ES2622964T3 - Solución para la extracción de ARN - Google Patents
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Abstract
Solución para la extracción de ARN de una muestra biológica que contiene ARN y, como mínimo, ADN, comprendiendo dicha solución: (a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de dicha solución; (b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de dicha solución; (c) una sal de guanidinio a una concentración de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de dicha solución; (d) un tiocianato a una concentración de 0,1 a 0,5 M basada en la cantidad total de dicha solución, en la que en los casos en los que la solución comprenda tiocianato de guanidinio, la concentración de tiocianato de guanidinio está incluida en la concentración de la sal de guanidinio y no está incluida en la concentración de tiocianato; y (e) un tampón para mantener el pH de dicha solución entre 4 y 6.
Description
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DESCRIPCION
Solucion para la extraccion de ARN SECTOR TECNICO
La presente invencion se refiere a una solucion para la extraccion de ARN sustancialmente puro a partir de una muestra biologica.
ANTECEDENTES TECNICOS
La informacion genetica escrita en el ADN se transcribe en ARN en diversas combinaciones, para producir fenotipos complicados de organismos. Es conocida que la contribucion del ARN a los fenotipos de los organismos es dependiente de los tipos y niveles de expresion del ARN, y la extraccion de ARN altamente puro a partir de diversos materiales biologicos es importante para la realizacion de analisis de la expresion genica. Para la consecucion de este objetivo, se han desarrollado hasta la fecha muchos procedimientos para la extraccion de ARN. Entre los ejemplos de procedimientos para el aislamiento de ARN utilizados con frecuencia, se incluyen la extraccion con fenol, la precipitacion a partir de soluciones de sales caotropicas y la adsorcion a membranas de silice.
El documento de patente 1 da a conocer una solucion para la extraccion de ARN que comprende guanidina de 2 a 5 M y del 40 al 60% de fenol. Anteriormente, la extraccion de ARN habia requerido no menos de 2 dias de operacion utilizando una ultracentrifuga, pero la utilizacion de esta solucion ha permitido la extraccion eficiente de ARN en 3 horas. Este procedimiento se denomina el procedimiento de una sola etapa.
Como mejora del procedimiento descrito en el documento de patente 1 anterior, el documento de patente 2 da a conocer una solucion de extraccion para la extraccion y la separacion simultanea de ARN, ADN y proteinas de una muestra que comprende estos componentes. Mas especificamente, la literatura describe la extraccion y la separacion de ARN en una fase acuosa mediante la utilizacion de una solucion de fenol del 30 al 50% que contenia guanidina de 0,5 a 2 M.
Aunque las soluciones descritas en los documentos de patente 1 y 2 tienen diferentes composiciones, el ARN se puede extraer mediante operaciones similares utilizando las soluciones. Es decir, cada solucion se utiliza para la homogeneizacion de un tejido biologico y se utiliza un disolvente organico hidrofobo, tal como cloroformo, despues de la centrifugacion del homogeneizado para conseguir la separacion de fases. Posteriormente, se recupera la fase acuosa en la parte superior que comprende el ARN. A continuacion, se precipita el ARN con alcohol y se lava con el fin de extraer el ARN.
Sin embargo, el ARN aislado utilizando las soluciones y los procedimientos descritos en los documentos de patente 1 y 2 todavia muestran contaminacion con ADN genomico (residual) en una cantidad que puede ser detectada mediante el ensayo de reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR), dando lugar a problemas tales como la perdida de cuantitatividad de ARN en los casos de RT-PCR (documento de patente 3, por ejemplo, parrafo 0005). Por lo tanto, el ARN aislado mediante estos procedimientos tiene que ser purificado para la eliminacion de ADN como un contaminante.
Un procedimiento utilizado de forma habitual para la eliminacion de ADN, contenido como impureza en una muestra de ARN extraido, es el tratamiento de la muestra de ARN con desoxirribonucleasa (DNasa). Sin embargo, en los casos en los que el tratamiento con DNasa se lleva a cabo en una fase liquida, es necesario llevar a cabo la extraccion con fenol/cloroformo y la desnaturalizacion de las proteinas de nuevo para la eliminacion de la DNasa despues del tratamiento. Ademas, en los casos en los que la extraccion se realiza utilizando una combinacion de columnas de membrana de silice, la operacion de lavado de las columnas debe llevarse a cabo de forma repetida. Aunque la contaminacion con ADN se reduce por este tratamiento con DNasa, se requiere este trabajo adicional y se produce la perdida de ARN, lo que da como resultado una disminucion en la cantidad de ARN extraido, lo cual es problematico.
Como un procedimiento para evitar la contaminacion de una muestra de ARN con ADN sin realizar tratamiento con DNasa, el documento de patente 3 da a conocer un procedimiento que utiliza un reactivo de extraccion de ARN a un pH de menos de 4. Sin embargo, es bien conocido que el acido nucleico sufre despurinacion y se degrada en condiciones acidas y, por lo tanto, es dificil aislar ARN sustancialmente intacto. Ademas, dado que el equilibrio de la solucion de ADN en la fase acuosa/organica en condiciones acidas esta desplazado hacia su distribucion en la fase organica, se puede esperar hasta cierto punto el efecto de suprimir la contaminacion de la fase acuosa con ADN genomico, mediante la utilizacion de un reactivo para la extraccion de ARN a un pH de menos de 4, pero la supresion completa de la contaminacion con fragmentos de ADN pequenos con un numero pequeno de bases es imposible.
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DOCUMENTOS DE LA TECNICA ANTERIOR [Documentos de patente]
Documento de patente 1: US 4.843.155 B Documento de patente 2: JP 5-344.886 A
Documento de patente 3: Solicitud de patente PCT abierta a Inspeccion publica No. 2007-532.140 traducida al japones.
CARACTERISTICAS DE LA INVENCION PROBLEMAS A RESOLVER POR LA INVENCION
Tal como se ha descrito anteriormente, el ARN sustancialmente puro libre de contaminacion con ADN no puede extraerse con las soluciones convencionales para la extraccion de ARN a partir de muestras biologicas, incluso en casos en los que se requiere cuantitatividad, lo que ha resultado problematico. Por lo tanto, para la eliminacion de ADN como contaminante, ha sido necesaria una etapa adicional, tal como tratamiento con DNasa. La presente invencion tiene como objetivo resolver estos problemas y da a conocer una solucion para la extraccion de ARN sustancialmente puro a partir de una muestra biologica.
MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS
Los inventores de la presente invencion estudiaron las composiciones de las soluciones convencionales para la extraccion de ARN y descubrieron que la concentracion de fenol tiene una relacion especialmente fuerte con el efecto de prevencion de la contaminacion con ADN, completando asi la presente invencion.
Es decir, la presente invencion da a conocer lo siguiente:
[1] Una solucion para la extraccion de ARN de una muestra biologica que contiene ARN y, como minimo, ADN, comprendiendo la solucion:
(a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;
(b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;
(c) una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de la solucion;
(d) un tiocianato a una concentracion de 0,1 a 0,5 M basada en la cantidad total de la solucion, en la que en los casos en los que la solucion comprenda tiocianato de guanidinio, la concentracion de tiocianato de guanidinio esta incluida en la concentracion de la sal de guanidinio y no esta incluida en la concentracion de tiocianato; y
(e) un tampon para mantener el pH de la solucion entre 4 y 6.
[2] La solucion, segun el punto [1], en la que la concentracion de fenol es del 55 al 65% en volumen basada en la cantidad total de la solucion.
