ES2562979T3 - Tratamiento de infecciones estreptocócicas - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de una proteína PhtX aislada para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección por Streptococcus pneumoniae, en la que la infección por Streptococcus pneumoniae se produce en la sangre, pulmón, un compartimiento del oído o en las meninges de un paciente humano en un entorno en el cual la concentración libre de Zn2+ y/o Mn2+ es suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresión de al menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae y en la que el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+, según se mide mediante lavado bronquial y/o análisis de sangre.

Description

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DESCRIPCION

Tratamiento de infecciones estreptococicas

La presente solicitud se refiere al campo de las vacunas y de las composiciones inmunogenicas que protegen contra la enfermedad por estreptococos y en particular a vacunas que contienen protemas provenientes de la familia de protemas de la triada de polihistidina.

Antecedentes

Streptococcus pneumoniae es una de las causas principales de morbilidad y de mortalidad infecciosa en el mundo, responsable de un espectro grande de infecciones tales como otitis media, neumoma, bacteremia y meningitis {Hausdorff 2005, McCullers 2001}. La aparicion de cepas resistentes a antibiotico de este microorganismo tambien ha resaltado la necesidad de proporcionar vacunacion profilactica efectiva {Lynch, III 2005, Bridy-Pappas 2005}.

Las vacunas actuales estan constituidas por selecciones epidemiologicamente dominantes a base de serotipo de polisacaridos capsulares neumococicos, conjugados o no a una protema portadora {Dagan 2004, Fedson 2004, Mbelle 1999, Smart 1987}. Sin embargo, las formulaciones de vacuna no cubren todos los serotipos de este microorganismo, lo cual podna en particular ser de relevancia en ciertas regiones del globo con serotipos dominantes diferentes {Dagan 1992}. Ademas, se podna esperar que el uso de vacunas espedficas de serotipo pudiera permitir, al final, la seleccion positiva de serotipos de tipo que no son de vacuna {Nunes 2008, Singleton 2007}.

Una estrategia alternativa implica el desarrollo de vacunas dirigidas contra antfgenos neumococicos comunes. Entre los candidatos multiples, la familia de la protema Pht, restringida al genero Streptococcus, comprende algunos prometedores, que estan bien conservados a traves de las especies neumococicas {Hamel 2004, Zhang 2001}, y que son objetivos para anticuerpos en los individuos infectados y son protectores despues de la exposicion en ratones inmunizados {Beghetto 2006}. Originalmente, tres grupos reportaron esta familia de protemas de manera independiente, y se utilizaron tres denominaciones separadas: Pht (por pneumococcal histidine triad: triada de histidina neumococica) {Adamou 2001}, Php (por pneumococcal histidine protein: protema de histidina neumococica) {Zhang 2001}, y BVH {Hamel 2004}. Dichas protemas se caracterizan por un motivo de triada de histidina, HxxHxH, repetido cinco a seis veces en sus secuencias de aminoacidos. Se han descrito cuatro miembros de esta familia: phtA (BVH-11-3), PhtB (PhpA/BVH-11) y PhtD (BVH-11-2) que comparten hasta el 81 % de identidad de secuencia, y PhtE (BVH-3) que diverge de las otras tres protemas, mostrando solamente hasta el 35 % de identidad con las mismas. Es una protema mas larga, la unica con seis repeticiones del motivo de triada de histidina. En estudios de inmunizacion en ratones, todos los miembros de la familia Pht han demostrado obtener un nivel alto de proteccion contra la infeccion neumococica posterior con diversos cepas/serotipos diferentes {Adamou 2001, Hamel 2004, Ogunniyi 2007, Wizemann 2001, Zhang 2001}. La administracion de las protemas Pht A, B, D y/o E para tratar y prevenir enfermedades que provoca S. pneumoniae se describe en los documentos WO00/37105A2, WO00/39299A2, WO2009/12588A1, WO01/14421A1, WO01/98334A2, WO03/054007, y WO02/22168A2.

A pesar de su importancia potencial en la vacunacion contra S. pneumoniae, todavfa no se ha determinado la funcion biologica de estas protemas. Los resultados provenientes de experimentos de marcacion con anticuerpo y de citometna de flujo demostraron que las protemas Pht estan expuestas sobre la superficie de la bacteria encapsulada {Hamel 2004}, lo cual esta de acuerdo con su relevancia como objetivo de vacuna. Mediante mutagenesis insercional, se ha sugerido que PhtA, PhtB, y PhtD estan implicadas en la virulencia espedfica de pulmon {Hava 2002}, sin indicacion adicional acerca de su funcion biologica. Entre sus supuestos papeles, se ha sugerido la neutralizacion del factor C3b del complemento {Hostetter 1999, Ogunniyi 2009}, lo cual implica que estas podnan interferir con la fagocitosis. Ademas de esto, tambien se sospecha un papel en la adherencia. En efecto, se ha reportado {Panina 2003} un vinculo genetico entre phtD e Imb, codificando este ultimo una protema supuesta de adhesion a laminina {Spellerberg 1999}. Al menos debido al alto numero de restos de histidina en las triadas de histidina, se ha sugerido que las protemas Pht pueden estar implicadas en la union al ADN y /o metal {Adamou 2001}. De manera mas espedfica, algunos estudios resaltan un vinculo entre la familia Pht y cinc. En efecto, se han encontrado sitios de union a AdcR en las regiones corriente arriba de los genes pht, siendo AdcR descrito como un factor de transcripcion que regula la captacion de cinc {Panina 2003}. Asimismo, la estructura cristalina de una porcion de PhtA revela la presencia de iones de cinc unidos a un dominio de triada de histidina {Riboldi-Tunnicliffe 2005}. Sin embargo, no esta claro si la funcion de dichas protemas es la depuracion o el transporte de cinc, o si el cincjuega mas bien un papel conformacional o funcional.

Los aspectos importantes que necesitan ser resueltos para los candidatos para vacuna son su nivel de expresion y regulacion asociada, su presencia, asf como su variabilidad de secuencia. Por lo tanto, los inventores han solucionado estos diferentes aspectos con respecto a las protemas Pht.

Streptococcus pneumoniae provoca diferentes estados patologicos que exhiben diferentes patologfas dependiendo del sitio en el cual se expande la poblacion neumococica. La septicemia se produce en casos en los que S. pneumoniae entra al torrente sangumeo, mientras que la neumoma se presenta en casos en los que S. pneumoniae se multiplica en el pulmon. S. pneumoniae tambien es un patogeno importante en infecciones de otitis media. S.

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pneumoniae tambien puede entrar al Ifquido cefalorraqmdeo para ocasionar meningitis.

Existe la necesidad de desarrollar mejores vacunas neumococicas que puedan dirigirse contra enfermedades neumococicas espedficas y que proporcionen proteccion optima contra una forma particular de enfermedad neumococica.

Por consiguiente, se proporciona una composicion inmunogenica que comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz de una protema PthX aislada para su uso en el tratamiento o la prevencion de una infeccion por Streptococcus pneumoniae, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en la sangre, pulmon, un compartimiento del ofdo o en las meninges de un paciente humano, en un entorno en el cual la concentracion de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresion de al menos una protema PhtX en el Streptococcus pneumoniae y en la que el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+, segun se mide mediante lavado bronquial y/o analisis de sangre.

En un segundo aspecto de la invencion, se proporciona un uso de una cantidad farmaceuticamente eficaz de una protema PhtX aislada en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de una infeccion por Streptococcus pneumoniae, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en la sangre, pulmon, un compartimiento del ofdo o en las meninges de un paciente humano, en un entorno en el cual la concentracion de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresion de al menos una protema PhtX en el Streptococcus pneumoniae y en la que el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+, segun se mide mediante lavado bronquial y/o analisis de sangre.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Organizacion de los genes pht en la cepa TIGR4 serotipo 4 de Streptococcus pneumoniae.

Figura 2. Regiones corriente arriba de los genes pht que contienen al promotor. (a) gen phtE,(b) gen phtA, (c) gen phtB, (d) gen Imb, (e) gen yfnA. Las regiones -35 y -10 estan con doble subrayado, los sitios de inicio de la transcripcion estan indicados mediante una letra en negrita y el sfmbolo (+1), los sitios de union a ribosoma (rbs) supuestos estan subrayados, y los marcos de lectura abiertos estan representados mediante flechas que indican la direccion de transcripcion a traves de una serie de letras en negrita. Los numeros a la izquierda corresponden a las posiciones de secuencia en los numeros de referencia de GenBank AY569979 (a, d y e) y AY569980 (b y c).

Figura 3. Secuencias terminadoras de la transcripcion independientes de Rho de los genes pht y ptsl. Genes (a) phtE, (b) phtB, (c) pgtD, (d) phtA y (e) pstl. Los codones de detencion estan subrayados en negrita, las regiones terminadoras estan subrayadas, y las secuencias subrayadas con una lmea discontinua indican la region de horquilla de los terminadores. Los marcos de lectura abiertos estan representados por flechas que indican la direccion de la transcripcion a traves de una serie de letras en negrita. En (a), la region en cursiva (gen phtF; codon de inicio supuesto con doble subrayado) presenta el 78 % de identidad con las primeras 481 pares de bases del gen phtE. Sin embargo, los codones de detencion subrayados evitan la traduccion de gen significativa. Los numeros corresponden a posiciones de secuencia en los numeros de referencia Gen Bank AY569979 (a y c) y AY569980 (b, d y e).

Figura 4. Analisis de RT-PCR de los transcritos de pht. (a) es gel de agarosa al 1 % que muestra los productos de RT-PCR con ARN de molde proveniente de celulas cultivadas hasta la fase de crecimiento semilogantmica. Los carriles 1 a 8 corresponden a las regiones 1 a 8 en la representacion esquematica en la (b). Los productos de RT- PCR mostrados en los carriles 1 a 8 se generan utilizando pares de cebadores que flanquean las regiones correspondientes representadas en el esquema. La longitud de cada producto de RT-PCR pronosticado se indica entre parentesis.

Figura 5. Analisis de inmunotransferencia en SDS-PAGE de extractos bacterianos. Se utilizo anticuerpo anti-PhtD para sondear los extractos provenientes del mutante cuadruple PhtABDE- (A), el mutante PhtE- (B), mutante PhtD- (C), mutante PhtB- (D), mutante PhtA- (E), y las cepas de tipo silvestre (F). La posicion de las diferentes bandas de Pht se indica a la derecha, y el marcador de masa molecular esta en el lado izquierdo de la imagen.

Figura 6. Curvas de crecimiento de la cepa de tipo silvestre 4/CDC y de mutantes deficientes en Pht en medio MS (a). Las curvas de crecimiento del tipo silvestre, del mutante deficiente en PhtD y del mutante cuadruple de Pht tambien se determinaron en MS con o sin Zn2+ 200 pM (b), 200 pM de Mn2+ (c), o Fe2+ 200 pM (d). Cada figura representa los resultados de un experimento representativo de tres.

Figura 7. Se cultivaron celulas bacterianas WU2 con o sin TPEN 30 pM, un agente quelante de cinc. Despues, las celulas se sondearon con anticuerpos anti-PhtB/D (a), anti-PhtE (b), anti-PhtD/E (c), o anti-polisacarido tipo 3 (d) seguido por anticuerpo secundario de cabra anti-raton conjugado con AlexaFluor, antes de que estos se analizaran mediante citometna de flujo. Como controles, las celulas se incubaron con el anticuerpo conjugado secundario. Se muestran las graficas representativas de FACS de las diferentes condiciones.

Figura 8. Analisis por transferencia Western. Se sometieron extractos de celulas enteras a SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia. Se sondearon nueve cepas diferentes con un anti-PhtD policlonal (a), y 8 con un anti-PhtE policlonal (b). Se muestra el marcador de masa molecular.

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Figura 9. Comparacion de secuencias senal de miembros de la familia PhtX. Las areas sombreadas identifican aminoacidos que estan conservados en al menos 2/3 de los miembros de la familia de PhtX.

Figura 10. Supervivencia de ratones despues de la exposicion letal intranasal con S. pneumoniae. Se inmunizaron ratones (n=20/grupo) con PhtD, PhtA, PhtB, PhtE con adyuvante AS02 o con AS02 solo (control), antes que estos se expusiesen a la cepa neumococica tipo 3/43. Se efectuaron analisis estadfsticos con la prueba logrank, comparados con el control: PhtD, p=0,0126; PhtA, p=0,0103; PhtB, p=0,0038; PhtE, p=0,0033.

Figura 11. Niveles de anticuerpo despues de la inmunizacion. A.) Los ratones se inmunizaron sistemicamente con CbpA, PspA, o PhtD con adyuvante AS02. B) Los ratones se inmunizaron por via intranasal con Cbpa, PspA o PhtD con adyuvante LT. En ambos casos la sangre se tomo en el dfa 42, y los niveles de anticuerpos espedficos se midieron mediante ELISA.

Figura 12. Supervivencia de ratones despues de la exposicion letal intranasal con S. pneumoniae. Los ratones se inmunizaron con Cbpa, PspA, PhtD con adyuvante AS02 o con AS02 solo (control), antes de que estos se expongan a las cepas neumococicas tipo 2/D39 (A), tipo 3/43 (B), o tipo 4/CDC (C). Los analisis estadfsticos se efectuaron con la prueba logrank, comparado con el control: (A) CbpA, p=0,0002, PspA, p=0,0001; PhtD, p=0,0009. (B) CbpA, p=0,885; PspA, p=0,184; PhtD, p=0,027. (C) CbpA, p=0,825; PspA, p=0,538; PhtD, p<0,0001.

Figura 13. Eficacia de la vacuna en un modelo de colonizacion nasofarngea con S. pneumoniae. Se inmunizaron ratones Balb/c con PhtD, PhtA, PhtB, PhtE, o LT solo (control), antes que estos se expusieran por via intranasal a la cepa neumococica 2/D39. Las colonias bacterianas se contaron en los lavados nasales en el dfa 2 y en el dfa 6 despues de la exposicion y se expresan como ufc promedio en log10. Cada punto representa un raton. Las barras horizontales de color negro son las medias geometricas. La lmea discontinua indica el lfmite de deteccion (a 0,84). Los analisis estadfsticos se efectuaron por dfa con ANOVA. Se muestran todas las diferencias significativas, comparadas con el control. *p<0,05; ns: no significativo.

