ES2559117T3

ES2559117T3 - Método de aislamiento de ARN purificado con contaminación reducida de ADN

Info

Publication number: ES2559117T3
Application number: ES11752549.3T
Authority: ES
Inventors: Gabriele Christoffel
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2010-09-06
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2031-09-06
Also published as: EP2426201A1; WO2012032034A1; US9487550B2; JP6096661B2; CN103080311B; DK2614147T3; CN103080311A; EP2614147B1; EP2614147A1; JP2013539367A; US20130225801A1

Abstract

Un método de aislamiento de al menos ARN de una muestra que comprende ARN y ADN, que comprende: a) añadir a la muestra una composición de desnaturalización ácida que comprende un agente caotrópico y fenol y lisar y/u homogeneizar la muestra; b) añadir un disolvente orgánico insoluble en agua y separar las fases resultantes, formando de este modo una mezcla de múltiples fases que comprende una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase orgánica, en donde el ARN se concentra en dicha fase acuosa y el ADN se concentra en dicha fase orgánica y/o en dicha interfase; y c) aislar dicho ARN a partir de dicha fase acuosa, en el que al menos un detergente catiónico se añade antes de la separación final de las fases.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Metodo de aislamiento de ARN purificado con contaminacion reducida de ADN

La presente invencion se refiere a un metodo para aislar ARN purificado a partir de muestras que comprenden ARN y ADN, donde la cantidad de contaminaciones de ADN en el ARN purificado es reducida. Ademas, la presente invencion se refiere a composiciones y metodos utiles para dicho proposito.

El documento US 2005/009045 describe un metodo para la liberacion y aislamiento de acidos nucleicos a partir de muestras biologicas que incluye la lisis de la muestra usando un tensioactivo cationico y una proteasa que va seguido por la purificacion de los acidos nucleicos liberados usando procedimientos clasicos, por ejemplo, por extraccion con fenol y una etapa de precipitacion de los acidos nucleicos extraidos con alcohol y una sal caotropica.

El documento WO 95/28409 Aldescribe metodos para el aislamiento de ARN y presenta dos metodos alternativos diferentes para efectuar la lisis celular: Segun la primera alternativa, el ARN se libera mecanicamente en presencia de un tampon que contiene fenol y un TCG o cloruro de guanidinio y que tiene un pH de aproximadamente 4 a 4,5. A esta mezcla se anade un disolvente organico insoluble en agua para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa con el ARN y una fase organica que contiene el ADN. La segunda alternativa difiere de la primera en que el ADN se libera en presencia de un detergente en lugar del tiocianato de guanidinio (TCG) o cloruro de guanidinio.

El aislamiento del ARN puro intacto es un paso critico para el analisis de la expresion genica en biologia molecular, aplicaciones clinicas y de biotecnologia. En la tecnica anterior se han desarrollado muchos metodos para lograr ese objetivo. Los metodos mas utilizados para el aislamiento del ARN se basan en la extraccion con fenol, precipitacion mediante el uso de soluciones de sal caotropica y la adsorcion en silice. Los metodos basados en fenol-cloroformo que utilizan sales caotropicas se describen por ejemplo en el documento US 4.843.155 y US 2008/057560. Los metodos respectivos permiten el aislamiento del aRn puro o el aislamiento de ARN, ADN y opcionalmente proteinas de la misma muestra. El principal de los metodos respectivos es homogeneizar la muestra en una composicion desnaturalizante que comprende fenol y un agente caotropico. El homogeneizado se somete a separacion de fases mediante la adicion de un disolvente organico insoluble en agua tal como cloroformo. Despues de la centrifugacion, la mezcla se separa en una fase acuosa que contiene ARN y una interfase y la fase organica que contiene el ADN y las proteinas. Para el aislamiento del ARN, se recoge la fase acuosa y el ARN se aisla de la misma, por ejemplo, por precipitacion del ARN mediante la adicion de un alcohol a dicha fase acuosa.

Los respectivos metodos proporcionan ARN no degradado sustancialmente puro. Sin embargo, el ARN aislado de acuerdo con el metodo respectivo, basado en fenol-cloroformo, contiene cantidades residuales de ADN que pueden detectarse, por ejemplo, mediante ensayos de reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT- PCR). Estas contaminaciones de ADN residual pueden perturbar la aplicacion posterior del ARN purificado. Esto constituye un problema, debido a que el ADN contaminante sirve como molde para la ADN polimerasa, lo que potencialmente podria dar productos de amplificacion adicional, distorsionando asi el rendimiento de una RT-PCR dependiente de ARN. Por lo tanto, el ARN aislado usando los metodos respectivos debe ser purificado para dar el ARN purificado libre de ADN.

Por lo tanto, ha habido intentos en la tecnica anterior para mejorar la calidad del ARN aislado mediante la reduccion de la cantidad de contaminaciones de DNA en el ARN purificado. Una practica comun para la eliminacion de la contaminacion de ADN es tratar la muestra que contiene ARN con una ADNasa. Sin embargo, la realizacion del respectivo tratamiento con ADNasa tiene inconvenientes, ya que aumenta los costes y etapas de manipulacion y la ADNasa puede comprender trazas de ARNasa, exponiendo asi el ARN al riesgo de degradacion. Otros intentos de reducir las contaminaciones de ADN incluyen una etapa de precipitacion adicional de ADN de la fase acuosa. Enfoques mejorados han utilizado adicionalmente una fase solida que une acido nucleico y condiciones de union adecuadas para la union del ADN a dicha fase solida, con el fin de eliminar las contaminaciones de ADN a partir de la fase acuosa que contiene ARN. Sin embargo, los metodos respectivos tambien tienen inconvenientes, ya que aumentan los costos debido a la necesidad de usar una fase solida que une acido nucleico adicional y las medidas de manipulacion adicionales. Otro enfoque para reducir las contaminaciones de ADN se basa en la reduccion del valor de pH hasta un valor inferior a 4 durante la extraccion con fenol (consulte por ejemplo, el documento US 2008/0057560). Sin embargo, tambien este metodo no da lugar a una reduccion satisfactoria de las contaminaciones de DNA en el ArN aislado.

Por lo tanto es entre otros un objetivo de la presente invencion proporcionar un metodo para aislar ARN a partir de una muestra que comprende ARN, ADN y opcionalmente proteinas, que consiga ARN puro y reduzca la cantidad de contaminaciones de DNA en el ARN aislado.

Ademas, es un objetivo de la presente invencion reducir la cantidad de ADN en una fase acuosa que contiene ARN que se obtuvo en particular durante una extraccion con fenol/cloroformo o durante un metodo de produccion de fase similar.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Sumario de la invencion

La presente invencion se basa en el hallazgo de que la adicion de al menos un detergente cationico a una muestra que se trata mediante la adicion de una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol disminuye considerablemente la cantidad de ADN en el ARN aislado. La adicion de dicho detergente cationico tiene sorprendentemente el efecto de que considerablemente menos ADN permanece en la fase acuosa que contiene ARN que se obtiene cuando se anade un disolvente organico insoluble en agua tal como, por ejemplo cloroformo. Sin pretender imponer ninguna teoria, se supone que la adicion del detergente cationico tiene el efecto de que se elimina mas ADN de la fase acuosa que contiene ARN y, por lo tanto, se dirige a la interfase y/o la fase organica formada durante la separacion de fases. Por lo tanto, mediante la adicion del detergente cationico, el ADN se elimina de manera eficiente a partir de la fase acuosa que contiene el ARN y se concentra en la interfase y/o la fase organica resultante. Esto reduce considerablemente la cantidad de contaminaciones de DNA en el ARN que posteriormente se aisla de dicha fase acuosa. Por lo tanto, la presente invencion proporciona considerables ventajas sobre la tecnica anterior y hace que los tratamientos adicionales de la fase acuosa que contiene ARN para la eliminacion de contaminaciones de ADN, tales como por ejemplo los tratamientos con ADNasa o la eliminacion de la contaminaciones de ADN mediante el uso de fases especificas que unen acidos nucleicos o purificacion adicional sean obsoletos.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de aislamiento de al menos ARN de una muestra que comprende ARN y ADN, comprendiendo dicho metodo las siguientes etapas:

a) anadir a la muestra una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol y efectuar la lisis y/u homogeneizar la muestra;

b) anadir un disolvente organico insoluble en agua y separar las fases resultantes, formando de este modo una mezcla de multiples fases que comprende una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica, en el que el ARN se concentra en dicha fase acuosa y el ADN se concentra en dicha fase organica y/o en dicha interfase; y

c) aislar dicho ARN a partir de dicha fase acuosa,

en el que al menos un detergente cationico se anade antes de la separacion final de las fases.

Como se ha descrito antes, la adicion de al menos un detergente cationico antes de separar las fases individuales tiene el efecto de que las contaminaciones de ADN se reducen considerablemente en la fase acuosa que contiene ARN, si se usa para la preparacion de la muestra una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol.

De acuerdo con un segundo aspecto, se proporciona un kit para uso en un metodo de acuerdo con la presente invencion, que comprende

a) una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol;

b) una solucion para la reduccion de las contaminaciones de ADN que comprende al menos un detergente cationico;

c) opcionalmente una fase solida que une acido nucleico y

d) opcionalmente tampones de lavado y elucion.

De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona un metodo para reducir la cantidad de ADN en una fase acuosa que contiene ARN formada en un metodo de aislamiento de ARN que implica el uso de una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol, en el que al menos se anade un detergente cationico a una muestra homogeneizada en dicha composicion de desnaturalizacion acida antes de que las fases obtenidas por la adicion de un disolvente organico insoluble en agua se separen en una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica.

De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente invencion se refiere al uso de al menos un detergente cationico para reducir la cantidad de ADN en un fase acuosa que contiene ARN que se obtiene

- homogeneizando una muestra en una composicion acuosa de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol;

- anadiendo un disolvente organico insoluble en agua y

- separando la mezcla en una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica, en el que el detergente cationico se anade antes de la separacion final de las fases.

De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente invencion se refiere al uso de al menos un detergente cationico para aumentar la cantidad de ADN en una interfase y/o una fase organica opcional reduciendo la cantidad de ADN en una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

fase acuosa que contiene ARN que se obtiene

- anadiendo un disolvente organico insoluble en agua y

Como se ha descrito anteriormente, la adicion del detergente cationico antes de separar las fases reduce considerablemente la cantidad de ADN en la fase acuosa que contiene ARN cuando la muestra se prepara en una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol. Esto permite, por ejemplo, el aislamiento de ARN puro que comprende menos contaminaciones de ADN.

Otros objetos, rasgos, ventajas y aspectos de la presente solicitud se haran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la siguiente descripcion y reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse, sin embargo, que la siguiente descripcion, reivindicaciones adjuntas y los ejemplos especificos, aunque indican realizaciones preferidas de la solicitud, se dan a modo de ilustracion solamente. Diversos cambios y modificaciones dentro del espiritu y alcance de la invencion divulgada seran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la lectura de lo siguiente.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de aislamiento de ARN que se basa en el uso de fenol, un agente caotropico y un disolvente organico insoluble en agua tal como por ejemplo cloroformo. En los metodos respectivos, se forma una mezcla de multiples fases, que comprende una fase acuosa que contiene ARN, opcionalmente una interfase y una fase organica. El ADN y las proteinas (si estan comprendidas en la muestra) estan comprendidos en la interfase y/o la fase organica. La presente invencion se basa en el hallazgo de que la cantidad de ADN se puede reducir considerablemente en la fase acuosa que contiene ARN, si al menos un detergente cationico se anade antes de la separacion final de las fases. La adicion de al menos un detergente cationico tiene el efecto de que mas ADN se elimina de la fase acuosa que contiene ARN y, en consecuencia, se concentra en la interfase y/o la fase organica. Ya que el ADN se extrae de manera mas efectiva de la fase acuosa que contiene ARN, el ARN aislado a partir de una fase acuosa respectivamente empobrecida en ADN comprende menos cantidades de ADN y, por lo tanto, menos contaminacion de ADN. Por lo tanto, la presente invencion proporciona una solucion al problema de la contaminacion de ADN residual en el ARN purificado que es eficaz, simple y no pone en peligro la calidad del ARN. Mas bien, la calidad del ARN es a menudo incluso mejor respecto a los metodos en los que no se anade ningun detergente cationico. Ademas, el metodo de acuerdo con la presente invencion es muy rentable, porque no hay necesidad de usar materiales adicionales, tales como fases solidas o enzimas, tales como por ejemplo, columnas de union a ADN o ADNasa. Por lo tanto, la presente invencion tiene ventajas considerables.

c) aislar dicho ARN a partir de dicha fase acuosa,

Las etapas a) a c) son etapas que tambien se realizan en los metodos conocidos en la tecnica anterior para el aislamiento de ARN. En la etapa a) la muestra se procesa, por lo general se lisa y/o homogeneiza, en una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol. La mezcla resultante se separa en una fase organica, por lo general, una interfase (dependiendo de la muestra) y una fase acuosa mediante la adicion en la etapa b) de un disolvente organico insoluble en agua tal como cloroformo. La formacion de dichas fases puede ser promovida por centrifugacion. En la etapa c), el ARN se aisla de la fase acuosa. La mejora de la presente invencion reside en que se anade al menos un detergente cationico a la mezcla antes de la separacion final de las fases. Sorprendentemente, se encontro que la adicion de dicho detergente cationico reduce considerablemente la cantidad de ADN en la fase acuosa que contiene ARN, si para preparar la muestra se usa una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol. Esta combinacion de reactivos utilizados en el metodo de acuerdo con la presente invencion (en particular, el agente caotropico, fenol, el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

detergente cationico y el disolvente organico insoluble en agua) es importante para conseguir las ventajas de la presente invencion. Por ejemplo, las ventajas no se logran cuando se anade el agente caotropico o el detergente cationico solos. Por lo tanto, es decisiva la combinacion precisa como se describe en la presente memoria. Las ventajas obtenidas con la combinacion especifica de las etapas, como se ensena en la presente invencion, se pone de manifiesto en los ejemplos proporcionados en este documento.

