JPH11513256A

JPH11513256A - 種子粉砕

Info

Publication number: JPH11513256A
Application number: JP9514686A
Authority: JP
Inventors: ウルブスコブ，ペテル; チャイルド，ロビン; オンケレン，アンリバン; プリンセン，エルス; ボルクハルト，ベルンハルト; サンデル，リリイ; ペテルセン，モルテン; ポウルセン，ゲルトブンドガルド; ボッテルマン，ヨハン
Original assignee: プラントジエネテイツクシステムズエヌ．ブイ
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 1999-11-16
Also published as: CZ104298A3; HUP9802535A3; US20020184660A1; AU718082B2; PL326082A1; DE69636288T2; HUP9802535A2; CA2234222C; US6797861B2; US6420628B1; WO1997013865A1; CA2234222A1; AU7284796A; EP0853676B1; EP0853676A1; DE69636288D1; CN1249245C; ATE331034T1; CN1211282A; PL187026B1

Abstract

(57)【要約】細胞の核ゲノムに取り込まれた少なくとも１個の裂開（ＤＺ）に選択的なキメラ遺伝子を含む植物であって、前記ＤＺに選択的なキメラ遺伝子が下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片ａ）１）植物の特定のＤＺの細胞で産生され、細胞壁ヒドロラーゼ、特にエンド−ポリガラクツロナーゼをコードする植物の内在性遺伝子の前記ＤＺでの発現を防止し、阻害し、または減少する、ＲＮＡ、または２）前記ＤＺ細胞で産生され、それらを殺しまたは不能化し、またはそれらの正常な代謝、生理、または発生を妨げる、タンパク質またはポリペプチドをコードする転写されるＤＮＡ領域、ｂ）少なくとも前記ＤＺ細胞の転写されるＤＮＡ領域の発現を指示する植物で発現可能なプロモーター、但し、前記の転写されるＤＮＡ領域がタンパク質またはポリペプチドをコードし、または前記ＤＺ細胞以外の細胞で前記植物において発現する内在性遺伝子によってコードされるセンスＲＮＡに指示されるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードするとき、前記の植物で発現可能なプロモーターは前記ＤＺ細胞で選択的に前記の転写される領域の発現を指示するＤＺに選択的なプロモーターである、を含んでなり、前記植物は、前記ＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含まない植物と比較すると、裂開特性が向上し、好ましくは裂開を遅延させることを特徴とする、植物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】種子粉砕緒言本発明は、裂開領域に選択的なタンパク質、特にポリガラクツロナーゼのような細胞壁ヒドロラーゼをコードする核酸断片を含んでなるＤＮＡ配列、対応する植物遺伝子の調節領域、及び植物における裂開特性、更に詳細にはBrassica nap us の莢裂開特性の改質のためのそれらの使用に関する。発明の背景莢裂開または莢実零れとも呼ばれる成熟果実または莢の下種による収穫量の損失、並びに次収穫年における自生生育での共存物の増加は、乾燥裂開果実を作る穀物で一般にみられる問題である。これらの好ましくない特性が具体的に当てはまる経済的に重要な穀物は油料種子ナタネであり、潜在的収穫量の５０％までが悪天候条件下で失われることがある。一般に豆果とも呼ばれる乾燥裂開果実は、単一心皮（多くの豆科植物の豆果など）からまたは複数の心皮（多くのアブラナ科植物の長角果など）から生じることがある。長角果の場合には、莢は縁と縁とが接合した２つの心皮からなっている。縁の間の縫合部はレプルムと呼ばれる厚い葉脈を形成している。莢の成熟が近づくと、２つのバルブはレプルムから次第に分離して、最終的にレプルムに付着していた種子の実零れを生じる。超微細構造の検討により、莢の実零れは莢バルブの分離の部位（すなわち、縫合部）での細胞壁材料の精密な分解と関連していることが示されている。裂開の前の細胞壁の分解と細胞凝集力の喪失は、主として細胞壁の中間ラメラの可溶化に起因している。この中間ラメラは一次細胞壁間に見いだされており、個々の細胞を互いに結合して組織を形成するセメントである。細胞分離の前にはエチレンクリマクテリックが起こり、これは加水分解酵素のセルラーゼ（β−１，４−グルカナーゼ）の活性の組織特異的増加と一時的に相関しており、これは具体的には裂開帯と呼ばれる縫合部に沿った細胞の層で起こる。対照的に、細胞壁分解酵素であるポリガラクツロナーゼの活性は、莢裂開と時間的または空間的に相関を全く示さない[Meakin and Roberts(1990)，J．Exp．Bot．41: 1003)。発生の初期段階における莢裂開は、豆果小昆虫であるDasineura brassicae の侵入に特徴的なものである。ポリガラクツロナーゼおよびセルラーゼの両方の活性の局部的増進が観察された。しかし、小昆虫によって誘発され且つ成熟に関連した実零れの制御は異なっていることがわかった[Meakin and Roberts(1991)，Annals of B otany 67: 193]。一見して、莢裂開の過程は、植物が葉、花、および果実のような器官を落とす落果と多くの特徴をエチレンは落果を誘発しまたは促進するが、オーキシンは落果を抑制または遅延させることが観察されている。落果に決定的な段階は、落果帯と呼ばれる細胞の不連続層における細胞壁加水分解酵素の高度に調整された発現、合成、および分泌である。セルラーゼ（β−１，４−グルカナーゼ）は、このような細胞壁ヒドロラーゼの１つの種類を構成している。セルラーゼ活性は、葉脱離帯、果実脱離帯、熟成果実、老化子葉、および花柱、および葯などの各種組織で同定されている[Kemmerer and Tucker(1994)，Plant Physiol．104: 557 およびこの文献に記載されている文献]。主として果実の落果に関与する第二の種類のヒドロラーゼは、特徴的なイソ型が同定されているポリガラクツロナーゼである[Bonghi et al．(1992)，Plant Mol．Biol．20: 839:T aylor et al.(199 0)Planta 183: 133]。 Kadkol et al．[(1988)，Aust．J．Biol．34: 79]は、単一のオーストラリア国で取得されたアブラナでの耐落果性が増加することを報告した。莢の成熟の変化は、放射線照射した種子から生じるアブラナの突然変異株でも観察されている [Luczkiewicz(1987)，Proc．7th in Rapeseed Congress 2: 463]。しかしながら、伝統的な育種法では、早期開花、成熟、および気腫痕耐性のような他の所望な特性に抵触することなくアブラナの栽培品種に耐落果性を導入することに成功したとは結論することはできない[Prakash and Chopra(1990)，Genetical Researc h 56: 1]。その経済的影響の大きさにも拘らず、油料種子の裂開の際に生じる遺伝子発現の分子的事象および変化に関してはほとんど知られていない。現在のところ、２つの莢特異的ｍ−ＲＮＡであって、その発現が空間的および時間的に莢発生と相関しているものが報告されている。しかしながら、コードしたタンパク質の機能は知られていない[Coupe et al．(1993)，Plant Mol．Biol．23: 1223; Coupe e t al．(1994)，Plant Mol．Biol．24: 223]。一般的期間でのＰＣＴ公表ＷＯ９４／２３０４３号明細書には、植物の落果および裂開を制御するための方法が記載されている。従って、本発明の目的は、植物に裂開帯に選択的遺伝子を提供することである。これらおよび他の目的は、本発明の概要、好ましい態様の説明、および請求の範囲によって明らかなように、本発明によって達成される。発明の概要本発明は、植物の裂開帯（「ＤＺ」）に特異的な遺伝子、これらの遺伝子によってコードされたｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ、およびこれらの遺伝子のプロモーターを提供する。詳細には、本発明は、配列番号１のｃＤＮＡおよびｍＲＮＡをコードする遺伝子のプロモーターであって、そのｍＲＮＡのｃＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド配列を有するものを提供する。更に詳細には、好ましい態様では、本発明は、１位から始まり２，３２８位で終わる配列番号１３の５’ 調節領域内に含まれるプロモーターに関する。もう一つの態様では、本発明は、ＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含まない植物と比較したときに、植物の形質転換に用いてトランスジェニック植物であって、このトランスジェニック植物のＤＺに選択的なキメラ遺伝子の発現により裂開特性が向上し、特に莢裂開特性が向上したものを得ることができるものも提供する。更にもう一つの態様では、したがって、本発明は、細胞の核ゲノムに取り込まれた少なくとも１個のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含む植物であって、このＤＺに選択的なキメラ遺伝子が下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片、すなわちａ）１）植物の特定のＤＺの細胞で産生し、細胞壁ヒドロラーゼ、特にエンド −ポリガラクツロナーゼ（「エンド−ＰＧ」）をコードする植物の内在性遺伝子、好ましくはＤＺに選択的な遺伝子のこれらの細胞での発現を防止し、抑制し、または減少させるＲＮＡ、または２）ＤＺの細胞中で産生し、細胞を殺しまたは無能力化しまたはその正常な代謝、生理または発生を妨害するタンパク質またはポリペプチドをコードする転写したＤＮＡ領域、ｂ）少なくともＤＺの細胞中の転写したＤＮＡ領域の発現を支配する植物で、発現可能なプロモーターであって、但し、転写したＤＮＡ領域がタンパク質またはポリペプチドをコードし、またはＤＺ以外の細胞中において植物で発現する内在性植物遺伝子によってコードされるセンスＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードするときには、植物で発現可能なプロモーターはＤＺに選択的なプロモーター、すなわちＤＺの細胞中で選択的に転写される領域の発現を支配するプロモーターであるもの、を含んでなる植物を提供する。好ましくは、転写したＤＮＡ領域は、タンパク質またはポリペプチドが産生される細胞にとって毒性を有するバルナーゼ(barnase)のようなタンパク質またはポリペプチド；タンパク質またはポリペプチドが産生される細胞中でオーキシンまたはオーキシン類似体の濃度を増加するインドール−３−アセタミドヒドロラーゼおよび／またはトリプトファンモノオキシゲナーゼのようなタンパク質またはポリペプチド；タンパク質またはポリペプチドが産生される細胞中でオーキシンに対する感受性を増加するｒｏｌＢ遺伝子生成物のようなタンパク質またはポリペプチド；またはタンパク質またはポリペプチドが産生される細胞中でエチレンに対する感受性を減少させる突然変異体ＥＴＲ１−１タンパク質または別のエチレンレセプタータンパク質のようなタンパク質またはポリペプチドをコードする。本発明のもう一つの好ましい態様では、転写されるＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡのようなＲＮＡ、またはリボザイム、ＤＺ、好ましくはＤＺに選択的な遺伝子で天然に発現される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに相補性の部分をコードする。本発明の好ましい態様の詳細な説明本発明で用いられる「裂開」という用語は、葯または果実のような植物器官または構造が成熟時に一定の線に沿ってまたは所定の方向に開いて、この器官または構造の内容物を零す過程を表す。その態様のいくつかでは、裂開の過程は、葉、花、または果実のような部分または器官が植物の残りの部分から分離する落果の過程を連想させるものである。本発明で用いられる「莢」という用語は、１、または２以上の心皮からなる乾燥裂開果実を意味する。油料種子アブラナでは、莢は２バルブ長角果であって、バルブが縦長の背面および内面縫合部であって裂開帯を含んでなるものの形状を有する。本発明で用いられる「莢裂開」という用語は、果実、特に莢が細胞の不連続層に沿って開裂して、最終的にバルブを分離した後、果実、特に莢内に含まれる種子を零す過程を表す。莢裂開は、アブラナ科のほとんどの属の乾燥果実を発生する多種多様な植物で見られる。「裂開帯」（ＤＺ）という用語は、そのほとんどの一般的な意味において、植物器官または構造が裂開の過程で開裂する帯の組織を包含する。巨視的には、ＤＺは、通常は器官における明確な縫合部の存在によって認識することができる。厳密な意味では、ＤＺは１〜３個だけの柔細胞の幅の領域を含んでなることがある。莢では、この領域は、通常は密に充填された細胞を含んでなり、レプルムをバルブ末端から分離するレプルムの維管束組織の縁に隣接している。本発明の目的のため、ＤＺは個の領域を取り囲む細胞層を含むこともある。ＤＺは、莢の室から表皮縫合部まで伸びている。本発明で用いられる「プロモーター」という用語は、転写の開始時にＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼによって（直接または間接的に）認識され、結合される任意のＤＮＡを表す。ポリメラーゼは、転写開始部位、および転写開始因子とＲＮＡポリメラーゼの結合部位を包含し、遺伝子調節タンパク質が結合することができる様々な他の部位（例えば、エンハンサー）を含んでなることができる。本発明で用いられる「植物で発現可能なプロモーター」という用語は、植物細胞で転写を駆動することができるプロモーターを意味する。これには、植物起源の任意のプロモーターが挙げられるが、植物細胞で転写を指示することができる植物以外の起源の任意のプロモーター、すなわちＣａＭＶ３５ＳまたはＴ−ＤＮＡプロモーターのようなウイルスまたは細菌性のある種のプロモーターも挙げられる。本発明で用いられる「調節領域」という用語は、転写の駆動、およびタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡのような所定のＤＮＡ配列の転写の時期および水準のコントロール（すなわち、調節）に関与する任意のＤＮＡを意味する。例えば、５′調節領域（または、プロモーター領域）は、コード配列の上流に位置し且つプロモーターおよび５′未翻訳リーダー配列を含んでなるＤＮＡ配列である。３′調節領域は、コード配列の下流（すなわち、３′）に位置し且つ１個以上のポリアデニル化シグナルを包含する好適な転写終止（および／または調節）シグナルを含んでなるＤＮＡ配列である。本発明で用いられる「細胞壁ヒドロラーゼ」という用語は、例えば裂開の過程で細胞壁材料の分解に関与している酵素を意味する。このような酵素の例としては、ポリガラクツロナーゼ、セルラーゼ（β−１，４−グルカナーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、細胞壁タンパク質を加水分解するプロテアーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。