ES2558155T3

ES2558155T3 - Compuestos que muestran actividad antagonista de glucacón y agonista de GLP-1

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Publication number: ES2558155T3
Application number: ES08845541.5T
Authority: ES
Inventors: Richard D. Dimarchi; Bin Yang; Chenguang Ouyang
Original assignee: Indiana University Research and Technology Corp
Current assignee: Indiana University Research and Technology Corp
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2008-10-27
Publication date: 2016-02-02
Anticipated expiration: 2028-10-27
Also published as: MX2010004298A; PA8802301A1; JP5771005B2; EP2214691B1; HK1141984A1; WO2009058734A1; EP2214691A4; WO2009058734A4; EP2214691A1; TW200920395A; US20110098217A1; PE20090932A1; CA2702289A1; AU2008318876B2; AR069136A1; JP2011502159A; US8980830B2; CL2008003243A1; AU2008318876A1

Abstract

Antagonista de glucagón/agonista de GLP-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 51, en el que los aminoácidos en las posiciones 4 y 7, o las posiciones 7 y 11, o las posiciones 11 y 15, o las posiciones 15 y 19, o las posiciones 19 y 23 de la SEQ ID NO: 51 están unidos a través de un puente de lactama; en el que el aminoácido C-terminal del antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 comprende un grupo amida en lugar del grupo ácido carboxílico del aminoácido nativo.

Description

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homoglutámico, ácido β-homoglutámico, un derivado con ácido sulfónico de cisteína, o un derivado con alquilcarboxilato de cisteína que tiene la estructura de:

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en el que X5 es alquilo C1-C4, alquenilo C2-C4 o alquinilo C2-C4, y la estructura de hélice alfa en la parte C-terminal de glucagón (alrededor de los aminoácidos 12-29 según la numeración de aminoácidos de glucagón de tipo natural) se estabiliza, por ejemplo, a través de la formación de un puente de lactama entre las cadenas laterales de los aminoácidos 12 y 16 o entre los aminoácidos 16 y 20, en relación con el péptido glucagón natural.

[0079] En una realización, el péptido glucagón comprende un péptido de SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 48, y en una realización adicional, el péptido glucagón comprende un péptido de SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 48 en el que el aminoácido en la posición 4 de esas secuencias es ácido glutámico y un grupo amida está sustituido por el grupo ácido carboxílico C-terminal presente en el aminoácido nativo. En una realización adicional, el péptido de SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 48 se modifica adicionalmente por la adición de la secuencia de SEQ ID NO: 21 al extremo carboxi terminal del péptido.

[0080] En una realización adicional, se han desarrollado análogos de glucagón en los que se han eliminado los cinco primeros aminoácidos del glucagón natural, el grupo amino del aminoácido N-terminal (fenilalanina) ha sido sustituido por un grupo hidroxilo (es decir, el primer aminoácido es ácido fenil láctico) y las cadenas laterales de uno

o más pares de aminoácidos seleccionados entre las posiciones 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24, y 24 y 28 están unidos entre sí, estabilizando así la hélice alfa del análogo de glucagón.

[0081] Según una realización, se proporciona un antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 que se modifica mediante una sustitución del residuo serina en la posición 11 de la SEQ ID NO: 2 (posición 16 según la numeración de aminoácidos de glucagón natural) por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido glutámico, glutamina, ácido homoglutámico, ácido homocisteico, treonina o glicina. Según una realización, el residuo de serina en la posición 11 de la SEQ ID NO: 2 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido glutámico, glutamina, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, y en una realización el residuo de serina está sustituido por ácido glutamico. Según una realización el antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 38.

[0082] En una realización, se proporciona un antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 en el que se forma un puente intramolecular entre dos cadenas laterales de aminoácidos para estabilizar la estructura tridimensional del extremo carboxi terminal del péptido de SEQ ID NO: 2. Más particularmente, las cadenas laterales de uno o más aminoácidos seleccionados de los pares de aminoácidos 7 y 11, 11 y 15, 15 y 19 o 19 y 23 de la SEQ ID NO: 2 están unidos entre sí, estabilizando así la hélice alfa del análogo de glucagón. Las dos cadenas laterales pueden estar unidas entre sí a través de enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas (tales como la formación de puentes salinos), o por enlaces covalentes. Según una realización, el tamaño del enlazador es de 7-9 átomos, y en una realización, el tamaño del enlazador es de 8 átomos. En una realización, el antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. En una realización, el aminoácido C-terminal del antagonista/agonistas de GLP-1 tiene un grupo amida que sustituye el grupo ácido carboxílico que está presente en el aminoácido natural.

