ES2536882T3 - Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas - Google Patents

Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas Download PDF

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Abstract

Un compuesto de la fórmula general: X-[NR-CO-Ar-W-(CH>=CH)n-(CH2)2-L]m (I) en la que representa un polímero; Ar representa un grupo heteroarilo o arilo opcionalmente sustituido; R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo; W representa un grupo ceto CO; n representa 0 o un número entero de 1 a 4; L representa un grupo saliente; y m representa un número entero de 1 a 8.

Description

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mM e imidazol 350 mM, pH 7,5) se añadieron 0,3 ml de una solución de reactivo PEG en agua desionizada (40 mg/ml, 1,9 equivalentes molares con respecto a la proteína). La solución se transfirió a un dializador D-Tube™ (Novagen, Nº de cat. 71508-3) y se dializó frente a 1 l de tampón a pH 6,2 (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 20 mM) a 4 °C durante 16 h.
La solución de reacción se purificó en una columna Resource S (GE Healthcare, Nº de cat. 17-1178-01) usando un gradiente lineal en 30 min desde acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, hasta acetato de sodio 20 mM con cloruro de sodio 700 mM, pH 4,5.
Las fracciones se recogieron y se analizaron usando SDS-PAGE y el resultado se muestra en la figura 9. Se usaron geles NuPAGE® Novex al 4-12 % Bis-Tris, Invitrogen, Nº de cat. NP0321BOX) y tampón de proceso NuPAGE MES SDS (Invitrogen, Nº de cat. NP002) y los geles se tiñeron con InstantBlue (Expedeon, Nº de cat. ISB1L). El PEG en el análisis por SDS-PAGE avanza aproximadamente el doble de su tamaño real frente a marcadores de proteína, de modo que un PEG de 20 kDa avanza como una proteína de 40 kDa. El fragmento de anticuerpo de dominio es una proteína de aproximadamente 12,7 kDa. En el carril etiquetado con 1 están los marcadores proteicos (patrones de proteínas Novex sharp, Invitrogen, Nº de cat. LC5800). El carril 2 muestra solo la proteína. El carril etiquetado con 3 es la solución de reacción. Una banda de 53 kDa corresponde a proteína monoPEGilada. La DiPEG-proteína se representa mediante una banda a aproximadamente 80 kDa y existe una cantidad traza de proteína multiPEGilada en la parte superior del carril. El carril 4 muestra el fragmento de anticuerpo de dominio monoPEGilado como una única banda sin ninguna contaminazión de proteína no PEGilada.
Ejemplo 8. PEGilación y unión por ELISA de un Affibody anti-TNF-alfa (cisteína con 1 tiol libre) con reactivo PEG 9 de 20 kDa.
A 1 ml de una solución de 1 mg/ml de Affibody anti-TNF-alfa (Affibody AB, Nº de cat. 10.0841.01) en tampon de fosfato de sodio 50 mM que contenía NaCl 150 mM y EDTA 20 mM a pH 7,8, se añadió DTT (3,0 mg) para reducir cualesquiera enlaces disulfuro y después de agitar en vórtice durante varios segundos la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 30 min. El 1 ml se cargó después a una columna PD-10 (GE Healthcare, Nº de cat. 17-0851-01) preequilibrada con tampón de fosfato a pH 6,2 (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM y EDTA 20 mM). La columna se eluyó después con 5 x 1 ml de tampón de fosfato nuevo a pH 6,2. Las mediciones a 280 nm indicaron que las fracciones 3 y 4 contenían las proteína reducida y se combinaron para dar 2 ml. A la solución de proteína se añadieron 10 μl de una solución de hidroquinona acuosa saturada y se mezcló bien. Se preparó una solución de 20 mg/ml de reactivo PEG 9 de 20 kDa en agua desionizada y se añadieron 73 μl (1 equivalente molar de PEG con respecto a tioles de cisteína libres) al Affibody tratado con DTT. La solución se agitó en vórtice durante varios segundos y después se dispuso a temperatura ambiente durante 3 h, después de lo cual se tomó una muestra para el análisis por SDS-PAGE.