[3] La solucion, segun los puntos [1] o [2], que comprende ademas un disolvente organico para separar una fase acuosa.
[4] La solucion, segun uno cualquiera de los puntos [1] a [3], en la que la muestra biologica es un liquido de cultivo de celulas cultivadas.
[5] La solucion, segun uno cualquiera de los puntos [1] a [3], en la que la muestra biologica es un componente de un fluido corporal de un organismo.
[6] La solucion, segun uno cualquiera de los puntos [1] a [3], en la que la muestra biologica es un componente de la sangre de un organismo
[7] Un procedimiento para la extraccion de ARN de una muestra biologica que contiene ARN y, como minimo, ADN, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
homogeneizar la muestra biologica junto con una solucion que comprende:
(a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;
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(b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;
(c) una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de la solucion;
(d) un tiocianato a una concentracion de 0,1 a 0,5 M basada en la cantidad total de la solucion, en la que en los casos en los que la solucion comprenda tiocianato de guanidinio, la concentracion de tiocianato de guanidinio esta incluida en la concentracion de la sal de guanidinio y no esta incluida en la concentracion de tiocianato; y
(e) un tampon para mantener el pH de la solucion entre 4 y 6;
mezclar el homogeneizado obtenido con un disolvente organico para la separacion de una fase acuosa; centrifugar la mezcla obtenida; y
recuperar una fase acuosa producida mediante la centrifugacion, que contiene el ARN.
[8] Un procedimiento para la extraccion de ARN de una muestra biologica que contiene ARN y, como minimo, ADN, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
homogeneizar la muestra biologica junto con una solucion que comprende:
(a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;
(b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;
(c) una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de la solucion;
(d) un tiocianato a una concentracion de 0,1 a 0,5 M basada en la cantidad total de la solucion, en la que en los
casos en los que la solucion comprenda tiocianato de guanidinio, la concentracion de tiocianato de guanidinio esta
incluida en la concentracion de la sal de guanidinio y no esta incluida en la concentracion de tiocianato; y
(e) un tampon para mantener el pH de la solucion entre 4 y 6; y
(f) un disolvente organico para la separacion de una fase acuosa; centrifugar el homogeneizado obtenido; y
recuperar una fase acuosa producida mediante la centrifugacion, que contiene el ARN.
[9] El procedimiento segun la reivindicacion 7 o 8, en el que la concentracion de fenol es del 55 al 65% en volumen basada en la cantidad total de la solucion de (a) a (e).
EFECTO DE LA INVENCION
Mediante la utilizacion de la solucion de la presente invencion, se puede extraer de forma sencilla ARN sustancialmente puro libre de contaminacion con ADN de una muestra biologica. Ademas, mediante la presente invencion, el ARN se puede obtener sin un tratamiento adicional, tal como tratamiento con DNasa que puede causar perdida de recuperacion, ARN que tiene una pureza que permite la utilizacion del ARN tal como esta, incluso en utilizaciones en las que se requiere cuantitatividad. En particular, un ARN de interes puede extraerse con elevada pureza incluso a partir de, entre las muestras biologicas, fluidos corporales tales como la sangre, que contienen cantidades muy grandes de RNasa y otros contaminantes.
DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido a partir de suero en el ejemplo 1, utilizando una solucion de la presente invencion.
La figura 2 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido a partir de suero en el ejemplo comparativo 1, utilizando una solucion descrita en el documento de patente 2.
La figura 3 muestra un electroferograma de acido nucleico extraido a partir de suero en el ejemplo comparativo 2, utilizando una solucion descrita en el documento de patente 1.
La figura 4 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido a partir de suero en los ejemplos 2 a 5, utilizando soluciones de la presente invencion.
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La figura 5 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido a partir de suero en los ejemplos 6 a 12, utilizando las soluciones de la presente invencion.
La figura 6 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido a partir de suero en el ejemplo 13 y el ejemplo comparativo 3, utilizando una solucion de la presente invencion y una solucion que se describe en el documento de patente 3.
La figura 7 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido de celulas cultivadas en el ejemplo 14, utilizando una solucion de la presente invencion.
La figura 8 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido a partir de suero en los ejemplos 15 y 16, utilizando soluciones de la presente invencion.
La figura 9 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido a partir de suero en el ejemplo comparativo 4, utilizando una solucion descrita en el documento de patente 3.
La figura 10 muestra electroferogramas de acido nucleico extraido a partir de suero en los ejemplos 17 y 18, utilizando soluciones de la presente invencion.
MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCION
La presente invencion es una solucion para la extraccion de ARN a partir de una muestra biologica, solucion que comprende, como sus componentes, los siguientes (a) a (e):
(a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;
(b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen (no menos del 3% en volumen y no mas del 10% en volumen), basada en la cantidad total de la solucion;
(c) una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M (no menos de 0,5 M y no mas de 2,0 M) basada en la cantidad total de la solucion;
(d) un tiocianato a una concentracion de 0,1 a 0,5 M (no menos de 0,1 M y no mas de 0,5 M) basada en la cantidad total de la solucion, en la que en los casos en los que la solucion comprenda tiocianato de guanidinio, la concentracion de tiocianato de guanidinio esta incluida en la concentracion de la sal de guanidinio y no esta incluida en la concentracion de tiocianato; y
(e) un tampon para mantener el pH de la solucion entre 4 y 6.
La muestra biologica utilizada en la presente invencion comprende ARN y, como minimo, ADN. Ademas, utilizando la solucion de la presente invencion, se puede extraer el aRn sustancialmente puro de la muestra biologica. En el presente documento, el termino "ARN sustancialmente puro" significa ARN del que el ADN contenido en la muestra biologica original se ha separado y que esta sustancialmente libre de la contaminacion con ADN. Si el ARN es sustancialmente puro o no, se puede juzgar observando si el ADN se detecta por electroforesis o no. Por ejemplo, dado que se puede utilizar el dispositivo "Agilent RNA 6000 pico kit" fabricado por Agilent Technologies Inc. (numero de modelo, 5067-1513) para la deteccion de acido nucleico en una cantidad de 50 pg/pl a 5000 pg/pl (recomendacion), el kit puede ser utilizado para la evaluacion de la presencia/ausencia de contaminacion por AdN. Mas especificamente, el acido nucleico extraido puede tratarse con RNasa y someterse a electroforesis utilizando "Agilent RNA 6000 pico kit". En los casos en los que no se detecto ningun pico, se puede decir que la contaminacion por ADN fue suprimida suficientemente y se pudo obtener ARN sustancialmente puro. Ademas, mediante el analisis de la cantidad de contaminacion por ADN mediante PCR cuantitativa, se puede evaluar la pureza del ARN. Por ejemplo, en los casos en los que se utiliza un aparato de PCR en tiempo real y "SYBR Green" (colorante fluorescente), se puede detectar el ADN de doble cadena en una cantidad de 60 pg, de modo que la evaluacion puede llevarse a cabo utilizando estos componentes. Mas especificamente, se anade acido nucleico extraido a una solucion de reaccion de PCR que contenia cebadores, ADN polimerasa y "SYBR Green" para llevar a cabo la amplificacion por PCR, y el resultado se compara con una curva de calibracion preparada de forma preliminar. Mediante este proceso, puede analizarse cuantitativamente la cantidad de contaminacion por ADN.
