ES2560262T3 - Bacteriófago o proteína lítica derivados del bacteriófago que es eficaz para el tratamiento de la biopelícula de Staphylococcus aureus - Google Patents

Abstract

Una composicion para la eliminacion de la biopellcula formada por Staphylococcus aureus que contiene bacteriofago capaz de destruir Staphylococcus aureus especificamente y eficaz en la destruction de la biopellcula formada por Staphylococcus aureus como un ingrediente activo, en donde el bacteriofago es un bacteriofago del genera fagos de tipo T4 de la familia Myoviridae denominado bacteriofago SAP-1 y depositado en la Coleccion Coreana de Cultivos Tipo el 10 de Julio de 2007 bajo el Num. de Acceso: KCTC 11153BP o un bacteriofago del genera virus de tipo <p29 de la familia Podovihdae denominado bacteriofago SAP-2 y depositado en la Coleccion Coreana de Cultivos Tipo el 10 de Julio de 2007 bajo el Num. de Acceso: KCTC 11154BP.

Description

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Bacteriofago o proteina litica derivados del bacteriofago que es eficaz para el tratamiento de la biopelicula de Staphylococcus aureus

Campo tecnico

La presente invencion se refiere al uso de un bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago para la eliminacion (destruccion) de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus. La presente invencion tambien se refiere al uso de un bacteriofago o proteina litica derivada del mismo que son eficaces en la eliminacion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus para el tratamiento de una enfermedad causada por la Staphylococcus aureus formador de biopelicula. Por lo tanto, la presente invencion proporciona una composicion para la eliminacion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus que contiene un bacteriofago o proteina litica derivada del mismo como ingrediente activo y una composicion farmaceutica que contiene un bacteriofago o proteina litica derivada del mismo, asi como los antibioticos convencionales para mejorar la actividad antibacteriana de los antibioticos convencionales. La presente invencion proporciona un desinfectante, un limpiador medico y un purificador ambiental con el proposito de eliminar la biopelicula formada por Staphylococcus aureus y tambien proporciona un agente terapeutico y un agente antibacteriano para el tratamiento de enfermedades causadas por la infeccion por Staphylococcus aureus asociada con biopelicula.

Tecnica anterior

En una region infectada por bacterias, se encuentra una comunidad estructurada en la mucosa de celulas bacterianas encerradas en una matriz polimerica. Esta agregacion compleja de celulas bacterianas se denomina biopelicula o pelicula biologica (J Bacteriol 176: 2137-2142, 1994). En el biopelicula, una colonia bacteriana esta envuelta por la matriz extracelular (superficie de la mucosa), que comprende matriz polimerica (compuesta por polisacaridos y polipeptidos). Es decir, la biopelicula es un complejo compuesto por una superficie biologica sblida, la colonia bacteriana, y una superficie no biologica, la matriz extracelular. Por lo tanto, en esta invencion, biopelicula indica toda estructura compuesta por dicha matriz extracelular y la colonia bacteriana en la misma. Biopelicula es el concepto propuesto por primera vez a finales de 1970 por el profesor Costerton, Director del Center of Biofilm Engineering, Universidad Estatal de Montana, EEUU, que indica el entorno en el que sobreviven muchas bacterias cubiertas por la matriz extracelular de materiales viscosos secretados por las bacterias (las baclerias adheridas sobre una superficie solida secretan materiales viscosos tales como polisacaridos, etc). Las biopeliculas se encuentran en todas partes en la naturaleza. El limo mucoso que se encuentra en las rocas o los estanques es un ejemplo. La biopelicula es una pequena ciudad de bacterias donde las bacterias se comunican y se defienden del mundo exterior. Asi, la biopelicula proporciona un entorno para que las bacterias sobrevivan bajo diversas tensiones ambientales incluyendo los antibioticos.

La biopelicula se observa con frecuencia no solo en la naturaleza sino tambien en relacion con las enfermedades infecciosas. Se puede formar en los organos de los seres humanos y se puede generar en forma de placas en los dientes y se puede generar en los dispositivos medicos para equipamientos para trasplantes o industriales. Por lo tanto, la biopelicula ha sido una de las principales preocupaciones de los investigadores que estudian el dolor de oido en oido medio y la neumonia acompahada de enfermedad periodontal o fibrosis quistica. De acuerdo con el informe realizado por el NIH, EEUU en 2002, un maximo de 80% del total de las infecciones bacterianas se propagan a traves de una biopelicula.

Incluso los antibioticos eficaces en bacterias planctonicas pierden su efecto una vez que las bacterias forman biopeliculas (Trends Microbiol 9: 34-39 de 2001). Una vez que las bacterias forman la biopelicula, un anticuerpo no puede invadir a traves de la matriz extracelular de la biopelicula, dando como resultado la inhabilitacion del sistema inmunitario del anfitrion. Una de las propiedades mas conocidas especificas de la biopelicula es el desarrollo de resistencia a antibioticos que puede ser hasta 1.000 veces mayor que las celulas planctonicas (Antimicrob Agents Chemother 47: 3407-3414, 2003). El mecanismo de aumento de la resistencia contra los antibioticos por la biopelicula no ha sido revelado, pero puede ser descrito por las siguientes tres razones. La primera razon es "el cambio ecologico de los microorganismos". Una vez que se forma biopelicula, la adherencia entre las bacterias se vuelve fuerte, de modo que la colonia bacteriana no es apta para ser propagada, lo que da como resultado la disminucidn de la proliferacion. Despues, las bacterias comienzan a perder la dependencia de la interaccion con el medio ambiente y, en consecuencia el metabolismo de las bacterias se vuelve lento y la sensibilidad frente a los antibioticos disminuye.

La segunda razon son las propiedades fisicas de la "matriz extracelular compuesta por polisacaridos viscosos". Los polisacaridos viscosos que forman la matriz extracelular tienen la propiedad electrica de ser aptos para unirse a los antibioticos. La union de polisacaridos viscosos a los antibioticos interrumpe la propagacion de los antibioticos. Eso es, los antibioticos no pueden ser liberados en las bacterias diana, de modo que los antibioticos no pueden hacer efecto. La tercera razon es la "produccion de un inhibidor", que esta presumiblemente involucrado en el mecanismo general de adquisicion de resistencia a antibioticos. El inhibidor mas representativo que inhibe el efecto de los antibioticos son las beta-lactamasas producidas por Pseudomonas. Una vez que se forma la biopelicula, las

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bacterias que residen en ella pero que no tienen resistencia comienzan la adquisicibn de los genes relacionados con la resistencia por transferencia horizontal de genes y como resultado estas bacterias se convierten en bacterias resistentes. Una vez que se ha generado biopelicula en el area infectada, se puede considerar que la zona se ha converiido en resistente a los antibioticos. Por lo tanto, una vez que se genera la biopelicula, es muy dificil tratar las enfermedades infecciosas mediante el uso de antibioticos generales,

Por lo tanto, la formacion de biopelicula indica una infeccion bacteriana cronica, Como se ha descrito anteriormente en esta memoria, la sensibilidad de las bacterias a los antibioticos se vuelve debil, lo que sugiere que las dosis normales de los antibioticos no son eficaces. Para superar semejante baja sensibilidad, los antibioticos se utilizan en exceso, dando como resultado solamente la produccion de bacterias resistentes a los antibioticos Es decir, en la infeccion por bacterias, en particular cuando la biopelicula ya se ha generado, el tratamiento con antibioticos ya no es eficaz.

Para evitar que los antibioticos sean desactivados por biopelicula, se requiere un nuevo antibidtico capaz de destruir la biopelicula o se tiene que desarrollar un metodo para el tratamiento simultaneo con un antibidtico convencional y un componente especifico capaz de destruir la matriz extracelular de la biopelicula para que los antibioticos convencionales funcionen con eficacia.

La bacteria Gram positiva Staphylococcus aureus, es un microorganismo patogeno que causa purulencia, absceso, diversas infecciones piogenas, y sepsis. Es un patogeno muy peligroso que muestra la mayor resistencia frente a la meticilina (73% de promedio, que es el nivel superior de resistencia en todo el mundo), de acuerdo con la investigacion en Corea. Eso significa que el Staphylococcus aureus que no es destruido por la meticilina supone en 73% de su poblacion total, lo que indica que Staphylococcus aureus es un patogeno muy peligroso. Muchas cepas de Staphylococcus aureus son capaces de formar biopelicula Una vez que se genera la biopelicula, la liberacion de farmacos es imposible, lo que da como resultado una infeccion cronica. Es decir, la formacion de biopelicula causa la infeccion cronica (FEMS Microbiology Letters 252: 89-96, 2005). El tratamiento de las enfermedades asociadas con biopellculas causadas por Staphylococcus aureus es especialmente dificil, en comparacion con otros tratamientos de infeccion por bacterias que se ocupan de biopeliculas generadas por otros patogenos Incluso si un farmaco se administra para tratar la enfermedad, la liberacion del farmaco es dificil a causa de la biopelicula. Incluso si el farmaco es liberado, el efecto del tratamiento sobre Staphylococcus aureus altamente resistente no es tan grande por el tratamiento basado en antibioticos convencionales. Por lo tanto, para el tratamiento de la biopelicula de Staphylococcus aureus, es necesario un enfoque novedoso con un nuevo material.

Se han realizado varios intentos hasta ahora para tratar la biopelicula generada por Staphylococcus aureus. Sin embargo, los resultados no han sido satisfactorios. El unico intento eficaz fue la utilizacion de lisostafina, precisamente se habia informado de que la lisostafina podria ser util para la eliminacion de la biopelicula generada por Staphylococcus aureus (Antimicrob Agents Chemother 47: 3407-3414, 2003). La Lisostafina es una enzima antibacteriana producida por estafilococos que es capaz de destruir la pared celular de los estafilococos. Esta enzima es una endopeptidasa de glicilglicina que digiere especificamente los puentes de pentaglicina cruzados que se encuentran en la estructura de peptidoglicano de los estafilococos. Por lo tanto, se espera que la lisostafina sea un agente anti-estafilococico extremadamente potente. Incluso si la lisostafina tiene un efecto antibacteriano excelente, no es perfecto Todavia existen muchos estafilococos que no son sensibles a la lisostafina (cepas resistentes a lisostafina) (J Clin Microbiol 11: 724-727, 1980: Antimicrob Agents Chemother 47: 3407-3414, 2003). Puesto que la sensibilidad a la lisostafina es diferente entre los estafilococos, esta no puede ser eficaz en todos los estafilococos. Por otra parte, se estan generando cepas resistentes a lisostafina. Tales cepas resistentes a lisostafina se llaman variantes de Staphylococcus aureus resistentes a lisostafina (Antimicrob Agents Chemother 51: 475-482, 2007). El mecanismo de adquisicibn de resistencia contra la lisostafina no se ha explicado todavia. Pero, existia un informe sobre el mecanismo que decia lo siguiente. Cuando el gen femA esta mutado y por lo tanto no se expresa la proteina FemA funcional, se generan puentes cruzados de monoglicina en la estructura de peptidoglicano, lo que vuelve impotente la lisostafina (J Bacteriol 188: 6288-6297, 2006) Para superar el problema anterior de la utilizacion de lisostafina, se estan acometiendo activamente estudios para establecer un metodo para utilizar lisostafna junto con otra enzima tal como lisozimas o antibioticos tales como la meticilina, la oxacilina y la vancomicina para un mejor efecto (Antimicrob Agents Chemother 21: 631-535, 1982; J Antimicrob Chemother 59: 759-762, 2007; Folia Microbiol (Praha) 51: 381-386, 2006). A pesar del tratamiento simultaneo, si Staphylococcus aureus tiene una baja sensibilidad frente a la lisostafina o resistencia, la eliminacion de la biopelicula todavia es imposible. Por lo tanto, se requiere una nueva sustancia para superar las desventajas del tratamiento con lisostafina. La nueva sustancia podria ser administrada de forma independiente o administrada simultaneamente con los antibioticos convencionales. Sera mas preferido que la nueva sustancia pueda funcionar por medio de mecanismos diferentes del de la lisostafina o los antibioticos convencionales.

