ES2559183T3 - Procedimientos de tratamiento de una enfermedad de tipo inflamatorio - Google Patents

Procedimientos de tratamiento de una enfermedad de tipo inflamatorio Download PDF

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Longgui Wang
Xiaomei Liu
Lian Mo
Simon K. Mencher
James P. Mccarron, Jr.
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Natrogen Therapeutics International Inc
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Abstract

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una enfermedad de tipo inflamatorio asociada con los niveles de expresión de citocinas, que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) o fórmula (II) **Fórmula** en las que R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 y R10 son iguales o diferentes y representan un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo nitroso; un grupo nitro; un monosacárido; un disacárido; un átomo de halógeno; un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional insustituido o sustituido con uno o más restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacáridos, disacáridos, aminas, amidas, tioles, sulfatos, sulfonatos, sulfonamidas o halógenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono; un grupo -R11R12, en el que R11 y R12 pueden ser iguales o diferentes y representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene de 1 a 18 átomos de carbono que puede portar, adicionalmente, uno o más grupos hidroxi y/o amino, un grupo arilo sustituido o insustituido que puede comprender uno o más heteroátomos o un grupo acilo, o R11 y R12 forman juntos un anillo que tiene de 2 a 6 grupos CH2 opcionalmente sustituidos; un grupo azo -N>=N-R13, en el que R13 representa un sistema aromático que puede estar sustituido con uno o más grupos carboxilo y/o grupos fosforilo o un grupo seleccionado del grupo que consiste en azúcares, aminoácidos, péptidos u hormonas esteroides; o R1 y R6, y R2 y R7, respectivamente, forman, de forma independiente entre sí, un anillo juntos que tiene de 1 a 4 grupos CH2 opcionalmente sustituidos; y R1 y R2 son iguales o diferentes y representan un átomo de hidrógeno; un átomo de halógeno; un grupo hidroxi; un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional insustituido o sustituido con uno o más restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacáridos, disacáridos, aminas, amidas, tioles sulfatos, sulfonatos, sulfonamidas o halógenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono; un grupo mono-, di- o trialquilsililo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono independientemente uno de otro en cada caso en el grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada; un grupo mono-, di- o triarilsililo con grupos arilo sustituidos o insustituidos independientemente entre sí en cada caso; un grupo -NR17R18, en el que R17 y R18 pueden ser iguales o diferentes y representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene de 1 a 18 átomos de carbono que puede portar adicionalmente uno o más grupos hidroxi y/o amino, un grupo arilo sustituido o insustituido que puede comprender uno o más heteroátomos, o un grupo acilo; un grupo metilenamino -CH2-NR17R18, en el que R17 y R18 tienen las definiciones anteriores; un residuo de aminoácido fisiológico unido al nitrógeno como una amida, monosacárido, disacáridos u oligosacáridos sustituidos o insustituidos; o un azúcar, aminoácido, péptido u hormona esteroide; y en la que la enfermedad de tipo inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en: diabetes de tipo I; síndrome de Sjögren; uveítis; conjuntivitis alérgica; enfermedad celíaca y colitis no específica.

Description

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DESCRIPCION
Procedimientos de tratamiento de una enfermedad de tipo inflamatorio Campo de la tecnica
La invencion se refiere a usos y composiciones farmaceuticas y a procedimientos de tratar enfermedades de tipo inflamatorio asociadas con la expresion de citocinas proinflamatorias y/o la expresion reducida de citocinas antiinflamatorias, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Antecedentes de la invencion
La inflamacion irregular y/o anormal es un componente principal de una amplia gama de enfermedades humanas. Las personas que sufren multiples trastornos degenerativos a menudo exhiben niveles excesivos de marcadores proinflamatorios en su sangre. Un tipo de estos marcadores proinflamatorios son las citocinas marcadoras proinflamatorias, incluyendo IL-1 a, p, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, TNF-a, LT, LIF, oncostatina e IFNcIa, p, y.
Una lista no limitante de problemas medicos comunes causados directamente por las citocinas inflamatorias incluyen: artritis en la que las citocinas inflamatorias destruyen conduce a lesion en la membrana sinovial y destruccion del cartflago articular y del hueso; insuficiencia renal, en la que las citocinas inflamatorias restringen la circulacion y danan las nefronas; lupus, en el que las citocinas inflamatorias inducen un ataque autoinmune; asma, en el que las citocinas inflamatorias cierran las vfas respiratorias; psoriasis, en la que las citocinas inflamatorias inducen dermatitis, pancreatitis, en la que las citocinas inflamatorias inducen lesiones celulares pancreaticas; alergia, en la que las citocinas inflamatorias inducen reacciones autoinmunes; fibrosis, en la que las citocinas inflamatorias atacan el tejido traumatizado; complicaciones quirurgicas, en las que las citocinas inflamatorias impiden la cicatrizacion; anemia, en la que las citocinas inflamatorias atacan la produccion de eritropoyetina; y fibromialgia en la que las citocinas inflamatorias estan elevadas en los pacientes de fibromialgia. Otras enfermedades asociadas con la inflamacion cronica incluyen cancer, que esta causado por inflamacion cronica; ataque cardfaco en el que la inflamacion cronica contribuye a aterosclerosis coronaria; enfermedad de Alzheimer, en la que la inflamacion cronica destruye las celulas cerebrales; insuficiencia congestiva cardfaca, en la que la inflamacion cronica produce consuncion del musculo cardfaco; ictus, en el que la inflamacion cronica estimula acontecimientos tromboembolicos; y estenosis de la valvula aortica, en la que la inflamacion cronica dana las valvulas cardfacas. La arteriosclerosis, la osteoporosis, la enfermedad de Parkinson, las infecciones, la enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, asf como la esclerosis multiple (una enfermedad autoinmune de tipo inflamatorio) tambien estan relacionadas con la inflamacion (1-18). Algunas enfermedades en estadios avanzados pueden ser potencialmente mortales. Se dispone de varias metodologfas para el tratamiento de dichas enfermedades inflamatorias; no obstante, los resultados generalmente son insatisfactorios, como pone de manifiesto la falta de eficacia y los efectos secundarios relacionados con el farmaco asociados con las mismas.
Enfermedad intestinal inflamatoria
La enfermedad intestinal inflamatoria (EII) comprende la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), ambas enfermedades cronicas idiopaticas que se producen con una frecuencia creciente en muchas partes del mundo. En EE.UU., afecta a mas de 600.000 anualmente. La EII puede afectar tanto al intestino delgado como al grueso. La EC puede afectar a cualquier porcion del tracto intestinal, pero con mayor frecuencia afecta al intestino delgado distal y al colon. No afecta al recto o causa inflamacion o infeccion con drenaje alrededor del recto. La CU suele producir ulceras en la parte inferior del intestino grueso, a menudo a partir del recto. Los sfntomas pueden variar, pero pueden incluir diarrea, fiebre y dolor. Los pacientes con CU prolongada tienen un mayor riesgo de desarrollar cancer de colon, Actualmente no existe un tratamiento satisfactorio, ya que la causa de la EII sigue sin estar clara, aunque se han propuesto mecanismos infecciosos o inmunologicos. Los tratamientos de la EII estan dirigidos a controlar los sfntomas inflamatorios, usando de forma convencional corticosteroides, aminosalicilatos y agentes inmunosupresores convencionales, tales como azatioprina (captopurina de 6 unidades), metotrexato y ciclosporina. De estos, las unicas terapias modificadoras de la enfermedad son los agentes inmunosupresores azatioprina y metotrexato, ambos con un inicio de la accion lento y con una eficacia unicamente moderada. La terapia a largo plazo puede producir danos hepaticos (fibrosis o cirrosis) y supresion de la medula osea. Asimismo, los pacientes a menudo se convierten en resistentes a este tratamiento. Otras pautas terapeuticas simplemente abordan los sfntomas (19, 20).
Psoriasis
La psoriasis es una de las enfermedades cutaneas cronicas en las que interviene el sistema inmunologico mas frecuentes que se presenta en formas diferentes y varios niveles de gravedad, que afecta aproximadamente al 2% o mas de 4,5 millones de personas de EE.UU., de los cuales 1,5 millones se considera que tienen una forma moderada o grave de la enfermedad. Del diez al treinta por ciento de los pacientes con psoriasis tambien desarrolla una forma de artritis, la artritis psoriasica, que dana al hueso y al tejido conjuntivo alrededor de las articulaciones. La psoriasis aparece en forma de parches de piel roja elevada cubierta por una acumulacion como copos blancos. Tambien puede tener un aspecto de grano (psoriasis pustular) o de quemadura (eritrodermica). La psoriasis puede
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tambien producir un picor y ardor intensos. Los pacientes sufren psicologicamente ademas de ffsicamente. Actualmente se dispone de varias modalidades para el tratamiento de la psoriasis, incluyendo el tratamiento topico, la fototerapia y las aplicaciones sistemicas. No obstante, generalmente se consideran solamente supresoras de la enfermedad y modificadoras de la enfermedad. Y ninguna de ellas es curativa. Ademas, muchos tratamientos son cosmeticamente indeseables, incomodos para su uso a largo plazo o se asocian con una toxicidad significativa.
Con un mayor conocimiento de las propiedades biologicas de la psoriasis durante las ultimas 2 decadas, se ha dispuesto de terapias biologicas dirigidas a la actividad de los linfocitos T y de las citocinas responsables de la naturaleza inflamatoria de esta enfermedad. En la actualidad, entre los farmacos prescritos para la psoriasis se incluyen los inhibidores del TNF-a usados inicialmente para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR), ENBREL® (etanercept), REMICADE® (infliximab) y HUMIRA® (adalimumab) y el inhibidor de linfocitos T AMEVIVE® (alefacept) de Biogen aprobado en 2002 y RAPTIVA® (Efalizumab) de Genentech/Xoma aprobado en 2003 (21). AMEVIVE ALEFACEPT® es una protefna de fusion de inmunoglobulina compuesta por el primer dominio extracelular del LFA-3 humano fusionado con los dominios bisagra C(H)2 y C(H)3 de la IgG(1) humana. Inhibe la proliferacion de los linfocitos T a traves de las celulas NK (22), RAPTIVA® tambien se conoce como anti-CD11a, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido a la molecula de adhesion de los linfocitos T, el antfgeno 1 asociado con la funcion de los leucocitos (LFA-1). La prevencion de la union de LFA-1 a su ligando (ICAM-1, molecula 1 de adhesion intercelular) inhibe la activacion y la migracion de los linfocitos, lo que tiene como resultado una disminucion de la infiltracion linfocitaria, de modo que se limita la cascada de acontecimientos que en ultima instancia conducen a los signos y los sfntomas de la psoriasis (23). No obstante, los potenciales efectos secundarios del inhibidor del TNF-a son graves, incluido el desarrollo de linfoma (24), empeoramiento de la insuficiencia cardfaca congestiva, lo que tiene como resultado una infeccion grave y sepsis, y exacerbaciones de la esclerosis multiple y problemas del sistema nervioso central (25, 26). Mientras que los efectos secundarios del inhibidor de linfocitos T de AMEVIVE®/RAPTIVA® pueden ser mas tolerables en el tratamiento de la psoriasis, RAPTIVA® es un agente inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores tienen el potencial de incrementar el riesgo de infeccion, reactivar infecciones cronicas latentes o incrementar el riesgo de desarrollar cancer.
Aunque se han realizado muchos avances en el conocimiento de las propiedades biologicas de la psoriasis durante las ultimas 2 decadas y se ha dispuesto de un tratamiento no convencional para la psoriasis como se ha descrito anteriormente, gran parte del sufrimiento que produce todavfa no se ha abordado adecuadamente. Una encuesta con mas de 40.000 pacientes americanos con psoriasis realizada por la National Psoriasis Foundation in 1998 mostro que un 79% de los pacientes mas jovenes se sentfan frustrados por la ineficacia de su tratamiento. De aquellos con enfermedad grave, el 32% sentfa que su tratamiento no era lo bastante agresivo (27, 28).
Artritis reumatoide
La artritis reumatoide (AR) represente otro ejemplo de molesto trastorno inflamatorio. Es una frecuente enfermedad cronica de tipo inflamatorio caracterizada por inflamacion cronica del revestimiento de la membrana (sinovio) de las articulaciones y/u otros organos internos. Las celulas inflamatorias tambien pueden invadir y danar los huesos y los cartflagos. La articulacion implicada puede perder su forma y alineacion, lo que tiene como resultado perdida de movimiento. Los pacientes con AR tienen dolor, rigidez, calor, enrojecimiento e inflamacion de las articulaciones y otros sfntomas sistemicos, fiebre, fatiga y anemia. Aproximadamente el 1% de la poblacion o 2,1 millones en EE.UU. actualmente estan afectados, de los cuales hay mas mujeres (1,5 millones) que varones (0,6 millones). La patologfa de la AR no se entiende del todo, aunque la cascada de reacciones inmunologicas inadecuadas se ha postulado como mecanismo. El tratamiento convencional es, por desgracia, ineficiente en la AR (29). La enfermedad no responde completamente a los medicamentos sintomaticos, incluyendo corticosteroides y farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) usados desde la decada de 1950. Asimismo, estos medicamentos pueden comportar un riesgo de efectos adversos graves. Los efectos terapeuticos de los farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad (FARME), tal como metotrexato (MTX), a menudo son inconsistentes y de corta duracion.
Recientemente se ha desarrollado una nueva clase de FARME biologicos (farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad) para el tratamiento de la AR en base al conocimiento del papel de las citocinas, TNF-a e IL-1, en el proceso inflamatorio. El FDA ha aprobado varios de estos FARME, incluyendo ENBREL® (etanercept) de Immunex/Amgen Inc. en 1998, REMICADE® (infliximab) de Centocor /Johnson & Johnson, HUMIRA® (adalimumab) de Abbott Laboratories Inc. en 2002, y KINERET® (anakinra) de Amgen in 2001. ENBREL® es una protefna recombinante receptora del TNF (TNFr). REMICADE® es un anticuerpo monoclonal de raton humanizado (quimerico) anti-TNF-a. HUMIRA® es un anticuerpo monoclonal completamente humano anti-TNF creado usando la tecnologfa de expresion en fagos que tiene como resultado un anticuerpo con regiones variables de las cadenas pesada y ligera derivadas del ser humano y las regiones constantes lgG1:k humana. Todos estos 3 farmacos basados en protefnas estan dirigidos y se unen al TNF-a para bloquear los efectos de TNF-a. KINERET® es un antagonista recombinante del receptor de IL-1, que es similar al IL-1 Ra humano nativo, a excepcion de la adicion de un solo residuo de metionina en su extremo amino. KINERET® bloquea la actividad biologica de la IL-1 inhibiendo de forma competitiva la union de la IL-1 al receptor de tipo I de la IL-1 (IL-1RI) y, en consecuencia, reduciendo los efectos proinflamatorios de la IL-1.
El tratamiento con estos FARME biologicos alivia los sfntomas, inhibe la progresion del dano estructural y mejora la funcion ffsica en pacientes con AR activa moderada o grave. Los 3 agentes bloqueantes del TNF-a comercializados
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tienen una eficacia similar cuando se combinan con MTX, un FARME de uso amplio, en el tratamiento de pacientes con AR (30). Aunque proporcionan una eficacia significativa y un buen perfil de seguridad global a corto y a medio plazo en muchos pacientes con AR, estos tratamientos biologicos pueden crear graves problemas y efectos secundarios a largo plazo, tal como en el hfgado, y todavfa se tienen que evaluar. Ha habido una asociacion molesta entre el uso de ENBREL® o EMICADE® y el desarrollo de linfoma (24). Como se ha descrito anteriormente, en varios informes se ha demostrado que en los pacientes tratados con ENBREL® o REMICADE® empeora su insuficiencia cardfaca congestiva y se desarrollan infecciones graves y sepsis, y se incrementan las exacerbaciones de la esclerosis multiple y de otros problemas del sistema nervioso central (26, 27).
Esclerosis multiple
La esclerosis multiple (EM) es una enfermedad autoinmunitaria diagnosticada en 350.000 a 500.000 personas en EE.UU. La presencia de multiples areas de inflamacion y cicatrizacion de la mielina en el cerebro y la medula espinal significan la enfermedad. Los pacientes con EM exhiben varios grados de deterioro neurologico en funcion de la localizacion y extension de la cicatrizacion de la mielina. Los sfntomas comunes de la EM incluyen fatiga, debilidad, espasticidad, problemas de equilibrio, problemas de la vejiga urinaria e intestinales, entumecimiento, perdida de vision, temblores y depresion. El tratamiento actual de la EM solo alivia los sfntomas o retrasa la progresion de la discapacidad, y varios tratamientos nuevos de la EM, incluyendo el trasplante de celulas madre y la terapia genica son conservadores (31, 32). Aunque se ha demostrado que los anticuerpos anti-TNF tienen efectos protectores en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), agravan la enfermedad en pacientes con EM, lo que sugiere que la inhibicion del TNF-a solo no es suficiente (33).
Trastornos neurodegenerativos
La enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (PK) son los 2 trastornos neurodegenerativos mas frecuentes. La EA es un trastorno cerebral. Afecta gravemente a la capacidad de una persona para llevar a cabo las actividades cotidianas. Afecta a las partes del cerebro que controlan el pensamiento, la memoria y el lenguaje. Se ha estimado que aproximadamente 4 millones de americanos, normalmente mayores de 60 anos, sufren EA.
La PK es un trastorno progresivo del sistema nervioso central que afecta a mas de 1,5 millones de personas en EE.UU. Clfnicamente, la enfermedad se caracteriza por una disminucion de los movimientos espontaneos, dificultad para andar, inestabilidad postural, rigidez y temblores. La PK se debe a la degeneracion de las neuronas pigmentadas en la sustancia negra del cerebro, lo que tiene como resultado una disminucion de la disponibilidad de dopamina. Las causas de estos trastornos neurodegenerativos son desconocidas y actualmente no existe una cura para la enfermedad
Por tanto, se necesitan nuevos abordajes para el tratamiento de las enfermedades de tipo inflamatorio anteriores y otras. Aunque los mecanismos por los cuales se producen las enfermedades de tipo inflamatorio todavfa no estan claros y a menudo varfan entre sf, se ha demostrado que la disfuncion del sistema inmunologico causada por la alteracion de la regulacion de las citocinas desempena un importante papel en el inicio y progresion de la inflamacion (Tabla 1) (27, 34, 35).