[0083] Ejemplos de emparejamientos de aminoácidos que son capaces de unirse covalentemente para formar un puente de unión que tiene siete átomos incluyen Orn-Glu (lactama); Lys-Asp (lactama); o Homoser-Homoglu (lactona). Ejemplos de emparejamientos de aminoácidos que pueden formar un enlazador de ocho átomos incluyen Lys-Glu (lactama); Homolys-Asp (lactama); Orn-Homoglu (lactama); 4-aminoPhe-Asp (lactama); o Tyr-Asp (lactona). Ejemplos de emparejamientos de aminoácidos que pueden formar un enlazador de nueve átomos incluyen Homolys-Glu (lactama); Lys-Homoglu (lactama); 4-aminoPhe-Glu (lactama); o Tyr-Glu (lactona). Cualquiera de las cadenas laterales de estos aminoácidos puede estar sustituida con grupos químicos adicionales, siempre y cuando la estructura tridimensional de la hélice alfa no se interrumpa. Un experto en la técnica puede imaginar emparejamientos alternativos o análogos o derivados de aminoácidos alternativos que crearían una estructura estabilizadora de tamaño similar y efecto deseado. Por ejemplo, un puente disulfuro homocisteína-homocisteína tiene 6 átomos de longitud y puede ser modificado adicionalmente para proporcionar el efecto deseado. Incluso sin enlace covalente, los emparejamientos de aminoácidos descritos anteriormente o emparejamientos similares que un experto en la técnica puede imaginar también pueden proporcionar estabilidad añadida a la hélice alfa a través de

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en el que X es Met, Leu, o Nle; Y es Asn o un aminoácido cargado; Z es Thr, Gly, Cys, Lys, ornitina (Orn), homocisteína, acetil fenilalanina (Ac-Phe), o un aminoácido cargado; en el que R10 se selecciona de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, 26, 27 y 50.

[0115] En un aspecto específico, el antagonista de glucagón comprende un derivado oxi de PLA. Tal como se usa aquí, "derivado oxi de PLA" se refiere a un compuesto que comprende una estructura modificada de PLA en la que el grupo hidroxilo ha sido reemplazado por O-R11, en el que R11 es un grupo químico. En este sentido, el derivado oxi de PLA puede ser, por ejemplo, un éster de PLA o un éter de PLA.

[0116] Los métodos de fabricación de derivados oxi de PLA son conocidos en la técnica. Por ejemplo, cuando el derivado oxi es un éster de PLA, el éster puede formarse por reacción del hidroxilo de PLA con un carbonilo que lleva un nucleófilo. El nucleófilo puede ser cualquier nucleófilo adecuado, incluyendo, pero sin limitación, una amina

o hidroxilo. Por consiguiente, el éster de PLA puede comprender la estructura de fórmula IV:

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en la que R7 es un éster formado por reacción del hidroxilo de PLA con un carbonilo que lleva un nucleófilo.

[0117] El carbonilo que lleva un nucleófilo (que reacciona con el hidroxilo de PLA para formar un éster) puede ser, por ejemplo, un ácido carboxílico, un derivado de ácido carboxílico, o un éster activado de un ácido carboxílico. El derivado de ácido carboxílico puede ser, pero sin limitación, un cloruro de acilo, un anhídrido de ácido, una amida, un éster, o un nitrilo. El éster activado de un ácido carboxílico puede ser, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS), tosilato (Tos), una carbodiimida, o un hexafluorofosfato. En algunas realizaciones, la carbodiimida es 1,3diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1,1'-carbonildiimidazol (CDI), clorhidrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), o 1,3-diisopropilcarbodiimida (DICD). En algunas realizaciones, el hexafluorofosfato se selecciona de un grupo que consiste en hexafluorofosfato de benzotriazol 1-il-oxitris(dimetilamino) fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de benzotriazol 1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronio (HATU), y hexafluorofosfato de obenzotriazol-N,N,N’,N'-tetrametil-uronio (HBTU).