En la presente invencion, la cantidad total de una solucion significa el volumen total que comprende la totalidad de los (a) a (e) descritos anteriormente. Por ejemplo, "fenol en una cantidad de mas de 50% en volumen basada en la cantidad total de la solucion" significa que mas de 500 ml de fenol estan contenidos en 1 l de la solucion despues de la mezcla de todos los componentes. Ademas, por ejemplo, "una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de la solucion" significa que la concentracion final en la solucion no es inferior a 0,5 M y no mas de 2,0 M, es decir, la sal de guanidinio esta contenida en una cantidad de no menos de 0,5 moles y no mas de 2 moles en 1 l de la solucion despues de la mezcla de todos los componentes.
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La solucion de la presente invencion comprende (a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de la solucion. Se descubrio que la utilizacion de una concentracion de fenol de mas del 50% en volumen, que es diferente de la concentracion utilizada en las tecnicas convencionales, produce el efecto de reducir la contaminacion de la fase acuosa, en la que se extrae el ARN, con el ADN como una impureza. Por ejemplo, la solucion de la presente invencion comprende fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen, no menos del 54% en volumen o no menos del 55% en volumen. Preferentemente, la solucion de la presente invencion comprende fenol en una cantidad de no menos del 55% en volumen. Ademas, la concentracion de fenol es preferentemente no mas del 75% en volumen en vista de la preparacion de la solucion de la presente invencion en el estado en el que los otros componentes de la solucion de la presente invencion, (b) polialcohol, (c) 0,5 a 2,0 M de la sal de guanidinio y (d) de 0,1 a 0,5 M del tiocianato se mezclan uniformemente a las respectivas concentraciones predeterminadas. Ademas, la concentracion de fenol es mas preferentemente no mas del 65% en volumen en vista de la reduccion de la influencia de la oxidacion del fenol. El intervalo de concentraciones de fenol es, preferentemente, uno determinado por una combinacion arbitraria de estos limites superiores y limites inferiores, y es, mas preferentemente, no menos del 53% en volumen y no mas del 65% en volumen, de forma especialmente preferente, no menos del 55% en volumen y no mas del 65% en volumen.
La solucion de la presente invencion comprende (b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de la solucion. El poliol en la presente invencion puede ser un alcohol alifatico que tiene una pluralidad de grupos hidroxilo, lo que permite la mezcla del componente (a) fenol y las soluciones acuosas de (c) y (d) en la solucion de la presente invencion, para mantener la solucion de la presente invencion uniforme. Como poliol, es preferente un alcohol alifatico C2-C6 que tiene de 2 a 4 grupos hidroxilo. Entre los ejemplos del poliol se incluyen glicerol, etilenglicol, propilenglicol y eritritol, y el poliol es mas preferentemente glicerol. El poliol se puede utilizar en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de la solucion de la presente invencion con el fin de mantener la solucion de la presente invencion como una solucion uniforme y para evitar la distribucion excesiva del componente fenol en la fase acuosa.
La solucion de la presente invencion comprende (c) una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de la solucion. Entre los ejemplos especificos preferentes de la sal de guanidinio se incluyen tiocianato de guanidinio y clorhidrato de guanidinio. Las sales de guanidinio tienen un efecto de proteger el ARN de la degradacion y mantener el fenol en estado de solucion en una solucion acuosa.
La solucion de la presente invencion comprende (d) un tiocianato a una concentracion de 0,1 a 0,5 M basada en la cantidad total de la solucion. Como tiocianato, se puede utilizar preferentemente una sal inorganica del acido tiocianico y se puede utilizar mas preferentemente tiocianato de amonio y tiocianato de sodio. Ademas, el tiocianato puede ser una mezcla de una pluralidad de diferentes sales inorganicas de acido tiocianico y, por ejemplo, se puede utilizar preferentemente una mezcla de tiocianato de amonio y tiocianato de sodio. Se considera que el tiocianato mejora la extraccion de ARN de una muestra biologica. En los casos en los que la solucion de la presente invencion comprende tiocianato de guanidinio, la concentracion de tiocianato de guanidinio esta incluida en la concentracion de la sal de guanidinio descrita anteriormente y no se incluye en la concentracion de tiocianato.
La solucion de la presente invencion comprende (e) un tampon para mantener el pH de la solucion entre 4 y 6. Como tampon, se pueden utilizar sales organicas y sales inorganicas que se utilizan convencionalmente para mantener el pH dentro de un intervalo deseado y muestran capacidad de tamponamiento. Entre los ejemplos especificos de tampon se incluyen sales organicas y sales inorganicas, tales como fosfato, acetato, citrato, ftalato, tartrato y lactato de sodio, potasio, litio y amonio. Entre las combinaciones de estas, se utilizan mas preferentemente acetato de sodio y citrato de sodio. Ademas, pueden utilizarse en combinacion una pluralidad de estas sales organicas y/o sales inorganicas. La concentracion del tampon no se limita, siempre que sea suficiente para mantener el pH dentro del intervalo deseado entre 4 y 6, y la concentracion es preferentemente de 0,02 a 0,2 M basada en la cantidad total de la solucion de la presente invencion. Con el fin de ajustar el pH de la solucion de la presente invencion, se puede anadir en su caso una solucion acida o alcalina acuosa apropiada, tal como una solucion de acido clorhidrico o de hidroxido de sodio ademas del tampon.
La solucion de la presente invencion puede contener uno o mas agentes surfactantes, tales como sorbitan polioxietilenico, dodecilsulfato de sodio y/o sarcosina para la purificacion del ARN de interes mediante la desnaturalizacion de las proteinas en la muestra biologica. Ademas, la solucion de la presente invencion puede contener uno o mas antioxidantes tales como aminofenol y/o quinolina impedidos, para la prevencion de la oxidacion del fenol.
En los casos en los que la muestra biologica esta en estado liquido cuando el ARN de interes se va a extraer, la solucion de la presente invencion se puede utilizar en una cantidad de no menos de 1 volumen, preferentemente no menos de 3 volumenes de la muestra.
A continuacion, se muestra un ejemplo del procedimiento para la extraccion del ARN de interes utilizando la solucion de la presente invencion. En primer lugar, la muestra biologica se homogeneiza en la solucion de la presente invencion para formar un homogeneizado. El procedimiento de homogeneizacion no esta restringido, y entre los
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ejemplos del procedimiento se incluyen agitacion mediante vortice o similar, aplastamiento con una aguja de inyeccion o similar y la utilizacion de un homogeneizador convencional. Posteriormente, se anade un disolvente organico al homogeneizado para la separacion de la fase acuosa y la mezcla resultante se somete a centrifugacion. El disolvente organico que se anade en esta etapa se utiliza preferentemente en una cantidad de, aproximadamente, el 2% en volumen a, aproximadamente, el 40% en volumen basado en el homogeneizado. La centrifugacion se puede llevar a cabo habitualmente de 6000 x G a 20.000 x g durante 3 minutos a 30 minutos, por ejemplo, a una velocidad de 12.000 x G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Sin embargo, la velocidad, la temperatura y el tiempo no se restringen siempre que la fase acuosa se pueda separar. Mediante la centrifugacion, se extrae en la fase acuosa el ARN de interes sustancialmente puro. Por otro lado, el ADN, proteinas y similares se separan en la fase organica o, en los casos en los que se produjo una fase intermedia, el ADN, proteinas y similares se separan en la fase organica y la fase intermedia.