Generalmente, las citocinas se pueden clasificar en 3 tipos: proinflamatorias (IL-1 a, p, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL- 12, IL-17, IL-18, TNF-a, LT, LIF, oncostatina e IFNcIa, p, y,); antiinflamatorias (IL-4, IL-10, IL-11, W-13 y TGFp); y quimiocinas (IL-8, Groa, MIP-1, MCP-1, ENA-78, y RANTES)..
En muchas afecciones inflamatorias, las citocinas proinflamatorias, especialmente TNF-a, IL-1 p, e IL-6, asf como la citocina antiinflamatoria IL-10, parecen desempenar un papel importante en la patogenia de varias enfermedades de tipo inflamatorio y, por tanto, pueden servir como potenciales objetivos terapeuticos. Por ejemplo, los niveles elevados de algunas citocinas proinflamatorias (TNF-a, IFNy, IL-1, iL-2, IL-6 e IL-12) y quimiocinas (IL-8, MCP-1 y RANTES) se han observado en varias enfermedades de tipo inflamatorio, tales como EC, psoriasis, AR, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto (34), en paralelo con un incremento de los receptores solubles de TNF, antagonistas de los receptores de IL-1 y la citocina antiinflamatoria IL-10 (36, 37). Se ha demostrado que la IL-10 suprime la produccion de niveles elevados de citocinas proinflamatorias, tanto in vitro en cultivos de LPMC como en pacientes in vivo (38). La respuesta positiva de los pacientes de EC tratados con IL-10 demuestra que tambien podrfa haber un desequilibrio entre la produccion de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias en la EC.
En resumen, el abordaje del tratamiento de enfermedades de tipo inflamatorio ha sufrido un cambio evolutivo en los ultimos anos, en parte como consecuencia de problemas crecientes de la gravedad de estas enfermedades y en parte debido al considerable progreso en el conocimiento del importante papel de las citocinas en su inmunopatogenia. La mayorfa de los esfuerzos se han centrado en apuntar al TNF-a e IL-1 (39), y varios productos (inhibidores de TNF-a infliximab, un anticuerpo monoclonal anti-TNF-a; y etanercept, el receptor de p75 TNF-a) actualmente se han comercializado o estan en ensayos clfnicos para el tratamiento de la AR, la psoriasis y la EII como se ha mencionado anteriormente. Otros diversos farmacos candidatos o estrategias dirigidas a IEL-1 (40), IL-6 o IL-10 se estan desarrollando (40-42). Estos tratamientos biologicos proporcionan una eficacia significativa a corto y medio plazo en muchos pacientes con AR (43-46). Aunque estos farmacos son bien tolerados y tienen un perfil de seguridad global bueno, se necesita una farmacovigilancia activa. En base a este mecanismo de accion y las
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notificaciones previas de una amplia variedad de efectos adversos, los riesgos a largo plazo de los efectos secundarios, incluyendo hematologicos, infecciosos, neuroticos, oncologicos e inmunologicos, tienen que examinarse.
Las estrategias dirigidas a una unica citocina proinflamatoria como terapia antiinflamatoria ignoran un hecho muy importante, que es que las enfermedades de tipo inflamatorio implican un “sistema” de redes de citocinas sofisticado. Por ejemplo, las quimiocinas, una familia de moleculas inmunitarias relacionadas con la IL-8, contienen aproximadamente 50 ligandos y 20 receptores, que a menudo actuan con redundancia, lo que hace que la seleccion de los antagonistas especfficos adecuados sea no solo diffcil sino que carezca de eficacia a largo plazo. Ademas, los productos actualmente comercializados o los productos en desarrollo son, principalmente, agentes basados en protefnas, que son caras de producir e incomodas de administrar (es decir, infusion). Por tanto, dado que el funcionamiento del sistema inmunologico esta finamente equilibrado por las actividades de los mediadores proinflamatorios y antiinflamatorios o citocinas, la modulacion de multiples citocinas pro/antiinflamatorias en lugar de bloquear unicamente una citocina proinflamatoria concreta mediante pequenas moleculas no solo conseguirfa mejor eficacia terapeutica con menos efectos secundaros sino que tambien tendrfa las muchas ventajas de los farmacos de molecula pequena.
Segun este concepto, los inventores examinaron varios tipos de moleculas pequenas para analizar su capacidad en la regulacion de multiples citocinas y exploraron sus potenciales aplicaciones clfnicas para el tratamiento de diversas enfermedades de tipo inflamatorio.
El meisofndigo es un derivado de indirubina que se ha usado para el tratamiento de la leucemia mieloide cronica (LMC) en China con efectos secundarios minoritarios (47). En la patente anterior de los inventores (patente de EE.UU. N° 6.566.341), los inventores demostraron que el meisofndigo y sus derivados son activos contra tumores solidos por su capacidad para inhibir las quinasas dependientes de ciclina, inducir la diferenciacion celular y estimular la apoptosis. En la invencion actual, los autores muestran nuevas actividades terapeuticas de esta clase de moleculas en el tratamiento de diversas enfermedades de tipo inflamatorio, incluyendo enfermedades inflamatorias intestinales y psoriasis en roedores y en seres humanos. Los inventores han demostrado que este tipo de agente inhibe la secrecion y expresion de multiples citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-1p, IL-6 y TNF-a en las Imeas celulares y estimula la produccion de la citocina antiinflamatoria IL-10. En un caso humano, tambien se ha demostrado que el meisofndigo es muy eficaz contra la EII y no se observaron efectos secundarios significativos.
El documento EP 1 079 826 de Eisenbrand y col., titulado “Use of Indigoid Bisindole Derivatives for the Manufacture of a Medicament to Inhibit Cyclin Dependent Kinases," esta dirigido al uso de derivados de bisindol indigoide para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con la perdida de control de la proliferacion. De acuerdo con el documento EP 1 079 826, la psoriasis, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades infecciosas, los trastornos nefrologicos y neurodegenerativos e infecciones virales son todas ellas enfermedades asociadas con la perdida del control de la proliferacion. El documento EP 1 079 826 ensena que el medicamento es eficaz en el tratamiento de estas enfermedades asociadas con la perdida del control de la proliferacion a traves de la inhibicion de las quinasas dependientes de ciclina (CDK).
Por el contrario, los solicitantes descubrieron que el isofndigo, el indigo, la indirrubina y derivados definidos por las reivindicaciones adjuntas se pueden usar para suprimir o inhibir la expresion de citocinas proinflamatorias, por ejemplo TNF-a, IL-1 e IL-6, para tratar las enfermedades de tipo inflamatorio asociadas con la expresion de citocinas.
Aunque determinadas enfermedades mencionadas en el documento EP 1 079 826 como asociadas con la perdida de control de la proliferacion celular tambien estan relacionadas con la expresion de citocinas. Los solicitantes han descubierto que la cantidad de agente terapeutico necesaria para tratar estas correspondientes enfermedades inhibiendo los niveles de citocinas es significativamente menor que el necesario para inhibir las CDK tal como ensena el documento EP 1 079 826. El documento WO 03/051900 se refiere a isofndigo, indigo e indirubina y a su uso en el tratamiento del cancer.
Sumario de la invencion
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas y permite el tratamiento de diversas enfermedades de tipo inflamatorio con mfnimos efectos secundarios. Una de las ventajas mas importantes de la presente invencion es que los compuestos terapeuticos no solo abordan los sfntomas de varias enfermedades de tipo inflamatorio, sino que tambien modifican las enfermedades a traves de la supresion de la expresion/secrecion de multiples citocinas proinflamatorias (IL-1 a, p, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, TNF-a, LT, LIF, oncostatina o IFNcla, p, y) y/o mediante la estimulacion de la expresion de citocinas antiinflamatorias (IL-4, IL-10, IL-11, W-13 o TGFp).
La presente invencion a menudo tiene como resultado una curacion en lugar de simplemente una remision temporal de los sfntomas de la enfermedad. Por el contrario, las terapias existentes para las enfermedades de tipo inflamatorio, en la mayorfa de los casos solo alivian los sfntomas durante un corto periodo de tiempo. Adicionalmente, los compuestos terapeuticos de la presente invencion son moleculas pequenas que son simples, qufmicamente estables y son sustancialmente faciles de producir y de administrar. Adicionalmente, los solicitantes
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han descubierto que dosis/concentraciones comparativamente bajas de los compuestos generalmente son suficientes para inhibir sustancialmente las citocinas proinflamatorias en el paciente, reduciendo el riesgo de producir efectos secundarios asociados con el tratamiento.
Las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento incluyen, preferentemente, al menos un compuesto seleccionado de isoindigo, indigo, indirubina o un derivado definido en las reivindicaciones adjuntas, un agente antiinflamatorio y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
Breve descripcion de las fiauras
La Figura 1 es una representacion esquematicas de los papeles de las citocinas pro/antiinflamatorias y factores de crecimiento y los sitios de accion del meisoindigo en el proceso patologico de las enfermedades cronicas de tipo inflamatorio.
La Figura 2 muestra el efecto del meisoindigo sobre la secrecion de IL-1p en celulas THP-1 monocfticas humanas estimuladas con LPS. Efecto inhibidor del meisoindigo sobre la produccion de IL-1p en celulas THP-1 monocfticas humanas estimuladas con LPS. Las celulas THP-1 se trataron/estimularon con y sin 1 pg de lipopolisacarido (LPS, Sigma) y se expusieron durante 24 horas a una serie de concentraciones de meisoindigo (de 31,25 nM a 16.000 nM). La viabilidad de las celulas se examino al microscopio tras tincion con azul de tripano. Los niveles proteicos de IL-1 p secretados en los medios de cultivo se midieron mediante ELISA y se calcularon a partir de su curva estandar (panel A) usando un kit de ensayo de R&D Systems como se describe en Materiales y Procedimientos en el Ejemplo 1 a continuacion. Se uso la prueba t de student para determinar la significacion estadfstica, *** indica P < 0,001. Como se ha mostrado en el panel B, el meisoindigo inhibe significativamente la produccion de IL-1 p a una concentracion tan baja como 31 nM.
La Figura 3 muestra el efecto del meisoindigo sobre la secrecion y expresion de IL-6 en celulas THP-1 monocfticas humanas estimuladas con LPS. Efectos del meisoindigo sobre la produccion (panel B) y la transcripcion (panel C) de la IL-6 en celulas THP-1 estimuladas con LPS: las celulas THP-1 se trataron/estimularon con y sin 1,0 pg/ml de LPS y se expusieron a una serie de concentraciones de meisoindigo (de 0,031 a 16 pM) durante 24 horas. La protefna IL-6 en el medio se midio mediante ELISA y la transcripcion de IL-6 en las celulas se midio mediante PCR en tiempo real como se describe en Materiales y Procedimientos en el Ejemplo 2 siguiente. Panel A: Curva estandar establecida usando la protefna IL-6 pura y se uso para el calculo de la produccion de protefnas en el panel B; Panel C: Ensayo de PCR en tiempo real para la transcripcion de IL- 6. ***: < 0,001. Como se muestra en los paneles B y C, el meisoindigo inhibe significativamente tanto la secrecion como la transcripcion de IL-6.
La Figura 4 muestra el efecto del meisoindigo sobre la secrecion y la expresion de TNF-a en celulas THP-1 monocfticas humanas. Efectos del meisoindigo sobre la produccion de protefnas (panel B) y la transcripcion genica (panel C) de TNF-a en celulas THP-1 estimuladas con LPS: las celulas THP-1 se trataron/estimularon con y sin 1,0 pg/ml de LPS y se expusieron a una serie de concentraciones de meisoindigo (de 0,031 to 16 pM) durante 24 horas. La protefna TNF-a en el medio se midio mediante ELISA y su transcripcion en las celulas se midio mediante tecnologfa PCR en tiempo real como se describe en Materiales y Procedimientos en el Ejemplo 3 siguiente. Panel A: Curva estandar establecida usando la protefna TNF-a pura y se uso para el calculo de la produccion de protefnas en el panel B. Se obtuvo una inhibicion dependiente de la concentracion de meisoindigo en la secrecion de TNF-a (Panel B). Panel C: Ensayo de PCR en tiempo real para la transcripcion de TNF-a. No se observaron efectos del agente sobre la transcripcion de TNF-a. ***: P < 0,001.
La Figura 5 muestra la estimulacion de IL-10 con meisoindigo en celulas THP-1. Estimulacion del meisoindigo sobre la produccion de IL-10 en celulas THP-1 tratadas con LPS. Las celulas THP-1 se trataron con y sin 1,0 pg/ml de LPS y se expusieron a una serie de concentraciones de meisoindigo (de 0,031 to 16 pM) durante 24 horas. La protefna IL-10 en el medio se midio mediante ELISA como se describe en Materiales y Procedimientos en el Ejemplo 4 siguiente. Panel A: La curva estandar se establecio usando la protefna IL-10 pura y se uso para el calculo de la produccion de protefnas en el panel B. Aunque el LPS estimulante de la inflamacion disminuyo el nivel proteico de IL-10, el meisoindigo aumento significativamente la produccion de protefnas y el efecto de estimulacion maximo se produjo a 62,5 nM con un incremento de aproximadamente 2 veces de la secrecion de IL-10 (panel B). **: P < 0,01.
La Figura 6 muestra los efectos del meisoindigo y NATURA sobre la expresion de citocinas proinflamatorias y quinasas dependientes de ciclina en celulas THP-1. Las celulas THP-1 que crecieron exponencialmente se estimularon con (panel A y B) y sin (panel C) 1 pg de LPS y se expusieron durante 24 horas a las concentraciones indicadas de meisoindigo o NATURA. La viabilidad de las celulas se analizo con ensayo de excepcion con azul de tripano. Los niveles proteicos de IL-1 p, IL-6 e IL-10 secretados en los medios de cultivo se midieron mediante ELISA como se ha descrito en los ejemplos anteriores usando un kit de ensayo de R&D Systems como se describe en Materiales y Procedimientos en el Ejemplo 5 a continuacion. Se uso la prueba t de Student para determinar la significacion estadfstica, * indica P < 0,001. El meisoindigo y NATURA inhiben significativamente la produccion de IL-1 p e IL-6 y estimularon la produccion de IL-10 a las concentraciones de 31,25 y 62,5 nM. Por el contrario, no se observo efecto inhibidor de los compuestos sobre CDK2 a las
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concentraciones bajas (31,25 y 62,50 nM) en las mismas condiciones experimentales.
La Figura 7 muestra que el meisofndigo es eficaz contra la colitis ulcerosa aguda inducida por DSS en ratones. Ejemplos de histoqufmica de las paredes colonicas de colitis ulcerosa aguda inducida con 5% de DSS en ratones Balb/c tratados con y sin meisofndigo (tincion con H y E, aumento original x 100). La induccion con DSS y el tratamiento con meisofndigo se realizaron como se describe en Materiales y Procedimientos en el ejemplo 7 siguiente. El Panel A muestra la morfologfa normal de la pared colonica de animales en el grupo control normal a los que se administro agua de bebida sin DSS. El Panel B muestra la pared colonica de un raton con colitis ulcerosa aguda inducida por 5% de DSS que indica la presencia de infiltracion intense de celulas inflamatorias (folfculos linfoides, flechas rojas) y la desaparicion focal de las criptas mucosas (lesiones erosivas, flechas azules). El Panel C muestra la pared colonica de un raton tratado con meisofndigo con colitis ulcerosa aguda inducida por DSS al 5%. La morfologfa es similar a la mostrada en el control normal (panel A), lo que indica que el meisofndigo es eficaz contra la colitis ulcerosa aguda inducida por DSS en ratones.
La Figura 8 son fotograffas de sigmoidoscopia flexible de un paciente con enfermedad intestinal inflamatoria antes y despues del tratamiento con meisofndigo. Los paneles superiores son las fotos de dos sitios de la inflamacion (A y B) que muestran claramente inflamacion con edema grave. El examen patologico realizado por un anatomopatologo del Mount Sinai Medical Center de Nueva York concluyo “protocolitis cronica muy activa" con erosion y caractensticas sugestivas de enfermedad intestinal inflamatoria idiopatica”. Los paneles inferiores son las fotos de sigmoidoscopia flexible de las mismas localizaciones 9 semanas despues de tratar al paciente con meisofndigo. Despues del tratamiento, la superficie del colon paso a estar normal, el edema desaparecio y los vasos se pueden ver claramente, aunque hay cicatrices en la localizacion B (panel inferior) durante la remision. El informe del anatomopatologo concluyo “protocolitis cronica inactiva” sugestiva de enfermedad intestinal inflamatoria idiopatica”.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. Un uso preferido de la presente invencion comprende administrar a un animal que necesite dicho tratamiento uno o mas como se define en las reivindicaciones. En una realizacion preferida, el compuesto se administra en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad de tipo inflamatorio inhibiendo la expresion de citocinas proinflamatorias y/o estimulando las citocinas antiinflamatorias.
Debe entenderse que los presentes usos incluyen, entre otros, tratar la enfermedad de tipo inflamatorio impidiendo la inflamacion asociada con la enfermedad a traves de la regulacion de las citocinas implicadas en el progreso patologico, impidiendo por tanto el inicio de la enfermedad de tipo inflamatorio.
La enfermedad de tipo inflamatorio se selecciona del grupo constituido por: diabetes de tipo I; enfermedad de Sjogren; uveitis; enfermedad celfaca; conjuntivitis alergica y colitis no especffica.
Otras enfermedades de tipo inflamatorio divulgadas en el presente documento pero no reivindicadas incluyen: artritis, artritis reumatoide, una enfermedad intestinal inflamatoria; psoriasis; esclerosis multiple; un trastorno neurodegenerativo; insuficiencia cardfaca congestiva; ictus; estenosis de la valvula aortica; insuficiencia renal; lupus; pancreatitis; alergia; fibrosis; anemia; aterosclerosis; una enfermedad metabolica; una enfermedad osea; una enfermedad cardiovascular, una complicacion de la quimioterapia/radioterapia; diabetes de tipo II; una enfermedad hepatica; un trastorno gastrointestinal; una enfermedad oftalmologica; retinopatfa diabetica; un trastorno pulmonar, una enfermedad renal; dermatitis; caquexia relacionada con el VIH; malaria cerebral; espondilitis anquilosante; lepra; anemia y fibromialgia.
