ES2656958T3 - Medición de la longitud de telómeros en muestras fijadas en formalina, embebidas en parafina (FFPE) por PCR cuantitativa - Google Patents
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Abstract
Un método para medir la longitud de telómero en un tejido embebido en parafina fijado en formalina que comprende: (a) extraer el ácido nucleico telomérico diana de un tejido embebido en parafina, fijado en formalina utilizando un método de extracción suave que no aísla los fragmentos de ADN en una columna y que retiene una mayoría de los fragmentos de ácido nucleico diana teloméricos que son de al menos 50 pb, (b) combinar en una reacción en cadena de la polimerasa el ácido nucleico telomérico diana extraído de la etapa (a) que comprende sustancialmente una primera y una segunda cadena complementarias, un primer cebador telomérico en el que el primer cebador telomérico es capaz de hibridarse con la primera cadena del ácido nucleico telomérico diana y de ser extendido por ADN polimerasa para formar un cebador telomérico extendido, y un segundo cebador telomérico, en el que el segundo cebador telomérico es capaz de hibridarse con el primer cebador telomérico extendido y de ser extendido por ADN polimerasa pero no es capaz de hibridarse con el ácido nucleico telomérico diana y que se extiende mediante ADN polimerasa; (c) calentar la reacción en cadena de la polimerasa a una temperatura suficiente para generar monocadenas de ácido nucleico y reducir la temperatura a una temperatura comprendida entre 49 °C y 60 °C para dejar que los cebadores se hibriden con sus dianas y se extiendan, y (d) repetir la etapa (c) durante al menos 4 ciclos, (e) calentar la reacción en cadena de la polimerasa a una temperatura suficiente para generar una monocadena de ácidos nucleicos y reducir la temperatura de 55 °C a 65 °C para dar cabida a que se hibriden los cebadores con sus dianas y se extiendan durante otros 20 a 40 ciclos más, (f) identificar el ciclo de replicación en el que se pasa la señal de PCR umbral, y (g) determinar la longitud de telómero media.
Description
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Tal como se describe en el presente documento, hay de 5 a 10 ciclos de calentamiento de la reacción en cadena de la polimerasa para una temperatura suficiente para generar una monocadena de ácido nucleico y de reducción de la temperatura a una temperatura que permita que se hibriden los cebadores con sus dianas y se extiendan. En una realización, hay al menos 5 ciclos, al menos 6 ciclos, al menos 7 ciclos, al menos 8 ciclos, al menos 9 ciclos o al menos 10 ciclos. En esta etapa de los ciclos el intervalo de temperatura es de 49 °C – 60 °C o de 50 °C a 58 °C o a 56° Co a 57°C o a 58°C oa 59 °C.
Tal como se describe en el presente documento, hay una etapa más de calentamiento de la reacción en cadena de la polimerasa a una temperatura suficiente para generar una monocadena de ácido nucleico y de reducción de la temperatura a una temperatura que permita que los cebadores se hibriden con sus dianas y se extiendan durante 20 a 40 ciclos más o de 20 a 30 ciclos más o de 25 a 30 ciclos más. En esta etapa, la temperatura es suficiente para maximizar la hibridación de los cebadores con los cebadores extendidos, tal que se genera preferentemente el amplicón. En esta etapa de la reacción de PCR, la temperatura el intervalo de temperatura es de 55 °C a 65°C o de 58 °C a 63°C o a59°C o a 60°C oa 61°C oa 62 °C.
Tal como se describe en el presente documento, se mide la longitud de telómero a partir de células tumorales fijadas en formalina. Las muestras adecuadas son las derivadas de muestras de tejido embebido en parafina fijado en formalina. Las muestras adecuadas se derivan de tejido sólido.
Tal como se describe en el presente documento, el amplicón generado por extensión del primer y el segundo cebador es de aproximadamente 50 a 100 pares de base, de 60 a 90 pares de base, de 70 a 80 pares de base.
Tal como se describe en el presente documento, el ácido nucleico telomérico diana se extrae tejido embebido en parafina, fijado en formalina utilizando un método de extracción suave que retiene la mayoría de los fragmentos de ácido nucleico diana teloméricos que son de al menos 50 pb, al menos 60 pb, al menos 70 pb, al menos 80 pb. El método de extracción retiene los fragmentos de ácido nucleico que son de menos de 60 pb, que son de menos de 70 pb, que son de menos de 80 pb, que son de menos de 90 pb, que son de menos de 100 pb, que son de menos de 110 pb. El método de extracción de ADN suave no utiliza una columna para aislar los fragmentos de ADN. Es posible encontrar fragmentos de ADN pequeños en las muestras de FFPE que se pueden perder durante la extracción en columna. El método de extracción de ácido nucleico puede ser el kit de extracción de ADN de tejido FFPE BioChain.