[0118] Los métodos de fabricación de éteres a partir de la reacción con un grupo hidroxilo (por ejemplo, el hidroxilo de PLA) también se conocen en la técnica. Por ejemplo, el grupo hidroxilo de PLA puede hacerse reaccionar con un alquilo halogenado o alcohol alquílico tosilado para formar un enlace éter.

[0119] Generalmente, el grupo químico de R11 es aquel que no disminuye la actividad del péptido. En algunas realizaciones, el grupo químico aumenta la actividad, estabilidad y/o solubilidad del péptido.

[0120] En una realización específica, el grupo químico unido a PLA a través de un enlace que contiene oxígeno (por ejemplo, a través de un enlace éster o éter) es un polímero (por ejemplo, un polialquilenglicol), un carbohidrato, un aminoácido, un péptido, o un lípido, por ejemplo, un ácido graso o un esteroide.

[0121] En una realización específica, el grupo químico es un aminoácido, que, opcionalmente, es una parte de un péptido, de manera que la fórmula IV es un depsipéptido. En este sentido, PLA puede estar en una posición distinta al residuo de aminoácido N-terminal del péptido, de manera que el péptido comprende uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más) aminoácidos N-terminales al residuo PLA. Por ejemplo, el péptido puede comprender PLA en la posición n, en el que n es 2, 3, 4, 5, o 6 del péptido.

[0122] Los aminoácidos N-terminales al residuo PLA pueden ser sintéticos o naturales. En una realización específica, los aminoácidos que son N-terminales a PLA son aminoácidos naturales. En una realización, los aminoácidos que son N-terminal a PLA son los aminoácidos N-terminales de glucagón nativo. Por ejemplo, el péptido puede comprender en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 52

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E16K20(lactama), D28] G (6-39)

[0323] Tal como se muestra en la Tabla 17, los péptidos antagonistas de glucagón/agonistas de GLP-1 que comprenden un puente de lactama entre los aminoácidos 16 y 20 (según la numeración de glucagón natural) exhibió la mayor actividad de GLP-1. Un puente de lactama entre los residuos 12 y 16 también permitió que el péptido

5 mostrara una potente actividad de GLP-1.

[0324] Los péptidos antagonistas de glucagón/GLP-1 modificados para reemplazar la secuencia de aminoácidos de glucagón natural por la secuencia nativa de GLP-1 fueron sintetizados y comparados con los correspondientes péptidos que carecen de la sustitución de la secuencia de GLP-1. Los resultados combinados de tres ensayos

10 separados se muestran en la Tabla 18.

TABLA 18

Péptido: SEQ ID NO: Antagonismo de glucagón Agonismo de GLP-1

IC50 (nM, inhibir glucagón 0,2-0,8 nM): EC50 (nM)

Glucagón: 1 0,19 ± 0,015 (EC50)a

GLP-1: 0,014 ± 0,003

[PLA6, K12E16 (lactama), D28] G (629): 75 58,3 ± 3,3 38,5 ± 7,6

[PLA6, K12E16 (lactama), GLP(23-32)] G (6-29): 79 Sin agonismo

[PLA6, E16K20 (lactama), D28] G (629): 76 11,7 ± 2,8 a 5,5 ± 0,2 6,9 ± 4,6 (ensayo 1), 4,2 ± 1,6 (ensayo 2)

[PLA6, E16K20 (lactama), GLP(23-32)] G (6-29): 80 11,7 ± 0,5b, 73,5 ± 51,2 ± 11,2

[PLA6, E16, GLP(2332)] G (6-29): 104 64,5 ± 11,4b 85,6 ± 12,7b

[A2E3, E9, E16K20(lactama), D28] G (2-29): 81 63,2 ± 2,3 175,2 ± 15,7

[A2E3, E9, E16K20(lactama), GL(23-32)] G (2-29): 82 423±--antagonista parcial* 9,8 ± 4,2*