Trastornos neurodegenerativos divulgados en el presente documento incluyen: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson; la enfermedad intestinal inflamatoria se selecciona del grupo constituido por: enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa; la complicacion gastrointestinal es diarrea, la enfermedad hepatica se selecciona del grupo constituido por: una hepatitis autoinmune, hepatitis C, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria o insuficiencia hepatica fulminante; la enfermedad osea es osteoporosis; el trastorno pulmonar se selecciona del grupo constituido por: rinitis alergica, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, inflamacion granulomatosa cronica, fibrosis qufstica y sarcoidosis; la enfermedad cardiovascular se selecciona del grupo constituido por: enfermedad cardfaca aterosclerotica; insuficiencia cardfaca congestiva; y la enfermedad renal se selecciona del grupo constituido por: glomerulonefritis y vasculitis.
Como se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la enfermedad es enfermedad inflamatoria intestinal (EII), incluyendo especfficamente la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, o la enfermedad que se esta tratando tratar es artritis, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad posradioterapia o aterosclerosis.
El compuesto esta en una cantidad para inhibir la expresion de citocinas proinflamatorias y/o para estimular la expresion de citocinas antiinflamatorias. En una realizacion, el compuesto esta, preferentemente, en una cantidad para inhibir al menos un 30% la expresion de una o mas de las citocinas proinflamatorias seleccionadas del grupo constituido por: IL-1a, p, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, TNF-a, LT, LIF, oncostatina y IFNcla, p, y:
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Mas preferentemente, se inhibe al menos el 40% de la expresion de la citocina y, lo mas preferentemente, se inhibe el 50% o mas. En otra realizacion, el compuesto esta, preferentemente, en una cantidad para estimular la expresion de citocinas antiinflamatorias. En esta realizacion, el compuesto esta, preferentemente, en una cantidad para aumentar las citocinas antiinflamatorias seleccionadas del grupo constituido por: citocinas IL-4, IL-10, IL-11, W-13 o TGFp en al menos un 25%, mas preferentemente al menos 50% y, lo mas preferentemente, al menos 75%.
Estructuras qufmicas:
La presente invencion esta dirigida al uso de un grupo especffico de compuestos de Formulas (I) o (II)
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FORMULA (I)
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FORMULA (II)
en las que R3, R4, R5, R6, R7, Rs, R9 y R10 son iguales o diferentes y representan un atomo de hidrogeno; un grupo hidroxi; un grupo nitroso; un grupo nitro; un monosacarido; un disacarido; un atomo de halogeno; un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional insustituido o sustituido con uno o mas restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacaridos, disacaridos, aminas, amidas, tioles, sulfatos, sulfonatos, sulfonamidas o halogenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a S atomos de carbono; un grupo -R11R12, en el que R11 y R12 pueden ser iguales o diferentes y representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene de 1 a 1 S atomos de carbono que puede portar, adicionalmente, uno o mas grupos hidroxi y/o amino, un grupo arilo sustituido o insustituido que puede comprender uno o mas heteroatomos o un grupo acilo, o R11 y R12 forman juntos un anillo que tiene de 2 a 6, grupos CH2 opcionalmente sustituidos; un grupo azo -N=N-R13, en el que R13 representa un sistema aromatico que puede estar sustituido con uno o mas grupos carboxilo y/o grupos fosforilo o un grupo seleccionado del grupo constituido por azucares, aminoacidos, peptidos u hormonas esteroides; o R1 y R6, y R2 y R7, respectivamente, forman, de forma independiente entre si, un anillo juntos que tiene de 1 a 4 grupos CH2 opcionalmente sustituidos;
Los grupos R1 y R2 son iguales o diferentes y representan un atomo de hidrogeno; un atomo de halogeno; un grupo hidroxi; un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional insustituido o sustituido con uno o mas restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacaridos, disacaridos, aminas, amidas, tioles sulfatos, sulfonatos, sulfonamidas o halogenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a S atomos de carbono; un grupo mono-, di- o trialquilsililo que tiene de 1 a 6 atomos de carbono independientemente uno de otro en cada caso en el grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada; uno grupo mono-, di- o triarilsililo con grupos arilo sustituidos o insustituidos independientemente entre si en cada caso; un grupo -NR17R18, en el que R17 y R18 pueden ser iguales o diferentes y representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene de 1 a 18 atomos de carbono que puede portar adicionalmente uno o mas grupos hidroxi y/o amino, un grupo arlo sustituido o insustituido que puede comprender uno o mas heteroatomos, o un grupo acilo; un grupo metilenamino -CH17R18, en el que R17 y R18 tienen las definiciones anteriores; un residuo de aminoacidos fisiologicos unidos al nitrogeno como una amida, monosacarido, disacaridos u oligosacaridos sustituidos o insustituidos; o un azucar, aminoacido, peptido u hormona esteroide.
Compuestos preferidos son aquellos en los que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs, R9 o R10 es, de forma
independiente, un monosacarido, un disacarido o un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional sustituido con uno o mas restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacaridos, disacaridos, aminas, amidas, tioles o halogenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 atomos de carbono; y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs, R9 o R10 potencia la bioactividad o la biodisponibilidad del compuesto.
Es preferible que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs, R9 o R10 potencie la bioactividad o la biodisponibilidad del compuesto
aumentando la solubilidad del compuesto. Es mas preferible que tanto la bioactividad como la biodisponibilidad aumenten por uno o mas de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs, R9 o R10.
Compuestos preferidos son aquellos en los que al menos R1 o R2 es un monosacarido, un disacarido insustituido o
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sustituido con uno o mas restos hidroxi o restos carboxi, un halogeno, un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional insustituido o sustituido con uno o mas restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacaridos, disacaridos, aminas, amidas, tioles, sulfatos, sulfonatos, sulfonamidas o halogenos, en que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 atomos de carbono. En muchos casos, solo uno de Ri o R2 necesita ser uno de los restos citados, siendo uno de los sustituyentes mas preferidos -CH2CH2OH.
Compuestos mas preferidos de las formulas (I) o (II) son unos en los que Ri o R2 es una molecula glicosido, lo mas preferentemente un monosacarido y, lo mas preferentemente, un monosacarido acetilado.
En una realizacion de la invencion, los usos implican los compuestos meisofndigo, glico-meisofndigo triacetilado (profarmaco) (mostrado como formula (V)) y NATURA (mostrado como Formula (VI)).
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FORMULA (V)
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FORMULA (VI)
El termino “hidrocarbilo” en el contexto de la presente invencion y en las formulas anteriores, se refie re ampliamente a un grupo hidrocarburo monovalente en el que la Valencia deriva por abstraccion de un hidrogeno de un atomo de carbono. Hidrocarbilo incluye, por ejemplo, grupos alifaticos (de cadena lineal y ramificada), cicloalifaticos, aromaticos y de caracter mixto (p. ej., aralquilo y alcarilo). Hidrocarbilo tambien incluye los grupos con insaturacion interna e insaturacion activada. Mas especfficamente, hidrocarbilo incluye (entre otros) grupos tales como alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, alcarilo, alquenilo, cicloalquenilo y alquinilo, preferentemente que tiene hasta 12 atomos de carbono. Las realizaciones preferidas incluyen aquellas en las que el grupo hidrocarbilo tiene de 1 a 8 atomos de carbono. Estos y otros grupos hidrocarbilo pueden contener, opcionalmente, un grupo o grupos carbonilo (que esta/estan incluido/s en el recuento de carbonos) y/o un heteroatomo o heteroatomos (tales como al menos un oxfgeno, azufre, nitrogeno o silicio) en la cadena o anillo.
El termino “hidrocarbilo funcional” en el contexto de la presente invencion y en las formulas anteriores, se refiere ampliamente a un grupo hidrocarbilo que posee funcionalidades “reactivas” y/o “reactivas latentes” pendientes y/o terminales y/o grupos salientes. Funcionalidades reactivas hacen referencia a funcionalidades que son reactivas con funcionalidades de monomero/polfmero comunes en condiciones normales bien entendidas por los expertos en la tecnica en cuestion. Ejemplos de funcionalidades reactivas son grupos que contienen hidrogeno activo tales como hidroxilo, amino, carboxilo, tio, amido, carbamoflo y metileno activado; grupos isocianato, ciano y epoxi; grupos etilenicamente insaturados tales como alilo y metalilo; y grupos insaturados activados tales como acriloflo y metacriloflo, y maleato y maleimido (incluyendo los aductos de Diels-Alder de los mismos con dienos tales como butadieno). Funcionalidades reactivas latentes dentro del significado de la presente invencion y, como entenderan claramente los expertos en la tecnica en cuestion, hacen referencia a funcionalidades que estan bloqueadas o enmascaradas para impedir la reaccion prematura. Ejemplos de funcionalidades reactivas latentes son cetiminas y aldiminas (aminas bloqueadas, respectivamente, con cetonas y aldehfdos), sales de amina-carboxilato e isocianatos bloqueados tales como alcohol (Carbamates), oxima y variaciones bloqueadas de caprolactama. Un “grupo saliente” dentro del significado de la presente invencion, y, como entenderan claramente los expertos en la tecnica en cuestion, es un sustituyente unido a la cadena o anillo hidrocarbilo durante que durante la reaccion se desplaza creando una valencia sobre un carbono o heteroatomo en la cadena o anillo de hidrocarbilo. Ejemplos de grupos salientes son atomos de halogeno tales como cloro, bromo y yodo; sales de amonio cuaternario, sales de sulfonio y sulfonatos.
Un monosacarido o disacarido de la presente invencion es, preferentemente, glucosa, fructosa, ribulosa, galactosa,
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manosa, celobiosa, alosa, altrosa, ribosa, xilosa, arabinosa, sacarosa o lactosa. Lo mas preferentemente es D- glucosa, D-ribosa, D-galactosa, D-lactosa, D-xilosa o D-sacarosa.
En una realizacion preferida, el monosacarido o disacarido esta acetilado, preferentemente al menos diacetilado y, lo mas preferentemente, triacetilado.
El termino “halogeno” indica fluor, cloro, bromo o yodo. Preferentemente, es fluor o cloro.
Como se usa en el presente documento, aminoacido significa un aminoacido L o D (o un residuo del mismo), preferentemente L, seleccionado del grupo constituido por alanina, arginina, acido aspartico, asparagina, cistefna, acido glutamico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina o valina. El termino peptido es dos o mas aminoacidos unidos por un enlace peptfdico, que contiene, preferentemente, de 2 a 8 aminoacidos y, lo mas preferentemente, que contiene de 2 a 6 aminoacidos.
Preparaciones farmaceuticas y administraciones:
La invencion se puede usar para tratar a un animal con una enfermedad de tipo inflamatorio como se define en las reivindicaciones, siendo preferible que el animal sea un mamffero y mas preferible que el animal sea un ser humano.
Tambien debe senalarse que los beneficios terapeuticos normalmente se llevan a cabo mediante la administracion de al menos 1, 2, 3 o mas de los compuestos como se define en las reivindicaciones de forma concurrente o secuencial. Los compuestos como se definen en las reivindicaciones tambien se pueden combinar con otras terapias para proporcionar cantidades combinadas terapeuticamente eficaces. El compuesto como se define en las reivindicaciones se puede administrar, por ejemplo, en combinacion con agentes adicionales, preferentemente agentes antiinflamatorios.
En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica para tratar una enfermedad de tipo inflamatorio asociada con la expresion de citocinas proinflamatorias como se define en las reivindicaciones incluye uno o mas compuestos como se define en las reivindicaciones; un agente antiinflamatorio y un vehfculo farmaceuticamente aceptable, en la que el agente antiinflamatorio se selecciona del grupo constituido por: un analgesico, un agente antirreumatico, un agente gastrointestinal, una preparacion para la gota, glucocorticoides, preparacion oftalmica, agente respiratorio, una preparacion nasal y un agente de membrana mucosa.
Preferentemente, el analgesico se selecciona del grupo constituido por: naproxeno, indometacina, ibuprofeno, trometamina ketorolaco, trisalicilato de colina magnesio y rofecoxib; el agente antirreumatico se selecciona del grupo constituido por: ciclosporina, sulfasalazina, valdecoxib, penicilamina y dexametasona; el agente gastrointestinal se selecciona del grupo constituido por: mesalamina, balsalazida disodica y olsalazina sodica; la preparacion para la gota es sulindac; el glucocorticoide se selecciona del grupo constituido por: dexametasona, dexametasona fosfato, acetato de metilprednisolona, hidrocortisona e hidrocortisona sodica fosfato; la preparacion nasal se selecciona del grupo constituido por dipropionato de beclometasona monohidrato, propionato de fluticasona, triamcinolona acetonido, flunisolida, furoato de mometasona monohidrato y budesonida; la preparacion oftalmica es trometamina ketorolaco; el agente respiratorio es nedocromilo sodico; y el agente de membrana mucosa se selecciona del grupo constituido por: dipropionato de alclometasona, butirato de hidrocortisona, flurandrenolida, valerato de betametasona y propionato de clobetasol.
En otra realizacion preferida, la composicion farmaceutica comprende meisofndigo y/o NATURA. Tfpicamente, el vehfculo farmaceuticamente aceptable es un diluyente inerte.
Adicionalmente, en otra realizacion mas, los compuestos, como se define en las reivindicaciones, estan en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad de tipo inflamatorio mediante la inhibicion de la expresion de citocinas proinflamatorias y/o mediante la estimulacion de la expresion de citocinas antiinflamatorias. En esta realizacion, el agente antiinflamatorio adicional mencionado anteriormente no se requiere en la composicion para que sea eficaz, pero es ventajoso.
Las composiciones farmaceuticas pueden tomar diversas formas adaptadas a la via de administracion elegida como se ha tratado anteriormente. Los expertos en la tecnica reconoceran diversas metodologfas sinteticas que se pueden usar para preparar composiciones farmaceuticamente aceptables no toxicas de los compuestos descritas en el presente documento. Los expertos en la tecnica reconoceran una amplia variedad de disolventes farmaceuticamente aceptables no toxicos que se pueden usar para preparar solvatos de los compuestos de la invencion, tales como agua, etanol, aceite mineral, aceite vegetal y dimetilsulfoxido.
Las composiciones se pueden administrar por via oral, topica, parenteral, mediante inhalacion o pulverizacion o rectal en formulaciones monodosis que contienen vehfculos, adyuvantes y transportadores no toxicos farmaceuticamente aceptables convencionales. Tambien se entiende que el mejor procedimiento de administracion puede ser una combinacion de procedimientos. La administracion oral en forma de una pfldora, capsula, elixir, jarabe, pastilla, trocisco o similares es particularmente preferida. El termino “parenteral”, como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutaneas, intradermicas, intravasculares (p. ej., intravenosa) intramusculares, espinales, inyeccion intratecal o inyecciones similares o tecnicas de infusion.
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Las composiciones farmaceuticas estan, preferentemente, en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsiones, capsulas duras o blandas, jarabes o elixires.
Las composiciones destinadas a uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la tecnica para fabricar composiciones farmaceuticas y dichas composiciones pueden contener uno o mas agentes seleccionados del grupo constituido por edulcorantes, aromatizantes, colorantes y consevantes con el fin de proporcionar preparaciones farmaceuticamente refinadas y agradables al gusto. Los comprimidos pueden comprender el principio activo mezclado con excipientes farmaceuticamente aceptables no toxicos, que son adecuados para fabricar comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulacion y disgregantes, por ejemplo almidon de mafz, o acido algfnico; aglutinantes, por ejemplo almidon, gelatina o goma arabiga, y lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, acido estearico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse mediante tecnicas que se conoce que retrasan la disgregacion y absorcion en el tracto gastrointestinal y, de este modo, proporcionan una accion sostenida durante un periodo de tiempo largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retraso de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formulaciones de uso oral se pueden presentar como capsulas de gelatina dura en las que el principio activo esta mezclado con un diluyente solido inerte, Por ejemplo carbonato calcico, fosfato calcico o caolfn, o como capsulas de gelatina blanda en las que el principio activo esta mezclado con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina lfquida o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosa. Dichos excipientes son agentes de suspension, por ejemplo carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sodico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arabiga; los dispersantes o humectantes pueden ser una fosfatida natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensacion de un oxido de alquileno con acidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensacion de oxido de etileno con alcoholes alifaticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilen-oxicetanol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y anhfdridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitano. Las suspensiones acuosas pueden tambien contener uno o mas conservantes, por ejemplo etilo, o p-hidroxi-benzoato de n-propilo, uno o mas agentes colorantes, uno o mas agentes aromatizantes y uno o mas edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sesamo, aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina lfquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetflico. Se pueden anadir edulcorantes, tales como los que se han indicado con anterioridad, y agentes edulcorantes para proporcionar preparaciones orales agradables al gusto. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adicion de un antioxidante tal como acido ascorbico.
Polvos y granulos dispersables adecuados para la preparacion de una suspension acuosa mediante la adicion de agua proporcionan el principio activo en mezcla con un dispersante o humectante, agente de suspension y uno o mas conservantes. Ejemplos de dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspension son como los que ya se han mencionado en lo que antecede. Tambien pueden estar presentes excipientes, por ejemplo edulcorantes, aromatizantes y conservantes adicionales.
Las composiciones farmaceuticas pueden tambien estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo parafina lfquida o mezclas de estos. Emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma arabiga o goma tragacanto, fosfatidas naturales, por ejemplo soja, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de acidos grasos y hexitol; anhfdridos, tales como monooleato de sorbitan; y productos de condensacion de estos esteres parciales con oxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitan. Las emulsiones puede tambien contener edulcorantes y aromatizantes.
