ES2558745T3 - Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para potenciar rasgos relacionados con el rendimiento de las semillas, en plantas con respecto a plantas de control, que comprende aumentar, la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido dedo de homeodominio de planta-homeodominio (PHDf-HD), cuyo polipéptido PHDf-HD comprende: (i) un dominio que tiene al menos el 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio cremallera de leucina/dedo de homeodominio de planta (ZIP/PHDf) como se representa en SEC ID Nº: 233; y (ii) un dominio que tiene al menos el 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un homeodominio (HD) como se representa en SEC ID Nº: 234; y (iii) en el que cuando dicho polipéptido PHDf-HD se utiliza en la construcción de un árbol filogenético de HD, tal como el ilustrado en la Figura 1, se agrupa con el grupo de polipéptidos PHDf-HD que comprende la secuencia de polipéptido como se representa en SEC ID Nº: 180, en lugar de con cualquier otro grupo HD; y/o en el que dicho polipéptido PHDf-HD tiene en orden creciente de preferencia al menos el 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con el polipéptido PHDf-HD como se representa en SEC ID Nº: 180 o con cualquiera de las secuencias de polipéptido proporcionadas en la Tabla D1 en la presente memoria, y opcionalmente la selección de plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento potenciados.

Description

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DESCRIPCIÓN

Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas

La presente invención se refiere, en líneas generales, al campo de la biología molecular y atañe a un procedimiento para potenciar rasgos relacionados con el rendimiento de semilla mediante el aumento de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido dedo de homeodominio de planta-homeodominio (PHDf-HD, por sus siglas en inglés plant homeodomain finger-homeodomain). La presente invención también atañe a plantas que tienen expresión aumentada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD, cuyas plantas tienen rasgos relacionados con el rendimiento de semilla potenciados, con respecto a las correspondientes plantas de tipo silvestre u otras plantas de control. La invención también proporciona construcciones útiles para los procedimientos de la invención.

El continuo aumento de la población mundial y la disminución de suministro de tierra cultivable disponible para la agricultura incentivan la investigación hacia el aumento de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras de cultivo y hortícolas utilizan técnicas de siembra selectiva para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, dichas técnicas de siembra selectiva tienen diversos inconvenientes, en concreto, que estas técnicas son típicamente laboriosas y producen plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre producen el rasgo deseable que se transmite desde las plantas progenitoras. Los avances en biología molecular han permitido a la humanidad modificar el plasma germinal de animales y plantas. La ingeniería genética de las plantas conlleva el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de producir cultivos o plantas que tienen diversos rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados.

Un rasgo de interés económico particular es el aumento del rendimiento. El rendimiento se define normalmente como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, del número y tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (por ejemplo, del número de ramas), de la producción de semillas, de la senescencia de las hojas y de más factores. El desarrollo de raíces, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés, y el vigor temprano también pueden ser factores importantes en la determinación del rendimiento. Por lo tanto, optimizar los factores mencionados anteriormente puede contribuir a aumentar el rendimiento del cultivo.

El rendimiento de semilla es un rasgo particularmente importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición humana y animal. Cultivos tales como maíz, arroz, trigo, canola y soja representan más de la mitad de la ingesta calórica humana total, bien a través del consumo directo de las propias semillas o a través del consumo de productos cárnicos generados sobre semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos utilizados en los procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raíces) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una semilla implica muchos genes y requiere la transferencia de metabolitos desde las raíces, hojas y tallos al interior de la semilla en crecimiento. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de los carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar el grano.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. Mejorar el vigor temprano es un objetivo importante de los programas de siembra de arroz modernos en variedades de cultivo de arroz tanto de clima templado como tropical. Las raíces largas son importantes para el anclaje adecuado al suelo en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados, y cuando las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, los brotes más alargados se asocian con el vigor. Cuando se practica siembra con perforación, para la buena emergencia de las plántulas son importantes mesocótilos y coleóptilos más alargados. La capacidad de modificar genéticamente el vigor temprano en plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, un vigor temprano pobre ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) a base de plasma germinal del Cinturón de Maíz en el Atlántico Europeo.

Un rasgo adicional de importancia es el de tolerancia mejorada al estrés abiótico. El estrés abiótico es la causa principal de pérdidas de cultivo en todo el mundo, reduciendo en más de un 50 % los rendimientos promedio para la mayoría de las plantas de cultivo principales (Wang y col. Planta (2003) 218: 1-14). El estrés abiótico puede producirse por sequía, salinidad, temperaturas extremas, toxicidad química, y estrés oxidativo. La capacidad de mejorar la tolerancia de la planta al estrés abiótico sería de gran ventaja económica para los granjeros de todo el mundo y permitiría la cosecha de cultivos durante condiciones adversas y en territorios cuando la cosecha de cultivos no pueda ser posible de otra forma.

Por lo tanto el rendimiento del cultivo puede aumentarse optimizando uno de los factores mencionados anteriormente.

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Dependiendo del uso final, la modificación de determinados rasgos de rendimiento puede estar favorecida sobre otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como forraje o producción de madera, o fuente de biocombustible, puede ser deseable un aumento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, el aumento en los parámetros de semilla puede ser particularmente deseable. Incluso entre los parámetros de semilla, algunos pueden estar favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de las semillas, ya sea que esté en la forma de tamaño de semilla aumentado o número de semilla aumentado.

Una estrategia para aumentar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en las plantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos de crecimiento intrínsecos de una planta, tal como el ciclo celular o diversas rutas de señalización implicados en el crecimiento de la planta o en los mecanismos de defensa.

De forma sorprendente, ahora se ha encontrado que el aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido dedo de homeodominio de planta-homeodominio (PHDf-HD), proporciona plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento de semilla con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con una realización, se proporciona un procedimiento para mejorar o potenciar rasgos relacionados con el rendimiento de semilla de una planta con respecto a las plantas de control, que comprende aumentar en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido dedo de homeodominio de planta-homeodominio (PHDf-HD).

Antecedentes

Los factores de transcripción normalmente se definen como proteínas que muestran afinidad de unión a ADN específica de secuencia y que son capaces de activar y/o reprimir la transcripción. El genoma de Arabidopsis thaliana codifica al menos 1533 reguladores transcripcionales, lo que explica el ~ 5,9 % de su número total estimado de genes (Riechmann y col. (2000) Science 290: 2105-2109). La base de datos The Database of Rice Transcription Factors (DRTF), es una colección de factores de transcripción conocidos y predichos de Oryza sativa L. ssp. indica y Oryza sativa L. ssp. japonica y, actualmente, contiene 2.025 supuestos modelos génicos de factores de transcripción (FT) en indica y 2.384 in japonica, distribuidos en 63 familias (Gao y col. (2006) Bioinformatics 2006, 22(10):1286-7).

Una de estas familias es la superfamilia de los factores de transcripción homeodominio (HD), implicados en muchos aspectos de los procesos del desarrollo. Los factores de transcripción HD se caracterizan por la presencia de un homeodominio (HD), que es un dominio de unión (DU) a ADN de 60 aminoácidos. Arabidopsis thaliana y el arroz contienen aproximadamente 100 factores de transcripción HD, los que adicionalmente pueden clasificarse en subfamilias a base de la identidad de secuencia de aminoácidos (Richardt y col. (2007) Plant Phys 143(4): 14521466). Algunas de estas subfamilias se caracterizan por la presencia de dominios conservados adicionales que facilitan la unión a ADN y/o las interacciones proteína-proteína.

Uno de estos dominios es el dedo PHD, llamado dedo de homeodominio de planta (PHDf, por sus siglas en inglés plant homeodomain finger) debido a su asociación en un mismo polipéptido con un HD de unión a ADN, que se identificó originalmente mediante identidad de secuencia de aminoácidos entre un factor de transcripción homeosecuencia de maíz, ZmHOX1a, (Bellman y Werr (1992) EMBO J 11:3367-3374) y su pariente de Arabidopsis ATHAT3.1 (Schindler y col. (1993) Plant J 4: 137-150). EL PHDf es un motivo similar a dedo de zinc Cys4-His-Cys3, capaz de quelar dos iones zinc. Los PHDfs se encuentran en proteínas nucleares y se cree que están implicados en la regulación transcripcional mediada por cromatina (Halbach y col. (2000) Nucleic Acid Res 28(18): 3542-3550).