Después de 3 h, una cantidad significativa de proteína PEGilada se había formado, de modo que la reacción de PEGilación se purificó sin permitir que la reacción se completara. La purificación se realizó usando una columna de cromatografía de intercambio catiónico Resource S (GE Healthcare, Nº de cat. 17-1178-01) con un gradiente de sal lineal (NaCl 0-700 mM) en un periodo de 30 min con pH 4,5, fase móvil de acetato de sodio 20 mM. El resultado se muestra en la figura 10. El carril etiquetado con 1 en la figura 10 muestra los marcadores proteicos usados a un PM estimado. El carril etiquetado con 2 muestra la solución de Affibody antes del tratamiento con DTT. El Affibody en presencia de DTT se muestra en el carril etiquetado con 3. El carril 4 muestra el Affibody después de eliminar el DTT por medio de la columna PD-10 y son visibles dos bandas que corresponden al Affibody monomérico (cisteína con tiol libre disponible para PEGilación) y Affibody dimérico (cisteínas no disponibles para PEGilación). El carril etiquetado con 5 muestra la solución de reacción de PEGilación. Una banda justo por encima del marcador proteico de 50 kDa puede observarse para el Affibody monoPEGilado. El Affibody purificado por cromatografía de intercambio catiónico se muestra en el carril 6 como una única banda sin ninguna contaminación a partir de una proteína no PEGilada.
La actividad de unión del producto monoPEGilado purificado a TNF-se analizó mediante un procedimiento ELISA:
Se añadió TNF-(10 ug/ml en Na2CO3 15 mM, NaHCO3 34,9 mM, pH 9,6) a una placa de microvaloración de 96 pocilllos (Maxisorp, Nunc) a 100 μl/pocillo y se incubó a 4 °C durante la noche. Después se eliminó el TNF-y se añadió PBS/1 % de BSA a 100 μl/pocillo y se incubó durante 1 h a TA. Después se eliminó el PBS/1 % de BSA y se añadió el Affibody anti-TNF-(0,026, 0,13, 0,65, 3,25 ug/ml en PBS/1 % de BSA) y se incubó durante 1 h a TA. Se añadió Affibody no PEGilado a los pocillos de control. La placa se lavó después tres veces con 300 μl/pocillo de PBS/0,1 % de Tween 20 (PBS/T). Después se añadió anticuerpo de conejo anti-PEG (Epitomics, Nº de cat. 2061-1; 1:1000 en el 1 % de BSA/PBS) a 100 μl/pocillo y se incubó durante 1 h a TA. Después de estos tres lavados con PBS/T, se añadió anticuerpo anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Abcam, Nº de cat. ab6721; 1:1000 en PBS/1 % de BSA) a 100 μl/pocillo y se incubó durante 1 h a TA. Los pocillos se lavaron después tres veces con PBS/T y se añadió sustrato de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (Sigma-Aldrich, Nº de cat. T0440) a 100 μl/pocillo. Después de 15 min de incubación en la oscuridad, se añadió reactivo de detección (Sigma-Aldrich, Nº de cat. 55689) a 100 μl/pocillo y se leyó la absorbancia a 650 nm.
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El resultado de ELISA mostrado en la figura 11 muestra la unión específica a TNF-mediante el Affibody PEGilado, confirmando que la proteína retiene actividad post-PEGilación. En ausencia de TNF-no hubo ninguna unión de anticuerpo anti-PEG.
Ejemplo 9. PEGilación sobre una secuencia de histidina de interferon alfa-2b (IFN -2b) que posee una secuencia de 8 histidinas en su extremo N terminal usando reactivo PEG 9 de 20 kDa. La actividad antivírica del IFN PEGilado de 20 kDa con y sin reducción con borohidruro de sodio.