De acuerdo con una realizacion, se usa al menos un detergente cationico que tiene la siguiente formula:

YR1R2R3R4X en la que

Y es nitrogeno o fosforo;

R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de un resto alquilo C1-C20 ramificado o no ramificado, un residuo alquileno C3 a C6, un residuo alquinilo C3 a C6 y/o un residuo aralquilo C6-C26 y en el que preferiblemente al menos uno de R1, R2, R3 o R4 es un residuo alquilo C6 a C20 e incluso mas preferido es al menos un residuo alquilo C10;

X - es el anion de un acido inorganico u organico monobasico o polibasico.

Como ejemplos de detergentes cationicos se incluyen, pero sin limitacion, sales de amonio cuaternario, aminas con enlace amida, polioxietilen alquil aminas y aminas aliciclicas, etilendiaminas sustituidas con N,N,N',N'-tetrakis, 2- alquil 1 -hidroxietil-2-imidazolin aminas etoxiladas y sales de alquil amonio.

De acuerdo con una realizacion, se usa un detergente cationico, que comprende un cation de amonio cuaternario cargado de forma permanente como grupo de cabeza polar. Preferiblemente, el detergente cationico es una sal de alquiltrimetilamonio. Preferiblemente, el detergente cationico comprende bromuro de amonio o cloruro de amonio. Lo mas preferiblemente, el detergente cationico se selecciona entre el grupo que consiste en bromuro de cetil trimetil de amonio (CTAB), bromuro de tetra decil trimetil amonio bromuro (TTAB) y bromuro de dodecil trimetil amonio (DTRB) o los compuestos correspondientes que comprenden un cloruro en lugar del bromuro.

Otros detergentes cationicos incluyen, pero no se limitan a cloruro de didecildimetilamonio, cloruro de benzalconio, bromuro de n-dodecil trimetil amonio (DTAB), bromuro de trimetil-tetradecilamonio, N,N'-dimetildodecilamina-N-oxido diclorhidrato de ctenidina; alquiltrimetilamonio, sales de bromuro de hexadecil trimetil amonio, cloruro de cetilpiridinio (CPC), amina de sebo polietoxilada (POEA), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio (BZT), 5-bromo-5- nitro-1,3-dioxano, cloruro de dimetildioctadecilamonio, bromuro de dioctadecildimetilamonio (DODAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB), cloruro de cetilpiridinio, bromuro de dimetil dioctadecil amonio, cloruro de coco alquilo dimetil bencil amonio, cloruro de alquil hidroxietil dimetil amonio, esterquat de trietanolamina y acido dioleico, cloruro de diestearil dimetil amonio, esterquat de trietanolamina y acido disebacico, esterquat de trietanolamina.

De acuerdo con una realizacion, se anade el al menos un detergente cationico en una concentracion que da lugar a una concentracion de detergente cationico en la muestra homogeneizada de la etapa a) y/o en la mezcla obtenida despues de la adicion del disolvente organico insoluble en agua en la etapa b ), que se selecciona del grupo que consiste del 0,01 % al 10 %, del 0,03 % al 7,5 %, del 0,03 % al 5 %, del 0,04 % al 2,5 %, del 0,04 % al 2 % y del 0,03 % al 1,7 % basado en el volumen total. Preferiblemente, el detergente cationico o la mezcla de detergentes cationicos estan comprendidos en una concentracion seleccionada del grupo que consiste en al menos el 0,03 %, al menos el 0,04 %, al menos el 0,05 %, al menos el 0,06 %, al menos el 0,08 %, al menos el 0,09 %, al menos el 0,1 % y al menos el 0,15 %. Como se ha descrito anteriormente, se pueden usar tambien mezclas de detergentes cationicos, preferiblemente CTAB mezclado con TTAB.

De acuerdo con una realizacion preferida, se anade el al menos un detergente cationico en forma de una solucion. En dicha solucion, el detergente cationico esta preferiblemente comprendido en una concentracion seleccionada del grupo que consiste del 0,1 % al 20 %, del 0,5 % al 10 %, del 0,1 % al 5 %, del 0,5 % al 5 %, del 0,1 % al 3 %, del 0,5 % al 3 %, y lo mas preferiblemente en una concentracion del 0,1 % al 1 % y del 0,5 % al 1 %, basado en el volumen total de la solucion. Lo mismo se aplica en caso de que se utilice una mezcla de detergentes cationicos.

Dicha solucion que comprende el al menos un detergente cationico puede comprender ingredientes adicionales, tales como por ejemplo, sales. La sal que esta preferiblemente comprendida en dicha solucion se puede seleccionar del grupo que consiste en sales de metal alcalino, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de litio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, acetato de sodio, nitrato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de litio, sulfato de potasio y mezclas de los mismos. La adicion de una sal respectiva, en particular, tiene la ventaja de que el detergente cationico permanece en solucion. Preferiblemente, dicha sal esta comprendida en la solucion en una concentracion seleccionada del grupo que consiste de 0-10 M, preferiblemente de 0,5 a 5 M, mas preferido de 0,5 a 1,5 M.

Existen varias opciones a la hora de anadir el detergente cationico antes de la separacion de las fases. De acuerdo con una realizacion, el detergente cationico se anade durante la etapa a) ya sea antes, durante o despues de anadir a la muestra, respectivamente, la composicion de desnaturalizacion acida. El detergente cationico tambien puede

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

estar comprendido en la composicion de desnaturalizacion acida. Ademas, el detergente cationico se puede anadir junto con, respectivamente, al mismo tiempo cuando se anade el disolvente organico insoluble en agua en la etapa b). Sin embargo, es importante que el detergente cationico se anada antes de llevar a cabo la separacion fase final de las fases con el fin de permitir que el detergente cationico ejerza sus efectos beneficiosos con respecto a la reduccion de la cantidad de ADN en la fase acuosa que contiene ARN. Dado que la separacion de fases final es decisiva, tambien esta dentro del alcance de la presente invencion llevar a cabo una separacion de fases inicial, a continuacion, anadir el detergente cationico a la fase acuosa y, finalmente, separar las fases, por ejemplo, con la ayuda de la centrifugacion, con el fin de permitir que el detergente cationico y el ADN residual se elimine de la fase acuosa en la fase organica y/o la interfase. Sin embargo, en particular, para ahorrar etapas de manipulacion se prefiere que el agente cationico se anada antes o al mismo tiempo que se anade el disolvente organico insoluble en agua. De acuerdo con una realizacion preferida, el detergente cationico se anade por separado y, por lo tanto, despues de mezclar la muestra con la composicion de desnaturalizacion acida y antes de anadir el disolvente organico insoluble en agua. Como se muestra en los ejemplos, se consiguen particularmente buenos resultados cuando se anade el al menos un detergente cationico despues de la etapa a) y antes de la etapa b).

La separacion de fases se puede lograr por sedimentacion. De acuerdo con una realizacion, la mezcla multi-fase se forma mediante la centrifugacion de la muestra. Aqui, se prefiere centrifugar la muestra a temperaturas mas bajas y, por lo tanto, a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente. Preferiblemente, la temperatura es < 15 0C, < 10 0C y particularmente preferidas son temperaturas aun mas bajas tales como < 7 0C, < 5 0C y < 4 0C. Se encontro, que la centrifugacion a una temperatura mas baja promueve la separacion de fases y, ademas, promueve la reduccion de ADN en la fase acuosa que contiene ARN cuando se usa un detergente cationico.

Para aislar el ARN a partir de dicha fase acuosa, se puede usar basicamente cualquier metodo conocido en la tecnica anterior para el aislamiento de ARN a partir de una solucion acuosa. Preferiblemente, el ARN se aisla mediante la adicion de al menos un alcohol a dicha fase acuosa, precipitando de ese modo el ARN. De acuerdo con una realizacion, el ARN respectivamente precipitado se puede recuperar por centrifugacion de la fase acuosa y decantando el liquido sobrenadante.

Preferiblemente, la fase acuosa se mezcla con al menos un alcohol y a continuacion dicha mezcla se pone en contacto con una fase solida que une acido nucleico con el fin de ayudar a la purificacion de acidos nucleicos.

Como fase solida que une acido nucleico, se puede usar cualquier material que sea capaz de unir acidos nucleicos y asi incluye varios materiales que son capaces de unir acidos nucleicos en condiciones adecuadas. Fases solidas ilustrativas que se pueden utilizar junto con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, compuestos que comprenden silice y fases solidas siliceas, incluyendo, pero sin limitarse a, particulas de silice, dioxido de silicio, tierra de diatomeas, vidrio, alquil-silice, silicato de aluminio y borosilicato; nitrocelulosa; papel diazotizado; hidroxiapatita (tambien conocida como hidroxilo apatita); nylon; oxidos metalicos; zirconia; alumina; soportes polimericos, soportes de dietilaminoetil y trietilaminoetil derivatizados, resinas de cromatografia hidrofobas (tales como fenilo u octil Sepharose) y similares. El termino fase solida no pretende implicar ninguna limitacion en cuanto a su forma o diseno. Por lo tanto, el termino fase solida abarca materiales apropiados que son porosos o no porosos; permeables o impermeables; incluyendo, pero sin limitarse a, membranas, filtros, laminas, particulas, particulas magneticas, perlas, geles, polvos, fibras, y similares. De acuerdo con una realizacion, la superficie de la fase solida no esta modifica y esta, por ejemplo, modificada con grupos funcionales. Preferiblemente, se usa una membrana que une acido nucleico. Las membranas adecuadas incluyen, pero no se limitan a membranas hidrofilas, membranas hidrofobas y membranas que unen acidos nucleicos a traves de intercambio ionico. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, membranas de silice y otras membranas que comprenden silice, membranas de nylon, membranas de celulosa tales como membranas de nitrocelulosa. Preferiblemente, la membrana es porosa. Ademas, se prefiere utilizar una membrana que comprende o que consiste en silice.

Como alcohol, se prefiere usar alcoholes de cadena corta ramificados o no ramificados con preferiblemente de uno a 5 atomos de carbono. Ejemplos son metanol, etanol, propanol, isopropanol y butanol. Tambien se pueden utilizar mezclas de alcoholes. El alcohol se selecciona preferiblemente de isopropanol y etanol porque dichos alcoholes son, en particular, eficaces para precipitar el ARN.