El nuevo enfoque de la atencion de los autores de la presente invencion en estos dias para ser capaces de complementar la tecnica convencional es utilizar un bacteriofago. El bacteriofago es una clase de agente de tipo virus que infecta bacterias y generalmente se denomina abreviadamente "fago". El bacteriofago es un organismo de estructura simple en el que el material genetico compuesto por acido nucleico esta cubierto con una envoltura de proteina. El acido nucleico es ADN o ARN de una sola hebra o de doble hebra. El bacteriofago fue encontrado por primera vez por Twort, un bacteriblogo Ingles, en 1915, durante su estudio del fenomeno de la fusion de las colonias de micrococos que eran transparentes. En 1917, d'Herelle, un bacteriologo trances, descubrio que habia algo de

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Shigellae disentriae en descomposicion en un producto filtrado de las heces de un paciente de disenteria y mas tarde a traves de su investigation adicional aislo un bacteriofago independiente y lo denomino bacteriofago. El termino bacteriofago significa "bacteria que come". Un bacteriofago necesita un anfitrion para su supervivencia y cada bacteria tiene su bacteriofago especifico El bacteriofago invade un anfitrion y se multiplica en el mismo. A continuacion el bacteriofago expresa un grupo de enzimas necesarias para la descomposicidn de la pared celular de una bacteria anfitriona. Estas enzimas destruyen la pared celular de una bacteria anfitriona atacando la capa de peptidoglicano implicada en la rigidez y la resistencia mecanica de la pared celular. Dicha proteina bacteriolitica del bacteriofago juega un papel en la destruccion de la pared celular de una bacteria anfitriona para allanar el camino para que el bacteriofago saiga del anfitrion. Dicha proteina bacteriolitica del bacteriofago se denomina generalmente lisina.

Los antibioticos (agentes antibacterianos) son todavia la mayor parte del tratamiento de las enfermedades infecciosas por bacterias. Sin embargo, desde 1980, el uso excesivo de antibioticos ha generado muchas cepas resistentes a los antibioticos, y desde el ario 2000, se han referido con frecuencia cepas multirresistentes. Con el reconocimiento de los problemas de la utilizacion de los antibioticos convencionales, los estudios se han centrado en los bacteriofagos como una alternativa muy potente para los antibioticos convencionales en muchos palses avanzados. Los bacteriOfagos no solo son eficaces en el tratamiento de las cepas resistentes a los antibioticos, sino tambien eficaces en el tratamiento de los pacientes con alergia a los antibioticos. Una vez se informo de que la lisina se habia utilizado para destruir Bacillus Anthracis utilizable como arma bioquimica para bioterrorismo (Nature 418: 884-889, 2002). Desde entonces, se han estado realizando activamente estudios para entender la actividad bactericida especifica y las funciones de la lisina.

Como una alternativa a los antibioticos convencionales, los bacteriofagos y las proteinas liticas derivadas de los mismos tambien llamaron la atencion de los autores de la presente invencion como un eliminador de la biopelicula. Existe una descripcion sobre el uso de bacteriofagos en si en relacion con la biopelicula (Publicacion Internacional Numero WO 2006/063176 A2; WO 2004/062677 A1). Sin embargo, el bacteriofago tiene una estrecha ventana de efecto, lo que sugiere que un bacteriofago no puede ser eficaz en bacterias completas de una especie. Por lo tanto, para asegurar el tratamiento eficaz, son necesarios diversos bacteriofagos. Y si fuera necesario, se requeriria una combinacion de diferentes bacteriofagos. La mezcla de bacteriofago que contiene diferentes tipos de bacteriofagos se llama coctel de bacteriofagos. Incluso entre los diferentes bacteriofagos que muestran el mismo efecto sobre las mismas bacterias, hay una diferencia en el sitio de escision del peptidoglicano de la pared celular y los mecanismos funcionales reales, que producen diferentes resultados. Por lo tanto, el uso simultaneo de dos bacteriofagos diferentes podria ser mas eficaz que el uso individual, por separado de cada bacteriofago.

Se ha intentado recientemente utilizar una proteina litica derivada de bacteriofago para eliminar la biopelicula En general, la proteina litica derivada de baderiofagos muestra un espectro mas amplio de actividad antibacteriana que su baderiofago madre. Por lo tanto, se espera que la proteina litica pueda ser mas eficaz en la eliminacion de la biopelicula que los bacteriofagos Sin embargo, parece demasiado pronto para sacar una conclusion con tan pocos informes realizados hasta ahora. Y, no hay ningun informe que describa una adividad de eliminacion suficiente de la biopelicula por una proteina litica. En relacion con la proteina litica derivada de bacteriofago, se informo de que una endolisina tp 11 recombinante podria eliminar la biopelicula generada por Staphylococcus aureus (Applied and Environmental 1 Microbiologia 73: 347-352, 2007). Sin embargo, el efecto de la endolisina <p11 no era suficiente debido a que el espectro antibacteriano era todavia demasiado estrecho. Para tratar la biopelicula generada por diferentes cepas de Staphylococcus aureus, se requieren diversas proteinas liticas derivadas de diferentes bacteriofagos. Lo que los autores de la presente invencion tienen que tener presente en la presente memoria es que cada proteina litica derivada de bacteriofago no es capaz de eliminar la biopelicula. De acuerdo con los informes anteriores, la endolisina <p11 tiene actividad de eliminacion de la biopelicula pero la endolisina cp 12 no. Por lo tanto, la actividad de eliminacion de biopelicula no es una propiedad comun de la proteina litica derivada de bacteriofago. De ese modo, es necesario obtener diversas proteinas liticas derivadas de bacteriofago que tengan actividad de eliminacion de biopelicula asi como diversos bacteriofagos.

Navarre et al. (Journal of Biological Chemistry, vol. 274, num. 22, 28 de Mayo 1999) describen que una proteina lisina derivada del fago cp11 estafilococico puede degradar la envoltura de la pared celular de los estafilococos, mas concretamente de S. aureus. Mas precisamente, Navarre et al. solamente describen una proteina lisina derivada del fago qj11 estafilococico que es capaz de destruir S. aureus de la cepa OS2 en lugar del propio bacteriofago. Sin embargo, Navarre no revela ningun resultado en relacion con la biopelicula o la actividad de eliminacion de la biopelicula tanto del fago estafilococico cp11 como de una proteina lisina derivada del mismo.

Descripcion

Problema tecnico

Los autores de la presente invencion proporcionan una composicion para la eliminacion de biopelicula formada por Staphylococcus aureus utilizando bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago, y adicionalmente tratan de utilizar la composiciOn para el tratamiento de la enfermedad causada por Staphylococcus aureus y a continuacion convertirla en cronica por la biopelicula formada de este modo.

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En particular, los autores de la presente invencion trataron de desarrollar una composicion eficaz en la eliminacion y el tratamiento de biopelicula generada por Staphylococcus aureus que es la causa de diversas enfermedades infecclosas asociadas con la biopelicula. Como resultado, los autores de la presente invencion completaron esta invencion mediante el desarrollo de una composicion eficaz para la eliminacion y el tratamiento de la biopelicula generada por Staphylococcus aureus utilizando el bacteriofago identificado primero por los autores de la invencion o la proteina litica derivados del bacteriofago.

Un objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion para la eliminacion de la biopelicula generada por Staphylococcus aureus que contiene el bacteriofago o la proteina litica derivada del bacteriofago de la presente invencion como ingrediente activo. La composicion de la presente invencion, ademas, puede induir un componente que se ha confirmado que tiene actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus

Otro objeto de la presente invencion es proporcionar un limpiador medico y un purificador del medio ambiente contra Staphylococcus aureus formador de biopelicula que contienen bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago de la presente invencion como ingrediente activo. El limpiador medico y el purificador del medio ambiente en la presente memoria pueden incluir adicionalmente un componente que se ha confirmado que tiene actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus

Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar un agente terapeutico o agente antibacteriano capaces de mejorar el efecto del tratamiento sobre la enfermedad asociada con la biopelicula causada por Staphylococcus aureus formador de biopelicula que contiene bacteridfago o proteina litica derivada del bacteriofago de la presente invencion como ingrediente activo. El agente terapeutico o agente antibacteriano de la presente invencion pueden incluir adicionalmente un componente que se ha confirmado que tienen actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus.

Solucion tecnica

Para lograr los objetos anteriores, los autores de la presente invencion completaron esta invencion mediante la confirmacion de que el bacteriofago aislado por los autores de la presente invencion y la proteina litica preparada utilizando un gen derivado del bacteriofago podrian eliminar la biopelicula formada por Staphylococcus aureus.

La presente invencion proporciona una composicibn para la eliminacion de biopelicula generada por Staphylococcus aureus que contiene bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago de la presente invencion como ingrediente activo.

La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica para el tratamiento de la enfermedad asociada con la biopelicula causada por Staphylococcus aureus formador de biopelicula que contiene bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago de la presente invencion como ingrediente activo La composicion puede incluir adicionalmente un componente que se ha confirmado que tiene actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus. Este componente adicional no tiene necesariamente poder para destruir la matriz extracelular de la biopelicula.

La presente invencion proporciona adicionalmente una composicion farmaceutica para la destruccidn de la matriz extracelular de la biopelicula junto con los antibioticos convencionales para aumentar el efecto del tratamiento de los antibioticos convencionales sobre la enfermedad asociada con la biopelicula causada por Staphylococcus aureus formador de pelicula que contiene bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago de la presente invencion como ingrediente activo. El antibiotico convencional incluido en esta composicion no tiene necesariamente poder para destruir la matriz extracelular de la biopelicula.

La composicion de la presente invencion se formula como un desinfectante, un limpiador medico, un purificador del medio ambiente, un agente terapeutico y un agente antibacteriano para la eliminacion de la biopelicula generada por Staphylococcus aureus o para el tratamiento de la enfermedad causada por Staphylococcus aureus y convertida en cronica por la biopelicula formada por Staphylococcus aureus formador de biopelicula. La composicion puede incluir adicionalmente un componente que se ha confirmado que tiene actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus.

En lo sucesivo, la presente invencion se describira con detalle.