A una solución de 4,67 ml de IFN -2b con una secuencia de 8 histidinas en el extremo N terminal (1,07 mg/ml en tampón de fosfato de sodio 50 mM que contiene NaCl 150 mM, pH 7,4) se añadieron 2,6 equivalentes molares de reactivo PEG 9 de 20kDa (217 μl de una solución de 60 mg/ml en agua desionizada) y la solución resultante se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La muestra de reacción después del análisis por SDS-PAGE (geles NuPAGE® Novex al 4-12 % Bis-Tris, tampón de proceso MES, todos de Invitrogen, y tinción con InstantBlue (Expedeon, Nº de cat. ISB1L)) se sometió a cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (columna TOSOH DEAE, STSKgel DEAE-5PW, Supelco, Nº de cat. 8-07164, conectada a un sistema Jasco HPLC) para purificar el IFN--2b monoPEGilado. Las fracciones obtenidas (1 ml cada una) de la columna de intercambio iónico se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones que contenían predominantemente IFN monoPEGilado se sometieron a liofilización. El residuo resultante obtenido después de la liofilización se disolvió en tampón de fosfato de sodio 50 mM que contenía NaCl 150 mM y borohidruro de sodio 2 mM y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1
h. La solución resultante se sometió después a cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60, Superdex 200, PBS 50 mM como eluyente, 1,6 ml/min de caudal y detección a 214 nm) para aislar el IFN monoPEGilado. La muestra aislada se analizó por SDS-PAGE y el resultado se muestra en la figura 12. En el carril etiquetado con 1 de la figura 12 están los marcadores proteicos. El carril etiquetado con 2 muestra solo el IFN de partida. El carril 3 muestra una única banda entre los marcadores proteicos de 50 y 60 kDa correspondientes al IFN -2b monoPEGilado de 20 kDa.
Actividad antivírica: El ensayo antivírico se realizó sobre células A549 cultivadas en DMEM/10 % de suero de carnero fetal (FCS) que contenía penicilina y estreptomicina. Se resuspendieron células A549 en DMEM/10 % de FCS a una concentración de 0,2 x 106 células/ml y se dividió en partes alícuotas a 50 μl/pocillo en placas de microvaloración de 96 pocillos. El día siguiente, se prepararon muestras de IFN PEGilado y nativo en una dilución de dos veces y se añadieron a los pocillos 50 μl de cada dilución. Las placas se incubaron después durante 24 h. Después el medio se eliminó y las células se incubaron con virus de la encefalomiocarditis (EMCV) preparado en DMEM/5 % de FCS (50 μl/pocillo). Las células se incubaron durante otras 24 h, después se lavaron con 300 μl/pocillo de PBS y se tiñeron con formaldehídoal 4 %/violeta de metilo al 0,1 % (50 μl/pocillo; Sigma-Aldrich, Nº de cat. 198099) durante 30 min. La placa se lavó después dos veces con 300 μl/pocillo de PBS y se secó al aire. El colorante se solubilizó con solución de SDS al 2 % (50 μl/pocillo) y la absorbancia se midió a 570 nm. El IFN-2b PEGilado de 20 kDa (A) sin tratar (B) tratado con borohidruro de sodio mostró una actividad de 64 pg/ml y 68 pg/ml, respectivamente.
Ejemplo 10. Estabilidad de reactivo PEG 9 en comparación con reactivos PEG comerciales con grupos funcionales maleimida.
La estabilidad de reactivo PEG 9 (muestras de 5 kDa y 20 kDa) se comparó con metoxi-poli(etilenglicol)maleimidopropionamida (Chirotech Technology Ltd, Nº de cat. 008-008, Nº de lote 223126001) y -metoxi--etil-maleinimidapolietilenglicol (Iris Biotech, Nº de cat. PEG1146, Nº de lote 128512) mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) a pH de 7,4. Se preparó una solución de D2O a pH de 7,4 liofilizando una solución acuosa de fosfato de sodio 50 mM que contenía NaCl 150 mM y EDTA 20 mM A pH 7,4 y se reconstruyó usando el mismo volumen con óxido de deuterio. Se añadió acetona como patrón al tampón a 1,0 μl por 3 ml. Se disolvieron muestras de reactivos PEG a 1 μmol en 0,75 ml del tampón y se analizaron después de 4 h y después de 25,5 h por espectroscopia de RMN a 400 MHz. La estabilidad de las muestras de PEG maleimida se determinaron comparando la integral a 6,86 ppm después de normalizar usando la integral para el patrón de acetona a 2,17 ppm. La estabilidad de reactivo PEG 9 se determinaron comparando la integral total para las señales a 7,31, 7,40, 7,47, 7,73 y 8,03 ppm después de normalizar usando la integral para el patrón de acetona a 2,21 ppm. Los picos a 7,31, 7,47 y 8,03 son del reactivo PEG 10 (figura 14) activo con proteínas formado como se esperaba a partir del reactivo PEG 9. La relación de 9 con respecto a 10 varió de 1,46 a 1,77 a 1 para ambas muestras 1 y 2 durante el transcurso del experimento. Los resultados del estudio de estabilidad se mustran en la tabla 1. Las muestras de PEG-maleimida se degradaron entre el 19 y el 55 % en un periodo de 21,5 h a pH 7,4 mientras que las muestras de reactivo PEG 9 no se degradaron en las mismas condiciones.