El disolvente organico para la separacion de la fase acuosa es un compuesto organico liquido que se va a utilizar para lograr la separacion en la fase acuosa que comprende el ARN de interes extraido por medio de la solucion de la presente invencion y la fase organica y/o la fase intermedia (si se produce) que comprende el ADN y similares. Como este disolvente organico, se puede utilizar uno que tenga el mismo grado de hidrofilicidad que el fenol, o que sea mas hidrofobo que este. Por ejemplo, en terminos del coeficiente de ClogP de distribucion de agua/octanol que se utiliza de forma habitual como un indice de hidrofilia, se puede utilizar un compuesto organico que tenga un valor de no menos de 1,4 (valor de ClogP para el fenol), y se puede utilizar preferentemente un compuesto organico que tiene un valor dentro del intervalo de 1,4 a 5. Se puede calcular un valor estimado del valor ClogP, por ejemplo, utilizando un programa como "Chem Draw" (marca registrada). Entre los ejemplos del disolvente organico que se puede utilizar en la presente invencion se incluyen, sin que constituyan limitacion, cloroformo (1,952), p-bromoanisol (3,064), 1-bromo-3-cloropropano (1,847), 4-bromoveratrol (2,7345), 6-bromo-1,4-benzodioxano (3,0005), 1-bromo-4- trifluorometoxibenceno (4,173), 1-bromo-2,4-dimetoxibenceno (2,8545), 4-fluoroanisol (2,344), 4-bromotolueno (3,504) y 4-bromobutirato de etilo (1,772). El valor entre parentesis para cada uno de los disolventes organicos anteriores indica el valor de ClogP calculado con "Chem Draw”.
El disolvente organico para la separacion de la fase acuosa se puede utilizar mediante la formacion utilizando la solucion de la presente invencion que comprende los (a) a (e) tal como se ha descrito anteriormente y la adicion del homogeneizado, pero el disolvente organico tambien puede estar contenido de forma preliminar en la solucion de la presente invencion que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente. En los casos de una solucion convencional, cuya concentracion de fenol no es mayor que el 50%, la inclusion de este disolvente organico con antelacion provoca la separacion de la solucion en la fase acuosa y la fase organica antes de la mezcla con una muestra biologica, de modo que ha sido dificil utilizar la solucion como una solucion de extraccion. En contraste, a la concentracion de fenol de la solucion de la presente invencion, el disolvente organico se puede mezclar uniformemente con la solucion de la presente invencion y la solucion resultante se puede almacenar como una unica solucion. En los casos en los que la solucion de la presente invencion contiene el disolvente organico de forma preliminar, es posible la separacion de la fase acuosa que contiene el ARN anadiendo una muestra biologica a la disolucion y homogeneizando la mezcla resultante para proporcionar un homogeneizado, y sometiendo inmediatamente a continuacion el homogeneizado a centrifugacion. Por consiguiente, en comparacion con los casos en los que la adicion del disolvente organico al homogeneizado se lleva a cabo mas tarde, el procedimiento puede ser muy sencillo, lo que es preferente.
En los casos en los que el disolvente organico para la separacion de la fase acuosa esta contenido de forma preliminar en la solucion de la presente invencion que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente, el contenido del disolvente organico se puede seleccionar dependiendo del tipo del disolvente organico que se anada y la concentracion de fenol en la solucion, dentro del intervalo en el que el disolvente organico se puede mezclar uniformemente en la solucion de la presente invencion. Por ejemplo, en los casos en los que la concentracion de fenol en la solucion de la presente invencion es del 65% y se selecciona cloroformo como disolvente organico, el cloroformo esta contenido preferentemente en un volumen arbitrario de hasta el 27% en volumen basado en la cantidad total, 100%, de la solucion que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente. Mas especificamente, es preferente anadir cloroformo en un volumen arbitrario de hasta 27 ml, a 100 ml de la solucion que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente. Mas preferentemente, el cloroformo esta contenido en una cantidad del 5 al 25% en volumen, aun mas preferentemente del 10 al 20% en volumen basada en la cantidad total, 100%, de la solucion que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente. Ademas, en los casos en los que la concentracion de fenol es del 58%, el cloroformo esta contenido preferentemente en un volumen arbitrario de hasta el 14%, mas preferentemente en una cantidad del 6 al 13% en volumen, aun mas preferentemente en una cantidad del 8 al 12% en volumen basada en la cantidad total, 100%, de la solucion que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente. Ademas, en los casos en los que la concentracion de fenol en la solucion es del 65% y se selecciona p-bromoanisol como disolvente organico, el p-bromoanisol esta contenido preferentemente en un volumen arbitrario de hasta el 22% en volumen, mas preferentemente en una cantidad del 5 al 20% en volumen, aun mas preferentemente en una cantidad del 10 al 18% en volumen basada en la cantidad total, 100%, de la solucion que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente. Ademas, de manera similar, en los casos en los que la concentracion de fenol es del 58%, el p- bromoanisol esta contenido preferentemente en un volumen arbitrario de hasta el 13% en volumen, mas preferentemente en una cantidad del 3 al 11% en volumen y, aun mas preferentemente, en una cantidad del 5 al 9% en volumen basada en la cantidad total, 100%, de la solucion que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente.
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Para purificar y concentrar adicionalmente el ARN que se ha extraido en la fase acuosa utilizando la solucion de la presente invencion, se puede anadir un alcohol inferior a la fase acuosa que comprende el ARN con el fin de precipitar el ARN y el ARN precipitado se puede recuperar. Como alternativa, el ARN que se ha precipitado mediante la adicion de un alcohol inferior a la fase acuosa que comprende el ARN, puede adsorberse a un portador al que el ARN se pueda adsorber, tal como una columna de membrana de silice y el ARN se puede eluir y se recuperar del portador (columna). Entre los ejemplos del alcohol inferior que se van a utilizar en esta etapa se incluyen etanol e isopropanol. La concentracion del alcohol inferior se puede determinar de acuerdo con la utilizada en tecnicas convencionales, tales como precipitacion con etanol y precipitacion con isopropanol, o de acuerdo con las concentraciones recomendadas por los fabricantes de portadores, tales como columnas de membrana de silice.
La solucion de la presente invencion se puede producir mezclando los (a) a (e) descritos anteriormente de manera que se alcancen sus concentraciones respectivas. El procedimiento de mezcla no esta restringido. Dependiendo de la composicion de la solucion, se pueden preparar soluciones respectivas a concentraciones mas elevadas con antelacion antes de mezclar las soluciones. Por ejemplo, se puede preparar con antelacion una solucion acuosa de tiocianato de guanidinio 6 M, una solucion acuosa de tiocianato de amonio 6 M, y acetato de sodio 1 M y despues mezclarlas para alcanzar las concentraciones de interes, seguido de la adicion de glicerol, fenol y una cantidad necesaria de agua a la misma, para preparar la solucion de la presente invencion. La solucion de la presente invencion en la que un disolvente organico para la separacion de la fase acuosa esta contenido de forma preliminar en la solucion, que comprende los (a) a (e) descritos anteriormente, se puede producir tambien de manera similar mediante la mezcla de los (a) a (e) y el disolvente organico de manera que se alcancen sus concentraciones deseadas.
