ES2560807T3 - Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas - Google Patents

Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de conjugación de una molécula que contiene un tiol o un grupo amino a un polímero, que comprende hacer reaccionar dicha molécula con un compuesto de fórmula general: X-[NR-CO-Ar-W-(CH>=CH)n-CH>=CH2]m (Va) en la que X representa un polímero; W representa un grupo ceto; n representa 0 o un número entero de 1 a 4; m representa un número entero de 1 a 8; y Ar representa un grupo arilo insustituido o sustituido.

Description

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Se disolvieron tres reactivos PEG con pesos moleculares de 5 kDa, 10 kDa y 20 kDa en tampón de fosfato, pH 7,8, dando soluciones de concentraciones de 0,5 mg/ml, 1 mg/ml y 2 mg/ml, respectivamente.
Para cada reacción de PEGilación, se usaron 5,0 μl de la solución de Fab reducido (0,23 mg/ml) y 0,42 μl de solución PEG (1 equivalente molar con respecto a tioles de disulfuro de bisagra reducidos). Las soluciones de reacción de Fab se diluyeron también con 4,6 μl de tampón de fosfato de pH 7,8 dando un volumen final de 10 μl. Las soluciones de reacción se incubaron a 4 °C durante 12 h.
Después se llevó a cabo un análisis por SDS-PAGE sobre las soluciones de reacción usando geles NuPAGE® Novex al 4-12 % Bis-Tris, Invitrogen, N.º de cat.: NP0321BOX) y tampón de procesamiento NuPAGE MES SDS (Invitrogen N.º de cat.: NP002). Los geles se tiñeron con InstantBlue (Expedeon, N.º de cat.: ISB1L). La figura 5 más adelante muestra el resultado. El PEG en el análisis por SDS-PAGE avanza aproximadamente el doble de su tamaño real frente a marcadores de proteína, de modo que un PEG de 5 kDa avanza como una proteína de 10 kDa. Fab es una proteína de aproximadamente 50 kDa y en gel de SDS-PAGE avanza o bien como una banda única a 50 kDa cuando no está reducida o bien como una banda o dos bandas a aproximadamente 25 kDa para la forma reducida. Estas son las cadenas pesada y ligera que no se mantienen ya juntas por el disulfuro de bisagra después de reducción e incubación con SDS. Por lo tanto, aunque el Fab puede estar di-PEGilado, con lo que se une un PEG único a cada una de las dos cisteínas del disulfuro de bisagra reducido en solución, el análisis por SDS-PAGE muestra mono-PEGilación de las cadenas pesada y ligera de 25 kDa. En el carril etiquetado con 1 están los marcadores proteicos (patrones de proteínas Novex sharp, Invitrogen, N.º de cat.: LC5800). El carril 2 muestra el Fab mismo. El carril etiquetado con el 4 muestra Fab reducido con DTT (aproximadamente 25 kDa). El carril 5 muestra el resultado de PEGilación de 5kDa con el producto primario correspondiendo una banda a 35 kDa a Fab PEGilado. Solo una pequeña cantidad de Fab reducido permanece a 25 kDa, lo que muestra que el Fab estaba en su mayor parte PEGilado. El carril 6 muestra el resultado de PEGilación de 10 kDa con el producto primario correspondiendo una banda por encima del marcador de 40 kDa a Fab PEGilado de 10 kDa. El carril 7 muestra el resultado de 20 kDa con el producto primario correspondiendo una banda por encima del marcador de 60 kDa a Fab PEGilado de 20 kDa. El carril 3 muestra el resultado de un intento de PEGilación sin una etapa de reducción anterior: el hecho de que no hay producto PEGilado indica que el sitio de reacción para la PEGilación es un enlace disulfuro reducido.
Ejemplo 3. PEGilación de asparaginasa con reactivo PEG 9 de 5 kDa
A 1 ml de 1 mg/ml de solución de asparaginasa (Sigma, N.º de cat.: A3809) en tampón de fosfato de sodio 20 mM que contenía NaCl 150 mM y EDTA 5 mM a pH 7,8 se añadió DTT (15,4mg) y después de agitación con vórtice durante varios segundos la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 40 min. Después se añadió dicho 1 ml de solución a una columna PD-10 (GE Healthcare, N.º de cat.: 17-0851-01) preequilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,8, que contenía NaCl 150 mM y EDTA 5 mM, recogiendo el eluyente como la fracción de carga. La columna se eluyó después con 5 x 1 ml de tampón de fosfato nuevo. Las fracciones 3 y 4 se combinaron dando 2 ml.
Se preparó una solución de 10 mg/ml de reactivo PEG 9 de 5 kDa en agua desionizada y se añadieron 2,0 μl (1,5 equivalentes de PEG a tioles libres) a 100 μl de la asparaginasa reducida. La solución se agitó en vórtice durante varios segundos y después se dispuso a 4 °C durante la noche, después de lo que se tomó una muestra para el análisis por SDS-PAGE. El resultado se muestra en la figura 6. El carril 1 muestra los marcadores proteicos usados para estimar el PM, el carril 2 muestra asparaginasa antes de la PEGilación y el carril 3 muestra la solución de reacción de asparaginasa reducida con reactivo PEG de 5 kDa. Se observa una banda fuerte correspondiente a la PEGilación de ambas cisteínas como el producto primario justo por encima del marcador proteico de 60 kDa. Una segunda banda de PM inferior está presente justo por encima del marcador proteico de 50 kDa que corresponde a la PEGilación de solo una de las dos cisteínas. Solo hay una banda muy tenue correspondiente a la asparaginasa reducida entre los marcadores proteicos de 30 y 40 kDa, lo que muestra que casi toda la proteína se había PEGilado con el reactivo PEG 9.
Ejemplo 4, PEGilación de G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos) que posee una única cisteína libre con reactivo PEG 9 con pesos moleculares de 5, 10 y 20 kDa y comparación con un PEG de 5 kDa que posee un grupo funcional maleimida.