La concentracion de alcohol usada para aislar el ARN depende de si esta destinada a incluir pequenos ARN en el ARN total aislado o no. En caso de que se pretenda purificar tambien ARN pequenos tales como miARN, se recomienda utilizar concentraciones superiores de alcohol. En caso de que no se desee incluir las respectivas especies pequenas de ARN en el ARN total aislado, se prefieren concentraciones de alcohol menores. La concentracion de alcohol cuando se mezcla con la fase acuosa puede estar en un intervalo del 10 % v/v al 90 % v/v en la mezcla resultante. Para el aislamiento del ARN total, incluyendo el ARN pequeno, es beneficioso usar una concentracion de alcohol > 40 % v/v, preferiblemente > 50 % v/v. En caso de que no se desee incluir ARN pequenos, la concentracion de alcohol es preferiblemente < 40 % v/v. Por lo tanto, la concentracion puede ser seleccionada del grupo que consiste en al menos el 20 %, al menos el 30 % v/v, al menos el 40 % v/v, al menos el 50 % v/v y al menos el 60 % v/v cuando se mezclan con la fase acuosa. Preferiblemente, la concentracion de alcohol se encuentra en un intervalo del 20 % v/v al 90 % v/v o del 30 % v/v al 85 %, preferiblemente en el intervalo del 30 % v/v al 70 % v/v cuando se mezcla con la fase acuosa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El termino “muestra” se utiliza en la presente memoria en un sentido amplio y se pretende que incluya varias fuentes que contienen acidos nucleicos. La muestra puede ser una muestra biologica pero el termino tambien incluye otras, por ejemplo, muestras artificiales que comprenden acidos nucleicos. Ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, sangre entera; hemoderivados; globulos rojos; globulos blancos; capa leucocitaria; frotis, incluyendo, pero sin limitarse a, frotis bucales, frotis faringeos, frotis vaginales, frotis uretrales, frotis cervicales, frotis rectales, frotis de lesion, frotis de absceso, frotis nasofaringeos y similares; orina; esputo; saliva; semen; liquido linfatico; fluido amniotico; liquido cefalorraquideo; derrames peritoneales; derrames pleurales; liquido de quistes; liquido sinovial; humor vitreo; humor acuoso; liquido de la bursa; lavados oculares; aspirados oftalmicos; plasma; suero; lavado pulmonar; aspirados pulmonares; tejidos, incluyendo, pero sin limitarse a, higado, bazo, rinon, pulmon, intestino, cerebro, corazon, musculo, pancreas; cultivos celulares, asi como lisados, extractos, o materiales obtenidos a partir de las muestras descritas anteriormente o cualquier celula y microorganismos y virus que pueden estar presentes en una muestra y similares. Los materiales obtenidos de entornos clinicos o forenses que contienen acidos nucleicos tambien estan dentro del sentido previsto del termino “muestra”. Ademas, el experto en la tecnica apreciara que tambien estan dentro del alcance del termino “muestra” los lisados, extractos, o materiales procesados o porciones obtenidas a partir de cualquiera de las muestras ilustrativas anteriores. Preferiblemente, la muestra es una muestra biologica derivada de un ser humano, animal, planta, bacteria u hongo. Preferiblemente, la muestra se selecciona del grupo que consiste en celulas, tejidos, bacterias, virus y fluidos corporales, como por ejemplo sangre, hemoderivados, tales como capa leucocitaria, plasma y suero, orina, licor, esputo, heces, LCR y esperma, frotis epiteliales, biopsias, muestras de medula osea y muestras de tejidos, preferiblemente muestras de tejidos de organos, preferiblemente de organos como el pulmon, el rinon o el higado. El metodo de acuerdo con la presente invencion es particularmente adecuado para el aislamiento de ARN a partir de muestras de tejido, en particular, de muestras de tejidos de organos. De acuerdo con una realizacion, el tejido no es sangre. De acuerdo con una realizacion, la muestra no es una muestra bacteriana ni una muestra derivada de bacterias.

Los terminos “acido nucleico pequeno” y “acidos nucleicos pequenos”, en particular, se refieren a los acidos nucleicos que tienen una longitud de menos de 1.000 nt, 500 nt, 400 nt, 300nt, 100 nt o menos de 70nt e incluyen, pero no se limitan a, miARN, siARN y otros acidos nucleicos de interferencia cortos, snoARN, snARN, ARNt, hnARN, acidos nucleicos circulantes, fragmentos de ADN genomico o ARN, acidos nucleicos degradados, ribozimas, ARN o ADN viral, acidos nucleicos de origen infeccioso, productos de amplificacion, acidos nucleicos modificados, acidos nucleicos plasmidicos u organelares, acidos nucleicos artificiales tales como oligonucleotidos.

La composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y el fenol puede tener una composicion como se describe en la tecnica anterior, por ejemplo, en el documento US 4.843.155 o el documento US 5.346.994.

Se puede usar cualquier agente caotropico en la composicion de desnaturalizacion acida que causa la alteracion en una proteina o acido nucleico mediante, por ejemplo, pero sin limitarse a, la alteracion de la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una proteina o un acido nucleico, dejando la estructura primaria intacta. Preferiblemente, el agente caotropico se selecciona del grupo que consiste en clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, tiocianato de sodio, yoduro de sodio, perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio, trifluoroacetato de sodio y urea. Preferiblemente, se usa una sal caotropica. En particular, se puede utilizar como agente caotropico el clorhidrato de guanidinio y/o el tiocianato de guanidinio.

El agente caotropico puede estar comprendido en la composicion de desnaturalizacion acida en una concentracion seleccionada del grupo que consiste en 0,1 hasta el limite de saturacion, de 0,1 a 6 M, de 0,5 a 4 M, de 0,5 a 3 M y de 0,5 a 2M.

El fenol esta preferiblemente comprendido en la composicion de desnaturalizacion acida en una concentracion seleccionada del grupo que consiste en del 10 % v/v al 70 % v/v, del 20 % v/v al 60 % v/v y del 30 % v/v al 50 % v/v basado en el volumen total de la composicion de desnaturalizacion acida. Preferiblemente, la concentracion de fenol se encuentra en el intervalo del 35 % v/v al 40 % v/v.

El valor pH de la composicion de desnaturalizacion es acido y puede ser < 6, preferiblemente < 5. Preferiblemente, el valor pH de la composicion de desnaturalizacion acida se encuentra en el intervalo de 3 a 6, y mas preferido, en un intervalo de 4 a 5.

Ademas, la composicion de desnaturalizacion acida puede comprender un tampon en una cantidad suficiente para mantener dicha composicion a un pH acido. Dicho tampon puede ser una sal de al menos uno de acetato, citrato, fosfato, ftalato, tartrato o lactato y puede ser, por ejemplo, seleccionado de fosfato de sodio, acetato de sodio y citrato de sodio. Preferiblemente, se usa acetato de sodio.

La composicion de desnaturalizacion acida puede comprender un solubilizante para mantener el fenol en solucion, sobre todo a 4 0C, y para lograr o mantener el disolvente como una solucion monofasica. Un solubilizante adecuado es glicerol. De acuerdo con una realizacion, el solubilizante esta comprendido en una concentracion de aproximadamente 2 a 10 %, preferiblemente de aproximadamente 5 %.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ademas, la composicion de desnaturalizacion acida puede comprender un componente tiocianato, preferiblemente tiocianato de amonio o tiocianato de sodio. Se cree que este componente tiocianato adicional mejora la extraccion de ARN a partir de la muestra biologica. El componente tiocianato puede estar comprendido en una concentracion de 0,1 a 1 M, preferiblemente 0,4 M.

De acuerdo con una realizacion, la composicion de desnaturalizacion acida tiene las siguientes caracteristicas:

- comprende fenol en una concentracion superior al 30 %, preferiblemente superior al 35 % y lo mas preferido entre el 35 % y el 40 %;

- tiene un pH de 4,3 a 6, preferiblemente de 4,5 a 5;

- comprende una sal caotropica en una concentracion de 0,5 a 4 M, preferiblemente de 0,5 a 3 M; y

- comprende preferiblemente al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en un tampon, un solubilizante y un compuesto tiocianato; ejemplos y concentraciones preferidas se han descrito anteriormente.

Preferiblemente, la composicion de desnaturalizacion acida combina todas las caracteristicas preferidas descritas anteriormente.

Disolventes organicos insolubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a, caprolactona, etilenglicol diacetato, polietilenglicol dibenzoato, cloroformo, tetracloruro de carbono, bromocloropropano, bromonaftaleno, bromoanisol, bromuro de ciclohexilo, dibromopropano, acido diclorobenzoico o mezclas de los mismos. Preferiblemente, el disolvente organico insoluble en agua es cloroformo.

El metodo de acuerdo con la presente invencion tambien puede comprender uno o mas etapas adicionales. Posteriormente se describen algunas opciones no limitantes.

Si se desea, las proteinas (si estan contenidas en la muestra) y/o el ADN pueden recuperarse tambien de la fase organica y/o la interfase con el metodo de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, las proteinas se pueden precipitar mediante la adicion de un alcohol inferior a la fase organica y recuperando las proteinas por sedimentacion. El ADN puede ser recuperado de la interfase y/o la fase organica, por ejemplo, por lavado con una cantidad predeterminada de la solucion de disolvente, la sedimentacion del ADN y la eliminacion de cualquier contaminacion de fenol y sal del ADN. Los metodos adecuados para el aislamiento de ADN y/o proteinas de la interfase y/o la fase organica se conocen en la tecnica anterior y, por tanto, no necesitan ninguna descripcion adicional aqui. La realizacion de los metodos de acuerdo con la presente invencion tambien tiene con respecto al aislamiento de ADN el efecto ventajoso de que el rendimiento de ADN se incrementa porque el ADN se elimina de manera mas eficiente de la fase acuosa y por lo tanto se concentra en la interfase y/o la fase organica, de donde se puede aislar el ADN.

Ademas, pueden llevarse a cabo una o mas etapas de lavado cuando se aisla el ARN de la fase acuosa. Preferiblemente, dichas etapas de lavado se llevan a cabo mientras el ARN se une a la fase solida que une acido nucleico en caso de que se utilice una fase solida. Para ello se pueden utilizar soluciones de lavado comunes. Se recomienda utilizar soluciones de lavado que no conducen a una liberacion del ARN de la fase solida de union a acidos nucleicos. Ademas, el sedimento que contiene ARN se puede lavar en el caso de que no se utilice utiliza ninguna fase de union. De acuerdo con una realizacion, la solucion utilizada para el lavado comprende al menos un agente caotropico, al menos un alcohol, al menos un detergente y/o al menos un componente de tamponamiento. Los agentes caotropicos que se pueden utilizar en las soluciones de lavado incluyen, pero no se limitan a, clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio y yoduro de sodio. Ademas, se pueden usar sales caotropicas que comprenden un anion caotropico seleccionado del grupo que consiste en tricloroacetato, perclorato y trifluoroacetato. Ejemplos de las respectivas sales caotropicas son sales alcalinas como perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio y trifluoroacetato de sodio. Como alcohol para el lavado, se pueden usar alcoholes de cadena corta ramificada o no ramificada con preferiblemente de uno a 5 atomos de carbono para el lavado, respectivamente, en la solucion de lavado. Ejemplos son metanol, etanol, propanol, isopropanol y butanol. Preferiblemente, se utilizan isopropanol y/o etanol. Preferiblemente, la solucion de lavado comprende al menos alcohol 10 % y al menos sal caotropica 900 mM, preferiblemente al menos sal caotropica 2 M. Ademas, la solucion de lavado puede comprender un detergente.

Tambien se proporciona un kit adecuado para su uso en el metodo de acuerdo con la presente invencion. Dicho kit comprende

b) una solucion para la reduccion de ADN en la fase acuosa que comprende al menos un detergente cationico y preferiblemente una sal;

c) opcionalmente una fase solida que une acido nucleico y

d) opcionalmente tampones de lavado y elucion.

La composicion de desnaturalizacion acida preferiblemente tiene las caracteristicas descritas anteriormente. Se remite a la divulgacion anterior. Ademas, la solucion para reducir ADN tiene tambien preferiblemente las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

caracteristicas descritas anteriormente. Se remite de nuevo a la divulgacion anterior.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invencion se proporciona un metodo para reducir la cantidad de ADN en una fase acuosa que contiene ARN formada en un metodo de aislamiento de ARN que implica el uso de una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol, en el que al menos un detergente cationico se anade a una muestra homogeneizada en dicha composicion de desnaturalizacion acida antes de que las fases obtenidas por la adicion de un disolvente organico insoluble en agua se separen en una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica.