Por lo tanto, los factores transcripcionales que combinan un PHDf y un HD son llamados PHDf-HD (Halbach y col. (2000), citado anteriormente). En plantas tales PHDf-HD se caracterizan, adicionalmente, por la presencia de una cremallera de leucina (ZIP, abreviatura del inglés zipper: cremallera) cadena arriba del PHDf. Ambos dominios (el ZIP y el PHDf) juntos forman una región de 180 aminoácidos altamente conservada llamada el dominio ZIP/PHDf (Halbach y col. (2000), citado anteriormente).

Plantas de tabaco transgénicas sobreexpresando fuertemente cualquiera de los dos polipéptidos PHDf-HD (ZmHOX1a o ZmHOX1b) de maíz, utilizando un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, combinado con un potenciador omega, mostraron cambios morfológicos idénticos: reducción del tamaño, formación de raíces adventicias, y transformaciones florales homeóticas (Uberlacker y col. (1996) Plant Cell 8: 349-362). Plantas de arroz y de tabaco transgénicas sobreexpresando fuertemente el polipéptido PHDF-HD HAZ1 de Oryza sativa, utilizando el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, no mostraron crecimiento anormal o cambio fenotípico en comparación con los tipos silvestres (Ito y col. (2004) Gene 331: 9-15).

En la patente de Estados Unidos 7.196.245, un polipéptido PHDf-HD de Arabidopsis thaliana (identificado como G416) se transformó en Arabidopsis, y mostró que promovía la floración temprana en las plantas transgénicas, en comparación con las plantas de control, sin impacto en el rendimiento de semilla.

Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que la expresión aumentada de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD proporciona plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento de semilla potenciados, con respecto a las plantas de control.

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temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración salina y mayor temperatura de lavado, mayor rigurosidad de lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente a, o por debajo de, la rigurosidad de hibridación. Una hibridación positiva da lugar a una señal que es al menos dos veces la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos o los procedimientos de detección de amplificación de genes son como se expusieron anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones más o menos rigurosas. El experto en la técnica es consciente de que, durante el lavado, pueden alterarse diversos parámetros y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación típicas de alta rigurosidad para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos incluyen una hibridación a 65 ºC en 1x SSC o a 42 ºC en 1x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 65 ºC en 0,3x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN más largos de 50 nucleótidos incluyen una hibridación a 50 ºC en 4x SSC o a 40 ºC en 6x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 50 ºC en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para la hibridación del ácido nucleico. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento. 1x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM, la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhardt 5x, SDS al 0,5-1,0 %, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado 100 g/ml, pirofosfato sódico al 0,5 %.

Con el fin de definir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook y col. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 y actualizaciones anuales).

Variante de corte y empalme

La expresión “variante de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye variantes de una secuencia de ácidos nucleicos en la que los intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado, desplazado o añadido, o en la que los intrones se han acortado o alargado. Dichas variantes serán aquellas en las que la actividad biológica de la proteína esté sustancialmente conservada; esto puede conseguirse conservando selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser sintetizadas por el hombre. En la técnica se conocen bien procedimientos para predecir y aislar dichas variantes de corte y empalme (véase, por ejemplo, Foissac y Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica

Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, localizado en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas incluyen Polimorfismos Mononucleotídicos (SNP, por las siglas Single Nucleotide Polymorphisms), así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Deleción (INDELs, por las siglas Small Insertion/Deletion Polymorphisms). El tamaño de los INDELs es normalmente menor de 100 pb. Los SNP y los INDELs forman la serie de variantes de secuencia más grande en las cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos.

Combinación de genes/Evolución dirigida

La combinación de genes o evolución dirigida consiste en repeticiones de combinación de ADN seguido de exploración y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos o partes de las mismas que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle y col., (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes de Estados Unidos 5.811.238 y 6.395.547).

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor

Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se usan todas indistintamente en el presente documento y se toman en un contexto amplio para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos reguladora capaz de efectuar la expresión de las secuencias a las que se unen. El término “promotor” se refiere típicamente a una secuencia de control de ácido nucleico localizada cadena arriba del inicio transcripcional de un gen y que está implicado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo así la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. En los términos anteriormente mencionados se incluyen las secuencias reguladoras transcripcionales procedentes de un gen genómico eucariota clásico (incluyendo la caja TATA que es necesaria para el inicio de la transcripción adecuado, con o sin secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras cadena arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o de una manera específica de tejido. También se incluye en el término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladores transcripcionales de caja -10. La expresión “elemento regulador” también incluye una molécula de fusión sintética o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

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Un “promotor de planta” comprende elementos reguladores, que median la expresión de un segmento de secuencia codificante en células de plantas. Por consiguiente, un promotor de planta no tiene que ser de origen vegetal, sino que puede originarse de virus o microorganismos, por ejemplo de virus que atacan a las células de planta. El “promotor de planta” también puede originarse de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácidos nucleicos a expresar en el procedimiento de la invención y descrito en el presente documento. Esto también se aplica a las otras señales reguladoras de “planta”, tales como terminadores de “planta”. Los promotores cadena arriba de la secuencias de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótido sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, la fase de lectura abierta (ORF, Open Reading Frame) o la región reguladora 3’ tal como terminadores u otras regiones reguladoras 3’ que se localizan fuera de la ORF. Además es posible que la actividad de los promotores aumente por la modificación de su secuencia o que se reemplacen completamente mediante más promotores activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a, o comprender, un promotor adecuado que exprese el gen de manera adecuada, en tiempo y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen indicador y evaluando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o la beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden después compararse con la de un promotor de referencia (tal como el que se usa en los procedimientos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando niveles de ARNm o comparando niveles de ARNm del ácido nucleico usado en los procedimientos de la presente invención, con niveles de ARNm de genes constitutivos tal como ARNr 18S, usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como transferencia de Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid y col., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente por “promotor débil” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se entiende niveles de aproximadamente 1/10.000 transcriptos a aproximadamente 1/100.000 transcriptos, a aproximadamente 1/5000000 transcriptos por célula. Por el contrario, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia codificante a alto nivel, o a aproximadamente 1/10 transcriptos a aproximadamente 1/100 transcriptos a aproximadamente 1/1000 transcriptos por célula. Generalmente, por “promotor de fuerza media” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que el de un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, inferior al obtenido cuando está bajo el control de un promotor CaMV 35S.

Unido operativamente

La expresión “unido operativamente” como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora puede iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo

Un “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, aunque no necesariamente en todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayor parte de las condiciones ambientales, en al menos una célula, tejido u órgano. La siguiente Tabla 2a proporciona ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del gen

Referencia

Actina

McElroy y col, Plant Cell, 2: 163-171, 1990

HMGP

WO 2004/070039

CAMV 35S

Odell y col, Nature, 313: 810-812, 1985

CaMV 19S

Nilsson y col., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997

GOS2

de Pater y col, Plant J Nov; 2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596

Ubiquitina

Christensen y col, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992

Ciclofilina de arroz

Buchholz y col, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994

Histona H3 de maíz

Lepetit y col, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992

Histona H3 de alfalfa

Wu y col. Plant Mol. Biol. 11:641-649, 1988

Actina 2

An y col, Plant J. 10(1); 107-121, 1996

34S FMV

Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443

(continuación)

Fuente del gen

Referencia

Subunidad pequeña Rubisco

US 4.962.028

OCS

Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1

Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2

Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

nos

Shaw y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846

V-ATPasa

WO 01/14572

Súper promotor

WO 95/14098

Proteínas de la caja G

WO 94/12015

Promotor ubicuo

Un promotor ubicuo es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado evolutivamente

5 Un promotor regulado evolutivamente es activo durante determinadas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios evolutivos.