Figura 14. Eficacia de la vacuna en un modelo de colonizacion nasofarngea con S. pneumoniae. Se inmunizaron ratones Balb/c con cualquiera de CbpA, PspA, PhtD, PsaA, o LT solo (Control), antes de que estos se expusieran por via intranasal a la cepa neumococica 2/D39 (A), 4/CDC (B), o 6B/CDC (C). Las colonias bacterianas se contaron en los lavados nasales en el dfa 2 y en el dfa 6 despues de la exposicion, y se expresan como ufc promedio en log 10. Cada punto representa un raton. Las lmeas discontinuas indican el lfmite de deteccion (a 0,84). Las barras horizontales de color negro son las medias geometricas. Los analisis estadfsticos se efectuaron por dfa con ANOVA. Se muestran todas las diferencias significativas, comparadas con el control. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001, ns: no significativo.

Figura 15. Eficacia de la vacuna en un modelo de colonizacion de pulmon con S. pneumoniae. Se inmunizaron ratones CBA/J con PhtD con adyuvante AS02 o con AS02 solo (Ctrl), antes de que estos se expusieran a la cepa neumococica 19F/2737, moderadamente virulenta. Los pulmones se tomaron en el dfa 3, 4 o 5 despues de la exposicion, y la carga bacteriana se evaluo mediante recuento de colonias (ufc). Cada punto representa un raton. La lmea discontinua indica el lfmite de deteccion (a 2). Las barras horizontales de color negro son las medias geometricas. Los grupos se compararon con ANOVA2 a lo largo de tres dfas, seguido por Tuckey-HSD: p<0,0001.

Descripcion detallada

La invencion proporciona una composicion inmunogenica que comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz de una protema PhtX aislada, para su uso en el tratamiento o la prevencion de una infeccion por Streptococcus pneumoniae en la cual la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en la sangre, pulmon, un compartimiento del ofdo o en las meninges de un paciente humano, en un entorno en el cual la concentracion de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresion de al menos una protema PhtX en el Streptococcus pneumoniae y en la que el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+, segun se mide mediante lavado bronquial y/o analisis de sangre.

Ox Ox Ox Ox

Zn y Mn estan presentes en un cuerpo humano en formas tanto libres como unidas. Zn o Mn unido esta unido a protemas tales como albumina y constituye la mayona de estos iones. Por otro lado, una cantidad pequena de Zn2+ o Mn2+ libre esta presente en los lfquidos corporales tales como sangre, linfa, lfquido intersticial o lfquido cefalorraqrndeo. El termino “unido” se refiere a iones que estan estrechamente asociados con protemas tales como la albumina. El termino “libre” se refiere a iones que no estan estrechamente asociados con protemas tales como la albumina. Dichos iones libres estan mas disponibles para la captacion por parte de S. pneumoniae. Se desvela un procedimiento para tratar o prevenir la infeccion por Streptococcus pneumoniae, en el que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en un entorno en el cual la concentracion libre de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresion de al menos una protema PhtX en el Streptococcus pneumoniae. En una opcion el procedimiento de la divulgacion proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la infeccion por Streptococcus pneumoniae en el que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en un entorno en el cual la concentracion unida y/o libre de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresion de al menos una protema PhtX en el Streptococcus pneumoniae.

Con la expresion “suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresion de al menos una protema

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PhtX” para los fines de la invencion, quiere decir que el nivel de Zn2+ y/o Mn2+ (unido y/o libre) es:

a) mas bajo que el usualmente encontrado en la posicion equivalente de un cuerpo humano, de modo tal que el nivel de expresion de al menos una protema PhtX en S. pneumoniae presente en ese cuerpo, es mas alto que el nivel de expresion de PhtX en S. pneumoniae encontrado en el compartimiento equivalente del cuerpo bajo condiciones normales (es decir en un individuo con niveles promedio de Zn2+ o Mn2+); o

b) mas bajo que el encontrado en regiones del cuerpo con disponibilidad elevada de Zn2+, de modo tal que el nivel de expresion de al menos una protema PhtX en S. pneumoniae presente en dicho sitio, es mas alto que el nivel de expresion de PhtX en S. pneumoniae encontrado en la region del cuerpo de disponibilidad elevada de Zn2+ en el mismo individuo.

En una realizacion, el nivel de Zn2+ unido esta reducido. En una realizacion, el nivel de Zn2+ libre esta reducido.

La situacion a) se puede lograr a traves de una disminucion en los niveles generales de Zn2+ y/o Mn2+ mientras que la situacion b) se puede lograr con el hecho que la infeccion por S. pneumoniae se produzca en un sitio que tenga niveles comparativamente bajos de Zn2+ y/o Mn2+.

Una protema PhtX es un miembro de la familia de protemas de triada de histidina. La protema PhtX opcionalmente es la protema de longitud completa pero puede ser un fragmento de la protema o un fragmento o protema de fusion que comprenda al menos un fragmento, o la protema PhtX de longitud completa. La protema PhtX expresada en S. pneumoniae sera una protema de longitud completa, sin embargo la protema PhtX administrada a un paciente humano opcionalmente es una protema PhtX de longitud completa, un fragmento de una protema PhtX o una protema de fusion que comprende al menos una protema PhtX o fragmento de la misma.

En una realizacion, la protema PhtX se selecciona a partir del grupo que consiste en PhtA, PhtB, PhtD y PhtE. En una realizacion, la protema PhtX es PhtD.

La presente invencion se refiere a miembros de las protemas de la familia de la tnada de polihistidina (Pht), fragmentos o protemas de fusion de las mismas. Las protemas PhtA, PhtB, PhtD o PhtE pueden tener una secuencia de aminoacidos que comparte el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una secuencia desvelada en los documentos WO 00/37105 o WO 00/39299 (por ejemplo, con la secuencia de aminoacidos 1-838 o 21-838 de SEC ID N°: 4 del documento WO 00/37105 para PhtD).

La familia de Pht (triada de polihistidina) comprende a las protemas PhtA, PhtB, PhtD, y PhtE. La familia se caracteriza por una secuencia de lipidacion, dos dominios separados por una region rica en prolina y varias triadas de histidina, implicadas posiblemente en la union a metal o nucleosido o en actividad enzimatica, (3-5) regiones de super helice, un extremo N-terminal conservado y un extremo C-terminal heterogeneo. Esta presente en todas las cepas de neumococos analizadas. Tambien se han encontrado protemas homologas en otros Streptococcus y en Neisseria. Se entiende, sin embargo, que los terminos Pht A, B, D, y E se refieren a protemas que tienen secuencias descritas en las citas anteriores o posteriores, asf como variantes de origen natural (y elaboradas por el hombre) de las mismas, que tienen una homologfa de secuencia que es al menos el 90 % identica a las protemas mencionadas. De manera opcional, esta es al menos el 95 % identica o al menos el 97 % identica.

Con respecto a las protemas PhtX, PhtA se desvela en el documento WO 98/18930, y tambien recibe el nombre de Sp36. Como se indico anteriormente, esta es una protema de la familia de la triada de polihistidina y tiene el motivo senal tipo II de LXXC. PhtD se desvela en el documento WO 00/37105, y tambien recibe el nombre de Sp036D. Como se indico anteriormente, esta tambien es una protema de la familia de la triada de polihistidina y tiene el motivo senal tipo II de LXXC. PhtB se desvela en el documento WO 00/37105, y tambien recibe el nombre de Sp036B. Otro miembro de la familia de PhtB es el polipeptido degradador de C3, como se desvela en el documento WO 00/17370. Esta protema tambien es de la familia de la triada de polihistidina y tiene el motivo senal tipo II de LXXC. Por ejemplo, un equivalente inmunitariamente funcional es la protema Sp42 descrita en el documento WO 98/18930. Un truncado de PhtB (aproximadamente 79 kD) se desvela en el documento WO99/15675, el cual tambien se considera un miembro de la familia PhtX. PhtE se desvela en el documento WO00/30299 y recibe el nombre de BVH-3. En casos en los que en el presente documento se haga referencia a cualquier protema Pht, se quiere decir que se pueden utilizar fragmentos inmunogenicos o fusiones de los mismos de la protema Pht. Por ejemplo, una referencia a PhtX incluye fragmentos inmunogenicos o fusiones de los mismos provenientes de cualquier protema Pht. Una referencia a PhtD o PhtB tambien es una referencia a las fusiones PhtDE o PhtBE como se encuentra, por ejemplo, en el documento WO0198334.

El uso de la invencion puede implicar la administracion de la protema PhtX de longitud completa, un fragmento de la protema PhtX o una protema de fusion que contiene al menos 1 o 2 fragmentos de las protemas PhtX. En caso que se utilicen fragmentos de protemas Pht (por separado o como parte de una protema de fusion), cada fragmento contiene opcionalmente uno o mas motivos de triada de histidina y/o regiones de super helice de dichos polipeptidos. Un motivo de tnada de histidina es la porcion de polipeptido que tiene la secuencia HxxHxH. en la cual H es histidina y x es un aminoacido distinto de histidina. Una region de super helice es una region predicha por el algoritmo “Coils”, Lupus, A y col. (1991) Science 252; 1162-1164. En una realizacion, el fragmento, o cada fragmento, incluye uno o mas motivos de triada de histidina asf como al menos una region de super helice. En una

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realizacion, el fragmento o cada fragmento contiene exactamente o al menos 2, 3, 4 o 5 motivos de tnada de histidina (opcionalmente, con la secuencia original de Pht entre las 2 o mas triadas, o secuencia intratriada que es mas del 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % identica a una secuencia de Pht intratriada neumococica natural -por ejemplo la secuencia intratriada mostrada en SEC ID N°: 4 del documento WO 00/37105 para PhtD). En una realizacion, el fragmento o cada fragmento contiene exactamente o al menos 2, 3 o 4 regiones de super helice. En una realizacion, una protema Pht desvelada en el presente documento incluye a la protema de longitud completa con la secuencia senal unida, la protema de longitud completa madura con el peptido senal (por ejemplo 20 aminoacidos en el extremo N-terminal) eliminado, variantes de la protema Pht de origen natural y fragmentos inmunogenicos de la protema Pht (por ejemplo fragmentos como se describe anteriormente o polipeptidos que comprenden al menos 15, 20, 30, 40, 50, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 aminoacidos contiguos provenientes de una secuencia de aminoacidos en el documento WO00/37105 (SEC ID N°: 4, 6, 8 o 10) o en el documento WO00/39299 (SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, 10 o 14), en la que dicho polipeptido puede provocar una respuesta inmunitaria espedfica para dicha secuencia de aminoacidos en el documento WO00/37105 o en el documento WO00/39299. En una realizacion, la protema PhtX es un fragmento descrito en el documento WO 09/12588, por ejemplo aquellos que comprenden o consisten de las secuencias de SEC ID N°: 2, 3 o 4.

En particular, el termino “PhtD” tal como se utiliza en el presente documento, incluye la protema de longitud completa con la secuencia senal unida, la protema de longitud completa madura con el peptido senal (por ejemplo, 20 aminoacidos en el extremo N-terminal) eliminado, variantes de origen natural de PhtD y fragmentos inmunogenicos de PhtD (por ejemplo, fragmentos como se describe anteriormente o polipeptidos que comprenden al menos 15 o 20 aminoacidos contiguos provenientes de una secuencia de aminoacidos de PhtD en el documento WO00/37105 o en el documento WO00/39299, en el que dicho polipeptido puede provocar una respuesta inmunitaria espedfica para dicha secuencia de aminoacidos de PhtD en el documento WO00/37105 o en el documento WO00/39299 (por ejemplo SEC ID N°: 4 del documento WO 00/37105 o SEC ID N°: 14 del documento WO 00/39299 para PhtD). En la presente invencion se pueden utilizar todas las formas de PhtD mencionadas anteriormente.

En una realizacion de la invencion, el uso en el tratamiento o la prevencion esta dirigido a S. pneumoniae, que crece en la sangre del paciente, por ejemplo para el tratamiento o la prevencion de septicemia o bacteremia. En una realizacion, el nivel de la concentracion libre de Zn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 7 nM, 5 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 700 pM, 500 pM, 300 pM, 200 pM 100 pM, 70 pM, 50 pM, 30 pM, 20 pM o 10 pM segun se mide para suero sangumeo. El nivel de Zn2+ se puede medir preparando una muestra de suero proveniente de una muestra de sangre utilizando procedimientos estandar y analizando la muestra utilizando espectrofotometro de absorbancia en horno de grafito (GF-AAS) o utilizando espectroscopia de absorcion atomica, por ejemplo utilizando un espectrometro ICP-AES simultaneo Vista AX-CCd.

En una realizacion de la invencion, la concentracion unida y libre de Zn2+ en la sangre es menor de 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 o 0,1 mg/l o menor de 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2 ,1, 0,5 o 0,1 pM tal como se mide para suero sangumeo. El nivel de Zn2+ se puede medir preparando una muestra de suero proveniente de una muestra de sangre utilizando procedimientos estandar y analizando la muestra utilizando espectrofotometro de absorbancia en horno de grafito (GF-AAS) o utilizando espectroscopia de absorcion atomica, por ejemplo utilizando un espectrometro ICP-AES simultaneo Vista AX-CCD.

En una realizacion de la invencion, la concentracion libre de Mn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 7 nM, 5 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 700 pM, 500 pM, 300 pM, 200 pM 100 pM, 70 pM, 50 pM, 30 pM, 20 pM o 10 pM segun se mide para suero sangumeo. El nivel de Mn2+ se puede medir preparando una muestra de suero proveniente de una muestra de sangre utilizando procedimientos estandar y analizando la muestra utilizando espectroscopia de absorcion atomica por ejemplo utilizando un espectrometro ICP-AES simultaneo Vista AX-CCD.