Los jarabes y elixires se pueden formular con edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones pueden tambien contener un demulcente, un conservante y agentes aromatizantes y colorantes. Las composiciones farmaceuticas pueden estar en forma de una solucion acuosa u oleaginosa inyectable esteril. Esta suspension se puede formular de acuerdo con la tecnica conocida usando dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspension que se han mencionado anteriormente. La preparacion inyectable esteril tambien puede ser una solucion o suspension inyectable esteril en un diluyente o disolvente no toxico parenteralmente aceptable, por ejemplo en forma de una solucion en 1,3-butanodiol. Entre los vehfculos y disolventes aceptables que se pueden emplear estan agua, solucion de Ringer y solucion isotonica de cloruro sodico. Ademas, convencionalmente se emplean aceites fijos esteriles en forma de un disolvente o un medio de suspension. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo suave incluyendo mono- o digliceridos sinteticos.
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Ademas, pueden usarse aceites grasos tales como acido oleico en la preparacion de sustancias inyectables.
La composicion tambien se puede administrar en forma de supositorios, por ejemplo para administracion rectal del farmaco. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el farmaco con un excipiente no irritante adecuado que sea solido a las temperaturas habituales pero lfquido a la temperatura rectal y que por lo tanto se funda en el recto liberando el farmaco. Dichos materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.
Como alternativa, las composiciones se pueden administrar por via parenteral en un medio esteril. El farmaco, dependiendo del vehfculo y la concentracion usada, puede suspenderse o disolverse en el vehfculo. De forma ventajosa, los adyuvantes tales como anestesicos locales, conservantes y agentes tampon se pueden disolver en el vehfculo.
Para la administracion a animales no humanos, la composicion que contiene el compuesto terapeutico se puede anadir al alimento o al agua de la bebida del animal. Asimismo, sera conveniente formular productos de alimento y de agua de bebida para animales de forma que el animal tome una cantidad adecuada del compuesto en su dieta. Tambien sera conveniente presentar el compuesto en una composicion como premezcla para la adicion al alimento o al agua de bebida. La composicion tambien se puede anadir como suplemento alimenticio o de bebida para seres humanos.
Los niveles de dosis del orden de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 250 mg por kilogramo de peso corporal al dfa y, mas preferentemente, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 150 mg por kilogramo de peso corporal al dfa, son utiles en el tratamiento de las afecciones indicadas anteriormente. La cantidad de principio activo que se puede combinar con los materiales vehiculantes para producir una forma farmaceutica unitaria variara en funcion de la afeccion que se este tratando y el modo de administracion concreto. Las formas farmaceuticas unitarias generalmente contendran entre de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg de principio activo. La dosificacion preferentemente sera al menos tres veces menos para tratar enfermedades inflamatorias mediante la modulacion de citocinas que para tratar trastornos de proliferacion inhibiendo la CDK. Por ejemplo, una dosis de meisofndigo para tratar la LMC es, generalmente, de aproximadamente 125 mg al dfa, mientras que la dosis de meisofndigo para tratar la EII normalmente es de 25 mg al dfa. Esto se debe a la cantidad significativamente menor necesaria para la regulacion de citocinas por esta clase de moleculas que se requiere para regular las CDK.
La frecuencia de la dosis tambien puede variar en funcion del compuesto usado y la enfermedad concreta tratada. No obstante, para el tratamiento de la mayorfa de los trastornos se prefiere una pauta de dosificacion de 4 veces al dfa o menos. Se entendera, sin embargo, que el nivel de dosis especffico para cualquier paciente particular dependera de una variedad de factores, que incluyen la actividad del compuesto especffico empleado, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el momento de administracion, la via de administracion y la tasa de excrecion, la combinacion de farmacos y la gravedad de la afeccion particular que se somete a tratamiento.
Los compuestos, como se define en las reivindicaciones, tendran propiedades farmacologicas deseables que incluyen, entre otras, la biodisponibilidad oral, la toxicidad baja, la baja union de las protefnas sericas y las semividas in vitro e in vivo deseables. La penetracion de la barrera hematoencefalica para los compuestos usados para tratar trastornos del SNC es necesaria, mientras a menudo se prefieren niveles cerebrales bajos de los compuestos usados para tratar los trastornos perifericos.
Se pueden usar ensayos para predecir estas propiedades farmacologicas deseables. Los ensayos usados para predecir la biodisponibilidad incluyen el transporte a traves de las monocapas de celulas intestinales humanas, incluyendo monocapas de celulas Caco-2. Se puede usar la toxicidad para hepatocitos cultivados para predecir la toxicidad del compuesto. La penetracion de la barrera hematoencefalica de un compuesto en seres humanos se puede predecir a partir de los niveles cerebrales de animales de laboratorio que reciben el compuesto por via intravenosa.
La union de las protefnas sericas se puede predecir en los ensayos de union a albumina. Dicho ensayos se describen en una recapitulacion de Oravcova, y col. (Journal of Chromatography B (1996) volumen 677, paginas 127).
La semivida del compuesto es inversamente proporcional a la frecuencia de dosis de un compuesto. Las semividas In vitro de los compuestos se pueden predecir a partir de ensayos de semivida microsomica como describen Kuhnz y Gieschen (Drug Metabolism and Disposition, (1998) volumen 26, paginas 1120-1127).
La cantidad de la composicion requerida para usar en el tratamiento variara no solo con el compuesto concreto seleccionado sino tambien con la via de administracion, la naturaleza de la afeccion que se este tratando y la edad y la afeccion del paciente y, en ultima instancia, sera a discrecion del medico o clfnico responsable.
Indicaciones terapeuticas del meisofndigo y otros derivados como se definen en las reivindicaciones adjuntas de isofndigo, indigo e indirrubina:
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
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En los ultimos 10 anos, el desarrollo de inhibidores de TNF-a y otras citocinas ha sido una de las areas mas activas del desarrollo de farmacos para el tratamiento de varias enfermedades de tipo inflamatorio. Aunque periodos cortos de resultados clfnicos de la aplicacion de dichos inhibidores especfficos para el tratamiento de varias enfermedades de tipo inflamatorio son positivos e incluso emocionantes y el futuro desarrollo de tratamientos anti-TNF-a y anti- citocinas sera, en general, interesante (34), la eficacia a largo plazo de estos tratamientos se ha complicado por el hecho de que en el proceso patologico de las enfermedades de tipo inflamatorio no solo participa una sola ruta sino un complicado sistema de redes de citocinas.
Las citocinas proinflamatorias han participado en una amplia gama de procesos inflamatorios patologicos, como tambien lo ha hecho la expresion reducida de citocinas antiinflamatorias.
La Figura 1 muestra la representacion esquematica de procesos patologicos en enfermedades de tipo inflamatorio humanas que implican a varias citocinas y factores de crecimiento que proporcionan una representacion esquematica de citocinas pro/antiinflamatorias y factores de crecimiento, y sitios de accion de derivados como se definen en las reivindicaciones adjuntas, tales como meisofndigo en el proceso patologico de las enfermedades de tipo inflamatorio. La estimulacion patologica de la inflamacion desencadena celulas respondedoras inflamatorias (linfocitos, monocitos, neutrofilos, celulas endoteliales, macrofagos tisulares y mastocitos) para liberar citocinas proinflamatorias y factores de crecimiento. A su vez, estas citocinas proinflamatorias y factores de crecimiento conducen a la salida de las celulas inmunitarias, neutrofilos y monocitos sangufneos del suministro de sangre y su posterior acumulacion en los sitios de inflamacion. En consecuencia, estos causan diversas enfermedades de tipo inflamatorio y/o trastornos autoinmunitarios. Estas enfermedades incluyen enfermedad intestinal inflamatoria (EII), psoriasis, artritis reumatoide, neurodegeneracion y otras. El meisofndigo, a concentraciones bajas (p. ej., 30 nM) inhibe la produccion de multiples citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-1p, IL-6, and TNF-a, y estimula la citocina antiinflamatoria IL-10.
En la Tabla 1 se resume la implicacion de varias citocinas en el proceso patologico de los trastornos autoinmunitarios. Aunque en los tejidos/organos de enfermedades autoinmunologicas se han encontrado incrementos significativos de varias citocinas proinflamatorias, algunas citocinas reguladoras estan moderadamente elevadas para equilibrar las citocinas proinflamatorias sobreactivadas. Tambien se cree que los trastornos autoinmunitarios se deben a un desequilibrio entre las citocinas proinflamatorias y las reguladoras (48).
Las observaciones de los inventores muestran que el meisofndigo regula por disminucion la secrecion/expresion de varias citocinas proinflamatorias. TNF-a, IL-1 e IL-6 y regula por aumento las citocinas antiinflamatorias IL-10. La expresion “consecuencias de la liberacion de citocinas proinflamatorias y factores de crecimiento" hace referencia al epidermotropismo de los linfocitos T, la induccion de la hiperproliferacion de K6/16, macrofagos de revestimiento, infiltracion de neutrofilos y linfocitos T activados, incremento y activacion de mastocitos, induccion de ICAM-1 y MHC de clase II, angiogenesis, cambio en la permeabilidad vascular, apoptosis, danos cerebrales y del sistema nervioso central, regulacion de la proliferacion de celulas sinoviales, degradacion del cartflago y resorcion osea.
Tabla 1. Lista de citocinas y factores de crecimiento implicados en el proceso patologico de varios trastornos
inflamatorios
Citocinas proinflamatorias
Citocinas reguladoras Quimiocinas Factores de crecimiento
TNF-a
IL -4 IL -8 FGF
LT
IL -10 Groa PDGF
LIF
IL-11 MIP-1 VEGF
Oncostatina M
W-13 MCP-1 GM-CSF
W15
ENA-78 M-CSF
IFNc1a/p
RANTES TGF-p
IFNy
IL-1a, p
IL-2
IL-3
IL-6
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(continuacion)
Citocinas proinflamatorias
Citocinas reguladoras Quimiocinas Factores de crecimiento
IL-9
IL-12
IL-17
IL-18
Enfermedad intestinal inflamatoria (EII): La EII comprende la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), que son 2 enfermedades de tipo inflamatorio cronicas solapantes del tracto gastrointestinal causadas por la alteracion de la regulacion del sistema inmunitario (20). Los pacientes con EII tienen una funcion de barrera epitelial intestinal defectuosa, lo que permite la colonizacion bacteriana del epitelio. Como resultado, los productos bacterianos y citocinas proinflamatorias (TNF-a, IL-1 e IL-6) producen estimulacion inflamatoria persistente. Los antfgenos bacterianos se introducen en el sistema inmunitario mediante celulas dendrfticas mucosas y macrofagos. En respuesta, los fagocitos intestinales (principalmente monocitos y neutrofilos) proliferan e incrementan la expresion y la secrecion de citocinas proinflamatorias. Como los inhibidores del crecimiento celular y los inductores de la diferenciacion celular demostrados en la patente anterior de los inventores, el meisofndigo y derivados del isofndigo, indigo e indirubina inhibiran de forma eficaz la proliferacion sobreactiva de las celulas inflamatorias al tiempo que suprimiran su expresion/secrecion de las citocinas proinflamatorias como se demuestra en los Ejemplos 1 a 4. Esta conclusion se ha confirmado en modelos animales, asi como en un paciente con EII, como se muestra en los Ejemplos 7-8.
Psoriasis: Las citocinas son mensajeros intercelulares que tienen un papel importante en el desarrollo y mantenimiento de la inflamacion cutanea. Se ha notificado que una serie de citocinas desempenan papeles cruciales en la patogenia de trastornos cutaneos inflamatorios. IL-1, TNF-a e IFN-y inducen la expresion de ICAM-1 y el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II (48, 49). IL-1, TNF-a y el factor de estimulacion de colonias de granulocitos-macrofagos son capaces de inducir la activacion, maduracion y migracion de celulas dendrfticas y la IL-2 activa los mastocitos (50). IL-6 y TGF-a potencian la proliferacion de queratinocitos. IL-1, TNF-a, TGF-a y VEGF inducen angiogenesis y atraen las celulas inflamatorias (51-53). La primacia de las citocinas en la produccion de respuestas inmunitarias cutaneas las convierten en una diana muy atractiva para nuevos modificadores de la respuesta biologica (18). Por tanto, como reguladores de multiples citocinas, las moleculas pequenas reivindicadas en la presente invencion, el meisofndigo y derivados del isofndigo, indigo e indirubina seran eficaces contra la psoriasis. Como se muestra en el Ejemplo 6, los inventores han demostrado en un modelo de roedores que el meisofndigo era verdaderamente eficaz de un modo dependiente de la dosis contra la psoriasis y el efecto fue mejor que el control positivo MTX.
Artritis reumatoide (AR): El papel de la red de citocinas en la inflamacion y la destruccion articular en la AR se ha investigado extensamente en los ultimos anos. Ademas del TNF-a, la IL-1 desempena una funcion central en la patogenia y las manifestaciones clfnicas de la AR (54). La capacidad de la IL-1 para dirigir la inflamacion y la erosion articular y para inhibir los procesos de reparacion de tejidos se ha establecido claramente en sistemas in vitro y en modelos animales y se ha conseguido aliviar los sfntomas de inflamacion en pacientes de AR mediante el bloqueo de la IL-1 (55). La IL-6 es una citocina multifuncional que regula la respuesta inmunitaria, la hematopoyesis, la respuesta de fase aguda y la inflamacion. La alteracion de la regulacion de la produccion de IL-6 esta implicada en la patologfa de varias enfermedades, incluyendo la AR. Un abordaje terapeutico para bloquear la senal de la IL-6 se ha llevado a cabo usando anticuerpo anti-IL-6R humanizado para la AR entre otras enfermedades (11, 56). La IL-10 es una citocina antiinflamatoria. Se ha demostrado que la expresion de IL-10 previene la artritis o mejora la enfermedad en modelos animales (57, 58). Aunque es obvio que citocinas tales como TNF-a, IL-1, IL-6 y IL-10 tienen papeles independientes, actuan juntas participando en determinados procesos patofisiologicos en la Ar. El hallazgo de una clase de moleculas descritas en la presente invencion, que son capaces de modular estas diferentes citocinas, tendra como resultado un espectacular progreso terapeutico en el tratamiento de la AR.
Esclerosis multiple (EM): La EM es un trastorno inflamatorio autoinmune. Aunque la causa de que el cuerpo ataque a su propia mielina en pacientes con EM sigue sin estar clara, las citocinas de regulacion alterada estan claramente implicadas en el proceso de la enfermedad. Usando la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo ampliamente usado para los estudios de EM basado en similitudes autoinmunes, histopatologicas, geneticas y clfnicas, se ha demostrado que en el estado claramente activo, tanto la EAE como la eM se caracterizan por la presencia de infiltrados inflamatorios perivasculares diseminados en el SNC, un proceso en el que las citocinas quimioatrayentes (quimiocinas) desempenan un papel importante. Existen pruebas de que la expresion de quimiocinas (miembros de la familia de la IL-8) durante la inflamacion autoinmune del SMC esta regulada por algunas citocinas proinflamatorias, tales como el TNF (59). Los papeles de otras citocinas pro/antiinflamatorias tales como IL-1 p, IL-6 e IL-10 tambien se confirmaron en modelos animales de EAE ((60-62) asi como en seres humanos
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(63). La IL-1p esta presente en lesiones de EM. El antagonista de los receptores de IL-1 (IL-1Ra) modera la induccion de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). Se ha observado un incremento del riesgo de EM en individuos con altos niveles de IL-1 (3 sobre la produccion IL- IRa y una elevada proporcion de la produccion de TNF sobre IL-10 (63).
Trastornos neurodegenerativos: La enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (PK) son los 2 trastornos neurodegenerativos mas frecuentes relacionados con neuroinflamacion. La neuroinflamacion es una caracterfstica del tejido afectado patologicamente en varios trastornos neurodegenerativos. Estos cambios se observan particularmente en areas del cerebro afectadas de casos de EA (64). El papel de las citocinas se ha implicado en la patogenia de la EA, aunque el mecanismo por el cual las citocinas contribuyen a la patogenia no se entiende completamente. En la EA, las microglias, especialmente las asociadas con depositos de amiloide, tienen un fenotipo que es consistente con un estado de activacion, incluyendo inmunorreactividad con anticuerpos frente a antigenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II y frente a las citocinas inflamatorias IL-1 p y TNF-a (65). Una de las caracteristicas neuropatologicas principales de la EA es el deposito en el cerebro de placas seniles que estan compuestas principalmente de peptidos beta amiloide toxicos (Abeta) que se generan a partir de una familia de Abeta que contiene las proteinas precursoras (AbetaPP). Se ha demostrado que las citocinas estimulan la expresion de la transcripcion de AbetaPP (66). El analisis del linaje genetico de los loci que controlan la edad de inicio en la EA y la EP revelo una asociacion significativa entre la eA y la glutation-S-transferasa, genes omega 1 y 2 (GSTO1, GSTO2) (7). La funcion de GSTO1 parece relacionada con el procesamiento postraduccional de la citocina proinflamatoria IL-1 p (67).
Inflamacion relacionada con consecuencias de radioterapia: Las enfermedades inflamatorias relacionadas con los danos producidos por la radiacion en el recto y el colon sigmoideo son complicaciones de lo mas frecuente con la radioterapia para cancer de la region pelvica, entre los que se incluyen los canceres de cuello uterino, utero, prostata, vejiga urinaria y testiculos. La proctosigmoiditis por radiacion es la forma clinicamente evidente mas frecuente de danos colonicos tras radiacion pelvica con una incidencia del 5% al 20%. Normalmente, los pacientes exhiben sintomas de tenesmo, hemorragia, diarrea de volumen bajo y dolor rectal. Rara vez se pueden desarrollar obstruccion de grado bajo o tractos fistulosos en los organos adyacentes.
El mecanismo de la radioterapia es a traves de sus danos al ADN en las celulas en proliferacion activa. Los danos patologicos tras la radioterapia localizada en el intestino/colon se pueden dividir en fases agudas y cronicas. Los cambios patologicos iniciales incluyen una perdida de linfocitos en la lamina propia y danos microscopicos en las celulas epiteliales de la mucosa y las celulas endoteliales vasculares. Estos cambios se manifiestan como un aplanamiento de las vellosidades y una disminucion de las celulas regenerativas de las criptas, seguido de un marcado edema submucoso con incremento de la permeabilidad vascular.
La endarteritis progresiva parece ser el principal mecanismo por el cual se producen los efectos cronicos que despues se manifiestan como fibrosis progresiva que conduce a atrofia mucosa, formacion de estenosis y trombosis, lo que causa danos isquemicos secundarios. La colitis por radiacion en la fase cronica demuestra una distorsion muy significativa de las criptas, telangiectasia vascular y fibrosis de la lamina propia. Es interesante el hecho de que algunos de estos cambios patologicos tambien estan presentes en la EII de larga duracion (68).