Tal como se describe en el presente documento, la muestra FFPE se desparafina antes de la extracción del ADN. Se extrae el ADN de la muestra FFPE sin previo desparafinado de la muestra de FFPE. La parafina no se elimina de la muestra FFPE.
Tal como se describe en el presente documento, el ácido nucleico extraído se calienta a al menos 88 °C, 89 °C, 90 °C, 91 °C, 92 °C, 93 °C, 94 °C, 95 °C, 96°C, 97 °C durante al menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 70 minutos, 80 minutos.
El tamaño del amplicón del gen de copia única en la reacción de PCR es similar al tamaño del amplicón para la reacción de PCR de telómero. El amplicón de gen único generado por la extensión de los cebadores primero y segundo es de aproximadamente 50 a 100 nucleótidos, de 60 a 90 nucleótidos, de 70 a 80 nucleótidos.
La etapa de determinación de la longitud de telómero es sustrayendo el ciclo umbral de la PCR cuantitativa del gen de copia única del ciclo umbral de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa telomérica (Δ Ct muestra=Ct telómero-Ct gen de copia única). La diferencia del número de ciclos promedio entre el gen de copia única y la reacción en cadena de la polimerasa telomérica determinará las longitudes de telómero (ΔCt=Ct telómero-Ct gen de copia única).
La longitud de telómero se determina para un individuo y se correlaciona con la longitud de telómero observada en una población de individuos o con un individuo de referencia. La población de individuos se ajusta en edad con la edad del individuo del ensayo. Para los seres humanos, la población con el ajuste de edad está dentro de una diferencia de aproximadamente 10 años con el individuo, más preferentemente una diferencia de 5 años siendo sobre todo preferente una diferencia de 1 año.
La correlación de la longitud de telómero medida del individuo y de la población se examina a través de diversos métodos estadísticos, tales como análisis de supervivencia, incluyendo modelo de los riesgos proporcionales o de regresión de Cox, estimación de la distribución de la supervivencia de Kaplan-Meier, prueba de Peto Wilcoxon, análisis de probabilidad máxima, análisis de regresión múltiple, entre otros.
Los métodos de la presente invención se pueden emplear para determinar la respuesta de un individuo al tratamiento con un inhibidor de telomerasa, un agente inductor de daños del telómero o un activador de la telomerasa. Se mide la velocidad a la que se acorta la longitud relativa del telómero en tumores sólidos a lo largo del tiempo de tratamiento medido para determinar la reacción del individuo al inhibidor de telomerasa o el agente inductor de daños del telómero. Se mide la velocidad a la que aumenta la longitud relativa del telómero para un
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Ensayo TRF
Se evaluaron las longitudes de telómero de las cuatro líneas celulares de referencia y dos muestras de cáncer de mama. Aproximadamente 1-2 μg del ADN genómico de cada línea celular o tejido fue digerida por Hinf/RsaI durante 2 horas a 37 ºC. Tras la digestión de ADN, se separaron los fragmentos de ADN genómico en un gel de agarosa al 0,8 % y se transfirieron a una membrana de nilón por transferencia. Se proporcionaron todos los reactivos de hibridación de membrana y de detección en el kit de ensayo de longitud de telómero TeloTAGGG (Roche Diagnostics, Mannheim Alemania). Se hibridaron las membranas transferidas con una sonda de APN marcada con digoxigenina (DIG) específica para repeticiones teloméricas, seguido de incubación con una fosfatasa algalina de anticuerpo anti-DIG de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cuantificó la fosfatasa alcalina utilizando un sustrato quimioluminiscente. Se calcularon las longitudes de telómero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de PCR cuantitativa
Se llevaron a cabo todas las reacciones de PCR cuantitativa utilizando un Sistema de Detección de Secuencia de ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Carlsbad CA). Se llevaron a cabo dos PCR para cada muestra, una para determinar el valor de umbral de ciclos (Ct) y para la amplificación de telómero (T) y otro para determinar el valor Ct para la amplificación de un gen de copia única (fosfoproteína ribosómica ácida P, 36b4). Las secuencias de cebador para la amplificación de telómero fueron Telg 5’-ACA CTA AGG TTT GGG TTT GGG TTA GGG TTT GGG TTA GTG T (SEQ ID NO: 1) y Tele 5’-TGT TAG GTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA ACA (SEQ ID NO: 2) (Cawthon, 13 14 2009); y las de la amplificación de 36B4 fueron 36B4u:5’-CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC (SEQ ID NO: 3) y 36B4d: 5’-CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A (SEQ ID NO: 4) (Cawthon, 2002).