En una realizacion de la invencion, la concentracion unida y libre de Mn2+ en la sangre es menor de 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 o 0,1 mg/l o menor de 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,2 o 0,1 pM segun se mide para suero sangumeo. El nivel de Mn2+ se puede medir preparando una muestra de suero proveniente de una muestra de sangre utilizando procedimientos estandar y analizando la muestra utilizando espectroscopia de absorcion atomica por ejemplo utilizando un espectrometro ICP-AES simultaneo Vista AX-CCD.

En una realizacion de la invencion, el uso en el tratamiento o la prevencion esta dirigido a S. pneumoniae que crece en el pulmon del paciente, por ejemplo el tratamiento o la prevencion de neumoma. En una realizacion, la concentracion libre de Zn2+ en el pulmon es menor de 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3 o 1 pg/kg segun se mide a partir de un lavado bronquial. En una realizacion, la concentracion libre de Mn2+ en el pulmon es menor de 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3 o 1 pg/kg segun se mide a partir de un lavado bronquial. De manera opcional, el nivel de Zn2+ o Mn2+ se mide a partir de una muestra de tejido en cuyo caso la concentracion de Zn2+ (o Mn2+) en el tejido pulmonar es menor de 20, 15, 10, 5, 2 o 1 pg/g o 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 o 0,1 pM tal como se mide a partir de tejido pulmonar. De manera similar, el nivel de iones en la muestra de tejido se puede medir mediante espectroscopia de absorcion atomica por ejemplo utilizando un espectrometro ICP-AES simultaneo Vista AX-CCD.

En una realizacion, la infeccion por S. pneumoniae se produce en el compartimiento del ofdo, por ejemplo el ofdo medio, por ejemplo como una infeccion de otitis media. En una realizacion, el nivel de Zn2+ y/o Mn2+ en el ofdo medio

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En una realizacion, la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en las meninges, por ejemplo como una infeccion de meningitis. En una realizacion la concentracion de Zn2+ en el lfquido cefalorraqmdeo es menor de 1,5, 1, 0,75, 0,5, 0,25 o 0,1 pM o menor de 100, 75, 50, 40, 25, o 10 pg/l. En una realizacion, la concentracion de Mn2+ en el lfquido cefalorraqmdeo es menor de 2.5, 2, 1,5, 1 o 0,5 pg/l o menor de 50, 25, 10 o 5 nM.

En una realizacion de la invencion, el paciente humano tiene nivel(es) disminuido(s) de Zn2+ y/o Mn2+ segun se mide mediante lavado bronquial y/o analisis de sangre.

Con “nivel(es) disminuido(s)” se quiere decir que el nivel de Zn2+ y/o Mn2+segun se mide mediante lavado bronquial o analisis de sangre es menor del de un humano promedio.

En una realizacion de la invencion, el paciente humano a ser tratado con PhtX es deficiente en Zn2+ y/o Mn2+. Es decir, el nivel de Zn2+ y/o Mn2+ es menor del 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 o 1 % del nivel habitual para ese lfquido corporal, por ejemplo, suero sangumeo, lfquido cefalorraqmdeo, lfquido intersticial, lavado bronquial.

En una realizacion, el paciente humano esta estresado. El paciente estresado tiene en el cuerpo niveles mas bajos de Zn2+ y/o Mn2+, por ejemplo en la sangre, lfquido intersticial, lfquido cefalorraqmdeo y/o linfa.

En una realizacion, el paciente humano tiene en el cuerpo niveles mas bajos de Zn2+ y/o Mn2+ debido a infeccion previa con una cepa bacteriana, por ejemplo una cepa de S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae, S. aureus, S. epidermidis, C. difficile, estreptococos del Grupo A, estreptococos del Grupo B y/o M. catarrhalis. La infeccion previa opcionalmente es una infeccion bacteriana cronica.

En una realizacion, la administracion de PhtX, por ejemplo PhtD, es para el tratamiento o la prevencion de infeccion por Streptococcus pneumoniae en forma de septicemia, bacteremia, meningitis, otitis media o neumoma.

La protema PhtX tambien se puede combinar de forma beneficiosa con antfgenos adicionales en el procedimiento o el uso de la invencion. Con combinado, se quiere decir que la composicion inmunogenica comprende todas las protemas dentro de las siguientes combinaciones, ya sea como protemas portadoras o como protemas libres o una mezcla de las dos. Por ejemplo, en una combinacion de dos protemas como se indica en el presente documento, ambas protemas se pueden utilizar como protemas portadoras, o ambas protemas pueden estar presentes como protemas libres, o ambas pueden estar presentes como protema portadora y como protema libre, o una puede estar presente como una protema portadora y una protema libre mientras que la otra esta presente solamente como una protema portadora o solamente como una protema libre, o una puede estar presente como una protema portadora y la otra como una protema libre. En casos en los que se de una combinacion de tres protemas, existen posibilidades similares. Las combinaciones incluyen pero sin limitacion, PhtD + NR1xR2, PhtD + protemas quimericas o de fusion NR1xR2-Sp91Cterminal, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + protemas quimericas o de fusion NR1xR2-Sp91Cterminal, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. De manera opcional, NR1xR2 (o R1xR2) proviene de CbpA o PspC. De manera opcional esta proviene de CbpA. Otras combinaciones incluyen combinaciones de 3 protemas tales como PhtD + NR1xR2 + Ply, y PhtA + NR1xR2 + PhtD. En una realizacion, la composicion de vacuna comprende neumolisina destoxificada y PhtD o PhtDE como protemas portadoras. En una realizacion adicional, la composicion de vacuna comprende neumolisina destoxificada y PhtD o PhtDE como protemas libres. En una realizacion, la combinacion de protemas comprende PhtD y neumolisina o PhtD y neumolisina destoxificada. En una realizacion, el uso de la invencion utiliza una combinacion de PhtD, neumolisina destoxificada y al menos un sacarido capsular de S. pneumoniae, preferentemente conjugado a una protema portadora.

Un aspecto, la presente invencion proporciona una composicion inmunogenica que comprende una protema PhtX y al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 1,5, 16, 17, 18 o 20 conjugados de sacarido capsular de S. pneumoniae que contienen sacaridos de serotipos diferentes de S. pneumoniae. En tal realizacion, al menos un sacarido esta conjugado a una protema PhtX tal como PhtD o protema de fusion de la misma, y la composicion inmunogenica puede provocar una respuesta inmunitaria eficaz contra PhtX, por ejemplo PhtD. En un aspecto adicional de la invencion, la composicion inmunogenica comprende al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 1,5, 16, 17, 18 o 20 conjugados de sacarido capsular de S. pneumoniae que contienen sacaridos de serotipos diferentes de S. pneumoniae y una protema PhtX, por ejemplo PhtD como una protema libre o no conjugada.

En una realizacion, la composicion inmunogenica de la invencion comprende neumolisina. Preferentemente, la neumolisina esta destoxificada, por ejemplo mediante tratamiento qmmico o mediante mutacion de al menos un aminoacido.

La presente invencion adicionalmente proporciona una composicion inmunogenica que contiene un excipiente y/o un adyuvante farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones inmunogenicas de la presente invencion pueden tener adyuvantes, en particular cuando se pretenden para su uso en una poblacion de adultos de edad avanzada, pero tambien para su uso en poblaciones de ninos menores de un ano de edad. Los adyuvantes apropiados incluyen una sal de aluminio tal como gel de

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hidroxido de aluminio o fosfato de aluminio o alumbre, pero tambien pueden ser otras sales de metal tales como las de calcio, magnesio, hierro o cinc.

El adyuvante se selecciona opcionalmente para que sea un inductor preferencial de una respuesta de tipo TH1. Dichos niveles altos de citocinas tipo Th1 tienden a favorecer la induccion de respuestas inmunitarias mediadas por celula hacia un antigeno dado, mientras que los niveles altos de citocinas tipo Th2 tienden a favorecer la induccion de respuestas inmunitarias humorales hacia el antigeno.

La distincion de respuesta inmunitaria tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad un individuo soportara una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citocinas en terminos de la descrita en clones de linfocitos T CD4 +ve murinos por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, p145173)). Tradicionalmente, las respuestas tipo Th1 estan asociadas con la produccion de las citocinas INF-y e IL-2 por los linfocitos T. Otras citosinas, con frecuencia asociadas directamente con la induccion de respuestas inmunitarias tipo Th1, tales como IL-12, no las producen los linfocitos T. En contraste, las respuestas tipo Th2 estan asociadas con la secrecion de IL-4, IL-5, IL-6, IL-0. Los sistemas de adyuvante apropiados que promueven una respuesta predominantemente Th1 incluyen: monofosforil-lfpido A o un derivado del mismo (o lfpido A destoxificado en general - vease por ejemplo el documento WO2005107798), en particular monofosforil-lfpido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) (para su preparacion vease el documento GB 2220211 A); y una combinacion de monofosforil-lfpido A, opcionalmente monofosforil-lfpido A 3-des-O-acilado, junto con cualquiera de una sal de aluminio (por ejemplo fosfato de aluminio o hidroxido de aluminio) o una emulsion aceite en agua. En tales combinaciones, el antigeno y 3D-MPL estan contenidos en las mismas estructuras particuladas, lo que permite un suministro mas eficiente de senales antigenicas e inmunoestimuladoras. Los estudios han demostrado que 3D-MPL puede potenciar adicionalmente la inmunogenicidad de un antigeno adsorbido en alumbre [Thoelen y col. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].

Un sistema potenciado implica la combinacion de un monofosforil-lfpido A y un derivado de saponina, en particular la combinacion de QS21 y 3D-MPL como se desvela en el documento Wo 94/00153, o una composicion menos reactiva en la cual QS21 se extingue con colesterol como se desvela en el documento WO 96/33739. Una formulacion de adyuvante particularmente potente, que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsion aceite en agua, se describe en el documento WO 95/17210. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende adicionalmente una saponina, la cual puede ser QS21. La formulacion tambien puede comprender una emulsion aceite en agua y tocoferol (documento WO 95/17210). Los oligonucleotidos que contienen CpG no metilado (documento WO 96/02555) y otros oligonucleotidos inmunomoduladores (documentos WO0226757 y WO03507822) tambien son inductores preferenciales de una respuesta TH1, y son apropiados para su uso en la presente invencion.

Se ha sugerido que los adyuvantes de emulsion aceite en agua per se son utiles como composiciones de adyuvante (documento EP 0 399 843B), tambien se han descritos como adyuvantes para vacunas combinaciones de emulsiones aceite en agua y otros agentes activos (documentos WO 95/17210; Wo 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Se han descrito otros adyuvantes de emulsion de aceite, tales como emulsiones agua en aceite (documentos US 5.422.109; EP 0 480 982 B2) y emulsiones agua en aceite en agua (documentos US 5.424.067; EP 0 480 981 B). De las cuales todas forman sistemas de emulsion oleosa (en particular cuando se incorporan tocoles) para formar los adyuvantes y las composiciones de la presente invencion.

En una realizacion, la emulsion oleosa (por ejemplo emulsiones aceite en agua) tambien comprenden un emulsionante tal como TWEEN 80 y/o un esterol tal como colesterol.

En una realizacion, la emulsion oleosa (opcionalmente emulsion aceite en agua) comprende un aceite no toxico, metabolizable, tal como escualano, escualeno o un tocoferol tal como alfa-tocoferol (y opcionalmente tanto escualeno como alfa-tocoferol), y opcionalmente un emulsionante (o agente tensioactivo) tal como Tween 80. Tambien se puede incluir un esterol (por ejemplo colesterol).

El procedimiento para producir emulsiones aceite en agua es bien conocido por el experto en la materia. Comunmente, el procedimiento comprende mezclar la fase oleosa que contiene tocol con un agente tensioactivo tal como una solucion de PBS/TWEEN80™, seguido por homogenizacion utilizando un homogeneizador, sena evidente para un experto en la materia que un procedimiento que comprende hacer pasar la mezcla dos veces a traves de la aguja de una jeringa, sena apropiado para homogeneizar volumenes pequenos de lfquido. De igual manera, el procedimiento de emulsificacion en microfluidizador (maquina M110S Microfluidics, maximo de 50 pases, durante un periodo de 2 minutos a una entrada de presion maxima de 600 kPa (presion de salida de aproximadamente 85 MPa)) podna ser adaptado por el experto en la materia para producir volumenes mas pequenos o mas grandes de emulsion. La adaptacion se puede lograr mediante experimentacion de rutina que comprende la medicion de la emulsion resultante hasta que se logre una preparacion con gotas minusculas de aceite del diametro requerido.

En una emulsion aceite en agua, el aceite y el emulsionante deben estar en un vefuculo acuoso. El vefuculo acuoso puede ser, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato.

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Opcionalmente, el tamano de las gotitas de aceite encontradas dentro de la emulsion aceite en agua estable son menores de 1 micrometro, sustancialmente pueden estar en el intervalo de 30-600 nm, de manera opcional sustancialmente alrededor de 30-500 nm de diametro, y de manera opcional sustancialmente 150-500 nm de diametro, y en particular aproximadamente 150 nm de diametro, segun se mide mediante espectroscopia de correlacion de fotones. En este sentido, el 80 % de las gotitas de aceite en numero debe estar dentro de los intervalos, opcionalmente mas del 90 % y opcionalmente mas del 95 % de las gotitas de aceite en numero estan dentro de los intervalos de tamano definidos. Las cantidades de los componentes presentes en las emulsiones oleosas de la presente invencion, de forma convencional estan en el intervalo del 0,5-20 % o del 2 a 10 % de aceite (del volumen de dosis total), tal como escualeno; y cuando esta presente, del 2 a 10 % de alfa-tocoferol; y desde el 0,3 a 3 % de agente tensioactivo, tal como monooleato de polioxietileno sorbitano. De manera opcional, la relacion de aceite (por ejemplo escualeno):tocol (por ejemplo a-tocoferol) es igual o menor de 1, ya que esto proporciona una emulsion mas estable. Tambien puede estar presente un emulsionante, tal como Tween80 o Span 85, a un nivel de aproximadamente el 1 %. En algunos casos podna ser conveniente que las vacunas de la presente invencion contengan tambien un estabilizador.