「遺伝子」という用語は、好適な調節領域、例えば植物で発現可能なプロモーターによって制御されている細胞でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写されるＤＮＡ領域（転写されるＤＮＡ領域）を含んでなる任意のＤＮＡ断片を意味する。したがって、遺伝子は、操作可能に連結したＤＮＡ断片、例えばプロモーター、５′未翻訳リーダー配列、コード領域、およびポリアデニル化部位を含んでなる３′未翻訳領域を含んでなることができる。内在性植物遺伝子は、植物種で天然にみられる遺伝子である。キメラ遺伝子は、植物種で普通に見られない任意の遺伝子、またはプロモーターが天然では転写したＤＮＡ領域の一部または全部と、または遺伝子の少なくとも１個の他の調節領域と関連していない任意の遺伝子である。「遺伝子の発現」という用語は、調節領域、特にプロモーターによって制御されているＤＮＡ領域を、生物活性を有する、すなわち他の核酸と相互作用することができるまたは生物活性を有するポリペプチドまたはタンパク質に翻訳することができるＲＮＡに転写する過程を表す。遺伝子の発現の最終生成物が生物活性を有するＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムであるときには、遺伝子はＲＮＡをコードすると言われる。遺伝子の発現の最終生成物が生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであるときには、遺伝子はタンパク質をコードすると言われる。遺伝子の発現の表現型効果は、遺伝子によってコードされるＲＮＡまたはタンパク質を産生する植物細胞（または植物）に対するＲＮＡまたはタンパク質の産生の生化学的、生理学的および／または発生効果を指す。遺伝子発現の表現型効果は、コードされるＲＮＡまたはタンパク質の生成を減少させまたは防止することによって、あるいはこのようなＲＮＡまたはタンパク質の生物活性を妨げることによって減少させまたは防止することができる。本発明で定義されるように、「このようなｍＲＮＡのｃＤＮＡが配列番号Ｘのヌクレオチド配列を含んでなる」と明細書に記載されるときには、（ＲＮＡ配列中の）Ｕ−残基が（ＤＮＡ配列中の）Ｔ−残基によって置換されることを除き、配列番号Ｘで表されるのと同じヌクレオチド配列を有する。本発明によれば、ＤＺに選択的なｃＤＮＡおよびそれらの対応する植物ゲノムＤＮＡ断片は、下記のように同定される。１）ＤＺ組織から単離されたｍＲＮＡから出発してｃＤＮＡを構築し、ｃＤＮＡライブラリーに判別スクリーニングを施して莢壁、種子、レプルム、茎、根、生殖器官などこれらに限定されない他の植物組織と比較して、特定のＤＺの組織に選択的に含まれるｍＲＮＡを同定する。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーを、例えばＤＺに選択的に含まれていることが確認されている細胞壁ヒドロラーゼのような単離されたタンパク質の決定されたアミノ酸配列から推定されるオリゴヌクレオチドを用いてする。更に、ネステド−ＰＣＲ法(nested-PCR approach)に同じオリゴヌクレオチドを用い、増幅した（複数の）断片をプローブとして用いてライブラリーをスクリーニングすることも可能である。ＤＺに選択的なｃＤＮＡライブラリーを、ＤＺ発生の様々な段階で単離したｍＲＮＡのプールから構築することができ、２）ＤＺに選択的なｍＲＮＡまたはタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離して、特性決定し、３）このｃＤＮＡをプローブとして用いて、ＤＺに選択的なｍＲＮＡまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる植物ゲノム中の領域を同定して単離する。あるいは、ゲノムＤＮＡを、ｃＤＮＡ配列から推定されるオリゴヌクレオチドを用いる逆ＰＣＲを利用して単離することができ、４）場合によっては、ｃＤＮＡに対応するＲＮＡプローブを構築して、目的とする特定のＤＺなどの様々な植物組織の通常のＲＮＡ−ＲＮＡ in situハイブリダイゼーション分析［例えば、De Block et al．(1993)，Anal．Biochem．216: 86を参照されたい］に用いて、このＤＺにおける推定ＤＺに選択的な内在性植物遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの選択的存在を確認する。本発明によるＤＮＡの発現に関する「裂開帯に選択的」という用語は、実用上は、一つの特定のＤＺ、特に莢ＤＺ、または限定された組のＤＺの細胞でのＤＮＡの高度に特異的な、好ましくは独占的な、発現を表す。したがって、ＤＺに選択的な遺伝子は、所定の裂開帯、植物の莢裂開帯の細胞で選択的に発現する植物の内在性遺伝子である。目的のＤＺを有する任意の植物を用いて、ＤＺに選択的な遺伝子を単離することができる。ＤＺに選択的な遺伝子の単離に好適な植物は、Arabidopsis thaliana、Brassica campestris、Brass ica juncea 、および特にBrassica napusなど、これらに限定されないアブラナ科の植物；Glycine max 、Phaseolus vulgarisなど、これらに限定されないマメ科の植物である。このような遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（またはそれから得られたｃＤＮＡ）は、ＤＺに選択的なｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）である。このようなｍＲＮＡの転写を駆動し、制御するプロモーターは、ＤＺに選択的なプロモーターと表される。ＤＺに選択的なプロモーターを例えば植物での細胞毒性（例えば、バルナーゼ遺伝子）を発現するのに用いて、植物の通常の生育および発生、および作物栽培学的性能（例えば、種子収率によって測定した）が、ＤＺ細胞以外の細胞、莢ＤＺ細胞以外の細胞の細胞毒性遺伝子の発現によって負の影響を受けないようにすることができる。ＤＺに選択的な遺伝子（すなわち、ＤＺに選択的なｃＤＮＡを調製することができるＤＺに選択的なｍＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ断片）を得たならば、ＤＺに選択的なプロモーターを含むプロモーター領域をｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の第一のアミノ酸をコードするコドンの上流（すなわち、５′ に位置した）領域として決定される。このようなプロモーター領域は、出発コドンの少なくとも約４００〜５００ｂｐ、好ましくは少なくとも約１０００ｂｐ、特に少なくとも約１５００〜２０００ｂｐ上流であるのが好ましい。便宜上、このようなプロモーター領域は出発コドンの約３０００〜５０００ｂｐを上回って伸長しないのが好ましい。実際のＤＺに選択的なプロモーターは、ＤＺに選択的なｍＲＮＡをコードする領域の上流（すなわち、５′）のゲノムＤＮＡの領域である。ｇｕｓ遺伝子のコード領域に操作可能に連結したＤＺに選択的なプロモーターを含んでなるキメラ遺伝子(Jefferson et al．(1986)，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 83: 8447)は、トランスジェニック植物で通常のin-situ での組織化学的手法によって分析されるように、目的とする特定のＤＺの細胞において（ｇｕｓ遺伝子によってコードされる）検出可能なβ−グルクロニダーゼ活性を選択的に生成する[De Block and Debrouwer(1992)，The Plant Journal 2: 261; De Bl ock and Debrouwer(1993)，Plants 189: 218]。ＤＺに選択的なプロモーターを得ることができる好ましいＤＺに選択的な遺伝子は、ヌクレオチド位置１１〜２７のオリゴヌクレオチドＰＧ１の配列（配列番号２）および）／またはヌクレオチド位置１１〜２７のヌクレオチド（すなわち、１１位から出発して２７位で終わる）オリゴヌクレオチドＰＧ３の配列（配列番号４）に対応する配列を含む、および／またはヌクレオチド位置１１〜２５のオリゴヌクレオチドＰＧ２（配列番号３）に相補的な配列および／またはヌクレオチド位置１１〜２７のオリゴヌクレオチドＰＧ５（配列番号５）の配列を含むｃＤＮＡを調製することができるＤＺに選択的なｍＲＮＡをコードする遺伝子、好ましくはBrassica napus遺伝子である。好ましくは、このようなＤＺに選択的なｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドＰＧ１およびＰＧ３およびＰＧ２およびＰＧ５の前記配列を含み、またはヌクレオチド位置９５〜１，３９３の配列番号１の領域によってコードされたタンパク質をコードする。特に好ましいＤＺに選択的な遺伝子は、少なくともヌクレオチド１０〜１６００の配列番号１の配列を含むｃＤＮＡを調製することができるＤＺに選択的なｍＲＮＡをコードするBrassica napus遺伝子である。もう一つの好ましいＤＺに選択的な遺伝子は、配列番号１０の配列を含むｃＤＮＡを調製することができるＤＺに選択的なｍＲＮＡをコードするBrassica napus遺伝子である。本発明の好ましいプロモーターは、配列番号１のｃＤＮＡに対応するゲノムクローンの５′調節領域、例えば位置１から出発して位置２，３２８で終わる配列番号１３の配列を有する５′調節領域に含まれるプロモーターである。更に好ましいプロモーター領域は、独特ＳｐｈＩ部位（位置２４６〜２５１）とＨｉｎｄＩＩ部位（位置１，８３６〜１，８４１）、特にＳｐｈＩ部位とＢａｍＨＩ部位（位置１，０５１〜１，０５６）との間のいずれかで出発し、ヌクレオチド位置２，３２８（ＡＴＧ翻訳出発コドンの直前）で終わる配列番号１３を含んでなるＤＮＡ断片である。このようなプロモーター領域は、本発明のＤＺに選択的なプロモーターと５′未翻訳リーダー領域とを含んでなり、ＤＺに選択的なキメラ遺伝子の構築に用いられる。これに関して更に好ましいプロモーター領域は、位置２５１（ＳｐｈＩ部位）と２，３２８との間の配列番号１３の配列を有するＤＮＡ断片（以後、「ＰＤＺ」と表す）である。しかしながら、より小さなＤＮＡ断片を本発明でプロモーター領域として用いることができ、翻訳開始コドンから少なくとも約４９０塩基対、更に好ましくは少なくとも約６６１塩基対、最も好ましくは約１３２６塩基対上流を含んでなる配列番号１３のＤＮＡの任意の断片を用いることができると思われる。本発明でプロモーター領域として用いられる特に好ましいより小さな断片は、ヌクレオチド１００２〜２３２８の配列番号１３の配列を含んでなるＤＮＡ配列を有する。配列番号１３の５′調節領域のプロモーターのＤＺ選択性は、ヌクレオチド１００２〜１６７４の間に配列番号１３のヌクレオチド配列を含むことによってかなり改良することができると思われる。したがって、このヌクレオチド配列を含んでなるプロモーターが特に好ましい。また、配列番号１３の５′調節領域のプロモーターの内部部分であって、このプロモーターのＤＺ選択性を決定するものを含む人工的プロモーターを構築することもできる。これらの人工プロモーターは、植物で発現することができるもう一つのプロモーターの「コアプロモーター」または「ＴＡＴＡボックス領域」、例えばＷＯ９３／１９１８８号明細書に記載されているようなＣａＭＶ３５Ｓ「ＴＡＴＡボックス領域」を含むことができる。好適なプロモーター断片または人工プロモーターは、例えばそれらをリポーター遺伝子（例えば、ｇｕｓ遺伝子）に適当に融合させ、（複数の）適当な組織および適当な発生段階でリポーター遺伝子の発現を検出することによって確認することができる。このようなより小さなプロモーターおよび／またはＤＺ選択性を決定する配列番号１３の５’調節領域の内部部分を含んでなる人工プロモーターは、ＤＺに特異的細胞での転写の一層良好な選択性を提供し、および／または本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子の転写領域の転写の水準を向上させることができる。実際のプロモーターの他に、本発明のＤＺに選択的な遺伝子の５′調節領域は、転写出発部位と翻訳出発部位との間には位置されたＲＮＡの５′未翻訳リーダー（５′ＵＴＬ）配列をコードするＤＮＡ断片も含んでなる。５′転写出発部位は、（配列番号１３の）位置２，２１９と２，２２７との間に配置されており、長さが約１０２〜１１０の５′ＵＴＬを生じると思われる。この領域は、プロモーターの特異性に実質的に影響を与えることなく別の５′ＵＴＬ、例えばもう一つの植物で発現可能な遺伝子の５′ＵＴＬに代えることもできると思われる。他の有用なＤＺに選択的な遺伝子または本発明で用いられるｃＤＮＡは、他の供給源、例えばB．napusの他の栽培品種からまたは他の植物種から、例えば核酸ハイブリダイゼーション：実際的方法（Nucleic Acid Hybridization: A Practi cal Approach）（１９８５年）、IRS Press Ltd UK、（B.D．HamesおよびS.J．H iggins監修）に記載の通常の方法を用いて高緊縮ハイブリダイゼーション条件でゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして配列番号１（または配列番号１０）のｃＤＮＡを用いることによって単離されたものである。したがって、本発明の目的に有用な遺伝子は、配列番号１のｃＤＮＡクローンのコード領域と本質的に同じヌクレオチド配列を有するコード領域を含むｃＤＮＡ変異体を調製することができるｍＲＮＡをコードし、ポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする任意の遺伝子である。また、プロモーター領域およびプロモーターは、例えば配列番号１３に含まれている配列を有するプロモーター領域またはプロモーターと本質的に同じｃＤＮＡを用いて確認することができる。遺伝子のｃＤＮＡまたは調節領域の配列のようなヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関して、「本質的に同じ」とは、２個の配列を整列したときに、配列同一性のパーセント、すなわち同一ヌクレオチドを有する位置の数を２個の配列の短い方のヌクレオチドの数で割ったものが、特に調節領域に関して８０％を上回り、好ましくは９０％を上回ることを意味する。２個のヌクレオチド配列の整列は、ウィンドーサイズ２０ヌクレオチド、ワード長さ４ヌクレオチド、およびギャップペナルティ４を用いて、ウィルバー・アンド・リップマン・アルゴリズム(Wilbur and Lipmann algorithm)［Wilbur and Lipmann(1983)，Proc．Na t．Acad．Sci．USA80: 726 ］によって行われる。２個の本質的に同じｃＤＮＡ変異体は、典型的には、互いに本質的に同じタンパク質をコードする。例えば、配列番号１のｃＤＮＡの変異体は、典型的には配列番号１のｃＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。「アミノ酸配列」に関しては、２個の関連配列を整列したときに、配列同一性のパーセント、すなわち同一アミノ酸残基を有する位置の数を２個の配列の短い方の残基の数で割ったものが、８０％を上回り、好ましくは９０％を上回ることと本質的に同じであることを意味する。２個のアミノ酸配列の整列は、ウィンドーサイズ２０アミノ酸、ワード長さ２アミノ酸、およびギャップペナルティ４を用いて、ウィルバー・アンド・リップマン・アルゴリズム(Wilbur and Lipmann algorithm)［Wilbur and Lip mann(1983)，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 80: 726 ］によって行われる。