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Tabla 1. Resultados de un estudio de estabilidad por RMN comparando reactivo PEG 9 con PEG maleimida
Muestra
Integral de 4 h para pico de 6,86 ppm Integral de 25,5 h para pico de 6,86 ppm % de degradación en un periodo de 21,5 h apH de 7,4
Muestra 1 de PEGmaleimida
1,16 0,52 55
Muestra 2 de PEGmaleimida
0,75 0,61 19
Integral total de 4 h para picos de 7,31,7,40, 7,47, 7,73, 8,03 ppm
Integral total de 25,5 h para picos de 7,31,7,40, 7,47, 7,73, 8,03 ppm
Muestra 1 de reactivo PEG 9
4,85 4,82 <1
Muestra 2 de reactivo PEG 9
3,93 4,01 0

Ejemplo 11. PEGilación del fragmento de laminina 925-983 (Lamß1925-933) que contenía un único tiol de cisteína libre a pH variable.
Lamß1925-933 es un nonapéptido lineal (Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2) (Sigma, Nº de cat. C0668), que corresponde a residuos 925-933 de la cadena B1 de laminina y contiene un único tiol de cisteína.
PEGilación con reactivoPEG 9 a pH variable: Se disolvió péptido Lamß1925-933 liofilizado (1 mg) en 500 μl de agua desionizada dando una solución madre de 2 mg/ml. Después de agitación con vórtice, la solución madre de péptido se usó recién preparada o se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. La solución madre de Lamß1925-933 se diluyó dos veces dando una concentración final de 1 mg/ml (1 mM) en la mezcla de reacción de PEGilación. Se disolvió péptido el reactivo PEG 9 de 5 kDa (5 mg) en 200 μl de agua desionizada dando una solución madre de 25 mg/ml. Después de agitación con vórtice, la solución madre de reactivo PEG se usó recién preparada o se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. La solución madre de PEG se diluyó cinco veces dando una concentración final de 5 mg/ml (1 mM) en la mezcla de reacción de PEGilación.
La solución madre de tampón contenía tampón de fosfato de sodio 1 M para el intervalo de pH de 6,0-8,0 y tampón de carbonato-bicarbonato de sodio 1 M para el intervalo de pH de 8,5-10,0. Para todos los valores de pH, la solución madre de tampón contenía también EDTA 10 mM e hidroquinona 381 μM. La solución madre de tampón se diluyó diez veces dando una concentración final de agente tampón 100 mM (fosfato de sodio o carbonato-bicarbonato de sodio), EDTA 1 mM e hidroquinona 38 μM.
Cada una de las mezclas de reacción de PEGilación contenía 5 μl de solución madre de Lamß1925-933, 1 μl de solución tampón, 2 μl de solución de reactivo PEG (correspondientes a una relación molar 1:1 de reactivo PEG con respecto al péptido modelo Lamß1925-933) y 2 μl de agua desionizada dando un volumen de reacción total de 10 μl. Después de agitación con vórtice durante varios segundos, seguida por una breve centrifugación (30 s a 5.000 x g) para recoger la solución en el fondo del tubo, las mezclas de reacción se incubaron en reposo a temperatura ambiente durante 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 16 y 24 horas. Después de la incubación a temperatura ambiente, los tubos que contenían las mezclas de reacción se dispusieron a -80 °C y se almacenaron hasta el análisis por cromatografía en fase inversa.