Los autores de la presente invencion aislaron un bacteriofago novedoso capaz de destruir especificamente Staphylococcus aureus, y depositaron el bacteriofago en la Korean Agricultural Culture Collection, National Institute of Agricultural Biotechnology el 14 de Junio de 2006 (num. de acceso: KACC 97001P) y en el Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology el 10 de Julio de 2007 (num. de acceso: KCTC 11153BP). Se ha solicitado una patente sobre las cuestiones relacionadas (Solicitud de Patente Coreana Num. 2006-55461). Los autores de la presente invencion continuaron el estudio y como resultado aislaron otro bacteriofago eficaz. y a continuacion depositaron el bacteriofago aislado en el Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, el 10 de Julio de 2007 (num. de acceso: KCTC 11154BP), y tambien solicitaron una patente para las cuestiones relacionadas (Solicitud de Patente Coreana Num. 2007-82358).

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Ademas, los autores de la presente invencion solicitaron una patente que describe una nueva proteina antibacteriana originada a partir del bacteriofago capaz de destruir especificamente Staphylococcus aureus basandose en la informacion genetica de la misma (Solicitud de Patente Coreana Num. 2006-73562 y Niim. 200782357).

Como se ha descrito anteriormente en esta memoria, la proteina litica (proteina antibacteriana) derivada de bacteriofago es una proteina que destruye la pared celular de una bacteria anfitriona cuando el bacteriofago sale de la bacteria anfitriona. Semejante proteina litica derivada de bacteriofago se denomina generalmente lisina. La proteina litica, lisina, se compone de un dominio catalitico N-terminal y un dominio de union J-terminal y estos dos dominios estan unidos por un conector corto. La lisina puede tener dos dominios cataliticos diferentes, lo que, sin embargo, es un caso raro. El dominio de union C-terminal se conjuga con la matriz sobre la pared celular de las bacterias diana. La diferencia entre el dominio catalitico y el dominio de union marca la diferencia en el espectro antibacteriano de la proteina litica. Por lo tanto, tambien es importante asegurar diversas proteinas liticas derivadas de diferentes bacteriofagos. La diversidad de proteinas liticas facilita el establecimiento de un metodo para hacer frente a mas bacterias y la terapia combinada de al menos dos proteinas liticas diferentes puede aumentar el efecto antibacteriano, en comparacion con un unico tratamiento de un tipo de proteina litica.

La presente invencion proporciona un bacteriofago SAP-1 (Num. de Acceso KCTC 11153BP) que tiene un genoma representado por la secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias representadas por los SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 26 y un bacteriofago SAP-2 (Num. de Acceso KCTC 11154BP) que tiene la secuencia de nucleotidos representada por el SEQ. ID. NO: 29 que son capaces de destruir especificamente Staphylococcus aureus y eficaces en la destruccion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus.

La presente invencion tambien proporciona proteinas liticas derivadas del bacteriofago SAP-1 que tiene la secuencia de aminoacidos representada por el SEQ. ID. NO: 28 y un gen que codifica la secuencia de nucleotidos representada por el SEQ. ID. NO: 27 y la proteina litica derivada del bacteriofago SAP-2 que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID. NO: 31 y un gen que codifica la secuencia de nucleotidos representada por el SEQ. ID NO: 30 que son capaces de destruir especificamente Staphylococcus aureus y eficaces en la destruccion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus. En la presente memoria, la actividad antibacteriana por actividad litica no se distingue de la actividad antibacteriana general resultado de otros mecanismos.

Los autores de la presente invencion proporcionan una composicion para la eliminacion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus utilizando bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago capaces de destruir especificamente Staphylococcus aureus y eficaces en la destruccion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus.

Una vez que la biopelicula es formada por Staphylococcus aureus, como se describe anteriormente en esta memoria, da como resultado una infeccion cronica y el tratamiento de semejante infeccion cronica es muy dificil. Todos los metodos de tratamiento convencionales basados en los antibioticos convencionales no son demasiado eficaces. En particular, la reciente aparicion de cepas resistentes a los antibioticos requiere un nuevo metodo para tratar la biopelicula formada por dichas cepas resistentes a los antibioticos. Los autores de la presente invencion proporcionan un metodo apropiado para tratar semejante biopelicula utilizando bacteriofago o proteina litica derivada del mismo.

Otro objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion para un limpiador medico y un purificador del medio ambiente que contiene el bacteriofago o la proteina litica derivada del bacteriofago como un ingrediente activo.

El limpiador medico se utiliza para evitar la formacion de la biopelicula sobre la superficie de los organos artificiales trasplantados o heridos. La biopelicula formada por Staphylococcus aureus se encuentra en gran medida sobre las superficies artificiales implantadas tales como cateteres, valvulas cardiacas, derivaciones y dispositivos protesicos (New Microbiol 22: 337-341, 1999; J Med Microbiol 50: 582-587, 2001; Infections Associated with Indwellin Medical Devices, pags. 55-88, 2000, ASM, Washington, DC). Por lo tanto, los dispositivos medicos implantables se recubren preferiblemente con un agente antibacteriano.

Una vez que se forma la biopelicula sobre los implantes artificiales, la operacion quirurgica es la unica manera de eliminar la biopelicula. Por lo tanto, es mas importante evitar que se forme biopelicula. La prevencion de la formacion de biopelicula tiene la ventaja de la sustitucion menos frecuente de los dispositivos medicos implantados y de ese modo disminuye el coste medico.

El limpiador medico puede ser pulverizado sobre la superficie de un area diana que debe ser protegida de la formacion de biopelicula, por ejemplo una articulacion artificial, un cateter, un endoscopio o una herida. El lavado se puede realizar por medio de lavado a mano, limpiador ultrasonico o lavadora automatica. Los dispositivos medicos pueden ser sumergidos en un limpiador medico. A medida que se generan cepas resistentes a los antibioticos, es necesario un metodo novedoso para el tratamiento de biopeliculas generadas por tales cepas resistentes a los

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antibioticos. Por lo tanto, los autores de la presente invencion desarrollaron un metodo apropiado utilizando el bacteriofago o la protelna litica derivada del bacteriofago.

El uso de la composicion de la presente invencion como un purificador ambiental indica el uso como un desinfectante general. La composicion de la presente invencion se puede utilizar eficazmente como un desinfectante para el area de la cocina e instalaciones

El contenido eficaz de bacteriofago o protelna litica derivada del bacteriofago en la composicion de la presente invencion para un limpiador medico y un purificador del medio ambiente puede ser determinado por los expertos en la tecnica despues de una sencilla investigacion preliminar. La dosis se puede regular teniendo en cuenta el campo elegido como diana y el metodo de aplicacion. El contenido del bacteriofago en la composicion de la presente invencion es preferiblemente de 1 * 103- 1 x 1012 ufp/mf y mas preferiblemente de 1 x 108 - 1 * 1010 ufp/mt. El contenido de la proteina litica en la composicion de la presente invencion es preferiblemente de 0,001% (p/v) - 0,1% (p/v), mas preferiblemente 0,002% (p/v) - 0,01% (p/v) y lo mas preferiblemente 0,005% (p/v). El bacteriofago y la proteina litica derivada del mismo de la presente invencion son complementarios entre si.

Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar un agente terapeutico y un agente antibacteriano que contiene el bacteriofago o la proteina litica derivada del bacteriofago como un ingrediente activo.

El bacteriofago o la proteina litica derivada del bacteriofago incluidos en la composicion de la presente invencion, como se describe anteriormente en esta memoria, son capaces de destruir especlfcamente Staphylococcus aureus y eficaces en la destruccion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus, de modo que tienen el efecto de un tratamiento sobre diversas enfermedades infecciosas crOnicas causadas por Staphylococcus aureus y convertidas en cronicas por la formacion de biopelicula tales como mastitis, dermatitis, sepsis, trastorno supurativo, intoxication alimentaria, neumonia, osteomielitis, impetigo, bacteremia, endocarditis, y enteritis, etc. La composicion de la presente memoria puede incluir adicionalmente un componente que se ha confirmado que tiene actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus para aumentar el efecto del tratamiento.

Los ejemplos del componente que se ha confirmado que tiene actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus que puede incluirse adicionalmente en la composicion de la presente invencion son meticilina, oxacilina y vancomicina, pero no siempre limitados a las mismas, y se pueden utilizar diversos antibioticos.

Cuando el bacteriofago o la proteina litica derivada del mismo se pueden administrar conjuntamente con los antibioticos convencionales u otras sustancias eficaces, esto les ayuda a tener un funcionamiento tan pleno como se desea al destruir la matriz extracelular de la biopelicula. El bacteriofago o la proteina litica derivada del mismo de la presente invenciOn pueden digerir un enlace especifico de la estructura de peptidoglicano, a diferencia de lisostafina, de modo que pueden ser eficaces en el tratamiento de la enfermedad causada por Staphylococcus aureus que no es sensible a la lisostafina o variantes resistentes a las lisostafina.

La dosis eficaz de la composicion de la presente invencion como un agente terapeutico o un agente antibacteriano puede ser determinada y prescrita por un medico experimentado. En esta invencion, "agente antibacteriano" es el termino generalizado para antisepticos, bactericidas y antibioticos La dosis eficaz se puede determinar especificamente teniendo en cuenta la edad y el peso de un animal, incluyendo un ser humano, los sintomas clinicos y los metodos de administracion

La dosis eficaz de la composicion farmaceutica de la presente invencion formulada para su aplicacion, pulverization, inyeccion y administracion general se puede determinar considerando el metodo de formulation, el metodo de administracion, la edad, el peso y el genero del paciente, la gravedad de la enfermedad, la dieta, el tiempo y la via de administration, la tasa de excretion y la reactividad, etc. Un medico experimentado puede determinar y prescribir la dosis eficaz teniendo en cuenta la fmalidad del tratamiento. En general, el contenido del bacteriofago en la composicion farmaceutica de la presente invencion es preferiblemente de 1 * 103 - 1 * 1012 ufp/mf y mas preferiblemente de 1 * 10s- 1 * 10 D ufp/mf. Y el contenido de la proteina litica en la composicion farmaceutica de la presente invencion es preferiblemente de 0,001% (p/v) - 0,1% (p/v), mas preferiblemente de 0,002% (p/v) - 0,01% (p/v) y lo mas preferiblemente de 0,005% (p/v). El bacteriofago y la proteina litica derivada del mismo de la presente invencion son complementarios entre si.

La composicion de la presente invencion se puede aplicar, pulverizar o inyectar en una zona diana. Ademas, la composition de la presente invencion se puede administrar por via oral o parenteral. La administracion parenteral se ilustra mediante la administracion intravenosa, la administration intraperitoneal, la administracion intramuscular, la administracion hipodermica o la administracion local.

El portador farmaceuticamente aceptable incluido en la composicion de la presente invencion queda ilustrado por lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidon, goma de acacia, fosfato de calcio, alginato, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral, pero no siempre se limita a los mismos. La composicion farmaceutica de la presente invencion puede incluir adicionalmente lubricantes, agentes humectantes, agentes edulcorantes, aromas, agentes emulsionantes, agentes de suspension y coadyuvantes, ademas de los ingredientes anteriores.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La composicion farmaceutica de la presenle invencion se puede formular mediante el uso de un portador y/o excipiente farmaceuticamente aceptable de acuerdo con un metodo generalmente realizado por los expertos en la tecnica como una dosis unitaria o en un envase multidosis. En este momento, la formulacion puede ser aceite o solucion en medio acuoso, suspension o emulsion, extracto, polvo, granulo, comprimido o capsula y un agente dispersante o adicionalmente se puede incluir un estabilizador en las mismas.