Por tanto, las citocinas pueden desempenar un papel entre varias enfermedades gastrointestinales en las que la inflamacion exhiben una parte significativa. Los estudios recientes se han centrado en el papel crucial de las citocinas en la EII cronica (69-74). Para aclarar el papel de las citocinas en la proctitis por radiacion, Indaram y col. (75) examinaron los niveles de citocinas en la mucosa colonica en pacientes con proctitis por radiacion y compararon estos valores con los obtenidos de controles normales y pacientes con EII. Hallaron que los niveles en la mucosa de IL-2, IL-6, and IL-8 eran significativamente mas altos y estadisticamente significativos (p < 0,05) tanto en la mucosa enferma (5,62 ± 0,13, 1,60 ± 0,31, 21,45 ± 4,03 pg/mg) como en la de aspecto normal (3,83 ± 0,78, 1,36 ± 0,34, 13,45 ± 3,18 pg/mg) en el grupo de proctitis por radiacion en comparacion con los de los controles normales (1,74 ± 0,23, 0,67 ± 0,05, 4,99 ± 1,39 pg/mg).
Por tanto, estos hallazgos demuestran una activacion similar de las citocinas en pacientes con proctitis por radiacion y EII. En los pacientes de proctitis por radiacion se demostro que los niveles de IL-2, IL-6 e iL-8 en la mucosa era significativamente mayor en comparacion con los controles normales. En comparacion, los pacientes de EII (CU y EC) demostraron niveles significativamente mayores de las citocinas, incluyendo IL-1, IL-2, IL-6 e IL-8 en comparacion con los controles normales.
La similitud en la expresion de citocinas en la mucosa en estas 2 enfermedades se relaciona de forma plausible directamente con la naturaleza de inflamacion intensa de las enfermedades. Se ha postulado que esta similitud en la activacion de citocinas en estas 2 enfermedades se puede traducir en los cambios patologicos similares observados en la EII cronica y la proctitis por radiacion. Esta hipotesis esta avalada por el hecho de que el tratamiento medico de la proctitis por radiacion, aunque bastante insatisfactorio, incluye tratamiento con diversos derivados de acido aminosalicilico y corticosteroides administrados por via oral o topica. Estas opciones de tratamiento son identicas para la gestion de la EII.
Como se demuestra en la presente invencion, el meisofndigo y su clase de moleculas pequenas como se define en
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las reivindicaciones adjuntas son capaces de regular por disminucion la IL-1p, la IL-6 y el TNF-a, y la regulacion por aumento de la citocina reguladora IL-10; cabe esperar una eficacia elevada y efectos secundarios bajos para este tratamiento.
Otras enfermedades relacionadas con la alteracion de la regulacion de las citocinas: Las enfermedades cardiovasculares (ECV), la aterosclerosis y las enfermedades metabolicas (el sfndrome metabolico) tambien se han ligado a una secrecion/expresion inadecuada de las citocinas pro/antiinflamatorias (10, 12-14, 76).
Diabetes: Un defecto fundamental en la diabetes de tipo II es la resistencia a la insulina, por la cual la insulina no suprime la produccion de glucosa en el hfgado ni estimula el consumo por tejidos perifericos, lo que da como resultado hiperglucemia. Las celulas p pancreaticas responden a un exceso de glucosa en plasma secretando mas insulina para superar los efectos de la resistencia a la insulina. A medida que progresa la resistencia a la insulina y las celulas p ya no pueden cumplir el requisito de incrementar la cantidad de insulina, los niveles de glucosa en plasma aumentan y se desarrolla diabetes de tipo II.
Muchos factores pueden contribuir al inicio de la diabetes de tipo II. Dado que el 80% de los pacientes con diabetes de tipo II son obesos y la obesidad siempre se asocia con la resistencia a la insulina, se han realizado investigaciones extensas sobre los mediadores moleculares que ligan la obesidad a la resistencia a la insulina. Se han identificado diversos factores como causas contribuyentes de la resistencia a la insulina en la obesidad y la diabetes de tipo II relacionada con la obesidad, principalmente los producidos por el tejido adiposo, AGL (acidos grasos libres), TNFa, IL-6, leptina, adiponectina y resistina. Los niveles de ARNm y de protemas de TNFa estan muy aumentados en los tejidos adiposos de animales obesos (77) y sujetos humanos (78). Todos los tipos diferentes de celulas en el tejido adiposo pueden producir citocinas. Los adipocitos expresan receptores de TNFa y son tambien la fuente principal del TNFa, que se piensa que funciona predominantemente de un modo autocrino/paracrino en el tejido adiposo.
La exposicion a largo plazo de celulas cultivadas (79) o animales (80) a TNFa induce resistencia a la insulina, mientras que la neutralizacion de TNFa aumenta la sensibilidad a la insulina y reduce la hiperglucemia en un modelo animal de diabetes de tipo II (81). La ausencia de TNFa o de receptores de TNFa por inactivacion genica mejora significativamente la sensibilidad a la insulina en modelos animales de obesidad (82).
Se han propuesto mecanismos para la resistencia a la insulina inducida por TNFa en adipocitos, asf como sistemicamente (83). El TNFa inhibe la fosforilacion del receptor de la insulina y el sustrato 1 del receptor de la insulina (IRS-1) a traves del inhibidor kB quinasa -p (IKK-p). La activacion de NF-kB por el TNF a es obligatoria para la represion de los genes abundantes en adipocitos esenciales para la funcion de los adipocitos y tambien es suficiente para inhibir la transcripcion genica mediada por PPAR-gamma. Asimismo, el TNFa estimula la lipolisis y otra expresion de citocinas en el tejido adiposo y desencadena la liberacion de AGL. De hecho, los niveles de FFV aumentan antes de una hiperglucemia franca en algunos modelos animales de resistencia a la insulina (83). Existen extensas pruebas que implican al exceso de AGL en plasma en la induccion y progresion de la resistencia sistemica a la insulina. En hepatocitos, los AGL contribuyen a un exceso de glucosa y produccion de VLDL. En celulas musculares, niveles altos de AGL alteran la senalizacion de la insulina y estimulan la oxidacion de AGL que conducen a una disminucion considerable de la oxidacion de la glucosa.
Los farmacos de sensibilizacion a la insulina disponibles en la actualidad, que pertenecen al agonista de PPAR- gamma, inhiben el perfil de expresion genica de los adipocitos inducido por TNFa a traves de la ruta de NF-kB (84). Como el TNFa derivado de adipocitos funciona como factor autocrino o paracrino, la liberacion sistemica de anticuerpos frente a TNFa puede no ser eficaz en el bloqueo de la actividad biologica del TNFa expresado localmente en el tejido adiposo (85). NATURA, que representa un nuevo tipo de inhibidor del TNFa de molecula pequena a traves de una simple difusion, podna, por tanto, ser un agente eficaz para bloquear la funcion de TNFa expresado localmente y potencialmente util en el tratamiento de la diabetes de tipo 2.
La diabetes mellitus de tipo I es una enfermedad autoinmune caracterizada por infiltracion de celulas mononucleares en los islotes de Langerhans y la destruccion selectiva de las celulas beta productoras de insulina. Aunque los linfocitos T CD8 + pueden ser iniciadores importantes, los linfocitos T CD4 + (86) y los macrofagos (87, 88) son los principales efectores celulares del proceso inmunitario que conduce a la muerte de las celulas beta. Los macrofagos activados secretan directamente IL-1beta, IL-6, IL-12, TNF-alfa, indirectamente desencadenan la produccion de IFN- gamma de los linfocitos T activados. La implicacion de las citocinas como TNF-alfa, IFN-gamma, IL-1beta, IL-6 e IL- 10, en la patogenia de la diabetes de tipo 1 se ha aclarado bien a traves de estudios de correlacion de la expresion de citocinas y el desarrollo de la diabetes de tipo 1, estudios de aumento de niveles de citocinas y estudios de deficiencia de citocinas (89). Ademas de los anticuerpos neutralizantes de citocinas y los receptores solubles de citocinas, los compuestos antiinflamatorios tambien muestran los efectos de retrasar o prevenir el inicio de la diabetes de tipo 1 en modelos animales.
La patogenia de la diabetes, desde la insulitis a la destruccion completa de las celulas beta, es un proceso relativamente cronico. El meisofndigo, NATURA y otros derivados como se definen en las reivindicaciones adjuntas inhiben las citocinas proinflamatorias y estimulan las citocinas antiinflamatorias y, por tanto, se pueden usar como agentes para prevenir o retrasar el inicio de la enfermedad, asf como para tratarla.
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En resumen, la alteracion de la regulacion de las citocinas esta implicada en diversas enfermedades, incluyendo enfermedades de tipo inflamatorio y las que normalmente no se consideran enfermedades de tipo inflamatorio. Una molecula que es capaz de modular las citocinas pro y antiinflamatorias deberfa proporcionar beneficios terapeuticos con efectos secundarios mfnimos para todos los tipos de enfermedades relacionadas con la alteracion de la funcion de estos componentes de la inflamacion. Como se demuestra en la presente invencion, la naturaleza del meisofndigo, una molecula pequena representativa de los derivados, como se definen en las reivindicaciones adjuntas, de isofndigo, indigo e indirrubina, sobre la regulacion de la expresion/secrecion de multiples citocinas pro/antiinflamatorias permite usar con eficacia los compuestos tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas para tratar trastornos de tipo inflamatorio asociados con la expresion de citocinas proinflamatorias como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1: El meisofndigo reduce la secrecion de IL-P en celulas THP-1 de la linea celular monocftica humana
Materiales y procedimientos
Materiales: El meisofndigo y NATURA fueron sintetizados por Natrogen Therapeutics, Inc, se purificaron mediante cromatografia de liquidos de alto rendimiento (HPLC) con una pureza del 98,5% y sus estructuras confirmadas mediante espectrometria de masas y resonancia magnetica nuclear (RMN).
El meisofndigo es un cristal rojizo oscuro con un peso molecular de 376. Se preparo en una solucion de sulfoxido de dimetilo (DMSO) y se almaceno a -20°C para los experimentos in vitro. La linea celular de monocitos humanos THP- 1 (90= se adquirio de la ATCC. Las celulas se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se cultivaron aproximadamente 1x105 celulas/ml a 37°C, 5% de CO2 durante 24 horas en medio RPMI-1640 modificado (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS.
Procedimientos: Las celulas se estimularon con o sin lipopolisacarido 1 pM (LPS, Sigma) y se expusieron durante 24 horas a diferentes concentraciones de meisofndigo (de 31,25 nM a 16.000 nM). La viabilidad de las celulas se examino al microscopio tras tincion con azul de tripano. Los niveles proteicos de IL-1p secretada en los medios de cultivo por las celulas se midieron despues mediante ELISA y se calcularon a partir de su curva estandar usando un kit de ensayo de R&D Systems de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el proveedor. El procedimiento se establecio y se valido mediante una buena curva estandar obtenida. En la Fig. 2, panel A, se muestra un ejemplo de la curva estandar.
Analisis estadistico: Todos los datos se expresaron como la media ± SD. La significacion estadfstica de cualquier diferencia entre los grupos control (LPS) y experimental se determino mediante la prueba t de Student. Los valores p entre los 2 grupos deben ser al menos inferiores a 0,05 para que se consideren estadfsticamente significativos.
Resultados y discusion
La IL-1p es una citocina proinflamatoria pleiotropica implicada en el proceso patologico de varias enfermedades de tipo inflamatorio. Para aclarar la actividad del meisofndigo, una molecula pequena representativa de los derivados de indigo, isofndigo e indirubina, contra la inflamacion, los inventores analizaron la actividad del meisofndigo sobre la secrecion de IL-1p en celulas THP-1 monocfticas humanas. Como se muestra en la Fig. 2, panel B, se encontro que el nivel basal de IL-1 p en las celulas THP-1 monocfticas humanas era indetectable. Anteriormente se ha demostrado que los incrementos en los niveles de la protefna IL-1 p y del ARNm en respuesta al lipopolisacarido (LPS) son principalmente el resultado de un incremento de la transcripcion del gen (91, 92). En la presente invencion, los inventores tambien observaron que tras la estimulacion de lPs, las celulas THP-1 secretaban una gran cantidad de IL-1 p en el medio (92,38 ± 3,667 pg/ml, Fig. 2, panel B). Es interesante el hecho de que la secrecion estimulada de IL-p se inhibfa significativamente mediante exposicion simultanea de las celulas a meisomdigo. Lo mas importante, los inventores encontraron que el meisofndigo era un potente, aunque tambien moderado, inhibidor de IL-1 p.
Esta caracterfstica sera una ventaja para los pacientes por la elevada eficacia con menos efectos secundarios cuando se usa para el tratamiento de trastornos inflamatorios. Potente porque una reduccion superior al 50% de la secrecion de IL-1 p mediada por LPS se consiguio repetidamente cuando las celulas se expusieron a meisofndigo a concentraciones tan bajas como de 31,25 nM; moderado porque el incremento de la concentracion de meisofndigo hasta 8 pM no tuvo como resultado una reduccion adicional de la secrecion, lo que es indicativo de que la actividad alcanzada era maxima. Esto es diferente del efecto del meisofndigo o NATURA sobre la inhibicion de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) en el que se necesita una concentracion mucho mas alta para la inhibicion del 50% de la actividad de CDK (aproximadamente 1,6 pM) en celulas de cancer de prostata LNCaP como se demuestra en la patente previa de los inventores.
El ultimo punto es significativo, ya que el documento anterior EP 1 079 826 solo expuso la inhibicion de CDK, en lugar de citocinas. Como resultado, en la presente invencion se usan concentraciones mucho menores de medicamentos en comparacion con la tecnica anterior. Adicionalmente, derivados concretos tambien pueden ser mas adecuados para la inhibicion de citocinas en comparacion con la inhibicion de CDK.
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Ejemplo 2: El meisofndigo inhibe la secrecion y la expresion de IL-6 en celulas THP-1 de la linea celular monocftica humana
Materiales y procedimientos
Materiales: Se uso el derivado representativo de meisofndigo. La linea celular y el procedimiento de ELISA fueron los mismos que se describen en el Ejemplo 1. La protefna IL-6 estandar se uso para establecer una curva estandar para el calculo de IL-6 en el medio secretado por las celulas (celulas estimuladas con LPS o no estimuladas en presencia o ausencia de meisofndigo). En la Fig. 3, panel A, se muestra una curva estandar tfpica. El analisis estadfstico tambien siguio el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
Procedimientos:
PCR en tiempo real: El efecto del meisofndigo sobre la transcripcion de la IL-6 (niveles de ARN) se determino mediante una tecnica de la reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real). El ARN total se extrajo usando un kit mini Qiagen Rneasy y el gen HPRT se uso como control interno.
Las celulas THP-1 monocfticas humanas en fase de crecimiento exponencial se expusieron a 1 pg/ml de LPS, meisofndigo 1 pM o 1 pg/ml de LPS mas meisofndigo 1 pM durante 24 horas. Despues se recogieron las celulas, se lavaron y se extrajo el ARN total para el ensayo de PCR en tiempo real. El ARN total (300 ng) se trato con DNasa I (Promega, Madison, WI) y se usaron SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) y oligo(dT) para la transcripcion inversa de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron en un volumen de 25-pl que contenfa ADNc diluido, mezcla maestra para PCR Sybr Green (Applied Biosystems) y una concentracion 2,5 pM de cada cebador especffico del gen de la IL-6: I: 5'- TCAATTCGtTcTGAAGAGG (SeC ID N°
1) y D: 5'- CCCCCAGGAGAAGATTCC (SEC ID N° 2). Se uso un analizador ABI SDS7700 (Applied Biosystems) a 50°C durante 2 minutos y a 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Los resultados de ADNc del ensayo se normalizaron a un control interno de HPRT medido en la misma placa. Despues de los ciclos, la especificidad de la amplificacion se valido mediante la generacion de una curva de fusion mediante desnaturalizacion lenta de los productos de PCR y despues mediante electroforesis en gel.
Resultados y discusion
La IL-6 es otra citocina proinflamatoria implicada en la inflamacion. Por tanto, se investigo el efecto del meisofndigo sobre la secrecion/expresion. De un modo similar a IL-1p, el nivel basal de IL-6 fue indetectable en las celulas THP-1 monocfticas humanas. Tras la estimulacion con 1 pg/ml de LPS, las celulas secretaron moderadamente IL-6 al medio (33,64 ± 3,29 pg/ml). Se encontro que el meisofndigo inhibfa fuertemente la secrecion de IL-6 en las celulas THP-1 estimuladas con LPS. Aproximadamente El 85% de la reduccion de la secrecion se observo cuando las celulas estimuladas se expusieron a meisofndigo a la concentracion mas baja de 31,25 nM del experimento (P < 0,001) (Fig. 3, panel B).
Para explorar si la reduccion de la secrecion de IL-6 mediada por meisofndigo se debfa a su inhibicion sobre la expresion de IL-6 estimulada por IL-6, se aplico una PCR en tiempo real para medir el efecto del meisofndigo sobre la transcripcion de ARNm de IL-6. Como se muestra en la Fig. 3, panel C, se observo una induccion significativa de la transcripcion de la IL-6 cuando las celulas THP-1 se expusieron a 1 pg/ml de LPS, que es consistente con los informes anteriores (93). Es interesante el hecho de que la transcripcion de la IL-6 inducida por LPS pudo suprimirse completamente exponiendo las celulas THP-1 estimuladas por LPS a una concentracion 1 pM de meisofndigo (P < 0,001). Por tanto, este hallazgo indica que la inhibicion del meisofndigo sobre la secrecion estimulada por LPS de IL- 6 probablemente sea el resultado de la supresion del agente sobre la produccion de IL-6 mediada por IL-6 en celulas THP-1.