Promotor inducible

Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108), ambiental o físico, o

10 puede ser “inducible por estrés”, es decir, activado cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o un “patógeno inducible,” es decir, activado cuando una planta está expuesta a la exposición a diversos patógenos.

Promotor especifico de órgano/específico de tejido

Un promotor específico de órgano o específico de tejido es uno que es capaz de iniciar preferentemente la transcripción en determinados órganos o tejidos, tales como hojas, raíces tejido de semillas, etc. Por ejemplo, un

15 “promotor específico de raíz” es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces las de plantas, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. En el presente documento a los promotores capaces de iniciar la transcripción solo en determinadas células se les denomina promotores “específicos de célula”.

A continuación en la Tabla 2b se indican ejemplos de promotores específicos de raíz:

20 Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de raíz

Fuente del gen

Referencia

RCc3

Plant Mol Biol. 1995 Jan;27(2):237-48

Arabidopsis PHT1

Kovama y col., 2005; Mudge y col. (2002, Plant J. 31: 341)

Transportador de fosfato en Medicago

Xiao y col., 2006

Arabidopsis Pyk10

Nitz y col. (2001) Plant Sci 161(2): 337-346

genes expresables en raíz

Tingey y col., EMBO J. 6: 1, 1987.

gen inducible por auxina en tabaco

Van der Zaal y col., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.

-tubulina

Oppenheimer, y col., Gene 63: 87, 1988.

genes específicos de la raíz del tabaco

Conkling, y col. Plant Physiol. 93: 1203, 1990.

gen G1-3b de B. napus

Patente de Estados Unidos No. 5.401.836

SbPRP1

Suzuki y col., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993.

LRX1

Baumberger y col. 2001, Genes & Dev. 15:1128

BTG-26 de Brassica napus

US 20050044585

(continuación)

Fuente del gen

Referencia

LeAMT1 (tomate)

Lauter y col. (1996, PNAS 3:8139)

The LeNRT1-1 (tomate)

Lauter y col. (1996, PNAS 3:8139)

gen de la patatina de clase I (patata)

Liu y col., Plant Mol. Biol. 153:386-395, 1991.

KDC1 (Daucus carota)

Downey y col. (2000, J. Biol. Chem. 275:39420)

gen de TobRB7

W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA

OsRAB5a (raíz)

Wang y col. 2002, Plant Sci. 163:273

ALF5 (Arabidopsis)

Diener y col. (2001, Plant Cell 13:1625)

NRT2;1Np (N. plumbaginifolia)

Quesada y col. (1997, Plant Mol. Biol. 34:265)

Un promotor específico de semilla es transcripcionalmente activo de forma predominante en tejidos de semilla, pero no necesariamente exclusivamente en tejidos de semilla (en casos de expresión parcial). El promotor específico de semilla puede estar activo durante el desarrollo y/o durante la germinación de la semilla. El promotor específico de semilla puede ser específico de endospermo/aleurona/embrión. En las Tablas 2d, 2e, 2f, se muestran ejemplos de promotores específicos de semilla (específicos de endospermo/aleurona/embrión). Ejemplos adicionales de promotores específicos de semilla se proporcionan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), cuya divulgación se incorpora como referencia como si se indicara completamente.

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de semilla

Fuente del gen

Referencia

genes específicos de semilla

Simon y col., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;

Scofield y col., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;

Baszczynski y col., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

albúmina de Nuez del Brasil

Pearson y col., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

legumina

Ellis y col., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

glutelina (arroz)

Takaiwa y col., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986;

Takaiwa y col., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.

zeína

Matzke y col Plant Mol Biol, 14(3):323-32 1990

napA

Stalberg y col, Planta 199: 515-519, 1996.

gluteína-1 de BPM y APM de trigo

Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989

SPA de trigo

Albani y col, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

,  y  gliadinas de trigo

EMBO J. 3:1409-15, 1984

promotor Itr1 de cebada

Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8

hordeína B1, C, D de cebada

Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996

DOF de cebada

Mena y col, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998

blz2

EP99106056.7

promotor sintético

Vicente-Carbajosa y col., Plant J. 13: 629-640, 1998.

prolamina NRP33 de arroz

Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

-globulina Glb-1 de arroz

Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

(continuación)

Fuente del gen

Referencia

OSH1 de arroz

Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

 globulina REB/OHP-1 de arroz

Nakase y col. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz

Trans Res 6:157-68, 1997

familia del gen ESR de maíz

Plant J 12:235-46, 1997

-kafirina de sorgo

DeRose y col., Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996

KNOX

Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999

oleosina de arroz

Wu y col, J. Biochem. 123:386, 1998

oleosina de girasol

Cummins y col., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992

PRO0117, supuesta proteína ribosomal 40S de arroz

WO 2004/070039

PRO0136, alanina aminotransferasa de arroz

No publicado

PRO0147, inhibidor de tripsina ITR1 (cebada)

No publicado

PRO0151, WSI18 de arroz

WO 2004/070039

PRO0175, RAB21 de arroz

WO 2004/070039

PRO005

WO 2004/070039

PRO009

WO 2004/070039

-amilasa (Amy32b)

Lanahan y col, Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991

gen similar a la  catepsina

Cejudo y col, Plant Mol Biol 20: 849-856, 1992

Ltp2 de cebada

Kalla y col., Plant J. 6: 849-60, 1994

Chi26

Leah y col., Plant J. 4: 579-89, 1994

B-Perú de maíz

Selinger y col., Genetics 149; 1125-38, 1998

Tabla 2d: ejemplos de promotores específicos de endospermo

Fuente del gen

Referencia

glutelina (arroz)

Takaiwa y col. (1986) Mol Gen Genet 208:15-22; Takaiwa y col. (1987) FEBS Letts. 221:43-47

zeína

Matzke y col., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323-32

gluteína-1 de BPM y APM de trigo

Colot y col. (1989) Mol Gen Genet 216:81-90, Anderson y col. (1989) NAR 17:461-2

SPA de trigo

Albani y col. (1997) Plant Cell 9:171-184

gliadinas de trigo

Rafalski y col. (1984) EMBO 3:1409-15

promotor Itr1 de cebada

Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8

hordeína B1, C, D de cebada

Cho y col. (1999) Theor Appl Genet 98:1253-62; Muller y col. (1993) Plant J 4:343-55; Sorenson y col. (1996) Mol Gen Genet 250:750-60

DOF de cebada

Mena y col, (1998) Plant J 116(1): 53-62

blz2

Onate y col. (1999) J Biol Chem 274(14):9175-82

promotor sintético

Vicente-Carbajosa y col. (1998) Plant J 13:629-640

(continuación)

Fuente del gen

Referencia

prolamina NRP33 de arroz

Wu y col, (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889

globulina Glb-1 de arroz

Wu y col. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889

globulina REB/OHP-1 de arroz

Nakase y col. (1997) Plant Molec Biol 33: 513-522

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz

Russell y col. (1997) Trans Res 6:157-68

familia del gen ESR de maíz

Opsahl-Ferstad y col. (1997) Plant J 12: 235-46

kafirina de sorgo

DeRose y col. (1996) Plant Mol Biol 32: 1029-35

Tabla 2e: Ejemplos de promotores específicos de embrión:

Fuente del gen

Referencia

OSH1 de arroz

Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

KNOX

Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999

PRO0151

WO 2004/070039

PRO0175

WO 2004/070039

PRO005

WO 2004/070039

PRO0095

WO 2004/070039

Tabla 2f: Ejemplos de promotores específicos de aleurona:

Fuente del gen

Referencia

-amilasa (Amy32b)

Lanahan y col, Plant Cell 4:203-211, 1992

Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991

gen similar a  catepsina

Cejudo y col, Plant Mol Biol 20:849-856, 1992

Ltp2 de cebada

Kalla y col., Plant J. 6:849-60, 1994

Chi26

Leah y col., Plant J. 4:579-89, 1994

B-Perú de maíz

Selinger y col., Genetics 149;1125-38,1998

Un promotor específico de tejido verde como se define en el presente documento es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido verde, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta.