Una solución madre de GCSF (0,66 mg/ml en tampon de fosfato de sodio 50 mM, pH 6,2, con NaCl 150 mM y EDTA 10 mM) se dividió en 5 fracciones de 100 μl cada una (G-CSF nativo y cuatro fracciones para las reacciones de PEGilación). Las fracciones se incubaron durante la noche a 4 °C con 1 equivalente molar de reactivo PEG a G-CSF. Para reactivo PEG 9 de 5 kDa y para PEG-maleimida de 5 kDa (Fluka, N.º de cat.: 63187), esto implica añadir 3,5 μl de una solución de 5 mg/ml de PEG en agua desionizada. Para reactivo PEG 9 de 10 kDa esto implica añadir 7 μl de una solución de 5 mg/ml de PEG en agua desionizada. Para reactivo PEG 9 de 20 kDa esto implica añadir 14,0 μl de una solución de 5 mg/ml en agua desionizada. Las reacciones de PEGilación se analizaron mediante SDS-PAGE (geles NuPAGE® Novex al 4-12 % Bis-Tris, tampón MES, todo de Invitrogen y tinción con Instant-Blue (Expedeon, N.º de cat.: ISB1L). El G-CSF sin reactivo PEG añadido mostró una banda entre los marcadores proteicos de 15 y 20 kDa. Para la PEGilación de 5 kDa con 9 fue visible una banda a aproximadamente 30 kDa correspondiente a G-CSF monoPEGilado de 5 kDa. Para la PEGilación de 10 kDa con 9 fue visible una banda más
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abajo de 40 kDa correspondiente a G-CSF monoPEGilado de 10 kDa. Para el resultado de PEG de 20 kDa fue visible una banda entre 50 y 60 kDa correspondiente a G-CSF monoPEGilado de 20 kDa. Para la reacción de PEGmaleimida de 5 kDa no se observó ninguna banda diferente a la del G-CSF sin reaccionar, lo que muestra que no tuvo lugar ninguna reacción con este reactivo.
Ejemplo 5. PEGilación sobre histidina en IFN -2b con una secuencia de 8 histidinas en su extremo C terminal con reactivo PEG 9 de 10 kDa y de 20 kDa.
A una solución de 20 μl de IFN α-2b (1,13 mg/ml en tampón de fosfato de sodio 10 mM que contenía EDTA 2 mM y NaCl 150 mM, pH 7,5) se añadió 1 equivalente molar de reactivo PEG 9 de 10 kDa (1,8 μl de una solución de 6 mg/ml en agua desionizada) y la solución resultante se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Se realizó también una repetición con 1 equivalente molar de reactivo PEG 9 de 20 kDa (3,3 μl de una solución de 6,6 mg/ml en agua desionizada). Ambas muestras se analizaron después mediante SDS-PAGE (geles NuPAGE® Novex al 412 % Bis-Tris, tampón MES, todo de Invitrogen y tinción con Instant-Blue (Expedeon, N.º de cat.: ISB1L). El resultado se muestra en la figura 7. En el carril etiquetado con 1 están los marcadores proteicos. El carril 2 es solo el IFN de partida. El carril 3 muestra el resultado de la reacción del reactivo PEG 9 de 10 kDa. Hay 5 bandas distintas entre los marcadores proteicos de 30 y 160 kDa correspondientes a IFN con 1 a 5 cadenas de PEG conjugadas. El carril 4 muestra el resultado de la reacción del reactivo PEG 9 de 20 kDa. Hay tres bandas distintas entre los marcadores proteicos de 60 y 110 kDa correspondientes a IFN con 1 a 3 cadenas de PEG conjugadas. El carril etiquetado como 5 es el reactivo PEG de 20 kDa que no se tiñe, de modo que no hay ninguna banda visible. El carril etiquetado como 6 es el reactivo PEG de 10 kDa que no se tiñe, de modo que no hay ninguna banda visible.
Ejemplo 6. PEGilación de un péptido (fragmento de leptina, con una única cisteína libre en la estructura) conreactivo PEG 9 de 5 kDa.
Un fragmento de leptina de 116-130 amidas de ratón (Sigma, N.º de cat.: L6788) de 1 mg se disolvió en 1 ml de tampon de fosfato de sodio 50 mM que contenía NaCl 150 mM y EDTA 10 mM a pH 7,8. Se preparó una solución de 5 mg/ml de reactivo PEG 9 de 5 kDa en el mismo tampón a pH 7,8. A 50 μl de solución de fragmento de leptina se añadieron 50 μl de tampón y 96,1 μl de la solución de PEG (3 equivalentes molares de PEG con respecto al tiol libre de la cisteína). La solución se agitó en vórtice durante varios segundos y después se dispuso a 4 ºC durante la noche, después de lo que se tomaron muestras para el análisis por RP-HPLC. La RP-HPLC consistía en una columna analítica Source 5RPC 4.6/150 (Amersham bioscience, N.º de cat.: 17511601) unida a un sistema de HPLC JASCO. El tampón A fue agua + ácido trifluoroacético al 0,05 % (grado HPLC de Fisher scientific) y el tampón B fue acetonitrilo (grado HPLC de Fisher scientific). El procedimiento fue del 100 % al 0 % de tampón A en 30 minutos con un caudal de 1 ml/min. Se realizó un seguimiento del perfil de HPLC a 214 nm y 280 nm. Los resultados para el fragmento de leptina, el reactivo PEG y la solución de reacción se muestran en la figura 8.
El fragmento de leptina tenía un tiempo de retención de 11,4 min. En la mezcla de reacción este pico desapareció y se reemplazó por un pico a 16,5 minutos, mostrando que el fragmento se había derivado con éxito.
Ejemplo 7: PEGilación y actividad biológica de un fragmento de anticuerpo de dominio marcado con polihistidina con reactivo PEG 9 de peso molecular de 20 kDa.
A 2,7 ml de una solución de fragmento de anticuerpo de dominio anti-TNF-alfa (secuencia proteica tomada de la patente WO 2005/035572 como la secuencia registrada como TAR1-5-19 en la figura 12 y expresada con una cola de seis histidinas en el extremo C terminal de la proteína, 1,5 mg/ml en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM e imidazol 350 mM, pH 7,5) se añadieron 0,3 ml de una solución de reactivo PEG en agua desionizada (40 mg/ml, 1,9 equivalentes molares con respecto a la proteína). La solución se transfirió a un dializador D-Tube™ (Novagen, N.º de cat.: 71508-3) y se dializó frente a 1 l de tampón de pH (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 20 mM) a 4 °C durante 16 h. La solución de reacción se purificó en una columna Resource S (GE Healthcare, N.º de cat.: 17-1178-01) usando un gradiente lineal durante 30 min desde acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, hasta acetato de sodio 20 mM con cloruro de sodio 700 mM, pH 4,5.