La estimulacion de LPS sobre los monocitos humanos activa las rutas de senalizacion de la transcripcion de la IL-6. El LPS se puede unir a una protefna denominada protefna de union a LPS (LBP). Se ha demostrado que tras su transferencia mediante la LBP al receptor de CD14, el LSP interacciono con el receptor de la senalizacion TLR4 y la protefna auxiliar MD-2. Esta interaccion tuvo como resultado la activacion de NF-kB y 3 MAP quinasas, de modo que se incrementa la transcripcion de IL-6 (94, 95). Si la supresion del meisofndigo sobre la transcripcion de IL-6 mediada por LPS se debe a la interrupcion de las vfas de transduccion de senal o no se tiene que investigar posteriormente.
Ejemplo 3: El meisofndigo suprime la secrecion de TNF-a en celulas THP-1 monocfticas humanas
Materiales y procedimientos
Se uso el derivado representativo de meisofndigo. La linea celular y el procedimiento de ELISA para medir la secrecion de TNF-a fueron los mismos que se describen en el Ejemplo 1, a excepcion de que se uso la protema de TNF-a estandar para establecer una curva estandar para el calculo de la protefna secretada en el medio por las celulas (celulas estimuladas con LPS o no estimuladas en presencia o ausencia de meisofndigo). En la Fig. 4, panel A, se muestra una curva estandar tfpica.
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El efecto del meisofndigo sobre la transcripcion de TNF-a (niveles de ARN) se determino mediante una tecnica de PCR en tiempo real usando los mismos procedimientos descritos en el Ejemplo 2, a excepcion de que los cebadores especfficos del TNF-a se usaron del siguiente modo: 5'-TGCCCAG-ACTCGGCAAAG (sEc ID N° 3) y 5'GGAGAAGGGTGACCGACT (SEC ID N° 4). El ARN total se extrajo usando un kit mini Qiagen Rneasy y el gen HPRT se uso como control interno.
Celulas THP-1 monocfticas humanas en crecimiento exponencial se expusieron a 0,1 pg/ml de LPS, meisofndigo 4 pM o 1 pg/ml de LPS mas meisofndigo 4 pM durante 24 horas. Despues se recogieron las celulas, se lavaron y se extrajo el ARN total para el ensayo de PCR en tiempo real, como se escribe en el Ejemplo 2.
Resultados y discusion
El TNF-a es una citocina proinflamatoria crucial investigada extensamente durante la ultima decada debido a sus importantes funciones biologicas contra el cancer y a su papel patologico en los trastornos inflamatorios. Se han comercializado varios inhibidores del TNF-a para el tratamiento de varias enfermedades de tipo inflamatorio. Como potencial agente antiinflamatorio, los inventores exploraron un papel del meisofndigo en la regulacion del TNF-a en la presente invencion.
Como sistema de modelo establecido, la estimulacion de las celulas THP-1 con LPS tuvo como resultado una enorme secrecion de TNF-a (Fig. 4, panel B). No obstante, el meisomdigo inhibio con eficacia la secrecion de TNF -a en las celulas THP-1 estimuladas con LPS de un modo dependiente de la concentracion (Fig. 4, panel B). Aproximadamente una reduccion del 50% de la secrecion se alcanzo cuando las celulas estimuladas se expusieron a meisofndigo 2,0 pM durante 24 horas (P < 0,001, en comparacion con LPS mas meisofndigo con LPS solo) a la cual no se observaron celulas apoptoticas usando tincion con azul de tripano. El incremento de la concentracion de meisofndigo hasta 8 pM no produjo mas reduccion de la secrecion de TNF-a aunque no se observaron celulas muertas. No obstante, se obtuvo una inhibicion completa cuando las celulas estimuladas se trataron con meisofndigo 16 pM, concentracion a la cual solo aparecio aproximadamente un 20% de celulas apoptoticas.
Los ensayos de PCR en tiempo real no mostraron efectos del meisofndigo (4 pM) sobre los niveles de ARNm de TNF-a (Fig. 4, panel C), lo que indica que la reduccion de la produccion de TNF-a en celulas THP-1 estimuladas con LPS mediante meisofndigo se produce a nivel postranscripcional. Esta bien establecido que los elementos ricos en AU (ARE) en la 3' UTR del ARNm del TNF-a estan implicados en la estabilidad del ARNm y la eficiencia de la traduccion (96). El ARE de TNF-a es una diana del factor estabilizante del ARNm HuR (97). La maduracion del ARNm de TNF-a se ve afectada por un elemento cis (2-APRE) en la 3'UTR, que hace el corte y empalme de los transcritos precursores de TNF-a dependientes de la activacion de la protema quinasa activada por ARN (PKR) (98).
Aunque los mecanismos por los cuales el meisofndigo inhibe la secrecion de TNF-a en celulas THP-1 estimuladas por LPS tienen que establecerse, el meisofndigo es una nueva molecula pequena que inhibe el TNF-a sin citotoxicidades, lo que lo convertirfa en un medicamento ideal para el tratamiento de enfermedades de tipo inflamatorio, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 4: El meisofndigo estimula la secrecion de IL-10 en celulas THP-1 monocfticas humanas
Materiales y procedimientos
El meisofndigo y la lfnea celular THP-1 usada en este ejemplo fueron las mismas que se describen en el Ejemplo 1. Los procedimientos de ELISA para medir la secrecion de IL-10 tambien siguieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 1, a excepcion de que se uso la protefna IL-10 estandar para establecer la curva estandar (Fig. 5, panel A) para el calculo de la protefna secretada en el medio por las celulas (celulas estimuladas con LPS o no estimuladas en presencia o ausencia de meisofndigo).
Resultados y discusion
El funcionamiento del sistema inmunologico esta finamente ajustado por las actividades de los mediadores o citocinas proinflamatorios y reguladores y las enfermedades de tipo inflamatorio se han considerado un resultado del desequilibrio entre estos tipos de moleculas (41, 46). Para entender si los efectos antiinflamatorios de las moleculas pequenas reivindicadas en la presente invencion son capaces de inducir citocinas reguladoras se investigo el efecto del meisofndigo en la secrecion de IL-10. Como se muestra en la Fig. 5, panel B, se observo una moderada aunque significativa estimulacion de la secrecion de IL-10 en las celulas THP-1. Se consiguio un incremento de aproximadamente el 60% en la secrecion de IL-10 cuando las celulas THP-1 se trataron con meisofndigo 0,0625 pM (P < 0,05). Por el contrario, como estimulante de la inflamacion, el LPS disminuyo ligeramente la secrecion de citocinas.
Ejemplo 5: El meisofndigo y sus derivados a concentraciones bajas seleccionan citocinas en lugar de CDK como dianas moleculares primarias
Materiales y procedimientos
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Materiales: El meisofndigo y NATURA se sintetizaron en Natrogen Therapeutics, Inc, como se ha descrito en los ejemplos anteriores.
La lfnea celular de monocitos humanos THP-1 (90= se adquirio de la ATCC. Las celulas se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se cultivaron aproximadamente 1x105 celulas/ml a 37°C, 5% de CO2 durante 24 horas en medio RPMI-1640 modificado (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS.
Procedimientos:
1) Efectos de meisofndigo y NATURA sobre la expresion/secrecion de las citocinas IL-1p, IL-6, IL-10: se estimularon celulas THP-1 monocfticas humanas con crecimiento exponencial con o sin lipopolisacarido 1 pM (LPS, Sigma) y se expusieron durante 24 horas a diferentes concentraciones de meisofndigo y NARURA (de 31,25 nM a 62,5 nM), respectivamente. La viabilidad de las celulas se analizo con ensayo de excepcion con azul de tripano. Los niveles proteicos de IL-1p secretada en los medios de cultivo por las celulas se midieron despues mediante ELISA y se calcularon a partir de su curva estandar usando un kit de ensayo de R&D Systems de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el proveedor, como se describe en los ejemplos 1 a 4.
2) Efectos de meisofndigo y/o NATURA sobre la actividad de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) en celulas THP-1 (99): se expusieron celulas THP-1 de crecimiento exponencial a meisofndigo o NATURA 31,25, 62,5 y 1500 nM durante 24 horas, respectivamente. Se recogieron las celulas, se lavaron y se extrajeron las protefnas totales como se ha descrito anteriormente (100). Cien pg de las protefnas se inmunoprecipitaron usando anticuerpos contra cdk2, cdk4/6 o ciclina D1 durante la noche a 4°C en presencia de un coctel de inhibidores de la proteasa. Los inmunoprecipitados se lavaron 4 veces con tampon de extraccion de protefnas y una vez con tampon de ensayo de la quinasa y se hicieron reaccionar con 75 pg/ml de histona H1 en presencia de [y-32P]-ATP (10 pCi/10 pM). La histona H1 fosforilada (representa actividad cdk) se midio mediante recuento por centelleo o mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (101, 102).
3) Analisis estadfstico: Todos los datos se expresaron como la media ± SD. La significacion estadfstica de cualquier diferencia entre los grupos control (LPS) y experimental se determino mediante la prueba t de Student. Los valores p entre los 2 grupos deben ser como mfnimo inferiores a 0,05 para que se consideren estadfsticamente significativos.
Resultados y discusion
Dado que se ha demostrado que la indirrubicina y sus derivados inhibfan las quinasas dependientes de ciclina, podrfa, por tanto, ser un tratamiento eficaz de las enfermedades asociadas con la perdida de control de la proliferacion mediante la inhibicion de CK. Para examinar que moleculas celulares son las dianas primarias relacionadas con las propiedades antiinflamatorias de esta clase de compuestos, los inventores compararon como el meisofndigo y NATURA modulaban las actividades de las CDK y las citocinas en las mismas condiciones de concentracion baja experimentales.
Como se muestra en la Fig. 6, similar a la observacion mostrada en los Ejemplos 1, 2 y 4, los incrementos estimulados por LPS de la produccion de IL-1 p e IL-6 se inhibieron significativamente mediante la exposicion de las celulas a meisofndigo y NATURA a concentraciones tan bajas como de 31,25 nM, mientras que la supresion mediada por LPS de IL-10 en las celulas THP-1 se multiplico casi por 2 veces mediante meisofndigo y NATURA [[n]] a concentraciones similares (Fig. 6A).
Por el contrario, con las mismas exposiciones, tanto meisofndigo como NATURA no pudieron inhibir las actividades de las quinasas 2, 4 y 6 dependientes de ciclina, asf como los niveles de la ciclina D1 (datos no mostrados). Una inhibicion parcial (23%) de dichos compuestos solo se consiguio cuando las celulas se trataron con una concentracion 1,5 pM (48 veces mayor) de meisofndigo o NATURA (Fig. 6B).
Ademas, el efecto de NATURA sobre la glucogeno sintasa quinasa-3p (GSK-3p) tambien se investigo en la presente invencion, ya que los inhibidores de CDK normalmente tambien son inhibidores de GSK-3[beta]. No obstante, no se observo actividad cuando las celulas se expusieron a NATURA a una concentracion tan alta como de 50 mM (datos no mostrados)
Por tanto, los datos en este ejemplo muestran claramente que el meisofndigo y una clase relacionada de moleculas es capaz de modular significativamente varias citocinas (inhiben las citocinas proinflamatorias y estimulan las citocinas antiinflamatorias) a una concentracion considerablemente baja, donde no se consiguen efectos inhibidores de la actividad CDK. Esto demuestra que a concentraciones bajas comparadas con las necesarias para la inhibicion de CDK, el meisofndigo y sus derivados estan dirigidos, principalmente, a citocinas en lugar de a quinasas dependientes de ciclinas. Esta conclusion esta respaldada por la reciente observacion de que la indirrubina y sus derivados no son inhibidores de la CDK verdaderamente biologicos, ya que la inhibicion de CDK por dichos compuestos se produce a traves de agregacion ffsica en lugar de mediante reaccion biologica. Ademas, la conclusion de los inventores tambien esta respaldada por las observaciones clfnicas de que se necesita una dosis total de 8696 mg de meisofndigo para alcanzar la remision maxima de la leucemia mieloide cronica (LMC) (104), mientras que solo se necesitan 525 mg del farmaco para obtener una cura completa de la enfermedad intestinal
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inflamatoria.
Resumen
Las celulas THP-1 secretaron IL-1p, IL-6, IL-8 y TNF-a, pero no IL-2, IL-4, IL-10 e IL-12 tras 24 horas de estimulacion de LPS, mientras que los niveles basales de estas citocinas eran indetectables mediante ELISA, lo que es coherente con los informes anteriores ( 93, 105). Para evaluar las potenciales aplicaciones clfnicas de una clase de moleculas pequenas de derivado de isofndigo, indigo e indirubina (Estructuras mostradas como las formulas I y II) en el tratamiento de varias enfermedades de tipo inflamatorio, los inventores examinaron los efectos reguladores del meisoindigo, como ejemplos sobre la secrecion y expresion de las citocinas pro y antiinflamatorias en un modelo de celulas THP-1 monocfticas humanas. Los datos estan resumidos en la tabla 2. El meisoindigo inhibio significativamente las secreciones de las citocinas proinflamatorias IL-1p, IL-6 y TNF-a en celulas THP-1 estimuladas por LPS y estimularon la secrecion de la citocina IL-10 reguladora pero no se observaron efectos sobre la IL-2 simplemente porque no se pudo estimular a las celulas para secretar estas citocinas proinflamatorias. Las reducciones o estimulaciones maximas de las secreciones de estas citocinas estan resumidas en la Tabla 2.
Tabla 2. Modulacion del meisoindigo sobre la secrecion de citocinas proinflamatorias y reguladoras en celulas THP-1
estimuladas con LPS
Tratamiento
Porcentaje de respuesta maxima sin citotoxicidad
TNF-a (inhibicion)
IL-1 p (Inhibicion) IL-6 (inhibicion) IL-10 (estimulacion)
LPS
100,00 ± 4,85 100,00 ± 3,43 100,00 ± 9,78 -18,27 ± 10,15
LPS/Meisofndigo
49,20 ± 3,37 48,76 ± 3,68 83,51 ± 5,41 201,97 ± 11,2
La reduccion de la secrecion de IL-6 mediante meisoindigo en celulas THP-1 estimuladas con LPS puede ser un resultado de la regulacion por disminucion de la transcripcion del gen de citocinas usando una tecnica de PCR en tiempo real. El ensayo de PCR en tiempo real tambien mostro una inhibicion moderada de meisoindigo sobre IL-15 en celulas THP-1 estimuladas con LPS (datos no mostrados). No se observo dicha regulacion por disminucion para el gen del TNF-a usando la misma tecnologfa. Aunque los mecanismos por los cuales el meisomdigo y las moleculas de esta clase regulan las citocinas pro y antiinflamatorias tienen que investigarse adicionalmente, los datos de los inventores en la presente invencion demuestran que esta clase de moleculas pequenas es capaz de modular citocinas importantes relacionadas con varias enfermedades de tipo inflamatorio.
Durante los ultimos anos, se han creado estrategias dirigidas a las citocinas proinflamatorias con diversos agentes basados en protefnas para el tratamiento de varios trastornos inflamatorios, incluyendo los inhibidores del TNF-a etanercept (EnBREL ®), infliximan (REMICADE ®; Centocor), adalimumab (HUMIRA ®; Abbott) y el antagonista del receptor de la IL-1 KINERET ®. Las primeras etapas de aplicacion clfnica de estos agentes indicaron que estos revolucionarios agentes terapeuticos han supuesto un avance en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como EII, AR y psoriasis. No obstante, las actuales terapias a base de protefnas inyectables tienen riesgos asociados, incluida la posibilidad de incremento de las neoplasias malignas, infecciones e incremento de la insuficiencia congestiva cardfaca (42). Ademas, estas estrategias tambien tienen limitaciones y se ven dificultadas por la sofisticada red de citocinas. Aunque se ha demostrado que varios tipos de moleculas pequenas son un inhibidor especffico de citocinas proinflamatorias, tales como inhibidores de TNF-a y NF-kB y tienen varias ventajas sobre los agentes basados en protefna, dirigido a una unica citocina proinflamatoria pueden no ser bastante fuertes para interrumpir las vfas patologicas inflamatorias, lo que limita su eficacia clfnica.
Por el contrario, ademas de todas las ventajas de las moleculas pequenas en aplicaciones clfnicas, como el hecho de que son faciles de fabricar y comodas de administrar, lo mas importante es que las moleculas reivindicadas en la invencion no solo suprimen de forma concurrente varias citocinas proinflamatorias, es decir IL-1 p, IL-6, and TNF-a, sino que tambien estimulan la citocina antiinflamatoria IL-.10. Ademas, en la patente anterior de los inventores se ha demostrado que estas moleculas inducen diferenciacion celular e inhiben la proliferacion celular a concentraciones mas altas. Por tanto, proporcionan una actividad clfnica mayor. Esta conclusion se ve respaldada por los excelentes resultados de eficacia conseguidos usando meisoindigo para el tratamiento de un paciente con EII sin efectos secundarios. Esta demostracion se proporciona en el Ejemplo 7 de la presente invencion.
Ejemplo 6: El meisoindigo potencia la diferenciacion de celulas epidermicas e inhibe la hiperplasia y la hiperqueratosis en roedores
Materiales y procedimientos
Materiales: El meisoindigo se sintetizo, purifico y su estructura se caracterizo en Natrogen Therapeutics, Inc. La pureza del compuesto fue del 98,5 %, como se describe en los ejemplos anteriores. Una suspension de meisoindigo se preparo recientemente en metilcelulosa sodica al 0,5% y se administro por via oral para las pruebas de animales
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descritas mas adelante. Otras sustancias qufmicas usadas en los siguientes experimentos se adquirieron en Sigma.
Ratones Kumming hembra sin patogenos de 12 semanas de edad con pesos corporales de 22 a 25 gramos se estabularon a razon de 5 por jaula y se les administro a voluntad agua corriente fresca y pienso para roedores comercial. Las estancias para animales se controlaron a 24 ± 2° C con una humedad relativa de 60 ± 5 % y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (07:00-19:00 h).