前記の配列整列などの配列データーのコンピューターの助けによる分析および解釈は、 Intelligenetics^TMSuite（Intelligenetics Inc.，カリフォルニア）のプログラムを用いて好都合に行うことができる。本発明によれば、ＤＺに選択的なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ並びにゲノムＤＮＡから得られる調節領域を、植物の裂開特性、特にBrassica napusでの莢裂開特性を向上させる目的で用いる。したがって、本発明によれば、植物で発現可能なプロモーターおよび転写したＤＮＡ領域であって、それらの一方または両方が本発明のＤＺに選択的な遺伝子から誘導されるものを含んでなる少なくとも１個のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡが提供される。トランスジェニック植物でのＤＺに選択的なキメラ遺伝子の発現は、ＤＺの細胞だけでの表現型効果を有する。したがって、ＤＺに選択的な遺伝子の発現は、所定の裂開帯（例えば、莢ＤＺ）における内在性植物遺伝子の発現の表現型効果を選択的に防止し、抑制し、阻害し、または減少させることがあり、裂開帯の細胞を選択的に殺しまたは無能化することがあり、またはＤＺ細胞の正常な代謝を妨害して、裂開、特に莢裂開を遅延し、または妨げることがある。本発明の目的のため、植物細胞（例えば、ＤＺ細胞）のすべての生化学的および／または生理学的過程が停止し、あるいは細胞の生化学的および／または生理学的過程を変化させて植物細胞壁の分解に関与する少なくとも１個の酵素、特にペクチン分解酵素、例えばポリガラクツロナーゼの細胞外生産を少なくとも３０％だけ、特に少なくとも７５％だけ、更に詳細には９０％だけ効果的に減少させる場合には、この細胞は殺されまたは不能化される。本発明の目的のために、内在性遺伝子の発現によって細胞によって産生されるｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の量を少なくとも３０％だけ、特に少なくとも７５％だけ、更に詳細には９０％だけ減少させると、植物細胞の内在性遺伝子の発現の表現型効果は妨げられ、抑制され、阻害され、または減少する。裂開が様々な程度まで遅延しまたは妨げられる植物は、植物を、少なくとも１個の本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子であって植物でのその発現によりＲＮＡと、例えば細胞壁加水分解酵素をコードする１種類以上の内在性遺伝子の発現の表現型効果を減少させまたはＤＺ細胞を殺すことによって裂開帯の細胞の正常な機能を様々な程度まで妨害するタンパク質またはポリペプチドを産生するものを含んでなる組換えＤＮＡで形質転換することによって生成する。裂開、特に果実の裂開の開始を遅らせることによって、種子の収穫前の実零れを減少させまたは防止することができることは、成熟前（すなわち、収穫前）の種子の損失の被害を受ける植物に適用することができるであろう。本発明の好ましい態様では、ＤＺに選択的なキメラ遺伝子は転写されるＤＮＡ領域を含んでなり、この領域はＲＮＡに転写され、ＤＺの細胞中でのその産生により、内在性遺伝子、好ましくは細胞壁ヒドロラーゼ、特にエンド−ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＺの細胞中での発現を減少させ、阻害し、または防止する。内在性遺伝子の発現の減少は、内在性遺伝子によって普通に産生されるｍＲＮＡの細胞質濃度の減少によって示すことができる。植物から単離される内在性遺伝子は、以後はセンスｍＲＮＡ（またはセンスプレ−ｍＲＮＡ、すなわちイントロン領域を含むことかできる未加工のｍＲＮＡ）をコードするセンス遺伝子と呼ぶ。内在性のセンス遺伝子は、細胞壁加水分解に関与する酵素、好ましくは、ペクチン分解酵素、例えばペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、ポリガラクツロナーゼなど、および特にエンド−ＰＧをコードする。ペクチン分解酵素、特にエンド−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁の中間ラメラ材料の分解および裂開の過程において重要な役割を果たしており、裂開帯または裂開帯の周りの領域におけるこれらの酵素の産生の選択的阻害（例えば、エンド−ＰＧコードｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡの発現による）は、莢実零れを少なくとも１日、好ましくは２〜５日間遅らせるものと考えられる。センス遺伝子は、裂開の過程中にＤＺの細胞によって分泌され且つ所定の裂開帯において細胞壁材料の分解に関与する任意の細胞壁ヒドロラーゼ、例えばセルラーゼ、グルカナーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼをコードすることができるが、センス遺伝子は内在性のＤＺに選択的な遺伝子であるのが好ましい。したがって、本発明の一つの態様では、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、センスｍＲＮＡまたはセンスプレｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードする。このようなアンチセンスＲＮＡは、センスＲＮＡ（またはセンスプレ−ｍＲＮＡ）に向けられていると言われる。これに関して、コードされるアンチセンスＲＮＡは、センスｍＲＮＡまたはセンスプレｍＲＮＡの一部、好ましくは長さが少なくとも５０塩基の、好ましくは長さが少なくとも１００〜１０００塩基の連続的伸長部に相補的な領域を含んでなる。もちろん長さが完全な長さのセンスプレ−ｍＲＮＡであるセンスＲＮＡに、または植物細胞によって産生される（センスプレ−ｍＲＮＡから加工することができまたは加工することができない）完全な長さのセンスｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの領域の長さの上限を用いることができる。しかしながら、アンチセンスＲＮＡは、センスプレ−ＲＮＡおよび／または加工されたセンスｍＲＮＡの配列の任意の部分に相補的であることができ、これは５′末端またはキャッピング部位の基部の配列、５′未翻訳領域の部分または全部、センスプレ−ｍＲＮＡのイントロンまたはエキソン領域（またはエキソンとイントロンを架橋する領域）、非コードおよびコード領域を架橋する領域、コード領域の３′末端を含むコード領域の全部または一部、および／または３′未翻訳領域の全部または一部に相補的であることができる。センス遺伝子が遺伝子群の一員である場合には、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子によってコードされるアンチセンスＲＮＡが少なくとも５０ヌクレオチドのセンスＲＮＡ、例えばＤＺに選択的なセンスＲＮＡの領域に相補的であり、且つこの遺伝子群の任意の他の一員によってコードされる任意のセンスＲＮＡの５０ヌクレオチドの任意の領域との配列同一性（前記参照）が５０％未満であり、好ましくは３０％未満である配列を含むのが好ましい。本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子における転写されるＤＮＡ領域は、センスｍＲＮＡまたはセンスプレ−ＲＮＡの極めて特異的な開裂を行うことができる特異的なＲＮＡ酵素またはいわゆるリボザイム（例えば、ＷＯ８９／０５８５２号明細書参照）をコードすることもできる。このようなリボザイムは、センスＲＮＡ（またはセンスプレ−ｍＲＮＡ）に向けられていると言われている。植物においてセンスｍＲＮＡを産生する内在性遺伝子の発現は、このようなセンスＲＮＡの一部または全部、好ましくは全部をコードするＤＺに選択的なキメラ遺伝子によって阻害または抑制することもできる[Jorgensen et al．(1992)， AgBiotech News Info 4: 265N]。本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子によってコードされるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムが向けられているセンスＲＮＡは、好ましくはｍＲＮＡであって、このようなｍＲＮＡの（二本鎖の）ｃＤＮＡが配列番号１（または配列番号１０）のヌクレオチド配列またはその変異体を含んでなるものである。本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子によってコードされるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムが向けられるセンスＲＮＡに対応するｃＤＮＡの好ましい領域は、ヌクレオチド８９０〜９５０の間のどこかで出発し、ヌクレオチド１５６０〜１６２０の間のどこかで終わるヌクレオチド配列番号１のヌクレオチド配列、例えばヌクレオチド９５２〜１６０７の間のヌクレオチド配列を含んでなるが、これに限定されない。本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子によってコードされるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムが向けられるセンスＲＮＡに対するｃＤＮＡのもう一つの好ましい領域は、ヌクレオチド１２８０〜１３４０の間のどこかで出発し、ヌクレオチド１５６０〜１６２０の間のどこかで終わる配列番号１のヌクレオチド配列、例えばヌクレオチド１２９６〜１６０７の間のヌクレオチド配列を含んでなるが、これに限定されない。前記のように、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードするＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、好ましくはＤＺに選択的なプロモーターによって制御される。特に有用なＤＺに選択的なプロモーターは、前記のＤＺに選択的な遺伝子からのプロモーター、特に位置１〜２，３２６の間の配列番号１３の５′調節領域内に含まれるプロモーターである。しかしながら、ＤＺに選択的な遺伝子が内在性のＤＺに選択的な遺伝子、好ましくはエンド−ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子によって産生されるセンスＲＮＡをコードする場合には、ＤＺに選択的なキメラ遺伝子のプロモーターは、ＤＺに選択的なプロモーターである必要はない。しかしながら、そのような場合には、ＤＺに選択的な遺伝子は少なくともＤＺの細胞中で発現するものであるべきである。実際に、センスＲＮＡはＤＺの細胞中で選択的に産生されるので、ＤＺの細胞以外の細胞中でＤＺに選択的な遺伝子によってコードされるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの産生は、そのような細胞に対して顕著な表現型効果を有さない。少なくともＤＺの細胞で発現するプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ転写体のプロモーター（Ｐ３５Ｓ）[Guilley et al．(1982)，Cell 30: 763]、またはAgrobacterium tumefaclens のノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）のような本質的な植物で発現可能なプロモーター[Depicker et al. (1982)，J．Mol．Appl．Genet．1: 561]である。本発明のもう一つの好ましい態様では、ＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、ｍＲＮＡであって、植物細胞で産生されると、植物細胞の代謝および／または生理を妨げるタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるものをコードする。ほとんどの場合に、このようなタンパク質またはポリペプチドの産生はＤＺ細胞以外の細胞では好ましくなく、これに関して、このようなキメラ遺伝子はＤＺに選択的なプロモーターを含んでなるのが好ましい。特に有用なＤＺに選択的なプロモーターは、これもまた前記のＤＺに選択的な遺伝子からのプロモーターである。本発明の一つの態様では、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、細胞内で生物学的に活性なオーキシンまたはオーキシン類似体を増加させる活性のタンパク質をコードする転写されるＤＮＡ領域を含んでなる。このようなタンパク質は、例えばそれぞれAgrobacterium tumefaciens Ｔ−ＤＮA遺伝子１（ｉａａＭ）および／または遺伝子２（ｉａａＨ）によってコードされるトリプトファンモノオキシゲナーゼおよび／またはインドール−３−アセタミドヒドロラーゼのように、オーキシンの生合成に関与していることがあり[Gielen et al．(1984)，The EMBO J．3: 835]、またはArabidopsis thaliana ＩＬＲ１遺伝子によってコードされるアミドヒドロラーゼであることがあり、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）−抱合体から活性なＩＡＡを放出する[Bartel and Fink(1995)，Science 268: 1745]。莢裂開前のＩＡＡ濃度減少の観察を考慮すれば（例１を参照）、植物のＤＺ細胞での選択的なこのようなオーキシン増加タンパク質の産生は、ＩＡＡの過剰生産により細胞を殺さず、観察された減少前に見られたように実質的にＩＡＡの濃度を保持および／または回復すると思われる。これは、裂開帯の細胞によって普通に産生される細胞壁加水分解酵素の産生および／または活性のＩＡＡによる長時間の阻害によって、莢裂開の開始を遅延させる。また、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子の転写されるＤＮＡ領域は、Agro bacterium rhizogenes ｒｏｌＢ遺伝子のオープン・リーディング・フレームを含んでなることもできる[Fumer et al．(1986)，Nature 319: 422]。植物におけるこのようなＤＺに選択的なキメラ遺伝子の発現により、莢ＤＺの細胞中のｒｏｌＢ遺伝子生成物の産生によりオーキシンに対する植物細胞の感受性が増加し、これにより莢実零れ前のＤＺでのＩＡＡ濃度の通常の減少が抑えられる。本発明のもう一つの態様では、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、エチレンを生成する植物細胞のエチレンに対する感受性を減少させる活性を有するタンパク質をコードする転写されるＤＮＡ領域を含んでなる。実際に、植物でのエチレンシグナル伝達経路に関与するいくつかの遺伝子が突然変異分析によって確認されており（例えば、ＥＴＲ１、ＥＴＲ２、ＥＩＮ４、ＥＲＳ、ＣＴＲ１、ＥＩＮ２、ＥＩＮ３，ＥＩＮ５、ＥＩＮ６、ＨＬＳ１、ＥＩＲ１、ＡＵＸ１、ＥＩＮ７）、それらの多くについて、対応する遺伝子がクローニングされている[Cha ng(1996)，TIBS 21: 123; Bleecker and Schaller(1996)，Plant Physiol．111: 653]。ＥＴＲ１、ＥＴＲ２、ＥＩＮ４、ＥＲＳは、いずれもエチレンレセプターをコードし、遺伝子の残りのものはレセプターの下流のエチレンシグナル伝達経路に関与していると考えられる[Ecker(1995)，Science 268: 667]。