[H1A2E3, E9, E16K20(lactama), D28] G (1-29): 83 129 ± 106 antagonista parcial 0,11±-

[H1A2E3, E9, E16K20(lactama), GLP(23-32)] G (1-29): 84 2148± --antagonista parcial* 0,017±-

15 [0325] Tal como se muestra en la Tabla 18, el efecto de sustituir la secuencia de glucagón natural por la secuencia de GLP-1 alrededor de las posiciones 16-25 de (según la secuencia de glucagón natural) aumentó la actividad agonista de GLP-1 en la mayoría de los casos. Sin embargo, para los péptidos que comprenden adicionalmente la secuencia de GLP-1 en las posiciones 2 y 3 (según la secuencia de glucagón natural) y carecen de PLA, la sustitución por la secuencia de GLP-1 alrededor de las posiciones 16-25 disminuyó la actividad antagonista del

20 glucagón.

[0326] Se produjeron y analizaron péptidos antagonista de glucagón/GLP-1 que carecen de PLA con diversos truncamientos N-terminales. Algunos de los péptidos también tenían la secuencia N-terminal de GLP-1. Los resultados combinados de dos ensayos separados se muestran en la Tabla 19.

25 TABLA 19

Péptido: SEQ ID NO: Antagonismo de glucagón Agonismo de GLP-1

IC50 (nM, inhibir glucagón 0,8 nM): EC50 (nM)

Glucagón: 1 0,55 (EC50)

GLP-1: 0,021, 0,0086*

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[PLA6, E16K20 (lactama), D28] G (629): 76 13,7 ± 1,2 10,6 ± 0,97

[G4T5, E9, E16K20 (lactama), D28] G (429): 85 12,7 ± 1,1 151,4 ± 8,8

[S2Q3, E9, E16K20 (lactama), D28] G (229): 86 48,6 ± 22,3 antagonista parcial 203,2 ± 4,2

[A2E3, E9, E16K20 (lactama), D28] G (229): 81 63,2 ± 2,3 175,2 ± 15,7

[H1A2E3, E9, E16K20 (lactama), D28] G (129): 83 129 ± 106 antagonista parcial 0,11 ± --

ANK2 (péptido de Bayer): * Agonista débil 0,28 ±-

* ANK2 se describe en Pan et al, J Biol Chem 281 (18): 12506-12515 (2006).

[0327] Tal como se muestra en la Tabla 19, el péptido antagonista de glucagón/GLP-1 que comprende PLA es un antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 más potente.

5 [0328] Se produjeron y analizó la actividad de depsipéptidos de antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 (que comprenden PLA en la posición n (n = 5 o 6) unido a Thr en la posición n-1 a través de un enlace éster). Su potencia como antagonistas de glucagón/agonistas de GLP-1 se comparó con un péptido que comprende PLA como el aminoácido N-terminal y los péptidos que carecen de PLA todos juntos. Los resultados combinados de dos ensayos separados se muestran en la Tabla 20.

10 TABLA 20

Péptido: SEQ ID NO: Antagonismo de glucagón Agonismo de GLP-1

IC50 (nM, inhibir glucagón 0,8 nM): EC50 (nM)

Glucagón: 1 0,55 (EC50)

GLP-1: 0,021, 0,0086*

[PLA6, E16K20(lactama), D28] G(6-29): 76 13,7 ± 1,2 10,6 ± 0,97

[S2Q3, E9, E16K20(Lactama), D28] G(2-29): 86 48,6 ± 22,3 antagonista parcial 203,2 ± 4,2

[A2E3, E9, E16K20(Lactama), D28] G(2-29): 81 63,2 ± 2,3 175,2 ± 15,7

[H1A2E3, E9, E16K20(Lactama), D28] G(1-29): 83 129 ± 106 antagonista parcial 0,11 ± -6

[S2Q3 -O-PLA6, D9, E16K20(Lactama), D28] G(2-29): 66 3,14 ± 1,89 45,70 ± 12,34

[A2E3 -O-PLA6, D9, E16K20(Lactama), D28] G(2-29): 64 4,68 ± 0,44 13,98 ± 1,02

[H1A2E3 -O-PLA6, D9, E16K20(Lactama), D28] G(1-29): 87 9,65 ± 0,57 6,20 ± 0,91

[0329] Tal como se muestra en la Tabla 20, la modificación de péptidos a depsipéptidos provocó un aumento tanto 15 de la actividad agonista de GLP-1 como la actividad antagonista de glucagón.