Los ejemplos de sistemas de emulsion se describen en los documentos WO 95/17210, WO 99/11241 y WO 99/12565, los cuales desvelan adyuvantes de emulsion a base de escualeno, a-tocoferol, y TWEEN 80, formulados opcionalmente con los inmunoestimulantes QS21 y/o 3D-MPL.

Por lo tanto, en una realizacion de la presente invencion, el adyuvante de la invencion puede comprender adicionalmente inmunoestimulantes adicionales, tales como LPS o derivados del mismo, y/o saponinas. Los ejemplos de inmunoestimulantes adicionales se describen en el presente documento y en “Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach” 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volumen 6, Eds. Powell, M.F., y Newman, M.J., Plenum Press, Nueva York y Londres, ISBN 0-306-44867-X.

Las preparaciones de vacuna que contienen composiciones inmunogenicas de la presente invencion se pueden utilizar para proteger o tratar un mairnfero susceptible a la infeccion, por medio de la administracion de dicha vacuna a traves de la via sistemica o en mucosas. Estas administraciones pueden incluir inyeccion a traves de las vfas de administracion intramuscular (IM), intraperitoneal (IP), intradermica (ID) o subcutanea (SC); o a traves de administracion en las mucosas a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Es posible la administracion intranasal (IN) de las vacunas para el tratamiento de neumoma u otitis media (ya que la presencia nasofarmgea de neumococos se puede evitar de manera mas efectiva, atenuando de este modo la infeccion en su etapa mas temprana). Aunque la vacuna de la invencion se puede administrar como una dosis unica, los componentes de la misma tambien se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o en tiempos diferentes (por ejemplo los conjugados de sacarido neumococico se pueden administrar por separado, al mismo tiempo o 1-2 semanas despues de la administracion de cualquier componente de protema bacteriana para la coordinacion optima de las respuestas inmunitarias una con respecto a la otra). Para la coadministracion, el adyuvante opcional para Th1 puede estar presente en cualquiera o en todas las diferentes administraciones. Ademas de una via de administracion unica, se pueden utilizar 2 vfas de administracion diferentes. Por ejemplo, los sacaridos o conjugados de sacarido se pueden administrar IM (o ID) y las protemas bacterianas se pueden administrar IN (o ID). Ademas, las vacunas de la invencion se pueden administrar IM para dosis de cebado e IN para dosis de refuerzo.

El contenido de antfgenos de protema en la vacuna tfpicamente esta en el intervalo de 1-100 |ig, opcionalmente de 5-50 |ig, por ejemplo en el intervalo de 5-25 |ig. Despues de una vacunacion inicial, los individuos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas de forma adecuada.

La preparacion de vacunas se describe en terminos generales en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Fullerton, patente E.U.A. 4.235.877, describe la encapsulacion dentro de liposomas.

Las vacunas o composiciones inmunogenicas de la presente invencion se pueden almacenar en solucion o liofilizadas. En una realizacion, la solucion se liofiliza en presencia de un azucar que actua como un lioprotector amorfo, tal como sacarosa, trehalosa, glucosa, manosa, maltosa o lactosa. En una realizacion, la solucion se liofiliza en presencia de un azucar que actua como un lioprotector amorfo, y de un agente formador de volumen que provea estructura mejorada de torta, tal como glicina o manitol. La presencia de un agente cristalino formador de volumen permite el acortamiento de los ciclos de congelamiento-desecado, en presencia de concentracion alta de sal. Los ejemplos de dichas mezclas para su uso en la liofilizacion de las composiciones inmunogenicas o vacunas de la invencion incluyen sacarosa/glicina, trehalosa/glicina, glucosa/glicina, manosa/glicina, maltosa/glicina, sacarosa/manitol/trehalosa/manitol, glucosa/manitol, manosa/manitol y maltosa/manitol. Tfpicamente, la relacion molar de los dos constituyentes es, de forma opcional, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 o 1:6. Las composiciones inmunogenicas de la invencion comprenden de forma opcional a los reactivos de liofilizacion descritos anteriormente.

Los agentes estabilizadores anteriores y las mezclas de agentes estabilizadores pueden tambien incluir un polfmero que pueda aumentar la temperatura de transicion vftrea (Tv') de la formulacion, tal como poli(vinilpirrolidona) (PVP), almidon hidroxietilo o dextrano, o un polfmero que actua como un agente cristalino formador de volumen tal como polietilenglicol (PEG) que tenga por ejemplo un peso molecular entre 1500 y 6000, y dextrano.

Aunque las composiciones inmunogenicas de la presente invencion se pueden administrar mediante cualquier via, la administracion de las vacunas descritas al interior de la piel (ID) forma una realizacion de la presente invencion. La piel humana comprende una cutfcula exterior “cornea”, llamada el estrato corneo, la cual recubre la epidermis. Debajo de esta epidermis esta una capa llamada la dermis, la que a su vez recubre el tejido subcutaneo. Los 5 investigadores han demostrado que la inyeccion de una vacuna al interior de la piel, y en particular la dermis, estimula una respuesta inmunitaria, la cual tambien puede asociarse con diversas ventajas adicionales. La vacunacion intradermica con las vacunas descritas en el presente documento forma una caractenstica opcional de la presente invencion.

La tecnica convencional de inyeccion intradermica, el “procedimiento mantoux”, comprende las etapas de limpiar la 10 piel, y despues estirarla con una mano, y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (calibre 26-31) orientado hacia arriba, la aguja se inserta en un angulo de entre 10-15°. Una vez que el bisel de la aguja esta insertado, se baja el barril de la aguja y se hace avanzar adicionalmente al tiempo que se proporciona una ligera presion para elevarla bajo la piel. Despues el lfquido se inyecta muy lentamente con lo cual se forma una vesfcula o protuberancia en la superficie de la piel, seguido por retiro lento de la aguja.

15 Mas recientemente, se han descrito dispositivos que estan espedficamente disenados para administrar agentes lfquidos al interior o a traves de la piel, por ejemplo los dispositivos descritos en los documentos WO 99/34850 y EP 1092444, tambien los dispositivos de inyeccion a chorro descritos por ejemplo en los documentos WO 01/13977; E.U.A. 5.480.381, E.U.A. 5.599.302, E.U.A. 5.334.144, E.U.A. 5.993.412, E.U.A. 5.649.912, E.U.A. 5.569.189, E.U.A. 5.704.911, E.U.A. 5.383.851, E.U.A. 5.893.397, E.U.A. 5.466.220, E.U.A. 5.339.163, E.U.A. 5.312.335, E.U.A. 20 5.503.627, E.U.A. 5.064.413, E.U.A. 5.520.639, E.U.A. 4.596.556, E.U.A. 4.790.824, E.U.A. 4.941.880, E.U.A.

4.940.460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Los procedimientos alternativos de administracion intradermica de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringas y agujas convencionales, o dispositivos disenados para el suministro balfstico de vacunas solidas (documento WO 99/27961), o parches transdermicos (documento WO 97/48440; documento WO 98/28037); o aplicados a la superficie de la piel (suministro transdermico o transcutaneo 25 documento WO 98/20734; documento WO 98/28037.

Las expresiones “que comprende”, “comprenden” y “comprende” en el presente documento estan pensados por los inventores para que sean opcionalmente sustituibles por las expresiones “que consiste en”, “consisten de” y “consiste en”, respectivamente, en cada caso.

Las realizaciones en el presente documento que se refieren a “composiciones de vacuna” de la invencion tambien 30 son aplicables a realizaciones que se refieren a “composiciones inmunogenicas” de la invencion, y viceversa.

Para que la presente invencion pueda entender mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solo para fines de ilustracion, y no se deben considerar como limitantes del ambito de la invencion en modo alguno.

Ejemplos

Procedimientos

35 Animales

Los ratones OF1 y CBA/J hembra utilizados en este estudio se adquirieron de los laboratorios Charles River (Lyon, Francia). Los ratones Balb/c provienen de Harlan (Horst, Los Pafses Bajos). Todos los experimentos y ensayos se realizaron en las instalaciones de GlaxoSmithKline Biologicals (GSK, Rixensart, Belgica) en conformidad con los lineamientos nacionales Belgas para la experimentacion con animales.

40 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

JC Paton (Universidad de Adelaida, Australia) proporciono amablemente la cepa 2/D39. Las cepas 4/CDC y 6B/CDC se obtuvieron del Centro para Control y Prevencion de Enfermedades (Center for Disease Control and Prevention (CDC)), y la cepa 19F/2737 de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (American type culture collection (ATCC)). E Yourassowski (Hospital Brugmann, Universidad de Bruselas, Belgica) proporciono la cepa 3/43.

45 Andrew Camilli proporciono amablemente la cepa TIGR4 de S. pneumoniae {Tettelin 2001} (Escuela de Medicina de la Universidad Tufts, Boston, MA, E.U.A.). David E Briles (Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, Alabama, E.U.A.) proporciono amablemente la cepa WU2. La cepa tipo 4 se obtuvo del CDC (Centro para Control y Prevencion de Enfermedades).

Los neumococos se cultivaron de forma rutinaria en caldo de Todd-Hewitt (THB, Difco) con extracto de levadura al 50 0,5 % (p/v) a 37°C/CO2al 8 %. Cuando era apropiado, se anadio eritromicina y/o espectinomicina (Sigma-Aldrich,

Bornem, Belgica) a una concentracion de 0,2 y 250 |ig/ml; respectivamente.

Las cepas DH5a y JM109 de Escherichia coli (Gibco BRL, Life Technology) se cultivaron en caldo de Luria-Bertani (LBT, Difco) con o sin Bacto-agar (Difco) al 1,5 % (p/v) a 37°C durante 16 horas. Cuando era apropiado, se anadio eritromicina o espectinomicina al medio de crecimiento a una concentracion de 100 |ig/ml.

Para el estudio sobre la aparicion de Pht, ademas de las 23 cepas propias y de la red de epidemiolog^a molecular neumococica (siglas del ingles: PMEN), TJ Mitchell (Escocia) proporciono 34 aislados, RE Gertz (EE.UU.) 6, AB Brueggemann (RU) 2 y 9 provinieron de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC).

Ant^genos

5 CbpA (o PspC) es una protema recombinante truncada, como se describe en Brookes-Walter y col. J. Infect.Dis. 67; 6533-6542 (1999), que proporciono amablemente JC Paton. La protema se construyo a partir de la secuencia de la cepa D39 y por lo tanto pertenece al clado A. PspA (clado 2) y PsaA son protemas recombinantes y se originan a partir de la cepa 2/D39 Ogunniyi y col. Infect. Immun. 68; 3028-3033 (2000), ambas proporcionadas por JC Paton.

Tratamiento y analisis de ADN

10 El ADN de plasmido de Escherichia coli se obtuvo utilizando el kit Plasmid Midi o Mini Purification (Qiagen Benelux, Venlo, Los Pafses Bajos). Los productos de PCR se purificaron con el kit de purificacion para PCR QIAquick y los productos de digestion de ADN se purificaron en gel de agarosa al 1 % (p/v) utilizando el kit para extraccion en gel QIAquick (Qiagen). Las enzimas de restriccion y de ligamiento se obtuvieron a partir de New England BioLabs (Westburg, Leusden, Belgica). Se utilizo el sistema Expand High Fidelity (Roche, Mannheim, Alemania) para cada 15 reaccion de PCR de estos estudios. Todos los productos comerciales se utilizaron bajo las condiciones recomendadas por los proveedores.

La determinacion de secuencia de ADN se lleva a cabo con el kit para determinacion de secuencia Big Dye Terminator en un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosystems (modelo 3100) (Applied Biosystems Inc, Forster City, CA, E.U.A.). Los analisis de secuencia se realizaron con el programa informatico MacVector V6.5 20 (Oxford Molecular Ltd., Madison) o con el programa informatico Vector NTI 7.1 (Informax), y las secuencias se compararon con la secuencia disponible del genoma de S. pneumoniae TIGR4 (
www.tigr.org) {Peterson 2001}.

Extraccion del ADN genomico de S. pneumoniae

El ADN cromosomico de cada cepa se obtuvo recolectando el cultivo confluente de una noche de una o dos placas de agar sangre altamente inoculadas en 1 ml de TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 5 mM; pH 7,8). La suspension 25 bacteriana se centrifugo en una microcentnfuga durante 5 minutos a velocidad maxima y el sedimiento se resuspendio en 75 pl de TE. Los lisados celulares se obtuvieron mediante adicion secuencial de 20 pl de lisozima (100 mg/ml) y de 20 pl de proteinasa K (20 mg/ml) e incubacion a 37°C, 45 minutos. Despues, se anadieron 500 pl de tampon de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; NaCl 0,14 M; citrato de sodio 0,1 M; EDTA 1 mM, pH 8,0; desoxicolato de sodio al 0,1 % (p/v)) y se incubo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de este periodo de 30 incubacion, se anadieron 250 pl de acetato de amonio (7,5 mM, pH 7,7) al lisado crudo y se incubo 10 minutos en hielo. El ADN viscoso se extrajo dos veces con fenol/cloroformo/isoamilo (25:24:1) y se precipito en alcohol isopropflico. El ADN resultante se lavo con etanol al 70 % (v/v) y se resuspendio en 50 pl de TE que contema 0,6 pl de ARNasa A (10 mg/ml). Las suspensiones de ADN se reservaron a 4°C.