El tratamiento de la enfermedad causada por Staphylococcus aureus utilizando el bacteriofago capaz de destruir la biopelicula o la proteina litica derivada del bacteriofago es ventajoso con respecto al tratamiento basado en antibioticos convencionales. Es decir, la eliminacion de la biopelicula y la destruccion de bacterias diana se pueden lograr al mismo tiempo mediante el metodo de tratamiento utilizando el bacteriofago o la proteina litica derivada del mismo. Asi que, incluso si Staphylococcus aureus sobrevive en la biopelicula, puede ser destruido con eficacia.

El termino "tratamiento’1 en esta invencion indica (i) la prevencion de la enfermedad infecciosa causada por Staphylococcus aureus; (ii) la inhibicion de la enfermedad infecciosa causada por Staphylococcus aureus y (iii) el alivio de una enfermedad infecciosa causada por Staphylococcus aureus.

+++Efectos ventajosos

Como se ha explicado anteriormente, el bacteriofago SAP-1, el bacteriofago SAP-2 y las proteinas liticas derivadas de dichos bacteriofagos de la presente invencion son capaces de destruir Staphylococcus aureus especificamente y destruir adicionalmente la biopelicula formada por Staphylococcus aureus, de modo que pueden ser utilizados eficazmente para la eliminacion de biopelicula por Staphylococcus aureus. Tambien se pueden utilizar como un limpiador medico y purificador del medio ambiente para la eliminacion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus y adicionalmente como un agente terapeutico y un agente antibacteriano con un mejor efecto de tratamiento por la eliminacion de la biopelicula de Staphylococcus aureus para el tratamiento de la infeccion causada por Staphylococcus aureus formador de biopelicula.

Y, el bacteriofago SAP-1, el bacteriofago SAP-2 y las proteinas liticas derivadas de esos bacteriofagos de la presente invencion no solo tienen actividad especifica de destruccion de Staphylococcus aureus, sino tambien tienen la actividad de eliminacion de la biopelicula. Por lo tanto, cuando se administran con los antibioticos o medicamentos convencionales, pueden aumentar el efecto del tratamiento de los antibioticos o medicamentos convencionales que tienen actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus que no han sido tan eficaces en el tratamiento debido a que han sido bloqueados por la matriz extracelular de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus.

Descripcion de los dibujos

La aplicacidn de las realizaciones preferidas de la presente invencion se entiende mejor con referenda a los dibujos adjuntos, en donde:

La Figura 1 es un conjunto de fotografias de microscopio electronico que muestran el bacteriofago especifico de Staphylococcus aureus aislado mediante analisis en placa. (A): Bacteriofago del genero fago de tipo T4 de la familia Myoviridae, (B): Bacteriofago del genero virus de tipo cp29 de la familia Podoviridae.

La Figura 2 es un diagrama esquematico que ilustra el metodo para la construccion de la biblioteca del genoma del bacteriofago paso a paso.

La Figura 3 es un conjunto de fotografias que ilustran el resultado de la electroforesis con la proteina litica expresada. (A) calle M: marcador de tamaho (198, 115, 90,5, 61,5, 46,2, y 37,8 kDa), calle 1: lisado celular que contiene la proteina litica expresada SAL-1 (B) calle M: marcador de tamaho (198, 115, 90,5, 61.5, 46,2, 37,8, 26, 18,5 y 9 kDa), calle 1: lisado celular que contiene la proteina litica expresada SAL-2. *: proteina litica expresada en exceso.

La Figura 4 es un conjunto de fotografias que ilustran la actividad litica de la proteina litica contra Staphylococcus aureus aislado clinicamente, en las que las zonas claras son generadas por la actividad litica de la proteina litica.

La Figura 5 es una fotografia que ilustra el resultado de la PCR con el gen ica C para el aislamiento de Staphylococcus aureus capaz de formar biopelicula.

La Figura 6 es una fotografia que ilustra la formacion de biopelicula por el Staphylococcus aureus SA1 aislado. (A): Staphylococcus aureus de control que no es capaz de formar biopelicula. (B): Staphylococcus aureus SA1 formador de biopelicula.

La Figura 7 es un conjunto de fotografias que ilustran la eliminacion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus SA1 por el bacteriofago y la proteina litica derivada del mismo de la presente invencion. Num. 1: muestra tratada con la proteina litica SAL-1 y luego tehida, Num. 2: muestra de control negativa tenida sin el tratamiento, Num. 3: muestra tratada con el bacteriofago SAP-2 y luego tehida, Num 4: muestra tratada con la proteina litica SAL-2 y despues tehida, Num. 5 muestra de control positiva tratada con lisostafina y luego tehida, y Num. 6: muestra tratada con PBS solo y luego tehida. La cantidad de cada componente del tratamiento no se considero significativa.

La fotografia superior muestra toda la placa de 96 pocillos y la fotografia inferior ilustra cada pocillo de la placa en detalle.

Mejor metodo

Las realizaciones practicas y actualmente preferidas de la presente invention son ilustrativas como se muestra en 5 los siguientes ejemplos.

Sin embargo, se apreciara que los expertos en la tecnica, en la consideration de esta descripcion, pueden realizar modificaciones y mejoras dentro del espiritu y el alcance de la presente invencion.

Ejemplo 1: Aislamiento de Staphylococcus aureus de patogeno y el aislamiento de bacteriofagos que tienen capacidad de destruccion especifica de Staphylococcus aureus

10 <1-1> Aislamiento de Staphylococcus aureus

El bacteriofago se distribuye ampliamente en la naturaleza y en particular vive junto con las bacterias. Para aislar el bacteriofago que infecta Staphylococcus aureus especificamente, los autores de la presente invencion recogieron muestras de lugares esperados en los que parece proliferar Staphylococcus aureus, seguido de la confirmacidn de que Staphylococcus aureus estaba creciendo en los mismos utilizando medio de agar Baird-Packer, el medio de 15 seleccion para Staphylococcus aureus.

En particular, se selecciono la mastitis bovina como una enfermedad diana para aislar las bacterias diana Staphylococcus aureus del patogeno La mastitis es una de las enfermedades mas representativas causadas por Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus fue aislado de las muestras extraidas de la leche de vacas lecheras con mastitis mediante el uso de un medio de agar Balrd-Parker, el medio de seleccion para Staphylococcus 20 aureus. A continuacion, las bacterias aisladas fueron identificadas como Staphylococcus aureus por el metodo de tincion de Gram, prueba de catalasa y prueba bioquimica utilizando Vitek (bioMerieux). Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

Vitek ID

200000-0 (A1-18) catalasa + coagulasa +

Tipo

Tarjeta de identification Gram positives (GPI)

Condicion

Final

Tiempo

Organismo

5 horas

Staphylococcus aureus

PB +

BAC OPT HCS 6NC 10B

+ + + +

40B -

ESC ARG URE TZR NOV

“ * - + "

DEX +

LAC MAN RAF SAL SOR

+ + “ " ”

sue +

TRE ARA PYR PUL INU

+ " + ”

MEL-

MLZ CEL RIB XYL CAT

“ “ “ +

BH/CO +

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<1-2> Aislamiento de bacteriofago especifico de Staphylococcus aureus

A continuacion, para aislar un bacteriofago especifico de Staphylococcus aureus, las muestras que se esperaba que contuvieran bacteriofago se cultivaron con Staphylococcus aureus. El caldo de cultivo se centrifugo para obtener el sobrenadante El sobrenadante obtenido se filtro. La solucion filtrada se cultivo nuevamente con Staphylococcus aureus cultivado como cebo para el aislamiento del bacteriofago, seguido de investigacion de la lisis de Staphylococcus aureus. La lisis de Staphylococcus aureus finalmente fue confirmada mediante analisis en placa

En particular, para aislar el bactenofago que tiene actividad de destruccion especifica de Staphylococcus aureus, las muestras se recogieron de suelo, de paja, de tierra y de aguas residuales de establo donde posiblemente sobrevive el bacteriofago. Las muestras se cultivaron con agitacion a 37”C durante 3-4 horas con el Staphylococcus aureus obtenido en el Ejemplo <1-1>. Despues del cultivo, el caldo de cultivo se centrifugo a 8.000 rpm durante 20 minutos para obtener el sobrenadante. El sobrenadante se filtro con un filtro de 0,45 pm. Se aislaron dos tipos de bacteriofagos especificos de Staphylococcus aureus mediante analisis en placa con el producto filtrado.

Para observar la morfologia del bacteriofago obtenido, el bacteriofago se purifico por centrifugacion en gradiente de densidad de CsCI (densidad: 1,15 g/mf, 1,45 g/mf, 1,50 g/mf y 1,70 g/mf) (38.000 rpm, 22 horas 4“C). El bacteriofago purificado se coloco sobre la rejilla de cobre, seguido de tincion negativa con acetato de uranilo al 2% y secado. La morfologia del bacteriofago fue fotografiada bajo el microscopio electronico. Como resultado, se confirmo que los bacteriofagos aislados de acuerdo con la clasificacion morfologica pertenecian al genero fago de tipo T4 de la familia Myoviridae y al genero virus de tipo cp29 de la familia Podoviridae (Figura 1). El bacteriofago aislado perteneciente al genero fagos de tipo T4 de la familia Myoviridae fue denominado bacteriofago SAP-1, que fue depositado en el Korean Agricultural Culture Collection, National Institute of Agricultural Biotechnology el 14 de Junio de 2006 (Niim. de Acceso: KACC 97001P) y en el Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology el 10 de Julio de 2007 (Nunn de Acceso: KCTC 11153BP). Otro bacteriofago aislado anteriormente perteneciente al genero virus de tipo q)29 de la familia Podoviridae se denomino bacteriofago SAP-2, que fue depositado en el Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology el 10 de Julio de 2007 (Num. de Acceso: KCTC 11154BP)

Ejemplo 2: Caracteristicas geneticas de los bacteriofagos especificos de Staphylococcus aureus SAP-1 y SAP-2 <2-1 > Caracteristicas geneticas del bacteriofago SAP-1

Se analizaron las caracteristicas geneticas del bacteriofago SAP-1 aislado. En primer lugar, el genoma del bacteriofago se extrajo por el metodo convencional, seguido de analisis genetico. Concretamente, se inocularon 50 mf de suspension de Staphylococcus aureus [DOeoo: 1] y 1 mf de suspension de bacteriofago filtrada a la concentracion de 1 x 10a ufp/mf en 200 mf de medio TSB (Caldo de Soja con Tripsina ahadida) (producto digerido de caseina, 17 g/l de producto digerido de soja, 3 g/l de dextrosa, 2,5 g/l de NaCI, 5 g/l de fosfato dipotasico, 2,5 g/) en un matraz de 1 I, seguido de cultivo con agitacion a 37°C durante 3-4 horas. Al termino del cultivo, se investigo la lisis de Staphylococcus aureus. Cuando la lisis de Staphylococcus aureus fue confirmada, el caldo de cultivo se filtro con un filtro de 0,45 pm. Despues, se anadio polietilenglicol 8000 al 20%/solucion de NaCI 2,5 M al producto filtrado por 1/6 del volumen de producto filtrado, que se mantuvoa 4°C durante toda la noche.