[0330] El efecto de PEGilación de péptidos antagonistas de glucagón/agonista de GLP-1 se exploró mediante la

síntesis de péptidos antagonistas de glucagón/agonistas de GLP-1 con grupos PEG de 20.000 Dalton unidos al

aminoácido en la posición 24 (según la numeración de glucagón natural) o unidos al residuo C-terminal de péptidos 20 que comprenden una extensión C-terminal. Para el péptido "[PLA6, E16K20 (lactama), K24 (COCH2CH2S-20 kDa)]

G (6-29)," se acopoló ácido 3-mercaptopropiónico a la amina de cadena lateral de Lys en la posición 24 (según la

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numeración de glucagón natural) para la pegilación. Para el péptido "[PLA6, E16K20 (lactama), K24 (rígido-S-20 kDa)] G (6-29)," se acopló primero ácido 3-aminoprop-1-inil-benzoico a la amina de cadena lateral de Lys en la posición 24 y a continuación se acopló ácido 3-mercaptopropiónico a la parte rígida unida para la pegilación. El enlazador resultante tenía la siguiente estructura:

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Los péptidos se ensayaron a continuación para la actividad agonista en el receptor de GLP-1 y la actividad 20 antagonista en el receptor de glucagón tal como esencialmente se describe en el presente documento. Los resultados se muestran en la Tabla 21.

TABLA 21

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Péptido: SEQ ID NO: Antagonismo de glucagón Agonismo de GLP-1

IC50 (nM, inhibir glucagón 0,2-0,8 nM): EC50 (nM)

Glucagón: 1 0,1-0,5 (EC50)

GLP-1: 0,01-0,05

[PLA6, K12E16(lactama), D28]G(6-29): 75 58,3 ± 3,3a 38,5 ± 7,6 a

[PLA6, K12E16(lactama), C24(20 kDa), D28]G(6-29): 88 628 ± 120 (n =1) 550-753 (n = 3)

[PLA6, K12E16(Lactama), D28,CEX-C40(20 kDa) ]G(6-40): 89 No antagonista (n = 1) 657 ± 28 (n = 1)

[PLA6, E16K20(lactama), D28]G(6-29): 76 5-27 (n = 10) 5-28 (n = 10)

[PLA6, E16K20(Lactama), C24(20 kDa), D28]G(6-29): 90 374-1462 (n = 3) 450-1842 (n = 4)

[PLA6, E9,E16K20(Lactama), C24(20 kDa)]G(6-29): 114 No detectado 825 (n = 1)

[PLA6, E 16K20(Lactama), D28,CEX-C40(20 kDa)]G(6-40): 91 350-500 (n = 5) 75-100 (n = 5)

[PLA6, E16K20(Lactama), K24(COCH2CH2S-20 kDa)] G(6-29): 115 300-400 (n = 3) 16-20 (n = 2)

[PLA6,E16K20(Lactama), K24(rígido-S-20 kDa)]G(6-29): 116 393-620 (n = 2) 1362-2675 (n = 2)

[PLA6, E16K20(Lactama),D28,GPC40(20 kDa)]G(6-40): 117 423 ± 133 (n =1) 43,6 ± 32 (n = 1)

[PLA6, E16K20(Lactama),D28,G29, CEX-C40(20 kDa)]G(6-40): 118 335 ± 86 (n =1) 180,2 ± 64 (n = 1)

[0331] Tal como se muestra en la Tabla 21, la pegilación generalmente aumentó la IC50 en el receptor de glucagón 60

y aumentó la EC50 en el receptor de GLP-1.