Para el ensayo de cromatografía en fase inversa se usó una columna Source 5RPC ST 4.6/150 (GE Healthcare, Nº de cat. 17-5116-01). La columna se conectó a un sistema de HPLC Jasco que comprendía una bomba de HPLC Jasco PU-980 Intelligent, una unidad de gradiente Jasco LG-980-02 Ternary, una unidad de desgasificación Jasco Degassys Populaire, un detector de UV Jasco UV-970 4-Intelligent, una interfaz Jasco LC-NetII/ADC para conexión a PC y una válvula de inyección manual Rheodyne 7725i. El sistema de HPLC se controló mediante un ordenador usando el paquete informático de cromatografía EZchrom SI versión 3.2.1 Build 3.2.1.34 (Agilent Technologies). El análisis del cromatograma y la exportación de datos se realizaron usando el sistema de datos de cromatografía EZchrom SI.
Se usó un sistema de tres eluyentes. El eluyente A contenía el 5 % de acetonitrilo (Far UV, grado HPLC, Fisher, Nº de cat. A/0627/17) y el 0,065 % de ácido trifluoroacético (TFA) (Acros, Nº de cat. 139721000) en agua desionizada. El eluyente B contenía el 0,075 % de TFA en acetonitrilo, mientras que el eluyente C fue el 100 % acetonitrilo. Los eluyentes se desgasificaron por sonicación antes de su uso. El programa de elución implicó un gradiente del 0-64 %
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de B en 20 minutos, seguido por lavado en el 100 % de acetonitrilo y reequilibración en eluyente A (Tabla 2). Se mantuvo un flujo constante de 1 ml/min a lo largo del proceso. Se registró la absorbancia a 215, 250, 280 y 350 nm a lo largo del proceso. Cada muestra (10 μl) se descongeló y se centrifugó brevemente (1 min a 14.000 g) inmediatamente antes de que se inyectaran 5 μl de sobrenadante en la columna de cromatografía en fase inversa.
Tabla 2: Ajustes para el programa de elución con gradiente usado para el ensayo de cromatografía en fase inversa
Tiempo (min)
Caudal (ml-min-1) A (%) B (%) C (%)
inicial
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La identidad de cada pico en los cromatogramas se confirmó procesando muestras estándar (reactivo PEG, péptido sin reaccionar reducido y oxidado) y mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica (SEC) para una estimación de tamaño relativa (para conjugado de producto de PEGilación: péptido-PEG). La columna usada para SEC analítico fue una columna analítica BioSep-SEC-S3000 (300 x 7,8 mm) (Phenomenex, Nº de cat. 00H-2146-KO). El eluyente de proceso usado fue tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0) que contenía acetonitrilo al 10 % (v/v) y el caudal se mantuvo constante a 2 ml/min a lo largo del proceso.
La figura 13 muestra cromatogramas de tiempo-transcurso de un experimento de PEGilación a pH 6,5, usando 1 equivalente molar de reactivo PEG 9 de 5 kDa. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, eran visibles cinco picos: el péptido reactivo con PEG Lamß1925-933 (pico 1); un dímero de péptido no reactivo formado mediante formación de disulfuro (pico 2); grupo saliente de ácido sulfónico del reactivo PEG 9 (pico 3, compuesto 11 en la figura 14); un pico correspondiente al producto peptídico PEGilado (conjugado de PEG de 5 kDa-Lamß1925-933) (pico 4) y el reactivo PEG 9 (pico 6, forma no reactiva).
Después de 4 horas de incubación, todo el péptido libre (pico 1) se había consumido cuando se completó la PEGilación. Algún pico de reactivo PEG activado en exceso (pico 5, compuesto 10 en la figura 14) también está presente debido a que alguno de los péptidos formó un dímero no reactivo (pico 2, nótese que el reactivo PEG absorbe más fuertemente que el péptido a concentraciones equivalentes). El Lamß1925-933 oxidado (pico 2) no podía estar PEGilado ya que no posee ningún tiol libre y, por lo tanto, su pico correspondiente (pico 2) permeció sin cambios durante el transcurso del experimento. Este resultado es coherente con la PEGilación del tiol de cisteína que tiene lugar en el péptido reducido.