La presente invencion tambien se refiere al uso de al menos un detergente ionico para reducir la cantidad de ADN en una fase acuosa que contiene ARN obtenida

- anadiendo un disolvente organico insoluble en agua y

- separando la mezcla en una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica,

en el que al menos un detergente cationico se anade antes de la separacion final de las fases. Como detergente ionico, se usan detergentes anionicos tales como SDS y preferiblemente detergentes cationicos. Como se ha descrito anteriormente, el detergente es preferiblemente un detergente cationico, porque un detergente cationico proporciona los mejores resultados con respecto a la reduccion de la cantidad de aDn en una solucion acuosa que contiene ARN. Mas detalles con respecto a la composicion de desnaturalizacion acida, los detergentes y otros detalles del uso descrito se han descrito anteriormente en relacion con el metodo de acuerdo con la presente invencion. Se remite a la divulgacion anterior. Preferiblemente, la composicion de desnaturalizacion acida combina todas las caracteristicas preferidas descritas anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere al uso de al menos un detergente cationico para aumentar la cantidad de ADN en una interfase y/o una fase organica reduciendo la cantidad de ADN en una fase acuosa que contiene ARN obtenida

- anadiendo un disolvente organico insoluble en agua y

Los detalles con respecto a la composicion de desnaturalizacion acida y el detergente cationico y las ventajas asociadas se han descrito en detalle anteriormente. Se remite a la respectiva divulgacion que tambien se aplica aqui.

Ejemplos Ejemplo 1:

El efecto de diferentes detergentes sobre la eliminacion del ADN genomico durante el aislamiento de ARN a partir de higado de rata se evaluo por el metodo siguiente:

1. Se homogeneizaron 270 mg de tejido hepatico estabilizado con RNAlater en 27 ml de reactivo Qiazol, un fenol acido y reactivo que contiene sal caotropica, utilizando un homogeneizador TissueRuptor.

2. Se dividieron en alicuotas 1000 pl del homogeneizado resultante en tubos Eppendorf de 2 ml. Por lo tanto, se utilizo 10 mg de tejido por muestra.

3. Se anadieron 8 pl (5 pg) de ADN genomico al reactivo Qiazol antes de la separacion de fases.

4. En una etapa siguiente, se anadieron 100 pl de los siguientes detergentes a los homogeneizados (por duplicado):

- Triton X-100 [100 %]

- Tween 20 [20 %]

- Bromuro de cetil-trimetil-amonio [1 %], CTAB

- Bromuro de tetra-decil-trimetil-amonio [1 %], TTAB.

Para la referencia, no se anadio detergente (“referenda”).

Esto fue seguido por la adicion de 200 pl de cloroformo y se agito con vortex.

5. Las muestras se centrifugaron durante 15 min a 12.000xg a 4 0C y la fase acuosa resultante se transfirio a nuevos tubos Eppendorf.

6. Se anadieron 1,5 volumenes de etanol absoluto a cada fase acuosa y se mezclo.

7. La mezcla se transfirio a mini columnas RNeasy (Qiagen) y se centrifugo durante 15s a 8.200xg, seguido por un lavado con 700 pl de tampon RWT (Qiagen) y posterior centrifugacion, 15s en 8.200xg.

5

10

15

20

25

30

35

40

8. Las columnas se lavaron a continuacion dos veces con 500 |jl de tampon RPE (Qiagen), se centrifugaron a 8.200xg durante 15 segundos y 2 minutos, respectivamente, seguido de una etapa de centrifugacion final a la velocidad maxima durante 1 minuto.

9. El ARN unido se eluyo en 30 jl de agua libre de ARNasa por centrifugacion a 8.200xg durante 1 min y la concentracion de ARN se determino espectroscopicamente utilizando un NanoDrop (ThermoScientific). Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Cuantificacion del ARN aislado utilizando Triton X-100, Tween 20, CTAB o TTAB como detergentes. La cuantificacion de los acidos nucleicos se realizo utilizando un espectrometro NanoDrop (ThermoScientific).

detergente: A260 A280 260/280 260/230 ng/pl Rendimiento de ARN [pg] Media

Blanco: -0,008 -0,024 0,33 3,10 -0,32

Triton x-100: 35.705 17.434 2,05 1,95 1428,2 42,85 37,71

Triton x-100: 27.149 13.336 2,04 1,96 1085,95 32,58

Tween20: 31.686 15.717 2,02 1,96 1267,46 38,02 36,14

Tween20: 28.553 14.056 2,03 1,98 1142,1 34,26

CTAB: 26.687 13.115 2,03 1,97 1067,46 32,02 32,24

CTAB: 27.039 13.182 2,05 1,97 1081,56 32,45

TTAB: 27.278 13.353 2,04 1,98 1091,11 32,73 34,49

TTAB: 30.206 14.758 2,05 1,98 1208,25 36,25

referencia: 29.524 14.469 2,04 1,93 1180,97 35,43 32,23

referencia: 24.184 11.942 2,03 1,82 967,37 29,02

Como puede verse, todas las variantes de protocolo dan como resultado un buen rendimiento de ARN. Sin embargo, los metodos de espectrometria utilizados no diferencian estrictamente entre ARN y ADN y, por tanto, el ARN, asi como el ADN se determina en el “rendimiento de ARN”. El rendimiento de ARN puro se mejora cuando se utiliza el metodo de acuerdo con la presente invencion en comparacion con el metodo de referencia y los metodos que utilizan los detergentes no cationicos Triton y Tween, debido a que la cantidad de ADN en el ARN aislado se reducia considerablemente cuando se utiliza el metodo de acuerdo con la presente invencion como posteriormente se demuestra por la correspondiente Tabla 3 y la Figura 1.

10. La integridad del ARN se evaluo usando un Agilent BioAnalyzer 2100® para comparar la influencia de los detergentes probados sobre la integridad del ARN. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Valores RIN (numero de integridad del ARN) superiores indican un mayor grado de integridad del ARN. Los ________________yalores RIN varian entre 10 (ARN intacto) y 1 (ARN totalmente degradado). ^_______________

detergente: Triton Tween CTAB TTAB Ref.

Area de ARN: 1207,1 1105 810,8 793,2 891,3

Conc. de ARN: 520 ng/pl 476 ng/pl 349 ng/pl 342 ng/pl 384 ng/pl

Relacion [28s/18s]: 1,2 1,4 1,4 1,4 1,4

RIN: 8,0 8,30 8,90 8,90 8,60

La Tabla 2 muestra que los numeros RIN mas altos se obtienen con el metodo de acuerdo con la presente invencion. Por lo tanto, la integridad del ARN del ARN aislado con el metodo de acuerdo con la presente invencion es mejor que la integridad del ARN del ARN que se aislo utilizando el metodo de referencia o cuando se anadian otros detergentes no cationicos.

11. Las muestras de ARN se diluyeron 1:50 con agua libre de ARNasa y a continuacion se sometieron a transcripcion inversa con 10 pmol de cebadores especificos del gen y sonda (mezcla de cebador PGK1, sonda PGK1) usando cada uno un kit QuantiTect RT-PCR (Qiagen) con y sin transcriptasa inversa en un volumen de reaccion de 25 pl:

(1) 30 min a 50 0C

(2) 15 min a 95 0C

(3) 15 s a 95 0C

(4) 1 min a 60 0C, repetir los pasos (3), (4) durante 40 ciclos.

Los valores de Ct y ACt resultantes se muestran en la Tabla 3 y la Figura 1 a) (valores Ct) y 1b) (valores ACt).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Tabla 3: Resultados de qRT-PCR llevados a cabo utilizando el ARN aislado del ejemplo 1 .”-RT” indica reacciones de control, que no contienen la transcriptasa inversa, “+ RT” indica reacciones qRT-PCR con transcriptasa inversa.

: Ct - RT Ct + RT ACt

Triton: 35,42 24,27 11,15

Tween: 37,31 24,47 12,84

CTAB: 39,61 24,55 15,06

TTAB: 39,45 24,42 15,03

Ref.: 37,29 24,36 12,93

En las reacciones “- RT”, solamente las contaminaciones de ADN pueden servir como molde y, en consecuencia, se amplifican en la PCR (el ARN no se transcribe inversamente en las reacciones “- RT” y, por tanto, no puede servir como molde). Por lo tanto, en las muestras que comprenden cantidades bajas de aDn, el umbral se alcanza despues de mas ciclos y, en consecuencia, los valores de Ct son mas altos. Por lo tanto, cuanto mayor es el valor Ct en la reaccion “- RT”, menor es la cantidad de molde y por lo tanto, menor es la cantidad de contaminaciones de ADN en el ARN aislado. Los mayores valores de Ct se consiguen con el metodo de acuerdo con la presente invencion. A fin de garantizar que los valores de Ct superiores no son atribuibles a un rendimiento global inferior de acidos nucleicos, se determinaron valores de Ct para la reaccion “+ RT”, en el que el ARN se transcribe de forma inversa y, en consecuencia, puede servir como molde para la PCR. Los valores de Ct son mas bajos en todas las reacciones “+ RT”, porque en las mismas, el ARN transcrito inversamente (y las contaminaciones de ADN) pueden servir como molde para la PCR y, por tanto, el umbral se alcanza antes que en las reacciones “- RT”. Como puede verse a partir de los resultados, los valores de Ct obtenidos son aproximadamente iguales en todas las muestras analizadas.

Los valores de ACt (ACt = (Ct de la reaccion “-RT”) - (Ct de la reaccion “+ RT”)) muestran las diferencias entre las dos reacciones y, por tanto, indican la cantidad de contaminaciones de ADN en el ARN aislado. Cuanto mayor es el valor ACt, menor es la cantidad de contaminacion de ADN en el ARN aislado. La Tabla 3 y la Figura 1 a) y b) demuestran, que el ARN aislado de acuerdo con la presente invencion en el que se anadieron detergentes cationicos comprende considerablemente menos cantidades de contaminaciones de ADN que el metodo de referencia. Por lo tanto, las contaminaciones de ADN se reducen de manera efectiva por las ensenanzas de la presente invencion. Los otros detergentes, no cationicos no fueron capaces de reducir la cantidad de contaminacion de ADN. Por el contrario, incluso condujeron a un aumento del ADN en el ARN aislado, como se puede ver a partir de los valores de ACt que son incluso menores que el valor ACt del metodo de referencia.

Ejemplo 2:

El siguiente experimento se realizo para evaluar la cantidad de ADN genomico co-purificado durante el aislamiento de ARN de diferentes tejidos usando el reactivo Qiazol al tiempo que se anade el detergente directamente al homogeneizado:

1. Se homogeneizaron 200 mg de pulmon, rinon, corazon, bazo y tejido cerebral estabilizado con RNAlater en 8 ml de reactivo Qiazol, usando un homogeneizador TissueRuptor.

2. Los homogeneizados, 1000 gl cada uno (correspondiente a 25 mg de tejido por muestra), se dividieron en alicuotas en tubos Eppendorf de 2 ml y se anadieron a los mismos 100 gl de las siguientes soluciones madre de detergente:

- Bromuro de cetil-trimetilamonio [1 %], CTAB

- Bromuro de tetra-deciltrimetilamonio [1 %], TTAB.

Para la referencia, no se anadio detergente (“referencia”).

Esto fue seguido por la adicion de 200 gl de cloroformo y se agito en vortex.

3. Las muestras se centrifugaron durante 15 min a 12.000xg a 4 0C y la fase acuosa resultante se transfirio a nuevos tubos Eppendorf.

4. El sobrenadante se mezclo con 1,5 volumenes de etanol absoluto y las fases acuosas se transfirieron a las mini columnas RNeasy (Qiagen) y se centrifugo durante 15s a 8.200xg, seguido de un lavado con 700 gl de tampon RWT (Qiagen) y posterior centrifugacion, 15s a 8.200xg.

5. Las columnas se lavaron a continuacion dos veces con 500 gl de tampon RPE (Qiagen), se centrifugaron a 8.200xg durante 15 segundos y 2 minutos, respectivamente, seguido de una etapa de centrifugacion final a la velocidad maxima durante 1 minuto.

6. El ARN unido se eluyo en 30 gl de agua libre de ARNasa por centrifugacion a 8.200xg durante 1 min y la concentracion de ARN se determino espectroscopicamente utilizando un NanoDrop (ThermoScientific). Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Cuantificacion del ARN aislado de los tejidos estabilizados con RNAlater sin utilizar detergente (“-“), (“CTAB”) [1 %] o (“TTAB”) [1 %]. La cuantificacion del ARN se realizo utilizando un NanoDrop (ThermoScientific).