[0332] El efecto de la acilación de ácidos grasos de péptidos antagonistas de glucagón/agonistas de GLP-1 se exploró mediante la producción y análisis del péptido antagonista de glucagón/agonista de GLP-1 [PLA6, E16K20

5 (lactama), D28] G (6-29) que comprende un ácido graso C16 unido a un residuo de Lys del péptido a través de un espaciador de residuo de ácido glutámico, en el que el residuo de Lys varió en la posición de aminoácido dentro de la secuencia del péptido antagonista de glucagón/agonista de GLP-1. Los resultados se muestran en la Tabla 22.

TABLA 22 10

Péptido: SEQ ID NO: Antagonismo de glucagón Agonismo de GLP-1

IC50 (nM, inhibir glucagón 0,4 nM): EC50 (nM)

Glucagón: 1 0,14 (EC50)

GLP-1: 0,06

[PLA6, E16K20(lactama),D28]G(629): 76 5-7 (n = 10) 20,73 ± -

[C16FA-O-PLA6, E16K20(lactama),D28]G(629): 92 337,8 ± 79,7 45,7 ± 13,8

[PLA6, K10(EC16FA), E16K20(lactama),D28]G(629): 93 31,1 ± 4,1 128,8 ± 38,7

[PLA6, E16, K20(EC16FA), D28]G(629): 94 576,5 ± 20,7 1290 ± 331

[PLA6, E16K20(lactama), K24(EC16FA), D28]G(6-29): 95 371,9 ± 40,0 292,7 ± 40,4

[PLA6, E16K20(lactama), D28, K29(EC16FA)]G(6-29): 96 386,4 ± 26,2 1412 ± 407

[PLA6, K10(EC16FA), E16, K20,D28]G(6-29): 106 221,9 ± 41,7 105,0 ± 30,3

EJEMPLO 21

[0333] Todos los péptidos descritos en el presente documento comprenden una amida C-terminal en lugar del 15 carboxilato C-terminal, a menos que se indique lo contrario. Las posiciones de los aminoácidos designados en el nombre del péptido están en conformidad con la numeración de glucagón natural.

[0334] Se prepararon péptidos modificados con colesterol mediante la conjugación de péptidos lactamizados con un derivado de colesterol bromoacetilado en solución. Los péptidos se ensamblaron utilizando la síntesis convencional 20 de péptidos en fase sólida (SPPS). La cadena de péptido derivada con PLA se cicló a través de un puente de lactama. El procedimiento de escisión y purificación estándar se aplicaron para obtener el depsipéptido deseado.

Ejemplo

25 Síntesis de péptido con puente lactama [PLA6, K10 (COCH2CH2S-Chol), E16K20 (lactama), D28] G (6-29) amida conjugado con colesterol

[0335] Se sintetizó una resina de peptidilo con secuencia de HO-PLA-TSDKSKYLDERRAKDFVQWLMDT [PLA6, Klo, E16, K20, D28] glucagón (6-29) mediante química Boc en fase sólida utilizando un sintetizador de péptidos 30 automático ABI 430A con 0,2 mmo de resina de amida MBHA y DEPBT como reactivo de acoplamiento. Se utilizaron los siguientes aminoácidos Boc: Ala, Arg (Tos), Asp (OcHx), Asn (Xan), Glu (OcHx), Gln (Xan), Leu, Lys (2-Cl-Z), Met, PLA, Ser (OBzl), Thr (OBzl), Trp (CHO), Tyr (2,6-di-Cl-Bzl) y VaI, excepto que el ácido glutámico en la posición 16 fue incorporado con Boc-Glu(OFm) -OH, la lisina en la posición 20 se incorporó con Boc-Lys-(Fmoc)-OH y la lisina en la posición 10 se incorporó con Boc-Lys(Alloc)-OH. Después de la eliminación de los grupos protectores Fm 35 y Fmoc en las posiciones 16 y 20 con piperidina al 20% en DMF, la resina de peptidilo se trató con 300 mg (1 mmol) de DEPBT en DIEA al 10%/DMF durante aproximadamente 4 h para formar el puente de lactama. Esta resina de peptidilo con puentes de lactama se trató con una solución compuesta de 100 mg (0,4 equiv.) de Pd (PPh3)4, 120 uL de PhSiH3, 0,25 ml de N-metilmorfolina y 0,5 ml de ácido acético en 10 ml de CHCl3 en atmósfera de N2 durante aproximadamente 3 h para eliminar el grupo Alloc. El ácido 3-tritiltiopropiónico se acopló a continuación mediante 40 DEPBT para obtener la resina de peptidilo con una secuencia de: HO-PLA-Thr-Ser-Asp-Lys(COCH2CH2SH)-Ser