Las fracciones se recogieron y se analizaron usando SDS-PAGE y el resultado se muestra en la figura 9, se usaron geles NuPAGE® Novex de Bis-Tris al 4-12 % de N.º de cat.de Invitrogen: NP0321BOX) y tampón de proceso NuPAGE MES SDS (N.º de cat. de Invitrogen: NP002) y los geles se tiñeron con InstantBlue (N.º de cat. de Expedeon: ISB1L). El PEG en análisis por SDS-PAGE avanza aproximadamente el doble de su tamaño real frente a marcadores de proteína, de modo que un PEG de 20 kDa avanza como una proteína de 40 kDa. El fragmento de anticuerpo de dominio es una proteína de aproximadamente 12,7 kDa. En el carril etiquetado con 1 están los marcadores proteicos (patrones de proteínas Novex sharp, N.º de cat. de Invitrogen: LC5800). El carril 2 muestra solo la proteína. El carril etiquetado con 3 es la solución de reacción. Una banda de 53 kDa corresponde a proteína monoPEGilada. La DiPEG-proteína se representa mediante una banda a aproximadamente 80 kDa y existe una cantidad traza de proteína multiPEGilada en la parte superior del carril. El carril 4 muestra el fragmento de anticuerpo de dominio monoPEGilado purificado como una banda única sin ninguna contaminación de proteína no PEGilada.
Ejemplo 8. PEGilación y unión por ELISA de un Affibody anti-TNF-alfa (cisteína con 1 tiol libre) con reactivo
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A 1 ml de una solución de 1 mg/ml de Affibody anti-TNF-alfa (Affibody AB, N.º de cat.: 10.0841.01) en tampón de fosfato de sodio 50 mM que contenía NaCl 150 mM y EDTA 20 mM a pH 7,8, se añadió DTT (3,0 mg) para reducir cualesquiera enlaces disulfuro y después de agitar en vórtice durante varios segundos la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 30 min. El 1 ml de solución se cargó después a una columna PD-10 (GE Healthcare, N.º de cat.: 17-0851-01) preequilibrada con tampón de fosfato a pH 6,2 (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM y EDTA 20 mM). La columna se eluyó después con 5 x 1 ml de tampón de fosfato nuevo a pH 6,2. Las mediciones a 280 nm indicaron que las fracciones 3 y 4 contenían la proteína reducida y se combinaron para dar 2 ml. A la solución de proteína se añadieron 10 μl de una solución de hidroquinona acuosa saturada y se mezcló bien. Se preparó una solución de 20 mg/ml de reactivo PEG 9 de 20 kDa en agua desionizada y se añadieron 73 μl (1 equivalente molar de PEG con respecto a tiol de cisteína libre) al affibody tratado con DTT. La solución se agitó en vórtice durante varios segundos y después se dispuso a temperatura ambiente durante 3 h, después de lo que se tomó una muestra para el análisis por SDS-PAGE.
Después de 3 h, una cantidad significativa de proteína PEGilada se había formado de modo que la reacción de PEGilación se purificó sin permitir que la reacción se completara. La purificación se realizó usando una columna de cromatografía de intercambio catiónico Resource S (GE Healthcare, N.º de cat.: 17-1178-01) con un gradiente de sal lineal (NaCl 0-700 mM) durante 30 min con pH 4,5, fase móvil de acetato de sodio 20 mM. El resultado se muestra en la figura 10. El carril etiquetado con 1 en la figura 10 muestra los marcadores proteicos usados a un PM estimado. El carril etiquetado con 2 muestra la solución de affibody antes del tratamiento con DTT. El affibody en presencia de DTT se muestra en el carril etiquetado con 3. El carril 4 muestra el Affibody después de eliminar el DTT por medio de la columna PD-10 y son visibles dos bandas que corresponden al Affibody monomérico (cisteína con tiol libre disponible para PEGilación) y affibody dimérico (cisteínas no disponibles para PEGilación). El carril etiquetado con 5 muestra la solución de reacción de PEGilación. Una banda justo por encima del marcador proteico de 50 kDa puede observarse para el affibody monoPEGilado. El affibody monoPEGilado purificado por cromatografía de intercambio catiónico se muestra en el carril 6 como una única banda sin ninguna contaminación a partir de una proteína no PEGilada.
La actividad de unión del producto monoPEGilado purificado a TNF-α se analizó mediante un procedimiento de ELISA:
Se añadió TNF-α (10 µg/ml en Na2CO3 15 mM, NaHCO3 34,9 mM, pH 9,6) a una placa de microvaloración de 96 pocilllos (Maxisorp, Nunc) a 100 μl/pocillo y se incubó a 4 ºC durante la noche. Después se eliminó el TNF-α y se añadió PBS/BSA al 1 % a 100 μl/pocillo y se incubó durante 1 h a TA. Después se eliminó PBS/BSA al 1 % y se añadió el affibody anti-TNF-α PEGilado (0,026, 0,13, 0,65, 3,25 µg/ml en PBS/BSA al 1 %) y se incubó durante 1 h a TA. Se añadió affibody no PEGilado a los pocillos de control. La placa se lavó después tres veces con 300 μl/pocillo de PBS/Tween 20 al 0,1 % (PBS/T). Después se añadió anticuerpo anti-PEG de conejo (Epitomics, N.º de cat.: 2061-1; 1:1000 en BSA al 1 %/PBS) a 100 μl/pocillo y se incubó durante 1 h a TA. Después de tres lavados con PBS/T, se añadió anticuerpo anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Abcam, N.º de cat.: ab6721; 1:1000 en PBS/BSA al 1 %) a 100 μl/pocillo y se incubó durante 1 h a TA. Los pocillos se lavaron después tres veces con PBS/T y se añadió sustrato de 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (Sigma-Aldrich, N.º de cat.: T0440) a 100 μl/pocillo. Después de 15 min de incubación en la oscuridad, se añadió reactivo de detección (Sigma-Aldrich, N.º de cat.: 55689) a 100 μl/pocillo y se leyó la absorbancia a 650 nm.
El resultado de ELISA mostrado en la figura 11 muestra la unión específica a TNF-α mediante el affibody PEGilado, confirmando que la proteína retiene actividad post-PEGilación. En ausencia de TNF-α no hubo ninguna unión de anticuerpo anti-PEG.
Ejemplo 9. PEGilación sobre una secuencia de histidina de interferón alfa-2b (IFN α-2b) que posee una secuencia de 8 histidinas en su extremo N terminal usando reactivo PEG 9 de 20 kDa. La actividad antivírica del IFN PEGilado de 20 kDa con y sin reducción con borohidruro de sodio.