La reactividad del reactivo PEG 1 hacia Lamß1925-933 a entre pH 6,0 y pH 8,0 se evaluó midiendo la conversión del péptido (pico 1) a producto de Lamß1925-933 PEGilado de 5 kDa (pico 4). Los resultados de los picos del péptido se normalizaron asignando el valor de 100 al área del pico calibrado correspondiente a la cantidad total de péptido usada en cada reacción de PEGilación, mientras que los resultados de los picos del producto se normalizaron usando un área de pico de producto máxima deducida correspondiente a la conversión total del péptido en producto. La conversión (%) se definió como la proporción de péptido PEGilado con respecto a la cantidad inicial de péptido usada en la reacción. El resultado se muestra en la figura 15. A pH de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0 todo el péptido se PEGiló. La velocidad hasta completar la reacción depende del pH, cuanto mayor sea el pH, más rápida será la velocidad, y refleja la diferente velocidad de formación de la estructura reactiva 10 (figura 14) a diferentes pH.
Ejemplo 12. Comparación de la reactividad de reactivo PEG 9 y una PEG-maleimida disponible comercialmente a pH variable.
La reactividad de reactivo PEG 9 hacia el péptido Lamß1925-933 del ejemplo 11 se comparó con un reactivo PEG reactivo con tiol disponible comercialmente, PEG maleimida (O-(2-maleimidoetil)-Ω’-metil-politilenglicol 5.000, Fluka, Nº de cat. 63187). Para asegurar que el reactivo PEG 9 estaba inmediatamente disponible para la reacción en el experimento de tiempo-escala, el reactivo se dejó formar en primer lugar la forma reactiva con tiol (reactivo 10, figura 14) mediante incubación a pH 7,5 (2 horas, 4 °C) y el reactivo 10 se aisló mediante cromatografía en fase inversa antes de su conjugación con el péptido. Todas las reacciones de péptidos se llevaron a cabo con reactivo PEG recién disuelto. Brevemente, la solución de reacción de PEGilación (escala de reacción: 10 μl) contenía 10 μg de Lamß1925-933, 50 μg de reactivo PEG (5 kDa) (correspondiente a una relación molar de 1:1 de reactivo PEG con respecto al péptido modelo Lamß1925-933) en tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 6,0-8,0) o carbonatobicarbonato de sodio 100 mM (pH 8,5-10,0) y EDTA 1 mM. Después de la incubación a temperatura ambiente, las
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mezclas de reacción se analizaron medainte cromatografía en fase inversa como se ha descrito previamente en el ejemplo 11. El resultado se muestra en la figura 16. Para reactivos PEG 9 (pH 9,0 a 10) y 10 (pH 6,0 a 8,0), la conversion total del péptido en la forma PEGilada pudo lograrse entre pH 6,0 y pH 10 en un periodo de 15 minutos.
Para la conversión del reactivo PEG-maleimida solo se alcanzó un máximo del 78,9 % después de 15 minutos. A pH superior, la conversión fue incluso inferior (51,2 a pH 10). Se tomó una muestra de la reacción de PEG-maleimida a pH 8,5 de nuevo después de 16 h y todo el péptido se había consumido.
A todos los valores de pH analizados, por lo tanto, los reactivos PEG 9 y 10 eran más eficaces que el reactivo de PEG-maleimida.
Ejemplo 13. Estabilidad de un conjugado de reactivo PEG péptido y comparación con un conjugado de péptido derivado de PEG-maleimida.
La estabilidad de conjugados de péptido Lamß1925-933 purificados preparados a partir de reactivo PEG 9 y PEGmaleimida del ejemplo 12 se compararon a lo largo de 12 días. La estabilidad de los conjugados se determinó realizando un seguimiento del área del pico de PEG-péptido usando cromatografía en fase inversa tal como se ha descrito en el ejemplo 11.
Síntesis de Lamß1925-933 PEGilado con reactivo PEG 9: El conjugado se preparó usando un procedimiento modificado del ejemplo 11 (pH de 6,0 usando una concentración final de péptido de 1,6 mg/ml y 0,4 mg de péptido). El producto se aisló mediante cromatografía en fase inversa. El pico de elución correspondiente al conjugado Lamß1925-933-PEG se recogió, se liofilizó y subsiguientemente se resuspendió en agua desionizada. Finalmente, se añadieron 2 mM de borohidruro de sodio (Acros Organics, Nº de cat. 200050250) y después la muestra se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,5). Síntesis de Lamß1925-933 PEGilado con PEG-maleimida: Se usó Lamß1925-933 (0,4 mg) para la PEGilación con reactivo PEGmaleimida de 5 kDa (5 kDa, Fluka, Nº de cat. 63187). Brevemente, se añadieron 20 μl de 10 x solución madre de tampón (que contenía tampón de fosfato de sodio 1 M (pH 8,0) y EDTA 10 mM) y 40 μl de solución madre de reactivo PEG (25 mg/ml en agua desionizada) a 200 μl de solución madre de péptido (2 mg/ml en agua desionizada). Después de 1,5 horas de incubación a temperatura ambiente, el producto se purificó usando cromatografía en fase inversa tal como se describe en el ejemplo 11. La muestra del pico de elución se liofilizó y subsiguientemente se resuspendió en agua desionizada y después se añadió tampón de fosfato de sodio 50 mM se ajustó el pH a 8,0. Se usó cromatografía en fase inversa para asegurar que las concentraciones de ambas solución de PEG-péptido fueran aproximadamente iguales.
