ES2562008T3 - Método para estadificar la progresión del cáncer con MFA - Google Patents

Abstract

Un metodo para clasificar una muestra de biopsia de tejido obtenida a partir de un tumor, que comprende - determinar los valores de rigidez para una pluralidad de puntos en dicha muestra con una resolucion espacial de al menos 100 μm, dando como resultado una distribucion de rigidez, - asignar a dicha muestra una probabilidad de malignidad, en el que - a una muestra que presenta una distribucion de rigidez al menos bimodal se le asigna una probabilidad elevada de que sea maligna, en donde dicha distribucion de rigidez al menos bimodal se caracteriza por un primer pico que presenta un valor de rigidez al menos dos veces mas elevado que el de un segundo pico.

Description

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dependiendo de la longitud total de la biopsia. Dado que las muestras de ensayo obtenidas para glándulas mamarias de ratón y pulmones no eran cilíndricas como las biopsias humanas, las áreas de barrido se eligieron con el fin de asegurar que las muestras de ensayo se cubrían totalmente.

5 Para el análisis de las muestras de tejido de glándula mamaria con MFA, las biopsias se pegaron en un disco de Teflón redondo usando pegamento de 2 componentes o se fijaron a una placa de Petri con pegamento epoxi de secado rápido en 5 minutos. Después de una etapa de secado previo de 2 minutos (para evitar la mezcla del epoxi y el tampón de la muestra de ensayo), la muestra de ensayo se dejó plana para optimizar el ángulo de la hendidura y para evitar la influencia de componentes externos (por ejemplo, el soporte de la estructura en voladizo). Las puntas de pipeta que actúan como "rampas" se colocaron directamente sobre segmentos desiguales de cada muestra de ensayo para mantener una coherencia del peso. El uso de fuerza excesiva (por ejemplo, rasgado o estiramiento) se minimizo todas las veces durante la manipulación de la muestra de ensayo. Todas las etapas preparativas se realizaron en un entorno de tampón estéril complementado con inhibidores de proteasa para evitar la contaminación y para asegurar que la muestra de ensayo permanecía en un estado cercano al nativo. Las muestras de ensayo

15 montadas se mantuvieron en solución de Ringer enfriada con hielo hasta el ensayo nanomecánico, que se realizó a temperatura ambiente o a 37 ºC.

Para puntas piramidales afiladas (estructuras en voladizo de nitruro de silicio de 200 mm de longitud, constante de resorte de la estructura en voladizo nominal k = 0,06 N m-1, frecuencia de resonancia [aire] = 18 kHz). La constante de resorte k exacta de la estructura en voladizo se determinó antes de cada experimento con el método de calibración térmica aunque la sensibilidad de desviación se determinó en fluido usando sustratos de vidrio sólidos como un material de referencia infinitamente rígido.

Las medidas de rigidez (módulo elástico, E) de biopsias se derivaron como se indica a continuación; las curvas de

25 carga-desplazamiento, también denominadas curvas de hendidura de fuerza, se registraron en un sitio dado de una forma orientada tanto durante la carga como durante la descarga. Una distancia regular de aproximadamente 500 µm se mantuvo entre las regiones de barrido en las que la distancia entre las dos estructuras en voladizo sirvió como una referencia. Un conjunto de datos individuales consistía en 1.024 curvas de carga-desplazamiento, a una tasa de toma de muestras de 1,5 Hz. Esto dio como resultado de aproximadamente 15 a 20 mapas de volumen de fuerza por muestra. Cuando era posible, se preparaban mapas de fuerza-volumen (FV) sobre una rejilla de 24 x 24 puntos con un tamaño de barrido de 20 x 20 µm a una tasa de aprox. 0,8 ciclos de carga/descarga por segundo. Cada curva de carga-desplazamiento consistía en 512 puntos de datos mientras que la longitud Z se ajustó de 5 µm a 8 µm dependiendo de las propiedades de la región analizada. Cada mapa de FV se ajustó a 20 x 20 µm2 para (i) optimizar el tiempo experimentar así como (ii) para proporcionar un área lo suficientemente

35 grande como para incorporar todos los componentes dentro del tejido (por ejemplo, células y matriz extracelular). La fuerza de carga máxima aplicada se ajustó a 1,8 nN y una profundidad de la hendidura de aproximadamente 150 a 3000. Se obtuvieron mapas adicionales de 72 x 72 FV (5184 curvas de fuerza-desplazamiento por mapa y un tamaño de píxel de 277 nm) para aumentar la resolución espacial con respecto a las áreas fundamentales de interés.