A una solución de 4,67 ml de IFN α-2b con una secuencia de 8 histidinas en el extremo N terminal (1,07 mg/ml en tampón de fosfato de sodio 50 mM que contiene NaCl 150 mM, pH 7,4) se añadieron 2,6 equivalentes molares de reactivo PEG 9 de 20kDa (217 μl de una solución de 60 mg/ml en agua desionizada) y la solución resultante se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La muestra de reacción después del análisis por SDS-PAGE (geles NuPAGE® Novex de Bis-Tris al 4-12 %, tampón de proceso MES, todos de Invitrogen y tinción con InstantBlue (N.º de cat. de Expedeon: ISB1L)) se sometió a cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (columna TOSOH DEAE, STSKgel DEAE-5PW, Supelco, N.º de cat.: 8-07164, conectada a un sistema Jasco HPLC) para purificar el IFN α-2b monoPEGilado. Las fracciones obtenidas (1 ml cada una) de la columna de intercambio iónico se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones que contenían predominantemente IFN monoPEGilado se sometieron a liofilización. El residuo resultante obtenido después de la liofilización se disolvió en tampón de fosfato de sodio 50 mM que contenía NaCl 150 mM y borohidruro de sodio 2 mM y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 h. La solución resultante se sometió después a cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60, Superdex 200, PBS 50 mM como eluyente, 1,6 ml/min de caudal y detección a 214 nm) para aislar el IFN monoPEGilado. La muestra aislada se analizó por SDS-PAGE y el resultado se muestra en la figura 12. En el carril
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se usó recién preparada o se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80 ºC hasta su uso. La solución madre de Lamß1925-933 se diluyó dos veces para dar una concentración final de 1 mg/ml (1 mM) en la mezcla de reacción de PEGilación. Se disolvió péptido el reactivo PEG 9 de 5 kDa (5 mg) en 200 μl de agua desionizada dando una solución madre de 25 mg/ml. Después de agitación con vórtice, la solución madre de reactivo PEG se usó recién preparada o se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80 ºC hasta su uso. La solución madre de PEG se diluyó cinco veces para dar una concentración final de 5 mg/ml (1 mM) en la mezcla de reacción de PEGilación. La solución madre de tampón contenía tampón de fosfato de sodio 1 M para el intervalo de pH de 6,0-8,0 y tampón de carbonato de sodio-bicarbonato 1 M para el intervalo de pH de 8,5-10,0. Para todos los valores de pH, la solución madre de tampón contenía también EDTA 10 mM e hidroquinona 381 μM. La solución madre de tampón se diluyó diez veces para dar una concentración final de agente tamponante 100 mM (fosfato de sodio o carbonatobicarbonato de sodio), EDTA 1 mM e hidroquinona 38 μM.
Cada una de las mezclas de reacción de PEGilación contenía 5 μl de solución madre de Lamß1925-933, 1 μl de solución tampón, 2 μl de solución de reactivo PEG (correspondientes a una relación molar 1:1 de reactivo PEG con respecto al péptido modelo Lamß1925-933) y 2 μl de agua desionizada para dar un volumen de reacción total de 10 μl. Después de agitación con vórtice durante varios segundos, seguida por una breve centrifugación (30 s a 5.000 x g) para recoger la solución en el fondo del tubo, las mezclas de reacción se incubaron en reposo a temperatura ambiente durante 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 16 y 24 horas. Después de la incubación a temperatura ambiente, los tubos que contenían las mezclas de reacción se dispusieron a -80 ºC y se almacenaron hasta el análisis por cromatografía en fase reversa.
Para el ensayo de cromatografía en fase reversa se usó una columna Source 5RPC ST 4.6/150 (GE Healthcare, N.º de cat.: 17-5116-01). La columna se conectó a un sistema de HPLC Jasco que comprendía una bomba de HPLC Jasco PU-980 Intelligent, una unidad de gradiente Jasco LG-980-02 Ternary, una unidad de desgasificación Jasco Degassys Populaire, un detector de UV Jasco UV-970 4-λ Intelligent, una interfaz Jasco LC-NetII/ADC para conexión a PC y una válvula de inyección manual Rheodyne 7725i. El sistema de HPLC se controló mediante un ordenador usando el paquete informático de cromatografía EZchrom SI versión 3.2.1 Build 3.2.1.34 (Agilent Technologies). El análisis del cromatograma y la exportación de datos se realizaron usando el sistema de datos de cromatografía EZchrom SI.
Se usó un sistema de tres eluyentes. El eluyente A contenía el 5 % de acetonitrilo (Far UV, grado HPLC, Fisher, N.º de cat.: A/0627/17) y ácido trifluoroacético al 0,065 % (TFA) (Acros, N.º de cat.: 139721000) en agua desionizada. El eluyente B contenía el 0,075 % de TFA en acetonitrilo, mientras que el eluyente C fue acetonitrilo al 100 %. Los eluyentes se desgasificaron por sonicación antes de su uso. El programa de elución implicó un gradiente de B del 064 % en 20 minutos, seguido por lavado en acetonitrilo al 100 % y reequilibración en eluyente A (Tabla 2). Se mantuvo un flujo constante de 1 ml/min a lo largo del proceso. Se registró la absorbancia a 215, 250, 280 y 350 nm a lo largo del proceso. Cada muestra (10 μl) se descongeló y se centrifugó brevemente (1 min a 14.000 g) inmediatamente antes de que se inyectaran 5 μl de sobrenadante en la columna de cromatografía en fase reversa.
Tabla 2: Ajustes para el programa de elución con gradiente usado para el ensayo de cromatografía en fase reversa
Tiempo (min) Caudal (ml-min-1) A (%) B (%) C (%)
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24,00 1,00 0 0 100
24,20 1,00 100 0 0
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La identidad de cada pico en los cromatogramas se confirmó procesando muestras estándar (reactivo PEG, péptido sin reaccionar reducido y oxidado) y mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica (SEC) para una estimación de tamaño relativa (para producto de PEGilación: conjugado péptido-PEG). La columna usada para SEC analítica fue una columna analítica BioSep-SEC-S3000 (300 x 7,8 mm) (Phenomenex, N.º de cat.: 00H-2146-KO). El eluyente de proceso usado fue tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0) que contenía acetonitrilo al 10 % (v/v) y el caudal se mantuvo constante a 2 ml/min a lo largo del proceso.
La figura 13 muestra cromatogramas de un experimento de PEGilación a través del tiempo a pH 6,5, usando 1 equivalente molar de reactivo PEG 9 de 5 kDa. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, eran visibles cinco picos: el péptido reactivo con PEG Lamß1925-933 (pico 1); un dímero de péptido no reactivo formado mediante formación de disulfuro (pico 2); el grupo saliente de ácido sulfónico del reactivo PEG 9 (pico 3, compuesto 11 en la figura 14); un pico correspondiente al producto peptídico PEGilado (conjugado PEG-Lamß1925-933 de 5 KDa) (pico 4) y el reactivo PEG 9 (pico 6, forma no reactiva).