Los ejemplos de promotores específicos de tejido verde que pueden usarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran a continuación en la Tabla 2g.

Tabla 2g: Ejemplos de promotores específicos de tejido verde

Gen

Expresión Referencia

Ortofosfato diquinasa de maíz

Específica de hoja Fukavama y col., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz

Específica de hoja Kausch y col., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa de arroz

Específica de hoja Liu y col., 2003

Pequeña subunidad de Rubisco de arroz

Específica de hoja Nomura y col., 2000

Beta expansina EXBP9 de arroz

Específica de brote WO 2004/070039

Pequeña subunidad de Rubisco de frijol de palo

Específica de hoja Panguluri y col., 2005

RBCS3A de guisante

Específica de hoja

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col. (1987) Genes Dev 1: 1183-1200). Dicha potenciación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se pone cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz, el intrón Adh1-S, 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Para una información general véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N. Y. (1994).

Gen endógeno

En el presente documento la referencia a un gen “endógeno”, no solo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin existir ninguna intervención humana), sino también se refiere a aquel mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente (re)introducida en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede encontrar una reducción sustancial de la expresión transgénica y/o reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado puede aislarse de un organismo o puede fabricarlo el hombre, por ejemplo, mediante síntesis química.

Expresión disminuida

En el presente documento la referencia a “expresión disminuida” o “reducción o eliminación sustancial” de expresión significa una disminución en la expresión del gen endógeno y/o los niveles de polipéptido y/o actividad de polipéptido con respecto a las plantas de control. La reducción o eliminación sustancial está en orden creciente de preferencia al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más reducido en comparación con el de las plantas de control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos. Para realizar el silenciamiento génico, éste puede ser tan pequeño como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, como alternativa éste puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR 5’ y/o 3’, ya sea en parte o en su totalidad). El tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos puede proceder del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gene diana), o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo y homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, el tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen diana (cadena en sentido o antisentido), más preferentemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % con el gen diana (cadena en sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito para los diversos procedimientos analizados en el presente documento para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión puede realizarse usando herramientas y técnicas rutinarias. Un procedimiento preferente para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno es introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo y homólogo de cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separado por un espaciador (ADN no codificante).

En dicho procedimiento preferente, la expresión del gen endógeno se reduce o elimina sustancialmente a través de silenciamiento mediado por ARN usando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferentemente capaz de formar una estructura en horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácidos nucleicos de ADN no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de unión de matriz (MAR, Matrix Attachment Region Fragment), un intrón, un poliengarce, etc.) se localiza entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial

o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN en horquilla (ARNh) El ARNh se procesa en la planta en los ARNip que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC escinde adicionalmente los transcriptos de ARNm, por lo cual se reduce sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en los polipéptidos. Para detalles adicionales generales véase, por ejemplo, Grierson y col. (1998) WO 98/53083; Waterhouse y col. (1999) WO 99/53050).

La realización de los procedimientos de la invención no se basa en introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que se clona el ácido nucleico como una repetición invertida, sino que pueden utilizarse cualquiera de uno o más de los diversos procedimientos de “silenciamiento génico” bien conocidos para conseguir los mismos efectos.

Un procedimiento de este tipo para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión génica (regulación negativa). En este caso, el silenciamiento se activa en una planta mediante una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este ARNbc se

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procesa adicionalmente por la planta de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos denominado ARN de interferencia pequeño (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcripto de ARNm del gen endógeno diana, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que se traducen en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación en sentido en una planta. “Orientación en sentido” se refiere a una secuencia de ADN que es homóloga a un transcripto de ARNm de la misma. Por lo tanto, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reducirá la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como cosupresión. La reducción de la expresión del gen sería más pronunciada si en una planta se introdujesen varias copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos, cuando hay una correlación positiva entre altos niveles de transcripto y la activación de cosupresión.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica el uso de secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de “ácidos nucleicos “antisentido” comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos “en sentido” que codifica una proteína, es decir complementaria a la cadena que codifica una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de transcripto de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es preferentemente complementaria a gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede localizarse en la “región codificante” y/o en la “región no codificante” de un gen. La expresión “región codificante” se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de aminoácidos. La expresión “región no codificante” se refiere a las secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones no traducidas 5’ y 3’).

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos completa (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que sea antisentido para solo una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluyendo la UTR 5’ y 3’ del ARNm). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de un transcripto de ARNm que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada se conoce en la técnica y puede comenzar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos antisentido, de acuerdo con la invención, puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o varios nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. En la técnica se conocen bien ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Las modificaciones de nucleótido conocidas incluyen metilación, ciclación y ‘protecciones’ y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. En la técnica se conocen bien otras modificaciones de nucleótidos.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). Preferentemente, la producción de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido en plantas se produce mediante una construcción de ácido nucleico establemente integrada que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico usadas para el silenciamiento en los procedimientos de la invención (tanto si se introducen en una planta como si se generan in situ) se hibridan con, o se unen a, los transcriptos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la hélice doble. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden introducirse en una planta por transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse para dirigir las células seleccionadas y después administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de tal manera que se unan específicamente a receptores o a antígenos expresados en una superficie de la célula seleccionada, por ejemplo, ligando la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también pueden administrarse a las células

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usando los vectores descritos en el presente documento.

De acuerdo con un aspecto adicional, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es una secuencia de ácidos nucleicos α-anomérica. Una secuencia de ácidos nucleicos α-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN de complementariedad en el que, contrario a las unidades β normales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y col. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625-6641). La secuencia de ácidos nucleicos antisentido también pueden comprender un 2’-o-metilrribonucleótido (Inoue y col. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y col. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

La reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno también puede realizarse usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que pueden escindir una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria, tal como ARNm, con el que tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585591) pueden usarse para escindir catalíticamente los transcriptos de ARNm que codifican un polipéptido, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Puede diseñarse una ribozima que tenga especificidad por una secuencia de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo: Cech y col. Patentes de Estados Unidos Nº 4.987.071; y Cech y col. Patente de Estados Unidos Nº 5.116.742). Como alternativa, pueden usarse transcriptos de ARNm correspondientes a una secuencia de ácidos nucleicos para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad de ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es conocido en la técnica (por ejemplo Atkins y col. (1994) documento WO 94/00012; Lenne y col. (1995) documento WO 95/03404; Lutziger y col. (2000) documento WO 00/00619; Prinsen y col. (1997) documento WO 97/13865 y Scott y col. (1997) documento WO 97/38116).

El silenciamiento génico también puede producirse por mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN T o inserción de transposón) o mediante estrategias como las descritas, entre otros, por Angell y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS documento WO 98/36083), o Baulcombe (documento WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucleico posteriormente introducido en una planta. La reducción de eliminación sustancial puede estar provocada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido puede unirse a diversas proteínas que interaccionan; por lo tanto pueden proporcionarse una o más mutaciones y/o truncamientos para un polipéptido que sea aún capaz de unir las proteínas que interaccionan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden mostrar su función normal (tal como ligando de señalización).

Una estrategia adicional para silenciamiento génico es dirigir la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen en células diana. Véase Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene y col., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L. J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que está implicado un polipéptido, serán muy conocidos por el experto. En particular, puede esperarse que las moléculas fabricadas por el hombre puedan ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicado el polipéptido diana.

Como alternativa, puede establecerse un programa de exploración para identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también pueden usarse, por ejemplo, para realizar recombinación homóloga.

Pueden usarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales para desactivar la expresión génica y/o traducción del ARNm. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente con una longitud de 19-24 nucleótidos. Actúan principalmente regulando la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayoría de los microARN (miARN) de planta tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco emparejamientos erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras de plegamiento características mediante RNasas específicas bicatenarias de la familia Dicer. Después del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex) uniéndose a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad del RISC, debido al emparejamiento con bases de ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los acontecimientos reguladores posteriores incluyen la escisión de ARNm diana y la destrucción y/o inhibición traduccional. Por tanto, los efectos de la sobreexpresión de miARN a menudo se reflejan en niveles de ARNm disminuidos de los genes diana.