Tejido: Detergente A260 A280 260/280 260/230 ng/pl Rendimiento de ARN [pg] Media

Pulmon: - 46.489 36.654 22.449 17.840 2,07 2,05 2,14 2,10 1860,0 1466,0 55,80 43,98 49,89

Pulmon: CTAB 28.391 13.337 2,13 2,10 1136,0 34,08 34,22

28.615: 13.288 2,15 2,12 1145,0 34,35

Pulmon: TTAB 32.779 15.829 2,07 2,12 1311,0 39,33 39,50

33.057: 15.950 2,07 2,12 1322,0 39,66

Rinon: - 67.937 33.207 2,05 2,15 2717,0 81,51 80,39

66.060: 32.092 2,06 2,13 2642,0 79,26

Rinon: CTAB 61.260 30.006 2,04 2,03 2450,0 73,50 70,53

56.288: 27.522 2,05 2,09 2252,0 67,56

Rinon: TTAB 83.496 41.914 1,99 2,03 3340,0 100,20 94,16

73.435: 36.589 2,01 2,08 2937,0 88,11

Corazon: - 39.950 19.412 2,06 2,16 1598,0 47,94 41,63

29.422: 14.065 2,09 2,18 1177,0 35,31

Corazon: CTAB 23.998 11.216 2,14 2,22 959,9 28,80 28,47

23.445: 11.083 2,12 2,22 937,8 28,13

Corazon: TTAB 30.764 14.469 2,13 2,05 1231,0 36,93 34,97

27.505: 13.121 2,10 2,15 1100,0 33,00

Bazo: - 67.898 33.537 2,02 1,99 2716,0 81,48 80,78

66.713: 32.764 2,04 2,02 2669,0 80,07

Bazo: CTAB 65.670 33.013 1,99 2,03 2627,0 78,81 69,66

50.415: 24.906 2,02 2,04 2017,0 60,51

Bazo: TTAB 63.087 30.851 2,04 2,03 2523,0 75,69 72,21

57.286: 27.859 2,06 2,02 2291,0 68,73

Cerebro: - 23.881 11.279 2,12 2,15 955,2 28,66 30,11

26.289: 12.786 2,06 2,16 1052,0 31,56

Cerebro: CTAB 24.501 11.645 2,10 2,11 980,0 29,40 29,81

25.168: 11.965 2,10 2,03 1007,0 30,21

Cerebro: TTAB 22.299 10.787 2,07 2,14 892,0 26,76 26,92

22.572: 10.757 2,10 2,16 902,9 27,09

5 Como puede verse, el rendimiento fue bueno con todos los protocolos, pero el ARN aislado con el metodo de acuerdo con la presente invencion comprende mucho menos ADN y, por lo tanto, el rendimiento de ARN puro incluso aumento como tambien se demostro posteriormente en la Tabla 6.

7. La integridad del ARN se evaluo mediante un Agilent Bioanalyzer 2100, los resultados se muestran en la Tabla 5.

10 Tabla 5: Evaluacion de la integridad del ARN, que se aislo en el ejemplo 2 usando un Agilent Bioanalyzer 2100.

detergente: - CTAB TTAB - CTAB TTAB

Tejido: pulmon pulmon pulmon rinon rinon rinon

Area de ARN: 178,6 143 165,3 435,3 331,5 347,8

Conc. de ARN: 93 ng/pl 74 ng/pl 86 ng/pl 226 ng/pl 172 ng/pl 180 ng/pl

Relacion [28s/18s]: 1,6 1,5 1,5 1,4 1,4 1,5

RIN: 9,40 9,60 9,80 9,10 9,10 9,0

detergente: - CTAB TTAB - CTAB TTAB

Tejido: corazon corazon corazon bazo bazo bazo

Area de ARN: 163,4 138,7 121,9 403,8 444,4 435,2

Conc, de ARN: 85 ng/|l 72 ng/|l 63 ng/|l 209 ng/|l 230 ng/|l 226 ng/|l

Relacion [28s/18s]: 1,4 1,5 1,5 1,3 1,5 1,6

RIN: 8,70 8,70 8,60 7,0 7,90 7,90

Como antes, el RIN es o bien igual al del metodo de referenda o incluso mejor cuando se utiliza el metodo de acuerdo con la presente invencion.

8. Las muestras de ARN se diluyeron con agua libre de ARNasa como sigue: pulmon 1:80, rinon 1:100, corazonl :50, 5 bazo 1: 100, cerebro 1:50. Dos gl de cada dilucion se sometieron a transcripcion inversa con 10 pmol de cebadores especificos del gen y sonda (mezcla de cebador PGK1, sonda PGK1) utilizando un kit QuantiTect RT-PCR (Qiagen) con y sin transcriptasa inversa en un volumen de reaccion de 25 |l:

(1) 30 min a 50 0C 10 (2) 15 min a 95 0C

(3) 15 s a 95 0C

(4) 1 min a 60 0C, repetir los pasos (3), (4) durante 40 ciclos.

Los valores de Ct y ACt resultantes se muestran en la Tabla 6 y la correspondiente Figura 2 a) y 2 b).

15

Tabla 6: Cuantificacion de la co-purificacion del ADN genomico mediante qRT-PCR utilizando el kit “QuantiTect RT- PCR” (Qiagen) con mezcla de cebador PGK1especifico del gen, sonda PGK1. “-RT” indica reacciones sin la ____________________transcriptasa inversa, “+ RT” reacciones con transcriptasa inversa____________________

Pulmon: Ct - RT Ct + RT ACt

-: 35,79 23,26 12,53

CTAB: 37,69 23,75 13,94

TTAB: 36,61 23,41 13,20

Rinon: Ct - RT Ct + RT ACt

-: 36,02 20,10 15,92

CTAB: 37,92 20,89 17,03

TTAB: 37,61 20,50 17,11

Corazon: Ct - RT Ct + RT ACt

-: 34,03 20,85 13,18

CTAB: 36,67 21,09 15,58

TTAB: 36,32 21,10 15,23

Bazo: Ct - RT Ct + RT ACt

-: 33,27 21,68 11,60

CTAB: 35,14 21,78 13,36

TTAB: 34,55 21,59 12,97

Cerebro: Ct - RT Ct + RT ACt

-: 35,69 21,44 14,25

CTAB: 36,52 21,22 15,31

TTAB: 37,13 21,46 15,67

20 Como puede deducirse a partir de los valores de ACt mas altos (vease tambien la figura 2 b), el metodo de acuerdo con la presente invencion reduce considerablemente la cantidad de contaminaciones de ADN en el ARN aislado a partir de diferentes muestras de tejido. Asi, el metodo de acuerdo con la presente invencion es particularmente adecuado para el aislamiento de ARN puro a partir de diferentes tejidos.

Ejemplo 3:

Se aislo ARN de cantidades crecientes de tejido utilizando el reactivo Qiazol, anadiendo el detergente cationico directamente al homogeneizado de acuerdo con el siguiente procedimiento:

5 1. Se homogeneizaron 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg y 50 mg de (a) higado estabilizado con RNAlater o (b) higado

congelado en 1 ml de reactivo Qiazol usando un homogeneizador TissueRuptor.

2. Se anadieron 100 pl de las siguientes soluciones madre de detergente:

- Bromuro de cetil-trimetilamonio [1 %], CTAB 10 - Bromuro de tetra-deciltrimetilamonio [1 %], TTAB.

15

20

25

Para la referencia, no se anadio detergente (“referenda”).

Esto fue seguido por la adicion de 200 gl de cloroformo y se agito en vortex.

3. Las muestras se centrifugaron durante 15 min a 12.000xg a 4 °C y la fase acuosa resultante se transfirio a nuevos tubos Eppendorf.

6. El ARN unido se eluyo en 30 gl de agua libre de ARNasa por centrifugacion a 8.200xg durante 1 min y la concentracion de ARN se determino espectroscopicamente utilizando un NanoDrop (ThermoScientific). Los resultados se muestran en las Tablas 7 y 8 y las Figuras 3 y 4.

Tabla 7: ARN aislado de cantidades crecientes de tejido hepatico estabilizado con RNAlater. La cantidad de tejido

detergente: Tejido [mg] A260 A280 260/280 260/230 ng/gl Rendimiento [gg] Media [gg]

-: 5 mg 24.452 11.957 2,05 1,78 978,1 29,34 26,78

-: 20.184 9.772 2,07 1,67 807,4 24,22

CTAB: 5 mg 27.690 13.550 2,04 1,63 1108 33,24 30,39

CTAB: 22.943 11.122 2,06 1,84 917,7 27,53

TTAB: 5 mg 26.255 12.763 2,06 1,81 1050 31,50 32,37

TTAB: 27.692 13.517 2,05 1,84 1108 33,24

-: 10 mg 32.399 15.988 2,03 1,74 1296 38,88 36,56

-: 28.529 14.006 2,04 1,84 1141 34,23

CTAB: 10 mg 35.878 17.622 2,04 1,65 1435 43,05 39,93

CTAB: 30.673 14.941 2,05 1,75 1227 36,81

TTAB: 10 mg 33.162 16.048 2,07 1,68 1326 39,78 37,37

TTAB: 29.124 14.254 2,04 1,66 1165 34,95

-: 20 mg 47.934 23.695 2,02 1,88 1917 57,51 57,72

-: 48.286 23.939 2,02 1,91 1931 57,93

CTAB: 20 mg 42.961 21.064 2,04 1,94 1718 51,54 51,50

CTAB: 42.875 21.048 2,04 1,93 1715 51,45

TTAB: 20 mg 50.276 24.630 2,04 1,87 2011 60,33 55,46

TTAB: 42.155 20.318 2,07 1,94 1686 50,58

-: 30 mg 52.353 25.974 2,02 1,57 2094 62,82 61,40

-: 49.972 24.760 2,02 1,68 1999 59,97

CTAB: 30 mg 47.091 23.258 2,02 1,66 1884 56,52 54,38

CTAB: 43.525 21.625 2,01 1,72 1741 52,23

TTAB: 30 mg 39.126 19.177 2,04 1,72 1565 46,95 46,02

TTAB: 37.573 18.623 2,02 1,76 1503 45,09

-: 50 mg 54.934 27.221 2,02 1,37 2197 65,91 65,99

-: 55.061 27.002 2,04 1,62 2202 66,06

CTAB: 50 mg 48.503 23.899 2,03 1,54 1940 58,20 56,69

CTAB: 45.963 22.397 2,05 1,68 1839 55,17

TTAB: 50 mg 42.100 20.818 2,02 1,61 1684 50,52 48,14

TTAB: 38.122 18.843 2,02 1,73 1525 45,75

Tabla 8: ARN aislado de cantidades crecientes de tejido hepatico congelado. La cantidad de tejido varia de 5 mg a ______50 mg. El rendimiento de ARN tambien se represento ^ en forma de graficos de barras (ver Figura 4).______

detergente: Tejido [mg] A260 A280 260/280 260/230 ng/pl Rendimiento [pg] Media [pg]

-: 5 mg 22.364 10.897 2,05 1,79 894,6 26,84 25,35

-: 19.890 9.507 2,09 1,66 795,6 23,87

CTAB: 5 mg 20.513 10.067 2,04 1,84 820,5 24,62 22,95

CTAB: 17.732 8.776 2,02 1,83 709,3 21,28

TTAB: 5 mg 15.694 7.761 2,02 1,85 627,8 18,83 18,22

TTAB: 14.671 7.324 2,00 1,75 586,8 17,60

-: 10 mg 34.160 16.683 2,05 1,91 1366 40,98 36,30

-: 26.352 12.897 2,04 1,85 1054 31,62

CTAB: 10 mg 28.975 14.074 2,06 1,86 1159 34,77 38,04

CTAB: 34.420 16.551 2,08 1,88 1377 41,31

TTAB: 10 mg 33.370 16.137 2,07 1,90 1335 40,05 37,56

TTAB: 29.217 14.178 2,06 1,90 1169 35,07

-: 20 mg 40.552 19.820 2,05 1,65 1622 48,66 45,93

-: 36.012 17.575 2,05 1,75 1440 43,20

CTAB: 20 mg 32.167 15.513 2,07 1,83 1287 38,61 41,58

CTAB: 37.117 18.403 2,02 1,87 1485 44,55

TTAB: 20 mg 42.320 20.829 2,03 1,82 1693 50,79 47,67

TTAB: 37.131 18.027 2,06 1,74 1485 44,55

-: 30 mg 44.764 21.929 2,04 1,71 1791 53,73 50,93

-: 40.108 19.658 2,04 1,82 1604 48,12

CTAB: 30 mg 36.568 17.965 2,04 1,66 1463 43,89 43,32

CTAB: 35.634 17.471 2,04 1,68 1425 42,75

TTAB: 30 mg 32.383 15.709 2,06 1,82 1295 38,85 45,36

TTAB: 43.215 21.409 2,02 1,85 1729 51,87

-: 50 mg 51.985 25.841 2,01 1,59 2079 62,37 63,18

-: 53.315 26.260 2,03 1,72 2133 63,99

CTAB: 50 mg 44.704 21.817 2,05 1,79 1788 53,64 52,92

CTAB: 43.495 21.121 2,06 1,73 1740 52,20

TTAB: 50 mg 44.839 21.898 2,05 1,84 1794 53,82 51,54

TTAB: 41.056 20.090 2,04 1,66 1642 49,26

5

7. La integridad del ARN se evaluo usando un Agilent Bioanalyzer 2100, los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10.