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Después de 4 horas de incubación, todo el péptido libre (pico 1) se había consumido según se completó la PEGilación. Algún pico de reactivo PEG activado en exceso (pico 5, compuesto 10 en la figura 14) también está presente debido a que alguno de los péptidos formó un dímero no reactivo (pico 2, nótese que el reactivo PEG absorbe más fuertemente que el péptido a concentraciones equivalentes). El Lamß1925-933 oxidado (pico 2) no podía estar PEGilado ya que no posee ningún tiol libre y por lo tanto, su pico correspondiente (pico 2) permaneció sin cambios durante el transcurso del experimento. Este resultado es coherente con la PEGilación del tiol de cisteína que tiene lugar en el péptido reducido.
La reactividad del reactivo PEG 1 hacia Lamß1925-933 a entre pH 6,0 y pH 8,0 se evaluó midiendo la conversión del péptido (pico 1) a producto de Lamß1925-933 PEGilado de 5 kDa (pico 4). Los resultados de los picos del péptido se normalizaron asignando el valor de 100 al área del pico calibrado correspondiente a la cantidad total de péptido usada en cada reacción de PEGilación, mientras que los resultados de los picos del producto se normalizaron usando un área de pico de producto máxima deducida correspondiente a la conversión total del péptido en producto. La conversión (%) se definió como la proporción de péptido PEGilado con respecto a la cantidad inicial de péptido usada en la reacción. El resultado se muestra en la figura 15. A pH de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0 todo el péptido se PEGiló. La velocidad hasta completar la reacción depende del pH, cuanto mayor sea el pH, más rápida será la velocidad y refleja la diferente velocidad de formación de la estructura reactiva 10 (figura 14) a diferentes pH.
Ejemplo 12. Comparación de la reactividad de reactivo PEG 9 y una PEG-maleimida disponible comercialmente a pH variable.
La reactividad de reactivo PEG 9 hacia el péptido Lamß1925-933 del ejemplo 11 se comparó con un reactivo PEG reactivo con tiol disponible comercialmente, PEG maleimida (O-(2-maleimidoetil)-Ω’-metil-polietilenglicol 5.000, Fluka, N.º de cat.: 63187). Para asegurar que el reactivo PEG 9 estaba inmediatamente disponible para la reacción en la escala temporal del experimento, se dejó al reactivo formar en primer lugar la forma reactiva con tiol (reactivo 10, figura 14) mediante incubación a pH 7,5 (2 horas, 4 °C) y el reactivo 10 se aisló mediante cromatografía en fase reversa antes de su conjugación con el péptido. Todas las reacciones de péptidos se llevaron a cabo con reactivo PEG recién disuelto. Brevemente, la solución de reacción de PEGilación (escala de reacción 10 μl) contenía 10 μg de Lamß1925-933, 50 μg de reactivo PEG (5 kDa) (correspondiente a una relación molar 1:1 de reactivo PEG con respecto al péptido modelo Lamß1925-933) en tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 6,0-8,0) o carbonatobicarbonato de sodio 100 mM (pH 8,5-10,0) y EDTA 1 mM. Después de la incubación a temperatura ambiente, las mezclas de reacción se analizaron mediante cromatografía en fase reversa como se ha descrito previamente en el ejemplo 11. El resultado se muestra en la figura 16. Para reactivos PEG 9 (pH 9,0 a 10) y 10 (pH 6,0 a 8,0), la conversión total del péptido a la forma PEGilada pudo lograrse entre pH 6,0 y pH 10 en un periodo de 15 minutos.
Para la conversión del reactivo PEG-maleimida solo se alcanzó un máximo del 78,9 % después de 15 minutos. A pH superior, la conversión fue incluso inferior (51,2 a pH 10). Se tomaron muestras de la reacción de PEG-maleimida a pH 8,5 de nuevo después de 16 h y todo el péptido se había consumido.
A todos los valores de pH analizados por lo tanto, los reactivos PEG 9 y 10 eran más eficaces que el reactivo de PEG-maleimida.
Ejemplo 13. Estabilidad de un conjugado peptídico de reactivo PEG 9 y comparación con un conjugado peptídico derivado de PEG-maleimida.
La estabilidad de conjugados de péptido Lamß1925-933 purificados preparados a partir de reactivo PEG 9 y PEGmaleimida del ejemplo 12 se compararon a lo largo de 12 días. La estabilidad de los conjugados se determinó realizando un seguimiento del área del pico de PEG-péptido usando cromatografía en fase reversa tal como se ha descrito en el ejemplo 11.
Síntesis de Lamß1925-933 PEGilado con reactivo PEG 9: el conjugado se preparó usando un procedimiento modificado del ejemplo 11 (pH 6,0 usando una concentración peptídica final de 1,6 mg/ml y 0,4 mg de péptido). El producto se aisló mediante cromatografía en fase reversa. El pico de elución correspondiente al conjugado Lamß1925-933-PEG se recogió, se liofilizó y subsiguientemente se resuspendió en agua desionizada. Finalmente, se añadieron 2 mM de borohidruro de sodio (Acros Organics, N.º de cat.: 200050250) y después la muestra se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,5). Síntesis de Lamß1925-933 PEGilado con PEG-maleimida: se usó Lamß1925-933 (0,4 mg) para la PEGilación con reactivo PEGmaleimida de 5 kDa (5 kDa, Fluka, N.º de cat.: 63187). Brevemente, se añadieron 20 μl de solución madre de tampón 10 x (que contenía tampón de fosfato de sodio 1 M (pH 8,0) y EDTA 10 mM) y 40 μl de solución madre de reactivo PEG (25 mg/ml en agua desionizada) a 200 μl de solución madre de péptido (2 mg/ml en agua desionizada). Después de incubación de 1,5 horas a temperatura ambiente, el producto se purificó usando cromatografía en fase reversa tal como se describe en el ejemplo 11. La muestra del pico de elución se liofilizó y subsiguientemente se resuspendió en agua desionizada y después se añadió tampón de fosfato de sodio 50 mM para ajustar el pH a 8,0. Se usó cromatografía en fase reversa para asegurar que las concentraciones de ambas solución de PEG-péptido fueran aproximadamente iguales.