Aislamiento de ARN

35 El ARN total se aislo a partir de neumococos cultivados a partir de una densidad optica a 600 nm (DO600) de 0,01 en THY hasta DO600 diferentes para evaluar la expresion genica en diferentes fases de crecimiento (logantmica inicial, DO600 = 0,3; logantmica tardfa, DO600 =0,9; estacionaria, DO600 = 1,2). Las celulas se centrifugaron y resuspendieron en Tris-EDTA sin ARNasa que contema 6 mg de lisozima por ml y 1 mg de desoxicolato de sodio por ml, y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Despues de incubar, se realizo el aislamiento del ARN con el 40 kit QIAGEN RNeasy Mini siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico contaminante se elimino incubando las muestras de ARN con 1 unidad de ADNasa I por pg de ARN durante 1 hora a 37°C, seguido por inactivacion de ADNasa con EDTA 2,5 mM durante 10 minutos a 65°C. El ARN total se cuantifico utilizando el kit para cuantificacion de ARN Ribogreen® (Molecular Probes), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Amplificacion rapida del extremo 5' de ADNc (RACE)

45 El procedimiento utilizado para identificar los inicios de transcripcion se adapto de Ranasinghe y Hobbs {Ranasinghe 1998}. Brevemente, se utilizo un cebador espedfico para el extremo 3' del gen phtE para sintetizar el ADN complementario (ADNc) de primera cadena, a partir del ARN total con la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Despues se anadio ARNasa A durante 1 hora a temperatura ambiente para generar extremos 3' romos en el tnbrido de ADNc-ARN. El tnbrido se inserto en el plasmido pKS 50 digerido con EcoRV (Stratagene) utilizando ADN ligasa T4 (incubacion durante una noche, 16°C). Se establecio una reaccion de PCR para amplificar el extremo 5' utilizando otro cebador de phtE antisentido espedfico del extremo 3' y el cebador del promotor T7 espedfico de pKS. Se realizo la determinacion de secuencia de la union pKS-ADNc para identificar la base +1.

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Identificacion del terminador de la transcripcion

La identificacion del terminador se realizo utilizando el paquete Wisconsin Sequence Analysis version 10.1 (Genetics Computer Group) a base del procedimiento de Brendel y Trifonov {Brendel 1984}.

RT-PCR

Los estudios de RT-PCR se realizaron de la siguiente manera. Primero se desnaturalizo el ARN (2 |jg) durante 5 minutos a 65°C en una mezcla que contema cebador antisentido espedfico del extremo 3' del gen 10 pM y 20 unidades de ARNasaOut en un volumen total de 10 pl. Despues se llevo a cabo la reaccion de transcripcion inversa mediante adicion de ditiotreitol 5 mM, dNTP 1 mM, 15 unidades de transcriptasa inversa Thermoscript (Invitrogen), tampon para smtesis de ADNc 1X y agua esteril sin de ARNasa hasta un volumen de 20 pl. La mezcla de transcripcion inversa se incubo a 56-58°C durante 1 hora, seguido por desnaturalizacion de la transcriptasa inversa durante 5 minutos a 85°C. La cadena de ARN en los hnbridos de ARN-ADNc se degrado incubando la solucion de transcripcion inversa a 37°C durante 20 minutos con 1 unidad de ARNasa H. La reaccion de PCR se llevo a cabo con 2 pl de ADNc utilizando diferentes cebadores sentido 5' espedficos del gen y los cebadores antisentido 3' espedficos del gen, utilizados para la reaccion de transcripcion inversa (concentraciones finales 0,5 pM), dNTP 0,2 mM, tampon para reaccion de ADN polimerasa Taq, 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq (Amersham Biosciences) y agua esteril hasta un volumen de 50 pl. El ciclo de PCR consistio en desnaturalizacion inicial a 94°C durante 5 minutos, seguido por 25-30 ciclos de desnaturalizacion a 94°C durante 15-30 segundos, hibridacion a 55°C (phtE, phtD) o 63°C (phtB, D, A) durante 15-30 segundos y extension a 72°C durante 1 minuto, y se completo mediante u final de extension a 72°C durante 5-7 minutos. Tambien se efectuo un control negativo constituido por ARN sin reaccion de transcripcion inversa para excluir la contaminacion por ADN en la preparacion de ARN. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % (p/v) y se visualizo mediante tincion con bromuro de etidio.

Preparacion de mutantes de Pht

Se construyeron los vectores de mutador a partir del vector pGEM-T (Promega Benelux, Leiden, los Pafses Bajos), que se replica en E. coli pero no en S. pneumoniae. Estos contienen zonas recombinantes que corresponden a las regiones corriente arriba y corriente abajo de los genes pht que se van a suprimir, se amplificaron mediante PCR, que rodean a un gen de resistencia a antibiotico (los cebadores y sitios de restriccion utilizados para construir los vectores mutadores se pueden proporcionar bajo pedido). Para preparar el mutante cuadruple deficiente en Pht, se tuvieron que utilizar dos genes diferentes de resistencia a antibiotico con el fin de combinar la delecion en los dos locus diferentes (locus phtD/phtE, y locus phtA/phtB). Se selecciono para el locus phtD/phtE un gen de resistencia a eritromicina (ermB), amplificado a partir de un derivado del vector pJDC9. Para el locus phtA/phtB, se utilizo un gen de resistencia a espectinomicina (gen aad(9)), purificado a partir del plasmido pR350 (que proveyo amablemente J Paton).

La clonacion con los diferentes plasmidos construidos se realizo en las cepas DH5a o JM109 de E. coli, y se sembraron en placas de agar lB con los antibioticos respectivos. La transformacion de E. coli con el ADN de plasmido se llevo a cabo mediante procedimientos estandar con celulas tratadas con CaCl2 {Hanahan 1985}.

La cepa 4/CDC de S. pneumoniae se preparo para la transformacion mediante dos etapas de crecimiento sucesivas, antes de resuspender en medio CTM (Casaminoacidos 10 g/l; 5 g/l de triptona; NaCl5 g/l; extracto de levadura 10 g/l; K2HPO4 0,4 M; glucosa al 20 %; glutamina 30 mg/ml; BSA al 1 %, CaC^0,1 M; pH 7,8) tomando alfcuotas y congelando en glicerol al 15 %. Dichas alfcuotas se utilizan para la transformacion. Despues de descongelar, se anadio CSP-1 o CSP-2 (100 ng/ml en medio CTM) para inducir la competencia, y las bacterias se incubaron a 37°C. Para optimizar la competencia se tomaron diferentes puntos de tiempo (5, 10, 15, y 20 minutos). Despues de la adicion de 1 pg del vector mutador, las celulas se incubaron a 32°C durante 30 minutos, con agitacion, seguido por 2-4 horas a 37°C, en CO2 al 5 %. Por ultimo, las bacterias se sembraron en placas de agar sangre con los antibioticos apropiados. Para el mutante cuadruple, la cepa PhtD,E-KO se transformo con el plasmido que ocasiona la deficiencia de PhtA,B utilizando el mismo protocolo que se describio anteriormente.

SDS-PAGE y analisis por transferencia Western

Las suspensiones bacterianas destruidas con calor se obtuvieron recolectando el cultivo confluente de una noche a partir de 5 placas de agar sangre altamente inoculadas, en 1 ml de PBS esteril (NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH 7,2), y una etapa de incubacion a 56°C durante 45 minutos. Despues, se anadio tampon para muestra (base Trizma 60 mM, sDs al 1 % (p/v), glicerol al 10 % (v/v), azul de bromofenol al 0,01 % (p/v), p-mercaptoetanol al 2 % (v/v)) a las suspensiones destruidas con calor. Las preparaciones se hirvieron durante 5 minutos, se centrifugaron en una microcentnfuga a maxima velocidad durante 2 minutos y se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) segun describe Laemmli {Laemmli 1970}. Las protemas se transfirieron mediante electroforesis de los geles de poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Richmond, CA), como se describe {Towbin 1979}. Las membranas se sondearon con un anticuerpo policlonal de raton generado contra PhtD, seguido por anti-IgG de raton, de cabra, conjugado con fosfatasa alcalina (Promega Benelux.). Las bandas marcadas con enzima se visualizaron con un sistema de substrato NBT/BCIP.

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Crecimiento de cultivo en medio deficiente en iones

La cepa 4/CDC de tipo silvestre, y los correspondientes mutantes deficientes en PhtD y deficientes en Pht cuadruples se cultivaron bajo condiciones diferentes de empobrecimiento o complementacion de ion en un medio sintetico qmmicamente definido (MS) {SICARD 1964}. El medio MS se complemento mediante concentraciones cada vez mayores de, alternativamente, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, o Zn2+. Se controlo la densidad optica a 600 nm durante la fase logantmica y en la fase estacionaria. Los resultados se compararon con los del tipo silvestre.

La cepa WU2 de tipo silvestre se cultivo con o sin el quelante espedfico de Zn, N,N,N',N',-tetrakis(2-piridilmetil)- etilendiamina (TPEN) para observar el efecto del empobrecimiento de cinc sobre la expresion de Pht a los niveles de ARN (mediante RT-PCR) y protema (mediante citometna de flujo).

Citometna de flujo

Las bacterias WU2 se cultivaron en THB + extracto de levadura al 0,5 % a 37°C, CO2 al 8 %, hasta la fase logantmica. De manera alternativa, se anadio al medio TPEN 30 jM, un quelante de cinc. Despues de centrifugar, los sedimentos bacterianos se resuspendieron en una solucion que contema anticuerpos monoclonales anti-PhtE, anti-PhtB/D, anti PhtD/E o anti-polisacaridos tipo 3 como control. Despues de 2 horas a 4°C, las soluciones se centrifugaron, los sedimentos bacterianos se lavaron en PBS-BSA al 2 % antes de incubarlos durante 1 hora a temperatura ambiente en anticuerpo secundario de cabra anti-raton conjugado con AlexaFluor™ (Molecular Probes) en PBS-BSA al 2 %. Despues de lavar, las celulas se fijaron en PBS-formaldelddo al 0,25 % y se realizo el analisis de FACS. Se registro la mediana de la fluorescencia de superficie.

PCR de transcriptasa inversa cuantitativa

El ARN total proveniente de la cepa D39 cultivada hasta una D.O ~ 0,5 (semi-log) se purifico utilizando el kit RNeasy™ Midi (Qiagen) y se cuantifico con el kit para ensayo de ARN Quant-iT™ RiboGreen™ (Invitrogen). Las muestras (1 g) se procesaron dos veces con 1,5 pi de ADNasa RQ1 sin ARNasa (Promega) durante 30 minutos a 37°C. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 1 pi de ADNasa STOP seguido por incubacion durante 10 minutos a 65°C. El ADNc de la primera cadena se genero utilizando la transcriptasa inversa Superscript™ II (Invitrogen), cebadores aleatorios (Invitrogen) y el inhibidor de ribonucleasa recombinante RNasin™ (Promega). La PCR en tiempo real se llevo a cabo en un volumen de reaccion de 50 pi utilizando el kit de reactivos TaqMan™ PCR Core (Applied Biosystems), segun describe por el fabricante. Se utilizaron los siguientes cebadores y sondas: gyrB, GGGAAATAGCGAAGTGGTCAAG (sentido), GGAATCGGAGAAGGCTTCAC (antisentido) y TTACCAATCGCCTCTTC (sonda); phtD, CCCATGCGGACAATATTCG (sentido), TGACTGCGTTCCTGCTTCTG (antisentido), CGTTTAATCTCTTCTTTTGT (sonda).

Todos los ensayos se hicieron por duplicado (desde el cultivo hasta PCR-c) y se analizo la transcripcion relativa del gen mediante el procedimiento 2'aaCx (Livak y Schmittgen, 2001) utilizando gyrB como control interno y crecimiento en THB solo como calibrador.

Determinacion de la aparicion de Pht

Con el fin de seleccionar cepas representativas de S. pneumoniae, se analizo la estructura de la poblacion en conformidad con el genotipo de cepa segun se determina mediante MLST (sigla del ingles de Multilocus sequence Typing: Tipo de Secuencia Multi-Locus;
www.mlst.net). A base del Tipo de Secuencia (ST) de aislado de MLST, se determinaron los linajes clonales principales. Para cada grupo, se selecciono una cepa representativa para el analisis de aparicion, el cual se llevo a cabo mediante transferencia Western en extractos bacterianos enteros con anticuerpos policlonales anti-PhtD (reactividad cruzada con A, B y D) o anti-PhtE, y mediante PCR en ADN genomico neumococico utilizando cebadores espedficos para PhtA, B, D o E.

Determinacion de secuencia de ADN para analisis de conservacion de PhtD

El ADN de 107 cepas seleccionadas por MLST se amplifico mediante PCR utilizando cebadores de oligonucleotido espedficos para PhtD. Las 107 secuencias se alinearon mediante el programa ClustaIX y se calculo la identidad mediante el programa Superneedle (porcentaje de identidad es 100 x (numero de identidades/longitud de la secuencia mas corta)).

Ejemplo 1

Caracterizacion de los genes pht

Organizacion genomica de los genes pht

En un trabajo previo, la determinacion de secuencia de ADN de clones solapantes provenientes de una biblioteca genomica de la cepa SP64 de S. pneumoniae {Hamel 2004} y el analisis de PCR permitio la deduccion de la organizacion genomica de los genes pht y de sus genes colindantes en esta cepa tipo 6B. Los genes phtA y phtB, asf como los genes PhtD y PhtE, estan organizados como un par. El analisis BLAST en el sitio en la red TIGR (
www.tigr.org) {Peterson 2001} indico que los dos tandems de genes estan localizados separados aproximadamente

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por 161 kpb en el genoma TIGR4 de S. pneumoniae y que la organizacion genomica es identica a la observada en la cepa SP64 (Figura 1). Tambien se encontro la misma organizacion del gen pht en la cepa 4/CDC y en la cepa WU2, con la excepcion de que phtA esta perdido en esta ultima (datos no mostrados). La determinacion de secuencia de los genes pht que rodean al ADN de la cepa TIGR4 confirmo esta ultima observacion (datos no mostrados). Analisis adicionales demostraron que phtA y phtB estan separados por 157 pb, mientras que phtD y phtE estan separados por 209 pb en la cepa TIGR4, la cual se eligio para trabajos posteriores.

En el lado del tandem phtD-phtE, un gen que presenta 72 % de similitud de secuencia con los genes Imb de los estreptococos de los grupos A y B, que codifica las protemas de union a laminina (n.° de referencia AAK34689 {Ferretti 2001} y AAD13796 {Spellerberg 1999}, respectivamente), esta localizado 7 pb corriente arriba del gen phtD (Figura 1). Recientemente, este producto de gen se denomino tambien como AdcAII, y se describio como una protema de union a cinc similar a transportador ABC {Loisel 2008}. Un ORF de 1392 pb, localizado a 142 pb corriente arriba del homologo del gen Imb, codifica una protema que presenta 64 % de similitud de secuencia con la protema YfnA transportadora de metabolito de Bacillus subtilis (n.° de referencia D69814) y 81 % de similitud con una permeasa de aminoacido supuesta de S. pyogenes (n.° de referencia AAK33157) {Ferretti 2001, Kunst 1997}. Se encontro una secuencia que presenta 79 % de identidad con los primeros 481 pb de phtE (propuesto phtF) 226 pb despues del codon de detencion de phtE (Figura 1). Esta secuencia tambien muestra 72 % de identidad con los genes phtA, B y D.