Tabla 9: Integridad del ARN de ARN aislado de tejido estabilizado con RNAlater ensayado con un Agilent 10 ______________________________________Bioanalyzer 2100:__________________________________

detergente: - CTAB TTAB - CTAB TTAB

Cantidad de tejido: 5 mg 5 mg 5 mg 10 mg 10 mg 10 mg

Area de ARN: 377,1 441,4 511,4 574,5 552,1 582,6

Conc. de ARN: 173 ng/pl 203 ng/pl 235 ng/pl 264 ng/pl 253 ng/pl 267 ng/pl

Relacion [28s/18s]: 1,6 1,6 1,6 1,5 1,7 1,5

RIN: 9,40 9,60 9,60 9,30 9,70 9,40

detergente: - CTAB TTAB - CTAB TTAB

Cantidad de tejido: 20 mg 20 mg 20 mg 30 mg 30 mg 30 mg

Area de ARN Conc. de ARN Relacion [28s/18s] RIN: 1109,6 955,9 806,6 967 991,4 749,4

509 ng/pl: 439 ng/pl 370 ng/pl 444 ng/pl 455 ng/pl 344 ng/pl

1,5
1,5
1,5: 1,6 1,6 1,4

9,10: 9,40 9,40 9,10 9,10 8,90

Tabla 10: Integridad del ARN de ARN aislado de muestras de tejido congelado ensayado con un Agilent Bioanalyzer

2100:

detergente: - CTAB TTAB - CTAB TTAB

Cantidad de tejido: N.°1 N.2 2 N.2 3 N.2 4 N.2 5 N.2 6

Area de ARN: 313,8 329,7 273,7 656,9 517,0 557,8

Conc. de ARN: 165 ng/pl 173 ng/pl 144 ng/pl 345 ng/pl 272 ng/pl 293 ng/pl

Relacion [28s/18s]: 1,7 1,8 1,7 1,8 1,8 1,8

RIN: 9,80 9,70 9,80 9,60 9,60 9,70

detergente: - CTAB TTAB - CTAB TTAB

Cantidad de tejido: N.2 7 N.2 8 N.2 9 N.2 10 N.2 11 N.2 12

Area de ARN: 681 629,9 715,4 776,7 641,6 638,9

Conc. de ARN: 358 ng/pl 331 ng/pl 376 ng/pl 408 ng/pl 337 ng/pl 336 ng/pl

Relacion [28s/18s]: 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0

RIN: 9,60 9,50 9,70 9,70 9,70 9,50

5 Como puede verse, el valor RIN es excelente para el ARN aislado por el metodo de acuerdo con la presente invencion.

8. Las muestras de ARN se diluyeron 1:70 con agua libre de ARNasa. Dos pl de esta dilucion se sometieron a continuacion a transcripcion inversa con 10 pmol de cebador especifico de gen y sonda (mezcla de cebador PGK1, sonda PGK1) cada uno usando un kit QuantiTect RT-PCR (Qiagen) con y sin transcriptasa inversa en un volumen 10 de reaccion de 25 pl:

(1) 30 min a 50 °C

(2) 15 min a 95 0C

(3) 15 s a 95 0C

15 (4) 1 min a 60 0C, repetir los pasos (3), (4) durante 40 ciclos.

Los valores de Ct y ACt resultantes se enumeran en la Tabla 11 a) y b) y se representan como graficos de barras en la Figura 5 a) y b).

20 Tabla 11 a) y b): Ensayos de qRT-PCR utilizando el kit “QuantiTect RT-PCR” (Qiagen) para evaluar la co-

purificacion del ADN genomico y, por lo tanto, la contaminacion durante el aislamiento del ARN a partir de tejido hepatico estabilizado con RNAlater ((a)) y congelado ((b)) sin detergente (“-”), CTAB o TTAB como se indica por las cantidades crecientes de tejido. Los graficos de barras mostrados en la Fig. 5 a) y b) ilustran la disminucion de ADN genomico de acuerdo con los valores de ACt mostrados en la Tabla 11 a) y b).

25

a)

higado estabilizado con RNAlater

detergente: cantidad de tejido Ct - RT Ct + RT Act

-: 5 mg 36,53 23,54 12,99

CTAB: 5 mg 36,89 23,25 13,64

TTAB: 5 mg 37,36 23,22 14,14

-: 10 mg 35,19 22,56 12,63

CTAB: 10 mg 37,67 22,98 14,70

TTAB: 10 mg 37,11 22,84 14,28

-: 20 mg 34,38 22,44 11,94

CTAB: 20 mg 36,95 22,19 14,76

TTAB: 20 mg 36,45 22,61 13,84

-: 30 mg 34,88 22,85 12,04

CTAB: 30 mg 38,29 22,62 15,67

TTAB: 30 mg 36,80 22,47 14,33

-: 50 mg 34,67 22,19 12,48

CTAB: 50 mg 37,29 22,52 14,77

TTAB: 50 mg 36,70 22,58 14,13

b)

higado congelado

detergente: cantidad de tejido Ct - RT Ct + RT Act

-: 5 mg 34,80 23,78 11,02

CTAB: 5 mg 36,53 23,52 13,01

TTAB: 5 mg 36,46 24,11 12,35

-: 10 mg 33,85 23,24 10,61

CTAB: 10 mg 35,97 23,00 12,97

TTAB: 10 mg 36,35 23,21 13,14

-: 20 mg 34,07 22,77 11,31

CTAB: 20 mg 36,28 23,08 13,20

TTAB: 20 mg 36,85 22,94 13,91

-: 30 mg 34,66 22,75 11,91

CTAB: 30 mg 36,59 22,78 13,81

TTAB: 30 mg 36,37 22,52 13,85

-: 50 mg 33,94 22,56 11,38

CTAB: 50 mg 36,10 22,21 13,89

TTAB: 50 mg 36,46 22,43 14,03

Ejemplo 4:

El efecto sobre la co-purificacion del ADN genomico durante el aislamiento de ARN se evaluo utilizando cantidades 5 variables de un detergente cationico, el cual se anadio directamente al homogeneizado de acuerdo con el siguiente

procedimiento con cuatro preparaciones de ARN individuales por condicion:

1. Se homogeneizaron 930 mg de higado estabilizado con RNAlater en 31 ml de reactivo Qiazol usando un homogeneizador TissueRuptor.

2. Los homogeneizados, 1000 gl cada uno (corresponde a 30 mg de higado), se dividen en alicuotas en tubos

10 Eppendorf de 2 ml y a las muestras no se anadio detergente o se anadieron cantidades crecientes de una solucion

madre CTAB 1 %: 50 gl, 100 gl, 150 gl, 200 gl seguido de la adicion de 200 gl de cloroformo y agitacion en vortex.

3. Las muestras se centrifugaron durante 15 min a 12.000xg a 4 °C, la fase acuosa resultante se transfirio a nuevos tubos Eppendorf.

4. El sobrenadante se mezclo con 1,5 volumenes de etanol absoluto y las fases acuosas se transfirieron a mini 15 columnas RNeasy (Qiagen) y se centrifugo durante 15s a 8.200xg, seguido de un lavado con 700 gl de tampon RWT

(Qiagen) y posterior centrifugacion, 15s a 8.200xg.

20 6. El ARN unido se eluyo en 30 gl de agua libre de ARNasa por centrifugacion a 8.200xg durante 1 min y la

concentracion de ARN se determino utilizando un espectrometro NanoDrop (ThermoScientific). Los resultados se muestran en la Tabla 12 y la Figura 6.

Tabla 12: Influencia de cantidades crecientes de CTAB durante la extraccion de ARN sobre la recuperacion de ARN. Se realizaron cuatro aislamientos independientes de ARN para cada condicion. “Referenda” indica que no se anadio

CTAB durante el aislamiento de ARN.

pi CTAB: A260 A280 260/280 260/230 ng/pi Rendimiento [pg] Media

referencia: 61.772 30.792 2,01 1,84 2471 74,13

referencia: 61.338 30.397 2,02 1,76 2454 73,62 71,97

referencia: 54.492 26.881 2,03 1,75 2180 65,40

referencia: 62.267 30.651 2,03 1,76 2491 74,73

5

50 pi 50 pi 50 pi 50 pi: 56.441 50.333 37.408 59.050 27.980 24.700 18.097 29.230 2,02 2,04 2,07 2,02 1,77 1,84 1,91 1,82 2258 2013 1496 2362 67,74 60,39 44,88 70,85 60,97

100 pi: 54.058 26.644 2,03 1,74 2152 64,85

100 pi: 52.015 25.405 2,05 1,78 2081 62,43 60,11

100 pi: 45.635 22.325 2,04 1,80 1825 54,75

100 pi: 48.680 23.947 2,03 1,82 1947 58,41

150 pi: 52.744 26.175 2,02 1,64 2110 63,30

150 pi: 46.100 22.432 2,05 1,83 1844 55,32 56,39

150 pi: 44.619 21.694 2,05 1,90 1785 53,55

150 pi: 44.492 21.652 2,05 1,81 1780 53,40

200 pi: 41.886 20.785 2,02 1,76 1675 50,25

200 pi: 41.403 20.379 2,03 1,80 1656 49,68 50,55

200 pi: 42.729 20.774 2,05 1,79 1709 51,27

200 pi: 42.509 20.974 2,03 1,84 1700 51,00

Los resultados tambien se resumen en la Figura 6. La presumible disminucion en el rendimiento de ARN entre el metodo de referencia y el metodo de acuerdo con la presente invencion es atribuible en gran medida a una disminucion de ADN genomico en el ARN aislado, y no a una disminucion de ARN, lo que entre otros viene apoyado 10 por los ensayos de QRT-PCR (vease la Figura 7) y los otros ejemplos presentados en la presente memoria.

7. La integridad del ARN se evaluo usando un Agilent BioAnalyzer 2100. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13: Efectos de cantidades crecientes de CTAB sobre la integridad del ARN. Los eluidos de ARN se diluyeron ________ 1:10 con agua libre de^ ARNasa y se analizaron usando un Agilent Bioanalyzer 2100. _________

pi CTAB: referencia referencia 50 pi 50 pi 100 pi 100 pi 150 pi 150 pi

Area de ARN: 338,6 433,3 378,5 356,2 305,3 309,5 337,8 249,7

Conc. de ARN: 138 ng/pl 177 ng/pl 154 ng/pl 145 ng/pl 124 ng/pl 126 ng/pl 138 ng/pl 102 ng/pl

Reiacion [28s/18s]: 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6

RIN: 9,50 9,50 9,50 9,50 9,50 9,50 9,50 9,50

15

8. Las muestras de ARN se diluyeron 1:90 con agua libre de ARNasa y se sometieron a transcripcion inversa con 10 pmol de cebador especifico de gen y sonda cada uno (mezcla de cebador PGK1, sonda PGK1) utilizando un kit QuantiTect RT-PCR (Qiagen) con y sin transcriptasa inversa en un volumen de reaccion de 25 pl:

20 (1) 30 min a 50 0C

(2) 15 min a 95 0C

(3) 15 s a 95 0C

(4) 1 min a 60 0C, repetir los pasos (3), (4) durante 40 ciclos.

25 Los valores de Ct y ACt resultantes se muestran en la Tabla 14 y la correspondiente Figura 7.

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 14: Extraccion de ADN genomico cuantificado por cantidades crecientes de CTAB durante el aislamiento de ARN mediante ensayos de qRT-PCR utilizando el kit “QuantiTect RT-PCR” (Qiagen) aumentando las cantidades de CTAB evaluadas por qRT-PCR. Los ensayos de qRT-PCR se realizaron de acuerdo con el ejemplo 4._____

: Ct - RT Ct + RT Act

Referencia: 36,79 23,46 13,33

50 gl CTAB: 38,21 23,57 14,64

100 gl CTAB: 38,61 23,73 14,88

150 gl CTAB: 39,35 23,60 15,75

200 gl CTAB: 38,77 23,55 15,22

Los resultados tambien se ilustran en la Figura 7. Como puede verse, el aumento de la cantidad de CTAB tuvo como resultado un aumento de la reduccion de las contaminaciones de ADN en el ARN aislado.