Ambas muestras de estabilidad se incubaron a temperatura ambiente. Después de 12 días, las muestras se
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analizaron mediante RPC analítica y la estabilidad determinada con el cambio en el área de integración para los picos del conjugado se muestra en la figura 17. El conjugado derivado de reactivo PEG 9 permaneció estable a lo largo de 12 días. Para el conjugado derivado de PEG-maleimida, solo permaneció el 63 % en el cromatograma que mostraba que el reactivo PEG 9 conduce a un producto más estable.
Ejemplo 14. PEGilación usando PEG funcionalizado en ambos extremos – reactivo PEG 12.
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Se preparó reactivo PEG 12 de un modo análogo al reactivo PEG 9 usando O,O’-bis(2-aminoetil)polietilenglicol 6000 (Fluka, N.º de cat.: 14504) y se dejó reaccionar con el péptido modelo del ejemplo 11 (Lamß1925-933). Se añadieron agua (6 μl), 2 μl de 10 x solución madre de tampón (que contenía tampón de fosfato de sodio 1 M (pH 8,0), 381 μM de hidroquinona y EDTA 10 mM) y 2 μl de reactivo PEG 12 (25 mg/ml) a 10 μl de solución madre de Lamß1925-933 (2 mg/ml en agua desionizada). Esto correspondió a una relación molar de 1:0,375 de péptido modelo con respecto al reactivo PEG. La solución de reacción (5 μl) se analizó mediante RPC analítica (tal como se describe en el ejemplo 11) después de 2,5 h de incubación a temperatura ambiente. Todos los componentes de la solución de reacción eluyeron como picos separados: El monómero Lamß1925-933 eluyó a 8,1 min, el dímero de Lamß1925-933 oxidado eluyó a 8,9 min, el reactivo PEG no activado eluyó a 17,3 min, el reactivo PEG activado eluyó a 15,7 min y el grupo saliente 11 a 10,1 min. El pico del producto eluyó a 14,2 minutos. Después de 2,5 h, el 65 % del Lamß1925-933 libre presente (86 % de reacción en el reactivo 12) en la solución de reacción se había conjugado mostrando que ambos extremos reactivos del reactivo PEG 12 experimentan reacción y que este reactivo bifuncional puede usarse exitosamente para unir una molécula peptídica en ambos extremos de una molécula de PEG.
Ejemplo 15. Uso de poli(1-vinil-2-pirrolidona) (PVP) como el componente polimérico: conjugación de PVP con péptido modelo Lamß1925-933.
Preparación de reactivo PVP (3 etapas):
Etapa 1: PVP con un grupo amino terminal: un tubo a presión se cargó con cisteamina (0,028 g), dioxano (8 ml) y una barra de agitación magnética. Después de un suave calentamiento para permitir formar una solución, la solución se purgó con argón a temperatura ambiente durante 5 min. Mientras aún se purgaba, se añadió después 1-vinil-2pirrolidona (2,0 g) y después de otros 5 min se continuó añadiendo 2,2’-azobis(2-metilpropionitrilo) (0,089 g). Después de otros 2 min el tubo a presión se selló con un tapón roscado en atmósfera de argón y se dispuso en un baño de aceite a 60 °C durante 17 h con agitación. Después de dejar enfriar el tubo y su contenido a temperatura ambiente, se añadió dietiléter (15 ml), lo que causó la precipitación del producto polimérico. La fase líquida se retiró por decantación y el residuo sólido se volvió a disolver en acetona (3 ml). La solución de acetona resultante se añadió después gota a gota a dietiléter (25 ml) con agitación rápida y el precipitado se aisló en un embudo de vidrio sinterizado N.º: 2 con un pulso repentino de vacío ligero. El sólido se lavó con dietiléter recién preparado (10 ml) y después se dejó secar al vacío a temperatura ambiente (masa = 1,44 g, sólido blanco).
Etapa 2 – Conjugación de grupo terminal reactivo proteico a PVP-amina: se mezclaron PVP-amina (500 mg), ácido 4-(3-tosilpropanoil)benzoico (estructura 6 en la figura 3, 166 mg) y 4-dimetilaminopiridina (6 mg) con diclorometano anhidro (10 ml) en atmósfera de argón y con agitación se añadió después 1,3-diisopropilcarbodiimida (155 μl). La mezcla resultante se dejó en agitación durante un fin de semana a temperatura ambiente. Los compuestos volátiles se evaporaron durante el fin de semana, de modo que el residuo sólido se volvió a disolver en diclorometano (10 ml) y después se filtró a través de una lana de algodón no absorbente. Al filtrado se añadió después dietiléter (30 ml) y el precipitado resultante se aisló por centrifugación (4.600 rpm, -9 °C, 10 min). La fase líquida se separó por decantación y el residuo remanente se volvió a disolver en diclorometano (10 ml). El procedimiento de purificación por precipitación de dietiléter se repitió dos veces más y el residuo se dejó secar al vacío (513 mg). Las señales de RMN de diagnóstico para el grupo de engarce conjugado a PVP tuvieron lugar a 7,97, 7,82, 7,59 y 7,38 en CDCl3.
Etapa 3 – Fraccionamiento de reacción PVP: una porción (120 mg) del material sólido obtenido en la etapa anterior se mezcló con tampón de acetato de sodio acuoso 20 mM, NaCl 150 mM, pH 4,0 y después se centrifugó a 13.000 rpm hasta que fue visible una solución transparente y la fase líquida se filtró en 0,45 μm. El filtrado después se
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fraccionó (se cargaron 1,9 ml) en una columna de exclusión por tamaño de grado 200 prep HiLoad 16/60 Superdex™ (GE Healthcare) funcionando a tampón de acetato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 4,0 a 1 ml/min, recogiendo fracciones cada 1 min durante la elución del pico. La fracción que eluyó entre 73,9 y 74,9 min se usó para la conjugación de proteína después de liofilización. La reacción del péptido se llevó a cabo en tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 8,0) que contenía EDTA 1 mM, hidroquinona 38 μM, Lamß1925-933 1,03 mM y un exceso de reactivo PVP. La mezcla de reacción se analizó mediante RPC analítica tal como se describe en el ejemplo 11. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, aproximadamente el 60 % del péptido modelo Lamß1925-933 libre presente en la mezcla de reacción se convirtió en conjugado Lamß1925-933-PVP (tiempo de retención de RPC de 11,3 min) que demuestra exitosamente que pueden usarse polímeros diferentes a PEG.
Ejemplo 16. Síntesis y uso de un reactivo PEG con un grupo saliente L basado en amina.