Los microARN artificiales (amiARN), que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN de planta. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento diana y pueden usarse para ayudar a diseñar los

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(Klaus y col., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

El etiquetado en activación de ADN T

El etiquetado en activación de ADN T (Hayashi y col. Science (1992) 1350-1353), implica la inserción de ADN T, que normalmente contiene un promotor (también puede ser un potenciador de traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb cadena arriba o cadena abajo de la región codificante de un gen en una configuración de tal manera que el promotor dirige la expresión del gen diana. Típicamente, la regulación de la expresión del gen diana mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor nuevamente introducido. El promotor se incorpora típicamente en un ADN T. Este ADN T se inserta al azar el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección por Agrobacterium y conduce a expresión modificada de genes cerca al ADN T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debidos a la expresión modificada de los genes cerca al promotor introducido.

TILLING

El término “TILLING” es la abreviatura de “Targeted Induced Local Lesions In Genomes” (Inducción Dirigida de Lesiones Locales en el Genoma) y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. El TILLING también permite la selección de plantas que llevan dichas variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden presentar expresión modificada, en fuerza o en localización o en tiempo (si las mutaciones afectan, por ejemplo, al promotor). Estas variantes mutantes pueden presentar mayor actividad que la mostrada por el gen en su forma natural. El TILLING combina mutagénesis de alta densidad con procedimientos de detección de alto rendimiento. Las etapas seguidas típicamente en el TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP y Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, páginas 16-82; Feldmann y col., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 137-172; Lightner J y Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 91-104); (b) preparación y agrupamiento de ADN en individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heteroduplex; (e) DHPLC, en la que la presencia de un heteroduplex en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del mutante individual; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los procedimientos de TILLING son bien conocidos en la técnica (McCallum y col., (2000) Nat Biotechnol

18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homóloga

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición definida seleccionada. La recombinación homóloga es una tecnología convencional utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levaduras o el musgo Physcomitrella. Se han descrito procedimientos para realizar recombinación homóloga en plantas no solo para el modelo de plantas (Offringa y col. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada y col. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8), y existen estrategias que son generalmente aplicables independientemente del organismo diana (Miller y col, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rendimiento

El término “rendimiento” en general significa un producto medible de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, un área y un periodo de tiempo específicos. Las partes de planta individuales contribuyen directamente al rendimiento a base de su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado de un cultivo y año, que se determina dividiendo la producción total (incluyendo la producción tanto cosechada como valorada) por metro cuadrado plantado. El término “rendimiento” de una planta puede estar relacionado con biomasa vegetativa (biomasa de raíz y/o brote), con órganos reproductores y/o con propágulos (tal como semillas) de esta planta.

Vigor temprano

“Vigor temprano” se refiere a un crecimiento bien equilibrado saludable activo especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede ser el resultado del aumento de la eficacia biológica de la planta debido a, por ejemplo, plantas que están mejor adaptadas a su ambiente (es decir, optimizando el uso de fuentes de energía y repartiendo entre brotes y raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran supervivencia aumentada de plántula y un mejor establecimiento del cultivo, que a menudo produce campos muy uniformes (creciendo el cultivo de una manera uniforme, es decir, alcanzando la mayoría de las plantas las diversas etapas de desarrollo a sustancialmente el mismo tiempo) y a menudo mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor temprano puede determinarse midiendo diversos factores, tales como, peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de plántula, altura de plántula, longitud de raíz, biomasa de brote y raíz y muchos más.

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spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otras.

Descripción detallada de la invención

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que la expresión aumentada en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD proporciona plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento de semilla potenciados, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con una primera realización, la presente invención proporciona un procedimiento para potenciar en plantas rasgos relacionados con el rendimiento de semilla, con respecto a las plantas de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD, en el que el polipéptido PHDf-HD comprende:

(i)

un dominio que tiene al menos el 25 %, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio cremallera de leucina/dedo de homeodominio de planta (ZIP/PHDf), como se representa en SEC ID Nº: 233; y

(ii)

un dominio que tiene al menos el 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con un homeodominio (HD) como se representa en SEC ID Nº: 234; y

(iii) en el que dicho polipéptido PHDf-HD, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético de HD, tal como el ilustrado en la Figura 13, se agrupa con el grupo de polipéptidos PHDf-HD que comprenden la secuencia de polipéptido como se representa en SEC ID Nº: 180, en lugar de con cualquier otro grupo de HD; y/o en el que dicho polipéptido PHDf-HD tiene en orden creciente de preferencia al menos el 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más, de identidad de secuencia con el polipéptido PHDf-HD como se representa en SEC ID Nº: 180, o con cualquiera de las secuencias de polipéptido proporcionadas en la Tabla D1 en el presente documento y, de forma opcional, seleccionar plantas que tengan potenciados rasgos relacionados con el rendimiento.

Un procedimiento preferente para aumentar la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD es mediante la introducción y expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD.

En lo sucesivo, cualquier referencia en el presente documento a “proteína útil en los procedimientos de la invención” se considera que significa un polipéptido PHDf-HD, como se define en el presente documento. En lo sucesivo, cualquier referencia en el presente documento a una “secuencia de ácido nucleico útil en los procedimientos de la invención” se considera que significa una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar tal polipéptido PHDf-HD. La secuencia de ácido nucleico que se introducirá en una planta (y por lo tanto útil en la realización de los procedimientos de la invención) es cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique el tipo de polipéptido, que será descrita ahora, en lo sucesivo también llamada “secuencia de ácido nucleico de PHDf-HD” o “gen de PHDf-HD”.

Un "polipéptido PHDf-HD" como se define en el presente documento se refiere a cualquier polipéptido que comprende: (i) un dominio que tiene al menos el 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio cremallera de leucina/dedo de homeodominio de planta (ZIP/PHDf) como se representa en SEC ID Nº: 233; y (ii) un dominio que tiene al menos el 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con un homeodominio (HD) como se representa en SEC ID Nº: 234.

De forma alternativa o adicional, un “polipéptido PHDf-HD” como se define en el presente documento, se refiere a cualquier polipéptido que comprende: (i) un dominio PHD como se representa en PFAM00628; y (ii) un HD como se representa en PFAM00046.

De forma adicional, el "polipéptido PHDf-HD” como se define en el presente documento, se refiere a cualquier secuencia de polipéptido, la que cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético de HD, tal como el ilustrado en la Figura 1, se agrupa con el grupo de polipéptidos PHDf-HD que comprenden la secuencia de

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(i)

un ácido nucleico representado en SEC ID Nº: 242;

(ii)

un ácido nucleico o fragmento del mismo que es complementario a SEC ID Nº: 242;

(iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEC ID Nº: 243;

(iv) un ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones rigurosas con uno cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados anteriormente en (i), (ii) o (iii).

Preferentemente, la secuencia de polipéptido que codifica la secuencia de ácido nucleico variante, obtenida mediante combinación de genes, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético de HD, tal como el ilustrado en la Figura 1, se agrupa con el grupo de polipéptidos PHDf-HD que comprenden la secuencia de polipéptidos representada en SEC ID Nº: 180, en lugar de con cualquier otro grupo HD.

Además, las variantes de secuencias de ácido nucleico se pueden también obtener mediante mutagénesis dirigida. Hay disponibles varios procedimientos para conseguir la mutagénesis dirigida, siendo los más comunes los procedimientos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos PHDf-HD se pueden obtener a partir de cualquier fuente natural o artificial. La secuencia de ácido nucleico se puede modificar a partir de su forma natural en composición y/o entorno genómico a través de manipulación deliberada por el ser humano. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PHDf-HD es de una planta, además, preferentemente de una planta monocotiledónea, más preferentemente de la familia Poaceae, muy preferentemente la secuencia de ácido nucleico es de Oryza sativa.

La realización de los procedimientos de la invención proporciona plantas que tienen el rendimiento de semilla aumentado con respecto a las plantas de control. Las expresiones “rendimiento” y “rendimiento de semilla” se describen con más detalle en la sección “definiciones” en el presente documento.