En el lado del tandem de phtA-phtB, un ORF de 1332 pb, que presenta 73 % de similitud de secuencia con el gen ptsI de Streptococcus salivarius (numero de referencia P30299) {Gagnon 1992}, se localizo 253 pb corriente arriba del gen phtA (Figura 1). Este gen presenta un desplazamiento del marco de lectura en la cepa TIGR4 al que se le determino la secuencia y se comparo con el gen ptsI encontrado en la secuencia del genoma completo (n.° de referencia AAK75285). No se localizo ORF funcional inmediatamente corriente abajo de ambos pares de genes.

Ejemplo 2

Organizacion transcripcional de los genes pht

La organizacion genomica de los genes pht sugirio que los genes en tandem debenan transcribirse de manera coordinada. Por lo tanto, se realizaron estudios adicionales para examinar esta hipotesis. Primero, se identificaron los promotores y los sitios de union a ribosoma supuestos de los genes pht. La 5'-RACE en el gen phtE permitio la identificacion de su inicio de transcripcion, a partir del cual se dedujo la region de promotor. Se encontro que el sitio de inicio de transcripcion (+1) esta localizado 96 bases corriente arriba del sitio de inicio de traduccion de PhtE, corriente abajo de los sitios de union de ARN polimerasa -10 y -35 de S. pneumoniae tfpicos {Morrison 1990} y corriente arriba de un sitio de union a ribosoma (Figura 2a). Se encontro una organizacion de secuencia similar corriente arriba de los genes phtA, phtB e yfnA, lo que indica la presencia de promotores supuestos (Figuras 2b, c y e). Sin embargo, debido a la proximidad cercana del gen Imb (7 pb), no se identifico secuencia de promotor para el gen phtD. Por otro lado, una secuencia identica a las secuencias -35 de los otros genes pht se localizo corriente arriba del gen Imb (Figura 2d). Los sitios de union a ribosoma se observaron 5 a 7 pb corriente arriba de todos los codones de inicio. Tambien se identificaron los sitios de terminacion de la transcripcion del gen pht y genes adyacentes. El analisis por ordenador de las estructuras secundarias predichas de ARNm sugirio la presencia de estructuras similares a terminador de tallo lazo en los extremos 3' de los genes. Se podnan formar estructuras de horquilla con energfas libres de disociacion (AG) calculadas de -9,4, -27,0, -16,8, y -21,6 kcal/mol para phtB, phtD, phtA, y ptsI respectivamente, segun se determina mediante el procedimiento de Turner y col. (1988) {Turner 19988} (Figura 3a). De hecho, el terminador identificado para el gen phtD fue identico al reportado por el sitio en la red TIGR para ORF SP1003, el cual corresponde al homologo del gen phtD (
www.tigr.org). No se identificaron terminadores de la transcripcion por el grupo TIGR para los otros genes pht o genes circundantes, reflejando probablemente diferencias en los algoritmos utilizados por ambos estudios. La mayona de las horquillas acababan con un tramo de restos T, como el tfpicamente encontrado en los terminadores de la transcripcion procariotas {Rosenberg 1979} y se localizan dentro de 70 pb corriente abajo de los codones de detencion (Figura 3). De manera interesante, la secuencia de terminador de phtE (AG de -4,7 kcal/mol) se localizaba 1867 pb corriente abajo de su codon de detencion y del gen phtF, conteniendo el ultimo ORF codones de detencion en marco que evitan su traduccion (Figura 3a). No se identificaron secuencias de terminador corriente abajo de los genes yfnA e Imb.

La organizacion genomica sugirio que phtE podna ser parte de un operon constituido por los genes yfnA, Imb, phtD, phtE y phtF. No obstante, la 5'-RACE (Figura 2a) y la identificacion del terminador (Figura 3a) indicaron que phtE era el primer gen transcrito en un mensaje bicistronico, constituido por los genes phtE y phtF, lo cual se confirmo mediante RT-PCR. Las regiones phtE a phtF se amplificaron mediante RT-PCR (Figura 4a, carriles 4 y 6), mientras que no se obtuvo producto de amplificacion con el par de cebadores espedficos para la region entre los genes phtD y phtE (Figura 4a, carril 5), lo que indica la terminacion de la transcripcion corriente abajo de phtD (Figura 3c).

Como se muestra en la Figura 4a (carriles 1 a 3), la RT-PCR amplifico las regiones yfnA a phtD. Ademas, Loisel y col. {Loisel 2008} han demostrado que este transcrito de phtD tambien codifica, ademas de yfnA, lmb y phtD, los dos genes corriente arriba de yfnA (ccdA, que esta implicado en la biogenesis del citocromo c y spr0904 que presenta similitud con tiorredoxina). Como un aspecto interesante, la identificacion de un promotor supuesto corriente arriba del gen lmb (Figura 2d) sugirio acoplamiento transcripcional de los genes phtD e lmb.

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Los resultados obtenidos para los genes phtB y phtA mostraron que estos se transcriben como moleculas de ARNm monocistronicas, como sugirio la identificacion de los sitios de promotor (Figura 2b y 2c) y de terminador (Figura 3b y 3d). El analisis de la organizacion transcripcional de phtA y phtB mediante RT-PCr con cebadores espedficos de phtB, revelo un amplicon espedfico de phtB (Figura 4a, carril 7). No se obtuvo producto de amplificacion mediante RT-PCR con cebadores que amplifican la region entre phtA y phtB (Figura 4a, carril 8), lo que indica una organizacion monocistronica de los genes phtA y phtB. La identificacion del sitio de terminador (Figura 3e) indico que ptsI se transcribe como un mensaje monocistronico, lo cual tambien confirma que phtA no es parte de un transcrito policistronico.

Ejemplo 3

Construccion y uso de mutantes de Pht

Caracterizacion de los mutantes

Se construyeron los mutantes PhtA", PhtB-, PhtD-, PhtE-, y el mutante cuadruple PhtABDE-. Para evaluar la exactitud de la recombinacion, se purifico el ADN genomico de las cepas mutantes y las regiones recombinantes se sometieron a determinacion de secuencia (datos no mostrados). Asimismo, los mutantes se caracterizaron fenotipicamente mediante inmunotransferencia, utilizando un anticuerpo anti-PhtD policlonal de raton (Figura 5). Este anticuerpo reconocio los cuatro isotipos de Pht. Sin embargo, las bandas de PhtE seran mas tenues, lo que confirmo la gran divergencia de esta Pht con respecto a las otras tres.

Influencia de diversos iones sobre el crecimiento bacteriano

El crecimiento del mutante cuadruple de Pht disminuyo dramaticamente en medio MS, en comparacion con el de la cepa de tipo silvestre y de los diferentes mutantes unicos de Pht (Figura 6a). Cuando el medio se complemento con hasta 200 |iM de Fe2+, Zn2+, o Mn2+, el crecimiento del tipo silvestre y del mutante deficiente en PhtD mejoro ligeramente (velocidad de crecimiento contra MS solo: 96-130 %). Por el contrario, el comportamiento del mutante cuadruple fue sorprendente. Mientras que la adicion de 200 |iM de Fe2+ al MS solo indujo un aumento del crecimiento del 25,3 % (Figura 6d), la misma concentracion de Zn2+ o Mn2+ restablecio la habilidad de crecimiento del mutante cuadruple (Figura 6b,c). Esto representa hasta el 92,3 % de aumento en la velocidad de crecimiento, en comparacion con la obtenida en MS solo. Sin embargo, esta recuperacion de la velocidad de crecimiento era retardada, solamente visible despues de incubacion durante una noche, ya que no era visible la mejora dentro de las primeras horas de cultivo. La adicion de Mg2+ no restablecio el crecimiento de forma completa a 200 pM, como lo hizo Zn2+ o Mn2+, pero se obtuvo aumento similar en las velocidades de crecimiento cuando se anadio Mg2+1 mg/ml al MS (datos no mostrados). La adicion de concentraciones altas de Cu2+ fue toxica para las cepas del tipo silvestre y mutantes (datos no mostrados).

Ejemplo 4

Efecto del empobrecimiento de cinc sobre la expresion de pht

Cuando el quelante de cinc TPEN se anadio al medio de cultivo, se aumento el nivel de expresion de las protemas Pht, como se determino mediante experimentos de citometna de flujo (Figuras 7 a,b,c). Como un control, no se observo cambio en la fluorescencia promedio con anticuerpo anti-polisacarido tipo 3 en las mismas condiciones de empobrecimiento de cinc (Figura 7d). Al nivel de ARN, mediante RT-PCR se pudo medir un aumento de hasta 25 veces en el nivel de transcripcion de phtE en la condicion de empobrecimiento de cinc (datos no mostrados).

Ademas, se realizaron experimentos de RT-PCR-c utilizando ARNm purificado proveniente del aislado neumococico (cepa D39) cultivado ya sea en THB o en THB + TPEN 25 pM. La concentracion del quelante anadida al medio fue sub-optima, segun se determino con experimentos preliminares, lo que significa que TPEN no evitaba el crecimiento (como se observo cuando la concentracion de TPEN era lo suficientemente alta como para quelar todos los iones en el medio), pero lo retrasaba (datos no mostrados). La adicion de TPEN al medio daba como resultado un aumento de 4,84 veces en el nivel de expresion del ARNm de phtD. La complementacion de THB+TPEN con ZnSO4 25 pM restauro la expresion del ARNm de phtD hasta un nivel similar al observado en medio solo, lo que sugiere que entre todos los iones que puede quelar TPEN (Zn, Mn, Cd, Co, Ni, Cu, Mg, Ca), Zn tiene el mayor impacto sobre el nivel de expresion de phtD.

Ejemplo 5

Presencia de Pht en neumococos

En total, se investigaron 74 cepas (incluyendo 23 cepas PMEN y propias). En este conjunto de cepas representativas, estaban representados 18 linajes clonales, 46 cepas (61 %) con 27 ST diferentes que pertenedan a los 3 grupos clonales principales (1, 11 y 23), estaban presentes 56 ST diferentes, entre los cuales los mas representados eran 81, 90, 124, 156, 162 y 199 (22 cepas), y estaban presentes 27 serotipos diferentes, entre los cuales los mas representados eran 19F, 6B, 3, y 23F (47 % de todas las cepas).

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Mediante PCR en ADN genomico, se encontraron los genes de PhtD, PhtE, PhtB y PhtA en el 100 %, 97 %, 81 %, y 62 % de las cepas, respectivamente. Se encontro que el cincuenta y cuatro por ciento de las cepas portaban los cuatro genes pht en sus genomas. En las inmunotransferencias con anticuerpos policlonales generados contra PhtD, se pudo detectar la PhtD en todas las cepas. De igual manera, las otras Phts se encontraron mediante inmunotransferencia en todas las cepas que portan sus genes respectivos. De manera notable, debido a la gran divergencia genetica, la PhtE se detecto de manera mas adecuada con un anticuerpo policlonal espedficamente generado contra esta (Figuras 8). Se encontraron algunas Phts peculiares, tal como una PhtE de un tamano mas bajo (10 kDa mas pequena) en 6 aislados, y de un tamano incluso mas pequeno (20 kDa menos) en 8 cepas. De igual manera, se encontro que 4 cepas produdan una PhtA truncada (Figuras 8), cuyo gen no se detecto mediante PCR. Como un aspecto interesante, estas 4 cepas tambien expresaban la PhtE truncada en 20 kDa. Al menos, la determinacion de secuencia del locus de phtA/B de las cepas phtB negativas ha revelado que el unico gen presente en este locus es un dbrido entre cualquiera de los genes phtA y phtB o phtA y phtD.

Como un aspecto interesante, el analisis de secuencia ha demostrado que la secuencia senal que codificaban los genes pht era espedfica para cada uno de los miembros de la familia Pht. En efecto, la secuencia senal espedfica de un miembro de la familia Pht difiere al menos en una posicion con la secuencia senal de otro miembro de la familia Pht (vease tabla 1).

Despues, se intento determinar si se pueden hacer vrnculos entre el perfil de expresion de Pht y el genotipo/serotipo del aislado. En las cepas analizadas, todos los aislados de los serotipos 2, 4, 14, 6B y 7F posefan las 4 Phts, y todos los aislados de los serotipos 3, 9, 19F y 22F caredan de PhtA o portaban una PhtA mas pequena.

Acerca de un vinculo potencial entre el genotipo MLST y el perfil de expresion de Pht, se pudieron determinar las siguientes caractensticas: la PhtE truncada en 10 kDa se encontro principalmente en el grupo del genotipo ST 199. Los serotipos de estas cepas eran 19F, 19A, 15A, 1 y 6A. La PhtE truncada en 20 kDa se observo en 8 aislados que pertenedan todos al mismo linaje clonal (grupo 1), pero que portaban diferentes serotipos (9, 19A, 19F, 14). Por ultimo, las cepas que caredan de PhtA se observaron en linajes clonales diferentes. Por lo tanto, no se identifico un vinculo importante entre la falta de PhtA y el genotipo.

Ejemplo 6

Conservacion de PhtD

En el estudio de la presencia de Pht, se encontro que PhtD esta presente entre todas las cepas neumococicas analizadas, lo que la designa como la mejor candidata para vacuna entre la familia Pht. En este sentido, se encontro esencial determinar el nivel de conservacion de secuencia entre las cepas neumococicas. Para esto, se efectuo la determinacion de secuencia de ADN.