La muestra biologica que se va a utilizar en la presente invencion no esta limitada en tanto que comprenda ARN y, como minimo, ADN. Por ejemplo, la muestra biologica puede comprender, ademas de ADN, proteinas tales como componentes de impurezas que preferentemente se separan del ARN de interes. Entre los ejemplos especificos de la muestra biologica se incluyen celulas cultivadas; liquidos de cultivo de celulas cultivadas; tejidos corporales, tales como secciones quirurgicas y muestras de biopsia; celulas vivas; sangre; componentes de la sangre (suero, plasma); orina y fluidos corporales tales como saliva y lagrimas. La muestra biologica no se limita a estas y se puede utilizar una muestra arbitraria que contenga ARN. Cuando se aplica la solucion de la presente invencion a estas muestras biologicas, en los casos en los que la muestra biologica es una muestra liquida tal como un fluido corporal, la muestra recogida se puede mezclar tal como esta con la solucion de la presente invencion o se puede diluir con PBS o agua antes de mezclarla con la solucion de la presente invencion. En los casos en los que la muestra biologica es un sedimento celular o un trozo de tejido, la muestra recogida se puede mezclar tal como esta con la solucion de la presente invencion o se puede diluir con PBS o agua antes de mezclarla con la solucion de la presente invencion y, en los casos en los que se diluye la muestra, se prepara preferentemente un homogeneizado de la muestra biologica antes de la dilucion con agua o PBS con el fin de evitar la degradacion del ARN.
Entre las muestras biologicas, los fluidos corporales, especialmente la sangre, contienen a veces una cantidad muy grande de RNasa y otros contaminantes y, en este caso, es muy dificil la extraccion de ARN substancialmente puro mediante un procedimiento convencional. Con una concentracion de fenol de mas de 50% en volumen, la solucion de la presente invencion permite la extraccion eficaz de los contaminantes, tales como proteinas, en una fase organica, de modo que el ARN de interes puede ser obtenido con pureza elevada. Ademas, se reduce la fase intermedia que aparece despues de la centrifugacion y se puede lograr separacion clara entre fases, de manera que la fase acuosa que comprende el ARN de interes se puede separar facilmente.
El ARN extraido utilizando la solucion de la presente invencion es acido ribonucleico en el que una pluralidad de ribonucleotidos estan unidos por enlaces fosfodiester, y el peso molecular, el numero de bases y el origen del ARN no estan restringidos. En general, el ARN se clasifica en muchos tipos segun su clasificacion funcional, y entre los ejemplos de los tipos se incluyen ARNm (ARN mensajero), ARNt (ARN de transferencia), ARNr (ARN ribosomico), ARNnc (ARN no codificante), ARNsn (ARN nuclear pequeno) y ARNsno (ARN nucleolar pequeno). Sin embargo, en vista de la estructura quimica, la unica diferencia conocida es el peso molecular (numero de bases), y queda incluido en la presente invencion ARN que tiene cualquier peso molecular. ARN que tienen un numero de bases de, aproximadamente, 15 a 500 bases, que reciben generalmente el nombre de ARN pequenos, y ARN que tienen generalmente un numero de bases de, aproximadamente, 18 a 25, que son ARNmi (microARN), tambien estan incluidos en el ARN de la presente invencion.
En general, la diferencia principal en la estructura quimica primaria entre el ARN y el ADN es la presencia/ausencia del grupo hidroxilo (-OH) en la posicion 2' de la ribosa como el azucar constituyente. Cuanto menor es el numero de bases, menor es la diferencia estructural entre el ARN y el ADN y es mas dificil la separacion de ARN y ADN por extraccion. Sin embargo, mediante la utilizacion de la solucion de la presente invencion, el ARN que tiene un numero relativamente pequeno de bases, tal como ARN pequeno, se puede extraer tambien con pureza elevada.
En el estado en el que ADN y ARN coexisten, habitualmente es dificil distinguir entre ellos y cuantificar cada uno de ellos utilizando un medidor de absorcion o luminometro. Sin embargo, mediante la utilizacion de la solucion de la presente invencion, se puede obtener ARN sustancialmente puro, por lo que es posible la cuantificacion de ARN
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utilizando un absorciometro o luminometro. Ademas, en los casos en los que se utiliza la solucion de la presente invencion en el analisis de ARN utilizando qRT-PCR o una micromatriz, el analisis se puede realizar de manera sencilla sin necesidad de tratamiento con DNasa, en ausencia de ruido debido a la coexistencia de ADN.
EJEMPLOS
A continuacion, la presente invencion se describira concretamente por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invencion no queda limitado por estos ejemplos.
<Ejemplo 1>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se mezclaron los componentes respectivos de la solucion, de manera que sus concentraciones finales fueron como se describe a continuacion, para preparar una solucion para la extraccion de ARN.
fenol al 58% en volumen glicerol al 5% en volumen
tiocianato de guanidinio 0,8 M (mezclado como una solucion acuosa) tiocianato de amonio 0,4 M (mezclado como una solucion acuosa)
tampon de acetato de sodio 0,1 M (mezclado como una solucion acuosa), ajustado a pH 5.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
Se utilizo suero como muestra biologica que contiene ARN, asi como ADN y proteinas, para la extraccion de ARN. Se homogeneizo la muestra mediante la mezcla de 900 pl de la solucion preparada anteriormente en (1) y 300 pl de suero por agitacion con vortice. Se anadieron 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado resultante y la mezcla resultante se mezclo, seguida de centrifugacion de la mezcla a temperatura ambiente a 12.000 x G durante 10 minutos. Mediante esto, se formo una fase acuosa que contenia el ARN, y una fase organica y una fase intermedia que contenian el ADN y las proteinas. De estas, se separaron 400 pl de la fase acuosa en otro tubo.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico -
A la fase acuosa que contenia ARN separado en (2) se anadieron 1,5 volumenes de etanol al 100%, y se colocaron 700 pl de la mezcla resultante en una columna para la purificacion de acido nucleico, "RNeasy Mini Spin Column" contenida en un "mini kit miRNeasy"(fabricado por QIAGEN), seguido por centrifugacion de la columna a 8.000 x G durante 15 segundos para permitir la adsorcion del acido nucleico a la columna. Se desecho el liquido que paso a traves de la columna. Al repetir esta operacion hasta que no quedo muestra de ARN mezclado con etanol, todo el acido nucleico contenido en la fase acuosa se adsorbio a la columna. Posteriormente, segun el protocolo para el "mini kit miRNeasy", la columna se lavo dos veces con 700 pl de tampon RWT y 500 pl de tampon RPE, y a continuacion se seco la columna, seguida de elucion con 30 pl de agua libre de RNasa, para obtener una muestra de ARN purificada y concentrada.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - Con tratamiento con RNasa -
Con el fin de confirmar que el acido nucleico extraido era ARN, la muestra que se separo en (2) se sometio a tratamiento con RNasa. A la fase acuosa que contiene ARN separado en (2), se anadieron 1,5 volumenes de etanol al 100%, y se dejo que el acido nucleico se adsorbiera a la columna de la misma manera que en (3a). Despues de lavar la columna con 350 pl de tampon RWT, se anadio RNasa diluida a la misma para realizar el tratamiento de RNasa del acido nucleico adsorbido en la columna, y la columna se lavo dos veces con 350 pl de tampon RWT y 500 pl de tampon RPE, seguido de secado de la columna. Posteriormente, la elucion se llevo a cabo con 30 pl de agua libre de RNasa, para obtener una muestra de ARN purificada y concentrada.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
Despues de desnaturalizacion por calor de 1 pl de cada una de las muestras de ARN obtenidas en (3a) y (3b) a 70°C durante 2 minutos, se enfrio rapidamente cada muestra. A continuacion las muestras se sometieron a electroforesis utilizando "Agilent RNA 6000 pico kit" fabricado por Agilent Technologies Inc. (numero de modelo, 5.067-1.513). Los resultados se muestran en la figura 1. Ademas, mediante la funcion de analisis de mancha del "Bioanalyzer 2100", se calculo el area del pico de 25 a 500 nt para confirmar el tamano maximo y la cantidad (concentracion) de acido nucleico detectado.