配列決定されたエチレンレセプターは、応答レギュレーター成分のレシーバードメイン、および／またはいわゆる細菌性２成分レギュレーターのセンサー成分のヒスチジンキナーゼドメインと相同性を有し、レシーバードメインの相同性のあるなしによって２群に分割される。群Ｉのエチレンレセプターはセンサーおよびレシーバーに相同性のドメインを両方とも含んでなり、例えばＥＴＲ１（アラビドプシス (Arabidopsis)）およびｅＴＡＥ１（トマト）が挙げられる。群IIのエチレンレセプターは、センサー成分のヒスチジンタンパク質キナーゼドメインと相同性のドメインだけを含んでなり、例えばＥＲＳ（アラビドプシス(Arabidopsis)）およびＮＲ（トマト）が挙げられる。同定された遺伝子の突然変異体対立遺伝子によってコードされるレセプターは、エチレンに優性不感受性を与える[Chang(199 6),同上；Bleecker and Schaller(1996)，同上]。したがって、ＤＺに選択的なキメラ遺伝子であって、エチレンを生成する植物細胞のエチレンに対する感受性を減少させる活性を有するタンパク質をコードする転写されるＤＮＡ領域を含んでなるものの例は、ＥＴＲ１−１のようなArabidopsis thalianaＥＴＲ１遺伝子の優性のエチレン不感受性の突然変異体対立遺伝子のオープン・リーディング・フレームを含んでなるものである[Chang et al．(1993)，Science 262: 539]。このようなＤＺに選択的なキメラ遺伝子を発現する植物は、ＤＺの細胞で選択的に突然変異体エチレンレセプター（ＥＴＲ１−１タンパク質）を産生し、したがってこれらの細胞は植物ホルモンエチレンに対して不感受性になり、莢裂開の開始前に観察されるエチレンクリマクテリックなどのホルモンの濃度の変化に（代謝的に）応答しない。また、前記の群Ｉのエチレンレセプターのいずれか一つの優性のエチレン不感受性の突然変異体対立遺伝子のオープン・リーディング・フレームを含んでなる転写されるＤＮＡ領域を同じ効果に用いることができると考えられる。ＤＺに選択的なキメラ遺伝子を発現する植物細胞にエチレン不感受性を付与するこれらのＤＺに選択的なキメラ遺伝子のもう一つの例では、Arabidopsis thalianaＥＲＳ遺伝子[Hua et al．(1995)，Science 269: 1712]またはトマトＮＲ遺伝子[Wilkinson et al．(1995)，Science 270: 1807] のような前記の群ＩＩのエチレンレセプターの任意の一つの優勢なエチレン不感受性の突然変異体対立遺伝子のオープン・リーディング・フレームを含んでなる転写されるＤＮＡ領域を同じ目的に用いることができる。また、前記のエチレンシグナル伝達経路に関与する遺伝子によってコードされる生成物の残りはレセプターの下流で作用すると思われる。ＣＴＲ１、ＥＩＮ２、およびＥＩＮ３について、遺伝子はクローニングされている[Ecker(1995)，Sc ience 268: 667]。前記遺伝子を標的とするＤＺに特異的なプロモーターの制御下で転写される裂開帯における後者の遺伝子の例えばアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムＲＮＡによる発現の調節は、エチレンに対する感受性にも影響する。本発明のもう一つの態様では、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、莢ＤＺの細胞のような植物細胞で産生され、このような細胞を殺すかまたは少なくともその代謝、機能、または発生を実質的に妨げるタンパク質またはポリペプチドをコードする転写されるＤＮＡ領域を含んでなる。このような転写されるＤＮＡ領域の例は、ＲＮアーゼＴ１および特にバルナーゼのようなリボヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列、ジフテリア毒素のＡ−ドメイン[Greenl and et al．(19 83)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80: 6853]またはPseudomonas 外毒素Ａを含んでなるものである。細胞毒性を有するタンパク質をコードするいくつかの他のＤＮＡ配列は、その既知の生物学的特性によって用いることができる。例としては、パパインのようなプロテアーゼ、グルカナーゼ、ホスホリパーゼＡ２のようなリパーゼ、脂質ペルオキシダーゼ、E．coli Ｄａｍメチラーゼのようなメチラーゼ、ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼのようなＤＮアーゼ、植物細胞壁阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の更にもう一つの態様では、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、植物細胞下ら分泌され、裂開帯（例えば、莢ＤＺ）で産生される少なくとも１種類のエンド−ポリガラクツロナーゼ、特に配列番号１のｃＤＮＡによってコードされるエンド−ＰＧの少なくとも活性を阻害することができるタンパク質またはポリペプチドをコードする転写されるＤＮＡ領域を含んでなる。本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子では、コードされるＲＮＡの５′未翻訳領域が通常はキメラ遺伝子のＤＺに選択的なプロモーターのようなプロモーターと関連しているのが好ましい。しかしながら、５′未翻訳領域は、別の植物で発現可能な遺伝子からのものであってもよい。したがって、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、ＤＺに選択的な遺伝子の完全な５′調節領域（５′未翻訳領域を含む）を含んでなることが好ましい。特に有用な５′調節領域は、配列番号１３の位置１，３２９のすぐ上流の領域、好ましくは少なくとも４９０ｂｐの領域、更に好ましくは位置２，３２９の上流の最初のＳｐｈＩ部位まで伸長する領域である。また、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子は、好ましくは３′未翻訳領域であって、植物細胞でのｍＲＮＡの正確にポリアデニル化させるものを含んでなる。これらのシグナルはポリガラクツロナーゼ遺伝子のような植物遺伝子化から得ることができ、または植物にとって異質な遺伝子から得ることができる。異種の３′転写終止およびポリアデニル化シグナルの例は、オクトピンシンターゼ遺伝子[De Greve et al．(1982)，J．Mol．Appl．Genet．1: 499]、ノナピンシンターゼ遺伝子[Depicker et al．(1982)，J．Mol．Appl．Genet．1: 561]、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子７[Velten and Schell (1985)，Nucl．Acids Res．13: 6998] などのシグナルである。好ましくは、ＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡは、通常のキメラマーカー遺伝子も含んでなる。キメラマーカー遺伝子はまた、植物で発ー可能なプロモーター、好ましくは構成的プロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、またはルビスコ(Rubisco)の小さなサブユニットをコードする遺伝子のプロモーターのような光で誘導可能なプロモーターの制御下で且つ５′末端で操作連結しており、且つ３′末端で好適な植物の転写終止およびポリアデニル化シグナルに操作連結しているマーカーＤＮＡを含んでなる。マーカーＤＮＡは、好ましくはＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドであって、植物の細胞で発現して、これらの細胞をマーカーＤＮＡが発現されない細胞から容易に分離することができるものをコードする。マーカーＤＮＡの選択は決定的なものではなく、任意の好適なＤＮＡを周知の方法で選択することができる。例えば、マーカーＤＮＡは、形質転換した植物細胞に識別可能な色を提供するタンパク質、例えばＡ１遺伝子(Meyer et al．(1987)，Nature 330: 677)をコードすることができ、耐ホスフィノスリシン性をコードするバー遺伝子のような形質転換した植物細胞に耐除草剤性を提供することができ（ＥＰ０，２４２，２４６号明細書）、または耐ゲンタマイシン性をコードするａａｃ（６′）遺伝子のような形質転換細胞に抗生物質耐性を提供することができる（ＷＯ９４／０１５６０号明細書）。本発明のＤＺに選択的なプロモーターは、ＤＺの細胞で遺伝子を発現させることに関する活性または効果が極めて特異的であると考えられる。しかしながら、キメラ遺伝子に含まれるプロモーターの特徴（例えば、組織特異性）は、このようなキメラ遺伝子で形質転換したいくつかの植物では僅かに改質することができる。これは、例えば、植物ゲノムにおけるランダム組込みの結果としての「位置効果」に起因することができる。したがって、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子で形質転換した幾つかの植物では、ある種の非−ＤＺ細胞でキメラ遺伝子の低水準の発現を観察することができる。したがって、場合によっては、植物ゲノムを、第二の植物で発現可能なプロモーターによって制御され且つＤＺに選択的なキメラ遺伝子の遺伝子生成物の活性を相殺し、防止しまたは阻害することができるＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードする第二の転写ＤＮＡ領域を含んでなる第二のキメラ遺伝子で形質転換することもできる。ＤＺに選択的なキメラ遺伝子がバルナーゼをコードするときには、第二のキメラ遺伝子がバースター、すなわちバルナーゼの阻害剤をコードする[Hartley(1988)，J．Mol．Biol．202: 913]。第二のキメラ遺伝子によってコードされる他の有用なタンパク質は、抗体または抗体断片、好ましくは一本鎖抗体であって、ＤＺに選択的なキメラ遺伝子によってコードすることによって生物学的に不活性化されるタンパク質に特異結合することができるものである。好ましくは、第二のプロモーターは、植物の少なくとも非ＤＺ細胞において第二の転写されるＤＮＡ領域の発現を駆動して、幾つかの形質転換した植物の細胞中のＤＺに選択的なキメラ遺伝子の低発現の好ましくない効果を相殺し、防止し、または阻害することができる。有用な第二のプロモーターの例は、ＣａＭＶ最小３５Ｓプロモーター[Benfey and Chua(1990)，Science 250: 959]、またはAgrob acterium tumefaciens Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーターである[Depicker et al．(1982)，J．Mol．Appl．Genet．1: 561]。他の有用なプロモーターは、ＤＺでは活性を持たないことが知られている遺伝子、例えば配列番号７、配列番号９、または配列番号１１の配列を含んでなるｃＤＮＡを調製することができるｍＲＮＡをコードするBrassica napus遺伝子からのプロモーターである。植物では、第二のキメラ遺伝子は、好ましくはＤＺに選択的なキメラ遺伝子と同じ遺伝子座であって、その結合分離を確実にしている。これは、ベクターまたは同じＴ−ＤＮＡの一部のような単一の形質転換ＤＮＡ上で両者のキメラ遺伝子を結合することによって得ることができる。しかしながら、幾つかの場合には、結合分離は、常に望ましいものではない。したがって、両構築物が別個の形質転換ＤＮＡ上に存在して、形質転換により植物ゲノムの異なる位置に２個の構築物を組み込むようにすることができる。本発明の更にもう一つの態様では、改良された裂開特性を有する植物を単一の植物細胞からこの細胞を既知の方法で形質転換することによって得て、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を核ゲノムに安定に取り込むことができる。ＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡは、植物、特にAgroba cterium によって媒介される形質転換を受け易い植物の核ゲノムに安定に取り込むことができる。遺伝子伝達は、無害化したＴｉ−プラスミドであって、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含んでなり、Agrobacterium に含まれているベクターを用いて行うことができる。この形質転換は、例えば欧州特許第０，１１６，７１８号明細書に記載の手順を用いて行うことができる。Ｔｉ−プラスミドベクター系は、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列の間にまたは右Ｔ−ＤＮＡボーダーの少なくとも左にＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含んでなる。あるいは、任意の他の種類のベクターを用いて、（例えば、欧州特許第０，２３３，２４７号明細書に記載の）直接遺伝子伝達、（例えば、欧州特許第０，２７０，３５６号明細書、ＷＯ８５／０１８５６号明細書、および米国特許第４，６８４，６１１号明細書に記載の）花粉によって媒介される形質転換、（例えば、欧州特許第０，０６７，５５３号明細書、および米国特許第４，４０７，９５６号明細書に記載の）植物ＲＮＡウイルスによって媒介される形質転換、（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号明細書に記載の）リポソームによって媒介される形質転換などの方法を応用して植物を形質転換することができる。例えば、Fromm et al［(1990)，Bio/Technology 8: 833］およびGordon-Kamm et al．[(1990)，The Plant Cell 2: 603]によって記載されている微量投射衝撃 (microprojectile bombardment)のような他の方法も、同様に好適である。主要な穀物などの単子葉植物の細胞も、ＷＯ９２／０９６９６号明細書に記載の方法でコンパクトな胚形成カルスを形成することができる傷をつけたまたは酵素分解した完全な組織、またはそれから得られる胚形成カルスを用いて形質転換することもできる。次いで、生成する形質転換植物細胞を用いて、通常の方法で形質転換した植物を再生させることができる。得られた形質転換植物を、通常の育種計画で用いて、同じ特徴を有する更に形質転換した植物を産生させ、または同一または関連植物種の他の品種に本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を導入することができる。形質転換植物から得られる種子は、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を安定なゲノムインサートとして含んでいる。下記の例では、Brassica napus化らのＤＺに選択的なキメラ遺伝子の単離および特性決定、ＤＺに選択的なプロモーター、および植物の裂開特性の改良のためのこのようなプロモーターの使用を説明する。例では、特に断らない限り、全ての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al．（1989）分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第２版、Cold Spring Harbor L aboratory Press、ニューヨーク、およびAusubel et al．