Procedimientos:
Efecto del meisoindigo sobre la diferenciacion de celulas epidermicas en colas de raton: Sesenta ratones Kunming hembra se dividieron aleatoriamente en 5 grupos, 20 en el grupo control y 10 en 4 grupos analizados con farmaco. El meisoindigo se preparo recientemente como una suspension en metilcelulosa sodica al 0,5%. El farmaco se administro por via oral a dosis de 50, 100, and 200 mg/kg, respectivamente, una vez al dfa durante 13 dfas. Se uso metotrexato (MTX) como control positivo a una dosis de 1 mg/kg, i.p. una vez cada 2 dfas, durante el mismo periodo de tiempo. Como control negativo se usaron el mismo volumen y vehfculo para la suspension de meisoindigo. Veinticuatro horas despues de la ultima administracion, se sacrifico a los animales y sus colas se cortaron a 1,5 cm de la base. Se prepararon portaobjetos para su analisis histologico como describieron originalmente Bosman y col., (106). Los portaobjetos se prepararon cortando las colas en secciones longitudinales y se tineron con hematoxilina y eosina (H y E). Despues, los portaobjetos se analizaron con un microscopio optico para evaluar el grado de ortoqueratosis (OQ) e hiperplasia epidermica. Lo ultimo se realizo midiendo la longitud horizontal de la capa granular completamente desarrollada, el estrato granuloso, dentro de una escala individual en relacion con su longitud total. La actividad del farmaco se definio mediante el incremento de las celulas escamosas positivas que contiene el estrato granuloso de la capa granular entre dos folfculos pilosos.
Efectos antimitoticos del meisoindigo sobre el epitelio vaginal de raton: Sesenta ratones Kunming hembra se dividieron aleatoriamente en 5 grupos, 20 en el grupo control y 10 en 4 grupos analizados con farmaco. Todos los ratones recibieron estrogenos a una dosis de 0,2 mg/animal durante 3 dfas para permitir que las celulas epiteliales vaginales se desarrollaran bajo la estimulacion de la hormona estrogeno. El meisoindigo se preparo recientemente como una suspension en de metilcelulosa sodica al 0, %. El farmaco se administro por via oral a dosis de 50, 100, and 200 mg/kg, respectivamente, una vez al dfa durante 3 dfas. Se uso metotrexato (MTX) como control positivo a una dosis de 1 mg/kg, i.p. una vez al dfa, durante el mismo periodo de tiempo. Como control negativo se usaron el mismo volumen y vehfculo para la suspension de meisoindigo. Una hora despues de la ultima administracion se administro a los animales colchicina i.p., 2 mg/kg, para detener las celulas en la fase M. Cinco horas despues, se sacrifico a los animales y los tejidos vaginales se fijaron en formalina al 10%, se incluyeron en parafina y se prepararon los portaobjetos. Los portaobjetos se tineron con H y E y al menos 500 celulas del fondo se examinaron al microscopio. Se calculo el fndice mitotico (porcentaje de celulas mitoticas).
Resultados y discusion
En este ejemplo se uso el modelo de cola de raton habitual para medir cuantitativamente si los compuestos reivindicados en la presente invencion pueden potenciar la diferenciacion de celulas epidermicas, disminuyendo de este modo la hiperplasia y la hiperqueratosis. Este modelo fue descrito originalmente por Jarrett A (107) y fue modificado por Bosman y col. (106), y en la actualidad esta siendo usado por otros (108-110).
El efecto del meisoindigo sobre la formacion de una capa granular en las celulas epiteliales escamosas de la cola del raton se muestra en la Tabla 3. Se observo un incremento significativo de la formacion de la capa granular en el epitelio de la cola de raton cuando los ratones recibieron meisoindigo durante 13 dfas de un modo dependiente de la dosis. El efecto terapeutico a las 3 dosis fue mejor que el del control positivo, en el que se administro a los ratones el farmaco clfnico disponible MTX para el tratamiento de la psoriasis.
Tabla 3. Efecto del meisoindigo sobre la formacion de la capa granular en las celulas epiteliales escamosas de colas
de ratones
Grupos
Dosis (mg/kg) N° de animal Escamas granulosas (X ± SD) Valor p
Control
N/A 20 14,81 ± 4,61
MTX
1,0 10 17,22 ± 4,92 < 0,05
Meisoindigo
50,0 10 22,37 ± 6,20 < 0,01
Meisoindigo
100,0 10 25,98 ± 4,12 < 0,001
Meisoindigo
200,0 10 31,30 ± 7,92 < 0,001
El MTX es un agente quimioterapeutico inmunosupresor que inhibe significativamente la mitosis celular. Para
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analizar si el meisofndigo potencia la diferenciacion de las celulas epidermicas, disminuyendo de este modo la hiperplasia y la hiperqueratosis mediante el mecanismo similar al del MTX, se investigo el efecto del meisofndigo sobre el fndice mitotico (IM) del epitelio vaginal de raton. Como se muestra en la Tabla 4, el tratamiento de los ratones con MTX durante 3 dfas tuvo como resultado una disminucion significativa del IM en comparacion con el control sin tratar (14,76 ± 4,29 de los grupos tratados con MTX frente a 20,04 ± 3,71 del control, P < 0,001). Por el contrario, como se muestra en la Tabla 4, no se produjeron efectos significativos del meisofndigo sobre el IM a dosis menores (50 y 100 mg/kg, P>0,05) en las mismas condiciones experimentales. Solo se observo una ligera disminucion del IM (16,06 ± 2,66 de los grupos tratados frente a 20,04 ± 3,71 del control, P < 0,05) a una dosis mayor (200 mg/kg).
Nuestros datos mostraron que el meisofndigo estimulaba significativamente la formacion de la capa granular en el epitelio de la cola de raton mientras que no se observo ningun efecto sobre el IM, lo que sugiere que el meisofndigo inducfa diferenciacion de las celulas epiteliales y estimulaba a las celulas epiteliales escamosas diferenciadas incompletamente a que madurasen. Esta observacion in vivo confirma ademas el informe anterior de los inventores en el que se indicaba que el meisofndigo podrfa inducir diferenciacion de celulas ML-1 in vitro (111).
Tabla 4. Efecto del meisofndigo sobre el fndice mitotico en epitelio vaginal estimulado con estrogenos de ratones
hembra
Grupos
Dosis (mg/kg) N° de animal Indice mitotico (X ± SD) Valor p
Control
N/A 20 20,04 ± 3,71
MTX
1,0 10 14,76 ± 4,29 < 0,001
Meisofndigo
50,0 10 20,01 ± 4,29 > 0,05
Meisofndigo
100,0 10 17,92 ± 4,75 > 0,05
Meisofndigo
200,0 10 16,06 ± 2,66 < 0,05
El modelo de cola de raton usado en este ejemplo es un modelo in vivo de uso habitual para evaluar el valor terapeutico de agentes para el tratamiento de la psoriasis. La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas y no se refiere al tratamiento de la psoriasis, no obstante, las observaciones anteriores de los inventores sugieren que las moleculas pequenas definidas en el presente documento son capaces de tratar la enfermedad de tipo inflamatorio psoriasis. Los mecanismos de la actividad anti-psoriasis de estas moleculas pequenas son diferentes del agente inmunosupresor y quimioterapeutico MTC, ya que no se observo un efecto directo del meisofndigo sobre la mitosis celular. En su lugar, la modulacion de la secrecion/expresion de varios tipos diferentes de citocinas demostrada en los ejemplos 1-4 en la presente invencion mas la capacidad de estas moleculas para inducir la diferenciacion celular es, probablemente, la base molecular de la accion anti-psoriasis.
Ejemplo 7: El meisofndigo suprime la colitis ulcerosa aguda inducida en ratones Balb/c
Materiales y procedimientos
Materiales: El meisofndigo se sintetizo, purifico y su estructura se caracterizo en Natrogen Therapeutics, Inc. como se describe en los ejemplos anteriores. Una suspension de meisofndigo se preparo recientemente en metilcelulosa sodica al 0,5% y se administro por via oral para las pruebas de animales descritas mas adelante. El DSS (sal de dextrano sulfato sodico, peso molecular: 36.000-44.000) se adquirio en ICN Biomedicals. Otras sustancias qufmicas usadas en los siguientes experimentos se adquirieron en Sigma.
Ratones Balb/c hembra sin patogenos de 12 semanas de edad con pesos corporales de 22 a 25 gramos se estabularon a razon de 5 por jaula y se les administro a voluntad agua corriente fresca y pienso para roedores comercial. Las estancias para animales se controlaron a 24 ± 2° C con una humedad relativa de 60 ± 5 % y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (07:00-19:00 h).
Induccion de colitis ulcerosa aguda. Colitis inducida por DSS en ratones Balb/c: La colitis se indujo con DSS en el agua de bebida (PM 36.000 - 50.000, ICN biochemicals) como se ha descrito anteriormente (112). En resumen, los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos compuestos por 10 ratones cada uno. En el grupo de control negativo (Grupo 1), se administro a los ratones agua corriente fresca a voluntad y pastillas de MF, cambiando por recientes dos veces a la semana, durante 7 dfas. En el grupo control positivo (grupo tratado con DSS o Grupo 2), se administro 5% de DSS en el agua corriente durante 7 dfas para inducir colitis y se alimento a los ratones con pastillas de MF. En el grupo tratado con DSS-Meisofndigo (grupo de ensayo o grupo 3), se administro a los ratones DSS al 5% en el agua de bebida y se les administro meisofndigo por via oral una vez al dfa a una dosis de 50 mg/kg durante 7 dfas consecutivos. Se registraron las indicaciones fecales de colitis diariamente, incluyendo el peso corporal y la naturaleza de las heces (sueltas y/o hemorragia o sangre oculta). Despues se sacrifico a los ratones.
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Se extrajeron tejidos de colon, se fijaron en formalina al 10 % /PBS y se incluyeron en parafina. Para minimizar los artefactos ffsicos, el colon extrafdo se coloco sobre un papel de filtro cualitativo grueso sin estirar. Despues, se expuso la parte interior del colon cortandolo longitudinalmente. Los portaobjetos se tineron con H y E y 3 tecnicos/anatomopatologos los analizaron histoqufmicamente de forma enmascarada.
Analisis estadfstico
Todos los datos se expresaron como la media ± SD. La significacion estadfstica de cualquier diferencia entre los grupos control y experimental se determino mediante la prueba t de Student con un valor p de al menos < 0,05.
Resultados y discusion
Todos los animales en el grupo control positivo manifestaron de forma gradual heces sueltas, sangre oculta y perdida de peso despues de beber DSS al 5% el dfa 4. En varios casos graves (7/10), la sangre macroscopica se adhirio al ano ademas de los sfntomas mencionados anteriormente. Aunque los procedimientos para inducir colitis ulcerosa en este experimento eran muy agresivos y los sfntomas que se produjeron eran muy agudos (manifestados en el plazo de 4 dfas), se observo sangre oculta en el grupo tratado con meisofndigo solo en el 40% (4/10) de los animales. Los otros sfntomas, como heces sueltas, tambien fueron menos graves que los del grupo control. No se observaron sfntomas de colitis en los animales del grupo control negativo (ratones normales), Fig. 7, panel A.
Los analisis histologicos mostraron que tejidos de todos los animales del grupo control positivo desarrollaron lesiones similares a colitis ulcerosa grave como se pone de manifiesto por una infiltracion celular inflamatoria, incluyendo leucocitos polimorfonucleares y multiples lesiones erosivas (puntuaciones 1-3). Tambien se observaron abscesos en las criptas y epitelio regenerado en la mucosa colonica (Fig. 7, panel B). Para evitar el juicio subjetivo, 3 tecnicos/anatomopatologos individuales contaron de forma cuantitativa y enmascarada los danos ulcerosos del colon en ratones de control positivo y de los grupos tratados con meisofndigo al microscopio. Se observo una reduccion del 55% de las ulceraciones en animales del grupo tratado con meisofndigo en comparacion con el grupo control positivo (2,89 ± 1,46 en el grupo tratado con meisofndigo frente a 6,38 ± 2,20 en el grupo control positivo). La Fig. 7, Panel C, muestra la pared colonica de un raton tratado con meisofndigo con colitis ulcerosa aguda inducida por DSS al 5%. La morfologfa es similar a la mostrada en el control normal (panel A), lo que indica que el meisofndigo es eficaz contra la colitis ulcerosa aguda inducida por DSS en ratones.
Ejemplo 8: El meisofndigo detuvo completamente la enfermedad inflamatoria idiopatica en un paciente
Paciente: Se diagnostico a una mujer de 43 anos de edad en un periodo de mas de cuatro anos un caso de protocolitis cronica activa con erosion y caracterfsticas sugestivas de enfermedad intestinal inflamatoria idiopatica. El primer diagnostico se realizo en la North Shore University Hospital Manhasset, Long Island, Nueva York en 1999 mediante colonoscopia. Los principales sfntomas incluyeron diarrea, heces sueltas y hemorragia, mientras que su estado de salud global se considero excelente. Se determino que el fndice de actividad clfnica (Tabla 5) (113) estaba entre 7 y 8. Su medico le prescribio espuma de hidrocortisona, que se administro durante 10 dfas de acuerdo con las instrucciones del medico. No obstante, no se obtuvo un efecto terapeutico con este agente. En febrero de 2000, volvio a su casa en China y varias veces visito a los medicos chinos y probo varias hierbas medicinales chinas sugeridas, pero no se observo un efecto terapeutico. A principios de 2002, acudio a un hospital medico chino muy conocido y respectado en Beijing, donde se le realizo una sigmoidoscopia flexible. De nuevo se le diagnostico enfermedad intestinal inflamatoria activa.
Tabla 5. Indice de actividad clfnica para la evaluacion de pacientes con colitis ulcerosa (113)
Sfntoma
Puntuacion estandar Puntuacion del paciente
Antes del tratamiento
Despues del tratamiento
Diarrea (n° de heces diarias)
0-2
0
3 o 4
1
5 o 6
2 2 0
7-9
3
10 o mas
4
Diarrea nocturna
No
0 0 0
Sfntoma
Puntuacion estandar Puntuacion del paciente
Antes del tratamiento Despues del tratamiento
Si
1
Sangre visible en heces (% de movimientos)
0
0
< 50
1
>50
2 2 0
100
3
Incontinencia fecal
No
0
Si
1 1 0
Dolor o retortijones abdominales
Ninguno
0
Leves
1 1 0
Moderados
2
Intensos
3
Bienestar general
Perfecto
0
Muy bueno
1
Bueno
2 2 0
Normal
3
Malo
4
Terrible
5
Dolor en la palpacion abdominal
Ninguno
0
Leve y localizado
1
Leve o moderado y difuso
2 0 0
Intenso o de rebote
3
Necesidad de farmacos antidiarreicos
No
0 1 0
Si
1
Puntuacion maxima
21 9 0
En este momento, como los tratamientos previos no habfan tenido efectos, su medico le prescribio medicamentos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
tradicionales chinos. Se le administraron estos durante varios meses aunque no tuvo como resultado ninguna mejora de sus smtomas. Durante el periodo de febrero de 2000 al verano de 2002, tambien probo otros diversos medicamentos tradicionales chinos debido a la naturaleza constante y muy molesta de su enfermedad, pero nada tuvo exito. Despues de volver a EE.UU. en 2002, fue al Mount Sinai Medical Center, un centro americano reconocido nacionalmente para el tratamiento de la enfermedad intestinal inflamatoria. En octubre de 2001, su nuevo medico le realizo de nuevo una colonoscopia junto con un analisis histologico de dos muestras de biopsia (A y B) (Fig. 8, panel A, antes del tratamiento). Los analisis concluyeron que dos localizaciones (A y B) de la inflamacion eran “protocolitis cronica muy activa con erosion y caractensticas sugestivas de enfermedad intestinal inflamatoria idiopatica”. El medico prescribio CANASA® (mesalamina en forma de supositorio), un farmaco recientemente aprobado por la FDA y considerado el mejor farmaco disponible para su afeccion.
Despues de administrar CANASA® durante 7 dfas, sus smtomas paredan aliviarse; no obstante, al mismo tiempo se produjeron efectos secundarios significativos. Estos incluyeron picor cutaneo, retortijones abdominales, dolor y hemorragia. A continuacion solicito consejo a su medico y se le indico que usara esta medicacion de forma intermitente. No obstante, los efectos secundarios empeoraron realmente cada vez que se uso la medicacion. Por tanto, la paciente detuvo toda aplicacion de este medicamento.
Se sugirio el meisomdigo como posible tratamiento en base a los hallazgos de los inventores de que se podfan suprimir varias citocinas proinflamatorias y que se podfan estimular citocinas antiinflamatorias, tales como citocina IL-10. Dado que se notificaron efectos secundarios muy minoritarios a una dosis de 150 mg al dfa de este medicamento en China para el tratamiento de la leucemia mieloide cronica se sugirio el uso de meisomdigo.
El paciente administro voluntariamente meisomdigo a una dosis recomendada de 25 mg, una vez al dfa durante tres semanas de tratamiento programado. Despues de las primeras tres dosis, el paciente obtuvo una remision completa (tres dfas despues del tratamiento) y todos los smtomas inflamatorios desaparecieron. Esto tuvo como resultado una puntuacion cero usando el mdice de actividad clmica (Tabla 5). Despues de nueve semanas de remision (tres semanas con el medicamento, tres semanas sin el medicamento y tres semanas con el medicamento de nuevo), el paciente de nuevo visito a su medico y requirio una sigmoidoscopfa flexible para determinar si su remision era subjetiva u objetiva. La sigmoidoscopfa flexible se realizo el 4 de noviembre de 2003. Despues de revisar los resultados, su medico concluyo que su inflamacion se habfa detenido completamente. Los analisis anatomopatologicos confirmaron esta conclusion e indicaron que las muestras A y B eran ahora “protocolitis cronica inactiva que hace pensar en enfermedad intestinal inflamatoria idiopatica.” La Fig. 7 muestra la foto antes (panel A, octubre de 2002) y despues del tratamiento (panel B, 4 de noviembre de 2003) del mismo sitio de inflamacion en los analisis de colon realizados por el mismo medico.
Ejemplo 9: Efecto terapeutico del meisomdigo en la colitis ulcerosa cronica en ratones Balb/c
Se ha demostrado que el meisomdigo es un regulador de multiples citocinas IL-1p, IL-6, IL-10 y TNF-a, que se sabe que estan implicadas en los procesos patologicos y el mantenimiento de varias enfermedades inflamatorias. Asimismo, se ha demostrado que el meisomdigo es un agente citostatico que inhibe la proliferacion de las celulas en rapido crecimiento y estimula la diferenciacion y maduracion celular.