En la muestra (3a) en la que el tratamiento enzimatico no se llevo a cabo, se encontro solo un unico pico que tenia un tamano de menos de 200 bases (carril 1). La cantidad de acido nucleico calculado en este caso fue de 816 pg/pl. Por otro lado, en el patron electroforetico de la muestra tratada con RNasa (3b), no se detecto ningun pico (carril 2).
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La cantidad de acido nucleico calculado en este caso fue de 61 pg/pl. Con el fin de confirmar el ruido en el sistema de deteccion, se llevo a cabo la misma operacion que en el ejemplo 1 utilizando PBS que no contiene acido nucleico, en lugar de suero (carril 3, BLANCO). Dado que la cantidad de acido nucleico calculado en este caso fue de 63 pg/pl, se considero que la cantidad de acido nucleico calculada para carril 2 era debida al ruido. De los resultados anteriores, se pudo confirmar que el acido nucleico extraido era ARN que no contenia ADN. Dado que el ARN que tiene de 22 a 25 bases y el pico obtenido en el presente ejemplo mostraron distancias de migracion similares en la electroforesis, se considero que el ARN que se encontro en el carril 1 tenia de 22 a 25 bases.
Los resultados anteriores se resumen en la tabla 1.
<Ejemplo comparativo 1>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo la solucion descrita en el documento de patente 2 con la misma composicion que en el ejemplo 1, excepto porque la concentracion de fenol fue del 50% en volumen en terminos de concentracion final de la solucion.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
Se llevo a cabo la operacion de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - Con tratamiento con RNasa - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(3c) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - Con tratamiento con DNasa -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en (3b) en el ejemplo 1 excepto porque la fase acuosa que contenia el ARN se trato con DNasa en lugar de RNsa en (3b), para obtener una muestra purificada y concentrada. Otras condiciones fueron las mismas que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 2.
En la muestra en la que no se llevo a cabo el tratamiento enzimatico, se detectaron dos picos intensos (correspondientes al numero de bases de, aproximadamente, 200 y, aproximadamente, 500) y un pico debil (correspondiente al mismo numero de bases que en el ejemplo 1) (carril 1). En la muestra tratada con RNsa, los picos de 200 bases y 500 bases apenas variaron y, por lo tanto, se descubrio que los dos picos no se debian a ARN (carril 2). Por otra parte, el pico debil unico habia desaparecido y, por lo tanto, se confirmo que este pico era debido a ARN como en el caso del ejemplo 1. En la muestra tratada con DNasa, los dos picos intensos habian desaparecido, y se detectaron fragmentos muy cortos debido a la degradacion (carril 3). Por lo tanto, se descubrio que estos dos picos intensos eran debidos a la contaminacion con fragmentos de ADN.
De este modo, cuando se utilizo la solucion que contenia el 50% en volumen de fenol, se observo contaminacion con ADN y no se pudo extraer ARN puro. Los resultados anteriores se resumen en la tabla 3.
<Ejemplo comparativo 2>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo la misma solucion que la solucion de extraccion que se describe en el documento de patente 1, excepto porque la concentracion de fenol fue del 60% en volumen. Es decir, la solucion contenia el 60% en volumen de fenol, tiocianato de guanidinio 2 M, acetato de sodio 0,1 M y el 0,2% en volumen de 2-mercaptoetanol en terminos de concentraciones finales, y el pH de la solucion fue de 4.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
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(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en la figura 3.
Se observaron tres picos similares a los del ejemplo comparativo 1. Por lo tanto, se pudo confirmar la contaminacion con fragmentos de ADN.
El resultado anterior se resume en la tabla 3.
<Ejemplo 2>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion de manera que la composicion de la solucion fue la misma que en el ejemplo 1 excepto porque la concentracion de fenol fue del 55% en volumen en terminos de concentracion final.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - con tratamiento con RNasa - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 4.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 (carril 1) y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada. Dado que el pico en la muestra tratada con RNasa (carril 5; RNasa(+)) era tan debil como en el BLANCO, se pudo confirmar que el acido nucleico extraido solo contenia ARN.
Los resultados anteriores se resumen en la tabla 1.
<Ejemplo 3>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion de manera que la composicion de la solucion fue la misma que en el ejemplo 1 excepto porque la concentracion de fenol fue del 65% en volumen en terminos de concentracion final.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 2 en la figura 4.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 1.
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<Ejemplo 4>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion de manera que la composicion de la solucion fue la misma que en el ejemplo 1 excepto porque la concentracion de fenol fue del 53% en volumen en terminos de concentracion final.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 3 de la figura 4.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 1.
<Ejemplo 5>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica, excepto porque se anadieron 240 pl de cloroformo en lugar de 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 4 en la figura 4.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 1.
<Ejemplo 6>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica, excepto que se anadieron 100 pl de 4-bromoveratrol en lugar de 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
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La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 1 en la figura. 5.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 1.
<Ejemplo 7>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica, excepto porque se anadieron 100 pl de 6-bromo-1,4-benzodioxano en lugar de 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 2 en la figura 5.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 1.
<Ejemplo 8>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica, excepto porque se anadieron 100 pl de 1-bromo-4-trifluorometoxibenceno en lugar de 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 3 de la figura 5.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 1.
<Ejemplo 9>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
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(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica, excepto porque se anadieron 100 pl de 1-bromo-2,4-dimetoxibenceno en lugar de 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 4 en la figura 5.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 1.
<Ejemplo 10>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica, excepto porque se anadieron 100 pl de 4-fluoroanisol en lugar de 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 5 en la figura 5.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1 y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 2.
<Ejemplo 11>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica, excepto porque se anadieron 100 pl de 4-bromotolueno en lugar de 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 6 en la figura. 5.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1, y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 2.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<Ejemplo 12>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica, excepto porque se anadieron 100 pl de 4-bromobutirato de etilo en lugar de 60 pl de p-bromoanisol al homogeneizado.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 7 en la figura 5.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1, y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la tabla 2.
<Ejemplo 13>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion mediante la adicion de acido clorhidrico a la solucion preparada en el ejemplo 1 de manera que el pH de la solucion se ajusto a 4,2.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 1 en la figura. 6.
Se detecto tambien el mismo pico que en el ejemplo 1 en el caso en que el pH de la solucion fue 4,2, y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada.
El resultado anterior se resume en la Tabla 2.
<Ejemplo comparativo 3>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion mediante la adicion de acido clorhidrico a la solucion preparada en el ejemplo comparativo 1 de manera que el pH de la solucion se ajusto a 3,6.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
5
10
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45
50
55
60
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. El resultado se muestra en el carril 2 en la figura 6. Se observaron los mismos tres picos que en el ejemplo comparativo 1. Por esto, se pudo confirmar que, en los casos en los que se utiliza la solucion que contiene el 50% en volumen de fenol, se produce tambien la contaminacion con fragmentos de ADN a un pH de 3,6.
El resultado anterior se resume en la tabla 3.
<Ejemplo 14>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 excepto porque se utilizaron celulas cultivadas (celulas HEK293) suspendidas en 300 pl de PBS como muestra biologica, en lugar de 300 pl de suero.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1, excepto porque se anadieron 1,25 volumenes de etanol a la fase acuosa, en lugar de 1,5 volumenes.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - con tratamiento con RNasa -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1, excepto porque se anadieron 1,25 volumenes de etanol a la fase acuosa, en lugar de 1,5 volumenes.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 excepto porque se utilizo "ARN Agilent 6000 nano kit" (numero de modelo, 5067-1511) (fabricado por Agilent Technologies Inc.) como el kit, en lugar de "Agilent ARN 6000 pico kit". Los resultados se muestran en la figura 7.