Análisis de datos de MFA

Las curvas de hendidura de fuerzas se analizaron usando un método que se ha descrito anteriormente (Oparic, et al., Biophysical Journal,. 98 (11): p. 2731-40, 2010, Plodinec, et al., Journal of Structural Biology, 174 (3): p. 476-484, 45 2011). En resumen, el software se desarrolló en LABVIEW para el análisis automatizado de los datos de FV. El punto de contacto se determinó mediante la aplicación de un ajuste por dinámico ha curvas de fuerza sin ajustar basadas en un algoritmo publicado (Lin, et al., Journal of Biomechanical Engineering-Transactions of the Asme, 129 (6): p. 904-912, 2007). Las curvas de fuerza se obtuvieron mediante la hendidura h, que corresponde a la diferencia entre el desplazamiento del elemento piezoeléctrico y la desviación de la estructura en voladizo, y multiplicando la desviación de la estructura en voladizo d con la constante de resorte k para obtener la carga F. Las curvas de fuerzas sin carga se analizaron para realizar un ajuste lineal hasta la parte superior de un 50 % de la curva de fuerza, que define la rigidez entre la carga máxima F = 1,8 nN y la carga mínima de 0,9 nN. Algunos efectos extraños en la curva de fuerza tales como adhesión se pudieron evitar con este procedimiento. La relación de Poisson se ajustó a 0,5. El módulo de Young se determinó de acuerdo con el método de Oliver y Pharr (Oliver et al.,

55 Journal of Materials Research, 7 (6), 1564-1583, 1992). Los valores de la pendiente se representaron espacialmente para producir mapas de rigidez codificados con color en Igor Pro 6.22. Una interpolación del eje nervado de segundo grado en 2D se realizó en los mapas de rigidez en 2D para suavizar la presentación visual de los datos.

Análisis inmunohistoquímico

Después de MFA, todas las muestras se recuperaron, se fijaron en formalina y se embebieron en parafina de acuerdo con procedimientos histológicos convencionales. Se cortaron secciones de aprox. 5 µm de espesor y se transfirieron en portaobjetos de vidrio. La primera y la última láminas de secciones secuenciales se tiñeron de forma rutinaria con Hematoxilina y Eosina (H & E). El examen histopatológico posterior incluía la evaluación del tipo de 65 lesión (carcinoma ductal invasivo, DCIS, fibroadenoma etc.) y un número de marcadores histopatológicos convencionales (alcance de infiltración tumoral, fibrosis, necrosis, e infiltración linfocítica). Para análisis

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laminina está muy desorganizada y revela que la pérdida de polaridad epitelial es coherente con malignidad y capacidad de invasión.

Tabla 1

Caso nº.

Edad / sexo Valores de rigidez de MFA ± DT [kPa] Pico 1 Pico 2 Pico 3 otro Diagnóstico histopatológico correspondiente Grado (g)

1 2 3 4 5 6

20 / hembra 31 / hembra 34 / hembra 50 / hembra 53 / hembra 55 / hembra 1,19 ± 0,82 --1,13 ± 0,78 --1,17 ± 0,67 --1,23 ± 0,24 --1,31 ± 0,76 --1,83 ± 1,13 -- Sano Sano Sano Sano Sano Sano ------

7 8 9 10 11

61 / hembra 47 / hembra 48 / hembra 49 / hembra 56 / hembra 1,33 ± 0,32 2,63 ± 2,06 --1,91 ± 0,99 --3,94 ± 1,49 --3,41 ± 1,97 --3,68 ± 1,92 - Fibroadenoma con hiperplasia ductal Fibroadenoma Fibroadenoma Fibroadenoma Fibroadenoma -----