La solucion se centrifugo a 8000 rpm durante 20 minutos para obtener el bacteriofago a partir del producto precipitado. El producto precipitado del bacteriofago obtenido se suspendio en 1 mf de PBS (solucion salina tamponada con fosfato), a la que se anadio polietilenglicol 8000 al 20%/solucion de NaCI 2,5 M por 1/6 del volumen total, que se mantuvo a 4°C durante una hora. Una hora mas tarde, la solucion se centrifugo a 14 000 durante 10 minutos para obtener el precipitado de bacteriofago purificado. El producto precipitado se mezclo con 200 pf de tampon yoduro (Tris-HCI 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, Nal 4 M) suavemente, que se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos. El genoma del bacteriofago se extrajo usando el kit DNeasy Tissue (Qiagen) y el kit de purificacion de PCR (Labopass).

El genoma extraido del bacteriofago fue ADN genomico (ADNg). El tamario del ADNg total era demasiado grande para analizar su secuencia directamente. Asi, se construyo primero la biblioteca de ADNg, seguido de secuenciacion. La biblioteca de ADNg se construyo mediante el uso de la enzima de restriccion Msp I de acuerdo con el metodo convencional presentado en la Figura 2.

En particular, para obtener diversos fragmentos de genes, se trato el ADNg extraido con la enzima de restriccion Msp I a 30°C durante un minuto, lo que lleva a la fragmentacion parcial del ADNg. Despues de la fragmentacion, los fragmentos de genes se introdujeron en el vector fagemido pBluescript II SK (+) (Stratagene) utilizando ligasa T4. El plasmido recombinante construido que contenia los fragmentos de los genes de bacteriofago se introdujo en E. coli Top10F' (Invitrogen) por electroporacion, uno de los metodos de electro-transformacion. El transformante que tenia el plasmido recombinante se selecciono sobre placas de agar que contenian ampicilina con un suplemento de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranosido) e IPTG (isopropil-D-1- tiogalactopiranosido) por medio de seleccion de colonias Blue-White. La unica colonia seleccionada se inoculo en el medio de cultivo que contenia ampicilina, seguido de cultivo con agitacion durante la noche. El plasmido se extrajo

de las celulas cultivadas mediante el uso de un kit de purification de plasmidos (iNtroN Biotechnology). El plasmido extraido se sometio a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para examinar el tamario. Basandose en el tamario confirmado, se selecciono el plasmido recombinante.

Los plasmidos seleccionados fueron 51 en total y cuyos clones correspondientes fueron tambien 51. Estos clones se 5 cultivaron de nuevo, a partir de los cuales se extrajeron de nuevo plasmidos. Se analizaron las secuencias de nucleotidos de los plasmidos extraidos. La secuenciacion se realizo con un cebador directo M13 y un cebador inverso M13 que son cebadores generales ampliamente utilizados para la secuenciacion. La secuencia de cada cebador se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2

Cebador

Secuencia

Cebador directo M13

GTCGTGACTGGAAAACCCTGGCG

Cebador inverso M13

TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT

10

Las secuencias de genes obtenidos de este mode son secuencias parciales que forman todo el genoma del bacteriofago SAP-1, que estan representados por el SEQ. ID. NO: 1 al SEQ. ID. NO: 26.

La homologia de las secuencias de nucleotidos del bacteriofago SAP-1 con los genes de bacteriofagos conocidos se analizo utilizando BLAST en la Red (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTA. Como resultado, se confirmo que la 15 secuencia de nucleotidos del bacteriofago SAP-1 tenia la mas alta homologia con el bacteriofago G1. Para entender las funciones geneticas de cada parte del genoma, se realizo el analisis de los ORF (Open Reading Frame) basado en secuencia de genes del bacteriofago G1 utilizando el buscador de ORF de NCBI (
http://www.ncbi.nlm nih.QOv/Qorf/qorf htmf) y el programa Vector NTI ContigExpress (INFORMAX). Como resultado, se obtuvo la secuencia del gen de la proteina litica del bacteriofago SAP-1. La secuencia de nucleotidos entera de la 20 proteina litica derivada del bacteriofago SAP-1 esta representada por el SEQ. ID. NO: 27. V la secuencia de aminobcidos de la proteina litica derivada del bacteriofago SAP-1 estb representada por el SEQ. ID. NO: 28. La proteina litica derivada del bacteriofago SAP-1 fue denominada SAL-1.

<2-2> Caracteristicas geneticas del bacteriofago SAP-2

Se analizaron las Caracteristicas geneticas del bacteriofago SAP-2 aislado. En primer lugar, el genoma del 25 bacteriofago SAP-2 se extrajo por el metodo conventional, seguido por el analisis genetico. En particular, se anadieron 50 mf de suspension de Staphylococcus aureus (DOecx): 1) y 1 mf de suspension de bacteriofago filtrada a una concentration de 1 » 108ufp/mf a 200 mf de medio TSB en un matraz de 1 I, seguido de cultivo con agitation a 37°C durante 3-4 horas. Una vez terminado el cultivo, se investigo la lisis de Staphylococcus aureus. Cuando se confirmo la lisis de Staphylococcus aureus, el caldo de cultivo se filtro con un filtro de 0,45 pm. Para eliminar el ADN 30 y el ARN de Staphylococcus aureus que quedaba en el caldo de cultivo filtrado, se anadieron 200 U de ADNasa I y ARNasa A a 10 ml de caldo de cultivo filtrado, que se mantuvo a 37°C durante 30 minutos. Para inactivar la ADNasa I y la ARNasa A, se anadieron 500 pf de EDTA 0,5 M (acido etilendiaminotetraacetico), que se dejo estar durante 10 minutos. A continuation, para destruir la proteina de la envoltura exterior del bacteriofago, se anadieron 100 pf de proteinasa K (20 mg/mf) y 500 pf de SDS (dodecilsulfato de sodio) al 10% a la misma, seguido de incubacion a 65°C 35 durante 1 hora. Despues de una hora de incubacion, se anadieron a esto 10 mf de una solution mixta que comprendia fenol, cloroformo y alcohol isoamilico (25:24:1) y se mezclaron bien La mezcla se centrifugo a 18.000 rpm para separar las capas Se recupero la capa superior, a la que se ariadio alcohol del 100% al doble del volumen de la capa superior recuperada, seguido de extraction del genoma puro.

El genoma del bacteriofago extraido fue ADNg. El ADNg del bacteriofago SAP-2 fue secuenciado directamente ya 40 que el ADNg no era demasiado grande.

Los cebadores utilizados para la secuenciacion directa del ADNg del bacteriofago SAP-2 se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3

Cebador

Secuencia

Promotor T7

TAATACGACTCACTATAGGGCGA

' Promotor SP6

GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT

1

CGTAATGCTTCAAAATGTTC

2

GAGCAATGTTAGTTGATTACTCATT

3

CCATTTAAAAAATAATCATCACGTT

4

TGCAATTCATATATTAGATGATAA

5

TATGCTTTATATGGAGGTTGATAAC

6

AATTAGTGTACCGTCACCTAAAGA

7

TGCAACACCATCGTGATGTA

8

GTTGTTGAACATCGCAACAG

9

CAAAATCTGATAAAAACGTCAT

10

GACGTGATGAGGATTATTAT

11

ATAAATTCTCTTI CTTTTTCCTCAAATTCAAATCTCGCTAATGT

. ........... 12

CATACGTGGATAATTACGTTTCAACATTAATTCCTCATTT

13

ATCAAATTCATTTAAAATTTT CTTT CT

14

AATGTCACCTATGTTTAATGCAGA

15

AGTTCATCATTTAAGAATTGAACAACAGAACT

16

TTTGTTGCTCTAATGATGTAATACGTTGTTCTAATATAACAG

17

TCACTTGCAATAATACCACTTTCTAAT

18

GTCAAGTATCATTTTAATACAATTT

19

TCATTATACATTACGTGACGCTTA

20 AGCTTCTCTTTCTTTTTTCCATCTA

21 J GAACTTCATTGTATTTAGCGCTGTTG

22

TGAATCTTCATATGGTCGACCTGCAG

23

ATTTAATAGTTTTGCACAAGTACCAA

24

CAAACTAACCCATCTGATAAACAAAC

25

AACCTAATGGCTATTGGTTCCAACCA

26

GGTAACAGTTCAGTTAATTCACAT

27

GGTGCCATAATTTATTATTCCTCC

— 28

TTAATCGTACCTAATTTAATATCAC

29

AACGTAAATCGTTATTACTTGCAATG

30

CGTTACAACACCCGGAGAATATTA

31

CCAAATGTCCAAGATnTGAATAA

32

TTTAAAATGTACAGGTACGTATAC

I-------------- 33

TTGAATTTAACGAATATAATTTGGC

34

AT ATT AT CAT GATTGCACATAACTG

35

CTAAAAGGTTATGGACGTTTTAAT

36 AATTTTT AT GACT AT AT AAAAT CATT

Cebador

Secuencia

37

AC AAAAAAC ATTTAAC AACAC GTAT

38

AAATAAAATACAAAACATAATCAAT

La secuencia de nucleotidos del genoma completo del bacteriofago SAP-2 esta representada por el SEQ. ID. NO: 29. El numero total de nucleotidos que forman el genoma del bacteriofago SAP-2 es 17.938.

La homologla de la secuencia de nucleotidos del bacteriofago SAP-2 con los genes de bacteriofagos conocidos se 5 analizo utilizando BLAST en la Red. Como resultado, la homologia de la secuencia de nucleotidos analizada del bacteriofago SAP-2 fue de 86,0% con el fago phi P68 de Staphylococcus aureus, 81,1% con 44AHJD y una homologia de 49,2% con el bacteriofago 66 Para entender las funciones geneticas de cada parte del genoma. se realizo el analisis de ORF basado en la secuencia de genes del fago phi P68 de Staphylococcus aureus que muestra la mas alta homologia utilizando el buscador de ORF de NCBI y el programa Vector NTI ContigExpress. 10 Comparando con la publicacion "Complete nucleotide sequence and molecular characterization of two lytic Staphylococcus aureus phages: 44AHJD y P68, FEMS Microbiology Letters, 2003, 219: 275-283", se investigo la homologia de los ORF. Como resultado, se obtuvo la secuencia del gen de la protelna litica del bacteriofago SAP-2. El gen que codifica la proteina litica del bacteriofago SAP-2 se componia de 750 pb y la protelna litica expresada a partir del mismo se componia de 250 aminoacidos. La secuencia del gen que codifica la proteina litica del 15 bacteriofago SAP-2 esta representada por el SEQ. ID. NO: 30 y la secuencia de aminoacidos de la proteina litica del bacteriofago SAP-2 esta representada por el SEQ. ID. NO: 31. La proteina litica derivada del bacteriofago SAP-2 se denomino SAL-2.