En el presente documento la referencia a rasgos potenciados relacionados con el rendimiento se considera que significa un aumento en la biomasa (peso) de una o más partes de una planta, las que pueden incluir partes aéreas (cosechables) y/o partes por debajo del suelo (cosechables). En particular, tales partes cosechables son semillas, y la realización de los procedimientos de la invención da como resultado plantas que tienen rendimiento de semilla aumentado con respecto al rendimiento de semilla de las plantas de control.

Tomando al maíz como ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como uno o más de los siguientes: el aumento del número de plantas establecidas por hectárea o acre, un aumento en el número de mazorcas por planta, un aumento en el número de hileras, el número de granos por hilera, el peso del grano, el peso de mil granos, el longitud/diámetro de la mazorca, el aumento de la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como ejemplo, un incremento en el rendimiento puede manifestarse en sí mismo como un aumento en uno o más de los siguientes: el número de plantas por hectárea o acre, el número de panículas por planta, el número de espigas por panícula, el número de flores (floretes) por panícula (que se expresa como una proporción del número de semillas llenas sobre el número de panículas primarias), el aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), el aumento en el peso de mil granos, entre otros.

La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de semilla en comparación con las plantas de control, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD como se define en el presente documento.

Dado que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen rasgos relacionados con el rendimiento de semilla potenciados, es probable que estas plantas presenten una tasa de crecimiento aumentada (durante al menos parte de su ciclo de vida) con respecto a la tasa de crecimiento de plantas de control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida.

La tasa de crecimiento aumentada puede ser específica a una o más partes de una planta (incluyendo semillas), o puede ser sustancialmente en toda la planta. Las plantas que tienen una tasa de crecimiento aumentada pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede significar el tiempo necesario para crecer a partir de una semilla madura seca hasta la etapa en la que la planta ha producido semillas maduras secas, similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como el vigor temprano, tasa de crecimiento, índice de verdor, tiempo de floración y velocidad de la maduración de la semilla. El aumento en la tasa de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o, sustancialmente, durante el ciclo de vida completo de una planta. Una tasa de crecimiento aumentada durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar vigor (temprano) potenciado. El aumento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de la cosecha de una planta lo que permite que las plantas se siembren más tarde y/o se cosechen más pronto de lo que de otra manera sería posible (puede obtenerse un efecto similar con un tiempo de floración más temprano). Si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de

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acompaña a alta o baja temperatura, salinidad o estrés por sequía, puede provocar la desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. En consecuencia, estos diversos estreses ambientales a menudo activan rutas de señalización celulares y respuestas celulares semejantes, tales como la producción de proteínas de estrés, la regulación positiva de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la detención del crecimiento. Dado que estreses ambientales diversos activan rutas similares, la ejemplificación de la presente invención con estrés por sequía, no debería verse limitada al estrés por sequía, sino más como una detección para indicar la implicación de los polipéptidos PHDf-HD como se define anteriormente, en la potenciación de rasgos relacionados con el rendimiento de semilla, con respecto a las plantas de control crecidas en condiciones de estrés comparables, en estreses abióticos en general.

La expresión “estrés abiótico”, como se define en el presente documento, se entiende que se refiere a uno cualquiera o más de: estrés hídrico (debido a sequía o a exceso de agua), estrés anaeróbico, estrés salino, estrés térmico (debido a temperaturas altas, frías o de congelación), estrés por toxicidad química y estrés oxidativo. De acuerdo con un aspecto de la invención, el estrés abiótico es un estrés osmótico, seleccionado entre estrés hídrico, estrés salino, estrés oxidativo y estrés iónico. Preferentemente, el estrés hídrico es estrés por sequía. La expresión estrés salino no se restringe a sal común (NaCl), sino que puede ser cualquier estrés provocado por uno o más de: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2, entre otros.

La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento de semilla potenciados, en condiciones de estrés abiótico con respecto a plantas de control que crecen en condiciones de estrés comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para potenciar rasgos relacionados con el rendimiento de semillas, en plantas que crecen en condiciones de estrés abiótico, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD. De acuerdo con un aspecto de la invención, el estrés abiótico es un estrés osmótico, seleccionado entre uno a más de los siguientes: estrés hídrico, estrés salino, estrés oxidativo y estrés iónico.

Otro ejemplo de estrés ambiental abiótico, es la disponibilidad reducida de uno o más de los nutrientes que las plantas necesitan asimilar para el crecimiento y desarrollo. Se vierte una enorme cantidad de fertilizantes en los campos para optimizar el crecimiento de la planta y la calidad, debido a la fuerte influencia de la eficacia en la utilización de la nutrición en el rendimiento de la planta y la calidad del producto. La productividad de las plantas normalmente se limita por tres nutrientes principales, fósforo, potasio y nitrógeno, el que, entre estos tres, usualmente es el elemento limitante de la tasa en el crecimiento de la planta. Por lo tanto, el principal elemento nutricional necesario para el crecimiento de la planta es el nitrógeno (N). Es el constituyente de numerosos compuestos importantes encontrados en las células vivas, incluyendo aminoácidos, proteínas, (enzimas), ácidos nucleicos, y clorofila. Del 1,5 % al 2 % de la materia seca vegetal es nitrógeno, y es aproximadamente el 16 % de la proteína total de la planta. Por lo tanto, la disponibilidad de nitrógeno es un factor limitante principal del crecimiento y la producción de plantas de cultivo (Frink y col. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4): 1175-1180), y tiene también un impacto principal en la acumulación de proteína y en la composición de aminoácidos. Por lo tanto, son de gran interés las plantas de cultivo con rasgos relacionados con el rendimiento potenciados, preferentemente rasgos relacionados con el rendimiento de semilla potenciados, cuando crecen en condiciones limitantes de nitrógeno.

La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas que crecen en condiciones de déficit de nutrientes, particularmente en condiciones de déficit de nitrógeno, con rasgos relacionados con el rendimiento de semilla potenciados, con respecto a plantas de control que se cultivan en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para potenciar rasgos relacionados con el rendimiento de semilla en plantas que se cultivan en condiciones de déficit de nutrientes, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD. El déficit de nutrientes puede producirse por una carencia o exceso de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, cadmio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

La presente invención engloba a plantas o partes de las mismas (incluyendo semillas), o células de las mismas, obtenibles por los procedimientos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o partes de las mismas o células de las mismas, comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD, como se define anteriormente.

La invención también proporciona construcciones génicas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión aumentada en plantas de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos PHDf-HD. Las construcciones génicas pueden insertarse en vectores, que pueden estar disponibles en el comercio, adecuados para la transformación en plantas y para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también proporciona el uso de una construcción génica como se define en el presente documento en los procedimientos de la invención.

Más específicamente, la presente invención proporciona una construcción que comprende:

(a) un secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido PHDf-HD como se ha definido anteriormente;

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Nombre

Organismofuente SEC ID Nº: del ácido nucleico SEC ID Nº: del polipéptido N.º de acceso de la base de datos Estado

Orysa_PHDf HD

Oryza sativa 179 180 Os02g05450.1 NM_001052422 LC

Arath_PHDf_HD_PRHA

Arabidopsis thaliana 181 182 At4g029940 NM_119140 LC

Eucgr_PHDf_HD

Eucalyptus grandis 183 184 ADW17964 LC

Medtr_PHDf_HD

Medicago Truncatula 185 186 AC 123547 FL

Pinra_PHDf_HD

Pinus radiata 187 188 ADW18458 FL

Poptr_PHDf_HD

Populus tremuloides 189 190 scaff_VI.625 FL

Sacof_PHDf_HD

Saccharum officinarum 191 192 CA157855.1, CA261734.1, CA253314.1, CA220753.1, CA201958.1 FL