Ambas muestras de estabilidad se incubaron a temperatura ambiente. Después de 12 días, las muestras se analizaron mediante RPC y la estabilidad determinada con el cambio en el área de integración para los picos del conjugado se muestra en la figura 17. El conjugado derivado de reactivo PEG 9 permaneció estable a lo largo de 12 días. Para el conjugado derivado de PEG-maleimida, solo permaneció el 63 % en el cromatograma que mostraba que el reactivo PEG 9 conduce a un producto más establa.
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Se preparó reactivo PEG 12 de un modo análogo al reactivo PEG 9 usando O,O’-bis(2-aminoetil)polietilenglicol 6000 (Fluka, Nº de cat. 14504) y se hizo reaccionar con el péptido modelo del ejemplo 11 (Lamß1925-933). Se añadieron agua (6 μl), 2 μl de 10 x solución madre de tampón (que contenía tampón de fosfato de sodio 1 M (pH 8,0), 381 μM de hidroquinona y EDTA 10 mM) y 2 μl de reactivo PEG 12 (25 mg/ml) se añadieron a 10 μl de solución madre de Lamß1925-933 (2 mg/ml en agua desionizada). Esto correspondió a una relación molar de 1:0,375 de péptido modelo
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cobre (1 mM) a 2,5 ml de solución de IL-1Ra (0,6 mg/ml, 1,5 mg de IL-1-Ra) en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 200 mM. Después de incubación durante 16 horas a 4 °C, se añadieron 25 mM de EDTA y la muestra se cargó en una columna PD-10 (GE Healthcare) preequilibrada con tampón de fosfato de sodio 50 mM pH 7,5 que contenía EDTA 20 mM. La columna se eluyó después con x 3,5 ml de tampón de fosfato nuevo. La concentración de proteína usada para la PEGilación fue de 0,43 mg/ml y el pH de 7,4 y se incubó durante 16 horas a 4 °C. Reactivo PEG 9 (20 kDa) a 1,5 equivalentes molares con respecto a la proteína. La reacción se incubó durante 16 h a 4 °C. Las especies monoPEGiladas se aislaron usando la misma cromatografía que es describe en el ejemplo 17 junto con el tratamiento de borohidruro de sodio. El resultado de SDS-PAGE del producto se muestra en el carril 2 de la figura 19 en el que no puede observarse nada de proteína libre. La bioactividad del producto se evaluó midiendo la inhibición de la liberación de IL-6 dependiente de IL-1 en células MG-63 tal como se describe en el ejemplo 17 y el resultado se muestra en la figura 20. El IL-IRa pegilado poseía actividad inhibidora en el ensayo.
Ejemplo 19: Síntesis de reactivo PEG: Síntesis de reactivo PEG 15 de 10 kDa.