（1994）分子生物学の最新のプロトコール、最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Bi ology，Current Protocols)、米国の第１および２巻に記載の標準的方法によって行う。植物の分子研究の標準的材料および方法は、植物分子生物学の実験室速報(Plant Molecular Biology Labfax)（１９９３年）、R.D.D．Croy著、BIOS Sc ientific Publications Ltd（英国）およびBlackwell Scientific Publications、英国から共同公表、に記載の標準的方法にしたがって行う。例および本発明の説明において、配列表の下記の配列を参照する。配列番号１： Brassica napusのエンド−ポリガラクツロナーゼをコードするＤＺに選択的なｃＤＮＡ配列番号２：オリゴヌクレオチドＰＧ１配列番号３：オリゴヌクレオチドＰＧ２配列番号４：オリゴヌクレオチドＰＧ３配列番号５：オリゴヌクレオチドＰＧ５配列番号６：ＰＣＲ断片ＢＰＧ３２−２６配列番号７：ＰＣＲ断片ＫＰＧ３２−８配列番号８：ＰＣＲ断片ＬＰＧ１２−１６配列番号９：ＰＣＲ断片ＬＰＧ３２−２４配列番号１０：ＰＣＲ断片ＬＰＧ３２−２５配列番号１１：ＰＣＲ断片ＬＰＧ３２−３２配列番号１２：ｐＧＳＶ５のＴ−ＤＮＡ配列番号１３： Brassica napusのエンドポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現を駆動するＤＺに選択的なプロモーター領域を含んでなるゲノムクローンの配列本発明およびその利益を更に例示するため、下記の具体例を示すが、これらは例示のためのものであり、限定的なものではない。例１莢発生中の莢裂開の特性決定内在性ホルモンのプロフィール Brassica napus cv Fido植物を、未加熱温室で生育させた。発芽化ら１２日目に、植物を１０００ｃｍ³コンポストに移して、更に莢を開花から２〜８週間後に１週間の間隔で集めた。莢を最初の３個の軸方向の総状花序の末端の一つの基部から取った。莢を、裂開帯、莢壁、および種子に分離した。試料を乳鉢と乳棒とで粉砕した後、−２０℃で８０％メタノールの総量中で１６時間抽出した。植物ホルモンの精製および分析は、本質的に文献記載の方法で行った[Bialek and Cohen(1989)，Plant Physiol．90: 398; Prinsen et al． (1991)，細胞および分子植物生物学の実験室ガイド(A Laboratory Guide for Ce llular and Molecular Plant Biology)、Negrutiu and Gharti-Chhetri 監修、B irkhaeser Verlag 、バーゼル／ボストン／ベルリン、１７５から１８５頁；Cha uvaux et al．(1993)，J．Chromatogr．A 657: 337]。莢の様々な部分（莢壁、裂開帯、および種子）をエチレン前駆体である１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）およびその抱合体の内在性濃度、並びにインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）およびその抱合体についてスクリーニングした。エチレン発生のピーク［Meakin and Roberts(1990)，J．Exp．Bot．41: 1003 も参照されたい］を、莢実零れの直前に観察し、このピークを遊離ＡＣＣの観察ピークと相関させた。特に、裂開帯では、莢開放の開始直前にＩＡＡ濃度（遊離並びに抱合体）の減少を観察した。このＩＡＡ濃度の減少は、裂開帯におけるセルラーゼ活性の増加と特異的に相関した。もう一つの実験では、莢を酵素ＡＣＣシンターゼの競合的阻害剤であるアミノエトキシビニルグリシン（ＡＶＧ）で莢を処理することによって阻害した。ＡＶＧは、開花から２８日後に５００ｍｌ／ｌで適用した。この処理により、全莢でのエチレン生成が４０〜５０％減少し、莢壁裂開も約４日間遅れた。処理した莢の裂開帯および種子の内在性ＡＣＣ濃度の減少は、エチレン生成の減少と相関した。分析を行った他の組織（莢壁、隔膜、および裂開帯と莢壁との間の帯）では、前記のようなＡＣＣ濃度または合成の減少は見られなかった。莢開放前の裂開帯での内在性ＩＡＡ含量の減少は、コントロールおよびＡＶＧで処理した植物のいずれでもこれらの実験でも見られた。莢実零れにおけるオーキシンの発生を検討するため、合成オーキシンである４ −クロロフェノキシ酢酸（４ＣＰＡ）を用いてオーキシン濃度を操作した。４ＣＰＡを開花から３５日後に１５０ｍｇ／ｌのスプレーとして適用し、全期間中オーキシン濃度を高水準に人工的に保った。これにより、莢実零れの傾向が顕著に遅れ（表１を参照）、莢壁の老化も約２週間遅れた。内在性植物ホルモン濃度には、影響は全くなかった。しかしながら、β- グルカナーゼ活性は、裂開帯で著しく減少した。これらの結果は、β- グルカナーゼの生成および／または活性に対するオーキシンの阻害効果を明らかに示している。オーキシンの減少は、莢実零れの主因である。莢裂開帯におけるポリガラクツロネート分解酵素活性の例示油料種子アブラナｃｖＦｉｄｏの莢を開花後６．５週目に収穫し、心皮と種子を取りだし、粗製酵素抽出物を維管束および長角果の２個の室を分離する薄膜を有するレプルムを含む裂開帯の周囲の組織から調製した。次いで、抽出物を、それぞれ沸騰した（対照物として使用）および活性な酵素調製物とともにインキュベーションした基質のゲル浸透クロマトグラフィーに基づいて分子量ダウンシフト分析法を用いてポリマー性基質（ウロン酸）に対するその作用に関して試験した。この分析法では、特にエキソ方式で単一の単糖類の除去としてのエンド活性を有する酵素が、ポリマー性基質の分子量分布を極めてゆっくりと変化させるだけであることを見いだしている。ウロン酸に対する分析は、本質的にBlumenkr antz and Asboe-Hansen[(1973)，Anal．Biochem．54: 484]によって記載された方法で行った。この分析法は、本明細書では、厳密に定性的な意味において酵素活性の存在を示すためだけに用いた。油料種子アブラナの莢からのＤＺ調製物は、低メチル化度のペクチン性ポリマーの完全な脱重合に要する全ての酵素活性を含んでいる。この酵素混合物の１成分は、ポリガラクツロネートポリマーに特異的に作用していることがわかった。既知の植物酵素のうちでエンド−ポリガラクツロナーゼのみが、用いたポリガラクツロネート調製物の分子量ダウンシフトに関与していることも示された。エンド−ポリガラクツロナーゼは、莢裂開中に見られる中間のラメラ材料の広範な分解に重要な役割を果たしていると結論する事ができる。裂開の過程中の組織観察莢組織の構造の詳細な検討により、裂開帯で起こる生化学過程に関する組織変化の知見が更に得られた。電子顕微鏡により、莢壁の速やかな脱水により裂開帯、中果皮、隔膜、および種子落果帯に位置した柔細胞の分解が直ちに進行することが観察された。分解の最初の兆候は、細胞壁の膨潤によって示された。次の細胞分離は、裂開帯だけで見られ、中間ラメラの線に沿って起こり、続いて細胞壁の微小原繊維の分散が観察された。最後に、裂開帯の全ての細胞が分離することが観察されたが、莢の２個のバルブは裂開帯を通過する維管束ストランドだけによって付着したままであった。電子顕微鏡を用いて分析したところ、莢開放中に中間ラメラの極めて劇的な分解が見られたが、主要な細胞壁は幾らかの薄化および軟化過程を除き、本質的に完全なままであった。これらの観察は、主要な細胞壁における全ての過程は、中間ラメラの分解にとって補助的なものであることを示している。裂開帯における細胞の中間ラメラの完全な溶解は、エンドＰＧのようなペクチン分解酵素の存在を示している。このような酵素は、中間ラメラペクチンの充填部分を分解するが、中性ポリマーに親和性を有する他の多糖類ヒドロラーゼは、中間ラメラの脱重合に関与している。 β−ガラクタナーゼおよびβ−グルカナーゼを均質に精製した。基質特異性の詳細な検討を行ったところ、これらの酵素は裂開帯における主要な細胞壁の薄化に関与していた。例２ Brassica napus からのＤＺに選択的なエンド−ポリガラクツロナーゼｃＤＮＡクローンの単離 Brassica napus cv Topaz 植物の莢裂開帯のポリ−Ａ⁺ｍＲＮＡを、次のようにして調製した。組織（葉、裂開帯、莢壁、根または茎）２０ｇを液体窒素中で粉砕し、Waringブレンダー中で抽出緩衝液（４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％サルコシル、０．１Ｍ２ーメルカプトエタノール）１００ｍｌを用いて３０秒間ホモゲナイズした。ホモゲネートを新しい試験管に移して、２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０を１／１０容と、ＴＥ飽和フェノール／クロロホルム１容を加えた。溶液を激しく振盪し、氷上で１５分間冷却し、４℃で１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。上清を前記のようにしてフェノール／クロロホルムで再度抽出した。等容のイソプロパノールを再抽出した上清に加えて、−２０℃で一晩インキュベーションすることによってＲＮＡを沈澱した。１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、ＲＮＡペレットを変性緩衝液２ｍｌに溶解した。次に、４ＭＬｉＣｌ１４ｍｌを加えて、溶液を氷浴に一晩保持した。ＲＮＡを１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離することによってペレット化し、８０％エタノールで洗浄し、乾燥して、水１ｍｌに溶解した。ポリ−Ａ⁺ＲＮＡを、製造業者の指示によりオリゴ−ｄ（Ｔ）セファロースカラム上で単離した（Boehringer，マンハイム）。ランダムまたはオリゴ−ｄ（Ｔ）感作した第一の鎖状ｃＤＮＡの合成は、Ｍ− ＭＬＶ逆転写酵素と、製造業者（Life Technologies/BRL ）によって略記された条件にしたがって前記の方法で調製した全ポリ−Ａ⁺ＲＮＡ６μｇをもちいて行った。第一の鎖状ｃＤＮＡを、次のＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。４種類の縮重したプライマーを、トマト[DellaPenna et al．(1986)，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 83: 6420; Grierson et al．(1986)，Nucl．Acids Res．1 4: 8595]、トウモロコシ[Niogret et al．(1991)，Plant Mol．Biol．17: 1155] 、アボカドおよびエノセラ(oenothera)[Brown and Crouch(1990)，ThePlant Cel l 2：263]からの公表されたポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）アミノ酸配列からの保存領域に基づいて設計した。用いた４種類の配列（ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、およびＰＧ５）を、配列番号２〜５に示す。ＥｃｏＲＩに対する制限酵素部位を２個の上流プライマーＰＧ１およびＰＧ３の５−末端に導入し、ＢａｍＨＩ部位を２個の下流プライマーＰＧ２およびＰＧ５の５−末端に導入した。全てのＰＣＲ反応は、下記の最終組成を有した。５０μｌの反応容積中、５０ｍｌＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭＭｇＣｌ、および０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、縮重プライマー１００ｐＭ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１Ｕ。鋳型ＤＮＡを１ｘＰＣＲ反応緩衝液中で９５℃で３分間初期変性した後、ＰＣＲ反応を１ｘＰＣＲ緩衝液（ホットスタートＰＣＲ）中でＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１Ｕを加えることによって下記の条件で開始した。９５℃１分間、４５℃１分間、および７２℃１分間、３５サイクルの後、７２℃３分間。ホット・スタート・ネステドＰＣＲのため、ＰＣＲ反応２リットルを新しいＰＣＲ反応で鋳型として適用した。ＰＣＲ生成物をクロロホルム抽出し、エタノール沈澱し、ＴＥに再溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。制限されたＰＣＲ生成物を低融点アガロースから精製し、ＢａｍＨＩおよびEｃｏＲＩで切断したｐＧＥＭ−７ｚにクローニングした。ＰＣＲ断片のＤＮＡ配列は、Sequenase ve rsion 2.0（Pharmacia）を用いるジデオキシ連鎖終止法によって得た。最長のＰＣＲ断片は、ＰＧ３／ＰＧ２、ＰＧ１／ＰＧ２、またはＰＧ３／ＰＧ５プライマーの組み合わせを用いて、少量のＰＧ１／ＰＧ５ＰＣＲ反応を鋳型として用いて行った。７個の高度に多様化したＰＧ関連クローンがＰＣＲ生成物の配列決定によって確認され、少なくとも７個の異なるＰＧイソ型(isoforms)が存在することを示していた。３種類の形態は、単一の組織だけから得られ、すなわち裂開帯から１ｐｇ３２−２５（配列番号１０）、莢壁からＫｐｇ３２−８（配列番号７）、および葉からｂｐｇ３２−２６（配列番号６）が得られた。Ｌｐｇ３２−３２（配列番号１１）、１ｐｇ３２−２４（配列番号９）は、２個の莢組織だけで見られ、１ｐｇ１２−１６（配列番号８）は、分析した３種類の組織全てで得られた。１ｐｇ３５−８（位置８８４〜１，２４５の配列番号１のＤＮＡ配列を含む）は、ＰＧ３／ＰＧ５プライマーの組み合わせをネステドＰＣＲ反応に用いるときに、裂開帯で確認された唯一の型であった。根、茎、葉および胚軸における並びに莢発生中のＰＧ関連ＰＣＲクローンの発現を、下記のようにノーザン分析によって検討した。個々の組織の総ＲＮＡを、０．６６Ｍホルムアルデヒド／１％アガロースゲル中でゲル電気泳動によって分離した[Sambrook et al．(1989),同上]。ＲＮＡをHybond-Nフィルターに移して、紫外線照射によってフィルターに固定した。フィルターを、５ｘデンハート、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．１％ピロホスフェート、７５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、および１００μｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中で６８℃でプレハイブリダイゼーションを行った。ＰＣＲ生成物を放射能標識し、熱変性し、プレハイブリダイゼーション緩衝液に直ちに加えた後、ハイブリダイゼーションを６８℃で1６時間継続した。フィルターをSambr ook et al．[(1989),同上]にしたがって洗浄し、最後の洗浄は６８℃で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で行った。フィルターを、増強スクリーンを用いて− ８０℃でオートラジオグラフィーを行った。１ｐｇ３５−８クローンにハイブリダイズする転写体は、根、茎、葉、および胚軸から単離した総ＲＮＡでは検出できなかった。しかしながら、１ｐｇ３５− ８クローンは、分析を行った全ての段階で裂開帯で独占的に発現し且つ５週間後には、劇的に増加して多量に見いだされる１．６〜１．７ｋｂの転写体にハイブリダイズした。ＤＺに選択的なｃＤＮＡは、開花後６週間目に裂開帯から単離されたポリ−Ａ⁺ ＲＮＡ５μｇを用いてLambda ZAP⁽ ^{登録商標)}II挿入ペクター(Stratagene)で構築した。