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Síntesis de reactivo PEG 13: el reactivo PEG 13 (figura 19) se preparó a partir de la conjugación directa de compuesto 2 (26 mg) con mPEG de 5 kDa-NH2 (40 mg) en DMSO (5 ml) usando DIPC (11 mg) en un procedimiento análogo al del ejemplo 1 para proporcionar un sólido blancuzco (31 mg). El espectro de RMN del producto (en CDCl3) dio señales de diagnóstico a 8,02 y 7,59 ppm.
Reacción con el péptido modelo Lamß1925-933 del ejemplo 11: la reacción se llevó a cabo en tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 7,5) que contenía EDTA 1 mM, hidroquinona 38 pM, Lamß1925-933 1,03 mM y 3 equivalentes molares de reactivo PEG 13. La mezcla de reacción se analizó por RPC analítica tal como se describe en el ejemplo
11. El Lamß1925-933 monomérico eluyó a 8,1 min, el Lamß1925-933 dimerizado eluyó a 8,9 min, el grupo saliente de amina eluyó a 9,3 min, el reactivo PEG 13 sin grupo saliente amina a 15,2 min, el reactivo PEG 13 a 15,75 min y el pico del producto a 14,2 min. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, aproximadamente el 10 % del péptido modelo Lamß1925-933 libre presente en la mezcla de reacción se convirtió en conjugado Lamß1925-933-PEG.
Ejemplo 17. La PEGilación del tiol y la actividad de IL-1-Ra usando reactivo PEG 9
Una forma no glucosilada recombinante del antagonista del receptor de interleucina 1 humana (IL-1-Ra) se usó como una proteína modelo. La IL-1-Ra consiste en 153 aminoácidos, dos enlaces disulfuro (Cys69/Cys116 y Cys66/Cys122), tiene un peso molecular de 17,3 kDa y contiene una cola de hexahistidina N-terminal.
Una serie de PEGilaciones de tiol se llevó a cabo usando 1-4 equivalentes molares de reactivo PEG 9 de 10 kDa en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,0 y 7,5). Debido a que la proteína se expresaba reducida, la reducción de los disulfuros antes de la PEGilación no fue necesaria. La concentración de proteína fue de 0,1 mg/ml. Después de 1 hora de incubación a 4 °C, se tomaron muestras para el análisis por SDS-PAGE y el resultado se muestra en la figura 18. A ambos pH de 6,0 y 7,5, el producto principal de la reacción de PEGilación fue IL-1-Ra monoPEGilado cuando se usó 1 equivalente molar de reactivo PEG. Una banda tenue correspondiente a un producto di-PEGilado también puede observarse, así como una banda correspondiente a un IL1-Ra no PEGilado. Aumentar los equivalentes molares de PEG usados en la reacción dio como resultado un aumento de especies di-, tri-y tetra-PEGiladas. Una PEGilación a gran escala a pH 6,0 se realizó después usando 1,5 mg de IR-1-Ra (0,2 mg/ml) y 1,5 equivalentes molares de reactivo PEG 9 de 20 kDa en tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0 que contenía EDTA 20 mM. La solución se agitó con vórtice brevemente y se dispuso a 4 °C durante 2 horas. El IL-1-Ra PEGilado se purificó mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) y cromatografía de exclusión por tamaño. Antes de la IMAC, se eliminó el EDTA mediante ciclos repetidos de concentración y dilución con tampón de fosfato recién preparado a pH 7,4 usando un dispositivo de centrifugación por ultrafiltración Amicon ultra-4 3.000 Da MWCO (Millipore, N.º de cat.: UFC 800324). Finalmente, la muestra se concentró a 4 ml y se trató con borohidruro de sodio 2 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente y seguidos por carga en una columna HisTrap HP (1 ml) (GE Healthcare, N.º de cat.: 17-5247-01) preequilibrada con solución salina de tampón de fosfato (PBS) a pH 7,4. La columna se lavó con 20 ml de PBS y la elución implicó un gradiente de PBS a PBS que contenía imidazol 500 mM en 40 minutos. Las fracciones (1 ml) de eluato se recogieron y una parte alícuota de cada fracción se analizó por SDS-PAGE para identificar las fracciones que contenían el producto PEGilado. Subsiguientemente, las fracciones que contenían el producto PEGilado se combinaron conjuntamente y se concentraron mediante ultrafiltración (Amicon ultra-4 3.000 Da MWCO) a un volumen final de 0,6 ml. Las fracciones de IMAC concentradas se cargaron
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en una columna HiLoad Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, N.º de cat.: 17-1069-01) que se preequilibró con PBS a pH 7,4. El caudal se mantuvo a 1 ml/min a lo largo del funcionamiento y los productos mono-PEGilados eluyeron a aproximadamente 62 min. Las fracciones (1 ml) se recogieron alrededor del pico de elución y una parte alícuota de cada fracción se analizó mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían producto mono-PEGilado puro se concentraron mediante ultrafiltración y se volvieron a analizar mediante SDS-PAGE para confirmar la pureza y el resultado se muestra en el carril 2 de la figura 19. El gel muestra una única banda correspondiente a proteína mono-PEGilada y nada de proteína libre es visible.
Después de cuantificación por espectrofotometría UV, la muestra se analizó en actividad biológica in vitro evaluando la inhibición de la liberación de IL-6 dependiente de IL-1 en células MG-63. Se añadieron células MG-63 a 20.000 células/pocillo en 100 μl de DMEM/FCS al 10 %. Al día siguiente, se retiró el medio y se añadieron 50 μl/pocillo de medio recién preparado. Las muestras se añadieron en una dilución de 5 veces por duplicado (25 μl/pocillo), se preincubaron durante 1 h después se añadió IL-1 a una concentración final de 0,3 ng/ml (25 μl/ml). La placa se incubó durante 24 h adicionales. Para evaluar la viabilidad celular, se añadieron 10 μl de bromuro de tiozolil-azultetrazolio (MTT; 5 mg/ml en DMEM; Sigma-Aldrich, N.º de cat.: M5655) a cada pocillo y se incubó durante 3 h. Después la placa se centrifugó a 1.500 g durante 5 min y el medio se aspiró cuidadosamente. El producto de formazán en células con actividad metabólica se disolvió después en DMSO (100 μl/pocillo) y la absorbancia se midió a 570 nm. El resultado se muestra en la figura 20 y muestra que el IL-1Ra PEGilado mantenía actividad inhibidora después de PEGilación con el reactivo 9.