Se pudo confirmar que, en la muestra sin tratamiento enzimatico en (3a), se extrajo casi sin degradacion ARN ribosomico 18S y 28S (valor RIN: 2,3) (carril 1). La cantidad de acido nucleico calculado en este caso fue 79 ng/pl. En el resultado obtenido con la muestra tratada con RNasa (3b), no se detecto en absoluto el mismo pico que en el ejemplo 1 (carril 2). La cantidad de acido nucleico calculado en este caso fue 4 ng/l. Se investigo el ruido producido en el sistema de deteccion cuando ninguna muestra se sometio a electroforesis (carril 3) y, como resultado, la cantidad de acido nucleico en este caso fue 2 ng/pl. De este modo, se considero que la cantidad de acido nucleico en el carril 2 era debida al ruido. Basandose en estos resultados, se confirmo que el acido nucleico extraido era enteramente ARN.
Los resultados anteriores se resumen en la tabla 2.
<Ejemplo 15>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se mezclaron los componentes respectivos de la solucion de manera que sus concentraciones finales fueron tal como se describe a continuacion, para preparar una solucion para la extraccion de ARN. Es decir, se anadieron 60 pl adicionales de p-bromoanisol a 900 pl de la solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1, para preparar la solucion.
• Fenol al 58% en volumen
• Glicerol al 5% en volumen
• Tiocianato de guanidinio 0,8 M de (mezclado como una solucion acuosa)
• Tiocianato de amonio 0,4 M (mezclado como una solucion acuosa)
• Tampon de acetato de sodio 0,1 M (mezclado como una solucion acuosa), ajustado a pH 5.
• p-Bromoanisol al 6,6% en volumen de basado en la cantidad total (100%) de los componentes anteriores
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
Se homogeneizo la muestra mediante mezcla de 900 pl de la solucion preparada en el punto (1) anterior y 300 pl de suero por agitacion con vortice. El homogeneizado resultante se centrifugo a temperatura ambiente a 12.000 x G durante 10 minutos. Por esto, se formo una fase acuosa que contenia el ARN, y una fase organica y una fase intermedia que contenian el ADN y las proteinas. De estas, se separaron 350 pl de la fase acuosa en otro tubo.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - con tratamiento con RNasa - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en los carriles 1,
3 y 5 en la figura 8.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1, y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada (carril 1). Dado que el pico en la muestra tratada con RNasa (carril 3; RNasa(+)) era tan debil como en el BLANCO (carril 5), se pudo confirmar que el acido nucleico extraido solo contenia ARN.
Los resultados anteriores se resumen en la tabla 2.
<Ejemplo 16>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se mezclaron los componentes respectivos de la solucion de manera que sus concentraciones finales fueron tal como se describe a continuacion, para preparar una solucion para la extraccion de ARN. Es decir, se anadieron 90 pl adicionales de cloroformo a 900 pl de la solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1, para preparar la solucion.
Fenol al 58% en volumen Glicerol al 5% en volumen
Tiocianato de guanidinio 0,8 M de (mezclado como una solucion acuosa)
Tiocianato de amonio 0,4 M (mezclado como una solucion acuosa)
Tampon de acetato de sodio 0,1 M (mezclado como una solucion acuosa), ajustado a pH 5.
Cloroformo al 10% en volumen de sobre la base de la cantidad total (100%) de los componentes anteriores
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
Se homogeneizo la muestra mediante mezcla de 900 pl de la solucion preparada en el punto (1) anterior y 300 pl de suero por agitacion con vortice. El homogeneizado resultante se centrifugo a temperatura ambiente a 12.000 x G durante 10 minutos. Por esto, se formo una fase acuosa que contenia el ARN, y una fase organica y una fase intermedia que contenian el ADN y las proteinas. De estas, se separaron 350 pl de la fase acuosa en otro tubo.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico -
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - con tratamiento con RNasa - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en los carriles 2,
4 y 5 en la figura 8.
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1, y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada (carril 2). Dado que el pico en la muestra tratada con RNasa (carril 4; RNasa(+)) era tan debil como en el BLANCO (carril 5), se pudo confirmar que el acido nucleico extraido solo contenia ARN.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Los resultados anteriores se resumen en la tabla 2.
<Ejemplo comparativo 4>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo la solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo comparativo 3 excepto porque la concentracion de fenol fue del 55% en volumen.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - con tratamiento con RNasa - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 9.
En la muestra sin tratamiento enzimatico de (3a), se detecto un pico bastante mas ancho en comparacion con el pico del ejemplo 1 (carril 1) y la muestra tratada con RNasa (3b) tambien mostro un pico (carril 2). Dado que el pico obtenido con la muestra tratada con RNasa (RNasa(+)) fue tambien mas ancho que el pico en BLANCO (carril 2), se pudo confirmar la contaminacion con acido nucleico distinto del ARN (ADN).
Los resultados anteriores se resumen en la tabla 3.
<Ejemplo 17>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenia la misma composicion que en el ejemplo 1 en terminos de concentraciones finales, excepto porque el pH se ajusto a 4.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - con tratamiento con RNasa - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 10 (carriles 1,2 y 5).
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1, y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada (carril 1). Dado que el pico en la muestra tratada con RNasa (carril 2; RNasa (+)) era tan debil como en el BLANCO (carril 5), se pudo confirmar que el acido nucleico extraido solo contenia ARN.
Los resultados anteriores se resumen en la tabla 2.
5
10
15
20
25
30
<Ejemplo 18>
(1) Preparacion de la solucion para la extraccion de ARN
Se preparo una solucion que tenfa la misma composicion que en el ejemplo 1 en terminos de concentraciones finales, excepto porque el pH se ajusto a 6.
(2) Extraccion de ARN de la muestra biologica
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1 utilizando suero como muestra biologica.
(3a) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - sin tratamiento enzimatico - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(3b) Purificacion y concentracion de ARN a partir de la fase acuosa - con tratamiento con RNasa - La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
(4) Evaluacion de la pureza mediante electroforesis
La operacion se llevo a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 10 (carriles 3, 4 y 5).
Se detecto el mismo pico que en el ejemplo 1, y se pudo confirmar que solo se extrajo ARN con pureza elevada (carril 3). Dado que el pico en la muestra tratada con RNasa (carril 4; RNasa(+)) era tan debil como en el BLANCO (carril 5), se pudo confirmar que el acido nucleico extrafdo solo contenfa ARN.
Los resultados anteriores se resumen en la tabla 2.