Ejemplo 3: Clonacion del gen de la proteina litica y construccion del plasmido de expresion

<3-1> Construccion del plasmido de expresion de la proteina litica SAL-1

20 A partir de la secuenciacion de genes y el analisis de ORF realizados en el Ejemplo <2-1>, se identified la secuencia

genica de la proteina litica SAL-1. Para expresar la proteina litica diana a partir del gen de la proteina litica, se

construyo un sistema de expresion de la proteina litica a gran escala utilizando el vector pBAD-TOPO (Invitrogen). El gen de la proteina litica se subclono en los sitios para las enzimas de restriccion Nco I y Not I del vector de acuerdo con el metodo convencional Antes de la clonacion, se elimino el sitio de escision de enteroquinasa en el vector 25 pBAD-TOPO y en su lugar se inserto el sitio para la enzima de restriccion Not I. El plasmido de expresion de la proteina litica construido fue denominado pBAD-TOPO-SAL1. Se transformo E. coli BL21 (DE3) (Novagen) con el plasmido de expresion de la proteina litica, dando como resultado la preparacion de una cepa productora de la proteina litica. La cepa productora de la proteina litica preparada se deposito de ese modo en el Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology el 10 de Julio de 2007 (Num de acceso: KCTC 30 11151 BP).

<3-2> Construccion del plasmido de expresion de la proleina litica SAL-2

A partir de la secuenciacion genica y el analisis de ORF realizados en el Ejemplo <2-2>, se identified la secuencia

genica de la proteina litica SAL-2. Para expresar la proteina litica diana a partir del gen de la proteina litica, se

construyo un sistema de expresion a gran escala de la proteina litica utilizando el vector pBAD-TOPO (Invitrogen). El 35 gen de la proteina litica se subclono en los sitios para las enzimas de restriccion Nco I y Not I del vector de acuerdo con el metodo convencional, Antes de la clonacion, se elimino el sitio de escision de enteroquinasa en el vector pBAD-TOPO y en su lugar se inserto un sitio para la enzima de restriccion Not I. El plasmido de expresion de la proteina litica construido fue denominado pBAD :: lysinM. Se transformo E. coli Origami (DE3) (Novagen) con el plasmido de expresion de la proteina litica, dando como resultado la preparacion de una cepa productora de la 40 proteina litica. La cepa productora de la proteina litica preparada de ese modo se deposito en el Biological Resource Center Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology el 10 de Julio de 2007 (Num. de acceso: KCTC 11152BP)

Ejemplo 4: Expresion en exceso de la proteina litica

La proteina litica se expreso en exceso en E. coli transformada con el plasmido recombinante construido en el 45 Ejemplo 3. Los metodos para la expresion en exceso de ambas SAL-1 y SAL-2 son similares. El sistema de expresion basado en el vector pBAD-TOPO es el metodo que induce la expresion en exceso utilizando L-arabinosa, que es un sistema de expresion adecuado de la proteina toxica para las bacterias anfitrionas (de acuerdo con las instrucciones del fabricante titulado "sistema de expresion pBAD" y el protocolo num. 25-0257 publicitado en 2004).

La expresion en exceso de las proteinas liticas se describe con detalle mas adelante. El plasmido construido 50 contenia el gen de resistencia a ampicilina, por lo que cada medio de cultivo recibio un suplemento de ampicilina. Para expresar la proteina litica SAL-2, se utilizo Origami (DE3) como una cepa productora. Esta misma cepa productora contenia el gen de resistencia a tetraciclina. Por lo tanto, para expresar la proteina litica SAL-2, cada medio de cultivo recibio un suplemento de ampicilina y tetraciclina. Se utilizo medio LB (triptona, 10 g/L; extracto de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

levadura 5 g/L; NaCI 10 g/L) como medio de cultivo. Cada cepa productora de la proteina litica se inoculo en 5 mf de medio LB con un suplemento de antibioticos apropiados, seguido de cultivo con agitacion a 37°C durante toda la noche. Se volvieron a inocular 100 pf de cada caldo de cultivo durante la noche en 10 mf de medio LB de nueva aportacion con un suplemento de antibioticos apropiados, seguido de cultivo con agitacion de nuevo a 37°C, La induccion se llevb a cabo con L-arabinosa al 0,2%, momento en el que la densidad celular (DOsoo) era 0,8-1 (para la proteina litica SAL-1) o 0,5 (para la proteina litica SAL-2). Para inducir la expresion de la proteina litica SAL-1, la temperatura de cultivo se mantuvo a 37°C y para inducir la proteina litica SAL-2, la temperatura de cultivo se cambio a 23°C despues de que comenzara la induccion. El tiempo de cultivo adicional para inducir la expresion de SAL-1 fue de 4 horas y de 12 horas para la expresion de SAL-2. Una vez completado el cultivo, se centrifugo 1 mf del caldo de cultivo celular a 8000 rpm durante 5 minutos, y luego se recupero el producto precipitado celular. Las celulas se lisaron mediante la adicion de 100 pf de solucion de SDS al 1% al producto precipitado celular. Se utilizaron 12 pf del producto lisado celular como muestra para la electroforesis. Precisamente, se anadieron al producto lisado celular 3 pf de 5x tampon de carga de la muestra utilizado para la electroforesis, que se mezclo bien y se hirvio en un bano de agua durante 5 minutos. La electroforesis se realizo de acuerdo con el metodo convencional. A continuacion, se confirmo la proteina litica expresada en exceso. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Ejemplo 5: Separacion y purificacion de la proteina litica expresada

<5-1> Separacion y purificacion de SAL-1

Se centrifugaron 500 mf de caldo de cultivo del transformante cultivado en medio LB a 8000 rpm durante 5 minutos para obtener el precipitado celular. El producto precipitado se suspendio en 6 mf de tampon fosfato de sodio 20 mM (pH 6,0) que contenia fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM. Para precipitar las proteinas ribosomales, se le anadieron a esto 2 mg de sulfato de estreptomicina. Las celulas de la suspension celular preparada se desorganizaron por sonicacion. La sonicacion se realizo mediante la repeticion de 20 segundos de sonicacion - 5 segundos de descanso durante 20 minutos El producto lisado celular completo resultante se centrifugo a 8.000 durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante obtenido mediante centrifugacion seguido de precipitacion con sulfato de amonio al 35% (p/v), conduciendo a la concentracion de proteina litica expresada. Precisamente, se anadio sulfato de amonio a la concentracion final de 35% (p/v), y la solucion mixta se mantuvo en hielo durante 15 minutos para precipitar la proteina. A continuacion, la solucion mixta se centrifugo a 10.000 x g durante 15 minutos para obtener el producto precipitado. El producto precipitado se disolvio en 2 mf de tampon de adsorcion (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 0,25 M, pH 6,5) que se va a utilizar para la cromatografia. Para retirar el exceso de sulfato de amonio, la solucion de proteina preparada se sometio a dialisis frente a tampon de adsorcion a 4°C durante la noche mediante la sustitucion del tampon de adsorcion por un tampon nuevo de vez en cuando. Una vez completada la dialisis, la solucion de proteina se centrifugo a 10.000 x g durante 25 minutos para eliminar los materiales insolubles. La solucion de proteina se filtro con un filtro de 0,2 pm, seguido de cromatografia de intercambio cationico. Se utilizo CM-Sephadex C-50 (Pharmacia) como resina de intercambio cationico, que era una resina de intercambio cationico debil. La columna estaba cargada con CM-Sephadex C-50 por 2 7 cm y el volumen total de lecho cargado total fue de aproximadamente 14 mf. Despues del equilibrado de la columna con tampon de adsorcion, se realizo la cromatografia La solucion de proteina se cargo en la columna, que se lavo con 100 mf de tampon de adsorcion Otras proteinas derivadas de E. coli excepto la proteina litica apenas fueron adheridas a la resina cargada en la columna. Al final, la proteina litica se hizo eluir mediante el uso de solucion de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,5) que contiene NaCI con una concentracion creciente de 0,2 M a 0,8 M Para retirar el NaCI utilizado para la elucion de la proteina litica, se sometio a dialisis la fraccion de eluyente que contenia la proteina litica frente a solucion de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,5) a 4°C durante la noche mediante la sustitucion de la solucion de fosfato de sodio por una solucion de fosfato de sodio de nueva aportacion de vez en cuando. El producto dializado se concentro sometiendolo a dialisis hasta etilenglicol 20.000 seco.

<5-2> Separacion y purificacion de SAL-2

Se centrifugaron 500 mf de caldo de cultivo del transformante cultivado en medio LB a 8000 rpm durante 5 minutos para obtener el producto precipitado celular. El producto precipitado se suspendio en 6 mf de tampon Tris-HCI 80 mM (pH 4,0). Las celulas de la suspension celular preparada se lisaron por congelacion/descongelacion. Precisamente, para la congelacion/descongelacion, la suspension celular se congelo mediante el uso de nitrogeno liquido, que se descongelo a 30°C durante 5 minutos. Esta congelacion/descongelacion se repitio 8 veces. Y el producto lisado celular resultante se centrifugo a 8000 rpm durante 5 minutos para eliminar los desechos celulares. El sobrenadante obtenido mediante centrifugacion seguido de precipitacion con sulfato de amonio al 30% (p/v), conduciendo a la concentracion de proteina litica expresada. Precisamente, se anadio sulfato de amonio a la concentracion final de 30% (p/v), y la solucion mixta se mantuvo en hielo durante 15 minutos para precipitar la proteina. A continuacion, la solucion mixta se centrifugo a 10.000 xg durante 15 minutos para obtener el producto precipitado. El producto precipitado se disolvio en 2 mf de tampon de adsorcion (fosfato de sodio 25 mM, pH 5,8) que se iba a utilizar para la cromatografia. Para retirar el exceso de sulfato de amonio, la solucion de proteina preparada se sometio a dialisis frente a tampon de adsorcion a 4“C durante la noche mediante la sustitucion del tampon de adsorcion por tampon de nueva aportacion de vez en cuando. Una vez completada la dialisis, la solucion de proteina se centrifugo a 10.000 xg durante 25 minutos para eliminar los materiales insolubles La solucion de proteina se filtro con un filtro de 0,2 pm, seguido por cromatografia de intercambio cationico. Se utilizo HiTrap SPFF (GE Healthcare) como resina de intercambio cationico, que era una resina de intercambio cationico fuerte. Despues

del equilibrado de la columna con tampon de adsorcion, se realizo la cromatografia. La solucion de proteina se cargo en la columna, que se lavo con 100 mf de tampon de absorcion. Otras proteinas derivadas de E. coli excepto la proteina litica apenas se adhirieron a la resina cargada en la columna. Por ultimo, la proteina litica se hizo eluir mediante el uso de solucion de fosfato de sodio 25 mM (pH 5,8) que contenia KCI con el aumento de la 5 concentracion de 0,2 M a 0,8 M. Para retirar el KCI utilizado para la elucion de la proteina litica, la fracciOn de eluyente que contenia la proteina litica se sometio a dialisis frente a solucion de fosfato de sodio 25 mM (pH 5,8) a 4°C durante la noche mediante la sustitucion de la solucion de fosfato de sodio por solucion de fosfato de sodio de nueva aportacion de vez en cuando. El producto sometido a dialisis se concentro por medio de dialisis hasta etilenglicol 20.000 seco.