Ejemplo 5:

Para comparar el efecto sobre la co-purificacion del ADN genomico durante el aislamiento de ARN de tejido utilizando dos soluciones de detergentes cationicos diferentes (CTAB y el tampon “BB” (Qiagen, contiene 1 % de CTAB y una sal)) se llevo a cabo el siguiente experimento:

1. Se homogeneizaron 425 mg de bazo estabilizado con RNAlater y 425 mg de bazo congelado en 31 ml de reactivo Qiazol, usando cada uno un homogeneizador TissueRuptor.

2. Los homogeneizados, 1000 gl cada uno, se dividieron en alicuotas en tubos Eppendorf de 2 ml y se anadieron directamente al homogeneizado 100 pl de las siguientes soluciones madre:

- Bromuro de cetil-trimetilamonio [1 %], CTAB

- Tampon Qiagen BB (1 % CTAB en NaCl)

Para la referencia, no se anadio detergente (“referenda”).

Esto fue seguido por la adicion de 200 gl de cloroformo y se agito en vortex.

4. El sobrenadante se mezclo con 1,5 volumenes de etanol absoluto y la fase acuosa se transfirio a mini columnas RNeasy (Qiagen) y se centrifugo durante 15s a 8.200xg, seguido de un lavado con 700 gl de tampon RWT (Qiagen) y posterior centrifugacion, 15s a 8.200xg.

6. El ARN unido se eluyo en 30 gl de agua libre de ARNasa por centrifugacion a 8.200xg durante 1 min y la concentracion de ARN se determino espectroscopicamente utilizando un NanoDrop (ThermoScientific). Los resultados se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15: Cuantificacion de ARN aislado de bazo estabilizado con RNAlater (“RNAlater”) o congelado (“congelado”) utilizando dos composiciones que contienen diferentes detergentes cationicos, que se anadieron directamente al homogeneizado. “Referencia” indica que no se anadio detergente o tampon. Se llevaron a cabo cuatro

tejido: tampon A260 A280 A260/280 A260/230 ng/gl Rendimiento [gg] Media

RNAlater: referencia 71.422 36.032 1,98 1,91 2857 85,71 81,68

69.842: 35.012 1,99 1,89 2794 83,82

61.597: 30.460 2,02 1,91 2464 73,92

70.124: 35.122 2,00 1,97 2805 84,15

67.317: 33.899 1,99 1,97 2693 80,79

RNAlater: 100 pl CTAB 72.124 36.581 1,97 1,99 2885 86,55 87,45

149.061: 73.708 2,02 2,02 5962 178,86

73.858: 36.688 2,01 1,99 2954 88,62

72.922: 37.341 1,95 1,98 2917 87,51

72.588: 36.490 1,99 2,01 2904 87,12

RNAlater: 100 gl tampon BB 76.363 38.307 1,99 1,99 3055 91,65 84,30

74.162: 37.259 1,99 1,98 2966 88,98

73.515: 37.149 1,98 1,99 2941 88,23

60.654: 30.132 2,01 1,98 2426 72,78

66.558: 32.823 2,03 2,06 2662 79,86

congelado: referencia 60.330 30.174 2,00 1,83 2413 72,39 65,43

51.787: 26.151 1,98 1,86 2071 62,13

53.694: 27.049 1,99 1,85 2148 64,44

49.318: 24.708 2,00 1,67 1973 59,19

57.510: 29.020 1,98 1,85 2300 69,00

congelado: 100 gl CTAB 58.830 29.681 1,98 1,87 2353 70,59 69,54

51.649: 25.876 2,00 1,92 2066 61,98

58.727: 29.401 2,00 1,94 2349 70,47

60.331: 30.073 2,01 1,92 2413 72,39

60.223: 30.488 1,98 1,71 2409 72,27

congelado: 100 gl tampon BB 50.196 25.252 1,99 1,91 2008 60,24 64,54

53.888: 26.953 2,00 1,92 2156 64,68

49.138: 24.273 2,02 1,89 1966 58,98

59.651: 30.126 1,98 1,92 2386 71,58


: 55.991 28.220 1,98 1,92 2240 67,20

7. La integridad del ARN se evaluo usando un Agilent BioAnalyzer 2100, vease la Tabla 16.

5 Tabla 16: Comparacion de la integridad del ARN de ARN aislado de bazo estabilizado con RNAlater y congelado de acuerdo con el ejemplo 5. Los eluidos de ARN se diluyeron 1:10 en agua libre de ARNasa antes de analizarlos en un ___________________________________Agilent Bioanalyzer 2100.___________________________________

RNAlater: referencia referencia CTAB CTAB BB BB

Area de ARN: 536,4 525,2 717,9 666,0 891,9 605,3

Conc. de ARN: 267 ng/gl 262 ng/gl 357 ng/gl 332 ng/gl 444 ng/gl 301 ng/gl

Relacion [28s/18s]: 1,3 1,5 1,4 1,3 1,6 1,5

RIN: 7,0 7,90 8,50 8,40 9,30 8,80

congelado: referencia referencia CTAB CTAB BB BB

Area de ARN: 446,8 351,6 434,9 422 358 409,3

Conc. de ARN: 222 ng/gl 175 ng/g 217 ng/g 210 ng/gl 178 ng/gl 204 ng/gl

Relacion [28s/18s]: 1,0 1,3 1,5 1,6 1,6 1,7

RIN: 6,0 7,0 7,60 8,0 8,10 8,0

Como puede verse, la integridad del ARN mejora cuando el aislamiento de ARN a partir de dicho tejido se hace 10 utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion.

8. Las muestras de ARN se diluyeron 1:100 con agua libre de ARNasa y se sometieron a transcripcion inversa con cebadores especificos del gen (mezcla de cebador PGK1 y sonda PGK1) a una concentracion de 10 gM cada uno usando un kit QuantiTect RT-PCR (Qiagen) con y sin transcriptasa inversa en un volumen de reaccion de 25 gl:

15 (1) 30 min a 50 0C

(2) 15 min a 95 0C

(3) 15 s a 95 0C

(4) 1 min a 60 0C, repetir los pasos (3), (4) durante 40 ciclos.

20 Los valores de Ct y ACt resultantes se muestran en la Tabla 17 y la correspondiente Figura 8.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Tabla 17: Comparacion de la co-purificacion del ADN genomico de bazo estabilizado con RNAlater (“RNAlater”) y congelado (“congelado”) usando CTAB o tampon BB como aditivo. “Ref.” indica el uso de reactivo Qiazol sin CTAB o _______con tampon BB anadido. “RT” y "+ RT" indican ensayos qRT-PCR sin y con transcriptasa inversa._______

: Ct - RT Ct + RT Act

RNAlater ref.: 34,04 23,62 10,42

RNAlater CTAB: 35,39 23,57 11,83

RNAlater BB: 35,59 23,25 12,34

congelado ref.: 34,02 24,19 9,83

congelado CTAB: 35,42 24,01 11,41

congelado BB: 35,81 24,15 11,66

Como puede deducirse de la Tabla 17 y la Figura 8, el metodo de acuerdo con la presente invencion mejora la pureza del ARN aislado del respectivo tejido disminuyendo la cantidad de contaminaciones de ADN. Esto puede deducirse de los valores aumentados de ACt.

Ejemplo 6:

En la presente memoria, el aislamiento de ARN se realizo de acuerdo con el protocolo de referencia utilizando QIAzol (que comprende fenol y un agente caotropico, pero no CTAB), la presente invencion (en la que CTAB se anade al homogeneizado), y de acuerdo con la tecnica anterior, en la que solo se usa fenol y CTAB, pero ningun agente caotropico (vease, por ejemplo el documento EP 1 219 707). Este ejemplo muestra que la combinacion de la composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol con un detergente cationico es decisiva para el aislamiento de ARN puro de manera eficiente al tiempo que reduce las cantidades de contaminacion de ADN a partir de muestras y, en particular muestras dificiles, tales como muestras de tejido. El ARN se aislo de la fase acuosa que contiene ARN utilizando dos metodos diferentes - por precipitacion asi como por purificacion utilizando minicolumnas RNAeasy (Qiagen) que comprenden una membrana de silice.

6.1. La fase acuosa que contiene ARN para el aislamiento de ARN usando QIAzol se obtuvo como sigue:

1. Para este experimento, se homogeneizaron 2x100 mg de bazo estabilizado con RNAlater y tejido de pulmon en 9 ml de reactivo Qiazol usando un TissueRuptor.

2. Los homogeneizados se distribuyeron en alicuotas de 900 pl en tubos de Eppendorf de 2 ml o en alicuotas de 1000 pl.

3. Se anadieron 100 pl de tampon BB QIAGEN (comprende CTAB 1 % y una sal) a cada muestra de 900 pl. Para el metodo de referencia utilizando QIAzol solo, no se anadio detergente. Se anadieron 180 pl de cloroformo a todas las muestras, se agitaron en vortex, seguido de una incubacion de 2-3 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 12.000xg a 4 0C durante 15 minutos y la fase acuosa resultante se transfirio a un nuevo tubo Eppendorf.

6.2. La fase acuosa que contiene ARN para el aislamiento del ARN utilizando el metodo de acuerdo con el documento EP 1 219 707 se obtuvo como sigue:

1. Se homogeneizaron 2x100mg de tejido de pulmon estabilizado con RNAlater y bazo en 9 ml cada uno de una solucion que contiene 8 ml de fenol pH 4,3, 2 ml de CTAB 10 %, 500 pl de acetato de sodio 2 M pH 4,0, 9,48 ml de agua libre de ARNasa.

2. Los homogeneizados (1000 pl) se transfirieron a continuacion a tubos Eppendorf de 2 ml. La cantidad de tejido en el homogeneizado fue la misma que con los otros metodos. Se anadio 200 pl de cloroformo seguido por agitacion en vortex e incubacion durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a continuacion durante 15 minutos a 12.000xg a 4 0C.

3. La fase acuosa se transfirio a nuevos tubos Eppendorf y se almaceno durante la noche a -20 0C hasta su posterior procesamiento.

6.3. Aislamiento de ARN a partir de la fase acuosa que contiene ARN por precipitacion

Las fases acuosas obtenidas de acuerdo con 6.1 y 6.2 fueron identicamente procesadas adicionalmente como sigue:

1. El ARN se precipito mediante la adicion de 500 pl de isopropanol, mezclando y una incubacion de 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de una etapa de centrifugacion de 15 minutos a 12.000xg a 4 0C.

2. El sobrenadante se desecho y el sedimento de ARN se lavo una vez mediante la adicion de 1 ml de etanol al 75 %, agitacion con vortex y posterior centrifugacion durante 5 minutos a 7500xg a 4 0C.

3. El sobrenadante se desecho, el sedimento se seco al aire y se resuspendio en 30pl de agua libre de ARNasa a 60 0C durante 10 minutos.

4. El ARN resultante se cuantifico usando un Nanodrop (ThermoScientific), ver Tabla 19.

Tabla 18: Se muestran los resultados del ARN precipitado de acuerdo con el ejemplo 6.3. “Fenol con CTAB” se refiere al metodo de acuerdo con el documento EP 1 219 707 utilizando fenol y CTAB, “QIAzol sin CTAB” se refiere al metodo de referencia QIAzol, en el que no se anade CTAB y “QIAzol con CTAB” se refiere al metodo de acuerdo ___________________________________con la presente invencion.___________________________________

Tejido: Extraccion Purificacion A260 A280 260/280 260/230 ng/gl Rendimiento de ARN [gg] Media



: 0,331 0,238 1,39 1,5 13,24 0,40

bazo: fenol con precipitacion 1,207 0,773 1,56 1,99 48,3 1,45 0,92

CTAB: 0,78 0,488 1,6 2,01 31,18 0,94



: 0,755 0,445 1,7 1,77 30,2 0,91



: 42,505 22,024 1,93 1,56 1700 51,00

bazo: QIAzol sin precipitacion 48,968 24,951 1,96 1,81 1959 58,77 58,12

CTAB: 52,727 26,941 1,96 1,92 2109 63,27



: 49,524 25,066 1,98 1,9 1981 59,43



: 46,864 23,918 1,96 1,74 1875 56,25

bazo: QIAzol con precipitacion 45,774 23,047 1,99 1,95 1831 54,93 56,15

CTAB: 49,143 24,577 2 1,78 1966 58,98



: 45,367 23,141 1,96 1,65 1815 54,45



: 0,203 0,128 1,58 2,07 8,103 0,24

pulmon: fenol con precipitacion 0,184 0,126 1,46 2,17 7,363 0,22 0,31

CTAB: 0,398 0,285 1,4 2 15,91 0,48



: 0,238 0,202 1,18 1,74 9,537 0,29



: 20,544 10,63 1,93 1,56 821,8 24,65

pulmon: QIAzol sin precipitacion 20,373 10,682 1,91 1,57 814,9 24,45 23,35

CTAB: 17,786 9,504 1,87 1,63 711,4 21,34



: 19,137 9,485 2,02 1,63 765,5 22,97



: 17,027 9,044 1,88 1,37 681,1 20,43

pulmon: QIAzol con precipitacion 17,696 9,282 1,91 1,54 707,9 21,24 20,41

CTAB: 17,516 8,973 1,95 1,6 700,6 21,02



: 15,795 8,339 1,89 1,55 631,8 18,95

5

Los resultados muestran que el metodo de acuerdo con el documento EP 1 219 707, en el que se usa fenol y CTAB, pero no agente caotropico, no es adecuado para aislar ARN a partir de muestras de tejido.