１ｋｂｐより大きなｃＤＮＡを低融点アガロースゲルから精製し、Lamb da ZAP^{（登録商標）}IIペクターに連結した。主ライブラリーは、１．２５ｘ１０６ｐｆｕからなり、平均ｃＤＮＡインサートサイズは約１．５ｋｂｐであった。ライブラリースクリーニングは、高緊縮条件下で標準的手続きにしたがって行った[Sambrook et al．(1989)，同上]。ｃＤＮＡは、Sequenase v．2.0（Amersham）を用いて配列決定した。配列分析は、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージｖ．７[Devereux et al．(1984)，N ucl．Acids Res．12: 387]。３００，０００のプラークを１ｐｇ３５−８ＰＣＲ−断片をプローブとしてスクリーニングしたところ、約２００の陽性ハイブリダイゼーションシグナルが得られた。５個の強力にハイブリダイズしているプラークを精製して均質にした。インサートＤＮＡをラムダベクターから切除した後、制限酵素分析を行ったところ、１３００ｂｐのインサートを有するものだけを除き、全てのｃＤＮＡクローンに約１６００ｂｐのｃＤＮＡインサートを示した。４個の最大のｃＤＮＡインサート（それぞれＸ、５、９および１１と命名）の制限酵素マッピングでは、４個のｃＤＮＡインサート間に微小な差異を示した。最も注目すべきことは、ｃＤＮＡクローンＸおよび１１におけるＮｓｉＩ制限酵素部位の存在、およびｃＤＮＡクローン９におけるＨｉｎｄＩＩ部の存在である。対照的に、ｃＤＮＡクローン５には、これらの制限部位は全くない。５′および３′ｃＤＮＡ末端の部分配列決定を行ったところ、異なるｃＤＮＡクローンの間に小さな欠失／挿入を含む追加の配列変更が明かとなった。これらの結果は、異なるが高度に均質なＰＧコード遺伝子の裂開帯での発現を示している。配列データーは、より大きな４個のｃＤＮＡインサートは全てＰＧタンパク質に対する完全コード配列を含むことも示していた。ｃＤＮＡクローンＸの完全配列およびその最大のオープン・リーディング・フレームの推定アミノ酸配列を、配列番号１に示す。オープン・リーディング・フレームは、大きさが４３３アミノ酸で、分子量が４６．６ｋＤであり、既知のエンドポリガラクツロナーゼにかなりの類似性を有するタンパク質をコードする。他の細胞壁ヒドロラーゼと同様に、推定されるＤＺに選択的なエンド−ＰＧは、同時翻訳的に開裂するＮ−末端シグナルペプチドを含む前駆体として最初に生成する。最も有望な開裂部位は、アミノ酸２３と２４との間に位置し、推定分子量が４４．２ｋＤの成熟タンパク質を生じる。ｃＤＮＡクローンＸをプローブとして用いるノーザン分析により、以前に得た発現パターンを確認して、伸長した。総ＲＮＡを、莢の様々な組織（裂開帯、莢壁、種子および隔膜）から、５個の時点（開花後（ＷＡＡ）２、３、５、７および９週間）で、記載の方法で調製した。総ＲＮＡ５μｇをゲル電気泳動によって分離して、配列番号１の放射能標識したｃＤＮＡをプローブとして前記の緊縮条件下でハイブリダイズした。一晩暴露した後、オートラジオグラムを展開した。２ＷＡＡでは、シグナルは検出されず、３ＷＡＡでは、微かなシグナルが観察された。デンシトメトリースキャンニングおよび読みとりに基づき、５ＷＡＡの時点で測定した発現水準は、３ＷＡＡで見られた量の約３．５倍であり、７ＷＡＡでは、３ＷＡＡで見られた量の約７倍であり、９ＷＡＡでは、３ＷＡＡで見られた量の約１２倍であった。莢壁または種子には、シグナルは検出されなかった。隔膜では、９ＷＡＡで微かな発現（３ＷＡＡでのＤＺにおける水準に匹敵する）が測定された。この実験に用いたＲＮＡを、莢の発生に約９週間を要した植物のそれぞれの組織から抽出した。例３ｃＤＮＡクローン１ｐｇ３５−８に対応するB．napusゲノムクローンからのＤＺに選択的なプロモーターの単離 Escherichia coli NM538株の市販のラムダＥＭＢＬ３Brassica napus cv．Bri dger ゲノムライブラリー(Clontech Laboratories，Inc.)を、下記の方法でスクリーニングした。Hybond-Nナイロン膜に移した後、１ｐｇ３５−８ｃＤＮＡをランダムプライミングを用いて放射能標識し、フィルターを５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート、０．５％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌニシンＤＮＡ（１ｘＳＳＰＥ、０．１８ＭＮＡＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．７、１ｍＭＥＤＴＡ）中で高緊縮条件下でハイブリダイズし、高緊縮条件下で（６８℃、０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、最終洗浄液中）洗浄した。約６００，０００のプラークをスクリーニングし、１１個のハイブリダイズするプラークを単離した。２個のハイブリダイズするプラーク、ラムダ２および１１を、２回再スクリーニングした。２回目の再スクリーニングの後、ファージ溶解生成物を、マルトースなしで生育したE．coli NM538 上でラムダ２および１１から作成した。ラムダ２および１１からのＤＮＡ調製物をＳａｌＩで消化し、ゲル電気泳動に付し、HybondN ナイロン膜に移した。標識した１ｐｇ３５−８ｃＤＮＡクローンを用いてハイブリダイゼーションしたところ、いずれのクローンにも同一のハイブリダイゼーションパターンを得た。強力にハイブリダイズする６．３ｋｂのＳａｌＩ断片をラムダ１１から単離して、ｐＵＣ１８に挿入し、マスタークローン６．３Ｓａｌを得た。６．３Ｓａｌを１ｐｇ３５−８に対応するものとして確認するため、配列決定プライマーを設計し、１ｐｇ３５−８に存在する２個の独特アミノ酸をコードするＤＮＡ伸長部の決定を行うことができた。Sanger法によるジデオキシ配列決定により、単離したゲノムクローン６．３Ｓａｌは、これに関して１ｐｇ３５ −８ｃＤＮＡと同一であることを確認した。このクローンの制限マッピングでは、これは全１ｐｇ３５−８オープン・リーディング・フレームをカバーし、更に約１００〜２００ｂｐの下流配列と約３．５ｋｂの上流配列とを含むことを示していた。約２．３ｋｂの伸長部（プロモーター、５′未翻訳領域、およびオープン・リーディング・フレームの最初の２４個のヌクレオチドを含む）のＤＮＡ配列を決定し、配列番号１３に示す。ｃＤＮＡクローン（配列番号１）およびゲノムクローン（配列番号１３）が異なるB．napus栽培品種（それぞれ、cv．Topaz およびcv．bridger ）から単離されたことを考慮し、これらの配列の整列時に、重なりあう断片は１００％の配列同一性を示すことを意外にも見いだした。６．３Ｓａｌクローンに含まれる遺伝子に対応するＤＺに選択的な遺伝子の転写開始部位は、プライマー伸長分析[Sambrook et al．（1989）分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第２版、Cold Spr ing Harbor Laboratory Press 、ニューヨーク]、またはＲＡＣＥ−ＰＣＲ[In n is et al．（1990）ＰＣＲプロトコール：方法および応用の便覧(PCR Protocols : AGuide to Methods and Applications)、Academic Press，Inc.]のような一般にしられている手法を用いて決定される。５′ＵＴＬは、配列番号１３の位置２，２１９〜２，２２７の間に位置していると考えられる。詳細に確定され部位を指示された突然変異誘発法[Ausubel et al．(1994)，同上]を用いて、ＤＮＡ配列を改質して、コード配列のＡＴＧ翻訳開始コドンの周りに独特制限酵素（例えば、Ｎｃｏｌ）認識部位を作成する。これにより、ＤＺに選択的な遺伝子のプロモーター領域を目的とするＤＮＡ配列に直接融合させて、本発明のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を構築することができる。ＡＴＧ翻訳開始コドンの周りの独特制限部位の上流（すなわち、５′）の５００〜２，０００塩基対の間に配置された独特制限酵素認識部位を用いて、詳細に画定されたＤＮＡ断片を単離して、次いでこれをプロモーターカセット（以後、ＰＤＺと呼ぶ）であって、植物でのＤＺに選択的な発現を指示するものとして用いる。例えば、植物でのＤＺに選択的な発現を指示することができるＳｐｈＩ−ＮｃｏＩ断片（約２．０８ｋｂ）を次にプロモーターカセット（以後、ＰＤＺ１と表す）として用いる。下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなるＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺまたはＰＤＺ１−ｇｕｓ−３′ｎｏｓ）を構築する。 − ＰＤＺまたはＰＤＺ１：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる５′ 調節領域。 − ｇｕｓ： β−グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ断片[Jefferson et al．（1986）Proc．Natl．Acad．Sci．USA83: 8447]。 − ３′ｎｏｓ：ノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化部位を含んでなる３′未翻訳末端（「３'ｎｏｓ」）｛Depicker et al．(1982)，J．Mol．App l．Genet．1: 561]。植物でのＤＺに選択的な発現を指示することができる第二のプロモーターカセットは、十分に確立され部位を指示された突然変異誘発法を用いてＤＮＡ配列を改質して、コード配列のＡＴＧ翻訳開始コドンのすぐ上流の独特制限部位を作成した。この目的のため、ＡＴＧコドンのすぐ上流のＳｍａＩ部位を、配列番号１３の位置２３２７および２３２８におけるＡ−ヌクレオチドをＧ−ヌクレオチドに変更することによって処理した。約２．１ｋｂのＳｐｈＩ−ＳｍａＩ断片（以後、プロモーターカセットＰＤＺ２と呼ぶ）を、プラスミドｐＢ１１０１中のＧＵＳコード領域の上流のＳｍａＩ部位で融合させ、キメラＰＤＺ２−ｇｕｓ−３ ′ｎｏｓ遺伝子構築物を有するプラスミド（２．１ｇｕｓｐｇｅｍ７）を生じた。選択可能なキメラマーカー遺伝子ＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｏｃｓを構築した[D e Almeida et al．(1989)，Mol．Gen．Genet．218: 78]。これは、下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなる。 − ＰＳＳＵ： Arabidopsis thalianaリブロース−１，５−ビホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット１Ａコード遺伝子[Krebbers et al．(1988) ，Plant Mol．Biol．11: 745]。 − ｂａｒ：ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子の領域[Thompson et al．(1987)，The EMBO J．6: 2519]。 − ３′ｏｃｓ：オクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化部位を含んでなる３′未翻訳末端[De Greve et al．(1983),J．Mol．Appl．Genet．1: 499] 。あるいは、ＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７であって、３′ｏｃｓがＴ−ＤＮＡ遺伝子７のポリアデニル化部位を含んでなる３′未翻訳末端で置換されていることを除き、前記のキメラ選択可能なマーカー遺伝子と同一の断片を含んでなるものを構築した（３′ｇ７；Veltenand Schell(1985)，Nucl．Acids Res．13，6981] 。ＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ２−ｇｕｓ−３′ｎｏｓ；約４．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片としてクローニングした）、およびキメラマーカー遺伝子（ＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７）は、両方ともＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５のボーダー配列の間に配置されたポリリンカーに導入して、Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの間にＰＤＺ２−ｇｕｓ−３′ｎｏｓおよびｐＳｓｕＡｒａ− ｂａｒ−３′ｇ７キメラ遺伝子構築物を有するプラスミドベクターｐＴＣＯｌ５５を生じた。ｐＧＳＶ５はプラスミドｐＧＳＣ１７００[Comelissen and Vandew iele(1989)，Nucl．Acids Res．17: 833]から誘導されたが、このプラスミドとは、β−ラクタマーゼ遺伝子を含まず、且つそのＴ−ＤＮＡが配列番号２の配列を特徴とする点で異なっている。例４エンド−ＰＧプロモーターの制御下でのバルナーゼコード領域を有するキメラ遺伝子の構築下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなるＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−バルナーゼ−３′ｎｏｓまたはＰＤＺ１−バルナーゼ−３′ｎｏｓ）を構築する。 − ＰＤＺまたはＰＤＺ１またはＰＤＺ２：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる例３の５′調節領域。 − バルナーゼ： Bacillus amyloliquefaciencs のバルナーゼをコードするＤＮＡ断片[Hartley(1988)，J．Mol．Biol．202: 913]。ＤＺに選択的なキメラ遺伝子およびＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７またはＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｏｃｓキメラマーカー遺伝子を両方とも、例４のＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５のボーダ配列の間に配置されたポリリンカーに導入する。Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの間のＰＤＺ２−ｂａｒｎａｓｅ−３′ｎｏｓを、ｐＴＣ０９９におけるバルナーゼコード領域の上流のｐＴＡ２９プロモーターをＰＤＺ２プロモーターカセットに置き換えることによって構築した。このため、ＰＤＺ２を含んでなる２．１ｋｂ（平滑化）ＳｐｈＩ−ＳｍａＩ断片を、ｐＴＣＯ９９において成熟バルナーゼに対するコード配列の５′末端で加工されたＡＴＧ−コドンと重なりあっているＳｍａＩ部位から平滑化したＮｃｏＩ部位までと融合し、Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの間にＰＤＺ２−バルナーゼ−３′ｎｏｓキメラ遺伝子を有するプラスミドベクターｐＴＰＲ１を生じた。