gly13 de un gen KRAS se seleccionaron como el sitio diana, y se diseñó una sonda de fijación complementaria a la cadena sentido capaz de hibridarse con el sitio diana que tenía la secuencia de tipo silvestre. De forma similar, se diseñó una sonda de fijación contra la cadena antisentido. Se introdujo un ácido nucleico fotorreticulante, 3-cianovinilcarbazol-1’-β-desoxirribósido (CNVK) (preparado mediante un procedimiento descrito en el documento JP 2009-254279 A., obtenido de Fujimoto lab., School of Materials Science, Japan Advanced Institute of Science and Technology), en las sondas de fijación en los sitios en los que las sondas de fijación no se habían fotorreticulado entre sí. La síntesis de las sondas de fijación se encomendó a FASMAC Co., Ltd. Las secuencias de las sondas de fijación se muestran en la tabla 1. La fórmula estructural de CNVK se muestra en la figura 1.
Tabla 1
- Sonda de fijación
- Secuencia Comentarios
- 0DN09
- GCCTACNVKGCCACCAGC Complementaria a la cadena sentido de la secuencia de KRAS de tipo silvestre
- 0DN10
- TTGGACNVKCTGGTGGCG Complementaria a la cadena antisentido de la secuencia de KRAS de tipo silvestre
2. Preparación del fragmento génico de KRAS de tipo silvestre Se preparó ADN genómico humano a partir de sangre periférica de una persona sana mediante un procedimiento
convencional. El ADN resultante se usó como plantilla para amplificar una región del exón 2 de KRAS que 15
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T7 : 5’-AATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEC ID Nº 8)
(Resultados y discusión)
Con respecto a la muestra con la relación de mezcla (tipo silvestre/mutado) de 99/1 antes de la fotoirradiación, se confirmó que la relación de mezcla aumentó a 87/13 después de la fotoirradiación.
«Ejemplo 4»
Confirmación de la amplificación selective de gen mutado en caso de realización de una fotorreticulación en la reacción de amplificación por PCR
(Material y procedimientos)
1. Preparación de la solución de reacción PCR
Se preparó la solución de reacción para PCR siguiente y se usó como solución de reacción para la amplificación génica:
Tampón PCR (10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/l de KCl, 1,5 mmol/l de MgCl2 y 0,001 % (p/v) de gelatina);
200 µmol/l de cada dNTP (= dATP, dTTP, dCTP y dGTP) y 0,75 U/µl de AmpliTaq Gold (Applied Biosystems).
A la solución de reacción para amplificación génica se añadieron 0,2 µmol/l de NF1 y 0,2 µmol/l de NR1 como cebadores de amplificación. Posteriormente se añadieron 0,4 µmol/l de ODN09 y 0, 4 µmol/l de ODN10 como sondas de fijación. Las secuencias de los cebadores de amplificación y las sondas de fijación fueron las mismas que las descritas en el ejemplo 1. La solución de reacción resultante para la amplificación génica se vertió en tubos discretos y se añadieron por separado 1 µl de 100 pmol/l de fragmento génico de KRAS de tipo silvestre y 1 µl de 100 pmol/l fragmento génico de KRAS mutado como cada plantilla a los tubos discretos para su uso en la reacción PCR siguiente. Cada fragmento génico usado como plantilla de este reacción corresponde a 107 copias.
2. Implementación de la reacción PCR con reacción de fotorreticulación
La solución de reacción y cada fragmento génico plantilla se añadieron a tubos de 0,2 ml para la PCR tal como se ha descrito anteriormente y se realizó la PCR. La reacción PCR se realizó calentando a 94 ºC durante 10 minutos, repitiendo un ciclo compuesto de reacciones a 94 ºC durante 30 segundos, a 55 ºC durante 30 segundos y a 72 ºC durante 30 segundos 35 veces, y calentando a 72 ºC durante 3 minutos. En todos los 35 ciclos, los tubos se irradiaron con luz a 366 nm durante 5 segundos, usando UV-LED, en cada etapa de hibridación a 55 ºC durante 30 segundos para formar la fijación. Ambas soluciones de reacción se sometieron después de la PCR a electroforesis usando un gel de agarosa al 3 % y el gel se tiñó con bromuro de etidio para confirmar productos amplificados usando un transiluminador.
(Resultados y discusión)
Los resultados se muestran en la figura 4. No se detectó ningún producto amplificado por PCR derivado del fragmento génico de tipo silvestre mediante tinción con bromuro de etidio después de la electroforesis, mientras que se detectó un producto amplificado por PCR derivado del fragmento génico mutado. Se halló a partir de los resultados que la reacción de fotorreticulación con las sondas de fijación para tipo silvestre pudo reconocerse una ligera mutación tal como una sustitución de una base y esto provocó una diferencia en la cantidad de ácido nucleico amplificado mediante PCR entre las secuencias de tipo silvestre y la mutada. Se considera que puede establecerse un procedimiento para detectar selectivamente un ácido nucleico mutado con alta sensibilidad usando dichas sondas de fijación con alta específidad.
«Ejemplo 5»
Confirmación de la sensibilidad de detección de genes mutados en caso de realización de una fotorreticulación en la reacción de amplificación por PCR
(Material y procedimientos)
1. Preparación de sondas de fijación fotorreticulantes
El punto de mutación Leu858 de un gen EGFR se seleccionó como el sitio diana, y se diseñó una sonda de fijación complementaria a la cadena sentido capaz de hibridarse con el sitio diana que tenía la secuencia de tipo silvestre. De forma similar se diseñó una sonda de fijación contra la cadena antisentido. Se introdujo el ácido nucleico fotorreticulante descrito en el ejemplo 1, CNVK, a las sondas de fijación en los sitios en los que las sondas de fijación no estaban fotorreticuladas entre sí. La síntesis de las sondas de fijación se encargó a FASMAC Co., Ltd. Las secuencias de las sondas de fijación se muestran en la tabla 2.
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