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29 de glucagón modificado para comprender PLA en lugar de la Phe en la posición 6 y AIB en la posición 16 (según la numeración de glucagón natural) y que comprende una amida C-terminal (SEQ ID NO: 97) y se analizó la actividad antagonista del glucagón y la actividad agonista de GLP-1. La IC50 en el receptor de glucagón en respuesta a 0,2 nM de glucagón era 7,04 (0,69) en un ensayo y 22,0 (2,84) en otro (SD proporcionado en

5 paréntesis). La EC50 en el receptor de GLP-1 fue 795 (31,2)

EJEMPLO 23

[0342] Todos los péptidos descritos en el presente documento comprenden una amida C-terminal en lugar del

10 carboxilato C-terminal, a menos que se indique lo contrario. Las posiciones de los aminoácidos designados en el nombre del péptido están en conformidad con la numeración de glucagón natural.

[0343] Se modificaron péptidos antagonistas de glucagón/agonistas de GLP-1 a depsipéptidos que contienen PLA y/o para comprender los aminoácidos nativos de GLP-1 en las posiciones 2 y 3 en lugar de los aminoácidos nativos

15 del glucagón en estas posiciones (numeración según GLP-1 y glucagón nativos). Los péptidos se ensayaron a continuación para las actividades de antagonista de glucagón y GLP-1. Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 24.

TABLA 24 20

Péptido: SEQ ID NO: Antagonismo de glucagón Agonismo de GLP-1

IC50 (nM, inhibir glucagón 0,4 nM): EC50 (nM)

Glucagón: 1 0,323 (EC50)

GLP-1: 0,057

[PLA6, E16K20(lactama), D28] G(6-29): 60 20,34 ± 1,8 18,22 ± 0,56

[PLA6, E9] G(6-29): 61 94,65 ± 17,95 900,72 ± 818,56

[PLA6, E9K12(Lactama)] G(6-29): 62 72,47 ± 7,04 143,95 ± 21,62

[A2E3, E9, E16K20(Lactama), D28] G(2-29): 63 151,46* 298,56*

[A2E3 -O-PLA6, D9, E16K20(Lactama), D28] G(2-29): 64 21,80 ± 6,45 18,01 ± 2,14

[S2Q3, E9, E16K20(Lactama), D28] G(2-29): 65 23,37* 283,43*

[S2Q3 -O-PLA6, D9, E16K20(Lactama), D28] G(2-29): 66 20,85 ± 3,09 112,21 ± 11,12

EJEMPLO 24

[0344] Todos los péptidos descritos en el presente documento comprenden una amida C-terminal en lugar del 25 carboxilato C-terminal, a menos que se indique lo contrario. Las posiciones de los aminoácidos designados en el nombre del péptido están en conformidad con la numeración de glucagón natural.

[0345] Los siguientes péptidos fueron sintetizados como se describe en general anteriormente y posteriormente se analizó la capacidad de estimular el receptor de GLP-1 mediante el ensayo de liberación de AMPc de células que 30 expresan el receptor de GLP-1 humano y la capacidad de estimular el receptor de glucagón mediante el ensayo de liberación de AMPc de células que expresan el receptor de glucagón humano y estimuladas con 0,5 nM de glucagón, tal como se describe en general en el Ejemplo 13. Los resultados de los ensayos se muestran en la Tabla

25.

35 TABLA 25

Péptido: Antagonismo de glucagón Agonismo de GLP-1

IC50 (nM, inhibir glucagón 0,5 nM G): EC50 (nM)

Glucagón: 0,005 ± 0,008

GLP-1: 0,005 ± 0,002

[PLA6, E9]Glucagon(6-29) PLA: 23,75 ± 4,16 Sin agonismo

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Claims

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