12 13 14 15 16 17

63 / hembra 44 / hembra 45 / hembra 61 / hembra 73 / hembra 83 / hembra 0,56 ± 0,24 1,82 ± 0,96 7,71 ± 4,55 0,61 ± 0,21 1,54 ± 0,30 -0,46 ± 0,21 1,19 ± 0,84 -0,75 ± 0,22 1,64 ± 0,78 declive exponencial definido por la enfermedad 0,73 ± 0,34 1,47 ± 1,67 -0,63 ± 0,50 -declive exponencial definido por la enfermedad Carcinoma ductal invasivo Carcinoma invasivo oncocítico Carcinoma ductal-lobular invasivo Carcinoma ductal invasivo Carcinoma ductal invasivo con patrón de crecimiento lobular Carcinoma apocrino 3 2 2 2 2 2

21

18

61 / 0,57 ± 1,99 5,75 ± 1,62 Carcinoma ductal invasivo 1

hembra

0,16 ±

0,73

19

69 / 0,66 ± 1,71 - Carcinoma ductal invasivo 1

hembra

0,31 ±

1,41

20

79 / hembra 0,53 ± 0,23 1,81 ± 0,42 7,41 ± 2,49 Carcinoma lobular invasivo 1

21

95 / hembra 0,31 ± 0,12 - 8,45 ± 1,77 Carcinoma ductal invasivo 1

Tabla 2

Ratón (muestra nº.) Valores de rigidez de MFA [kPa] ± DT Diagnóstico histopatológico correspondiente Pico 1 Pico 2

1 1,148 ± 0,482 -Normal 2 1,075 ± 0,622 -Normal 3 1,021 ± 0,524 -Normal 4 0,983 ± 0,860 -Normal 5 1,149 ± 1,275 -Normal 6 0,959 ± 0,931 -Normal 7 0,956 ± 0,260 -Normal 8 1,124 ± 0,503 -Normal

1 1,023 ± 0,054 1,449 ± 0,693 Premaligno 2 -2,437 ± 0,844 Premaligno 3 1,012 ± 0,434 2,046 ± 0,679 Premaligno 4 1,265 ± 0,549 1,963 ± 1,382 Premaligno 5 1,612 ± 0,244 2,166 ± 1,042 Premaligno 6 1,579 ± 0,973 -Premaligno 7 1,568 ± 0,648 -Premaligno

1 0,591 ± 0,178 1,404 ±0,556 Cáncer inicial 2 0,467 ± 0,158 1,496 ± 0,748 Cáncer inicial 3 0,721 ± 0,068 4,195 ± 2,837 Cáncer inicial 4 0,443 ± 0,112 1,069 ± 0,512 Cáncer inicial 5 0,771 ± 0,152 1,446 ± 0,879 Cáncer inicial 6 0,498 ± 0,192 1,554 ± 0,895 Cáncer inicial 7 0,521 ± 0,180 1,414 ± 0,812 Cáncer inicial

1 0,626 ± 0,197 3,171 ± 2,312 Cáncer tardío 2 0,723 ± 0,277 2,422 ± 0,701 Cáncer tardío 3 0,503 ± 0,032 5,081 ± 2,746 Cáncer tardío 4 0,650 ± 0,131 5,279 ± 3,122 Cáncer tardío 5 0,767 ± 0,041 4,493 ± 3,060 Cáncer tardío 6 0,567 ± 0,223 2,636 ± 1,449 Cáncer tardío 7 0,744 ± 0,301 3,451 ± 1,701 Cáncer tardío 8 0,699 ± 0,155 4,404 ± 1,001 Cáncer tardío

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Tabla 3

Ratón (pulmón nº.) Normal

Valores de rigidez de MFA [kPa] ± DT Metástasis Alrededores

1 9,917 ± 4,753 2 11,302 ± 5,246 3 11,334 ± 5,808

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4 5 6

0,776 ± 0,689 9,723 ± 5,215 0,588 ± 0,377 10,685 ± 6,763 0,777 ± 0,880 8,354 ± 4,548

Listado de elementos de referencia

100

Microscopio de fuerza atómica de la invención

1

Elemento piezoeléctrico

11

Retracción máxima

12

Extensión de forma máxima

13

Intervalo de trabajo óptimo

14

Intervalo de trabajo no óptimo

15

Umbral para elevar la estructura en voladizo

16

Umbral para bajar la estructura en voladizo

2

Estructura en voladizo

21

Punta de la estructura en voladizo

22

Láser

23

Espejo

24

Fotodiodo

25

Soporte de la estructura en voladizo

3

Motor

31

Controlador

4

Muestra

41

Soporte de la muestra

R

Primera dirección

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Claims (1)

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