Vitvi_PHDf_HD

Vitis vinifera 193 194 AM477372.2, AM488059.1 FL

Zeama_PHDf_HD

Zea mays 195 196 EE162310, DN204182, CF057937 FL

Arath_PHDf_HD_HAT3.1

Arabidopsis thaliana 197 198 AT3G19510 NM_112838 LC

Lotja_PHDf_HD

Lotusjaponicus 199 200 AP006117.1 LC

Orysa_PHDf HD_HAZ1

Oryza sativa 201 202 AB081340 Os06g12400.1 LC

Petcr_PHDf_HD_PRHP

Petroselinum crispum 203 204 L21975 LC

Zeama_PHDf_HD_HOX1a

Zea mays 205 206 X67561 LC

Zeama_PHDf_HD_HOX1b

Zea mays 207 208 X92428 LC

Zeama_PHDf_HD_HOX2a

Zea mays 209 210 X89760.1 LC

Zeama_PHDf_HD_HOX2b

Zea mays 211 212 X89761 LC

Vitvi_PHDf_HD_II

Vitis vinifera 213 214 AM464161.2 AM478203.2 LC

Poptr_PHDf_HD_II

Populus tremuloides 215 216 scaffJX.730 LC

Poptr_PHDf_HD_III

Populus tremuloides 217 218 LG_I002624 LC

Poptr_PHDf_HD_IV

Populus tremuloides 219 220 LG_XVNI1192 LC

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Nombre

Organismofuente SEC ID Nº: del ácido nucleico SEC ID Nº: del polipéptido N.º de acceso de la base de datos Estado

Ostta_PHDf_HD

Ostreococcus tauri 221 222 CR954214.4 LC

Aqufor_PHDf_HD partial

Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens 223 224 DR914726.1, DR941696.1, DR943570.1 Parcial

Glyma_PHDf_HD

Glycine max 225 226 Cóntigo GM06LC25006 Parcial

Lotco_PHDf_HD

Lotus corniculatus 227 228 AP004517 Parcial

Sorpr_PHDf_HD 3'

Sorghum propinquum 229 230 BF656332 Parcial

Sorpr_PHDf_HD 5'

Sorghum propinquum 231 232 BF704605 Parcial

Phypa_PHDf HD

Physcomitrella patens 238 239 XM_001762483 LC

Phypa_PHDf_HD

Physcomitrella patens 240 241 XM_001779822 LC

Zeama_PHDf_HD

Zea mays 242 243 LC

Ejemplo 2: Alineamiento de las secuencias del polipéptido PHDf-HD

La University of Potsdam, Alemania, ha creado bases de datos de factores de transcripción de planta, incluso para Orysa sativa, llamada riceTFDB. Se han descargado todas las secuencias de polipéptido correspondientes a los factores de transcripción que pertenecen a la familia HD (120 modelos de genes (91 locus) identificados hasta ahora), incluyendo los dos polipéptidos PHDf-HD (Os02g05450.1 y Os06g12400.1) identificados hasta la fecha. Las secuencias de polipéptido de la Tabla D1 de la presente solicitud se añadieron (cuando son de longitud completa, es decir 21 secuencias de polipéptido) al conjunto de la familia HD.

El alineamiento de todas las secuencias de polipéptido se realizó con el algoritmo Clustal (1.83) de alineamiento progresivo, utilizando valores predeterminados (Thompson y col. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna y col. (2003). Nucleic Acids Res 31:3497-3500). Posteriormente se construyó un árbol neighbour-joining, y se representa en la Figura 1 de la presente solicitud. El grupo de interés, que comprende los dos parálogos de arroz (Os02g05450.1 y Os06g12400.1) se han señalado con un círculo. Cualquier polipéptido que cae dentro de este grupo HD (después de una nueva etapa de alineamiento múltiple, como se describe anteriormente en el presente documento) se considera útil en la realización de los procedimientos de la invención, como se describe en el presente documento.

En un alineamiento de secuencia múltiple de los polipéptidos PHDf-HD de longitud completa de la Tabla D1, se pueden identificar varias características, y están marcadas en la Figura 5. Del extremo N al extremo C de los polipéptidos son: (i) una señal predicha de localización nuclear (SLN); (ii) una cremallera de leucina (ZIP), con cuatro héptadas (recuadradas, en las que normalmente aparece una leucina (ocasionalmente una isoleucina, una valina, o una metionina)) cada siete aminoácidos; (iii) un dedo HD (PHDf), con la típica C4HC3 (cuatro cisteínas, una histidina, tres cisteínas) con una de cisteína característica espaciando; (iv) un tramo ácido (rico en los aminoácidos ácidos D y E); (v) tramos básicos (ricos en los aminoácidos básicos K y R); (vi) un homeodominio (HD).

Ejemplo 3: Cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los procedimientos de la invención

Los porcentajes de similitud e identidad globales entre las secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles en la realización de los procedimientos de la invención se determinaron usando uno de los procedimientos disponibles en la técnica, el programa informático MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: una aplicación que genera matrices de similitud/identidad utilizando secuencias de proteína o de ADN. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; programa informático presentado por Ledion Bitincka). El programa informático MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o proteína sin la necesidad de alinear previamente los datos. El programa realiza una serie de alineamientos por pares usando el algoritmo de

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Ejemplo 4: Identificación de dominios comprendidos en las secuencias de polipéptido útiles en la realización de los procedimientos de la invención

La base de datos The Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) es una interfaz integrada por las bases de datos de firmas usadas comunmente para búsquedas basadas en texto y secuencia. La

5 base de datos InterPro combina estas bases de datos, que usan diferentes metodologías y grados variables de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas pata obtener firmas proteicas. Las bases de datos colaboradoras incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAMs. InterPro está alojada en el European Bioinformatics Institute en el Reino Unido.

Los resultados de la exploración InterPro de la secuencia de polipéptido como se representa en SEC ID Nº: 180, se 10 presentan en la Tabla D5.

Tabla D5: Resultados de la exploración InterPro de la secuencia de polipéptido como se representa en SEC ID Nº: 180

Número de acceso InterPro

Nombre de la base de datos integrada Número de acceso a la base de datos integrada Nombre de acceso a la base de datos integrada Coordenadas de aminoácidos en SEC ID Nº: 180

IPR0013556 Homeosecuencia

ProDom PD000010 PRH_ARATH_P48785 439-497

IPR0013556 Homeosecuencia

PFAM PF00046 Homeosecuencia 439-495

IPR0013556 Homeosecuencia

SMART SM00389 HOX 438-500

IPR0013556 Homeosecuencia

Profile PS50071 Homeobox_2 436-496

IPR00195 dedo de Zinc, tipo PHD

PFAM PF00628 PHD 197-251

IPR00195 dedo de Zinc, tipo PHD

SMART SM00249 PHD 197-249

IPR00195 dedo de Zinc, tipo PHD

Profile PS50016 ZF_PHD_2 195-251

IPR012287 Relacionado con homeodominio

Gene3D G3DSA:1.10.10.60 Sin descripción 436-501

IPR013256 Cromatina SPT2

SMART SM00784 Sin descripción 78-154

Untegrated IPR

PANTHER PTHR19418 Proteína de homeosecuencia 397-414 431-590

Los resultados de la exploración InterPro identifican claramente las características esenciales de un polipéptido PHDf-HD, es decir, un dedo de zinc de PHDf y una homeosecuencia, como se representa respectivamente, por

15 ejemplo, por las entradas de Pfam PF00628 y PF00046.