Se preparó reactivo de ácido 4-(3-(2-hidroxietilsulfonil)propanoil)benzoico PEGilado 15 a partir de ácido 4-(3-(2hidroxietilsulfonil)propanoil)benzoico 14 de un modo análogo al descrito para la síntesis de ácido 4-(3tosilpropanoil)benzoico 9 del ejemplo 1, tal como se muestra en la fig. 21. En primer lugar, se preparó ácido 4-(3-(2hidroxietilsulfonil)propanoil)benzoico 14 de un modo análogo al ácido 4-(3-tosilpropanoil)benzoico pero usando mercaptoetanol en lugar de 4-metilbencenotiol (etapa 2, ejemplo 1). RMN 14 (400 MHz) δ 3,35 (t, 2H, COCH2), 3,5 (m sobrelapado, 4H, CH2SO2CH2), 3,8 (t, 2H, CH2OH), 5,2 (s ancho, CH2OH), 8,05 (m, 4H, CH aromático), 13,4 (s ancho, 1H, COOH). Para la etapa de conjugación a PEG, la sulfona 14 (143 mg) y O-(2-aminoetil)-O’-metil-PEG (PM: 10 kDa, 1 g, BioVectra) se disolvieron en tolueno seco (5 ml). El disolvente se eliminó al vacío sin calentamiento y el residuo sólido seco se volvió a disolver después en diclorometano seco (10 ml) en atmósfera de argón. A la solución resultante, enfriada en un baño de hielo, se añadió lentamente diisopropilcarbodiimida (DIPC, 87 mg) en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se mantuvo después en agitación durante toda la noche (15 h) a temperatura ambiente. Los compuestos volátiles se eliminaron después al vacío (30 °C, baño de agua) para proporcionar un residuo sólido que se volvió a disolver con calentamiento suave (35 °C) en acetona (45 ml). La solución se filtró a través de lana de algodón no absorbente para eliminar material insoluble. La solución se enfrió después en un baño de hielo seco para dar un precipitado blanco que se separó mediante centrifugación (4600 rpm, 30 min). La fase líquida se decantó y este procedimiento de precipitación se repitió tres veces. Después, el sólido blancuzco resultante se secó al vacío proporcionando el reactivo PEG 15 (1 g). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 3,30 (t, 2H, COCH2), δ 3,40 (s, 3H, PEG-OCH3), δ 3,40 – 3,85 (m ancho, PEG), δ 3,50 (m sobrelapado, 2 x 2H, CH2SO2CH2), δ 3,80 (t, 2H, CH2OH), δ 7,95, δ 8,05 (2 x d, 2 x 2H, ArH de resto de ácido carboxílico).
Reactivos PEG análogos de diferentes pesos moleculares de PEG se prepararon mediante el mismo procedimiento general. Así, se preparó PEG de 5 kDa mediante reacción de la sulfona 14 (256 mg), O-(2-aminoetil)-O’-metil-PEG (5 kDa, 1 g, Biovectra) y DIPC (174 mg) en diclorometano seco (15 ml) proporcionando después del procedimiento de purificación por precipitación en acetona un sólido blancuzco 15 (1 g).
Ejemplo 20: Síntesis de reactivo PEG: Síntesis de reactivo PEG 17 de 10 kDa.
Se preparó reactivo PEG 17 a partir de reactivo PEG 9 como sigue (figura 22): Se dejó reactivo PEG 9 (10 kDa, 75 mg) en agitación con ácido mercaptosuccínico (6 mg) e hidrogenocarbonato de sodio (20 mg) en agua desionizada (2 ml) durante aproximadamente 18 h. Los productos volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio y el residuo sólido se volvió a disolver en acetona caliente (4 ml) eliminándose por filtración compuestos insolubles a través de lana de algodón no absorbente. Después, el producto se precipitó a partir de la acetona enfriando la solución en un baño de hielo seco y después se aisló por decantación la fase líquida siguiendo a la centrifugación. La precipitación de acetona se repitió otras tres veces y el sólido se secó después al vacío dando 16 (51 mg). El compuesto 16 (40 mg) se oxidó después a la forma de sulfona 17 mezclándolo con oxone en metanol:agua 1:1 (1 ml) durante aproximadamente 18 h. La mezcla se diluyó después con acetona (10 ml) y los productos insolubles se eliminaron después por filtración por gravedad a través de una lana de algodón no absorbente. El filtrado homogéneo se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio y después se volvió a disolver en acetona (2 ml) con 2 gotas de HCl 1 N añadidas y después se aisló mediante precipitación en acetona sencilla como se ha descrito para 16 (mg). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 3,24-3,08 (m sobrelapado, CH2CH, COCH2), 3,38 (s, PEG-OCH3), 3,44 a 3,84 (s ancho, m sobrelapado, PEG y CH2SO2), 4,44 (dd, SO2CH), 7,45 (s ancho, NH), 7,98 y 8,06 (2 x d, 4H, ArH de resto de ácido carboxílico).

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