10 Ejemplo 6: Actividad antibacteriana de las proteinas liticas

Se investigo la actividad antibacteriana de las proteinas liticas separadas/purifcadas en el Ejemplo 5. Para este experimento se utilizo Staphylococcus aureus aislado e identificado por los autores de la presentes invencion de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1.

Se extendio 1 mf de caldo de cultivo de Staphylococcus aureus cultivado en medio TSB (DOsoo: 1) sobre cada medio 15 en placa, seguido de secado. Se afiadieron gota a gota 5 pf de solucion de proteina que contenia la proteina litica preparada anteriormente, seguido de incubacion en una incubadora a 37°C durante la noche. A continuacion, se examino la lisis de Staphylococcus aureus aislado. Como resultado, como se muestra en la Figura 4, se confirmo que se formaban zonas claras por la actividad litica de las proteinas liticas

Ejemplo 7: Actividad de eliminacion de biopelicula

20 <7-‘\>: Selection de Staphylococcus aureus formador de biopelicula

Para investigar si la composicion que contenia bacteriofago o proteina litica derivada de bacteriofago eran capaces de destruir la biopelicula, se selecciono primero Staphylococcus aureus capaz de formar biopelicula. Para seleccionar Staphylococcus aureus capaz de formar biopelicula, se analizo primero la existencia de genes implicados en la formacion de biopelicula. Precisamente PIA (polisacarido de adherencia intercelular) es importante 25 para la formacion de biopelicula (Science 284: 1523-1527, 1999). Y el gen ica C (1054 pb) esta implicado en la biosintesis de PIA (J Clin Microbiol 39: 2151-2156, 2001; Infect Immun 67: 5427-5433, 1999). Por lo tanto, para seleccionar Staphylococcus aureus formador de biopelicula, se llevo a cabo la amplificacion por PCR del gen ica C con el ADN genomico preparado a partir de tres tipos de cepas de Staphylococcus aureus. Los cebadores para la PCR se prepararon como sigue

30

Tabla 4

( Cebador

Secuencia

Ica C F

ATGAAAAAGATTAGAGTTGAACTC

Ica C R

TTAATAAGCATTAATGTTCAATT

A partir de la PCR, se confirmo que una de las cepas de Staphylococcus aureus tenia el gen ica C (este Staphylococcus aureus se denomino SA1) (Figura 5). Es decir, este Staphylococcus aureus SA1 tiene presumiblemente la capacidad de formar biopelicula. Despues, se examino la formacion de biopelicula por 35 Staphylococcus aureus SA1, Precisamente, se cultivo Staphylococcus aureus SA1 en 5 mf medio TSB que contenia D-(+)-glucosa al 0,25% durante la noche El caldo de cultivo de Staphylococcus aureus SA1 se diluyo (1:50) con medio TSB que contenia D-(+)-glucosa, que fue alterado en una placa de 96 pocillos (poliestireno, Corning) en 200 pf. La placa se sometio a cultivo con agitacion a 100 rpm durante 24 horas en una incubadora a 37°C. Despues de 24 horas de cultivo, se anadieron 50 pf de medio TSB que contenia D-(+)-glucosa al 0,25% en cada pocillo de la 40 placa para complementar el medio evaporado, seguido de cultivo a 37°C durante 24 horas. Una vez completado el cultivo adicional, cada pocillo se lavo con 200 pf de PBS, seguido del examen de la formacion de biopelicula. Como se muestra en la Figura 6, el Staphylococcus aureus SA1 seleccionado formaba biopelicula.

<7-2> Actividad de eliminacion de biopelicula

Los autores de la presente invencion investigaron si el bacteriofago o la proteina litica derivada del bacteriofago de la 45 presente invencion podrian destruir la biopelicula formada por Staphylococcus aureus SA1, de acuerdo con el metodo de Wu et al. (analisis en placa de biopelicula. Antimicrob Agents Chemother 47: 3407- 3414. 2003). Concretamente, se cultivo Staphylococcus aureus SA1 en 5 mf de medio TSB que contenia D-(+)-glucosa al 0,25% durante la noche. El caldo de cultivo de Staphylococcus aureus SA1 se diluyo (1:50) con medio TSB que contenia D- (+)-glucosa, que fue alterado en una placa de 96 pocillos (poliestireno, Corning) en 200 pf. La placa se sometio a 50 cultivo con agitacion a 100 rpm durante 24 horas en una incubadora a 37°C. Despues de 24 horas de cultivo, se afiadieron 50 pf de medio TSB que contenia D-(+)-glucosa 0,25% en cada pocillo de la placa para complementar el medio evaporado, seguido de cultivo a 37°C durante 24 horas. Despues del cultivo adicional, los pocillos se lavaron

5

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35

40

con 200 p£ de PBS. La suspension de bacteriofago y la solucion de proteina litica se aiiadieron a cada pocillo de forma independiente, que se mantuvo durante 24 horas. Veinticuatro horas mas tarde, el medio fue eliminado y cada pocillo se lavo con PBS. Despues de secar la placa, se llevo a cabo la tincion con safranina con 200 p£ de safranina al 0,1% durante una hora, seguido del examen de eliminacion de la biopelicula. Los resultados se muestran en la Figura 7. En este ejemplo, se confirmo que la biopelicula formada por Staphylococcus aureus SA1 habia sido destruida por el bacteriofago SAP-1, el bacteriofago SAP-2 y aquellas proteinas liticas derivadas de los dos bacteriofagos. La solucion de proteina litica fue mas eficaz en la destruction de la biopelicula que la suspension de bacteriofago. Es decir, la proteina litica derivada de bacteriofago es mas eficaz en la destruction de la biopelicula que el propio bacteriofago. La destruccion de la biopelicula comienza con la rotura de la matriz extracelular, lo que sugiere que el bacteriofago SAP-1, el bacteriofago SAP-2 y las proteinas liticas derivadas de los dos bacteriofagos tambien son eficaces en la destruccion de la matriz extracelular de la biopelicula.

Ejemplo 8: Actividad inhibidora de la formacion de biopelicula

La actividad inhibidora de la formacion de biopelicula de la composicion que contiene bacteriofago o proteina litica derivada de bacteriofago se investigo mediante el uso de un cateter medico El cateter medico general (cateter de balon Foley recubierto con elastomero de silicona: Sewoonmedica Co. Ltd.) se corto en trozos de 1 cm, dando como resultado 15 trozos de cateter. Tres de ellos no se trataron con nada y 12 de ellos se agruparon de nuevo en cuatro, el grupo 1 se trato con PBS que contenia bacteriofago SAP-1, el grupo 2 se trato con PBS que contenia bacteriofago SAP-2, el grupo 3 se trato con PBS que contenia SAL-1, la proteina litica derivada del bacteriofago SAP-1 y el grupo 4 se trato con PBS que contenia SAL-2, la proteina litica derivado del bacteriofago SAP-2, sobre sus superficies. La concentracion de bacteriofago en la composicion que contenia el bacteriofago fue de 1 * 101Q ufp/mf y la concentracion de proteina litica en la composicion que contenia proteina litica fue de 0,005% (p/v). El tratamiento de la superficie se llevo a cabo por inmersion de esos trozos de cateter completamente en la composicion que contenia el bacteriofago o la composicion que contenia la proteina litica (una hora). Despues del tratamiento de la superficie, el caldo de cultivo de Staphylococcus aureus SA1 cultivado por el metodo del Ejemplo <7-2> se diluyo (1:50) con medio TSB que contenia D-(+)-glucosa y esta solucion diluida se pulverizo sobre la superficie de los trozos del cateter. En este momento, tambien se pulverizo el lumen del cateter. Los trozos de cateter se incubaron a continuacibn en un banco limpio a 37°C durante 24 horas utilizando el dispositivo de hibridacion. Veinticuatro horas mas tarde, para complementar el medio evaporado, se pulverizo adicionalmente medio TSB que contenia D-(+)- glucosa al 0,25%, seguido de incubacion a 37°C durante 24 horas de nuevo. Una vez completada la incubacion adicional, los trozos de cateter se cortaron longitudinalmente, seguido de lavado con PBS. Despues del lavado, se investigo la formacion de biopelicula. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

Metodo de tratamiento superficial (remojo durante 1 hora)

No tratado Tratado con composicion que contiene bacteriofago SAP-1 Tratado con composicion que contiene bacteriofago SAP-2 Tratado con composicion que contiene SAL-1 Tratado con composicion que contiene SAL-2

Resultado

+ + + — ____ —

“+“ Indica biopelicula formada, y indica biopelicula no formada. Tres de estos signos son el maximo que puede representar cada experimento. Es decir,"+++" indica que se formo biopelicula sobre los tres trozos del cateter y "—“ indica que no se formo biopelicula en ninguna de estos tres trozos del cateter.

Para el tratamiento superficial, se utilizo PBS que contenia bacteriofago o PBS que contenia la proteina litica. Se realize un experimento adicional de la misma manera que se describio anteriormente, excepto que el tratamiento superficial fue distinto. Es decir, para tratar la superficie en este experimento adicional, se utilizo gelatina sinovial ampliamente utilizada para la inyeccion de cateteres que contenia la misma concentracion de bacteriofago o de proteina litica derivada del bacteriofago en lugar de PBS A diferencia de la inmersion anterior durante una hora, esta vez solamente se unto bien. Pero el resultado fue compatible con el del experimento anterior.

5

10

15

20

25

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35

Tabla 6

Metodo de tratamiento superficial (untado con gelatina sinovial)

No tratado Tratado con composicion que contiene bacteriofago SAP-1 Tratado con composicion que contiene bacteriofago SAP-2 Tratado con composicion que contiene SAL-1 Tratado con composicion que contiene SAL-2

Resultado

+ + + ... — ... ...

"+" Indica biopelicula formada, y indica biopelicula no formada. Tres de estos signos son el maximo que puede representar cada experimento. Es decir, "+++" indica que se formo biopelicula sobre los tres trozos del cateter y "—" indica que no se formo biopelicula en ninguno de estos tres trozos del cateter.

A partir de los resultados anteriores, se confirmo que la formacion de biopelicula por Staphylococcus aureus SA1 puede ser inhibida eficazmente por las composiciones que contienen bacteriofago SAP-1, bacteriofago SAP-2 o las proteinas liticas derivadas de los dos bacteriofagos. Por lo tanto, la composicion de la presente invencion se puede utilizar eficazmente como un limpiador medico y un purificador ambiental que incluye un desinfectante.