Ejemplo 18. PEGilación sobre una secuencia de polihistidina de IL-1Ra usando reactivo PEG 9 y actividad de la proteína PEGilada
El IL-1Ra del ejemplo 17 se PEGiló también en la cola de polihistidina después de oxidar las cisteínas exentas de proteína a disulfuros con sulfato de cobre antes de la reacción de PEGilación como sigue: se añadió sulfato de cobre (1 mM) a 2,5 ml de solución de IL-1Ra (0,6 mg/ml, 1,5 mg de IL-1-Ra) en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 200 mM. Después de incubación durante 16 horas a 4 °C, se añadió EDTA 25 mM y la muestra se cargó en una columna PD-10 (GE Healthcare) preequilibrada con tampón de fosfato de sodio 50 mM pH 7,5 que contenía EDTA 20 mM. La columna se eluyó después con 3,5 ml de tampón de fosfato nuevo. La concentración proteica usada para la PEGilación fue 0,43 mg/ml y el pH 7,4 y se incubó durante 16 horas a 4 °C. Reactivo PEG 9 (20 kDa) a 1,5 equivalentes molares con respecto a la proteína. La reacción se incubó durante 16 h a 4 °C. Las especies monoPEGiladas se aislaron usando la misma cromatografía que se describe en el ejemplo 17 junto con el tratamiento de borohidruro de sodio. El resultado de SDS-PAGE del producto se muestra en el carril 2 de la figura 19 donde no puede observarse nada de proteína libre. La bioactividad del producto se evaluó midiendo la inhibición de la liberación de IL-6 dependiente de IL-1 en células MG-63 tal como se describe en el ejemplo 17 y el resultado se muestra en la figura 20. El IL-IRa pegilado poseía actividad inhibidora en el ensayo.
Ejemplo 19: síntesis de reactivo PEG: síntesis de reactivo PEG 15 de 10 kDa.
Se preparó reactivo de ácido 4-(3-(2-hidroxietilsulfonil)propanoil)benzoico PEGilado 15 a partir de ácido 4-(3-(2hidroxietilsulfonil)propanoil)benzoico 14 de un modo análogo al descrito para la síntesis de ácido 4-(3tosilpropanoil)benzoico PEGilado 9 en ejemplo 1, tal como se muestra en la fig. 21. En primer lugar, se preparó ácido 4-(3-(2-hidroxietilsulfonil)propanoil)benzoico 14 de un modo análogo al ácido 4-(3-tosilpropanoil)benzoico pero usando mercaptoetanol en lugar de 4-metilbencenotiol (etapa 2, ejemplo 1). RMN 14 (400 MHz) δ 3,35 (t, 2H, COCH2), 3,5 (m solapado, 4H, CH2SO2CH2), 3,8 (t, 2H, CH2OH), 5,2 (s ancho, CH2OH), 8,05 (m, 4H, CH aromático), 13,4 (s ancho, 1H, COOH). Para la etapa de conjugación a PEG, la sulfona 14 (143 mg) y O-(2-aminoetil)-O’-metil-PEG (PM: 10 kDa, 1 g, BioVectra) se disolvieron en tolueno seco (5 ml). El disolvente se eliminó al vacío sin calentamiento y el residuo sólido seco se volvió a disolver después en diclorometano seco (10 ml) en atmósfera de argón. A la solución resultante, enfriada en un baño de hielo, se añadió lentamente diisopropilcarbodiimida (DIPC, 87 mg) en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se mantuvo después en agitación a temperatura ambiente durante toda la noche (15 h). Los productos volátiles se eliminaron después al vacío (30 °C, baño de agua) para proporcionar un residuo sólido que se volvió a disolver con calentamiento suave (35 °C) en acetona (45 ml). La solución se filtró a través de lana de algodón no absorbente para eliminar material insoluble. La solución se enfrió después en un baño de hielo seco para dar un precipitado blanco que se separó mediante centrifugación (4600 rpm, 30 min). La fase líquida se retiró por decantación y este procedimiento de precipitación se repitió tres veces. Después el sólido blancuzco resultante se secó al vacío para proporcionar el reactivo PEG 15 (1 g). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 3,30 (t, 2H, COCH2), δ 3,40 (s, 3H, PEG-H3), δ 3,40 – 3,85 (m ancho, PEG), δ 3,50 (m solapado, 2 x 2H, CH2SO2CH2), δ 3,80 (t, 2H, CH2OH), δ 7,95, δ 8,05 (2 x d, 2 x 2H, ArH de resto de ácido carboxílico).
Reactivos PEG análogos de diferentes pesos moleculares de PEG se prepararon mediante el mismo procedimiento general. Así, se preparó PEG de 5 kDa mediante reacción de la sulfona 14 (256 mg), O-(2-aminoetil)-O’-metil-PEG (5 kDa, 1 g, Biovectra) y DIPC (174 mg) en diclorometano seco (15 ml) proporcionando después del procedimiento de purificación por precipitación en acetona un sólido blancuzco 15 (1 g).
Ejemplo 20: síntesis de reactivo PEG: síntesis de reactivo PEG 17 de 10 kDa.
Se preparó reactivo PEG 17 a partir de reactivo PEG 9 como sigue (figura 22): Se dejó reactivo PEG 9 (10 kDa, 75
mg) en agitación con ácido mercaptosuccínico (6 mg) e hidrogenocarbonato de sodio (20 mg) en agua desionizada (2 ml) durante aproximadamente 18 h. Los productos volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio y el residuo sólido se volvió a disolver en acetona caliente (4 ml) con productos insolubles eliminados por filtración a través de lana de algodón no absorbente. Después el producto se precipitó a partir de la acetona enfriando la solución en un 5 baño de hielo seco y después se aisló retirando por decantación la fase líquida tras centrifugación. La precipitación de acetona se repitió otras tres veces y el sólido se secó después al vacío dando 16 (51 mg). El compuesto 16 (40 mg) se oxidó después a la forma de sulfona 17 mezclándolo con oxone en metanol:agua 1:1 (1 ml) durante aproximadamente 18 h. La mezcla se diluyó después con acetona (10 ml) y los productos insolubles se eliminaron después por filtración por gravedad a través de lana de algodón no absorbente. El filtrado homogéneo se evaporó a
10 sequedad en un evaporador rotatorio y después se volvió a disolver en acetona (2 ml) con 2 gotas de HCl 1 N añadidas y después se aisló mediante una precipitación con acetona sencilla como se describe para 16 (mg). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 3,24-3,08 (m solapado, CH2CH, COCH2), 3,38 (s, PEG-OCH3), 3,44 a 3,84 (s ancho, m solapado, PEG y CH2SO2), 4,44 (dd, SO2CH), 7,45 (s ancho, NH), 7,98 y 8,06 (2 x d, 4H, ArH de resto de ácido carboxílico).
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