Los experimentos previos de los inventores demostraron que el meisomdigo tiene un efecto de cicatrizacion en la colitis ulcerosa agresiva aguda inducida por dextrano sulfato sodico (DSS) en ratones Balb/c. Estos resultados muestran que el meisomdigo es un agente eficaz contra varias enfermedades inflamatorias cronicas como se define en las reivindicaciones y la enfermedad intestinal inflamatoria (EII), que no se reivindica.
Para este experimento se uso un modelo de colitis ulcerosa cronica inducida por DSS para comprobar las dianas moleculares in vivo y evaluar la actividad del meisomdigo contra la EII.
Materiales y procedimientos
Materiales: El meisomdigo se sintetizo, purifico y se caracterizo su estructura en Natrogen Therapeutics, Inc. Se preparo recientemente una suspension de meisomdigo en metilcelulosa sodica al 0,5% y se almaceno a 4°C. La suspension farmacologica se administro por via oral para los ensayos animales descritos a continuacion. El acido 5- aminosalidlico (5-ASA) se adquirio en Sigma/ el DSS (sal de dextrano sulfato sodico, peso molecular: 36.00044.000) se adquirio en ICN Biomedicals. Otras sustancias qmmicas usadas en los siguientes experimentos se adquirieron en Sigma.
Ratones Balb/c sin patogenos de 12 semanas de edad con pesos corporales de 22 a 25 gramos se estabularon a razon de 5 por jaula y se les administro a voluntad agua corriente fresca y pienso para roedores comercial. Las estancias para animales se controlaron a 24 ± 2° C con una humedad relativa de 60 ± 5 % y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (07:00-19:00 h).
Procedimientos: Induccion de colitis ulcerosa cronica. Colitis inducida por DSS en ratones Balb/c: La colitis ulcerosa cronica se indujo con DSS en el agua de bebida (PM 36.000 - 44.000, ICN biochemicals) como se ha descrito anteriormente (4). En resumen, 60 ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos compuestos por 12 ratones cada uno. El grupo 1 se uso como control negativo (sin induccion de la enfermedad) y se administro agua corriente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
fresca a voluntad y las pastillas de alimentos se cambiaron por nuevas dos veces a la semana, desde el inicio al final del experimento. Los grupos 2-5 se usaron para inducir cronicamente la colitis ulcerosa y para analizar la actividad del meisofndigo. Los animales en los grupos 2-5 se alimentaron con normalidad asf como el grupo control negativo y tambien se les administro agua de bebida con 5 % de DSS (PM 36.000 - 44.000) durante 7 dfas, seguido de agua destilada durante 10 dfas despues. De nuevo se administro a los animales agua de bebida que contenfa 5% de DSS durante 7 dfas, seguido de agua destilada durante otros 10 dfas. Este procedimiento se repitio durante un total de 3 ciclos.
Despues de 3 ciclos se desarrollo colitis ulcerosa cronica y se estabilizo como se ha descrito. El grupo 2 (grupo control positivo) se alimento con solucion salina y el grupo 3 se trato con 5-ASA a 50mg/kg/d mediante sonda como control farmacologico positivo. Los grupos 4 y 5 se trataron con meisofndigo a dosis de 25 y 75 mg/kg, una vez al dfa durante 12 dfas.
Durante el periodo del experimento, un investigador independiente determino y registro a diario los indices de actividad de la enfermedad (IAE), reflejados mediante los pesos corporales, la consistencia de las heces y la aparicion de sangre oculta y sangre rectal visible, de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente [[114, 116]. Dichos parametros clfnicos son medidas funcionales exhaustivas similares a los sfntomas clfnicos subjetivos observados en la colitis ulcerosa (CU) humana y se correlacionan bien con el grado de cicatrizacion histologica medida como puntuaciones de las criptas [114-116]. Despues se sacrifico a los ratones. Se extrajeron tejidos/organos del bazo, el colon y otros, se examino el aspecto y se registraron sus pesos. Para minimizar los artefactos ffsicos, el colon extrafdo se coloco sobre un papel de filtro cualitativo grueso sin estirar. Se expuso la parte interior del colon cortandolo longitudinalmente. Todos los tejidos de colon se fijaron en formalina al 10 % /PBS, se incluyeron en parafina y se realizaron secciones para portaobjetos. Los portaobjetos se tineron con H y E para su analisis histologico. Los portaobjetos fueron analizaron de forma enmascarada por tecnicos/anatomopatologos y se fotografiaron. Las intensidades de la colitis ulcerosa se clasificaron en una escala de 0 - 3 y se expresaron como el fndice patologico de acuerdo con el sistema de puntuacion estandar. 0, normal; 1, infiltracion focal de celulas inflamatorias, incluyendo leucocitos polimorfonucleares; 2, infiltracion de celulas inflamatorias, atrofia glandular y abscesos en las criptas; 3, ulceracion de la mucosa. Los numeros de danos ulcerosos en los folfculos linfoides se contaron en las secciones longitudinales medicas del colon al microscopio optico.
Analisis estadistico
Todos los datos se expresaron como la media ± SD. La significacion estadfstica de cualquier diferencia entre los grupos control y experimental se determino mediante la prueba t de Student con un valor p de al menos < 0,05.
Resultados y discusion:
Indice de actividad de la enfermedad (IAE): Despues de beber DSS al 5% durante 7 dfas, todos los ratones manifestaron inicialmente diarrea y sangre oculta en sus heces con disminuciones significativas del peso corporal, aunque no se observaron dichos sfntomas en animales alimentados con agua destilada. No obstante, estos signos desaparecieron (el IAE alcanzo el nadir en 8 - 9 dfas) despues de administrar a los ratones agua destilada durante los siguientes 10 dfas. No obstante, en posteriores administraciones de DSS (3 ciclos de administracion), estos sfntomas clfnicos no se recuperaron sino que se deterioraron durante el periodo de consumo de agua destilada de 10 dfas.
Despues del tercer ciclo de alimentacion con DSS, se trato a los animales durante 12 dfas mediante sonda con vehfculo, 50 mg/kg/dfa de 5-ASA, 25 o 75 mg/kg/dfa de meisofndigo. Veinticuatro horas despues de la ultima administracion, se determinaron las puntuaciones del IAE para los cinco grupos. Como se muestra en la Tabla 6 mas adelante, despues de cesar la alimentacion con DSS durante 12 dfas, el IAE disminuyo en un 50% en el grupo tratado con vehfculo, lo que muy probablemente se debfa a autocuracion [111]. No obstante, la extension de la disminucion del IAE en los grupos tratados con 5-SA y dos grupos tratados con meisofndigo se potencio significativamente hasta un 70%, lo que refleja una respuesta terapeutica del tratamiento farmacologico. La eficacia del meisofndigo con ambas dosis fue igual a la del 5-ASA.
Tabla 6- Indice de actividad de la enfermedad (perdida de peso, consistencia de las heces y hemorragia/3)
Agente
Tratamiento previo Media ± SD Tratamiento posterior Media ± SD Recuperacion (%)
Solucion salina
Hembras (n = 5) 2,40 ± 0,2 1,07 ± 1,0
Machos (n = 6)
2,40 ± 0,2 1,33 ± 1,15
Media (n = 11)
2,40 ± 0,2 1,2 ± 1,2 50,6
Agente
Tratamiento previo Media ± SD Tratamiento posterior Media ± SD Recuperacion (%)
ASA 50 mg/kg
Hembras (n = 0) N/A N/A
Machos(n = 10)
3,27 ± 0,3 0,86 ± 1,0
Media (n = 10)
3,27 ± 0,3 0,86 ± 1,0 73,1 (p = 0,031)
Meisofndigo 25 mg/kg
Hembras (n = 5) 3,20 ± 0,2 0,67 ± 1,15
Machos (n = 7)
2,73 ± 0,35 0,93 ± 1,0
Media (n = 12)
3,00 ± 0,1 0,80 ± 1,06 73,3 (p = 0,023)
Meisofndigo 75 mg/kg
Hembras (n = 6) 3,11 ± 0,68 0,93 ± 1,0
Machos (n = 6)
3,27 ± 0,75 0,97 ± 1,0
Media (n = 12)
3,22 ± 0,71 0,95 ± 1,0 70,3 (p = 0,033)
Nada
Hembras (n = 6) 0 0 N/A
Machos (n = 6)
0 0 N/A
Media (n = 12)
0 0 N/A
Puntuaciones de sangre oculta:
La tabla 7 a continuacion muestra las puntuaciones de sangre oculta en todos los grupos de animales tratados o no 5 tratados. Doce dfas despues de detener la alimentacion con DSS, los animales del grupo tratados con vehfculo mostraron una ligera recuperacion (27,2 %), que fue consistente con la naturaleza cronica de colitis inducida por 3 ciclos consecutivos de alimentacion con DSS, como se ha indicado previamente [4]. Por el contrario, se observo una mejora significativa en los grupos tratados con 5-ASA y con meisofndigo. Los animales en el grupo de dosis baja de meisofndigo mostraron la mejor respuesta terapeutica (87%) en comparacion con 75,7 % en el grupo tratado con la 10 dosis alta. La dosis baja tambien fue mejor que el control positivo con 5-ASA con una recuperacion del 80%. La cicatrizacion con meisofndigo de la hemorragia en la EII inducida con DSS en animales tambien es coherente con una observacion previa de que el tratamiento con meisofndigo produjo una terminacion rapida de la hemorragia en un paciente con colitis ulcerosa.
Histologfa cualitativa:
15 Las secciones transversales (medias) de los colon de ratones se prepararon en formalina para su inclusion en parafina. Los portaobjetos se tineron con H y E. Dos ratones de cada grupo se usaron para preparar los portaobjetos y para el analisis de la calidad de la preparacion de portaobjetos y la tincion.
La histologfa de los animales tratados con vehfculo mostro perdida de epitelio superficial, perdida de glandulas y la presencia de inflamacion cronica. Los portaobjetos de los animales de los grupos tratados con meisofndigo son mas 20 similares a los grupos tratados con 5-ASA que mostraron menos erosion, infiltrados inflamatorios menos intensos en comparacion con los de los ratones con EII.
5
10
15
20
25
Tabla 7- Puntuacion de sangre oculta
Agente
Tratamiento previo Media ± SD Tratamiento posterior Media ± SD Recuperacion (%)
Solucion salina
Hembras (n = 5) 2,4 + 0,89 1,2 + 1,09 50
Machos (n = 6) 2,0 + 0 2,0 + 0 0
Media (n = 11) 2,2 + 0,6 1,6 + 0,8 27,2
ASA 50 mg/kg
Hembras (n = 0) N/A N/A N/A
Machos (n = 10) 3,0 + 1,05 0,6 + 0,96 80,0
Media (n = 10) 3,0 + 1,05 0,6 + 0,96 80,0 (p < 0,01)
Meisofndigo 25 mg/kg
Hembras (n = 5) 2,8 + 1,09 0,8 + 1,0 71,4
Machos (n = 7) 3,1 + 1,06 0 + 0 100
Media (n = 12) 3,0 + 1,04 0,4 + 0,77 86,7 (p < 0,01)
Meisofndigo 75 mg/kg
Hembras (n = 6) 3,3 + 1,03 0,6 + 1,0 81,8
Machos (n = 6) 3,6 + 0,81 1,0 + 1,0 72,2
Media (n = 12) 3,5 + 0,9 0,83 + 1,0 76,3 (p < 0,01)
Nada
Hembras (n = 6) 0 0 N/A
Machos (n = 6) 0 0 N/A
Media (n = 12) 0 0 N/A
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25
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35
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25
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Claims (15)

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    1. Una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad de tipo inflamatorio asociada con los niveles de expresion de citocinas, que comprende al menos un compuesto de formula (I) o formula (II)
    imagen1
    FORMULA (I)
    imagen2
    FORMULA (II)
    en las que R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 y R10 son iguales o diferentes y representan un atomo de hidrogeno; un grupo hidroxi; un grupo nitroso; un grupo nitro; un monosacarido; un disacarido; un atomo de halogeno; un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional insustituido o sustituido con uno o mas restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacaridos, disacaridos, aminas, amidas, tioles, sulfatos, sulfonatos, sulfonamidas o halogenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 atomos de carbono; un grupo -R11R12, en el que R11 y R12 pueden ser iguales o diferentes y representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene de 1 a 18 atomos de carbono que puede portar, adicionalmente, uno o mas grupos hidroxi y/o amino, un grupo arilo sustituido o insustituido que puede comprender uno o mas heteroatomos o un grupo acilo, o R11 y R12 forman juntos un anillo que tiene de 2 a 6 grupos CH2 opcionalmente sustituidos; un grupo azo -N=N-R13, en el que R13 representa un sistema aromatico que puede estar sustituido con uno o mas grupos carboxilo y/o grupos fosforilo o un grupo seleccionado del grupo que consiste en azucares, aminoacidos, peptidos u hormonas esteroides; o R1 y R6, y R2 y R7, respectivamente, forman, de forma independiente entre si, un anillo juntos que tiene de 1 a 4 grupos CH2 opcionalmente sustituidos; y
    R1 y R2 son iguales o diferentes y representan un atomo de hidrogeno; un atomo de halogeno; un grupo hidroxi; un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional insustituido o sustituido con uno o mas restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacaridos, disacaridos, aminas, amidas, tioles sulfatos, sulfonatos, sulfonamidas o halogenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 atomos de carbono; un grupo mono-, di- o trialquilsililo que tiene de 1 a 6 atomos de carbono independientemente uno de otro en cada caso en el grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada; un grupo mono-, di- o triarilsililo con grupos arilo sustituidos o insustituidos independientemente entre si en cada caso; un grupo -NR17R18, en el que R17 y R18 pueden ser iguales o diferentes y representan un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene de 1 a 18 atomos de carbono que puede portar adicionalmente uno o mas grupos hidroxi y/o amino, un grupo arilo sustituido o insustituido que puede comprender uno o mas heteroatomos, o un grupo acilo; un grupo metilenamino -CH2-NR17R18, en el que R17 y R18 tienen las definiciones anteriores; un residuo de aminoacido fisiologico unido al nitrogeno como una amida, monosacarido, disacaridos u oligosacaridos sustituidos o insustituidos; o un azucar, aminoacido, peptido u hormona esteroide;
    y en la que la enfermedad de tipo inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en: diabetes de tipo I; sfndrome de Sjogren; uveitis; conjuntivitis alergica; enfermedad celiaca y colitis no especifica.
  2. 2. Uso de al menos un compuesto como se define en la reivindicacion 1 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de tipo inflamatorio asociada con los niveles de expresion de citocinas en un animal,
    y en el que la enfermedad de tipo inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en: diabetes de tipo I; sfndrome de Sjogren; uveitis; conjuntivitis alergica; enfermedad celiaca y colitis no especifica.
  3. 3. Al menos un compuesto de Formula (I) o Formula (II) como se define en la reivindicacion 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad de tipo inflamatorio asociada con los niveles de expresion de citocinas en un animal,
    y en el que la enfermedad de tipo inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en: diabetes de tipo I; sfndrome de Sjogren; uveitis; conjuntivitis alergica; enfermedad celiaca y colitis no especifica.
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  4. 4. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 2, o el compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en los que al menos R1 o R2 es un monosacarido, un disacarido insustituido o sustituido con uno o mas restos hidroxi o restos carboxi; un halogeno; un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional insustituido o sustituido con uno o mas restos hidroxi, restos carboxi, restos nitroxi, monosacaridos, disacaridos, aminas, amidas, tioles, sulfatos, sulfonatos, sulfonamidas o halogenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 atomos de carbono.
  5. 5. La composicion para uso, o el uso, o el compuesto para uso, de acuerdo con la reivindicacion 4, en los que al menos R1 o R2 es un monosacarido triacetilado.
  6. 6. La composicion para uso, o el uso, o el compuesto para uso, de acuerdo con la reivindicacion 4, en los que al menos R1 o R2 es un grupo metilo.
  7. 7. La composicion para uso, o el uso, o el compuesto para uso, de acuerdo con la reivindicacion 6, en los que R1 o R2 es un monosacarido acetilado.
  8. 8. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 2, o el compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en los que el compuesto de formula (I) es meisofndigo o es glico-meisofndigo triacetilado o es NATURA.
  9. 9. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, que ademas comprende un agente antiinflamatorio.
  10. 10. El uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el medicamento comprende ademas un agente antiinflamatorio.
  11. 11. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que el compuesto se administra en combinacion con un agente antiinflamatorio.
  12. 12. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 9, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 10, o el compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en los que el agente antiinflamatorio se selecciona del grupo que consiste en: un analgesico, un agente antirreumatico, un agente gastrointestinal, una preparacion para la gota, glucocorticoides, preparacion oftalmica, agente respiratorio, una preparacion nasal y un agente de membrana mucosa.
  13. 13. La composicion para uso, o el uso, o el compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en los que el analgesico se selecciona del grupo que consiste en: naproxeno, indometacina, ibuprofeno, trometamina ketorolaco, trisalicilato de colina magnesio y rofecoxib; el agente antirreumatico se selecciona del grupo que consiste en: ciclosporina, sulfasalazina, valdecoxib, penicilamina y dexametasona; el agente gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en: mesalamina, balsalazida disodica y olsalazina sodica; la preparacion para la gota es sulindaco; el glucocorticoide se selecciona del grupo que consiste en: dexametasona, dexametasona fosfato, acetato de metilprednisolona, hidrocortisona e fosfato sodico de hidrocortisona; la preparacion nasal se selecciona del grupo que consiste en dipropionato de beclometasona monohidrato, propionato de fluticasona, triamcinolona acetonido, flunisolida, furoato de mometasona monohidrato y budesonida; la preparacion oftalmica es trometamina ketorolaco; el agente respiratorio es nedocromilo sodico; y el agente de membrana mucosa se selecciona del grupo que consiste en dipropionato de alclometasona, butirato de hidrocortisona, flurandrenolida, valerato de betametasona y propionato de clobetasol.
  14. 14. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 2, o el compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en los que el compuesto se administra a una concentracion suficiente para inhibir las citocinas IL-1 a, p, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, TNF-a, LT, LIF, oncostatina o IFNcIa, p, y.
  15. 15. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 2, o el compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en los que el compuesto se administra a una concentracion suficiente para estimular la expresion de las citocinas IL-4, IL-10, IL-11, W-13 o TGF p.
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