Se llevó a cabo cada reacción de PCR para amplificación de telómero utilizando una muestra de 10 ng/10 μl (1 ng/μl) y una mezcla de PCR de 40 μl que contenía 1,25 ADN polimerasa U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), 150 nM de colorante fluorescente 6-ROX, 0.2 x tinte de ácido nucleico SYBR Green I (Invitrogen, Carlsbad CA), 50 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,2 mM de desoxinucleosido trifosfatos (Applied Biosystems, Carlsbad CA), 5 mM ditiotreitol, 1% sulfóxido de dimetilo y 15 mM Tris-HCl pH 8,0, y par de cebadores Telg y Telc (ambos en 900 mM). Es preferente la concentración de cebador mayor para el ADN telomérico cuando se utiliza ADN FFPE, ya que concentraciones de cebadores altas permiten varios sitios de hibridación.
Se amplificaron secuencias de telómero en tres etapas. Etapa 1: 95 °C durante 10 min para activar la ADN polimerasa AmpliTaq Gold; etapa 2: 5 ciclos de 15 s a 95 °C, 10 s a 50 °C para generar un producto de PCR que actuará como matriz para posteriores ciclos de amplificación. La temperatura de hibridación en la etapa 2 podría oscilar entre 49 °C y 58 °C. Etapa 3: 25 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 60 °C con adquisición de señal a 60 °C. El tiempo de ciclo total fue 55 minutos.
Se llevó a cabo la amplificación del gen 36B4 de copia única del siguiente modo. 10 minutos a 95 ºC para activar la ADN polimerasa AmpliTag Gold seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 °C, 1 min a 58 °C con adquisición de señal a 58 °C. Se llevó a cabo la amplificación de 36B4 utilizando 10 ng/10 μl de muestras (1 ng/μl), 40 μl de mezcla madre de SYBR Green (Applied Biosystems, Carlsbad CA) y el par de cebadores 36B4d (300 nM) y 36B4u (300 nM).
Se evaluaron varios kits de extracción de ADN FFPE disponibles en el mercado. Entre estos kits, el kit de extracción de ADN de tejido FFPE (Bio Chain Institute Inc. Hayward CA) proporcionó un método fiable para extraer el ADN genómico de muestras FFPE. (1) no fue necesaria la desparafinado de la muestra antes de la extracción de ADN.
(2) La purificación no depende de la separación de tamaños en la columna. Se observan pequeños fragmentos de ADN normalmente en las muestras de FFPE y se pueden perder en la purificación de columna. (3) Se puede invertir parcialmente la reticulación del ADN calentando ADN en una solución tamponada durante períodos de tiempo prolongados. (4) No se produce una interferencia detectable con las reacciones de PCR por el tampón de extracción, durante hasta 20 % de volúmenes de reacción de PCR en total.
En la Fig. 2 a se muestran ejemplos de ADN genómicos aislados de muestras FFPE o recién congeladas. La mayoría de los ADN de las muestras FFPE son relativamente cortas, en el intervalo de tamaño de 50 pb -2 kb. La Fig. 2b muestra como el ADN extraído con otros kits no retiene los fragmentos de ADN pequeños. Se puede medir con éxito la longitud de telómero mediante ensayo FFPE qPCR TL utilizando muestras de sección de tejido FFPE de tan solo 16 mm2 (espesor 10 μm) en un portaobjetos (Fig. 3). Se correlacionaron los rendimientos de ADN y el tamaño de la sección de tejido utilizada (Fig. 4).
Amplificación por PCR
Se modificó el número de ciclos de la etapa 2 a 5 ciclos para obtener un valor ΔCt apropiado ((Δ Ct muestra=Ct telómero-Ct referencia) cuando se utilizaron 10 ng de ADN en cada reacción de PCR. 10 ng -20 ng de ADN por reacción tuvieron una eficacia de PCR de >94 % en los estudios de reproducibilidad. El número de ciclos para la PCR de gen de copia única necesita ser de nueve ciclos más que para la PCR de telómero para producir un producto de PCR de gen de copia única suficiente. Las diferencias del número de ciclos promedio de gen de copia única y telómero (Ct 36B4 – Ct
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