ｐＴＣ０９９のＴ−ＤＮＡベクター部分は、ＥｃｏＲＩリンカー（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）をポリリンカーのＳｍａＩ部位に挿入し、ＢｇｌＩＩリンカー（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）をポリリンカーのＮｃｏＩ部位に挿入した後、ｐＴＣＯ１１３［ＷＯ９６／２６２８３号明細書］のキメラｐＴＡ２９−バルナーゼ−３′ｎｏｓ遺伝子をポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位に導入することによって、ｐＧＳＶ５のベクター部分化ら誘導される。Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの間のｐＴＰＲ１のポリリンカー配列にキメラ選択可能なマーカー遺伝子ｐＳＳＵＡｒａ−ｂａｒ−３′ｇ７を導入すると、ｐＴＰＲ３が生じる。前記のＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ２−バルナーゼ−３′ｎｏｓ）に、Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの間のｐＴＰＲ１のポリリンカー中に挿入したノパリンシンターゼプロモーター（ｐｎｏｓ−バルナーゼ−３′ｇ７）の制御下でｂａｒｓｔａｒコード領域を含んでなるｐＴＣＯ１１３［ＷＯ９６／２６２８３号明細書］のＢｇｌＩＩ断片を伴っている追加のＴ−ＤＮＡベクター（ｐＴＰＲ２）を構築する。Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの間のｐＴＰＲ２のポリリンカー配列にキメラ選択可能なマーカー遺伝子ｐＳＳＵＡｒａ−ｂａｒ−３’ｇ７を導入すると、ｐＴＰＲ４が生じる。例５Ｔ−ＤＮＡ遺伝子１生成物またはｒｏｌＢ遺伝子生成物をコードするＤＺに選択的なキメラ遺伝子の構築下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなるＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−ｇ１−３′ｎｏｓ）を構築する。 − ＰＤＺまたはＰＤＺ１またはＰＤＺ２：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる例３の５′調節領域。 − ｇ１：遺伝子１にすぐ隣接している配列とそれぞれ同一または相補的な配列を含んでなる適当に設計されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得られるAgrobacterium tumefaciens トリプトファン２−モノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（ｉａａＭまたはＴ−ＤＮＡ遺伝子１生成物）[Gie len et al．(1984)，EMBOJ．3: 835]。 − ３′ｎｏｓ下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなる第二のＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−ｇ２−３′ｎｏｓ）を構築する。 − ＰＤＺまたはＰＤＺ１またはＰＤＺ２：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる例３の５′調節領域。 − ｇ２：遺伝子２にすぐ隣接している配列とそれぞれ同一または相補的な配列を含んでなる適当に設計されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得られるAgrobacterium tumefaciens インドール−３−アセタミドヒドロラーゼをコードするＤＮＡ断片（ｉａａＭまたはＴ−ＤＮＡ遺伝子２生成物）[G ielen et al．(1984)，EMBO J．3: 835]。 − ３′ｎｏｓＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−ｇ１−３′ｎｏｓ単独またはＰＤＺ−ｇ２ −３′ｎｏｓとの組み合わせ）およびＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｏｃｓまたはＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７キメラマーカーを両方とも例４のＴ−ＤＮＡベクターｐＧ３Ｖ５のボーダー配列の間に配置されたポリリンカーに導入する。下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなるもう一つのＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−ｒｏｌＢ−３′ｎｏｓ）を構築する。 − ＰＤＺ：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる例３の５′調節領域。 − ｒｏｌＢ： Agrobacterium rhizogenes ｒｏｌＢ遺伝子のオープン・リーディング・フレーム[Fumer et al．(1986)，Nature 319: 422]。 − ３′ｎｏｓＤＺに選択的なキメラ遺伝子、およびＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｏｃｓまたはＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７キメラマーカー遺伝子を両方とも、例４のＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５のボーダー配列の間に配置されるポリリンカーに導入する。突然変異体ＥＴＲ１−１をコードするＤＺに選択的なキメラ遺伝子の構築下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなるＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−ｅｔｒ−１−３′ｎｏｓ）を構築する。 − ＰＤＺまたはＰＤＺ１またはＰＤＺ２：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる例３の５′調節領域。 − ｅｔｒ１−１：突然変異体ｅｔｒ１対立遺伝子[Chang et al．(1993)， Science 262: 539]および適当に設計されたプライマーを含んでなる７．３ｋｂのゲノムＥｃｏＲＩ断片を有するプラスミドを用いるＰＣＲ増幅によって得られる５イントロンによって分離されたコード配列のエキソンを含んでなる２．７ｋｂの断片として単離されるArabidopsis thaliana ETR遺伝子[Chang et al．(199 3)，Science 262: 239]の支配的でエチレン不感受性の突然変異体対立遺伝子のオープン・リーディング・フレーム。 − ３′ｎｏｓＤＺに選択的なキメラ遺伝子、およびＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｏｃｓまたはＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７キメラマーカー遺伝子を両方とも、例４のＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５のボーダー配列の間に配置されるポリリンカーに導入する。例７配列番号１のｃＤＮＡを調製することができるｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＺに選択的なキメラ遺伝子の構築下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなるＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−アンチ−ＰＧ−１−３′ｎｏｓ）を構築する。 − ＰＤＺまたはＰＤＺ１またはＰＤＺ２：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる例３の５′調節領域。 − アンチ−ＰＧ−１：配列番号１のヌクレオチド位置１０〜１６００の領域によってコードされるＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ断片。 − ３′ｎｏｓこのために、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとポリアデニル化シグナル（下記に説明する）とのあいだでクローニングした配列番号１の完全配列に相補的なＤＮＡ配列を含んでなる３５Ｓ−アンチセンスＰＧ構築物のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、ＨｉｎｃＩＩおよびＸｈｏＩで消化して、ＰＤＺ２を含んでなる断片で置き換えた。ＤＺに選択的なキメラ遺伝子、およびＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７またはＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｏｃｓキメラマーカー遺伝子を両方とも、例４のＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５のボーダー配列の間に配置されるポリリンカーに導入する。下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなるもう一つのＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−アンチ−ＰＧ−２−３′ｏｃｓ）を構築する。 − ＰＤＺまたはＰＤＺ１またはＰＤＺ２：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる例３の５′調節領域。 − アンチ−ＰＧ−２：配列番号１のヌクレオチド位置２０〜７００の領域によってコードされるＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ断片。 − ３′ｎｏｓＤＺに選択的なキメラ遺伝子、およびＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｏｃｓまたはＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７キメラマーカー遺伝子を両方とも、例４のＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５のボーダー配列の間に配置されるポリリンカーに導入する。下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片を含んでなる更にもう一つのＤＺに選択的なキメラ遺伝子（ＰＤＺ−アンチ−ＰＧ−３−３′ｎｏｓ）を構築する。 − ＰＤＺまたはＰＤＺ１またはＰＤＺ２：ＤＺに選択的なプロモーターを含んでなる例３の５′調節領域。 − アンチ−ＰＧ−３：配列番号１のヌクレオチド位置８００〜１６００の領域によってコードされるＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ断片。 − ３′ｎｏｓＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７キメラマーカー遺伝子を両方とも、例４のＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５のボーダー配列の間に配置されるポリリンカーに導入する。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、配列番号１の完全配列に相補的なＤＮＡ配列、または配列番号１の３′末端の６７９ｂｐに相補的なＤＮＡ配列（Ａ６７）、または配列番号１の３′末端の３３６ｂｐに相補的なＤＮＡ配列（Ａ３０）、およびポリアデニル化シグナルを含んでなる３種類の他のアンチセンス構築物を構築した。ｃＤＮＡ−ライブラリークローンＸのｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片として切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（Stratagene,カリフォルニア、米国）に挿入した。完全な長さのｃＤＮＡを、このプラスミドからＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片として単離し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで消化したｐＲＴ１００ベクターに挿入した[Topfer et al．(1987)，Nucleic Acids Research 15，5890]。生成するプラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、クレノウポリメラーゼで処理し、自己連結した。配列番号１の３′末端の６７９ｂｐを含んでなるｃＤＮＡインサートを有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミドのＨａｅＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間のＳｍａＩ− ＸｈｏＩで消化したｐＲＴ１００ベクターに挿入して、プラスミドＡ６７を生成した。Ａ６７構築物をＸｂａＩおよびＳｔｙＩで消化して、クレノウポリメラーゼで処理し、自己連結したところ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間の配列番号１の３′末端の３３６ｂｐに相補的なＤＮＡ配列を含んでなるプラスミドＡ３０を生じた。キメラ遺伝子は、ＰｓｔＩ断片として単離された。３５Ｓ−アンチセンス−ＰＧキメラ遺伝子、およびＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｏｃｓまたはＰＳＳＵ−ｂａｒ−３′ｇ７キメラマーカー遺伝子を、例４のＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５のボーダー配列の間に配置されたポリリンカーに導入する。例８油料種子アブラナの形質転換および形質転換体の特性決定 Agrobacterium によって媒介される形質転換 Brassica napusの胚軸の外植を得て、培養して、下記の改質を除き、本質的に De Block et al．によって記載された方法で形質転換した[(1989)，Plant Physi ol.91: 694]。 − 胚軸の外植を、Ａ２培地［ＭＳ、０．５ｇ／ｌＭｅｓ（ｐＨ５．７）、１．２％グルコース、０．５％アガロース、１ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、０．２５ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、および１ｍｇ／ｌ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）］中で３日間予備培養する。 − 感染培地Ａ３は、ＭＳ、０．５ｇ／ｌＭｅｓ（ｐＨ５．７）、１．２％グルコース、０．１ｍｇ／ｌＮＡＡ、０．７５ｍｇ／ｌＢＡＰ、および０．０１ｍｇ／ｌジベレリン酸（ＧＡ３）である。 − 選択培地Ａ５は、ＭＳ、０．５ｇ／ｌＭｅｓ（ｐＨ５．７）、１．２％グルコース、４０ｍｇ／ｌアデニン・ＳＯ₄、０．５ｇ／ｌポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．５％アガロース、０．１ｍｇ／ｌＮＡＡ、０．７５ｍｇ／ｌＢＡＰ、０．０１ｍｇ／ｌＧＡ３、２５０ｍｇ／ｌカーベニシリン、２５０ｍｇ／ｌトリアシリン、０．