A partir del analisis de 107 cepas (a base de la clasificacion MLST), se determino que la longitud de PhtD vana entre 831 y 853 aminoacidos con una masa molecular de alrededor de 100 kDa. Se encontro que PhtD esta altamente conservada entre las 107 cepas analizadas y solamente 1 secuencia presento una senal de detencion para una protema truncada (cepa 4/75). La region rica en prolina contiene 13-15 prolinas para todas las cepas (en 7 cepas, solamente 11-13 prolinas). Se encontraron tramos limitados de variabilidad <4 aminoacidos en la secuencia de PhtD.

Discusion

Las protemas Pht son candidatos prometedores para incorporarlos en una vacuna contra enfermedades infecciosas neumococicas. En este sentido, parece crucial investigar como se regula la expresion de estas protemas, con el fin de definir de manera mas adecuada su papel en la patogenesis neumococica.

El analisis genomico mostro que los cuatro homologos genicos estan dispuestos en tandem. Tambien se demostro la presencia de un quinto miembro, aunque truncado, de la familia genica pht, corriente abajo del gen phtE, lo que confirma el hallazgo en un estudio previo {Adamou 2001}. Al parecer este truncamiento se conserva debido a que se encontro la misma organizacion en el genoma de la cepa R6 de S. pneumoniae (n.° de referencia AAK99714) {Hoskins 2001}.

El presente estudio muestra que la organizacion en tandem de los genes pht no se correlaciona con una transcripcion bicistronica de pht. Ninguno de estos genes se cotranscribio con su pht vecino relacionado, en las condiciones analizadas. El analisis del promotor y el terminador se correlaciona bien con los estudios de RT-PCR tradicional. Los inventores del presente documento demuestran que los genes phtB, phtA y phtE poseen todos promotores supuestos individuales y que dicha transcripcion de ARNm probablemente termine poco despues de los codones de detencion correspondientes. Por otro lado, se observo una peculiaridad del gen phtD. En efecto, no se identifico promotor in silico para phtD. En cambio, se identificaron promotores, pero no terminadores de la transcripcion para los genes lmb e yfnA, dos genes localizados corriente arriba de phtD, lo cual tiende a indicar que dichos genes estan organizados en un sistema de operon. Esto corrobora el hallazgo reciente que phtD puede expresarse en un sistema de operon grande junto con los 4 genes corriente arriba {Loisel 2008}. No obstante, el hecho que se identifique un promotor para yfnA y para lmb indica que la transcripcion puede comenzar en estas ubicaciones, lo que significa que se pueden producir transcritos de diferente longitud que contienen phtD. Ademas, se identifico un sitio de union a adcR corriente arriba del gen lmb {Loisel 2008, Panina 2003}, lo cual tiende a decir

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que tambien puede existir un transcrito bicistronico regulado por cinc con Imb y phtD, lo cual ha sido sugerido por otros autores. Los estudios hechos por Spellerberg y col. {Spellerberg 1999} mostraron que el gen Imb estreptococico del grupo B (EGB) se cotranscribe con un gen cuyo producto presenta 67 % de similitud de secuencia con los primeros 225 (phtE) y los primeros 228 (phtA, phtD y phtB) aminoacidos de los productos del gen pht (n.° de referencia AF062533). Tambien se observa un ordenamiento genomico comparable en el genoma estreptococico del grupo A (EGA) {Ferretti 2001}. Adicionalmente, se propuso que la cotranscripcion de Imb y phtD podna indicar un vinculo funcional, en el que el producto genico de este ultimo esta implicado en la adhesion e invasion neumococica {Panina 2003}.

Es interesante indicar que el gen phtD se puede transcribir como un mensaje policistronico con los otros dos genes, yfnA e Imb, que puede estar implicado en actividades de transporte y de union espedfica, respectivamente. En efecto, se cree que YfnA en S pneumoniae {Hoskins 2001}, y las protemas homologas en B. subtilis {Yamamoto 1997}, S. pyogenes {Ferretti 2001}, y S. mutans {Ajdic 2002} son transportadores de aminoacido, miembros de la superfamilia de las permeasas. En cuanto a la protema Lmb, se ha descrito como una protema de union a cinc similar a transportador ABC {Loisel 2008} y como una protema de union a laminina supuesta {Spellerberg 1999}. En efecto, esta protema demuestra similitudes con una familia de adhesina conocida como Lral, encontrada inicialmente en estreptococos orales {Jenkinson 1994}, pero desde entonces descubierta despues en otros estreptococos y generos {Cockayne 1998}. Se sugirio que las protemas similar a Lral estan implicadas en la colonizacion del epitelio humano por estreptococos y su posterior invasion del torrente sangumeo {Elsner 2002}. No es claro por que yfnA, lmb, y phtD estan asociados en un sistema de operon. Una hipotesis posible es que estas tres protemas son necesarias en el mismo momento del ciclo bacteriano, para invasion o crecimiento, por ejemplo, sin que necesariamente esten asociadas en sus funciones. Sin embargo, la determinacion del papel de las protemas Pht podna dar alguna pista de su asociacion genomica. Se puede especular que las similitudes entre las protemas Pht intraespecies son indicativas de papeles intercambiables. Tambien podna ser que las protemas compartan funciones similares a traves de sus regiones homologas y, al mismo tiempo, ejerzan actividades distintas, incluso en fases diferentes del desarrollo de la bacteria. Los resultados obtenidos por los inventores en analisis de inmunotransferencia con extractos de protema provenientes de los diversos mutantes deficientes en Pht que los inventores se han producido, tienden a mostrar que no hay compensacion por perdida de gen mediante aumento del nivel de expresion de los productos de los genes de Pht restantes. Esta caractenstica tambien se describio recientemente a nivel de ARN, utilizando RT-PCR {Ogunniyi 2009}.

Como ya se menciono, todas las protemas Pht comparten motivos de triada de histidina {Adamou 2001, Hamel 2004, Zhang 2001}, que se cree estan implicadas en la union a metal. Como un aspecto interesante, se ha especulado que estos motivos podnan estar implicados en la union a cinc, especialmente para generar protemas Pht funcionales desde el punto de vista conformacional {Panina 2003}. Los mismos autores tambien plantean la hipotesis que un entorno restringido en cinc podna inducir la expresion de las protemas Pht y favorecer la colonizacion e invasion por Streptococcus. En este contexto, se efectuaron experimentos en los cuales se cultivaron cepas de tipo silvestre y deficientes en Pht en diferentes condiciones de empobrecimiento y complementacion de iones. En un medio sintetico mmimo, las cepas de tipo silvestre y deficiente en PhtD crecieron mas lentamente que en medio LB enriquecido, pero se observo que casi no hubo crecimiento del mutante cuadruple deficiente en Pht en el medio mmimo. De manera sorpresiva, cuando se anade Zn2+o Mn2+, y esto fue en particular visible a concentraciones en el intervalo de 20-200 |jM, el crecimiento del mutante cuadruple se restablecio hasta el del tipo silvestre. Sin embargo, los resultados de los inventores muestran que el crecimiento del mutante cuadruple estaba retrasado, en comparacion con el tipo silvestre.

Estas observaciones, ademas de confirmar la necesidad de Zn2+ y Mn2+ para el crecimiento bacteriano, arguyen un papel cntico de la familia Pht en la captacion de Zn2+ y Mn2+. El hecho, como fue observado por los inventores, de que la carencia de Zn2+ induce la smtesis de novo de protemas de la familia Pht es un argumento adicional para sustentar una relacion estrecha entre Pht y Zn2+. Esta regulacion probablemente se produce a traves de la protema AdcR, que regula la captacion de cinc en S. pneumoniae. En efecto, se han encontrado sitios de union supuestos para la protema AdcR corriente arriba de los genes phtA, phtB, y phtE y del operon lmb-phtD {Panina 2003}. La union de AdcR, inducida en condiciones de concentraciones altas de Zn2+, inhibe la transcripcion de los genes bajo su dependencia. Bajo condiciones de inanicion directa o indirecta de cinc, y por tanto reduccion en la concentracion intracelular de este metal, se alivia la represion por AdcR {Brenot 2007, Claverys 2001}. Contrario a esto y a lo que se ha observado en el presente estudio, recientemente se publico que la adicion de cinc en el medio de cultivo suscita la produccion de Pht {Ogunniyi 2009}. Sin embargo, los dos procedimientos utilizados son distintos en el sentido que, en el presente trabajo, el cinc se retira de un medio enriquecido en cinc mientras que Ogunniyi y col. agregan cinc a un medio pobre en cinc. Es razonable estimar que la produccion de Pht se regula en una manera con forma de campana dentro de un intervalo dado de concentraciones de cinc. Ademas, los efectos de la concentracion alta de cinc que observaron Ogunniyi y col. {Ogunniyi 2009}, que conducen a la expresion aumentada de Pht, pueden tener poca relevancia in vivo ya que las concentraciones de cinc libre disponibles en el hospedero humano son muy bajas.

En 1997, Dintilhac y col. {Dintilhac 1997a} concluyeron en su estudio que, ademas de Psa, descrita como una permeasa de Mn2+ tipo ABC, y de Adc, una permeasa de Zn2+ de tipo ABC, debena existir un tercer transportador, capaz de transportar tanto Zn2+ como Mn2+. Las protemas Pht o la protema de union a laminina podnan aparecer como candidatos para cumplir esta funcion. Los resultados del presente estudio son indicativos de un papel diferente

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para las Phts. En efecto, el hecho que las cepas de tipo silvestre y las deficientes en PhtD sean capaces de crecer en medio mmimo sin Zn2+ yMn2+ es intrigante. Ademas, tambien es intrigante la observacion de que el crecimiento del mutante cuadruple se rescato con un retraso cuando se anadio Zn2+ o Mn2+ al medio irnnimo. Estas observaciones se podnan explicar si se considera que las protemas Pht actuan como eliminadores de Zn2+ y Mn2+, con la funcion de almacenar y concentrar dichos cationes divalentes. Cuando las cepas de tipo silvestre y deficientes en PhtD se pusieron en medio mmimo, estas fueron capaces de empezar a crecer inmediatamente gracias a los iones almacenados previamente dentro de las protemas Pht, cuando las bacterias estaban en un medio mas rico. En contraste, los mutantes Pht cuadruples no pudieron almacenar dichos iones cuando se colocaban en condiciones favorables, y despues no pudieron crecer cuando se ponen en medio empobrecido. Cuando se anadio Zn2+ o Mn2+ en exceso al medio mmimo, es necesito algo de tiempo antes de que las permeasas de metal espedficas pudiesen atrapar los iones, debido a que estas tienen que encontrarlos al azar en el medio de cultivo, sin ayuda de las protemas Pht. Esto podna explicar el retraso necesario para que el mutante Pht cuadruple comience a crecer en tales condiciones. Asimismo, un posible papel eliminador para las protemas Pht es consistente con la presencia de cinco a seis dominios de union a cation.

Este mecanismo especulativo de almacenamiento, si se confirma, podna considerarse como un medio para que la bacteria regule la homeostasis de cinc y probablemente de manganeso. Los iones metalicos tales como cinc y manganeso son elementos traza esenciales. Sin embargo, estos son potencialmente daninos para las bacterias cuando estan en exceso, debido a que estos pueden competir con otros elementos como cofactores para algunas enzimas cnticas. Por lo tanto, es esencial que la bacteria regule la homeostasis de metal, y se sugiere que este es el papel principal de la familia Pht. Dicho sistema regulador permitina que S pneumoniae sobreviva cuando se enfrente a entornos limitados en cuanto a iones, por ejemplo durante las etapas iniciales del proceso de colonizacion en la nasofaringe humana {Bunker 1984, Harlyk 1997}.

La existencia de transcritos policistronicos con PhtD podna explicarse por la necesidad de Zn2+ o Mn2+ para Lmb, un miembro de la familia Lral, e YfnA, para ejercer su funcion. Para apoyar parcialmente esta afirmacion, se ha sugerido que Mn2+ es necesario para la adhesion a traves de la familia de protemas Lral, una caractenstica cntica para virulencia la {Dintilha 1997b, Papp-Wallace 2008}. Ademas, se ha demostrado en otros contextos que la laminina une Zn2+ para promover la union de alta afinidad entre la laminina y las protemas de union a laminina {Ancsin 1996, Bandyopadhyay 2002}. Por lo tanto, se puede plantear la hipotesis que Lmb necesita a PhtD para asegurar la presencia de Zn2+ cuando Lmb encuentra a la laminina, lo cual aumenta la union a los tejidos del hospedador. La regulacion de la homeostasis de cinc por las Phts tambien podna explicar por que estas protemas se han asociado con la inhibicion de C3b (Hostetter, 1999 41 /id; Ogunniyi, 2009 98 /id). En efecto, la escision de C3b por el factor I en presencia del factor H se regulado por cinc {Blom 2003}. Controlando la concentracion de cinc en el entorno bacteriano, las Phts podnan contribuir asf, en algunas circunstancias, a la inhibicion de C3b, lo cual necesita ser investigado adicionalmente.

Por lo tanto, eligiendo como blanco la familia de protemas Pht, el sistema inmune puede impedir la posibilidad de que las bacterias almacenen y utilicen los iones, lo cual parece ser crucial para el proceso de invasion. Por consiguiente, los presentes resultados confirman a las protemas Pht como candidatos genuinos para vacunas contra infecciones neumococicas. Los diferentes miembros de la familia Pht ya han sido evaluado respecto a su potencial para ser utilizados como antfgenos para vacunas neumococica {Adamou 2001, Hamel 2004, Ogunniyi 2007, Zhang 2001}. Despues de su descubrimiento, PhtA, PhtB y PhtD se examinaron respecto a su capacidad para proteger a los ratones contra un subconjunto de aislados neumococicos {Adamou 2001}. Se encontro que PhtD es la protema Pht que proporciona la proteccion mas amplia, mientras que la inmunizacion con PhtA es eficaz contra un numero mas pequeno de las cepas analizadas. Esto esta en lmea con los resultados del presente estudio, en el cual se muestra que PhtA se expresa en el 62 % de las cepas neumococicas, mientras que PhtD esta presente en el 100 %. Aunque se utilizo satisfactoriamente en dos estudios, el potencial de PhtB para suscitar proteccion cruzada se desconoce ya que esta se evaluo solo contra una unica cepa {Adamou 2001, Zhang 2001}. Sin embargo, debido a que se lo encontro en el 81 % de las cepas, se podna esperar que su cobertura entre cepas podna no ser optima. Acerca de PhtE, esta protema se encontro en el 97 % de las cepas, lo cual podna ser indicativo de una proteccion cruzada amplia. Sin embargo, esta Pht comparte solamente el 32 % de identidad con las otras tres Phts, y su parte C-terminal, la mas inmunogenica y conservada, es espedfica de PhtE. La region de PhtE comun con las otras Phts no es accesible a los anticuerpos {Adamou 2001, Hamel 2004}. Por lo tanto, PhtD, presente en todas las cepas analizadas, con una secuencia de aminoacidos altamente conservada entre los neumococos y que tambien demuestra reactividad cruzada con PhtA y PhtB, representa una mejor opcion.