6.4. Aislamiento de ARN de la fase acuosa que contiene ARN mediante el uso de minicolumnas de RNeasy 10 (Qiagen):

La fase acuosa se obtuvo como se describe anteriormente en 6.1 y 6.2. La fase acuosa se proceso como sigue:

1. La fase acuosa se mezclo con 1,5 volumenes de etanol absoluto y se transfirio a las mini columnas RNeasy 15 (Qiagen) y se centrifugo durante 15s a 8.200g. Esto fue seguido por un lavado con 700 gl de tampon RWT

(Qiagen) y posterior centrifugacion durante 15s a 8.200g.

2. Las columnas se lavaron a continuacion dos veces con 500 gl de tampon RPE (Qiagen) a 8.200g durante 15 segundos y 2 minutos, respectivamente, seguido de una etapa final de centrifugacion a velocidad maxima durante 1 minuto.

20 3. El ARN unido se eluyo en 30 gl de agua libre de ARNasa por centrifugacion a 8.200g durante 1 min. La

concentracion de ARN se determino espectroscopicamente usando un NanoDrop (ThermoScientific), ver Tabla 19.

Tabla 19: Se muestran los resultados del ARN aislado de acuerdo con el ejemplo 6.4, se utilizan las mismas 25 referencias como en la Tabla 18.

: fenol con CTAB 0,301 0,242 1,24 0,56 12,02 0,36

bazo: RNeasy 0,33 0,27 1,22 0,44 13,2 0,40 0,35


: 0,257 0,164 1,57 0,53 10,28 0,31



: 0,293 0,212 1,38 0,41 11,73 0,35

bazo: QIAzol sin CTAB RNeasy 31,044 16,024 1,94 1,83 1242 37,26 43,49

35,821: 18,197 1,97 2,02 1433 42,99

39,671: 19,348 2,05 2,01 1587 47,61

38,404: 18,57 2,07 1,82 1536 46,08

bazo: QIAzol con CTAB RNeasy 36,822 17,809 2,07 2,02 1473 44,19 42,52

39,335: 19,241 2,04 1,94 1573 47,19

34,019: 16,201 2,1 2,06 1361 40,83

31,56: 15,535 2,03 2,02 1262 37,86

pulmon: fenol con CTAB RNeasy 0,094 0,043 2,19 0,35 3,762 0,11 0,16

0,133: 0,117 1,14 0,63 5,302 0,16

0,189: 0,186 1,02 0,63 7,567 0,23

0,113: 0,117 0,97 0,48 4,54 0,14

pulmon: QIAzol sin CTAB RNeasy 15,433 6,975 2,21 2,17 617,3 18,52 18,51

15,944: 7,566 2,11 2,23 637,8 19,13

15,674: 7,502 2,09 2,21 626,9 18,81

14,637: 6,918 2,12 2,13 585,5 17,57

pulmon: QIAzol con CTAB RNeasy 15,843 7,519 2,11 2,15 633,7 19,01 18,17

15,901: 7,672 2,07 2,17 636 19,08

15,4: 7,636 2,02 2,07 616 18,48

13,424: 6,571 2,04 2,02 537 16,11

6.5 Determinacion del contenido de ADN genomico en el ARN aislado.

Se llevo a cabo ensayos qRT-PCR para evaluar el contenido de las contaminaciones de ADN genomico en el ARN 5 aislado de acuerdo con 6.3 o 6.4 de acuerdo con los siguientes pasos:

1. Las muestras de ARN procedentes de bazo se diluyeron a aproximadamente 30 ng/pl, los derivados de pulmon se diluyeron a ~10 ng/pl.

Las muestras de ARN que se prepararon usando la formulacion de fenol de acuerdo con el documento EP 1 219 10 707 no se diluyeron para su posterior qRT-PCR.

2. Los ensayos qRT-PCR se llevaron a cabo en un aparato de PCR en tiempo real RotoGene Q (Qiagen), utilizando la “mezcla maestra QuantiFast Probe RT PCR”, con 10 pmol de cebador y sonda (mezcla de cebador PGK1, sonda PGK1) cada una en un volumen de reaccion de 20 pl con 2 pl de la muestra de ARN como molde. Se realizaron varias reacciones de qRT-PCR independientes para cada muestra. Las condiciones de los ciclos

15 fueron:

(1) 10 minutos a 50 0C

(2) 5 minutos a 95 0C

(3) 10 s a 95 0C

20 (4) 30 s a 60 0C, repetir los pasos (3), (4) 40x

Los valores promedio de Ct y ACt y se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20: Comparacion de la co-purificacion del ADN genomico en el ARN preparado de acuerdo con el ejemplo 6.3 25 __________________y 6.4, las mismas referencias se utilizan como en las Tablas 18 y 19. _______________

Bazo: Ct - RT Ct + RT Act

Fenol con CTAB/ precipitacion: 36,86 34,32 2,54

Fenol con CTAB/ RNeasy: 38,68 38,35 0,32

QIAzol sin CTAB/ precipitacion: 29,01 20,07 8,94

QIAzol con CTAB/ precipitacion: 30,19 20,11 10,08

QIAzol sin CTAB/ RNeasy: 28,57 21,11 7,47

QIAzol con CTAB/ RNeasy: 30,18 20,91 9,27

Pulmon: Ct - RT Ct + RT Act

Fenol con CTAB/ precipitacion: 40,00 40 0,00

Fenol con CTAB/ RNeasy: 37,43 36,25 1,18

QIAzol sin CTAB/ precipitacion: 29,99 26,51 3,48

QIAzol con CTAB/ precipitacion: 31,31 26,60 4,71

QIAzol sin CTAB/ RNeasy: 32,14 26,98 5,16

QIAzol con CTAB/ RNeasy: 34,12 27,16 6,96

Como puede verse, los mejores resultados se consiguen con el metodo de acuerdo con la presente invencion, que conduce a una reduccion considerable en la cantidad de ADN en el ARN aislado al tiempo que aumenta la cantidad 5 de ARN aislado (puro).

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de aislamiento de al menos ARN de una muestra que comprende ARN y ADN, que comprende:

a) anadir a la muestra una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol y lisar y/u homogeneizar la muestra;

b) anadir un disolvente organico insoluble en agua y separar las fases resultantes, formando de este modo una mezcla de multiples fases que comprende una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica, en donde el ARN se concentra en dicha fase acuosa y el ADN se concentra en dicha fase organica y/o en dicha interfase; y

c) aislar dicho ARN a partir de dicha fase acuosa,

en el que al menos un detergente cationico se anade antes de la separacion final de las fases.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho al menos un detergente cationico tiene una o mas de las siguientes caracteristicas:

a) comprende un cation de amonio cuaternario cargado de forma permanente;

b) comprende bromuro de amonio y/o

c) se selecciona del grupo que consiste en CTAB, TTAB y DTRB.
3. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho al menos un detergente cationico se anade en forma de una solucion.
4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que dicha solucion tiene una o mas de las siguientes caracteristicas:

a) comprende el al menos un detergente cationico en una concentracion seleccionada del grupo que consiste en del 0,1 % al 10 %, del 0,1 % al 5 %, del 0,1 % al 3 % y del 0,1 % al 1 %; y/o

b) comprende una sal que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, acetato de sodio, nitrato de sodio, cloruro de litio, sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de litio, sulfato de potasio y mezclas de los mismos.
5. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en la etapa c) la mezcla multi-fase se forma mediante la centrifugacion de la mezcla a una temperatura inferior seleccionada del grupo que consiste en una temperatura <15 0C, una temperatura < 10 0C, una temperatura < 7 0C, una temperatura < 5 0C y una temperatura < 4 0C.
6. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ARN se aisla de la fase acuosa mediante la adicion de al menos un alcohol a dicha fase acuosa.
7. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la fase acuosa se mezcla con un alcohol y dicha mezcla se pone en contacto con una fase solida que une acido nucleico para unir el ARN.
8. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el alcohol se selecciona del grupo que consiste en metanol, etanol, propanol, isopropanol y butanol y/o se anade en una concentracion seleccionada del grupo que consiste en al menos el 20 %, al menos el 30 % v/v, al menos el 40 % v/v, al menos el 50 % v/v y al menos el 60 % v/v.
9. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol tiene una o mas de las siguientes caracteristicas:

a) el agente caotropico es una sal caotropica;

b) el agente caotropico se selecciona del grupo que consiste en hidrocloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, tiocianato de sodio, yoduro de sodio, perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio, trifluoroacetato de sodio y urea;

c) el agente caotropico esta comprendido en una concentracion seleccionada del grupo que consiste en de 0,1 a 6 M, de 0,5 a 4 M y de 0,5 a 3 M;

d) el fenol esta comprendido en una concentracion seleccionada del grupo que consiste en del 10 % v/v al 70 % v/v, del 20 % v/v al 60 % v/v y del 30 % v/v al 50 % v/v;

e) comprende un tampon en una cantidad suficiente para mantener dicha composicion a un pH acido;

f) comprende un solubilizante para mantener el fenol en solucion;

g) comprende un componente de tiocianato; y/o

h) tiene un valor de pH inferior a 6, preferiblemente el pH es < 5.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50
10. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el disolvente organico insoluble en agua es cloroformo.
11. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el detergente cationico se anade antes de la separacion de las fases de acuerdo con al menos una de las siguientes realizaciones

a) el detergente cationico se anade durante la etapa a) ya sea antes, durante o despues de anadir a la muestra la composicion de desnaturalizacion acida, respectivamente;

b) el detergente cationico esta comprendido en la composicion de desnaturalizacion acida;

c) el detergente cationico se anade junto con, respectivamente, al mismo tiempo cuando se anade el disolvente organico insoluble en agua en la etapa b);

d) el detergente cationico se anade por separado despues de mezclar la muestra con la composicion de desnaturalizacion acida y antes de anadir el disolvente organico insoluble en agua;

e) el al menos un detergente cationico se anade despues de la etapa a) y antes de la etapa b).
12. Un kit para su uso en un metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende

a) una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol;

b) una solucion para la reduccion de la cantidad de ADN en una fase acuosa que contiene ARN que comprende al menos un detergente cationico;

c) opcionalmente una fase solida que une acido nucleico y

d) opcionalmente tampones de lavado y de elucion.
13. El kit de acuerdo con la reivindicacion 12, que comprende una composicion de desnaturalizacion acida tal como se define en la reivindicacion 9 y/o una solucion de acuerdo con el punto b) que tiene las caracteristicas definidas en la reivindicacion 4.
14. Un metodo para reducir la cantidad de ADN en un fase acuosa que contiene ARN formada en un metodo de aislamiento de acido nucleico que implica el uso de una composicion de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol, en donde al menos un detergente cationico se anade a una muestra homogeneizada en dicha composicion de desnaturalizacion acida antes de que las fases obtenidas por la adicion de un disolvente organico insoluble en agua se separen en una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica.
15. Uso de al menos un detergente cationico para reducir la cantidad de ADN en un fase acuosa que contiene ARN obtenida

- homogeneizando una muestra en una composicion acuosa de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol;

- anadiendo un disolvente organico insoluble en agua y

- separando la mezcla en una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica, en el que al menos un detergente cationico se anade antes de la separacion final de las fases.
16. Uso de al menos un detergente cationico para aumentar la cantidad de ADN en una interfase y/o una fase organica reduciendo la cantidad de ADN en una fase acuosa que contiene ARN obtenida

- homogeneizando una muestra en una composicion acuosa de desnaturalizacion acida que comprende un agente caotropico y fenol;

- anadiendo un disolvente organico insoluble en agua y

- separando la mezcla en una fase acuosa, opcionalmente una interfase y una fase organica, en el que al menos un detergente cationico se anade antes de la separacion final de las fases.