５ｍｇ／ｌＡｇＮＯ₃である。 − 再生培地Ａ６は、ＭＳ、０．５ｇ／ｌＭｅｓ（ｐＨ５．７）、２％スクロース、４０ｍｇ／ｌアデニン・ＳＯ₄、０．５ｇ／ｌＰＶＰ、０．００２５ｍｇ／ｌＢＡＰ、および２５０ｍｇ／ｌトリアシリンである。 − 健康な苗条を、発根培地Ａ８である、１００〜１３０ｍｌの半濃度ＭＳ、１％スクロース、１ｍｇ／ｌイソ酪酸（ＩＢＡ）、１００ｍｇ／ｌトリアシリンを３００ｍｌのパーライト（最終ｐＨ６．２）に加え、１リットルの容器に入れたものに移した。ＭＳは、Murashige およびSkoog 培地を表す[Murashige and Skoog(1962)，Ph ysiol．Plant．15: 473]。胚軸外植に、 − Ｔ−ＤＮＡベクターｐＧＳＶ５と相同性を有する２．５ｋｂ断片に連結した細菌性の耐クロラムフェニコール性遺伝子をｐＭＰ９０に挿入することによって得たｐＭＰ９０の誘導体[Koncz and Schell (1986)，Mol．Gen．Genet．204: 38 3]であるｐＧＶ４０００のようなヘルパーＴｉ−プラスミド、 − Ｔ−ＤＮＡボーダーの間に、例３、４、５、６または７のＤＺに選択的なキメラ遺伝子とキメラマーカー遺伝子とを含んでなるｐＧＳＶ５から誘導されるＴ −ＤＮＡベクターを有するAgrobacterium tumefaciens C58C1RifR 株を感染させる。本発明のキメラ遺伝子の一つの型を有するこれらの形質転換体から選択された系を、更に交差実験に用いて、本発明のキメラ遺伝子の組み合わせを含んでなる新たな系を得る。形質転換体の特性決定核ゲノムに例３のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含んでなる例８の形質転換したBrassica napus植物を、通常のin-situ での組織化学的手法を用いて植物の各種の組織に入れた[De Block and Debrouwer(1992)，The Plant Journal 2:261; De Block and Debrouwer(1993)，Plants 189: 218]。莢のＤＺ層には、強力な染色で表されるように、高ＧＵＳ活性が見られたが、他の莢組織にはバックグラウンド標識は全く見られず、例３のプロモーターは莢ＤＺにおいて選択的に発現を指示することを示している。核ゲノムに例４、５、６または７のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を単独でまたは組み合わせて含んでなる例８の形質転換したBrassica napus植物を、下記の特徴に関して特性決定した。１）標的遺伝子生成物（例えば、細胞壁ヒドロラーゼ）の発現の減少、または異種遺伝子発現を監視することによって（Sambrook et al．、上記引用を参照）または発生中のＩＡＡまたはＩＡＡ抱合体の内在性水準を測定することによって（例１参照）、生化学活性の減少（Blumenkratz 、上記引用を参照）を分析することによる生理学的過程の変化、２）光学顕微鏡法および透過型電子顕微鏡法による莢の老化の際のＤＺ分析およびＤＺ細胞壁における変化であって、分離したＤＺ表面を走査型電子顕微鏡を用いて分析することによる莢開放後の細胞分離の程度（例１を参照）、３）個々の莢の実零れ耐性を分析することによるＤＺおよびその種子の実零れ耐性の機械的特性の変化。これは、Kadkol et al．によって記載された片持ち梁試験によって行うことができる[(1986)，Aust．J．Bot．34: 595]。アクチュエーターによって移動するクロスヘッド梁であって、これに負荷セルが一定の力を加えて莢を歪ませるようにしたものからなる「万能試験機」中で、固定した莢に片持ち梁として負荷を加える。これにより、移動および莢裂開帯で開放を開始し、促進するのに要する力を記録する。あるいは、実零れの受け易さの第一の評価は、制御した振動（林冠および機械装置による衝撃をシミュレートする）を加えた脱離した莢で行われる。振動は、エネルギー移動を向上させるため鋼球の入った容器中で固定振幅の水平振動からなっている。更にもう一つの手順では、ひび割れの伝播のし易さを摩擦測定によって決定する。この場合には、ＤＺに沿って押し込まれるクサビの摩擦によって生じる力を記録し、選択された極端な例の抵抗においてＤＺ組織を比較することができる。最後に、個々の選択した系に、屋外での本質的な性能分析を行う。これらの屋外試験の設計は、個々の系（導入遺伝子についてはホモ接合型）の２カ所での栽培を３回繰り返し行うことに基づいている。様々な形質転換体からの統計学的に有為な数の莢の分析を行うと、形質転換していないコントロール植物と比較して莢の実零れ耐性が増加することを示している。本発明のＤＺに選択的なプロモーターおよび組換えＤＮＡ構築物の使用は、例の特異的な植物の形質転換に限定されないのは勿論である。このようなプロモーターおよび組換えＤＮＡ構築物は、任意の穀物の形質転換に用いることができ、プロモーターが遺伝子発現を駆動することができ、好ましくはこのような発現は裂開帯の植物細胞で豊富に起こる。また、本発明のＤＺに選択的なプロモーターの使用は、本発明の特定の転写されるＤＮＡ領域の制御に限定されず、植物の任意の異種遺伝子またはＤＮＡ断片の発現を制御するのに用いることができる。更に、本発明は、前例に記載した特異的なＤＺに選択的なプロモーターに限定されない。むしろ、本発明は、例のプロモーターと同等なものであって、構造遺伝子の発現を、少なくとも実質的に選択的に裂開帯の植物細胞において、制御するのに用いることができる。実際に、例のＤＺに選択的なプロモーターのＤＮＡ配列は、そのヌクレオチドの幾つかを他のヌクレオチドに代えて、および／または幾つかのヌクレオチド欠失しまたは挿入することによって改質する事ができ、但しこのような改質は、改質プロモーターの制御下でキメラｇｕｓ遺伝子を用いて形質転換したトランスジェニック植物でＧＵＳ分析法によって測定したところ、プロモーターによって制御される発現の時期、水準、および組織特異性を実質的に変更するものではない（例３参照）。プロモーターのヌクレオチドの２０％までは、プロモーターの特性に影響を与えることなく変化することができる。このようなプロモーターは、前記のように、配列番号１３の選択されたＤＮＡ断片を用いる標準的条件下でハイブリダイゼーションにより単離する事ができる[Sambr ook et al．上記引用]。本明細書に引用した全ての公表物（特許公表を含む）は、参照することにより本明細書中に取込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バンオンケレン，アンリベルギー国ビー−2100 ドウルネ，ジェイ．ベルボーベンレイ 75 (72)発明者プリンセン，エルスベルギー国ビー−2650 エデジェム，ティメルドンクシュトラート５／11 (72)発明者ボルクハルト，ベルンハルトデンマーク国デイケイ−3520 ファルム，リンデガルドスベユ 27 (72)発明者サンデル，リリイデンマーク国デイケイ−2100 コペンハーゲンオー，ベンネミンデベユ 59 (72)発明者ペテルセン，モルテンデンマーク国デイケイ−1726 コペンハーゲンブイ，アルコナガテ２ (72)発明者ブンドガルドポウルセン，ゲルトデンマーク国デイケイ−1829 コペンハーゲンブイ，マドビグスアイレ５ (72)発明者ボッテルマン，ヨハンベルギー国ビー−9840 ゼベルゲム，ヘットヴィユンガールデケ５

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞の核ゲノムに取り込まれた少なくとも１個の裂開帯（ＤＺ）に選択的なキメラ遺伝子を含む植物であって、前記ＤＺに選択的なキメラ遺伝子が下記の操作可能に連結したＤＮＡ断片ａ）１）植物の特定のＤＺの細胞で産生され、細胞壁ヒドロラーゼ、特にエンド−ポリガラクツロナーゼをコードする植物の内在性遺伝子の前記ＤＺでの発現を防止し、阻害し、または減少する、ＲＮＡ、または２）前記ＤＺ細胞で産生され、それらを殺しまたは不能化し、またはそれらの正常な代謝、生理、または発生を妨げる、タンパク質またはポリペプチドをコードする転写されるＤＮＡ領域、ｂ）少なくとも前記ＤＺ細胞の転写されるＤＮＡ領域の発現を指示する植物で発現可能なプロモーター、但し、前記の転写されるＤＮＡ領域がタンパク質またはポリペプチドをコードし、または前記ＤＺ細胞以外の細胞で前記植物において発現する内在性遺伝子によってコードされるセンスＲＮＡに指示されるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードするとき、前記の植物で発現可能なプロモーターは前記ＤＺ細胞で選択的に前記の転写される領域の発現を指示するＤＺに選択的なプロモーターである、を含んでなり、前記植物は、前記ＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含まない植物と比較すると、裂開特性が向上し、好ましくは裂開を遅延させることを特徴とする、植物。２．前記の転写されるＤＮＡ領域が、細胞壁ヒドロラーゼをコードする前記植物の内在性遺伝子のセンスＲＮＡに指示されているアンチセンスＲＮＡをコードする、請求の範囲第１項に記載の植物。３．前記の転写されるＤＮＡ領域が、細胞壁ヒドロラーゼをコードする前記植物の内在性遺伝子のセンスＲＮＡに指示されているリボザイムをコードする、請求の範囲第１項に記載の植物。４．前記の内在性植物遺伝子が、ＤＺに選択的な遺伝子である、請求の範囲第２または３項に記載の植物。５．前記の内在性植物遺伝子が、エンド−ポリガラクツロナーゼをコードするｍＲＮＡをコードする、請求の範囲第２〜４項のいずれか１項に記載の植物。６．前記エンド−ポリガラクツロナーゼをコードする前記ｍＲＮＡが、前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド配列またはそれに本質的に類似のヌクレオチド配列を含んでなるｍＲＮＡである、請求の範囲第５項に記載の植物。７．前記転写されるＤＮＡ領域が、バルナーゼのようなリボヌクレアーゼ、またはジフテリア毒素のＡ断片のような細胞毒素をコードする、請求の範囲第１項に記載の植物。８．前記転写されるＤＮＡが、ＤＺの細胞で産生され、前記細胞中のオーキシンまたはオーキシン類似体の濃度を増加させ、またはオーキシンまたはオーキシン類似体に対する前記細胞の感受性を増加させるタンパク質をコードする、請求の範囲第１項に記載の植物。９．前記の転写されるＤＮＡ領域が、トリプトファン、モノオキシゲナーゼ、インドール−３−アセタミドヒドロラーゼ、およびアミドヒドロラーゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求の範囲第８項に記載の植物。 10．前記の転写されるＤＮＡ領域がｒｏｌＢ遺伝子の生成物をコードする、請求の範囲第８項に記載の植物。 11．前記の転写されるＤＮＡ領域が、ＤＺの細胞中で産生し、前記細胞のエチレンに対する感受性を減少させるタンパク質をコードする、請求の範囲第１項に記載の植物。 12．前記の転写されるＤＮＡ領域が、エチレンに不感受性である突然変異体ＥＴＲ１タンパク質、好ましくはＥＴＲ１−１タンパクをコードする、請求の範囲第１１項に記載の植物。 13．前記の転写されるＤＮＡ領域が、ポリガラクツロナーゼ、好ましくはエンド−ポリガラクツロナーゼを阻害することができるタンパク質をコードする、請求の範囲第１項に記載の植物。 14．ＤＺが、好ましくはBrassica種、特にBrassica napusの莢ＤＺである、請求の範囲第１〜１３項のいずれか１項に記載の植物。 15．前記植物で発現可能なプロモーターが、ＤＺに選択的なプロモーターである、請求の範囲第１〜１４項のいずれか１項に記載の植物。 16．前記ＤＺに選択的なプロモーターがｍＲＮＡをコードする遺伝子由来のものであり、前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド配列または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を含んでなる、請求の範囲第１５項のいずれか１項に記載の植物。 17．前記ＤＺに選択的なプロモーターが、配列番号１３のヌクレオチド配列の位置１〜２，３２８、または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を有する５ ′調節領域に含まれる、請求の範囲第１６項に記載の植物。 18．前記ＤＺに選択的なキメラ遺伝子が、少なくとも配列番号１３のヌクレオチド配列の位置１，８３９〜２，３２８、または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を含んでなるプロモーター領域を含む、請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の植物。 19．前記ＤＺに選択的なキメラ遺伝子が、少なくとも配列番号１３のＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩ部位の間で出発し、位置２，３２８で終わるヌクレオチド配列、または本質的に類似のヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第１８項に記載の植物。 20．前記ＤＺに選択的なキメラ遺伝子が、少なくとも配列番号１３のヌクレオチド配列の位置１〜２，３２８、または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を含んでなるプロモーター領域を含む、請求の範囲第１９項に記載の植物。 21．ｍＲＮＡの領域に相補的な少なくとも５０個のヌクレオチドの領域を含んでなるアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡが配列番号１または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を含んでなる、ＤＮＡ。 22．前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド配列または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を含んでなる、ｍＲＮＡをコードする遺伝子のプロモーター。 23．少なくとも配列番号１３のヌクレオチド配列の位置１，８３９〜２，３２８、または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ。 24．少なくともＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩ部位の間で出発し、位置２，３２８で終わる配列番号１３のヌクレオチド配列、または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を含んでなる、請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡ。 25．少なくとも配列番号１３のヌクレオチド配列の位置１〜２，３２８、または本質的にそれに類似のヌクレオチド配列を含んでなる、請求の範囲第２４項に記載のＤＮＡ。 26．請求の範囲第１〜２０項のいずれか１項に記載のＤＺに選択的なキメラ遺伝子。 27．請求の範囲第２６項に記載のＤＺに選択的なキメラ遺伝子で形質転換した植物細胞または植物細胞培養物。 28．請求の範囲第２６項に記載のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を含む植物の種子。 29．改良された裂開特性を有する植物の産生法であって、ａ）請求の範囲第２６項に記載のＤＺに選択的なキメラ遺伝子を有する出発植物の細胞の核ゲノムを形質転換し、ｂ）前記形質転換細胞から形質転換植物を再生する、段階を含んでなる、方法。