Se sabe que los HD tienen restos canónicos. El HD de los polipéptidos PHDf-HD es de secuencia altamente divergente, incluso en posiciones que son casi invariables entre homeodominios. En la Figura 3 se muestra el logo de secuencia del HD de los polipéptidos PHDf-HD de la Tabla D1. Los logos de secuencia son una representación gráfica de un alineamiento de secuencias múltiple de aminoácidos o ácido nucleico. Cada logo consiste de pilas de 20 símbolos, una pila para cada posición en la secuencia. La altura total de la pila indica la conservación de secuencia en esa posición, mientras que la altura de los símbolos dentro de la pila indica la frecuencia relativa de cada aminoácido o ácido nucleico en esa posición. En general, un logo de secuencia proporciona una descripción más rica y más precisa que una secuencia consenso de, por ejemplo, un sitio de unión. El algoritmo (WebLogo) para producir tales logos está disponible en el servidor de la University of California, Berkeley. El HD como se representa

25 en SEC ID Nº: 234, y comprendido en SEC ID Nº: 180, está en conformidad con el logo de secuencia como se representa en la Figura 3. Los polipéptido útiles en la realización de los procedimientos, de acuerdo con la invención, comprenden un HD comprendido en el logo de secuencia como se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 5: Predicción de las características de la estructura secundaria de las secuencias de polipéptido útiles en la realización de los procedimientos de la invención

Las súper hélices normalmente contienen un patrón repetido de siete restos de aminoácidos denominado repeticiones héptadas. Las súper hélices son importantes para identificar interacciones proteína-proteína, tales como 5 oligomerización, de ya sea, proteínas idénticas, proteínas de la misma familia, o proteínas no relacionadas. Recientemente se ha hecho mucho avance en la predicción computacional de súper hélices a partir de datos de secuencia. En las herramientas ExPASy Proteomics están disponibles muchos algoritmos bien conocidos para un experto en la materia. Uno de ellos, COILS, es un programa que compara una secuencia con una base de datos de súper hélices de dos cadenas paralelas conocidas y obtiene una puntuación de similitud. Después el programa

10 calcula la probabilidad de que la secuencia adopte una conformación de súper hélice, mediante la comparación de esta puntuación con la distribución de puntuaciones en proteínas globulares y de súper hélice.

El polipéptido PHDf-HD como se representa en SEC ID Nº: 180, tiene dos dominios súper hélice predichos Nterminales, con una alta probabilidad, en las tres ventanas (14, 21 y 28) examinadas. En la Tabla D6, se muestran las coordenadas de restos, restos, las tres ventanas y los valores correspondientes de probabilidad. En la Figura 4,

15 está el resultado gráfico del algoritmo COILS en el polipéptido como se representa en SEC ID Nº: 180, en la que las dos súper hélices predichas son claramente visibles en las tres ventanas (representado mediante las tres líneas), en la mitad N-terminal del polipéptido.

Tabla D6: Resultado numérico del algoritmo COILS en el polipéptido como se representa en SEC ID Nº: 180. Se muestran las coordenadas de restos (N.º), restos, las tres ventanas y los valores correspondientes de probabilidad. 20 Las probabilidades por encima de 0,09 se muestran el gris.

N.º

Resto Ventana=14 Prob Ventana=21 Prob Ventana=28 Prob

87

P d 0,001 e 0,001 E 0,001

88

T e 0,063 f 0,274 F 0,099

89

R f 0,063 g 0,567 G 0,099

90

R g 0,063 a 0,567 A 0,099

91

K b 0,066 b 0,642 B 0,188

92

H c 0,066 c 0,642 C 0,188

93

K d 0,069 d 0,642 D 0,591

94

Q e 0,178 e 0,642 E 0,672

95

K f 0,335 f 0,642 F 0,672

96

R g 0,335 g 0,642 G 0,772

97

K a 0,335 a 0,642 A 0,772

98

N b 0,347 b 0,642 B 0,772

99

D c 0,347 c 0,642 C 0,772

100

E d 0,347 d 0,642 D 0,772

101

S e 0,347 e 0,642 E 0,808

102

D f 0,347 f 0,642 F 0,808

103

E g 0,347 g 0,642 g 0,808

104

V a 0,347 a 0,642 a 0,808

105

S b 0,347 b 0,642 b 0,808

106

R c 0,347 c 0,642 C 0,808

107

M d 0,347 d 0,642 d 0,808

108

E e 0,347 e 0,642 e 0,808

109

K f 0,347 f 0,642 F 0,808

110

R g 0,347 g 0,642 g 0,808

(continuación)

N.º

Resto Ventana=14 Prob Ventana=21 Prob Ventana=28 Prob

111

A a 0,347 a 0,642 a 0,808

112

R b 0,307 b 0,514 b 0,808

113

Y c 0,066 c 0,503 c 0,808

114

L d 0,262 d 0,503 d 0,808

115

L e 0,262 e 0,503 e 0,808

116

I f 0,262 f 0,503 F 0,808

117

K g 0,262 g 0,503 g 0,808

118

I a 0,262 a 0,503 a 0,808

119

K b 0,262 b 0,503 b 0,808

120

Q c 0,262 c 0,503 c 0,808

121

E d 0,262 d 0,503 d 0,808

122

Q e 0,262 e 0,503 e 0,808

123

N f 0,262 f 0,503 F 0,808

124

L g 0,262 g 0,434 g 0,808

125

L a 0,262 a 0,434 a 0,808

126

D b 0,262 b 0,434 b 0,808

127

A c 0,262 c 0,304 c 0,808

128

Y d 0,145 d 0,304 d 0,808

129

S e 0,145 e 0,044 e 0,808

130

G f 0,119 f 0,009 F 0,367

131

D g 0,078 g 0,007 g 0,136

132

G a 0,002 a 0,001 a 0,005

133

W b 0 a 0,001 a 0,001

134

N b 0,001 b 0,045 b 0,057

135

G c 0,001 c 0,045 c 0,057

136

H d 0,003 d 0,07 d 0,219

137

S e 0,008 e 0,132 e 0,231

138

R f 0,025 f 0,357 F 0,231

139

E g 0,025 g 0,357 g 0,231

140

K a 0,025 a 0,357 a 0,231

141

I b 0,028 b 0,357 b 0,231

142

K c 0,07 c 0,357 c 0,462

143

P d 0,07 d 0,357 d 0,462

144

E e 0,998 e 0,997 e 0,974

145

K f 0,998 f 0,997 f 0,974

146

E g 0,998 g 0,997 g 0,974

(continuación)

N.º

Resto Ventana=14 Prob Ventana=21 Prob Ventana=28 Prob

147

L a 0,998 a 0,997 a 0,974

148

Q b 0,998 b 0,997 b 0,974

149

R c 0,998 c 0,997 c 0,974

150

A d 0,998 d 0,997 d 0,974

151

K e 0,998 e 0,997 e 0,974

152

K f 0,998 f 0,997 f 0,974

153

Q g 0,998 g 0,997 g 0,974

154

I a 0,998 a 0,997 a 0,974

155

M b 0,998 b 0,997 b 0,974

156

K c 0,998 c 0,997 c 0,974

157

Y d 0,998 d 0,997 d 0,974

158

K e 0,989 e 0,997 e 0,974

159

I f 0,896 f 0,997 f 0,974

160

A g 0,486 g 0,997 g 0,974

161

I a 0,409 a 0,997 a 0,974

162

R b 0,274 b 0,997 b 0,974

163

D c 0,255 c 0,997 c 0,974

164

V d 0,095 d 0,997 d 0,974

165

I e 0,025 e 0,871 e 0,974

166

H f 0,025 f 0,622 f 0,974

167

Q g 0,025 g 0,496 g 0,974

168

L a 0,025 a 0,496 a 0,974

169

D b 0,025 b 0,468 b 0,974

170

L c 0,005 c 0,111 c 0,974

171

C d 0,002 d 0,02 d 0,974

172

S e 0,001 e 0,007 e 0,719

173

S f 0,001 f 0,003 f 0,482

174

S g 0,001 g 0,001 g 0,066

175

G a 0 a 0 a 0,001

Está predicha otra súper hélice en la mitad C-terminal del polipéptido PHDf-HD como se representa en SEC ID Nº: 180, con una probabilidad menor que los dos dominios hélice comprendidos en la mitad N-terminal del polipéptido.

Ejemplo 6: Predicción de la localización subcelular de las secuencias de polipéptido útiles en la realización 5 de los procedimientos de la invención

LOCtree es un algoritmo que puede predecir la localización subcelular y la propensión a la unión de ADN de proteínas que no son de membrana en eucariotas vegetales y que no son vegetales así como en procariotas. LOCtree clasifica proteínas de animal eucariotas en una de cinco clases subcelulares, mientras que las proteínas de planta se clasifican en una de seis clases y las proteínas de procariota se clasifican en una de tres clases.

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Claims (1)

1. imagen1

   imagen2