- Eiemplo 1 Eiemplo 2 Eiemplo 3 Eiemplo 4 Eiemplo 5 Eiemplo 6 Eiemplo 7 Eiemplo 8 Eiemplo 9
- Composicion de la solucion
- Fenol (% en volumen)
- 58 55 65 53 58 58 58 58 58
- Tiocianato de guanidinio (M)
- 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
- Tiocianato de amonio (M)
- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
- Glicerol (% en volumen)
- 5 5 5 5 5 5 5 5 5
- Acetato de sodio (M)
- 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
- 2-Mercaptoetanol (% en volumen)
- - - - - - - - - -
- pH de la solucion
- 5 5 5 5 5 5 5 5 5
- Disolvente organico (anadido despues)
- Bromoanisol Bromoanisol Bromoanisol Bromoanisol Cloroformo Bromoveratrol Benzodioxano T rifluorometoxibenceno Dimetoxibenceno
- Disolvente organico (contenido anteriormente)
- - - - - - - - - -
- Muestra biologica
- Suero Suero Suero Suero Suero Suero Suero Suero Suero
- Cantidad de acido nucleico extraido (pg/pl)
- Sin tratamiento enzimatico
- 816 421
- Con tratamiento con RNasa
- 61 37
- Con tratamiento con DNasa
- - -
- Blanco
- 63 41
- Electroferograma Numero de figura/ numero de carril
- Figura 1 Figura 4 Fig. 4 Figura 4 Figura 4 Figura 5 Figura 5 Figura 5 Figura 5
- Carril 1,2
- Carril 1,5 Carril 2 Carril 3 Carril 4 Carril 1 Carril 2 Carril 3 Carril 4
- Pureza del ARN extraido
- buena buena buena buena buena buena buena buena buena
- Eiemplo 10 Eiemplo 11 Eiemplo 12 Eiemplo 13 Eiemplo 14 Eiemplo 15 Eiemplo 16 Eiemplo 17 Eiemplo 18
- Composicion de la solucion
- Fenol (% en volumen)
- 58 58 58 58 58 58 58 58 58
- Tiocianato de guanidinio (M)
- 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
- Tiocianato de amonio (M)
- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
- Glicerol (% en volumen)
- 5 5 5 5 5 5 5 5
- Acetato de sodio (M)
- 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
- 2-Mercaptoetanol (% en volumen)
- - - - - - - - - -
- pH de la solucion
- 5 5 5 4,2 5 5 5 4 6
- Disolvente organico (anadido despues)
- Fluoroanisol Bromotolueno Bromobutirato de etilo Bromoanisol Bromoanisol - - Bromoanisol Bromoanisol
- Disolvente organico (contenido anteriormente)
- - - - - - Bromoanisol Cloroformo - -
- Muestra biologica
- Suero Suero Suero Suero Celulas cultivadas Suero Suero Suero Suero
- Cantidad de acido nucleico extraido (pg/pl)
- Sin tratamiento enzimatico
- 274 209 193 174
- Con tratamiento con RNasa
- 24 29 25 22
- Con tratamiento con DNasa
- - - - -
- Blanco
- 41 41 38 38
- Electroferograma Numero de figura/ numero de carril
- Figura 5 Figura 5 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 8 Figura 10 Figura 10
- Carril 5
- Carril 6 Carril 7 Carril 1 Carril 1,2 Carril 1,3 Carril 2,4 Carril 1,2 Carril 3, 4
- Pureza del ARN extraido
- buena buena buena buena buena buena buena buena buena
Tabla 3
- Ejemplo comparativo 1 Ejemplo comparativo 2 Ejemplo comparativo 3 Ejemplo comparativo 4
- Composicion de la solucion
- Fenol (% en volumen)
- 50 60 50 55
- Tiocianato de guanidinio (M)
- 0,8 2 0,8 0,8
- Tiocianato de amonio (M)
- 0,4 - 0,4 0,4
- Glicerol (% en volumen)
- 5 - 5 5
- Acetato de sodio (M)
- 0,1 0,1 0,1 0,1
- 2-Mercaptoetanol (% en volumen)
- - 0,2 - -
- pH de la solucion
- 5 4 3,6 3,6
- Disolvente organico (anadido despues)
- Bromoanisol Bromoanisol Bromoanisol Bromoanisol
- Disolvente organico (contenido anteriormente)
- - - - -
- Muestra biologica
- Suero Suero Suero Suero
- Cantidad de acido nucleico extraido (pg/pl)
- Sin tratamiento enzimatico
- 4796 302
- Con tratamiento con RNasa
- 784 78
- Con tratamiento con DNasa
- 499 -
- Blanco
- 42 54
- Electroferograma Numero de figura/ numero de carril
- Figura 2 Carril 1-3 Figura 3 Carril 1 Figura 6 Carril 2 Figura 9 Carril 1,2
- Pureza del ARN extraido
- Insatisfactoria Insatisfactoria Insatisfactoria Insatisfactoria
Claims (9)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Solucion para la extraccion de ARN de una muestra biologica que contiene ARN y, como mfnimo, ADN, comprendiendo dicha solucion:(a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de dicha solucion;(b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de dicha solucion;(c) una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de dicha solucion;(d) un tiocianato a una concentracion de 0,1 a 0,5 M basada en la cantidad total de dicha solucion, en la que en los casos en los que la solucion comprenda tiocianato de guanidinio, la concentracion de tiocianato de guanidinio esta incluida en la concentracion de la sal de guanidinio y no esta incluida en la concentracion de tiocianato; y(e) un tampon para mantener el pH de dicha solucion entre 4 y 6.
- 2. Solucion, segun la reivindicacion 1, en la que la concentracion de fenol es del 55 al 65% en volumen basada en la cantidad total de dicha solucion.
- 3. Solucion, segun las reivindicaciones 1 o 2, que comprende ademas un disolvente organico para separar una fase acuosa.
- 4. Solucion, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha muestra biologica es un liquido de cultivo de las celulas cultivadas.
- 5. Solucion, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha muestra biologica es un componente de un fluido corporal de un organismo.
- 6. Solucion, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha muestra biologica es un componente de la sangre de un organismo
- 7. Procedimiento para la extraccion de ARN de una muestra biologica que contiene ARN y, como mfnimo, ADN, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:homogeneizar dicha muestra biologica junto con una solucion que comprende:(a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;(b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;(c) una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de la solucion;(d) un tiocianato a una concentracion de 0,1 a 0,5 M basada en la cantidad total de la solucion, en la que en loscasos en los que la solucion comprenda tiocianato de guanidinio, la concentracion de tiocianato de guanidinio estaincluida en la concentracion de la sal de guanidinio y no esta incluida en la concentracion de tiocianato; y(e) un tampon para mantener el pH de la solucion entre 4 y 6;mezclar el homogeneizado obtenido con un disolvente organico para la separacion de una fase acuosa; centrifugar la mezcla obtenida; yrecuperar una fase acuosa producida mediante la centrifugacion, que contiene el ARN.
- 8. Procedimiento para la extraccion de ARN de una muestra biologica que contiene ARN y, como mfnimo, ADN, comprendiendo el procedimiento las etapas de:homogeneizar dicha muestra biologica junto con una solucion que comprende:(a) fenol en una cantidad de no menos del 53% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;(b) un poliol en una cantidad del 3 al 10% en volumen basada en la cantidad total de la solucion;(c) una sal de guanidinio a una concentracion de 0,5 a 2,0 M basada en la cantidad total de la solucion;(d) un tiocianato a una concentracion de 0,1 a 0,5 M basada en la cantidad total de la solucion, en la que en los casos en los que la solucion comprenda tiocianato de guanidinio, la concentracion de tiocianato de guanidinio esta incluida en la concentracion de la sal de guanidinio y no esta incluida en la concentracion de tiocianato; y5 (e) un tampon para mantener el pH de la solucion entre 4 y 6; y(f) un disolvente organico para la separacion de una fase acuosa;centrifugar el homogeneizado obtenido; y10recuperar una fase acuosa producida mediante la centrifugacion, que contiene el ARN.
- 9. Procedimiento segun la reivindicacion 7 u 8, en el que la concentracion de fenol es del 55 al 65% en volumen basada en la cantidad total de dicha solucion de (a) a (e).15
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