Ejemplo 7

La inmunizacion con protemas pht confiere proteccion en un modelo de exposicion intranasal letal neumococica en raton

Para evaluar la proteccion obtenida por los miembros de la familia Pht en un la exposicion intranasal neumococica en raton, se inmunizaron ratones OF1 hembra (cuatro semanas de edad; n=20/grupo) por via intramuscular (i.m.) en el dfa 0 y 14 con 1 |jg de PhtD, PhtA, PhtB, o PhtE, formuladas con el Sistema de Adyuvante AS02 que consiste en una emulsion aceite en agua complementada con 3-O-desacil-4’-monofosforil-lfpido A (MPL) y QS21 (Garcon y col. Expert Rev. Vaccines 6; 723-739 (2007). Los animales de control se inyectaron con AS02 solo. En el dfa 28, los

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ratones se expusieron por via intranasal a la cepa neumococica tipo 3/43 (105 ufc en 50 |jl). La mortalidad se registro para los 10 dfas despues de la exposicion.

En otros experimented, la vacunacion con 1 jg de PhtD se comparo con 10 jg de PspA y 10 jg de CbpA. Todos los anftgenos se formularon con el Sistema de Adyuvante AS04, que consiste en sales de aluminio con MPL (Garcon y col. Expert Rev. Vaccines 6; 723-739 (2007). Las inmunizaciones i.m. se produjeron en el dfa 0, 14 y 28. Los animales de control se vacunaron con adyuvante solamente. En el dfa 42, los ratones se expusieron por via intranasal a S. pneumoniae tipo 4/CDC (5x106 ufc), tipo 2/D39 (2x105 ufc), o tipo 3/43 (105 ufc) en 50 jl. La mortalidad se registro para 10 dfas despues de la exposicion. Los datos de supervivencia se analizaron con la prueba logrank (Mantel-Haenszel).

Los resultados indican que la vacunacion con cualquiera de las protemas Pht permite la supervivencia de aproximadamente el 60 % de los ratones, mientras que solamente el 20 % de los animales sobrevivio en el grupo de control (Figura 10).

En experimentos posteriores, se vacunaron otros grupos de animales con tres anftgenos neumococicos diferentes, PspA, CbpA, y una protema de la familia Pht, espedficamente PhtD. Se evaluo el grado de la respuesta humoral y dos semanas despues de la ultima inmunizacion los animales se expusieron a tres cepas neumococicas diferentes. Se registro la supervivencia de los ratones para todas las combinaciones de anftgeno/cepa. Los niveles resultantes de anticuerpos fueron dependientes del anftgeno (Figura 11A). La vacunacion con 1 jg de PhtD suscito tftulos de anticuerpo mas altos que la vacunacion con 10 jg de CbpA o PspA. No obstante, el nivel de proteccion contra la exposicion letal intranasal a la cepa 2/D39, a partir de la cual se originan CbpA y PspA, fue similar para los tres anftgenos, con alrededor del 70 % de supervivencia (figura 12A). Las diferencias entre los anftgenos se evidenciaron cuando se utilizaron otras cepas. En efecto, la vacunacion con PhtD permitio que el 60 % y el 80 % de los ratones sobreviviesen a la exposicion con las cepas 3/43 y 4/CDC, respectivamente. En contraste, CbpA y PspA no proporcionaron proteccion o proporcionaron proteccion muy debil contra las exposiciones a los tipos 3 y 4. Por lo tanto, PhtD es el unico antfgeno que puede proporcionar proteccion contra las tres cepas.

Ejemplo 8

La inmunizacion con protemas Pht protege a los ratones contra la colonizacion nasofarngea de S. pneumoniae

Se utilizo un ensayo de colonizacion nasofarmgea para evaluar la capacidad de inmunizacion contra PhtD para prevenir la otitis media. Varios estudios han demostrado un vinculo entre la colonizacion nasofarmgea y la otitis media. Bogaert y col. Lancet Infect. Dis. 4(3); 144-154 (2004) muestran que las tasas de colonizacion tienden a ser mas altas durante la infeccion del tracto respiratorio y la otitis media. En efecto, la enfermedad neumococica no se producina sin la colonizacion nasofarmgea precedente y/o concurrente con la cepa homologa (Grey y col. J. Infect. Dis. 142; 923-933 (1980), Syrjanea y col. Paediatr. Infect. Dis. J. 24; 801-806 (2005)).

Se inmunizaron ratones Balb/c (cuatro semanas de edad; n=10/grupo) en los dfas 0, 14 y 28 por via intranasal con 5 jg de PhtD, PhtA, PhtB, o PhtE complementados con 0,2 jg de toxina labil (TL) de E. coli como un adyuvante (excepto en la ultima inmunizacion). Otro experimento con el mismo protocolo (programa y dosificaciones) consistio en comparar PhtD con CbpA, PsaA, y PspA. Los ratones de control se inyectaron con Tl sola. En el dfa 42, los ratones se expusieron por via intranasal a 7 x 104 ufc de la cepa tipo 6B/CDC, tipo 4/CDC, o tipo 2/D39. Las exposiciones se efectuaron utilizando un volumen de inoculo bacteriano pequeno (10 jl). Las colonias bacterianas se contaron en los lavados nasales recolectados 2 y 6 dfas despues de la exposicion. Los lavados nasales se obtuvieron por lavado abundante con 500 jl de PBS del interior de la cavidad nasal de ratones anestesiados. Despues, para contar las colonias bacterianas, 100 jl del lavado nasal se diluyeron 10 veces en caldo de Todd Hewitt. A partir de esto, 10 jl se sembraron en placa en base de agar sangre Difco™, complementado con sangre esteril, desfibrinada de borrego y gentamicina (3 jg/ml). La placa de Petri se inclino para diseminar la muestra y las colonias se enumeraron despues de incubar durante una noche a 37°C. Todos los datos de los recuentos de colonia, despues de la normalizacion, se compararon con ANOVA, seguido por la postprueba de Dunnett cuando la ANOVA se encontro significativa.

Para evaluar la actividad protectora de la vacunacion contra la colonizacion nasofarmgea, se inmunizaron ratones Balb/c por via intranasal con las diferentes protemas Pht antes que estos se expusiesen por la misma via a la cepa 2/D39. Como se puede observar en la figura 13, aunque solamente la vacunacion con PhtD o PhtE proporciono proteccion significativa contra la exposicion a la cepa tipo 2, todos los miembros de la familia Pht fueron capaces de reducir la carga bacteriana en la nasofaringe de los animales vacunados. Debido al mejor desempeno de PhtD en este modelo, este miembro de la familia Pht se eligio para experimentos adicionales, que consisten en comparar PhtD con otras protemas neumococicas. Por lo tanto, los ratones se inmunizaron con diferentes anftgenos neumococicos, incluyendo PhtD, y posteriormente se expusieron a una cepa tipo 2, una cepa tipo 4 o una cepa tipo 6B.

Como se observo despues de la inmunizacion sistemica, las respuestas humorales suscitadas despues de la inmunizacion intranasal fueron dependientes del anftgeno (figura 11B). En particular, CbpA suscito tftulos de anticuerpos mas bajos que PspA y PhtD. Sin embargo, el nivel de proteccion proporcionado por CbpA contra la cepa

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2/D39 homologa de clado fue similar al de PspA y PhtD (figura 14A).

Cuando se utilizo para la exposicion la tipo 4/CDC, solamente la inmunizacion con PhtD pudo proteger a los animales contra la colonizacion nasofarmgea, mientras que la inmunizacion con CbpA, PsaA o PspA no fue estadfsticamente distinguible del control con TL (figura 14B). Por ultimo, la exposicion al tipo 6B/CDC no evidencio ninguna diferencia en la proteccion en el dfa 2 despues de la exposicion, ya sea que los animales se inmunizaran con CbpA, PspA o PhtD (figura 14C). Solo PsaA parecio ser menos eficiente en ese respecto. En el dfa 6 despues de la exposicion, no habfa diferencia estadfstica entre todos los grupos. Sin embargo, un examen cuidadoso de los resultados para PhtD revelo que la mayona de los animales estaban protegidos contra la colonizacion nasofarmgea y que la conclusion estadfstica desfavorable probablemente se debe solamente a la presencia de dos valores fuera de rango. En conclusion, PhtD fue el unico antfgeno que pudo proporcionar algo de proteccion contra las tres cepas en este modelo de colonizacion nasofarmgea.

Ejemplo 9

La inmunizacion con Phtd protege a los ratones contra colonizacion del pulmon con S. neumoniae

El modelo se adapto a partir de Briles y col. J. Infect. Dis. 188; 339-348 (2003). Se inmunizaron ratones CBA/J hembra (cuatro semanas de edad; 30/grupo) por via i.m. en el dfa 0, 14 y 28 con 3 |jg de PhtD con adyuvante AS02. En el dfa 42, los ratones se expusieron por via intranasal a 2 x 107 ufc/50 jl de S. pneumoniae 19F/2737. Los ratones de control se inyectaron con adyuvante solo. La carga bacteriana se midio mediante recuento de colonias en pulmones recolectados 3, 4 y 5 dfas despues de la exposicion. Todos los datos de los recuentos de colonias, despues de la normalizacion, se compararon con ANOVA, seguido por la postprueba de Dunnett cuando el ANOVA se encontro significativa.

Los ratones CBA/J, una cepa susceptible a infecciones neumococicas, se vacunaron con PhtD antes que estos se desaffen con una cepa bacteriana 19F moderadamente virulenta. Dicho protocolo permite la induccion de una neumoma focal sin sepsis generalizada. Despues de la exposicion, se evaluo el numero de bacterias vivas en los pulmones en el dfa 3, 4 y 5.

Se demostro que la vacunacion con PhtD reduce la carga bacteriana en los pulmones hasta un grado elevado (mas del 95 %), en comparacion con el placebo (Figura 15a). La eficacia de la vacunacion con PhtD fue particularmente evidente cuando se analizo el numero de ratones no colonizados, ya que hasta el 80 % de los ratones vacunados permanecio libre de bacterias en el dfa 5, en comparacion con el 10 % en el grupo de control (Figura 15b).

Referencias

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion inmunogenica que comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz de una protema PhtX aislada para su uso en el tratamiento o la prevencion de una infeccion por Streptococcus pneumoniae, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en la sangre, pulmon, un compartimiento del ofdo o en las meninges de un paciente humano en un entorno en el cual la concentracion libre de Zn2+ y/o Mn2+ es suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresion de al menos una protema PhtX en el Streptococcus pneumoniae y en la que el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+, segun se mide mediante lavado bronquial y/o analisis de sangre.
2. 2. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la protema PhtX se selecciona del grupo que consiste en PhtA, PhtB, PhtD y PhtE.
3. 3. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que la protema PhtX es PhtD.
4. 4. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en sangre y la concentracion libre de Zn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 1 nM, 100 pM o 10 pM segun se mide en suero sangumeo.
5. 5. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en sangre y la concentracion libre de Mn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 1 nM, 100 pM o 10 pM segun se mide en suero sangumeo.
6. 6. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en un pulmon y el tratamiento o la prevencion reduce la carga bacteriana en los pulmones.
7. 7. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en un pulmon y la concentracion de Zn2+ en el tejido pulmonar es menor de 300, 200, 100, 50 o 10 |ig/kg, segun se mide mediante un lavado bronquial.
8. 8. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en un pulmon y la concentracion de Mn2+ en el tejido pulmonar es menor de 300, 200, 100, 50 o 10 |ig/kg, segun se mide mediante un lavado bronquial.
9. 9. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en el ofdo medio y la concentracion de Zn2+ en el ofdo medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2 o 0,1 |iM.
10. 10. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en el ofdo medio y la concentracion de Mn2+ en el ofdo medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2 o 0,1 |iM.
11. 11. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en las meninges y la concentracion de Zn2+ en el lfquido cefalorraqrndeo es menor de 1,5, 1, 0,75, 0,5, 0,25 o 0,1 |iM o menor de 100, 75, 50, 25, o 10 |ig/l.
12. 12. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 11, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en las meninges y la concentracion de Mn2+ en el lfquido cefalorraqrndeo es menor de 2,5, 2, 1,5, 1 o 0,5 |ig/l o menor de 50, 25, 10 o 5 nM.
13. 13. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el paciente humano tiene multiples infecciones bacterianas.
14. 14. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el paciente humano tiene una infeccion bacteriana cronica.
15. 15. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el paciente humano tiene menor Zn2+ y/o Mn2+ debido a una infeccion previa con una cepa bacteriana.
16. 16. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el paciente humano es susceptible a la infeccion por Streptococcus pneumoniae.
17. 17. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en la que la infeccion por Streptococcus pneumoniae es septicemia, bacteremia, meningitis, otitis media o neumoma.
18. 18. Uso de una cantidad farmaceuticamente eficaz de una protema PhtX aislada en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de una infeccion por Streptococcus pneumoniae, en la que la

    5 infeccion por Streptococcus pneumoniae se produce en la sangre, pulmon, un compartimiento del ofdo o en las meninges de un paciente humano, en un entorno en el cual la concentracion de Zn2+ y/o Mn2+ es suficientemente baja como para regular de forma positiva la expresion de al menos una protema PhtX en el Streptococcus pneumoniae y en la que el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+, segun se mide mediante lavado bronquial y/o analisis de sangre.

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