Ejemplo 9: Aplicacion de la composicion de la presente invencion en el tratamiento de la enfermedad causada por infeccion por Staphylococcus aureus

Se seleccionaron 24 vacas lecheras con mastitis bovina causada por infeccion por Staphylococcus aureus como dianas del experimento para examinar el efecto del tratamiento sobre la mastitis del bacteriofago SAP-1, el bacteriofago SAP-2 o las proteinas liticas derivadas de los mismos. Las vacas lecheras se agruparon en 8 grupos (tres vacas por grupo), y el grupo 1 se trato con PBS que contenia bacteriofago SAP-1 a una concentracion de 1 x 10s ufp/mf, el grupo 2 se trato con PBS que contenia bacteriofago SAP-2 a una concentracion de 1 * 10s ufp/mf, el grupo 3 se trato con PBS que contenia SAL-1 a una concentracion de 0,005% (p/v), el grupo 4 se trato con PBS que contenia SAL-2 a una concentracion de 0,005% (p/v), el grupo 5 se trato con PBS que contenia tanto bacteriofago SAP-1 a una concentracion de 1 » 10s ufp/mf como bacteriofago SAP-2 a una concentracion de 1 < 10B ufp/mf, el grupo 6 se trato con PBS que contenia tanto de SAL-1 a una concentracion de 0,005% (p/v) como SAL-2 a una concentracion de 0,005% (p/v), y el grupo 7 se trato con PBS que contenia bacteriofago SAP-1 a una concentracion de 1 x 10s ufp/mf, bacteriofago SAP-2 a una concentracion de 1 * 10a ufp/mf, SAL-1 a una concentracion de 0,005% (p/v) y SAL-2 a una concentracion de 0,005% (p/v). El tratamiento se realizo por medio de inyeccion diaria a traves de la papila, y la dosis fue de 5 mf por inyeccion. El grupo de control (3 vacas lecheras) se trato con 5 mf de PBS solo de la misma manera todos los dias. El tratamiento continue durante 10 dias, durante los cuales las celulas somaticas incluidas en la leche tomada de la vaca fueron sometidas a recuento por el metodo convencional. Una vez que se desarrolla la mastitis, los leucocitos se incrementan para evitar que el patogeno, y los leucocitos muertos por la lucha con el patogeno se llaman en la presente memoria celulas somaticas. Las celulas somaticas estan compuestas por celulas epiteliales mamarias, celulas inmunitarias (linfocitos), neutrofilos y monocitos. Se utiliza el analisis directo con el microscopic, el metodo mas comun, para el recuento de las celulas somaticas. En pocas palabras, la muestra de leche se unta en 1 cm3 de portaobjetos de vidrio seco, seguido de tincion. A continuacion, las celulas somaticas se contaron directamente bajo el microscopio. El numero de celulas somaticas se multiplied por el coeficiente del microscopio para calcular el numero de celulas somaticas en 1 mf de leche. Los resultados se muestran a continuacion. En la Tabla 7, se presenta el valor medio de tres vacas lecheras de cada grupo y no se proporciona el error estandar porque cada valor no es muy diferente del valor medio,

Tabla 7

Efecto del tratamiento sobre la enfermedad causada por la infeccion por Staphylococcus aureus (numero de celulas

somaticas/1 mf de leche)

A B C D E F G H

Antes del tratamiento

4,6 x 105 5,1 x 10s 4,8 x 105 4,7 x 105 5,0 x 105 5,1 x 105 4,9 x 105 5,1 x 105

Despues del tratamiento

6,7 x 10s 1,6 x 105 1,9 x 105 2,2 x 105 1,9 x 105 1,7 x 105 1,8 x 105 1,7 x 105

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En la tabla anterior, A) indica el resultado de la inyeccion con PBS; B) indica el resultado de la inyeccior con PBS que contenia bacteriofago SAP-1; C) indica el resultado de la inyeccion con PBS que contenia bacteriofago SAP-2; D) indica el resultado de la inyeccion con PBS que contenia SAL-1, la proteina litica derivada del bacteriofago SAP- 1; E) indica el resultado de la inyeccion con PBS que contenia SAL-2, la proteina litica derivada del bacteriofago SAP-2; F) indica el resultado de la inyeccion con PBS que contenia bacteriofago SAP-1 y bacteriofago SAP-2; G) indica el resultado de la inyeccion con PBS que contenia SAL-1, la proteina litica derivada del bacteriofago SAP-1 y SAL-2, la proteina litica derivada del bacteriofago SAP-2 y H) indica el resultado de la inyeccion con PBS que contenia bacteriofago SAP-1, bacteriofago SAP-2, SAL-1, la proteina litica derivada del bacteriofago SAP-1 y SAL-2, la proteina litica derivada del bacteriofago SAP-2.

Como se muestra en los resultados anteriores, solamente la inyeccion con la composicion que contenia bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago de la presente invencion fue significativamente eficaz en el tratamiento de la mastitis. Por lo tanto, se sugirio que la composicion que contenia bacteriofago o proteina litica derivada del bacteriofago de la presente invencion podria ser eficaz tambien en el tratamiento de otra enfermedad infecciosa causada por Staphylococcus aureus. Tambien se confirmo que el tratamiento individual de cada bacteriofago y proteina litica derivada del mismo era tan eficaz como el tratamiento combinado del bacteriofago y la proteina litica derivada del mismo, pero el tiempo para el efecto completo se acortaba con el tratamiento combinado. Los resultados de B) - E) de la Tabla 7 se obtuvieron los dias 9° a 10° del tratamiento y los resultados de F) - H) se obtuvieron los dias 7° a 8° del tratamiento. La dosis eficaz utilizada para F) - H) fue mayor que para B) - F). La concentracion de bacteriofago utilizado para F) se redujo a la mitad para hacer la cantidad total de bacteriofago igual a la utilizada para B) o C), seguido por el experimento de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Como resultado, el tiempo para el efecto completo fue similar al de antes de reducir la concentracion de bacteriofago pero mas corto que en el de caso B) o C). Por lo tanto, el tratamiento combinado podria ser mas eficaz.

Se investigo si Staphylococcus aureus aislado de las vacas lecheras con mastitis bovina podria formar biopelicula de la misma manera que se describe en el Ejemplo <7-1 >. Despues, se seleccionaron 6 vacas lecheras infectadas con el Staphylococcus aureus capaz de formar biopelicula. Las 6 vacas lecheras seleccionadas fueron agrupadas en tres (2 por grupo). Al Grupo 1 se le inyectaron los antibioticos convencionales solos, y al Grupo 2 se le inyectaron 5 mf de PBS que contenia bacteriofago SAP-1 a una concentracion de 1 x 10s ufp/mf, bacteriofago SAP-2 a una concentracion de 1 * 10s ufp/mf, SAL-1 a una concentracion de 0,005% (p/v) y SAL-2 a una concentracion de 0,005% (p/v) cada dia a traves de la papila Al Grupo 3 se le inyectaron 5 mf de PBS que contenia bacteriofago SAP-1 a una concentracion de 1 x 10s ufp/mf, bacteriofago SAP-2 a una concentracion de 1 x 108 ufp/mf, SAL-1 a una concentracion de 0,005% (p/v) y SAL-2 a una concentracion de 0,005% (p/v) junto con los antibioticos convencionales cada dia a traves de la papila. En ese memento, la composicion de la presente invencion se inyecto primero y luego se inyecto el antibiotico convencional inmediatamente despues. El antibiotico convencional utilizado en la presente memoria era crema de gentamicina ampliamente utilizada para el tratamiento de la mastitis bovina. El antibiotico comprende 70 mg de gentamicina y 2,5 mg de dexametasona en cada jeringa. Los resultados son los siguientes.

Tabla 8

Efecto del tratamiento sobre la enfermedad causada por infeccion por Staphylococcus aureus formador de biopelicula (numero de celulas somaticas/1 mf de leche)

A B C

Antes del tratamiento

4,7 x 105 5,0 x 105 4,8 x 105

Despues del tratamiento

4,3 x 105 1,8 x 106 1,7 x 105

En la tabla anterior, A) indica el resultado de la inyeccion con el antibiotico convencional solo; B) indica el resultado de la inyeccion con PBS que contenia dos tipos de bacteriofagos y dos proteinas llticas derivadas de los mismos; y C) indica el resultado de la inyeccion con PBS que contenia dos tipos de bacteriofagos y dos proteinas liticas derivadas de los mismos, junto con el antibiotico convencional.

Como se muestra en los resultados anteriores, el antibiotico convencional no fue eficaz en el tratamiento de la enfermedad infecciosa causada por Staphylococcus aureus formador de biopelicula, mientras que la composicion de la presente invencion demostro el efecto del tratamiento sobre la enfermedad infecciosa asociada con la biopelicula causada por Staphylococcus aureus formador de biopelicula Por lo tanto, la composicion de la presente invencion es presumiblemente eficaz tambien en otras enfermedades infecciosas asociadas con biopelicula causadas por Staphylococcus aureus formador de biopelicula. El resultado de B) se obtuvo aproximadamente 7 dias despues del tratamiento, pero el resultado de C) se obtuvo aproximadamente 6 dias despues del tratamiento. El intervalo de

tiempo no fue tan significativo, pero sugeria que el tratamiento combinado de la composicion de la presente invencion y el antibiotico convencional podria ser mas eficaz.

Los expertos en la tecmca apreciaran que los conceptos y realizaciones especificos descritos en la descripcion anterior se pueden utilizar facilmente como base para modifcar o disenar otras realizaciones para llevar a cabo los 5 mismos fines de la presente invention.

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   I.Una composicion para la eliminacion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus que contiene bacteriofago capaz de destruir Staphylococcus aureus especificamente y eficaz en la destruction de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus como un ingrediente activo, en donde el bacteriofago es un bacteriofago del genera fagos de tipo T4 de la familia Myoviridae denominado bacteriofago SAP-1 y depositado en la Coleccion Coreana de Cultivos Tipo el 10 de Julio de 2007 bajo el Num. de Acceso: KCTC 11153BP o un bacteriofago del genera virus de tipo tp29 de la familia Podoviridae denominado bacteriofago SAP-2 y depositado en la Coleccion Coreana de Cultivos Tipo el 10 de Julio de 2007 bajo el Num. de Acceso: KCTC 11154BP.

   2 La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el bacteriofago que tiene un genoma representado por la secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias representadas por los SEQ. ID. NO: 1 a NO: 26 o por la secuencia de nucleotidos representada por el SEQ. ID NO: 29.
2. 3. Una composicion para la eliminacion de biopelicula generada por Staphylococcus aureus que contiene la proteina litica derivada del bacteriofago capaz de destruir Staphylococcus aureus especificamente y eficaz en la destruccion de la biopelicula formada por Staphylococcus aureus como un ingrediente activo, en donde la proteina litica derivada del bacteriofago tiene la secuencia de aminoacidos representada por el SEQ. ID. NO: 28 o por el SEC. ID NO: 31.
3. 4. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en donde la composicion puede ser un desinfectante, un limpiador medico o un purificador del medio ambiente.

   5 La composicion de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en donde esta es una composicion farmaceutica.
4. 6. La composicion farmaceutica de acuerdo con la Reivindicacion 5, en donde la composicion farmaceutica contiene adicionalmente un antibiotico.
5. 7. La composicion farmaceutica de acuerdo con la Reivindicacion 6, en donde el antibiotico se selecciona del grupo que consiste en lisozima, lisostafina, meticilina, oxacilina y vancomicina.
6. 8. Una composicion como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, para su uso como un medicamento.
7. 9. Una composicion como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, para el Iratamienlo de la enfermedad causada por Staphylococcus aureus capaz de formar biopelicula
8. 10. Una composicion como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, para uso de acuerdo con la Reivindicacion 9, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en mastitis, dermatitis, sepsis, trastorno supurativo, intoxicacion alimentaria, neumonia, osteomielitis, impetigo, bacteriemia, endocarditis, y enteritis.